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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6986968
(24)【登録日】2021年12月2日
(45)【発行日】2021年12月22日
(54)【発明の名称】エネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/074 20100101AFI20211213BHJP
【ＦＩ】
C12N5/074
【請求項の数】4
【全頁数】39
(21)【出願番号】特願2017-549154(P2017-549154)
(86)(22)【出願日】2015年12月4日
(65)【公表番号】特表2017-536853(P2017-536853A)
(43)【公表日】2017年12月14日
(86)【国際出願番号】KR2015013269
(87)【国際公開番号】WO2016089178
(87)【国際公開日】20160609
【審査請求日】2017年8月1日
【審判番号】不服2019-8629(P2019-8629/J1)
【審判請求日】2019年6月27日
(31)【優先権主張番号】10-2014-0173007
(32)【優先日】2014年12月4日
(33)【優先権主張国】KR
(31)【優先権主張番号】10-2015-0172501
(32)【優先日】2015年12月4日
(33)【優先権主張国】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】518225779
【氏名又は名称】ステモン・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ソンハグ・キム
【合議体】
【審判長】
中島 庸子
【審判官】
高堀 栄二
【審判官】
松野 広一
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１３／１３４９３１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１３／１６３２９６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２００４， ｖｏｌ．２７９， ｎｏ．５２， ｐｐ．５４４６３−５４４６９
【文献】
Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．， １９９４， ｖｏｌ．５９， ｎｏ．２， ｐｐ．１６７−１７０
【文献】
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９８１， ｖｏｌ．４１， ｎｏ．１２， ｐｐ．５１８８−５１９２
【文献】
ＩＥＥＥ Ｉｎｔ． Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｓｙｍｐ． Ｐｒｏｃ．， ２０１０， ｐｐ．１７６３−１７６６
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
C12N5/00-5/074
ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
胚芽幹（ＥＳ）細胞培養培地に、出力強度１Ｗ／ｃｍ２〜２０Ｗ／ｃｍ２で１〜２０分間の超音波処理を施した後、当該超音波処理を施したＥＳ細胞培養培地と線維芽細胞を混合し、当該超音波処理を施したＥＳ細胞培養培地と線維芽細胞の混合物に対して、出力強度０．５Ｗ／ｃｍ２〜３Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間の更なる超音波処理を施し、更にＥＳ細胞培養培地を用いてスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）形成浮遊培養を行う工程を含み、
前記スフェロイドは、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）特性を有するものである、線維芽細胞から多能性細胞への逆分化方法。
前記スフェロイドは、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）特性を有するものである、線維芽細胞から多能性細胞への逆分化方法。
【請求項2】
スフェロイドは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４又はＡＦＰのうちいずれか一つの未分化マーカー又は３胚葉マーカー遺伝子を発現するものである、請求項１に記載の線維芽細胞から多能性細胞への逆分化方法。
【請求項3】
線維芽細胞は、哺乳類由来の線維芽細胞である、請求項１に記載の線維芽細胞から多能性細胞への逆分化方法。
【請求項4】
超音波処理を施した培養培地と線維芽細胞の混合物は、浮遊培養方式を通じて３日〜１０日間培養する、請求項１に記載の線維芽細胞から多能性細胞への逆分化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、超音波、レーザー又は熱処理などのエネルギー提供を通じて多能性特性を有する多能性細胞を誘導できるエネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）は、三つの種類の胚葉系、すなわち外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化する能力である。多能性幹細胞は、それらが体内で任意の細胞又は組織タイプを発生させるため、疾患モデル及び移植において臨床的に重要である。したがって、胚芽幹細胞、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）、体細胞及び患者由来細胞のリプログラミング又は分化において現在主要要求事項は、臨床適用のために外来遺伝物質や化学物質又は小分子の導入なしに、簡単であり、速くて、効果的であり、安全でなければならないということである。最近研究において、環境と遺伝子型間の相互作用は、生きている有機体の遺伝子発現及び表現型変異と密接に関連していることが立証された。構造、機械、磁性、超音波信号のような環境刺激を調節することによって、細胞運命、増殖及び細胞吸収効率を調節できる。これら接近の正確な分子メカニズムは、相変らず不明確であるが、これら方法は、遺伝物質、化学物質及び小分子の導入なしに、安全性を具現できる代案として受け入れられるものである。
【0003】
このような側面から、本発明者は、遺伝子及び化学物質がない条件で、細胞環境信号を利用したエネルギー提供を通じて未分化マーカーと外胚葉、中胚葉及び内胚葉よりなる３胚葉マーカー遺伝子を発現し、３胚葉に分化する多能性特性を有する新しい多能性細胞、いわゆるＰｈｙｓｉｃｓ（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｐｈｅｒｅ ｙｉｅｌｄｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓｔｉｍｕｌｕｓ）細胞を誘導する新しい方法を開発することによって本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、分化した細胞への逆分化誘導因子及び化学物質の導入なしに、エネルギー提供を通じて分化した細胞から多能性特性を有する新しいタイプの多能性細胞を誘導する方法及びその誘導装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
前記目的を達成するために、本発明は、培養培地と分化した細胞を混合し、前記混合物にエネルギーを提供し、一定時間培養を通じてスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成することを含み、前記スフェロイドは、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）特性を有するものである、分化した細胞から多能性細胞への逆分化方法を提供する。
【0006】
本発明は、また、細胞及び培養培地を収容できる培養チャンバーと、前記培養チャンバーの一側に配置され、前記細胞及び培養培地にエネルギーを提供できる装置と、を含み、分化した細胞と培養培地を混合し、前記混合物にエネルギーを提供し、一定時間培養を通じてスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成し、前記スフェロイドは、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）特性を有するものである、多能性細胞誘導装置を提供する。
【発明の効果】
【0007】
本発明は、分化した細胞への逆分化誘導因子及び化学物質の導入なしに、適切な超音波、レーザー又は熱処理などによるエネルギー提供を通じて分化した細胞から多能性特性を有し、且つ、公知の誘導万能幹細胞に比べて分化属性が強い新しいタイプの多能性細胞を誘導する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図2b】図２ｂは、ヒト皮膚線維芽細胞に対する超音波強度の効果を示すもので、（ｃ）は、超音波処理されたＨＤＦの生きている／死んだ細胞分析結果、（ｄ）は、前記（ｃ）で生きている及び損傷された細胞の比率である。
【図3a】図３ａは、１Ｗ／ｃｍ２の固定された強度の下で超音波露出時間の効果を示すもので、（ａ）は、超音波露出時間別にＨＤＦの形態変化比較、（ｂ）は、超音波露出時間別に生成された多細胞スフェロイドの数である。
【図3b】図３ｂは、１Ｗ／ｃｍ２の固定された強度の下で超音波露出時間の効果を示すもので、（ｃ）は、超音波処理されたＨＤＦの生きている／死んだ細胞分析結果、（ｄ）は、前記（ｃ）で生きている及び損傷された細胞の比率である。
【図4】図４は、ヒトＥＳＣ培養培地に対する超音波強度の効果を示すもので、上端は、超音波処理された培地で成長した超音波−処理されたＨＤＦの形態変化比較、下端は、前記で生成された多細胞スフェロイドの数である。
【図5】図５は、５Ｗ／ｃｍ２の固定された強度の下でヒトＥＳＣ培養培地の超音波露出時間の効果を示すもので、（ａ）は、超音波処理された培地で成長した超音波処理されたＨＤＦの形態変化比較、（ｂ）は、前記（ａ）で生成された多細胞スフェロイドの数である。
【図7a】図７ａは、浮遊培養条件の下で超音波刺激別（ＵＣ、ＵＭ、ＵＣＵＭ）に生成された多細胞スフェロイドのサイズ分布を示すもので、（ａ）は、総サイズ、（ｂ）は、５０〜１００μｍサイズのスフェロイドの分布である。
【図7b】図７ｂは、浮遊培養条件の下で超音波刺激別（ＵＣ、ＵＭ、ＵＣＵＭ）に生成された多細胞スフェロイドのサイズ分布を示すもので、（ｃ）は、１００〜２００μｍ、（ｄ）は、＞２００μｍサイズのスフェロイドの分布である。
【図8a】図８ａは、単層培養条件の下で超音波刺激別（ＵＣ、ＵＭ、ＵＣＵＭ）に生成された多細胞スフェロイドのサイズ分布を示すもので、（ａ）は、総サイズ、（ｂ）は、５０〜１００μｍサイズのスフェロイドの分布である。
【図8b】図８ｂは、単層培養条件の下で超音波刺激別（ＵＣ、ＵＭ、ＵＣＵＭ）に生成された多細胞スフェロイドのサイズ分布を示すもので、（ｃ）は、１００〜２００μｍ、（ｄ）は、＞２００μｍサイズのスフェロイドの分布である。
【図19】図１９は、ヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞の増殖能検証実験結果であって、（ａ）は、増殖マーカーであるＫｉ６７の発現を示す結果、（ｂ）は、Ｈ３３３４２とＰＩを利用して増加した細胞を染色した結果、（ｃ）は、培養時間によるスフェロイドのサイズを示すものである。
【図43】図４３は、細胞培養培地の効果を示すもので、（ａ）は、ＥＳ培地及びＨＤＦ培養培地を利用した結果、（ｂ）は、ＥＳ培地及びＨＤＦ培養培地においてヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞を誘導し、ＥＳマーカーを確認した結果である。
【図44a】図４４は、他の細胞株においてヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞を誘導した結果を示すものである。（ａ）は、細胞形態の変化を示す結果であり、それぞれ（ｂ）と（ｃ）は、他の細胞株においてヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞を誘導し、（ｂ）ＥＳマーカー及び（ｃ）３胚葉マーカーを確認した結果である。
【図44b】図４４は、他の細胞株においてヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞を誘導した結果を示すものである。（ａ）は、細胞形態の変化を示す結果であり、それぞれ（ｂ）と（ｃ）は、他の細胞株においてヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞を誘導し、（ｂ）ＥＳマーカー及び（ｃ）３胚葉マーカーを確認した結果である。
【図44c】図４４は、他の細胞株においてヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞を誘導した結果を示すものである。（ａ）は、細胞形態の変化を示す結果であり、それぞれ（ｂ）と（ｃ）は、他の細胞株においてヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞を誘導し、（ｂ）ＥＳマーカー及び（ｃ）３胚葉マーカーを確認した結果である。
【図45】図４５は、患者皮膚細胞からヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞を誘導した結果を示すものである。（ａ）は、細胞形態の変化を示す結果であり、（ｂ）は、他の細胞株においてヒトＰｈｙｓｉｃｓ細胞を誘導し、ＥＳマーカーと３胚葉マーカーを確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。本発明は、培養培地と分化した細胞を混合し、前記混合物にエネルギーを提供し、一定時間培養を通じてスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成することを含み、前記スフェロイドは、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）特性を有するものである、分化した細胞から多能性細胞への逆分化方法に関する。
本発明は、分化した細胞への逆分化誘導因子、化学物質などの逆分化誘導物質の導入なしに、適切なエネルギー提供を通じて分化した細胞から多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）特性を有し、且つ、公知の誘導万能幹細胞に比べて分化属性が強い新しいタイプの多能性細胞を誘導できることを特徴とする。
【0010】
前記多能性細胞は、外部環境によって分化誘導が良好に行われ、幹細胞の属性に比べて分化属性が強い前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の属性がさらに強いという点から、公知の誘導万能幹細胞と差別化された特徴を有する。すなわち、誘導万能幹細胞のような胚芽幹細胞を細胞治療剤として使用する場合、ある程度分化過程を経る用意段階が要求され、癌に変わることができる危険要素を内包し、逆分化誘導因子導入のためにウイルスベクターを使用することによる安全性の問題が提起されるが、本発明の多能性細胞は、遺伝子変異のための逆分化誘導因子又は化学物質などの逆分化誘導物質を別に導入することなく、誘導されるので、他の種類の細胞と共同培養を通じる培養が必要ないため、細胞汚染（他の細胞が混ざる問題点）問題点がなく、インビボ実験において癌細胞と類似のテラトーマを形成せず、癌発生の問題点がないため、安全性が確保されている。言い換えれば、本発明の多能性細胞は、誘導過程が単純で、短いため、自家細胞を処理し、移植時まで時間を画期的に短縮できる長所を有する。
【0011】
本発明は、特異的に、培養培地及び分化した細胞の両方にエネルギーを提供することによって、優れた収率でスフェロイドを生成できる。前記エネルギーは、超音波、レーザー又は熱処理のうちいずれか一つであることができる。
【0012】
本発明の多能性細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４又はＡＦＰのうちいずれか一つの未分化マーカー又は中胚葉及び内胚葉よりなる３胚葉マーカー遺伝子を安定的に発現することを特徴とする。
【0013】
前述したように、分化した細胞への逆分化誘導因子の導入なしに、多能性細胞が形成される点について、本発明者らは、エキソソームとの連関性を考慮した。すなわち、超音波、レーザー又は熱処理は、エネルギーによる温度上昇、ＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）生成誘導、超音波により生成されるマイクロバブルの振動、液体のフロー生成誘導、すなわち細胞膜に沿ってマイクロストリーム生成を誘導し、このような効果によって細胞膜に微細な損傷を加え、孔の生成を誘導することによって、外部物質の吸収が増加するようにし、これは、細胞内Ｃａ２＋濃度変化分析とＨ２Ｏ２生成可否を確認することによって立証される。すなわち細胞内Ｃａ２＋濃度変化分析は、細胞膜に損傷や膜の流動性が増加する場合、瞬間的に細胞内（ｃｙｔｏｓｏｌ）Ｃａ２＋濃度が増加することを反映し、細胞膜の流動性の増加を確認するもので、本発明の一具体例によれば、超音波処理直後、Ｃａ２＋濃度が速く増加してから、徐々に減少し、超音波を処理しない対照群の水準に減少することを通じて、細胞膜の損傷が誘導された後、回復されることが分かった。また、細胞内Ｈ２Ｏ２生成可否を確認した実験も、これと類似のパターンであって、初期超音波処理直後には、Ｈ２Ｏ２生成量が増加し、徐々に対照群の水準に減少することを通じて、細胞膜の損傷が誘導された後、回復されることが分かった。また、ＡＴＰが多様な細胞性ストレスに対する反応信号として用いられ、超音波処理後、多能性細胞においてのＡＴＰ濃度を分析した結果、未処理対照群に比べて高い水準にＡＴＰを放出した。また、ＡＴＰ放出によるイオノトロピック型Ｐ２Ｘ受容体と代謝型Ｐ２Ｙ受容体の発現も、多能性細胞において対照群に比べて活性化された。
【0014】
なお、エキソソームは、内部に遺伝情報物質（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｒｏｔｅｉｎ）を含んでいるものと知られており、細胞膜の損傷により細胞膜外に排出されたエキソソームが、周辺の他の細胞にさらに入る過程を通じて、エキソソーム内に存在する遺伝情報物質が伝達され得る。したがって、超音波処理による刺激によって細胞内低発現されるか、又は、発現が抑制された状態に維持された未分化マーカーの発現が誘導ないし促進されると同時に、細胞膜に損傷が生ずることによって、前記発現が誘導ないし促進された未分化マーカーを含む細胞内に存在するエキソソームが外部に排出され、周辺細胞に伝達される。なお、周辺細胞も細胞膜が部分的に損傷された状態であるため、細胞膜の流動性が増加し、細胞内にエキソソームが入る効率が正常状態に比べてさらに高いものと推定され、このようなエキソソーム内に存在する前記発現誘導ないし促進された未分化関連遺伝情報が伝達され、多能性細胞が作られるものと考えられた。本発明の一具体例において、多能性細胞誘導過程中に培養培地を回収し、培地内のエキソソームを抽出し、エキソソーム内に多能性細胞関連未分化マーカーが存在するかを確認した結果、知られた未分化マーカーが高い発現程度を示すことが確認され、本発明者らのこのような仮説を裏付けるものと考えられた。また、このような超音波、レーザー又は熱処理においても、核型奇形がなく、正常であるものと現われた。
【0015】
このような仮説は、細胞膜の損傷によるエキソソーム放出誘導を通じて多能性細胞を製造できることを可能にする。本明細書で、用語「多能性細胞」は、エネルギー、厳格な意味として、超音波、レーザー又は熱処理後、多能性を獲得した細胞を言う。本明細書において前記多能性は、胚芽幹細胞で発現される未分化マーカーを安定的に発現する状態を意味する。また、三つの種類の内胚葉、外胚葉及び中胚葉の３胚葉マーカーを発現する状態を意味する。前記多能性細胞は、「Ｐｈｙｓｉｃｓ（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｐｈｅｒｅ ｙｉｅｌｄｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓｔｉｍｕｌｕｓ）細胞」、又は「Ｐｈｙｓｉｃｓスフェロイド」と混用されて使用され得る。本発明の分化した細胞から多能性細胞への逆分化方法を図１を参照して具体的に説明すれば、次の通りある。
【0016】
まず、細胞培養培地と分化した細胞を混合し、前記混合物にエネルギーを提供する。分化した細胞の混合物にエネルギーを提供する前に、細胞培養培地にエネルギーを提供し、多能性細胞への逆分化効率を高めることができる。
前記エネルギーは、超音波、レーザー又は熱処理のうちいずれか一つであることができる。
【0017】
前記培養培地に対する超音波処理は、出力強度１Ｗ／ｃｍ２〜２０Ｗ／ｃｍ２の超音波を１〜２０分、具体的に、出力強度２Ｗ／ｃｍ２〜１０Ｗ／ｃｍ２の超音波を５〜１５分、より具体的に、出力強度３Ｗ／ｃｍ２〜７Ｗ／ｃｍ２の超音波を７〜１３分間行うことができる。培養培地に対するレーザー処理は、３００〜９００ｎｍ波長帯域のパルス型レーザービームを１秒〜２０秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを３秒〜１０秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを４秒〜６秒間照射することができる。前記波長帯域は、例えば４００ｎｍ、８０８ｎｍ、８８０ｎｍの波長を使用できる。
培養培地に対する熱処理は、４０〜５０℃の温度条件で５分〜２０分間行うことができる。
【0018】
前記培養培地として、胚芽幹細胞培養培地、幹細胞分化誘導培地などを使用できる。前記分化した細胞として、哺乳類由来の線維芽細胞；子宮警部癌細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌ）を含む癌細胞；又は肺上皮細胞（Ｌ１３２ ｃｅｌｌ）を含む器官内組織細胞などを使用できる。
分化した細胞にエネルギーを提供する場合、所定の強さで露出させることが好ましく、この範囲を脱する場合、細胞生存率が減少できる。
【0019】
したがって、培養培地と分化した細胞の混合物に対する超音波処理は、出力強度０．５Ｗ／ｃｍ２〜３Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間、より具体的に、出力強度０．７Ｗ／ｃｍ２〜２Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間、より具体的に、出力強度０．８Ｗ／ｃｍ２〜１．５Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間行うことができる。培養培地と分化した細胞の混合物に対するレーザー処理は、３００〜９００ｎｍ波長帯域のパルス型レーザービームを１秒〜２０秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを３秒〜１０秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを４秒〜６秒間照射するものであることができる。前記波長帯域は、例えば４００ｎｍ、８０８ｎｍ、８８０ｎｍの波長を使用できる。
培養培地と分化した細胞の混合物に対する熱処理は、４０〜５０℃の温度条件で１分〜１０分間露出した後、０℃〜４℃の温度条件で５〜１０秒間露出して行うことができる。
【0020】
次に、エネルギーが提供された混合物を一定時間培養し、多能性を有するスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成させる。エネルギーが提供された混合物の培養は、浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）又は単層培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）方式を通じて未分化マーカーを安定的に発現するスフェロイドが形成される期間、すなわち３日〜１０日間行うことができる。但し、前記培養時間は、培養方式、細胞又は培養培地の種類によって多能性を有するスフェロイド形成可否が異なるため、当業者の水準で適宜調節され得る。
【0021】
本発明の一具体例によれば、浮遊培養は、単層培養に比べてさらに高いスフェロイド形成効率を示す。また、浮遊培養は、単層培養に比べてスフェロイドの数とサイズがさらに大きくて、一定のサイズ分布を示す。
【0022】
本発明の一具体例によれば、超音波又はレーザー処理されたヒト皮膚線維芽細胞の浮遊培養時に、略３日目から未分化マーカーの発現が増加するか又は安定化され、この時期から逆分化が始まるものと認められる。また、熱処理されたヒト皮膚線維芽細胞の浮遊培養時に、略８日目から未分化マーカーの発現が増加するか又は安定化され、この時期から逆分化が始まるものと認められる。
【0023】
未分化マーカー、例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０などが発現されることを通じて、スフェロイドが多能性を有することを確認できる。未分化マーカーの確認は、ＲＴ−ＰＣＲ又は免疫細胞化学法により分析できるが、特にこれに制限されるものではない。
【0024】
また、本発明の多能性細胞は、３胚葉マーカー、すなわち外胚葉（ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ）、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ）、内胚葉（ＧＡＴＡ４、ＡＦＰ）マーカーを高い水準に発現する特徴を示す。また、本発明の多能性細胞は、増殖マーカータンパク質であるＫｉ−６７を発現し、増殖能を有する特徴がある。
また、前記の逆分化した多能性細胞を栄養細胞と共培養する場合、多能性細胞の増殖が増加し、分化誘導培地で培養後、外胚葉／内胚葉／中胚葉及び神経細胞／心筋細胞に分化することを確認できる。
【0025】
本発明は、また、細胞及び培養培地を収容できる培養チャンバーと、前記培養チャンバーの一側に配置され、前記細胞及び培養培地にエネルギーを提供できる装置と、を含み、分化した細胞と培養培地を混合し、前記混合物にエネルギーを提供し、一定時間培養を通じてスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成し、前記スフェロイドは、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）特性を有するものである、多能性細胞誘導装置を提供する。前記培養チャンバーは、通常、細胞培養に使用される培養器を意味する。例えば、培養チャンバーは、温度制御部と二酸化炭素制御部が具備されていて、培養チャンバー内の細胞培養条件は、目的と細胞の種類によって当業者の水準で適宜調節され得る。
また、前記培養チャンバーは、分化した細胞から多能性細胞に逆分化させるに際して、浮遊培養又は単層培養方式を使用でき、このような培養が可能な構造よりなることが好ましい。例えば、浮遊培養のための撹拌器が具備された培養チャンバーであることができる。
【0026】
前記エネルギーを提供できる装置は、超音波を照射できる超音波発生装置、レーザーを照射できるレーザー発生装置又は温度調節装置を含むことができる。前記超音波発生装置は、周波数が１０ｋＨｚ〜１００ＭＨｚである超音波を発生する公知の超音波装置であれば、制限なしに使用できる。
前記レーザー発生装置は、３００〜９００ｎｍ波長帯域のパルス型レーザービームを発生し、１〜１５Ｗ出力で、パルス持続時間が１ｍｓ〜９００ｍｓであり、周波数が１〜１００Ｈｚであるレーザー装置を使用できるが、特にこれに制限されるものではない。
温度調節装置は、−４０℃〜９９．９℃範囲の温度調節が可能な公知の温度調節装置を使用できるが、特にこれに制限されるものではない。
【0027】
本発明の多能性細胞誘導装置は、培養培地と分化した細胞の混合物に前記超音波発生装置、レーザー発生装置又は温度調節装置を利用して超音波、レーザー又は熱処理し、一定時間培養を通じて多能性を有するスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成することによって、分化した細胞から多能性細胞に逆分化させることができる。この際、逆分化効率を高めるために、培養培地を分化した細胞と混合する前に、培養培地に超音波、レーザー又は熱処理をあらかじめ行うことができる。
【0028】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0029】
〈実施例１〉Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の製造図１は、本発明のＰｈｙｓｉｃｓ（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｐｈｅｒｅ ｙｉｅｌｄｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓｔｉｍｕｌｕｓ）細胞形成を示す模式図であり、５Ｗ／ｃｍ２の強度で１０分間超音波処理したＥＳ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ）培地にヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ−０１３−５Ｃ、ＧＩＢＣＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ））（１×１０６）を混ぜ、細胞を含む混合物に超音波を５秒間１Ｗ／ｃｍ２の強度で処理した。生きている細胞を選別した後、３５ｍｍ細菌用ペトリディッシュで２×１０５のＨＤＦをヒトＥＳ培養培地で６日間浮遊培養した。
培養１日目からスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）が形成され、３日後から未分化マーカーが発現される。
【0030】
〈実験例１〉スフェロイド形成の最適条件実験ヒト皮膚線維芽細胞は、超音波処理時、スフェロイドを形成するので、スフェロイド形成効率を高めるための最適条件を確立するために、超音波処理条件、細胞培養方式などを異ならしめて、実験を行った。
細胞培養方式は、細胞培養ディッシュの表面がコーティングされていないディッシュ（細菌用ペトリディッシュ）で培養する浮遊培養（Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）と、細胞培養ディッシュの表面がコーティングされ、細胞が表面によく付くディッシュ（組織培養ディッシュ）で培養する単層培養（Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）を使用した。
【0031】
また、対照群として、何らの処理をしないグループ（Ｎｕｌｌ）、培地に超音波を処理したグループ（ＵＭ：Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｅｄｉａ、５Ｗ／ｃｍ２の超音波強度で１０分間処理）、細胞に超音波を処理したグループ（ＵＣ：Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ Ｃｅｌｌ、１Ｗ／ｃｍ２の超音波強度で５秒間処理）、及び細胞と培地に超音波を全部処理したグループ（ＵＣＵＭ：ＵＭ＋ＵＣ）に分け、培養時間による細胞形態の変化を観察し、スフェロイドの数を測定し、培養時間によるスフェロイド数とサイズの変化を分析することによって、スフェロイド形成効率を確認した。実験対象細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞である。
【0032】
まず、超音波強度条件を確立するために、超音波強度（５秒間０、０．５、１、３、５、１０Ｗ／ｃｍ２）別にＨＤＦ（１×１０６）に直接的に露出させた。生きている細胞を選別した後、３５ｍｍ細菌用ペトリディッシュで２×１０５のＨＤＦをヒトＥＳ培養培地で６日間培養した。
【0033】
【表1】
【0034】
図２ａの（ａ）に示されたように、０．５、１及び３Ｗ／ｃｍ２の超音波強度で、超音波処理された大部分のＨＤＦは、自発的に凝集され、多細胞スフェロイドを形成した。対照群は、ディッシュの表面に付着しているが、５及び１０Ｗ／ｃｍ２強度の超音波が処理されたＨＤＦは、スフェロイド形成なしに、細胞死滅が増加した。図２ａの（ｂ）は、図２ａの（ａ）で超音波強度別に生成された多細胞スフェロイドの数を示すものである。
１Ｗ／ｃｍ２の超音波強度で生きている／死んだ細胞分析及びイメージ分析結果、図２ｂの（ｃ）及び（ｄ）に示されたように、２５％の細胞が部分的に損傷を受け、９５％以上の細胞生存能が維持された。しかし、１Ｗ／ｃｍ２より高い超音波強度で、ＨＤＦは、深刻に損傷を受け、細胞死滅に至った。
したがって、１Ｗ／ｃｍ２の固定された超音波強度条件で、露出時間（０、１、２、５、１０、２０、４０秒）を異ならしめて、３５ｍｍ細菌用ペトリディッシュでヒトＥＳ細胞培養培地で３日間培養した。
【0035】
図３ａ及び図３ｂの（ａ）〜（ｄ）に示されたように、超音波に５秒間露出させた場合、生成されたスフェロイドの数は、他の露出時間に比べて最も高かった。しかし、１０秒以上露出した場合、細胞死滅が極的に増加したが、これは、細胞膜の損傷から起因したものと認められる。次に、ＥＳ細胞培養培地に超音波露出強度（０、１、５、１０Ｗ／ｃｍ２）を異ならしめて、１０分間処理した。３５ｍｍ細菌用ペトリディッシュで超音波露出した２×１０５ＨＤＦ（１Ｗ／ｃｍ２、５秒）をこれら培地で３日間培養した。
【0036】
図４に示されたように、１Ｗ／ｃｍ２より５Ｗ／ｃｍ２の超音波処理された培養培地で約２倍のスフェロイドが発生した。露出時間（０、５、１０、２０分）の変化は、スフェロイド形成効率に対して有意的な効果を示さなかった。一般的に、短い露出時間が一定のサイズ範囲とさらに多い数を引き起こした（図５）。
【0037】
次に、培養条件を異ならしめたとき、スフェロイド形成効果を調査するために、ＥＳＣ培養培地に超音波を処理し（５Ｗ／ｃｍ２、１０分）、ＨＤＦ（１×１０６）に超音波を処理した（１Ｗ／ｃｍ２、５秒）。生きているＨＤＦ（×１０５）を選別した後、細菌用ペトリディッシュで浮遊培養するか、又は、組織培養ディッシュで単層培養を行った。
【0038】
図６に示されたように、浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）された超音波処理されたＨＤＦは、単層培養されたものと比べて、さらに高いスフェロイド形成効率を示した。また、超音波の刺激を細胞及び培養培地の両方に加えたとき、さらに高いスフェロイド形成効率を示した。浮遊培養又は単層培養の下で超音波刺激別に生成された多細胞性スフェロイドのサイズ分布を観察するために、超音波処理されたＨＤＦ又は非処理ＨＤＦを細菌用ペトリディッシュ又は組織培養ディッシュで超音波処理又は非処理されたＥＳ培養培地で培養した。
【0039】
図７及び図８に示されたように、二つの培養ディッシュで、ＨＤＦ及び培養培地の両方が超音波処理されるとき（ＵＣＵＭ）、さらに高いスフェロイド形成効率が観察された。また、浮遊培養条件は、さらに高い効率を示し、スフェロイドは、数とサイズ面において大きくて（２００μｍ以上の直径）、単層培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）条件より一定のサイズ分布を示す。
【0040】
非処理されたＥＳ細胞培養培地で成長した超音波処理されたＨＤＦ（ＵＣ）は、スフェロイドを形成した。しかし、ＵＣＵＭ条件と比べて、スフェロイドの数とサイズ（２００μｍまで）は、非常に低い。超音波処理されたＥＳ細胞培地で正常ＨＤＦ培養（ＵＭ）結果、サイズが小さい（１００μｍ以下）少量のスフェロイドが形成された。組織培養ディッシュを利用した単層培養のＵＣ及びＵＭ条件は、スフェロイド形成効率が非常に低かった。大部分のＨＤＦは、培養ディッシュ表面に付着しており、スフェロイド数は、非常に小さい。
【0041】
また、浮遊培養又は単層培養の下で超音波刺激別に生成された多細胞性スフェロイドの培養時間別に代表的な未分化遺伝子の発現を分析するために、前記実施例１の方法によって対照群及び超音波処理されたグループ（Ｎｕｌｌ、ＵＭ、ＵＣ、ＵＣＵＭ）の細胞を培養時間（１、２、３、４、５及び６日）別に回収し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ ｄｉｒｅｃｔ ｋｉｔ（ａｍｂｉｏｎ）を利用してｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ−ＩＩ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）ｃＤＮＡを合成した後、表２に記載されたプライマーを使用してＰＣＲで増幅し、電気泳動し、分析した。ＲＴ−ＰＣＲを通じて分析した結果、図９でＨＤＦ及び培養培地の両方が超音波処理されるとき（ＵＣＵＭ）、未分化マーカー遺伝子の発現が安定的に発現され、特に浮遊培養した場合が単層培養細胞に比べてさらに高く現われた。
【0042】
培養環境による未分化属性のスフェロイド形成差異を確認するために、浮遊培養又は単層培養の下で未分化マーカーであるＯＣＴ３／４発現水準を比較した。このために、超音波処理後、培養時間（０、１、２、３、４、５及び６日）の間に培養された細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、抗体の浸透能力を向上させるために、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００が添加されたＰＢＳバッファーに４０分間露出させた後、非特異的なタンパク質反応を防止するために、５％ｎｏｎ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍが添加されたＰＢＳバッファーで３０分間室温でブロッキング過程を行った。その後、細胞を洗浄した後、それぞれの１次抗体（ＯＣＴ４；１：２００、ａｂｃａｍ）を入れ、４℃で一晩反応させ、０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ１００が添加されたＰＢＳバッファーで３回洗浄後、２次抗体（ＩｇＧ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｌｅｘａ ４８８）をＤ−ＰＢＳバッファーでそれぞれ１：１０００で希釈し、２時間室温で染色した。染色された細胞は、０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ１００が添加されたＰＢＳバッファーを使用して４回洗浄した後、スライドにＤＡＰＩが添加されたマウンティング溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌ．）を噴霧し、カバースリップで覆い、マニキュアで角部を密封した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【0043】
図１０に示されたように、おもしろくも、ＵＣＵＭ条件で超音波処理１日後直ちにＯＣＴ３／４発現が検出された。ＯＣＴ３／４発現は、徐々に増加し、浮遊培養条件は、単層培養条件よりさらに高い発現水準を示した。
【0044】
次に、浮遊培養でＵＣＵＭ条件の下でスフェロイド培養６日間、６種の未分化マーカー遺伝子であるＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＴＤＧＦ１、ｃ−ＭＹＣ及びＫＬＦ４をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果、図１１のように、処理後、１日にＯＣＴ３／４とＮＡＮＯＧ遺伝子発現が増加し、その後、他の遺伝子の発現も、培養時間が経過するにつれて、増加するものと現われ、すべてのマーカー遺伝子の発現が２日に観察されたが、安定的な発現は、３日後に観察された。最初のＯＣＴ３／４発現時点は、超音波処理１０時間後直ちに検出された（図１２）。
【0045】
Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の未分化能力を確認するために、４種の無作為に選別されたスフェロイドにおいてのＲＴ−ＰＣＲ結果、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１、ＴＤＧＦ１、ＦＯＸＤ３、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＥＳＧ１、ＬＩＮ２８ａ、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣを含む多能性マーカー遺伝子の発現を確認し、ヒトＨ９ＥＳＣ及び正常ＨＤＦと比較した（図１３）。実験は、５日培養されたｐｈｙｓｉｃｓ細胞を回収し、Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）ｓｍＲＮＡ ｄｉｒｅｃｔ ｋｉｔ（ａｍｂｉｏｎ）を利用してｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ−ＩＩ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）ｃＤＮＡを合成した後、表２に記載されたプライマーを使用してＰＣＲで増幅し、電気泳動し、分析した。
【0046】
【表2】
【0047】
アルカラインフォスファターゼ（ＡＰ）染色結果、多細胞スフェロイドの多能性状態の特徴を示すものと確認した。浮遊培養されたスフェロイドは、単層培養されたスフェロイドより明らかな赤色を示す（図１４）。ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０の発現は、Ｈ９ヒトＥＳ細胞と類似していた（図１５）。また、多細胞スフェロイドの多能性特性は、フローサイトメトリーを通じて確認した（図１６）。ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ−６０の９９．５％以上がスフェロイドで発現され、各発現水準は、Ｈ９ヒトＥＳ細胞と類似していた。
【0048】
また、スフェロイドを移し、マウス胚芽線維芽細胞（ＭＥＦ）栄養細胞とゼラチンコーティングされた組織培養プレートで共培養（ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ）したとき、細胞スプレッディングと成長が観察された。また、多能性マーカー遺伝子の発現が相変らず維持された（図１７）。
【0049】
また、未分化マーカーの発現をさらに確認するために、ＤＮＡメチル化分析を行った。遺伝子発現が始まるプロモーター部分がメチル化されると、当該部分で遺伝子発現されないことが分かり、脱メチル化された場合、すなわちＤＮＡでメチル基が脱落した場合、当該部分の遺伝子が発現されることを意味する。したがって、ＥＳ細胞の主要遺伝子である未分化幹細胞主要遺伝子であるＯＣＴ３／４とＮＡＮＯＧ遺伝子発現が起きているかを、二つの遺伝子のプロモーター部分のメチル化可否を調べた。
【0050】
このために、ＰｈｙｓｉｃｓスフェロイドからＤＮＡをｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋとフェノールを利用して抽出した後、ＥＺ ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅａｓｅｒｃｈ）を利用してＰｈｙｓｉｃｓスフェロイドのＯＣＴ３／４とＮＡＮＯＧ ＤＮＡメチル化を分析した。分析に利用したＤＮＡ増幅用プライマーは、次の通りである。１）ヒトＮＡＮＯＧ増幅用プライマー：
正方向プライマー：５’−ＴＡＧＧＡＧＴＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＴＴＡ−３’
逆方向プライマー：５’−ＡＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＴＡＡＴＣ−３’
増幅産物のサイズ：３７７ｂｐ、Ｔｍ：５５、産物でＣｐＧｓ：６
２）ヒトＯＣＴ４増幅用プライマー：
正方向プライマー：５’−ＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＧ−３’
逆方向プライマー：５／−ＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣ−３’
増幅産物のサイズ：４１７ｂｐ、Ｔｍ：５５、産物でＣｐＧｓ：４
【0051】
バイサルファイトゲノムシケーンシングにより評価される多能性特異ＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧ遺伝子のプロモーター領域においてサイトシングアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）のメチル化は、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞がＥＳ細胞と類似に高度で脱メチル化されるが、オリジナルＨＤＦ細胞においてこの領域のＣｐＧジヌクレオチドは、低い脱メチル化が認められる（図１８）。これらの結果は、ＯＣＴ３／４とＮＡＮＯＧプロモーターは、超音波処理により活性化されることを示唆する。
【0052】
〈実施例２〉Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の増殖能及び多分化能力Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の増殖能は、増殖マーカータンパク質であるＫｉ−６７免疫染色方法及びヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）とプロピジウムアイオダイド （ＰＩ）を利用した時間差細胞核染色を通じて評価した。
【0053】
図１９に示されたように、５日目に、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞でＫｉ−６７の発現が検出された。これより、さらに確かな証明のために、次のような方法を通じて細胞増殖を確認した。侵透性が良くて、生きている細胞の核に染色が可能なＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用して５日目に培養されたＰｈｙｓｉｃｓ細胞を染色し、染色試薬を完全に除去後、３日間培養してから、総８日間培養されたＰｈｙｓｉｃｓ細胞を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した後、さらにＰＩで細胞核を染色した。重複されない赤色信号は、５日後、細胞分裂により新しく形成されたＰｈｙｓｉｃｓ細胞を意味する。また、動画を通じて単一スフェロイドを５日間培養し、スフェロイド直径を測定した結果、サイズの増加を通じてＰｈｙｓｉｃｓ細胞の増殖能を立証する。
【0054】
Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の自己再生能力を評価するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色されたＰｈｙｓｉｃｓ細胞をさらに５日間培養してから、４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した後、ＰＩ及びＯＣＴ３／４でさらに染色した。ＰＩ信号は、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞内の核を意味する。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２とほぼ合併されたＯＣＴ３／４で対比染色された核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２が５日前にＰｈｙｓｉｃｓ細胞を染色したことを意味する。
【0055】
図２０に示されたように、追加培養の５日間、多能性特性（ＯＣＴ３／４）が娘Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞に伝達されなかった。これら結果は、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞が増殖することができるが、５日後、自己再生をしないことを意味する。また、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の初期培養時期の間に、各胚葉で特異マーカー遺伝子の発現を発見した。未分化した及び分化したマーカーの両方を発現するＰｈｙｓｉｃｓ細胞の独特な遺伝子発現パターンは、ヒトＥＳＣに由来するＥＢと比較できる（図２１）。なぜならば、それらの形態が非常に類似しているからである。
【0056】
免疫細胞化学分析結果、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞とＥＢは、内胚葉（ＧＡＴＡ４及びＡＦＰ）、外胚葉（ＰＡＸ６及びＮｅｓｔｉｎ）、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＳＭＡ）のマーカーを高く発現した。ＯＣＴ３／４以外にも、ＰＡＸ６の発現も、超音波処理後１日目にすぐ検出された。３胚葉の他の遺伝子の発現は、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の生成後３日目に始まった。培養１５日間、３胚葉マーカーの発現水準は、徐々に増加した。しかし、ＯＣＴ３／４発現は、８日後、減少した（図２２）。
【0057】
〈実施例３〉超音波刺激による細胞変化Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞発生中に、ＨＤＦへの超音波刺激の効果を評価するために、超音波条件別に比較した。超音波処理後及び超音波処理されたＨＤＦの２時間培養後、直接的にＳＥＭ分析を行った。
図２３に示されたように、複数の細胞膜の気孔がＵＣ及びＵＣＵＭ条件の両方で発生した。たぶんＨＤＦが超音波に直接的に露出したからであると認められる。しかし、ＵＭ条件でＨＤＦは、細胞膜を通過するどんな気孔発生も示さなかった。これは、培養培地にのみ超音波を処理することは、細胞膜の損傷に十分でないからである。特に、細胞培養の２時間後に生成された気孔は、ＵＣ及びＵＣＵＭ条件の両方で消えた。これらの結果は、超音波刺激は、細胞死滅を誘導するほどに深刻なことでないが、細胞膜の一時的な透過を誘導するには十分であり、その後、初期細胞培養時期の間に、損傷された細胞膜が回復されることを示唆する。
【0058】
損傷された細胞膜の回復過程は、また、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄキットを利用して細胞膜の損傷がないものは、（緑色蛍光）／死ぬか又は細胞膜の損傷がある細胞は、（赤色蛍光）分析によって立証された。ＨＤＦ細胞に超音波処理直後及び２時間が経過した後、蛍光試薬で染色した結果、２時間後、赤色蛍光の比率が減少することから見て、ＳＥＭ分析結果と同様に、２時間後、超音波による細胞膜の損傷が回復されるものと現われた（図２４）。また、試薬を超音波刺激を受けた細胞とスフェロイド形成の連関性を確認するために、超音波処理されたＨＤＦにｌｉｖｅ／ｄｅａｄキットを付加し、緑色／赤色の二重染色されたＨＤＦは、生きている細胞イメージング装置を利用して２４時間追跡した。
【0059】
図２５に示されたように、ＨＤＦは、ただ緑色又は赤色／緑色の二重で染色された他のＨＤＦと凝集し、多細胞スフェロイドを形成した。２４時間後、大部分の若干損傷されたＨＤＦは、安定したＰｈｙｓｉｃｓ細胞を形成した。また、超音波誘導された細胞膜の損傷及び一時的な透過は、それぞれ、蛍光染料Ｆｌｕｏ−４染料及びＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを使用して増加した細胞内Ｃａ２＋濃度及び細胞内Ｈ２Ｏ２生産によって特徴を示した。超音波を露出し次第に、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞のＣａ２＋濃度が急に増加してから、１５０秒に減少した（図２６）。Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞で細胞内Ｈ２Ｏ２の濃度は、未処理対照群ＨＤＦと比べて、超音波露出６０分後、６倍さらに高かった（図２７及び図２８）。
さらに、ＡＴＰが多様な細胞性ストレスに対する反応において信号として利用されるため、細胞外に放出されたＡＴＰの濃度を分析した。
【0060】
図２９に示されたように、超音波は、未処理ＨＤＦに比べてＰｈｙｓｉｃｓ細胞でＡＴＰの２２倍さらに多い放出を刺激した。イオノトロピック型Ｐ２Ｘ受容体及び代謝型Ｐ２Ｙ受容体は、ＡＴＰ放出によって発現が活性化されものと知られていて、これら受容体の発現を比較した。
【0061】
Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞においてＰ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２及びＰ２Ｙ１１のさらに高い発現が検出された（図３０）。Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の向上した細胞吸収は、さらに、Ａｌｅｘａ−７０５標識された量子点（ＱＤ７０５）を利用して確認した。ＱＤ７０５を培養ディッシュに付加し、２４時間後、共焦点顕微鏡イメージを得た。
【0062】
スフェロイドタイプ内Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞及び隣合う単一Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞と凝集しない単一細胞タイプが両方ともＱＤ７０５を吸収した。しかし、正常ＨＤＦは、ＱＤ７０５を吸収しなかった（図３１）。これは、外部の要素の細胞吸収が超音波刺激によって向上させることを立証するものである。
【0063】
なお、エキソソームＲＮＡは、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞培養培地から用意し、ＲＴ−ＰＣＲ分析を通じてＰｈｙｓｉｃｓ細胞の発生中に細胞培養環境の遺伝子発現パターンを研究した。一般的に、エキソソームは、複数の遺伝子要素、例えば、ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質を含む。また、エキソソームにおいて遺伝子要素の発現プロファイルは、細胞状態依存的である。
【0064】
図３２に示されたように、多能性マーカー遺伝子の高い発現がＰｈｙｓｉｃｓ細胞培養培地から精製されたエキソソームで観察された。最も顕著な遺伝子発現は、ＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧであった。培養時間が進行されるにつれて、ＯＣＴ３／４発現は、顕著に増加した。ＮＡＮＯＧ発現は、４日後に低下した。ｃ−ＭＹＣ発現は、浮遊培養条件で一定であるが、単層培養条件で２日後に減少した。すべての多能性マーカー遺伝子、例えば、ＲＥＸ１、ＴＤＧＦ１、ＦＯＸＤ３、ＵＴＦ１、ＬＩＮ２８の発現は、たとえそれらの発現水準が低いが、浮遊培養条件で検出された。しかし、これらの遺伝子は、単層培養条件では検出されなかった。これらの結果は、超音波処理されたＨＤＦのうち遺伝子要素の伝達可能性を示唆する。
【0065】
この仮説を立証するために、超音波−未処理されたＨＤＦをＰｈｙｓｉｃｓ細胞と共培養した。イメージング分析のために、リポフェクタミンによりＣｙ５．５赤色蛍光染料をＨＤＦで感染させた。Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞は、別に生成され、２日維持後、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞をＣｙ５．５−感染されたＨＤＦ培養ディッシュに付加した。共培養中に、培養培地に超音波を処理しなかった。これは、ＵＭ条件も多能性マーカー遺伝子発現を誘導できるからである。共焦点顕微鏡イメージは、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞との共培養中に、Ｃｙ５．５感染されたＨＤＦからＯＣＴ３／４発現が観察された。ＯＣＴ３／４発現は、Ｃｙ５．５感染されたＨＤＦ単独培養では、検出されなかった。これらの結果は、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の多能性特性が隣合う正常細胞に伝達され、その後、正常細胞のＰｈｙｓｉｃｓ細胞へのリプログラミングを強く立証する。一般的に、細胞において遺伝子要素伝達にエキソソームが参加する（図３３）。
【0066】
〈実施例４〉Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞のインビトロ分化インビトロ分化のために、５日培養されたＰｈｙｓｉｃｓ細胞をゼラチンがコーティングされた組織培養ディッシュに移した。移した細胞は、特異分化培地を利用して神経又は心臓系への分化を誘導した。前記特異分化培地は、表３の通りである。分化誘導後、８日になった細胞で３胚葉の主要タンパク質（ＧＡＴＡ４、ＡＦＰ、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ）が発現された（図３４）。
【0067】
【表3】
【0068】
【表4-1】
【表4-2】
【0069】
図３５及び図３６に示されたように、１〜２週分化時期の間に、遺伝子１７（ＳＯＸ１７、内胚葉）、ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ６（ＰＡＸ６、外胚葉）、Ｎｅｓｔｉｎ（神経細胞マーカー）、ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＭＡＰ２、外胚葉）、ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｂｅｔａ−ｔｕｂｕｌｉｎ（ＴｕＪ１、神経細胞マーカー）、ｍｓｈ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １（ＭＳＸ１、中胚葉）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉）、ｍｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ７（ＭＹＬ７、心筋細胞）、ＮＫ２ ｈｏｍｅｏ ｂｏｘ ５（ＮＫＸ２．５、心筋細胞）、及びＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｔｔｙｐｅ ２（ＴｎｎＴ２、心筋細胞）を含むＳＲＹ−ｂｏｘの発現がＲＴ−ＰＣＲにより観察された。特に、ＯＣＴ３／４の発現が分化誘導後に有意に減少した。
神経又は心臓細胞への分化は、また、免疫細胞化学によって確認された。
【0070】
図３７〜図３９に示されたように、星状細胞培地で成長したＰｈｙｓｉｃｓ細胞で神経前駆細胞マーカー（ＰＡＸ６及びＮｅｓｔｉｎ）が観察された。これらの分化したＰｈｙｓｉｃｓ細胞は、星状細胞培地を希突起膠細胞培地又はニューロン培地に替えた後、２週間追加分化が誘導されたとき、それぞれ希突起膠細胞マーカー（ＭＡＰ２及びＯ４）又はニューロンマーカー（ＭＡＰ２及びＴｕｊ１）の発現が観察された。分化時期の２週は、ＭＨＣ、ＳＭＡ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＮＫＸ２．５及びＴｎＴｃを含む心臓マーカーを検出するのに十分であった。特に、典型的な分節されたアクチンパターンがアクチニンで検出された。しかし、同じ培養条件の下で、ＨＤＦは、何らの神経又は心臓マーカーを発現しなかった。
【0071】
〈実施例５〉安定性検査超音波は、突然変異、遺伝子変形、癌発生などの好ましくない副作用を誘導しなかった。Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞は、正常核型を持っていた（図４０）。
【0072】
〈実施例６〉Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞のインビボ分化能評価Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞のインビボ分化能力を評価するために、５日培養されたＰｈｙｓｉｃｓ細胞を４〜５週齢の欠乏マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ｍｏｕｓｅ）の精巣と股筋肉に１×１０６細胞を注入し、４週間飼育後、精巣と筋肉を回収し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、冷凍切片（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）し、Ｈｕｍａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ染色を通じて注入した細胞の位置を把握し、多様な増殖及び分化関連タンパク質マーカー（Ｋｉ６７、ＣＤ４４、ＳＭＡ）を染色し、注入された細胞の分化有無を確認した。
【0073】
図４１で、精巣に注入されたＰｈｙｓｉｃｓ細胞は、４週後、精巣内の血管内皮細胞で観察され、Ｋｉ６７染色を通じて増殖されていることを確認し、矢印で表示した細胞から分かるように、血管内皮細胞マーカーであるＣＤ４４が染色されたことを確認した。マウス股に注入された細胞は、筋肉繊維層の外部であるラミナ層で発見され、筋肉タンパク質マーカーであるＳＭＡ染色が施されたことを確認した（図４２）。このような結果は、体内に注入されたＰｈｙｓｉｃｓ細胞が周辺細胞と環境に合わせて分化したことを示唆するものである。
【0074】
〈実施例７〉細胞培養培地の効果Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞を発生させるために、ヒトＥＳ細胞培養培地を使用した。ＥＳ細胞培養培地は、未分化状態でＥＳ細胞を維持及び繁殖するための制限培地として開発された。細胞培養培地の効果を調査するために、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞を発生させるために、正常ＨＤＦ培養培地を使用した。
【0075】
図４３の（ａ）及び（ｂ）に示されたように、ＥＳ細胞培養培地と比べて、形態及びスフェロイド形成効率は、非常に相異した。超音波処理されたＨＤＦ培地でシーディングした後、１日目に、多細胞スフェロイドは、少量形成された。しかし、２日後、多数のスフェロイドは、ディッシュ表面に付着していた。培養４日目に、すべてのスフェロイドは、ディッシュ表面に付着し、典型的な線維芽細胞形態で成長した。免疫細胞化学結果も、二つの種類の異なる培養培地条件間の異なる遺伝子発現パターンを示した。ＥＳ細胞培養培地を利用して発生した典型的なＰｈｙｓｉｃｓ細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ−４、及びＴＲＡ−１−６０の高い発現水準を示した。ＤＭＥＭ培地は、未分化マーカー遺伝子及び３胚葉マーカー遺伝子発現を誘導するためのどんな効果も認められなかった。これら結果は、スフェロイド形成及び特異マーカー遺伝子の発現が細胞培養培地の成分と密接に関連していることを示唆するものである。
【0076】
〈実施例８〉細胞株の効果Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞発生方法が他の細胞株に適用できるか、今後の臨床適用に適用できるかを評価するために、ＨｅＬａ細胞、Ｌ１３２ヒト肺上皮細胞及び患者由来皮膚線維芽細胞のような他の細胞株を利用してＰｈｙｓｉｃｓ細胞発生を照射した。
【0077】
図４４の（ａ）〜（ｃ）に示されたように、２種の細胞株も、超音波の直接的な露出後、細菌用ペトリディッシュで超音波処理されたＥＳ細胞培養培地で培養された後、多細胞スフェロイドを形成した。おもしろくも、ＨＤＦから生ずるＰｈｙｓｉｃｓ細胞と比べて、２種の細胞株から生じた新しいＰｈｙｓｉｃｓ細胞の形態及びサイズ分布は、非常に相異する。ＨｅＬａ細胞由来のＰｈｙｓｉｃｓ細胞のサイズ分布は、非常に一貫性がなく、サイズは、非常に大きかった。Ｌ１３２細胞由来のＰｈｙｓｉｃｓ細胞は、さらに複雑であり、凝集された形態を示した。各スフェロイドは、さらに融合され、板のような構造を形成した。
【0078】
図４４の（ｂ）及び（ｃ）に示されたように、２種の異なるＰｈｙｓｉｃｓ細胞からＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ４、及びＴＲＡ−１−６０を含む多能性マーカー及びＧＡＴＡ４、ＡＦＰ、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、及びＳＭＡを含む３胚葉マーカー遺伝子の発現は、免疫細胞化学によって確認された。また、患者皮膚細胞を利用した実験結果でも、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞のようなスフェロイドを形成し、多能性マーカー及び３胚葉マーカーの発現が免疫細胞化学によって確認された（図４５）。
これらの結果は、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞発生を誘導する超音波刺激が多様な細胞株に適用され得ることを強く立証し、患者細胞を利用した自己細胞治療の可能性を示す。
【0079】
〈実施例９〉他のエネルギー源提供の効果追加的な外部刺激をＨＤＦ及びＥＳ細胞培養培地に加えて、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の発生機作を確認及び評価した。
超音波処理の代わりに、レーザー処理を用いてＰｈｙｓｉｃｓ細胞が形成されるかを確認した。このために、超音波処理に使用されたヒト皮膚線維芽細胞を同一に使用し、レーザー処理条件は、Ｏｃｌａ治療用レーザー（Ｎｄｌｕｘ）を使用して、８０８ｎｍのレーザーを５秒間照射した後、培養した。
熱処理のために、皮膚線維芽細胞を４２℃に２分間露出させた後、アイスで約５秒間静置した。
【0080】
図４６及び図４７に示されたように、ＨＤＦ及びＥＳ細胞培養培地の両方にレーザー又は熱処理後、多細胞スフェロイドが成功的に発生した。レーザー処理されたＨＤＦは、また、レーザー誘導後、多細胞スフェロイドを直ちに形成した。たとえスフェロイドの形態が不規則的であり、サイズ分布が均一でないが、多能性マーカー及び３胚葉マーカーの高い水準の発現が観察された。熱処理も、スフェロイド形成を誘導した。しかし、効率は、超音波及びレーザー処理より低かった。維持８日間、熱により誘導された多細胞スフェロイドの半分以上がディッシュ表面に付着した。さらに低いスフェロイド形成効率にもかかわらず、多能性マーカー及び３胚葉マーカーの高い発現水準が観察された。これらの結果は、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の発生が物理的刺激と密接に関連していることを強く立証するものである。
【0081】
〈実施例１０〉マウスＰｈｙｓｉｃｓ細胞の製造図４８に示された過程によってマウスＰｈｙｓｉｃｓ細胞を製造した。このために、２０ＫＨｚ超音波を５Ｗ／ｃｍ２の強度で１０分間処理したＥＳ培地にＯＧ２マウスＭＥＦ（Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ；マウス胚芽線維芽細胞）を混ぜ、該細胞に直接的に超音波を５秒間１Ｗ／ｃｍ２の強度で処理し、培養した。培養された細胞は、１、３、５、８及び１０日間隔で蛍光顕微鏡で細胞の形態変化とＧＦＰ蛍光の発現を観察した。超音波処理のための培地組成は、表１の通りである。
前記ＭＥＦ細胞は、ＯＣＴ４プロモーターが挿入されたＧＦＰ遺伝子を形質転換させたマウスの１３．５日になった胚芽の線維芽細胞であって、一般的に、ＯＣＴ４が発現されない細胞であるが、もしＯＣＴ４が発現されると、ＧＦＰが発現され、緑色蛍光が認められる。
【0082】
図４９のＡで、対照群は、ＯＧ２ＭＥＦ細胞写真を示す図であって、緑色蛍光が現われなかった（ＯＣＴ４発現がない）。しかし、超音波を処理したＯＧ２ＭＥＦの場合、培養時間が経過するほど、細胞球体のサイズが増加し、緑色蛍光の強度が強くなることが分かる。これは、超音波処理がＯＣＴ４発現を誘発したことを意味し、ＯＣＴ４は、未分化幹細胞の主な特徴であって、これは、超音波処理によってＯＧ２ＭＥＦ細胞が幹細胞に逆分化することが分かる結果である。図４９のＢは、Ｔｉｌｅ ｓｃａｎ写真であって、広い範囲を複数枚の写真を撮って結合した写真を示す図であって、超音波処理効果を示す結果であり、多数のＭＥＦ細胞が超音波処理による逆分化でＯＣＴ４−ＧＦＰを発現し、図５０で生成されたスフェロイドのＧＦＰ発現効率を分析した結果、約９３％程度のＯＣＴ４−ＧＦＰ発現効率が現われ、フローサイトメトリーを利用して全体細胞においてのＧＦＰ発現を確認した結果、約８５．３％の細胞でＧＦＰが発現され、細胞表面において未分化タンパク質マーカーであるＳＳＥＡ１の発現を分析した結果でも、約７５．５％の発現が現われた（図５１）。このような結果は、超音波による逆分化効率が非常に高いことを示唆する。
【0083】
次に、下記表５に示されたプライマーセットを使用して代表的なマウス胚芽幹細胞（ＥＳｃ）の未分化マーカー遺伝子とタンパク質マーカー（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ１）の発現をＲＴ−ＰＣＲと細胞免疫化学法で確認した。
【0084】
図５２及び図５３に示されたように、マウスＰｈｙｓｉｃｓ細胞において未分化マーカーが発現されることを確認した。また、アルカラインフォスファターゼ染色を通じて確認した（図５４）。
【0085】
【表5】
【0086】
【表6】
【0087】
３胚葉マーカーを確認した結果、ｍＰｈｙｓｉｃｓは、内胚葉（ＧＡＴＡ６）、外胚葉（Ｎｅｓｔｉｎ）、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）のマーカーを高く発現した。３胚葉の他の遺伝子の発現は、Ｐｈｙｓｉｃｓ細胞の生成後、３日目に始まった。培養２０日間、３胚葉マーカーの発現水準は、徐々に増加した（図５５）。また、図５６で、免疫染色を通じて３胚葉タンパク質マーカーの発現が確認された。
【0088】
また、マウス細胞において超音波により形成されたｍＰｈｙｓｉｃｓ細胞は、正常核型を持っていた（図５７）。
【産業上の利用可能性】
【0089】
本発明の多能性細胞は、細胞治療剤分野において使用され得る。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16a】
【図16b】
【図16c】
【図17a】
【図17b】
【図18】
【図19a】
【図19b】
【図19c】
【図20】
【図21a】
【図21b】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44a】
【図44b】
【図44c】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]