特許 6987157 男性型脱毛標的遺伝子の発現を抑制する非対称ｓｉＲＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6987157

(24)【登録日】2021年12月2日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】男性型脱毛標的遺伝子の発現を抑制する非対称ｓｉＲＮＡ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20211213BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20211213BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/113 140Z

   A61K48/00ZNA

   A61P17/14

   A61K31/713

【請求項の数】7

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2019-566555(P2019-566555)

(86)(22)【出願日】2018年2月21日

(65)【公表番号】特表2020-508699(P2020-508699A)

(43)【公表日】2020年3月26日

(86)【国際出願番号】KR2018002103

(87)【国際公開番号】WO2018155890

(87)【国際公開日】20180830

【審査請求日】2019年10月7日

(31)【優先権主張番号】10-2017-0022909

(32)【優先日】2017年2月21日

(33)【優先権主張国】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】514298162

【氏名又は名称】オリックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｏｌｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100090251

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 憲一

(72)【発明者】

【氏名】ホン ソンウ

(72)【発明者】

【氏名】ファン ジヘ

【審査官】 馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５２４０３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１１−００４９７３３（ＫＲ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０５８６８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ １７／１４

Ａ６１Ｋ ３１／７１３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号６７３のアンドロゲン受容体（Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＡＲ）をコードする遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合し、
配列番号５００、５０６、及び５３８からなる群から選ばれるセンス鎖及び該センス鎖と相補的な１９ｎｔ以上のアンチセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖は、配列番号６１８、６２４、及び６５６からなる群から選ばれ、
前記センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端はブラント末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）を形成することを特徴とするｓｉＲＮＡ。

【請求項2】

前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖は一つ以上の化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項3】

前記化学的修飾は、次に構成された群から選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ：
ヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）、−ＯＣＨ_３（メトキシ）、−ＮＨ_２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル（ｐｒｏｐｙｌ）、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピルに置換；
ヌクレオチド内の糖（ｓｕｇａｒ）構造の酸素が硫黄に置換；
ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、又はメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）で修飾；
ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）又はＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への修飾；及び
コレステロール又は細胞侵入ペプチド結合。

【請求項4】

前記化学的修飾は、ヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）に置換、ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で修飾、又はコレステロール結合であることを特徴とする、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項5】

センス鎖の５’末端又は３’末端ヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）に置換される修飾；
センス鎖又はアンチセンス鎖のうち２個以上のヌクレオチド内の糖構造２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）に置換される修飾；
センス又はアンチセンス鎖において２５％以上のヌクレオチド結合がホスホロチオエートで修飾；及び
センス鎖の３’末端にコレステロール結合；
からなる群から選ばれる一つ以上の修飾を含むことを特徴とする、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項6】

ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖が下記表：

から選ばれ、センス鎖及びアンチセンス鎖の組合せが、
Ｎｏ．１とＮｏ．２との組合せ、
Ｎｏ．１とＮｏ．３との組合せ、
Ｎｏ．１とＮｏ．４との組合せ、
Ｎｏ．５とＮｏ．６との組合せ、
Ｎｏ．５とＮｏ．７との組合せ、
Ｎｏ．５とＮｏ．８との組合せ、
Ｎｏ．９とＮｏ．１０との組合せ、
Ｎｏ．９とＮｏ．１１との組合せ、
Ｎｏ．９とＮｏ．１２との組合せ
からなる群から選ばれる、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡを含む、脱毛予防又は治療用の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、男性型脱毛標的遺伝子の発現を抑制する非対称ｓｉＲＮＡ及びその用途に関し、詳しくは、ＳＲＤ５Ａ１（３−ｏｘｏ−５−ａｌｐｈａ−ｓｔｅｒｏｉｄ ４−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）遺伝子、ＳＲＤ５Ａ２（３−ｏｘｏ−５−ａｌｐｈａ−ｓｔｅｒｏｉｄ ４−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）遺伝子又はＡＲ（Ａｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子の発現を抑制する非対称ｓｉＲＮＡ及び該非対称ｓｉＲＮＡを含む脱毛予防又は治療用の組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

人間の毛髪は毛嚢から生える。毛嚢には毛乳頭があるが、毛乳頭には小さな血管が分布して毛髪の成長に必要な営養分を供給し、毛乳頭側面の上端には毛髪を保護するために皮脂を分泌する皮脂腺が分布している。毛乳頭は毛髪の成長を調節する部位であり、男性型脱毛において男性ホルモンが作用する部位でもある。毛乳頭における調節によって細胞分裂が起きる部位が毛基質であり、毛髪を生成する部位である。

【0003】

男性脱毛の主要因子は、ホルモンの異常に起因したものである。思春期になると性ホルモンが活発に分泌され、第２次性徴が現れる。このような変化は、性ホルモンであるアンドロゲン（男性ホルモン）とエストロゲン（女性ホルモン）によるものである。アンドロゲンは眉毛以下の体毛を発育させ、エストロゲンは主に毛髪の成長を促進する。男性において脱毛は、アンドロゲンが過剰分泌され、過剰分泌されたアンドロゲンがエストロゲンの作用を抑制することに起因する。

【0004】

具体的に、男性ホルモンによる男性脱毛機転と関連して５アルファ−還元酵素（Ｓｔｅｒｏｉｄ ５−ａｌｐｈａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が関与するが、５アルファ−還元酵素は、男性ホルモンであるテストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）をＤＨＴ（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）に還元させる主要酵素である。変換されたＤＨＴはアンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して毛嚢において毛の成長を調節し、皮脂腺の増殖に関与するものと知られている。

【0005】

アンドロゲン受容体は男性ホルモン（アンドロゲン）受容体であり、テストステロンとＤＨＴのいずれにも結合できるが、ＤＨＴに一層強い結合力を示すものと知られている。５アルファ−還元酵素及びアンドロゲン受容体が抑制されると、毛髪成長因子が増加して毛髪の成長を誘導することが知られており、逆に、５アルファ−還元酵素及びアンドロゲン受容体が活性化されると、毛髪の成長を抑制して脱毛が発生することが知られている（Ｃｈｈｉｐａ，ＲＲ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，７３：１４８３，２０１３； Ａｚｚｏｕｎｉ，Ｆ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｕｒｏｌｏｇｙ，２０１２：１８，２０１２； Ｗｉｎｉａｒｓｋａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９：３１１，２００６）。

【0006】

５アルファ−還元酵素には１型及び２型の２種類がある。５アルファ−還元酵素１型は皮膚全般、特に皮脂腺に主に分布し、２型は毛嚢の毛乳頭（Ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ）周囲及び外毛根鞘（Ｏｕｔｅｒ ｒｏｏｔ ｓｈｅａｔｈ）に主に分布する。薬物開発の初期には、２型の５アルファ−還元酵素だけを標的とする脱毛治療剤が主に開発されたが、最近は、１型も毛髪の成長に影響を与えることが知られ、５アルファ−還元酵素１型及び２型を全て抑制する治療剤を開発中である。

【0007】

このうち、５アルファ−還元酵素２型を抑制する薬物としてはフィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）を挙げることができる。フィナステリドは、もとは陽性前立腺肥大症の治療剤として開発されたが、薬物を服用した患者から毛髪成長促進が確認され、男性型脱毛治療剤としてＦＤＡと韓国食品医薬品安全処に承認された成分である。デュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）は５アルファ−還元酵素１型と２型を全て抑制する治療剤成分として知られている。アンドロゲン受容体に結合してＤＨＴの結合を妨害する拮抗剤として働く薬物を抗アンドロゲン薬物といい、このような抗アンドロゲン薬物としては、シメチジン（Ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ）、スピロノラクトン（Ｓｐｉｒｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）、フルタミド（Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、酢酸シプロテロン（Ｃｙｐｒｏｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）などが知られている。

【0008】

ただし、このような治療剤成分は、性機能障害、疲労感の訴えなどの問題点があり、妊娠可能年齢の女性への使用が制限される。妊産婦に露出されたとき、胎児の奇形を誘発しうる。したがって、このような副作用がない脱毛治療剤の開発が必要な現状である。

【0009】

このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、ＳＲＤ５Ａ１（３−ｏｘｏ−５−ａｌｐｈａ−ｓｔｅｒｏｉｄ ４−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）遺伝子、ＳＲＤ５Ａ２（３−ｏｘｏ−５−ａｌｐｈａ−ｓｔｅｒｏｉｄ ４−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）遺伝子又はＡＲ（Ａｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを用いて副作用の低いＲＮＡｉ新薬を開発して目的する脱毛の防止又は治療効果を示し得ることを確認し、本発明を完成した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の目的は、ＳＲＤ５Ａ１をコードする遺伝子、ＳＲＤ５Ａ２をコードする遺伝子又はＡＲをコードする遺伝子に特異的に抑制する非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｈｏｒｔｅｒ ｄｕｐｌｅｘ ｓｉＲＮＡ；ａｓｉＲＮＡ）を提供することにある。

【0011】

本発明の他の目的は、前記非対称ｓｉＲＮＡを含む脱毛予防又は治療用の組成物、又は脱毛の予防又は治療方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記の目的を解決するために、本発明は、ＳＲＤ５Ａ１（３−ｏｘｏ−５−ａｌｐｈａ−ｓｔｅｒｏｉｄ ４−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）をコードする遺伝子のｍＲＮＡ、ＳＲＤ５Ａ２（３−ｏｘｏ−５−ａｌｐｈａ−ｓｔｅｒｏｉｄ ４−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）をコードする遺伝子のｍＲＮＡ又はＡＲ（Ａｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードする遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合し、１５ｎｔ〜１７ｎｔのセンス鎖及び該センス鎖と相補的な１９ｎｔ以上のアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端はブラント末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）を形成することを特徴とするｓｉＲＮＡを提供する。

【0013】

本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡを含む脱毛予防又は治療用の組成物を提供する。

【0014】

本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡを個体に投与する段階を含む脱毛予防又は治療方法を提供する。

【0015】

本発明はまた、脱毛予防又は治療のための前記ｓｉＲＮＡの用途を提供する。

【0016】

本発明はまた、脱毛予防又は治療用薬剤の製造のための前記ｓｉＲＮＡの使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１Ａ及び図１Ｂは、ＳＲＤ５Ａ１を標的とする１００種の配列に対するａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。ＨｕＨ−７細胞に各塩基配列を標的とするａｓｉＲＮＡを０．３ｎＭ形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、２４時間後にｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＳＲＤ５Ａ１ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。グラフは、２回反復実験の平均とＳＤを示す。

【図2】ＳＲＤ５Ａ１を標的とする１２種の配列に対するａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。ＨｕＨ−７細胞に、各塩基配列を標的とするａｓｉＲＮＡ ０．３ｎＭ、１ｎＭ及び１０ｎＭをそれぞれ形質感染した後、４８時間後にウェスタンブロットを用いてＳＲＤ５Ａ１タンパク質の発現程度を測定した。

【図3】２回の反復実験によって、ＳＲＤ５Ａ１を標的とする様々な化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が付加された１２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。ＨｕＨ−７細胞に各塩基配列を標的とするｃｐ−ａｓｉＲＮＡを１ｕＭ又は３ｕＭインキュベーションした後、４８時間後にウェスタンブロットでＳＲＤ５Ａ１タンパク質の発現程度を測定した。

【図4】ＳＲＤ５Ａ１を標的とする様々な化学的修飾が付加された２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。ＨｕＨ−７細胞に各塩基配列を標的とするｃｐ−ａｓｉＲＮＡを０．３μＭ、１μＭ及び３μＭをそれぞれインキュベーションした後、２４時間後にリアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲを用いてＳＲＤ５Ａ１ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。グラフは、４回反復実験の平均とＳＤを示す。

【図5】図５Ａ及び図５Ｂは、ＳＲＤ５Ａ２を標的とする１１２種の配列に対するａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。ＨｕＨ−７細胞に各塩基配列を標的とするａｓｉＲＮＡを０．３ｎＭ形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、２４時間後にｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＳＲＤ５Ａ２ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。グラフは、２回反復実験の平均とＳＤを示す。

【図6】図６Ａは、ＳＲＤ５Ａ２を標的とする２３種の配列に対するａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。図６Ｂは、ＳＲＤ５Ａ２を標的とする６種の配列に対するａｓｉＲＮＡ及び４種の配列に対するａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。ＨｕＨ−７細胞に各塩基配列を標的とするａｓｉＲＮＡを３ｎＭ、１０ｎＭ形質感染した後、４８時間後にウェスタンブロットを用いてＳＲＤ５Ａ２タンパク質の発現程度を測定した。

【図7】２回の反復実験によってＳＲＤ５Ａ２を標的とする様々な化学的修飾が付加された１２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。ＨｕＨ−７細胞に各塩基配列を標的とするｃｐ−ａｓｉＲＮＡを１ｕＭインキュベーションした後、４８時間後にウェスタンブロットでＳＲＤ５Ａ２タンパク質の発現程度を測定した。

【図8】選定された２種のｃｐ−ａｓｉＳＲＤ５Ａ２に対する遺伝子抑制効率を示す結果である。ＨｕＨ−７細胞に各塩基配列を標的とするｃｐ−ａｓｉＲＮＡを１．９５ｎＭ濃度から１０００ｎＭまでの範囲でインキュベーションした後、２４時間後にＲＴ−ＰＣＲを用いてＳＲＤ５Ａ２ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。

【図9】選定された２種のｃｐ−ａｓｉＳＲＤ５Ａ２に対する遺伝子抑制効率を示す結果である。ＨｕＨ−７細胞に、各塩基配列を標的とするｃｐ−ａｓｉＲＮＡ ０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ及び３μＭをそれぞれインキュベーションした後、４８時間後にウェスタンブロットでＳＲＤ５Ａ２タンパク質の発現程度を測定した。

【図10】図１０Ａ及び図１０Ｂは、ＡＲを標的とする１１８種の配列に対するａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。Ａ５４９細胞に各塩基配列を標的とするａｓｉＲＮＡを０．３ｎＭ形質感染した後、２４時間後にｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＡＲ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。グラフは、２回反復実験の平均とＳＤを示す。

【図11】ＡＲを標的とする２０種の配列に対するａｓｉＲＮＡのタンパク質レベルにおける抑制効率を示す結果である。Ａ５４９細胞に各塩基配列を標的とするａｓｉＲＮＡを０．３ｎＭ形質感染した後、４８時間後にウェスタンブロットを用いてＡＲタンパク質の発現程度を測定した。３回反復実験を行った。

【図12】ＡＲを標的とする９種の配列に対するａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。Ａ５４９細胞に各塩基配列を標的とするａｓｉＲＮＡを０．１ｎＭ形質感染した後、４８時間後にｑＲＴ−ＰＣＲとウェスタンブロットを用いてそれぞれＡＲのｍＲＮＡとタンパク質の発現程度を測定した。

【図13】ＡＲを標的とする様々な化学的修飾が付加された９種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。Ａ５４９細胞に各塩基配列を標的とするｃｐ−ａｓｉＲＮＡを１μＭ又は３μＭインキュベーションした後、４８時間後にリアルタイムＰＣＲを用いてＡＲ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。グラフは、４回反復実験の平均とＳＤを示す。

【図14】ＡＲを標的とする様々な化学的修飾が付加された９種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示す結果である。Ａ５４９細胞に各塩基配列を標的とするｃｐ−ａｓｉＲＮＡを１μＭインキュベーションした後、４８時間後にウェスタンブロットアッセイを用いてＡＲタンパク質の発現程度を測定した。

【発明を実施するための形態】

【0018】

特に定義しい限り、本明細書で使う技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使う命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。

【0019】

本発明は、一観点において、配列番号６６９、６７０、又は６７１のＳＲＤ５Ａ１（３−ｏｘｏ−５−ａｌｐｈａ−ｓｔｅｒｏｉｄ ４−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）をコードする遺伝子のｍＲＮＡ、配列番号６７２のＳＲＤ５Ａ２（３−ｏｘｏ−５−ａｌｐｈａ−ｓｔｅｒｏｉｄ ４−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）をコードする遺伝子のｍＲＮＡ、又は配列番号６７３のＡＲ（Ａｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードする遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合し、１５ｎｔ〜１７ｎｔのセンス鎖及び該センス鎖と相補的な１９ｎｔ以上のアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端はブラント末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）を形成することを特徴とするｓｉＲＮＡに関する。

【0020】

男性型脱毛、例えばアンドロゲン性脱毛の標的遺伝子であるＳＲＤ５Ａ１をコードする遺伝子は、ＮＭ＿００１０４７．３、ＮＭ＿００１３２４３２２．１又はＮＭ＿００１３２４３２３．１のｍＲＮＡ受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）を有し、それぞれは配列番号６６９、配列番号６７０及び配列番号６７１の配列を含む。ＳＲＤ５Ａ２をコードする遺伝子は、ＮＭ＿０００３４８．３のｍＲＮＡ受託番号を有し、配列番号６７２の配列を含む。ＡＲをコードする遺伝子は、ＮＭ＿００１０１１６４５．２のｍＲＮＡ受託番号を有し、配列番号６７３の配列を含む。

【0021】

本発明におけるｓｉＲＮＡは、一般的なＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）作用を有する全ての物質を含む概念である。ＲＮＡｉは、１９９８年にＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓから最初に発見された細胞内遺伝子調節機作であり、作用機転は、細胞内に投入されたＲＮＡ二本鎖のうちのアンチセンス鎖が標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合することによって標的遺伝子分解を誘導することが知られている。そのうち、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、“ｉｎ ｖｉｔｒｏ”で遺伝子の発現を抑制する方法の一つである。１９ｂｐ〜２１ｂｐのｓｉＲＮＡは理論的に、殆どの遺伝子に対する選択的抑制が可能なため、癌、ウイルス性感染などの様々な遺伝子関連疾患治療剤として開発可能であり、最近に最も脚光を浴びている新薬開発候補技術である。哺乳動物に対してｓｉＲＮＡを用いた生体内治療を初めて試みたのは２００３年中半であり、それ以来、応用研究に対する多くの試みによって生体内治療に関して多数が報告された。

【0022】

ただし、可能性と違い、ｓｉＲＮＡの副作用及び短所も続いて報告されてきた。ＲＮＡｉベース治療剤を開発するには、１）効果的な伝達システムの不在、２）オフターゲット効果、３）免疫反応誘導、４）細胞内ＲＮＡｉ機構の飽和といった障壁を克服する必要性がある。ｓｉＲＮＡが標的遺伝子の発現を直接調節できる効果的な方法であるにも拘わらず、このような問題によって治療剤の開発に苦労している。これと関連して、本発明の出願人は、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｈｏｒｔｅｒ ｄｕｐｌｅｘ ｓｉＲＮＡ；ａｓｉＲＮＡ）構造関連技術を開発したことがある（ＷＯ２００９／０７８６８５）。ａｓｉＲＮＡは、従来のｓｉＲＮＡが持つ１９＋２構造に比べて短い二重らせん長を有する非対称ＲＮＡｉ誘導構造である。既存のｓｉＲＮＡ構造技術から確認されるオフ−ターゲット効果、ＲＮＡｉ機作の飽和、ＴＬＲ３による免疫反応などの問題点を克服した技術であり、これによって副作用の低いＲＮＡｉ新薬の開発が可能である。

【0023】

これに基づいて、本発明では１５ｎｔ〜１７ｎｔの長さを有するセンス鎖及び該センス鎖と相補的な１９ｎｔ以上のアンチセンス鎖を含む非対称ｓｉＲＮＡを提示することによって、本発明によるｓｉＲＮＡはオフ−ターゲット効果、ＲＮＡｉ機作の飽和、ＴＬＲ３による免疫反応などの問題を招かず、安定的に高い伝達効率を維持するとともに、目的する程度に有効に５α−還元酵素１型、５α−還元酵素２型、アンドロゲン受容体標的遺伝子に対する発現を抑制することができる。

【0024】

本発明においてセンス鎖は、ＳＲＤ５Ａ１、ＳＲＤ５Ａ２又はＡＲをコードする遺伝子と同じ核酸配列を有するポリヌクレオチドを意味し、１５ｎｔ〜１７ｎｔの長さを有する。一実施例において、前記センス鎖は１５ｎｔ、１６ｎｔ又は１７ｎｔの長さを有し得る。

【0025】

本出願の発明者らは、男性型脱毛において毛嚢の成長に必要なタンパク質合成を阻害し、毛乳頭を縮小させて脱毛誘発に主要な役割を果たす５α−還元酵素１型、５α−還元酵素２型、アンドロゲン受容体を標的遺伝子として選定した。各標的遺伝子に対する１００種以上のｓｉＲＮＡをスクリーニングし、抑制効率に優れたｓｉＲＮＡを選別した結果、配列番号５、６、１５、１８、４０、４８、４９、５９、６２、６９、７７、８６、２０５、２０８、２２８、２３１、２３２、２３３、２３７、２３８、２３９、２４０、２４２、２４８、２４９、２５９、２６０、２６２、２６５、２８３、２８４、２８５、２９１、２９２、３００、４７１、４７７、４９８、５００、５０２、５０３、５０５、５０６、５０７、５０９、５１０、５１５、５１７、５１８、５２１、５２４、５３４、５３８、５３９及び５４６からなる群から選ばれるセンス鎖及び該センス鎖と相補的なアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡは、ＳＲＤ５Ａ１、ＳＲＤ５Ａ２又はＡＲをコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現を有効に減少させることを確認した。

【0026】

具体的に、配列番号５、６、１５、１８、４０、４８、４９、５９、６２、６９、７７又は８６のセンス鎖及び該センス鎖と相補的なアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡは、ＳＲＤ５Ａ１をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現を減少させることができ、配列番号２０５、２０８、２２８、２３１、２３２、２３３、２３７、２３８、２３９、２４０、２４２、２４８、２４９、２５９、２６０、２６２、２６５、２８３、２８４、２８５、２９１、２９２又は３００のセンス鎖及び該センス鎖と相補的なアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡは、ＳＲＤ５Ａ２をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現を減少させることができ、配列番号４７１、４７７、４９８、５００、５０２、５０３、５０５、５０６、５０７、５０９、５１０、５１５、５１７、５１８、５２１、５２４、５３４、５３８、５３９又は５４６のセンス鎖及び該センス鎖と相補的なアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡは、ＡＲをコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現を減少させることができる。

【0027】

具体的に、配列番号４８、４９、６９、８６、２３１、２５９、２６０、２６２、４９８、５００、５０６、５０９、５１０、５１８、５３８、５３９及び５４６からなる群から選ばれるセンス鎖及び該センス鎖と相補的なアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡは、ＳＲＤ５Ａ１、ＳＲＤ５Ａ２又はＡＲタンパク質発現も有効に抑制することを確認した。

【0028】

前記センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端は、ブラント末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）を形成する。例えば、アンチセンス鎖の５’末端は、例えば１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ又は８ｎｔのオーバーハングを含むことができる。

【0029】

本発明においてアンチセンス鎖は、ターゲット遺伝子に相補的なポリヌクレオチドであり、１９ｎｔ以上、例えば２０ｎｔ以上、２１ｎｔ以上、２２ｎｔ以上、２３ｎｔ以上、２４ｎｔ以上、２５ｎｔ以上、２６ｎｔ以上、２７ｎｔ以上、２９ｎｔ以上、３０ｎｔ以上又は３１ｎｔ以上の長さを有する。一実施例において、前記アンチセンス鎖は１９ｎｔ〜２４ｎｔの長さ、例えば１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ又は２４ｎｔの長さを有することができる。前記アンチセンス鎖は非対称構造を考慮すると、センス鎖と一部分において相補的な配列を有することができる。

【0030】

前記アンチセンス鎖は、例えば、配列番号１０５、１０６、１１５、１１８、１４０、１４８、１４９、１５９、１６２、１６９、１７７、１８６、３１７、３２０、３４０、３４３、３４４、３４５、３４９、３５０、３５１、３５２、３５４、３６０、３６１、３７１、３７２、３７４、３７７、３９５、３９６、３９７、４０３、４０４、４１２、５８９、５９５、６１６、６１８、６２０、６２１、６２３、６２４、６２５、６２７、６２８、６３３、６３５、６３６、６３９、６４２、６５２、６５６、６５７、６６４からなる群から選ばれ得る。

【0031】

具体的に、配列番号１４８、１４９、１６９、１８６、３４３、３７１、３７２、３７４、６１６、６１８、６２４、６２７、６２８、６３６、６５６、６５７及び６６４からなる群から選ばれるアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡは、ＳＲＤ５Ａ１、ＳＲＤ５Ａ２又はＡＲタンパク質発現も有効に抑制することを確認した。

【0032】

場合によって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖は、一つ以上の化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことができる。

【0033】

一般のｓｉＲＮＡは、リン酸バックボーン構造による高い陰電荷及び高い分子量などによって細胞膜を通過できず、血液中で速く分解及び除去されるため、実際に標的部位にＲＮＡｉ誘導のための十分な量を伝達することは難しい。現在、ｉｎ ｖｉｔｒｏ伝達の場合、陽イオン脂質と陽イオンポリマーを用いた高い効率の伝達（ｄｅｌｉｖｒｙ）方法が多く開発されているが、ｉｎ ｖｉｖｏの場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏと同じ程度の高い効率でｓｉＲＮＡを伝達し難く、生体内に存在する様々なタンパク質との相互作用によってｓｉＲＮＡ伝達効率が減少するという問題点がある。

【0034】

そこで、本出願の発明者らは、非対称ｓｉＲＮＡ構造に化学的修飾を導入し、別の伝達ビークル無しに効果的であるとともに細胞内伝達ができる自己伝達能を持つａｓｉＲＮＡ構造体（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ａｓｉＲＮＡ：ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）を開発した。
前記センス鎖又はアンチセンス鎖において化学的修飾は、例えば、次に構成された群から選ばれる一つ以上を含むことができる：

【0035】

ヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）、−ＯＣＨ_３（メトキシ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル（ｐｒｏｐｙｌ）、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピルに置換；
ヌクレオチド内糖（ｓｕｇａｒ）構造の酸素が硫黄に置換；
ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、又はメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）で修飾；
ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）又はＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への修飾；及び
コレステロール又は細胞侵入ペプチド結合。

【0036】

一実施例において、前記化学的修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖においてヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ３（メチル）に置換、ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で修飾、又はコレステロール結合であり得る。これをよって、ｓｉＲＮＡの生体内安定性を向上させることができる。

【0037】

糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）に置換されるか、或いはヌクレオチド結合がホスホロチオエートに修飾されると、核酸分解酵素に対する抵抗性を高めることができ、コレステロール結合によって細胞膜と結合することにより、細胞内にｓｉＲＮＡの伝達を容易にさせることができる。

【0038】

具体的に、センス鎖の５’末端又は３’末端ヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ３（メチル）に置換される修飾；センス鎖又はアンチセンス鎖のうち２個以上のヌクレオチド内糖構造２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）に置換される修飾；センス鎖又はアンチセンス鎖において２５％以上のヌクレオチド結合がホスホロチオエートで修飾；及びセンス鎖の３’末端にコレステロール結合；からなる群から選ばれる一つ以上の修飾を含むことができる。

【0039】

ヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）に置換される修飾に関連して、センス鎖の５’末端に位置するヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）に置換され得る。また、センス鎖の５’末端から３’末端の方向に、糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）に置換された２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）が連続的又は非周期的に含まれ得る。前記センス鎖において２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）が非修飾ヌクレオシドと交互に含まれ得る。前記センス鎖において２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個の連続した２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドが非修飾ヌクレオシドと交互に含まれ得る。前記センス鎖において２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドが、例えば２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、２〜８個、又は８個存在し得る。

【0040】

前記アンチセンス鎖の５’末端から３’末端の方向に２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）が連続的又は非周期的に含まれ得る。前記アンチセンス鎖において２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）が非修飾ヌクレオシドと交互に含まれ得る。前記アンチセンス鎖において２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個の連続した２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドが非修飾ヌクレオシドと交互に含まれ得る。前記アンチセンス鎖において２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドが、例えば２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、２〜７個存在し得る。

【0041】

ヌクレオチド結合のホスホロチオエートへの修飾と関連して、センス鎖においてリボヌクレオチド間の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上がホスホロチオエートに修飾され得る。場合によって、センス鎖においてリボヌクレオチド間の結合全部（１００％）がホスホロチオエートに修飾され得る。

【0042】

前記アンチセンス鎖においてリボヌクレオチド間の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上がホスホロチオエートに修飾され得る。場合によって、アンチセンス鎖においてリボヌクレオチド間の結合全部（１００％）がホスホロチオエートに修飾され得る。

【0043】

他の観点において、本発明は、前記ｓｉＲＮＡを含む脱毛予防又は治療用の組成物に関する。

【0044】

本発明において治療は、組成物が投与された個体において脱毛の症状又は脱毛の深刻度が減少することを意味するか、悪化を防止することを意味し、場合によって、発毛が進行することを含み得る。本発明において予防は、脱毛の開始を防止する、脱毛の開始を遅延させる、或いは脱毛の発生可能性を減少させ得ることを意味する。

【0045】

前記組成物は、有効成分であるｓｉＲＮＡに加えて、薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能でなければならず、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールのいずれか１成分、又は２以上の成分を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化できる。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）した形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形の製造のために、本発明の属する技術分野に周知されている方法を用いることができ、凍結乾燥のための安定化剤が付加されてもよい。

【0046】

前記組成物の投与方法は、通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて、本技術分野における通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態で製剤化でき、単位−投与量又は多−投与量の容器、例えば密封したアンプル及び瓶などで提供されてもよい。

【0047】

組成物は、経口又は非経口投与が可能である。本発明による組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下又は局所投与が可能である。本発明による組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率又は疾病の重症度などに従って様々な範囲とすることができ、本技術分野における通常の専門家が容易に決定することができる。また、臨床投与のために公知の技術を用いて本発明の組成物を適切な剤形に製剤化することができる。

【0048】

さらに他の観点において、前記ｓｉＲＮＡを個体に投与する段階を含む脱毛の予防又は治療方法を提供する。

【0049】

さらに他の観点において、本発明は、脱毛予防又は治療のための前記ｓｉＲＮＡの用途に関する。

【0050】

さらに他の観点において、本発明は、脱毛予防又は治療用薬剤の製造のための前記ｓｉＲＮＡの使用に関する。

【0051】

本発明による予防又は治療方法に含まれる構成は、前述した発明に含まれる構成と同一であり、前述の説明は、予防又は治療方法にも同一に適用することができる。

【0052】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をさらに具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がそれらの実施例によって制限されないということは、当該技術の分野における通常の知識を有する者には明らかであろう。

【0053】

［実施例１］ＳＲＤ５Ａ１を標的とするＲＮＡｉ誘導二本鎖核酸分子１００種のスクリーニング
ＳＲＤ５Ａ１を標的とする高効率のＲＮＡｉ干渉を誘導する二本鎖の核酸分子を確保するために、ＳＲＤ５Ａ１遺伝子に対する標的配列の選定後にａｓｉＲＮＡをデザインした。ａｓｉＲＮＡ構造は一般に知られたｓｉＲＮＡと異なる構造を有するので、一般のｓｉＲＮＡデザインプログラムを用いてａｓｉＲＮＡの塩基配列をデザインする場合、最適化したａｓｉＲＮＡをデザインすることが多少困難である。したがって、ａｓｉＲＮＡは、次のような方法で作製した。ＮＣＢＩ ｄｂ検索によって男性型脱毛（アンドロゲン性脱毛）疾患の標的遺伝子であるＳＲＤ５Ａ１遺伝子情報を取得した（ｍＲＮＡ受託番号：ＮＭ＿００１０４７．３、ＮＭ＿００１３２４３２２．１、ＮＭ＿００１３２４３２３．１）。後で行う動物実験のために、マウスとの塩基配列相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を考慮した塩基配列を確保した後、ＧＣ含量３０〜６２％、４個以上のＧ、Ｃ連続配列は排除するなどのデザイン方法によって１００種のａｓｉＲＮＡをデザイン後に、ＯｌｉＸ社（韓国）で合成した。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを９５℃２分間、３７℃１時間インキュベーション過程を経てアニールし、１０％ＰＡＧＥ（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により、アニールされたａｓｉＲＮＡをＵＶトランスルミネーターで確認した。

【0054】

【表1】

【0055】

［実施例２］ＳＲＤ５Ａ１を標的とするＲＮＡｉ誘導二本鎖の核酸分子スクリーニング
ｍＲＮＡレベルで遺伝子抑制効率を確認するために、選定した１００種のａｓｉＲＮＡをＨｕＨ−７細胞株に０．３ｎＭ濃度で形質感染した後、ｑＲＴ−ＰＣＲを行ってＳＲＤ５Ａ１ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。

【0056】

ＨｕＨ−７細胞株はＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン条件で培養した。ＨｕＨ−７細胞を９６ウェルプレートに５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、ａｓｉＲＮＡ（０．３ｎＭ、ＯｌｉＸ社）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（１μｌ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総体積１００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ条件で、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供プロトコルに従ってリバーストランスフェクション（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）実験を行った。２４時間後にＴＯＹＯＢＯ ｓｕｐｅｒｐｒｅｐから提供する基本プロトコルに従ってＲＮＡ精製及びｃＤＮＡを合成し、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ−４０００機械でＳＲＤ５Ａ１ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｓ００６０２６９４＿ｍＨ）を用いてＳＲＤ５Ａ１遺伝子発現程度を確認し、その結果を図１Ａ及び図１Ｂに示した。

【0057】

１００種のａｓｉＲＮＡスクリーニング結果から、上位１２種（表１で、Ｎｏ．５、６、１５、１８、４０、４８、４９、５９、６２、６９、７７、８６）を選別して０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ濃度で処理した後、ウェスタンブロットを用いてタンパク質発現抑制効果を分析した。ＨｕＨ−７細胞を６ウェルプレートに２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した後、ａｓｉＲＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（１μｌ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総体積２ｍｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ条件で、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供プロトコルに従ってリバーストランスフェクション実験を行った。４８時間後にＭａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて細胞溶解（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）した後、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイでタンパク質を定量した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて各サンプルごとに１０μｇタンパク質を８０Ｖで２０分間、１２０Ｖで１時間電気泳動した後、ＰＶＤＥ膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）に、３００ｍＡで８０分間転写した。転写後に膜を５％スキームミルクで１時間ブロッキングした後、ＳＲＤ５Ａ１抗体（ＡＢｃａｍ，ａｂ１１０１２３）１：２０００で１２時間反応させた。翌日、抗ヤギＨＲＰ（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）１：１００００で１時間反応させた後、ＣｈｅｍｉＤｏｘ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＳＲＤ５Ａ１タンパク質発現程度を比較した。図２の結果から、ＳＲＤ５Ａ１タンパク質発現を抑制できる４種の（表１で、Ｎｏ．４８、４９、６９、８６）ａｓｉＲＮＡを選定した。

【0058】

［実施例３］ＳＲＤ５Ａ１遺伝子を標的とする細胞自己伝達能を持つ１６種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡ
ＳＲＤ５Ａ１を標的とする４種（表１でＮｏ．４８、４９、６９、８６）のａｓｉＲＮＡに２’ＯＭｅ（メチル）、ＰＳ（ホスホロチオエート結合）、コレステロールの個数及び位置によって３つの修飾パターンを持つＳＲＤ５Ａ１ ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ（総１６本鎖）をデザイン後、ＯｌｉＸ社（韓国）で合成した。ｃｐ−ａｓｉＲＮＡはエンドサイトーシス効率及び安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を高め、伝達ビークル（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）の援助なしにも高い効率で細胞膜を透過して標的遺伝子の発現を抑制することができる。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを９５℃２分間、３７℃１時間インキュベーション過程を経てアニールし、１０％ＰＡＧＥ（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により、アニールされたｃｐ−ａｓｉＲＮＡをＵＶトランスルミネーターで確認した。

【0059】

【表2】

【0060】

［実施例４］ＳＲＤ５Ａ１遺伝子を標的とする細胞自己伝達能を持つｃｐ−ａｓｉＲＮＡスクリーニング
上記の表２による１２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡを用いてＨｕＨ−７細胞株でＳＲＤ５Ａ１の発現抑制効果を確認した。ＨｕＨ−７細胞株に１２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地条件で１μＭ又は３μＭで２４時間インキュベーションした後、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン条件で培地を交換し、培地交換２４時間後に、タンパク質レベルでＳＲＤ５Ａ１発現を確認した。図３に示すように、２回の反復実験の結果、ＳＲＤ５Ａ１ ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ ＃４９（２，４）、＃８６（７，４）が５０％以上の遺伝子抑制効率を示すことを確認した。

【0061】

上で選別された２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡを用いてＨｕＨ−７細胞株でＳＲＤ５Ａ１の発現抑制効果を確認した。ＨｕＨ−７細胞株に２種のｃｐ−ａｓｉＲＮをＯｐｔｉＭＥＭ培地条件で０．３μＭ、１μＭ及び３μＭでそれぞれ２４時間インキュベーションした後、ｍＲＮＡレベルでＳＲＤ５Ａ１発現を確認した。４回の反復実験の結果、ＳＲＤ５Ａ１ ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ ＃４９（２，４）、＃８６（７，４）が１μＭ以上の濃度条件で５０％以上の遺伝子抑制効率を示すことを確認した（図４）。

【0062】

［実施例５］ＳＲＤ５Ａ２を標的とするＲＮＡｉを誘導する１１２種の二本鎖核酸分子のスクリーニング
ＳＲＤ５Ａ２を標的とし、高効率のＲＮＡｉ干渉を誘導する二本鎖の核酸分子を確保するために、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子に対する標的配列選定後にａｓｉＲＮＡをデザインした。ａｓｉＲＮＡ構造は一般に知られたｓｉＲＮＡと異なる構造を有するため、一般のｓｉＲＮＡデザインプログラムを用いてａｓｉＲＮＡの塩基配列をデザインする場合、最適化したａｓｉＲＮＡをデザインすることが多少難しい。したがって、ａｓｉＲＮＡは、次のような方法で行った。ＮＣＢＩ ｄｂ検索によって、男性型脱毛（アンドロゲン性脱毛）疾患を標的し得ると考えられるＳＲＤ５Ａ２遺伝子情報を取得した（ｍＲＮＡ受託番号：ＮＭ＿０００３４８．３）。後で行う動物実験を考慮して、マウスと８０％以上の相同性を示す塩基配列を確保した後、ＧＣ含量３０〜６２％、４個以上のＧ、Ｃ連続配列は排除するなどのデザイン方法で１００種のａｓｉＲＮＡをデザイン後に、ＯｌｉＸ社（韓国）で合成した。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを９５℃２分間、３７℃１時間インキュベーション過程を経てアニールし、１０％ＰＡＧＥにより、アニールされたａｓｉＲＮＡをＵＶトランスルミネーターで確認した。

【0063】

【表3】

【0064】

［実施例６］ＳＲＤ５Ａ２を標的とするＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子スクリーニング
ｍＲＮＡレベルで遺伝子抑制効率を確認するために、選定した１１２種のａｓｉＲＮＡをＨｕＨ−７細胞株に０．３ｎＭ濃度でトランスフェクションした後、ｑＲＴ−ＰＣＲを行ってＳＲＤ５Ａ２ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。ＨｕＨ−７細胞株は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン条件で培養した。ＨｕＨ−７細胞を２４ウェルプレートに５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ｓｉＲＮＡ（０．３ｎＭ，ＯｌｉＸ社）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（１μｌ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総体積５００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ条件で、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供プロトコルに従ってリバーストランスフェクション実験を行った。２４時間後にＴｒｉｚｏｌ（ＴａＫａＲａ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した後、Ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム機械でｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と下記のプライマーを用いてＳＲＤ５Ａ２遺伝子発現程度を確認した（図５Ａ及び図５Ｂ）。

【0065】

実験に用いたプライマー塩基配列は、次の表４の通りである。

【表4】

【0066】

１１２種のａｓｉＲＮＡスクリーニング結果から、上位２３種（表３でＮｏ．５、８、２８、３１、３２、３３、３７、３８、３９、４０、４２、４８、４９、５９、６０、６２、６５、８３、８４、８５、９１、９２、１００）を選別し、１０ｎＭ濃度でウェスタンブロット実験を行った。ＨｕＨ−７細胞を６ウェルプレートに２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した後、ａｓｉＲＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（１μｌ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総体積２ｍｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ条件で、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供プロトコルに従ってリバーストランスフェクション実験を行った。４８時間後にＭａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて細胞溶解をした後、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイでタンパク質を定量した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて各サンプルごとに１０μｇタンパク質を８０Ｖで２０分間、１２０Ｖで１時間電気泳動後、ＰＶＤＥ膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）に３００ｍＡで８０分間転写した。転写後に膜を５％スキームミルクで１時間ブロッキングした後、ＳＲＤ５Ａ２抗体（ＡＢｃａｍ，ａｂ１２４８７７）１：２０００で１２時間反応させた。翌日、抗ウサギＨＲＰ（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）１：１００００で１時間反応させた後、ＣｈｅｍｉＤｏｘ（ＢｉｏＲａｄ）を用いＳＲＤ５Ａ２タンパク質発現程度を比較した。この実験により、ＳＲＤ５Ａ２タンパク質発現を約５０％以上抑制できる４種の（表３で、Ｎｏ．３１、５９、６０、６２）ａｓｉＲＮＡを選定した（図６Ａ及び図６Ｂ）。

【0067】

［実施例７］ＳＲＤ５Ａ２遺伝子を標的とする細胞自己伝達能を持つ１６種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡ
ＳＲＤ５Ａ２を標的とする４種（表３でＮｏ．３１、５９、６０、６２）のａｓｉＲＮＡに２’ＯＭｅ（メチル）、ＰＳ（ホスホロチオエート結合）、コレステロール個数及び位置によって、３つの修飾パターンを持つＳＲＤ５Ａ２ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ（総１６本）をデザイン後、ＯｌｉＸ社（韓国）で合成した。ｃｐ−ａｓｉＲＮＡは、エンドサイトーシス効率及び安定性を高めるので、伝達ビークルの援助無しにも高い効率で細胞膜を透過して標的遺伝子の発現を抑制することができる。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを９５℃２分、３７℃１時間インキュベーション過程を経てアニールし、１０％ＰＡＧＥにより、アニールされたｃｐ−ａｓｉＲＮＡをＵＶトランスルミネーターで確認した。

【0068】

【表5】

【0069】

［実施例８］ＳＲＤ５Ａ２遺伝子を標的とする細胞自己伝達能を持つｃｐ−ａｓｉＲＮＡスクリーニング
上記の表５による１２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡを用いてＨｕＨ−７細胞株でＳＲＤ５Ａ２の発現抑制効果を確認した。ＨｕＨ−７細胞株に１２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地条件で１μＭ、３μＭで２４時間インキュベーションした後、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン条件で培地を交換し、培地交換２４時間後にタンパク質レベルでＳＲＤ５Ａ２発現を確認した。２回の反復実験の結果、ＳＲＤ５Ａ２ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ ＃５９（４，４）、＃６２（４，４）が５０％以上の遺伝子抑制効率を示すことを確認した（図７）。

【0070】

［実施例９］選定された２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡに対する標的遺伝子ＳＲＤ５Ａ２発現抑制効率の確認
上で選別された２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡを用いてＨｕＨ−７細胞株でＳＲＤ５Ａ２の発現抑制効果を確認した。ＨｕＨ−７細胞株に２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地条件で１．９５、３．９、７．８、１５．６、３１．３、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００（ｎＭ）で２４時間インキュベーションした後、ｍＲＮＡレベルでＳＲＤ５Ａ２発現を確認した。３回の反復実験の結果、ＳＲＤ５Ａ２ ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ ＃５９（４，４）、＃６２（４，４）がそれぞれ２２．３７ｎＭ、２７．１８ｎＭのＩＣ５０値を有することを確認した（図８）。

【0071】

上で選別された２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡを用いてＨｕＨ−７細胞株でＳＲＤ５Ａ２の発現抑制効果を確認した。ＨｕＨ−７細胞株に２種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地条件で０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ又は３μＭ濃度で２４時間インキュベーションした後、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン条件で培地を交換し、培地交換２４時間後にタンパク質レベルでＳＲＤ５Ａ２発現を確認した。２回の反復実験の結果、ｃｐ−ａｓｉＳＲＤ５Ａ２＃５９（４，４）、＃６２（４，４）の処理濃度が高くなるにつれて、標的とする遺伝子ＳＲＤ５Ａ２のタンパク質発現が減少することを確認した（図９）。

【0072】

［実施例１０］ＡＲを標的とするＲＮＡｉを誘導する１１８種の二本鎖核酸分子のスクリーニング
ＡＲを標的とする高効率のＲＮＡｉ干渉を誘導する二本鎖の核酸分子を確保するために、ＡＲ遺伝子に対する標的配列の選定後にａｓｉＲＮＡをデザインした。ａｓｉＲＮＡ構造は一般に知られたｓｉＲＮＡと異なる構造を有するので、一般のｓｉＲＮＡデザインプログラムを用いてａｓｉＲＮＡの塩基配列をデザインする場合、最適化したａｓｉＲＮＡをデザインすることが多少難しい。したがって、ａｓｉＲＮＡデザインは、次のような方法で行った。ＮＣＢＩ ｄｂ検索によって男性型脱毛（アンドロゲン性脱毛）疾患の標的遺伝子であるＡＲ遺伝子情報を取得した（ｍＲＮＡ受託番号：ＮＭ＿００１０１１６４５．２）。後で行う動物実験を考慮して、マウスと８０％以上の相同性を示す塩基配列を確保した後、ＧＣ含量３０〜６２％、４個以上のＧ、Ｃ連続配列は排除するなどのデザイン方法によって１００種のａｓｉＲＮＡをデザイン後、ＯｌｉＸ社（韓国）で合成した。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを９５℃２分間、３７℃１時間インキュベーション過程を経てアニールし、１０％ＰＡＧＥにより、アニールされたａｓｉＲＮＡをＵＶトランスルミネーターで確認した。

【0073】

【表6】

【0074】

［実施例１１］ＡＲを標的とするＲＮＡｉ誘導二本鎖核酸分子のスクリーニング
ｍＲＮＡレベルで遺伝子抑制効率を確認するために、選定した１１８種のａｓｉＲＮＡをＡ５４９細胞株に０．３ｎＭ濃度でトランスフェクションした後、ｑＲＴ−ＰＣＲを行ってＡＲ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。

【0075】

Ａ５４９細胞株はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン条件で培養した。Ａ５４９細胞を９６ウェルプレートに５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ｓｉＲＮＡ（０．３ｎＭ、ＯｌｉＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）とＲＮＡｉＭＡＸ（１μｌ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総体積１００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ条件でＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供プロトコルに従ってリバーストランスフェクション実験を行った。２４時間後に、ＴＯＹＯＢＯ ｓｕｐｅｒｐｒｅｐから提供する基本プロトコルに従ってＲＮＡ精製及びｃＤＮＡを合成し、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ−４０００機械でＡＲ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｔ）を用いてＡＲ遺伝子発現程度を確認した。１１８種のうち８８種に対してまずａｓｉＲＮＡスクリーニング実験を行い、標的遺伝子の発現を減少させる抑制効力を基準にして上位１３種（表６でＮｏ．４３、４９、６７、７０、７２、７４、７５、７７、７８、７９、８１、８２、８７）を選別し、選ばれた１３種は、残り３０種（表６でＮｏ．８８〜１１８）と２次ａｓｉＲＮＡスクリーニング実験を行った（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。

【0076】

２次のａｓｉＲＮＡスクリーニングを経て、標的遺伝子の発現を減少させる抑制効力を基準に上位２０種（表６でＮｏ．４３、４９、７０、７２、７４、７５、７７、７８、７９、８１、８２、８７、８９、９０、９３、９６、１０６、１１０、１１１、１１８）を選別し、選ばれた２０種を、タンパク質レベルにおけるＡＲ発現抑制効力を確認する実験を行った。Ａ５４９細胞を１２ウェルプレートに５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した後、ａｓｉＲＮＡ（０．３ｎＭ、ＯｌｉＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）とＲＮＡｉＭＡＸ（１μｌ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総体積１ｍｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ条件でＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供プロトコルに従ってリバーストランスフェクション実験を行った。４８時間後に、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で細胞溶解をした後、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイでタンパク質を定量した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて各サンプルごとに２０μｇタンパク質を８０Ｖで２０分間、１２０Ｖで１時間電気泳動後、ＰＶＤＥ膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）に３００ｍＡで１時間転写した。転写後に膜を５％スキームミルクで１時間ブロッキングした後、ＡＲ抗体（ＡＢｃａｍ，ａｂ１３３２７３）１：２０００で１２時間反応させた。翌日、抗ウサギＨＲＰ（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）１：５０００で１時間反応させた後ＣｈｅｍｉＤｏｘ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＡＲタンパク質発現程度を比較した。これにより、ＡＲタンパク質発現をより効果的に抑制できる上位９種（７０、７２、７８、８１、８２、９０、１１０、１１１、１１８）のａｓｉＲＮＡを選定した（図１１）。

【0077】

ａｓｉＲＮＡスクリーニングを経て標的遺伝子の発現を減少させる抑制効力を基準にして上位９種（表６でＮｏ．７０、７２、７８、８１、８２、９０、１１０、１１１、１１８）のａｓｉＲＮＡ候補を選別し、選ばれた９種をより低い濃度（０．１ｎＭ）で実験し、ｍＲＮＡとタンパク質レベルにおけるＡＲ発現抑制効力を確認する実験を行った。Ａ５４９細胞を１２ウェルプレートに５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに播種した後、ａｓｉＲＮＡとＲＮＡｉＭＡＸ（１μｌ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総体積０．５ｍｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ条件でＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供プロトコルに従ってリバーストランスフェクション実験を行った。４８時間後に、Ｔｒｉｚｏｌ（ＴａＫａＲａ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した後、Ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム機械でｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と下記の表７のプライマーを用いてＡＲ遺伝子発現程度を確認した。

【0078】

【表7】

【0079】

また、Ａ５４９細胞を１２ウェルプレートに５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した後、ａｓｉＲＮＡとＲＮＡｉＭＡＸ（１μｌ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総体積０．５ｍｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ条件で、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供プロトコルに従ってリバーストランスフェクション実験を行った。４８時間後に、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で細胞溶解をした後、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイでタンパク質を定量した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて各サンプルごとに２０μｇタンパク質を８０Ｖで２０分間、１２０Ｖで１時間電気泳動後にＰＶＤＥ膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で３００ｍＡで１時間転写した。転写後に、膜を５％スキームミルクで１時間ブロッキングした後、ＡＲ抗体（ＡＢｃａｍ，ａｂ１３３２７３）１：２０００で１２時間反応させた。翌日、抗ウサギＨＲＰ（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）１：５０００で１時間反応させた後、ＣｈｅｍｉＤｏｘ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＡＲタンパク質発現程度を比較した。選ばれた９種の実験の結果、０．１ｎＭ濃度でも効果的に７２、７８、１１０番が５０％レベルの遺伝子抑制効率を示すことを確認した（図１２）。

【0080】

［実施例１２］ＡＲ遺伝子を標的とする細胞自己伝達能を持つ９種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡ
ＡＲを標的とする３種のａｓｉＲＮＡに２’ＯＭｅ（Ｍｅｔｈｙｌ）、ＰＳ（ホスホロチオエート結合）、コレステロールの個数及び位置によって３つの修飾パターンを持つＡＲ ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ（総９種）をデザイン後、Ｄｈａｒｍａｃｏｎに合成を依頼した。ｃｐ−ａｓｉＲＮＡはエンドサイトーシス効率及び安定性を高めるので、伝達ビークルの援助なしにも高い効率で細胞膜を透過して標的遺伝子の発現を抑制することができる。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを９５℃２分間、３７℃１時間インキュベーション過程を経てアニールし、１０％ＰＡＧＥにより、アニールされたｃｐ−ａｓｉＲＮＡをＵＶトランスルミネーターで確認した。

【0081】

【表8】

【0082】

［実施例１３］ＡＲ遺伝子を標的とする細胞自己伝達能を持つｃｐ−ａｓｉＲＮＡスクリーニング
上記の表８による９種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡを用いてＡ５４９細胞株でＡＲの発現抑制効果を確認した。Ａ５４９細胞株に９種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地条件で１μＭ又は３μＭで２４時間インキュベーションした後、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン条件で培地を交換し、さらに２４時間経過後にｍＲＮＡレベルでＡＲの発現を確認した。４回の反復実験の結果、９種のＡＲ ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ ３μＭレベルで５０％レベルの遺伝子抑制効率を示すことを確認した（図１３）。

【0083】

同じ実験条件で９種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡを用いてＡ５４９細胞株でＡＲの発現抑制効果をタンパク質レベルで確認した。Ａ５４９細胞株に９種のｃｐ−ａｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地条件で１μＭ又は３μＭで２４時間インキュベーションした後、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン条件で培地を交換し、さらに２４時間経過後にＰｒｏｔｅｉｎレベルでＡＲの発現を確認した。このうち、＃７２（７，４）、＃７８（７，４）（４，４）（２，４）、＃１１０（７，４）（４，４）で１μＭレベルで無処理（ＮＴ）サンプルと１／２ＮＴサンプルの帯強度（ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を基準に５０％以上の標的遺伝子タンパク質発現の抑制効率を示した（図１４）。

【0084】

具体的な構成を参照して本発明を詳しく記載したが、このような記載は好ましい具現例に関するもので、発明の範囲を制限しないことは、当業者にとって明らかである。そこで、本発明の実質的範囲は、出願された請求項及びその等価物によって定義されるといえよう。

【産業上の利用可能性】

【0085】

男性型脱毛において毛嚢の成長に必要なタンパク質合成を阻害し、毛乳頭を縮小させて脱毛誘発に主要に働く５α−還元酵素１型、５α−還元酵素２型、アンドロゲン受容体をコードする遺伝子を標的遺伝子として選定し、これに対する抑制効率が高い非対称ｓｉＲＮＡを選別した。本発明によるｓｉＲＮＡは、高い伝達効率を有する上に、安定的に目的する程度に有効に５α−還元酵素１型、５α−還元酵素２型、アンドロゲン受容体標的遺伝子に対する発現抑制能を示すので、脱毛の予防又は治療剤に有用に用いることができる。

【0086】

以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施態様であり、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるべきといえよう。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]