特許 6987278 大腸癌のバイオマーカとしてのＢＭＭＦ１ ＲＥＰタンパク質の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6987278

(24)【登録日】2021年12月2日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】大腸癌のバイオマーカとしてのＢＭＭＦ１ ＲＥＰタンパク質の使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20211213BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20211213BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20211213BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20211213BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/574 A

   G01N33/53 P

   G01N33/53 D

   C12Q1/02

   !C07K16/18ZNA

【請求項の数】9

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2020-562839(P2020-562839)

(86)(22)【出願日】2019年1月25日

(65)【公表番号】特表2021-513658(P2021-513658A)

(43)【公表日】2021年5月27日

(86)【国際出願番号】EP2019051868

(87)【国際公開番号】WO2019149633

(87)【国際公開日】20190808

【審査請求日】2020年9月1日

(31)【優先権主張番号】18154190.5

(32)【優先日】2018年1月30日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】512113803

【氏名又は名称】ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム

(74)【代理人】

【識別番号】100110973

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 洋

(74)【代理人】

【識別番号】110002697

【氏名又は名称】めぶき国際特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅 俊男

(72)【発明者】

【氏名】ブント， ティモ

(72)【発明者】

【氏名】ツア ハウゼン， ハラルド

(72)【発明者】

【氏名】ド ヴェリエ， エセル−ミシェル

(72)【発明者】

【氏名】テスマー， クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】ハイケンヴェルダー， マティアス

(72)【発明者】

【氏名】ウェバー， アヒム

(72)【発明者】

【氏名】ブルク−ケルナー， アメリ

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１７−５２２８６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１９／１４９６３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１９−５３６００６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Corinna Whitley，Novel Replication-Competent Circular DNA Molecules from Healthy Cattle Serum and Milk and Multiple Sclerosis-Affected Human Brain Tissue，Genome Announcements，2014年，Vol.2 No.4，Page.e00849-14

【文献】 Kim Y. C. Fung，Blood-Based Protein Biomarker Panel for the Detection of Colorectal Cancer，PLOS ONE，2015年03月20日，Vol.10 No.3，Page.e0120425

【文献】 Timo Bund，Analysis of chronic inflammatory lesions of the colon for BMMF Rep antigen expression and CD68 macrophage interactions，Proc Nat Acad Sci USA，2021年，Vol.118 No.12，Page.e2025830118

【文献】 Turgay Kilic，Structural analysis of a replication protein encoded by a plasmid isolated from a multiple sclerosis patient，Acta Cryst，2019年，Vol.75 No.5，Page.498504

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５７４

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｃ０７Ｋ １６／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

大腸癌のバイオマーカとしての、牛肉及び牛乳因子グループ１（ＢＭＭＦ１）Ｒｅｐタンパク質の使用。

【請求項2】

前記Ｒｅｐタンパク質が、ＭＳＢＩ１ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）、ＭＳＢＩ２ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ）、ＣＭＩ１ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質（ＣＭＩ１ Ｒｅｐ）、ＣＭＩ２ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質（ＣＭＩ２ Ｒｅｐ）又はＣＭＩ３ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質（ＣＭＩ３ Ｒｅｐ）である、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

配列番号２又は配列番号３に含まれるエピトープに結合する抗Ｒｅｐ抗体によって、対象からのサンプル中のＲｅｐタンパク質を検出するステップを含む、前記対象における大腸癌（ＣＲＣ）の診断又は素因を提供するための方法。

【請求項4】

前記Ｒｅｐタンパク質に特異的な抗体が、配列番号１のアミノ酸１〜１３６、１３７〜２２９及び２３０〜３２４からなる群より選択されるアミノ酸配列内にあるエピトープに結合する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

対象からのサンプルが、癌性結腸組織、癌性結腸組織を取り囲む周囲組織及び良性結腸ポリープからなる群から選択される、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

さらに、ＣＤ６８陽性細胞が抗ＣＤ６８抗体によってサンプル中で検出される、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

配列番号２又は配列番号３に含まれるエピトープに結合する抗Ｒｅｐ抗体によって大腸癌患者の腫瘍周囲領域からのサンプル中のＲｅｐタンパク質を検出するステップと、各抗体について、大腸癌特異的患者生存時間の一般的指標として役立つ免疫組織学的スコアを提案する染色細胞の割合及び強度を決定するステップと、を含む大腸癌患者の生存時間に関する予後スコアを提供するための方法。

【請求項8】

配列番号１、８、１０〜１２及び１４で表される、牛肉及び牛乳因子グループ１（ＢＭＭＦ１）Ｒｅｐタンパク質、それらのフラグメント又はそれらの改変体からなる、大腸癌の診断又は素因を提供するためのバイオマーカ。

【請求項9】

配列番号２又は配列番号３に含まれるエピトープに結合する抗Ｒｅｐ抗体を含む大腸癌の診断試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、大腸癌（ＣＲＣ）のバイオマーカとしてのＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

世界中で何千人もの人々が結腸癌と診断されており、その多くは最終的にこの病気で死亡している。患者は典型的には結腸切除手術を受けた後、放射線療法又は全身化学療法を受け、この療法は腫瘍の肉眼的特性及び腫瘍ステージに基づいている。結腸外科的切除術後に化学療法を受けている一部の患者では無再発５年生存率が改善されるが、他の患者ではこの統計値は改善されない。

【0003】

大腸癌（ＣＲＣ）は、米国における癌死の第２の主要な原因である。大腸癌患者のほとんどは、予測バイオマーカの欠如及び現在のスクリーニング方法の不便さに起因するスクリーニング率の不良により、後期に診断される。より早期の検出を増強するために、早期の検出及びＣＲＣの病因へのさらなる洞察を容易にするバイオマーカが必要とされている。

【0004】

ＣＲＣは、結腸又は直腸における制御不能な細胞増殖の結果として進行したがんである。これらの悪性腫瘍は、遺伝的変化が正常から癌性増殖への移行を促進する既存の良性腺腫の結果として発症する可能性がある。エピジェネティックな事象は、この移行の重要なメカニズムとして認識されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

Ｆｕｎｇら、２０１５に記載されているような大腸癌の検出のための血液ベースのタンパク質バイオマーカパネルは、予測可能性に関して所望の結果を未だもたらしていない。したがって、残念ながら、予後及び診断の両方の目的のために使用され得るＣＲＣのバイオマーカは存在しない。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本出願において、本発明者らは、図１に示される結腸癌発生のモデルを作製した。

【0007】

本発明者らは、離乳期間中の牛乳製品による母乳栄養の代替、又は一般的に乳製品又は牛肉製品の摂取のいずれかによる生後１ヶ月以内のＢＭＭＦ（牛肉及び牛乳因子）剤の取り込みが、結腸におけるＢＭＭＦ抗原による新生児の早期感染につながることを見出した。母体の抗体（移行抗体）の減少と、しばしば観察される生後ごく初期の新生児の免疫寛容の誘導に関連した免疫系の弱さに基づき、これらの剤は結腸の免疫応答を直接逃れるか、又はこれらの剤に対する免疫寛容の状況が誘導されるかのいずれかであろう。その後数年から数十年のうちに、宿主の免疫系に依存して、結腸粘膜固有層内に蓄積するＢＭＭＦ抗原が増える。この蓄積はまた、ＢＭＭＦに対する受容体に相当する特定の分子の取り込みによって誘発され得る。これらの分子は牛の産物の消費によっても取り込まれ、宿主細胞表面の受容体に代謝される。感染の限局的拡散と共に、ＢＭＭＦの持続的な取り込みによって一定レベルの抗原量に到達すると、宿主免疫応答は慢性及び局所炎症の状態を誘導し、活性酸素種（ＲＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２）の安定した増加を生じ、これはＲＯＳによって誘導された周囲の細胞におけるランダムな突然変異の同時固定を伴う脱調節細胞増殖の確率を劇的に増加させる。

【0008】

Ｋｉ６７（Ｋｉ６７＝増殖マーカー）ＩＨＣ染色に基づく入手可能な結果は、特に陰窩の終点に近接して位置し、陰窩の遠位内腔部に向かって移動する上皮幹細胞に由来する基底上皮細胞が、結腸癌の腫瘍形成及び発生に対する基本的必要条件として突然変異の確率論的発現を可能にする本質的に高い増殖を特徴づけることを示している（図２）。したがって、ＢＭＭＦは固有層内の慢性炎症の誘発に対する特異的かつ局所的な誘因であり、ＲＯＳの増加を導き、それは周囲の上皮細胞における増殖及び突然変異を誘導し、結腸癌の前駆体としてポリープの形成を最終的に導く。

【0009】

詳細には、１１対のドナー組織サンプル（それぞれ腫瘍組織及び周囲組織）及び異なるドナーに由来する結腸ポリープ組織の４つのサンプルの選択物を、マウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体でのＩＨＣ染色に供した。１１個の腫瘍及び周囲サンプルに関して、１１個の組織のうち９個が、少なくとも２個の抗Ｒｅｐ抗体で強い特異的抗体染色を示した。例示的に、抗Ｒｅｐ抗体（例えば、抗体１０−３）による染色は、腫瘍ならびに周囲組織における組織サンプル４７９８、４７９９、４８０２、４８０６、４８０９及び４８１３におけるタンパク質標的の特異的検出を示す。一般に、染色強度は周囲組織の方が高く、周囲組織ではより小さなサイズの強く染色された細胞質集塊が結腸組織のリーベルキューンの特徴的なクリプト間の固有層内の細胞の明瞭な島内に集中している（全ての写真は陰窩の上皮細胞の環状配列の中心に結腸液に接触する陰窩の（内側の）内腔とリーベルキューンのクリプト全体に渡る切れ目を示している；図２）。腫瘍組織の染色はまた、主に腫瘍組織内の間質細胞の細胞質領域内で、より小さいサイズの凝集体の強い染色を示す。連続切断の染色に４種類の異なる抗Ｒｅｐ抗体を用いることにより、結腸ポリープの粘膜固有層にも同じ凝集体様構造が見える。結腸周囲組織及び結腸ポリープの両者ともに、最も高いＲｅｐ特異的抗体検出を有する領域は、ＣＤ６８陽性細胞について最も高い検出レベルを有する領域と相関する。これは、Ｒｅｐ特異的抗原の局在化が炎症性アイランド、すなわち、特に高レベルの炎症性単球、循環マクロファージ、又は組織マクロファージを有する領域と一致することを示している。

【0010】

本出願に追加的に示されるように、腫瘍周囲組織及び腫瘍組織のＲｅｐＩＲＳスコア（ＩＲＳ、免疫反応性スコア）の比較は、分析されたＣＲＣ患者の腫瘍周囲組織におけるＲｅｐ検出の有意な増加を確認する。

【0011】

本発明者らは、癌誘発のためには結腸陰窩間の粘膜固有層内のＢＭＭＦ抗原の量が慢性局所炎症の誘発に重要であり、拡散ＲＯＳ／ＮＯＳの誘発は最終的に、鍵となる突然変異の発現によって初期ポリープ／腫瘍前駆細胞に変わる可能性のある隣接陰窩の分裂幹細胞及び娘細胞においてランダムな突然変異を誘発すると結論した。したがって、腫瘍周囲のＢＭＭＦレベルとＣＤ６８陽性マクロファージの強度の相関が観察可能であるはずである。実際、対応するＣＲＣ患者内のＣＤ６８検出のためのＩＲＳ値に対するＲｅｐ検出のためのＩＲＳ値を試験することによって、Ｒｅｐ及びＣＤ６８検出の有意な相関が観察され、これは、Ｒｅｐのより高い検出レベルがＣＤ６８検出のより高いレベルと相関することを示す。

【0012】

患者の生存期間に対する、大腸癌患者の腫瘍周囲領域におけるＲｅｐ検出の予後スコアを検定するために、「Ｒｅｐ低値」と「Ｒｅｐ高値」にグループ化した患者データに基づいてカプラン・マイヤー曲線を算出した。大腸癌患者におけるＲｅｐ高値は、例えば、図１３と図１４に示すように、患者の全生存期間の有意な減少と相関する。実験はＲｅｐ検出と患者の生存の負の相関を示し、大腸癌組織におけるＲｅｐ検出の予後スコアを強調するハザード比４．７と相関することを示している。「Ｒｅｐ低値」とスコア化された患者は５年及び１０年生存確率が９２％であるのに対し、「Ｒｅｐ高値」の患者は５年後７４％、１０年後６５％と有意に生存確率が低下し、２０〜３０％の減少を示している。

【0013】

本発明者らはまた、Ｒｅｐタンパク質が検体中に存在する任意のこのような抗体に結合することを可能にする条件下で、抗Ｒｅｐタンパク質抗体を含むことが疑われる血清検体とＲｅｐタンパク質を接触させることによって、結腸癌患者の抗体レベルを試験した。本発明者らは、血清反応性が健康な対照と比較して、結腸癌患者において減少することを認識した。

【0014】

これまでに、１８種の、異なるが部分的に関連するＤＮＡ分子のスペクトルが、異なる試験材料（ウシ血清、乳、１つの多発性硬化症患者の剖検の脳組織）から単離された（Ｆｕｎｋ，Ｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｇｕｎｓｔ， ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｌａｍｂｅｒｔｏ，Ｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｗｈｉｔｌｅｙ，Ｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１４；ＷＯ２０１５／０６２７２６Ａ２；ＷＯ２０１６／００５０５４Ａ２）。１８分離物を、それらの分子特性に従って、４つの異なる群ＢＭＭＦ１〜ＢＭＭＦ４に分けた（ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎら、２０１７）。これらのグループのうち３つは、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）及びサイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）プラスミドと顕著な程度の類似性を明らかにした。第４のグループは、ジェミサーキュラーウイルス（Ｇｅｍｙｃｉｒｕｌａｒｖｉｒｉｄａｅ）の代表である３つの分離物から構成された。推定Ｒｅｐ遺伝子は、利用可能な配列とのインシリコ比較により得られたＢＭＭＦのＤＮＡ配列の一部として同定された。ｒｅｐ遺伝子において隣接するプライマーを使用する増幅はウシ血清からの完全及び部分環状ＤＮＡゲノムの単離を導いた（Ｆｕｎｋら、２０１４）。これは、特定の環状一本鎖ＤＮＡゲノムの存在について、市販の乳製品からのサンプルに拡張された。１４の異なる単離物（約１１００〜３０００ヌクレオチド）の全長環状一本鎖ＤＮＡ分子をクローニングし、配列決定した（Ｗｈｉｔｌｅｙら、２０１４； Ｇｕｎｓｔら、２０１４；Ｆｕｎｋら、２０１４；Ｌａｍｂｅｒｔｏら、２０１４）。ヒト脳及び血清（すべて多発性硬化症患者由来）からさらに４つの分離物を得た（Ｗｈｉｔｌｅｙら、２０１４；Ｇｕｎｓｔら、２０１４；Ｌａｍｂｅｒｔｏら、２０１４）。

【0015】

これらの分離物の中で、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）関連分離物Ｓｐｈｉｎｘ１．７６（１７５８ｂｐ；受入番号ＨＱ４４４４０４）に密接に関連する２つのＤＮＡ分子が、ＭＳ患者の脳組織から分離された。（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ Ｌ．２０１１））これらの分離物はＭＳＢＩ１．１７６（ＭＳＢＩ、多発性硬化症脳分離物）（１７６６ｂｐ）及びＭＳＢＩ２．１７６（１７６６ｂｐ）であり、それぞれ「ＭＳＢＩ１ゲノム」及び「ＭＳＢＩ２ゲノム」と命名された。ＭＳＢＩ１．１７６は、Ｓｐｈｉｎｘ１．７６の配列と９８％の配列類似性を共有する。分離物の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、それらの間で高い類似性を共有する推定ＤＮＡ複製タンパク質をコードする。もう１つの一般的な特徴は、イテロンのようなタンデムリピートの存在である。この反復領域のアラインメントは、コアにおける単一ヌクレオチドの変異を示す。このイテロン様反復は、Ｒｅｐタンパク質の結合部位を構成し得る。分離物の配列はＥＭＢＬ Ｄａｔａｂａｎｋに登録番号ＬＫ９３１４９１（ＭＳＢＩ１．１７６）及びＬＫ９３１４９２（ＭＳＢＩ２．１７６）（Ｗｈｉｔｌｅｙ Ｃ．ｅｔ ａｌ．２０１４）で寄託されており、ＷＯ２０１６／００５０５４Ａ２に整列及び記載されている。

【0016】

牛乳からさらに分離物を入手した。これらの牛乳分離物（ＣＭＩ）は、それぞれ「ＣＭＩ１ゲノム」、「ＣＭＩ２ゲノム」及び「ＣＭＩ３ゲノム」と命名されたＣＭＩ１．２５２、ＣＭＩ２．２１４及びＣＭＩ３．１６８であった。分離物の配列は登録番号ＬＫ９３１４８７（ＣＭＩ１．２５２）、ＬＫ９３１４８８（ＣＭＩ２．２１４）及びＬＫ９３１４８９（ＣＭＩ３．１６８）でＥＭＢＬ Ｄａｔａｂａｎｋに寄託されており、ＷＯ２０１６／００５０５４Ａ２に整列及び記載されている。

【0017】

本発明者らは、ＣＭＩゲノム及びＭＳＢＩゲノムの両方が、転写されたＲＮＡの有意な産生を示し、これにコードされたＲｅｐタンパク質が結腸癌アイランド及びポリープ周辺の周囲組織において発現されることを見出した。本発明者らは、コードされたＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ１ Ｒｅｐ、ＣＭＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ３ Ｒｅｐ）が結腸癌のバイオマーカとなることを見出した。ＤＮＡ複製関連タンパク質（ＲｅｐＢ）として、Ｒｅｐタンパク質はＤＮＡ結合活性を有し、エピソーム又はウイルスＤＮＡ分子の複製の開始に必須であり得る。Ｒｅｐタンパク質は自己オリゴマー化及び凝集の顕著な可能性を示し、これは、インビボ及びインビトロにおける原核生物系内で記載されている（Ｇｉｒａｌｄｏ，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｄｉａｚ ｄｅ ｌａ Ｅｓｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｔｏｒｒｅｉｒａ，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｄｅｌ Ａｌａｍｏ ｅｔ ａｌ．２０１５）。

【0018】

本発明者らは、Ｒｅｐタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製した。特定の実施形態において、抗Ｒｅｐ抗体は、図３に例示されるＲｅｐタンパク質のエピトープに結合する。特に好ましい抗体は、配列番号１のアミノ酸１〜１３６、１３７〜２２９及び２３０〜３２４からなる群より選択されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する。例えば、抗体は、配列番号２又は配列番号３に含まれるエピトープに結合する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、結腸癌発生のための提案されたモデルを示す。

【図2】図２は、Ｋｉ６７ＩＨＣ染色（利用可能なオンラインデータ）に基づく結果を示す。特に、陰窩の終点に近接して位置し、陰窩の遠位内腔部に向かって移動する上皮幹細胞に由来する基底上皮細胞は、結腸癌の腫瘍形成及び発生に対する基本的要求として突然変異の確率論的発現を可能にする本質的に高い増殖を特徴づけることが分かるであろう。

【図3】図３は、産生された抗体の特徴及びＲｅｐ内のエピトープの局在化を示す。

【図4】図４は、結腸癌組織及び取り囲む非癌性周囲組織への抗体１０−３（Ｃ群抗Ｒｅｐ抗体）の使用により得られたＩＨＣデータを示す。患者の指定：＃４７９９、＃４８０９、＃４７９８、＃４８０２、＃４８１３及び＃４８０６

【図5】図５は、患者＃４８０９の結腸腫瘍を取り囲む周囲組織に対する抗Ｒｅｐ抗体３−６及び１０−３（Ｃ群抗Ｒｅｐ抗体）及び市販の抗ＣＤ６８抗体の使用によって得られたＩＨＣデータを示す。

【図6】図６は、抗Ｒｅｐ抗体群Ａ及びＣ抗体（抗体１−５、３−６、１０−３及び１１−５）ならびに結腸良性ポリープを取り囲む周囲組織に対する市販の抗ＣＤ６８抗体の使用によって得られたＩＨＣデータを示す。

【図7】図７は、抗Ｒｅｐ抗体による大腸癌患者の腫瘍組織領域の免疫組織化学染色におけるＩＲＳ値の分布を示す。

【図8】図８は、抗Ｒｅｐ抗体を有する大腸癌患者の腫瘍周囲組織領域の免疫組織化学染色におけるＩＲＳ値の分布を示す。

【図9】図９は、抗ＣＤ６８抗体を有する大腸癌患者の腫瘍組織領域の免疫組織化学的染色のためのＩＲＳ値の分布を示す。

【図10】図１０は、抗ＣＤ６８抗体を有する大腸癌患者の腫瘍周囲組織領域の免疫組織化学的染色のためのＩＲＳ値の分布を示す。

【図11】図１１は、大腸癌患者の腫瘍周囲及び腫瘍組織のＩＲＳ値の表示である。

【図12】図１２は、Ｒｅｐ検出のＩＲＳ値を、ＣＤ６８陽性率に対してプロットし、これを７つのレベル（０〜６）に分類した結果を示す。

【図13】図１３は、大腸癌患者の生存率を「Ｒｅｐ低値」（ＩＲＳ値０〜１．９）と「Ｒｅｐ高値」（ＩＲＳ値２〜６）に分類したカプラン・マイヤー表示である。

【図14】図１４は、「Ｒｅｐ低値」（ＩＲＳ値０〜１．９）と「Ｒｅｐ高値」（ＩＲＳ値２〜６）に群分けした大腸癌患者のカプラン・マイヤー生存曲線のＣｏｘ相関に基づく腫瘍周囲大腸癌患者組織におけるＲｅｐ検出の予後ハザード比を表示したものである。

【図15】図１５は、大腸癌患者の生存率を「ＣＤ６８低値」（ＩＲＳ値０〜２．９）と「ＣＤ６８高値」（ＩＲＳ値３〜６）に分類したカプラン・マイヤー表示である。

【図16】図１６は、抗ＢＭＭＦ−Ｒｅｐ抗体５−２による免疫染色後の、典型的なＣＲＣ患者（腫瘍周辺部及び腫瘍）並びに個人ドナーの４つのポリープの組織ライセートにおけるＢＭＭＦ−Ｒｅｐ抗原の免疫検出の結果を示す。１００ｎｇのアフィニティー精製したＭＳＢＩ１．１７６Ｒｅｐタンパク質を陽性対照として負荷した。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明は、Ｒｅｐタンパク質が、結腸癌を発症する高められたリスクのためのバイオマーカとなり得、そしてＣＲＣ患者の全生存予後を決定するためのマーカーとして有用であるという教示を提供する。

【0021】

「結腸癌」と「大腸癌」（ＣＲＣ）という用語は互換的に使われる。大腸癌は、結腸又は直腸における制御不能な細胞増殖の結果として進化した癌である。これらの悪性腫瘍は、既存の良性アデノーマの遺伝子変化が正常から癌性増殖への移行を促進する結果として発症する可能性がある。「結腸癌」又は「大腸癌」という用語は、この疾患の前段階、初期段階又は後期段階、及びそれに由来する転移を意味する。

【0022】

異なる実施形態では、本発明はまた、将来の疾患リスクを評価するための、健康な結腸組織（癌診断のない個体由来の組織又は疾患についての特定のヒント）の系統的試験を包含し得る。これは、本発明が大腸癌を発症する素因を決定するのにも適していることを意味している。

【0023】

本明細書で使用される「Ｒｅｐタンパク質」は、ＤＮＡ複製関連タンパク質（ＲｅｐＢ）を指す。Ｒｅｐタンパク質はＤＮＡ結合活性を含み、エピソーム／ウイルスＤＮＡ分子の複製の開始に必須であり得る。一般に、Ｒｅｐタンパク質は、小さなＳｐｈｉｎｘゲノムの群からのＲｅｐタンパク質を指す（Ｗｈｉｔｌｅｙら、２０１４）。特に、Ｒｅｐタンパク質はＭＳＢＩ１ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）、ＭＳＢＩ２ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ）、ＣＭＩ１ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＣＭＩ１ Ｒｅｐ）、ＣＭＩ２ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＣＭＩ２ Ｒｅｐ）又はＣＭＩ３ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＣＭＩ３ Ｒｅｐ）である。好ましくは、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４９１の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＭＳＢＩ１．１７６によってコードされ、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、又はＲｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４９２の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＭＳＢＩ２．１７６によってコードされるＭＳＢＩ２であり、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する（Ｗｈｉｔｌｅｙ， Ｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。別の好ましい実施形態において、ＣＭＩ１ Ｒｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４８７の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＣＭＩ１．２５２によってコードされ、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態において、ＣＭＩ２ Ｒｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４８８の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＣＭＩ２．２１４によってコードされ、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態において、ＣＭＩ３ Ｒｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４８９の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＣＭＩ３．１６８によってコードされ、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。特に好ましい実施形態において、Ｒｅｐタンパク質は、配列番号１の１〜２２９のアミノ酸から本質的になるＢＭＭＦ１ゲノムの間で保存されたＮ末端領域、及び配列番号１のアミノ酸２３０〜３２４から本質的になるＭＳＢＩ１．１７６に特異的なＣ末端可変領域を含む。Ｎ末端保存領域は、配列番号１の１〜１３６のアミノ酸から本質的になる推定上の第１のＤＮＡ結合ドメインと、配列番号１の１３７〜２２９のアミノ酸から本質的になる第２の推定上のＤＮＡ結合ドメインとを含む。Ｃ末端ドメインは、任意の公知のタンパク質とほとんど配列相同性を示さず、そしてアミノ酸２３０〜３２４からなる。

【0024】

「Ｒｅｐタンパク質」はまた、配列番号１又は配列番号８のタンパク質のフラグメント及び改変体を包含し、これらは配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合し得る。好ましくはこのようなフラグメントは配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質の免疫原性フラグメントであり、これらは配列番号１又は配列番号８のＲｅｐタンパク質に対する抗Ｒｅｐタンパク質抗体のための少なくとも１つのエピトープを含み、そして好ましくは少なくとも７、８、９、１０、１５、２０、２５又は５０の連続するアミノ酸を含む。特定の実施形態では、フラグメントがＲｅｐタンパク質のドメイン、例えば、Ｎ末端保存領域、Ｃ末端可変領域、第１又は第２のＤＮＡ結合ドメインを含むか、又は本質的にそれらからなる。配列番号１又は配列番号８を有するタンパク質の変異体は配列番号１と比較して１つ以上のアミノ酸欠失、置換又は付加を含み、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有し、変異体は、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる。変異体の定義内に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む）、置換された結合を有するポリペプチド、ならびに天然に存在するもの及び天然に存在しないもの両方の、当技術分野で公知の他の改変を含有するポリペプチドである。Ｒｅｐタンパク質という用語は、異種アミノ酸配列、リーダー配列、又はタグ配列などを有する融合タンパク質を含む。本発明の特定の実施形態において、タンパク質タグは上記のＲｅｐタンパク質（例えば、ＭＳＢＩ１、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ２又はＣＭＩ３からなる群より選択されるＲｅｐタンパク質）上に遺伝的に移植される。特に、少なくとも１つのタンパク質タグは、配列番号１〜３、８〜１２、１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合される。このようなタンパク質タグは、化学物質によって、又は酵素的手段によって除去可能であり得る。タンパク質タグの例は、精製のためのアフィニティー又はクロマトグラフィータグである。例えば、ＲｅｐタンパクはＨｉｓ_６−Ｔａｇ（配列番号４）、Ｔ７−Ｔａｇ（配列番号５）、ＦＬＡＧ−Ｔａｇ（配列番号６）及びＳｔｒｅｐ−ＩＩ−Ｔａｇ（配列番号７）からなるグループから選択されるように、Ｔａｇ配列に融合することができる。Ｈｉｓ−Ｔａｇ （配列番号４）、Ｔ７−Ｔａｇ（配列番号５）、ＦＬＡＧ−Ｔａｇ（配列番号６）、又はＳｔｒｅｐＩＩ−Ｔａｇ（配列番号７）。さらに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体などの蛍光タグを、本発明によるＲｅｐタンパク質に付着させることができる。

【0025】

特に好ましい実施形態において、ＭＳＢＩ１ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）はヒト細胞株（例えば、ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨａＣａＴ、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＣａＳｋｉ、ＨＤＭＥＣ、Ｌ１２３６、Ｌ４２８、ＢＪＡＢ、ＭＣＦ７、Ｃｏｌｏ６７８、任意の一次細胞株）ならびにウシ細胞株（例えば、ＭＡＣ−Ｔ）又はマウス細胞株（例えば、ＧＴ１−７）における産生のためにコドン最適化される。これは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７５７７４に詳細に記載されている。

【0026】

本発明のＲｅｐタンパク質（上記で定義したＲｅｐ断片及びＲｅｐ変異体を含む）は、古典的化学合成によって調製することができる。合成は、均一溶液中又は固相中で行うことができる。組換えＤＮＡ技術の手段により、ポリペプチドを調製することもできる。

【0027】

本明細書で使用される「対象」は、マウス、ウシ、例えばウシ、サル及びヒトを含む哺乳動物個体又は患者を指す。好ましくは、対象はヒト患者である。

【0028】

本明細書で使用される「抗Ｒｅｐ抗体」は、Ｒｅｐタンパク質に検出可能なレベルで結合する抗体を指し、非Ｒｅｐタンパク質よりも本発明のＲｅｐタンパク質により強く親和性である。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質に対する抗原親和性がバックグラウンド結合よりも少なくとも２倍大きい。特に、抗Ｒｅｐ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ又はＭＳＢＩ２ Ｒｅｐに特異的である。特定の実施形態では、抗体がＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ１ Ｒｅｐ、ＣＭＩ２ Ｒｅｐ及び／又はＣＭＩ３ Ｒｅｐに対して交差特異的である。特定の実施形態では、抗Ｒｅｐ抗体がＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ１ Ｒｅｐ、ＣＭＩ２ Ｒｅｐ及び／又はＣＭＩ３ Ｒｅｐの少なくとも２つ、好ましくは全てに対して交差特異的である。

【0029】

本発明者らはまた、抗Ｒｅｐタンパク質抗体を含むことが疑われる検体とＲｅｐタンパク質を、Ｒｅｐタンパク質が検体中に存在する任意のこのような抗体に結合することを可能にする条件下で接触させることによって、結腸癌患者の抗体レベルを試験した。このような条件は、典型的には過剰のＲｅｐタンパク質を使用する生理学的温度、ｐＨ及びイオン強度である。検体とのＲｅｐタンパク質のインキュベーションに続いて、抗原を含む免疫複合体を検出する。特定の実施形態において、Ｒｅｐタンパク質はシグナル生成化合物（例えば、検出可能な標識）に結合されるか、又はシグナル生成化合物に結合されるさらなる結合剤（例えば、二次抗ヒト抗体）が、免疫複合体を検出するために使用される。

【0030】

抗Ｒｅｐ抗体はタンパク質抗原としてのＲｅｐタンパク質に基づくアッセイにおいて検出及び定量され得、これは、試料において疑われる哺乳動物（例えば、ヒト）抗体の標的として役立つ。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質は精製され、そして検体は例えば、血清又は血漿であり得る。この方法は、マトリックス上へのＲｅｐタンパク質の固定化、続いて、固定化されたＲｅｐタンパク質の検体とのインキュベーションを含む。最後に、Ｒｅｐタンパク質と検体の抗体との間に形成された免疫複合体のＲｅｐ結合抗体を、シグナル生成化合物、例えば、二次ＨＲＰ−（西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ）結合検出抗体に結合した検出結合剤によって定量し、ＨＲＰ基質に基づく定量を可能にする。このシグナル生成化合物又は標識は、それ自体が検出可能であるか、又は追加の化合物と反応させて検出可能な生成物を生成することができる。

【0031】

イムノアッセイの設計は、非常に多くのバリエーションがあり、そして多くの形式が当該分野で公知である。プロトコールは例えば、固体支持体又は免疫沈降を使用し得る。ほとんどのアッセイはシグナル発生化合物、例えば、標識抗体又は標識Ｒｅｐタンパク質に結合された結合剤の使用を含む；標識は、例えば、酵素、蛍光、化学発光、放射性、又は色素分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイも知られており、その例は、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンを利用するアッセイ、ならびにＥＬＩＳＡアッセイなどの酵素標識及び酵素媒介免疫アッセイである。

【0032】

イムノアッセイは、不均一又は均一フォーマットであり得、そして標準又は競合型であり得る。標準フォーマット及び競合フォーマットの両方が、当技術分野で知られている。

【0033】

免疫沈降又は凝集アッセイフォーマットにおいて、Ｒｅｐタンパク質と抗Ｒｅｐ抗体との間の反応は、溶液又は懸濁液から沈殿し、沈殿物の可視層又はフィルムを形成するネットワークを形成する。抗Ｒｅｐ抗体が検体中に存在しない場合、目に見える沈殿物は形成されない。

【0034】

さらなる実施形態において、本発明者らは、サンプル中の増加した量のＲｅｐタンパク質が結腸癌の診断又は素因と相関する方法を使用した。このような実施形態において、サンプル中のＲｅｐタンパク質は、抗Ｒｅｐ抗体によって検出される。

【0035】

本明細書中で使用される「サンプル」は、癌性結腸組織、癌性結腸組織を取り囲む周囲組織、及び（良性）結腸ポリープを包含する生物学的サンプルをいう。サンプルは、組織培養物又は生検検体などの組織サンプルを包含する。

【0036】

このような方法は、抗Ｒｅｐ抗体によって被験体由来のサンプル中のＲｅｐタンパク質を検出する工程を包含する。このような方法において、Ｒｅｐタンパク質は、免疫組織化学的方法又は免疫蛍光顕微鏡法によって組織サンプル中で検出される。

【0037】

特定の実施形態において、抗Ｒｅｐ抗体は、サンプル中のＲｅｐタンパク質の検出又は捕捉のために使用される。

【0038】

用語「抗体」は、好ましくは異なるエピトープ特異性を有するプールされたポリクローナル抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体調製物から本質的になる抗体に関連する。本明細書で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）又は「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は完全な免疫グロブリン分子、ならびにＲｅｐタンパク質に特異的に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ‘）_２断片など）を含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ‘）_２フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより迅速に取り除かれ、インタクトな抗体よりも非特異的な組織結合が少ないかもしれない。従って、これらのフラグメント、ならびにＦＡＢ又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の目的に有用な抗体には、キメラ、一本鎖、多機能（例えば、二重特異性）及びヒト化抗体又はヒト抗体が含まれる。

【0039】

特定の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントはシグナル生成化合物に結合され、例えば、検出可能な標識を有する。抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素で直接的又は間接的に検出可能に標識することができる。当業者は、通常の実験を用いて、抗体に結合するための他の適切な標識を知っているか、又はそれを確認することができる。

【0040】

抗Ｒｅｐ抗体は好ましくは当業者に周知の方法により、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列又はその断片を有するＲｅｐタンパクに対し、産生（生成）される。

【0041】

特定の実施形態において、抗Ｒｅｐ抗体は、小さなＳｐｈｉｎｘゲノム（抗Ｓｍａｌｌ−Ｓｐｈｉｎｘ様Ｒｅｐ抗体又は抗ＳＳＬＲｅｐ抗体）の群からのいくつかの又は全ての種類のＲｅｐタンパク質に結合することができる本発明の方法において使用される。このような抗ＳＳＬＲｅｐ抗体は、配列番号１のアミノ酸１〜２２９のＲｅｐタンパク質の保存されたＮ末端領域内のエピトープに結合する。特定の実施形態では、配列番号２（配列番号１のアミノ酸３２〜４９）又は配列番号３（配列番号１のアミノ酸１９７〜２１６）内のエピトープに結合する抗ＳＳＬＲｅｐ型の抗Ｒｅｐ抗体が使用される。配列番号２及び配列番号３のペプチド断片は、小さなＳｐｈｉｎｘゲノム群由来のＲｅｐタンパク質の間で高度に保存されており、それらの親水性のために露出しているようである。抗ＳＳＬＲｅｐ型の抗Ｒｅｐ抗体は、例えばマウス又はモルモットの免疫化によって、配列番号２又は３に示されるアミノ酸配列から本質的になるペプチドによって；又は配列番号１のアミノ酸１〜２２９の保存されたＮ末端Ｒｅｐタンパク質領域に由来する、好ましくは少なくとも８〜１５アミノ酸を含む他の免疫原性フラグメントによって産生され得る。

【0042】

さらなる実施形態において、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体が使用される。このような抗体は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する全長Ｒｅｐタンパク質でマウス又はモルモットのような哺乳動物を免疫することによって産生され得る。

【0043】

好ましくは、本発明の方法がピコグラムからフェムトグラムまでの範囲までのＲｅｐタンパク質を検出することができる抗Ｒｅｐ抗体を使用する。
このような抗Ｒｅｐ抗体群の例を表１に示す：

【0044】

【表1】

【0045】

Ａ群の抗Ｒｅｐ抗体は配列番号３（配列番号１のａａ１９８〜２１７）に示されるアミノ酸配列内にエピトープを有し、そして小さなＳｐｈｉｎｘゲノム群のこの保存されたエピトープを含むＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ及びＲｅｐタンパク質（例えば、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ４）を検出し得る。免疫蛍光アッセイにおいて、このような抗Ｒｅｐ抗体は特異的なＲｅｐ局在化パターンを検出し、ここで、主要な局在化は、細胞質及び核膜にわたって均一に分布され；そしてさらなる弱く均一に分布された局在化が核において見られる。このようなＡ群抗体の例は、実施例においてＡ群抗体として使用された抗体ＡＢ０１ ５２３−１−１（抗体１−５とも呼ばれる；ＤＳＭ ＡＣＣ３３２７）である。

【0046】

グループＢの抗Ｒｅｐ抗体は配列番号２（配列番号１のａａ３３〜５０）に示されるアミノ酸配列内にエピトープを有し、小さなＳｐｈｉｎｘゲノムグループ（例えば、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ４）のこの保存されたエピトープを含むＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ及びＲｅｐタンパク質を検出することができる。免疫蛍光アッセイにおいて、このような抗Ｒｅｐ抗体は、Ｒｅｐタンパク質の特異的スペックル（細胞質凝集）（しばしば核膜の周辺）を検出する。このようなＢ群抗体の例はＡＢ０２ ３０４−４−（抗体５−２とも呼ばれる；ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８）として指定される抗体であり、これは、実施例においてＢ群抗体として使用された。

【0047】

Ｃ群の抗Ｒｅｐ抗体は、ＭＳＢＩ１（配列番号１）の構造エピトープを特異的に検出する。免疫蛍光アッセイにおいて、このような抗Ｒｅｐ抗体は、特異的なＲｅｐ局在化パターンを検出し、ここで、主要な局在化は、細胞質及び核膜にわたって均一に分布され；そしてさらなる弱く均一に分布された局在化が核において見られる。このようなＣ群抗体の例は、ａａ１３７〜３２４の配列中にエピトープを有するＣ群抗体として実施例において使用された抗体ＭＳＢＩ１ ３８１−６−２（抗体３−６とも呼ばれる；ＤＳＭ ＡＣＣ３３２９）である。Ｃ群抗体の別の例は、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ（ａａ２３０〜３２４）のＣ末端ドメインにおけるエピトープを検出する抗体ＭＢＳＩ１ ５７２−１３−１９（抗体１０−３とも呼ばれる）である。Ｃ群抗体の別の例は、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ（ａａ１〜１３６）のＮ末端ドメインにおけるエピトープを検出する抗体ＭＢＳＩ１ ６１７−１−３（抗体１１−５とも呼ばれる）である。

【0048】

Ｄ群の抗Ｒｅｐ抗体はＭＳＢＩ１の構造エピトープ（配列番号１）を特異的に検出し、ここで、「Ｄ１」として指定される抗体ＭＳＢＩ１ ９６１−２−２（ＤＳＭ ＡＣＣ３３３１）は、ＭＳＢＩ１のＣ末端ドメイン中の配列番号９（ａａ２８１−２８７）に示されるエピトープを検出する。抗体ＭＳＢＩ１ ７６１−５−１（抗体１３とも呼ばれる； ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８）が「Ｄ２」として指定されるが、ＭＳＢＩ１の３Ｄ構造エピトープを検出し、これはインビボ条件下で排他的にアクセス可能であり、ウェスタンブロットではアクセスできない。免疫蛍光アッセイにおいて、このような抗Ｒｅｐ抗体は、Ｒｅｐタンパク質の特異的スペックル（細胞質凝集）（しばしば核膜の周辺）を検出する。
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、これらに限定されるものではない：

【実施例】

【0049】

実施例１：結腸組織におけるＢＭＭＦタンパク質標的の検出
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）に基づく結腸組織におけるＢＭＭＦ−Ｒｅｐ関連タンパク質標的の検出には、抗Ｒｅｐ抗体１０−３（１：５００希釈）、３−６（１：５００）、１１−５（１：１００）及び１−５（１：１００）を用いた。ウサギ抗ＣＤ６８抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ， Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＃７６４３７，１：８００）を用いて、単球、循環マクロファージ、組織マクロファージのＣＤ６８−特異的染色を行った。結腸組織試料のパラフィン包埋組織切片を、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ自動ＩＨＣ染色システム（ＥＤＴＡエピトープ回収バッファー）上で、それぞれの抗体とインキュベートした。比色染色は、Ｌｅｉｃａ ＤＡＢ染色キット（Ｌｅｉｃａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｃａｍ社のウサギ抗−マウス二次抗体ａｂ１２５９０４（１：５００））を用いて行った。染色した組織切片をＺｅｉｓｓ光学顕微鏡でデジタル化した。

【0050】

結果
１１対のドナー組織サンプル（各腫瘍組織及び周囲組織）及び結腸ポリープ組織の異なるドナー由来の４つのサンプルからの選択物を、マウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体でのＩＨＣ染色に供した。１１個の腫瘍及び周囲サンプルに関して、１１個の組織のうち９個が、少なくとも２個の抗Ｒｅｐ抗体で強い特異的抗体染色を示した。典型的には、抗体１０−３による染色が、腫瘍ならびに周囲組織における組織サンプル４７９８、４７９９、４８０２、４８０６、４８０９及び４８１３におけるタンパク質標的の特異的検出を示す。一般に、染色強度は周囲組織についてより高く、ここで、より小さいサイズの強く染色された細胞質凝集体は結腸組織のリーベルキューンの特徴的なクリプトの間の固有層内の細胞の別個の島内に集中する（すべての写真がリーベルキューンのクリプト全体にわたる横断切断を示し、陰窩の（内部）管腔は、陰窩の上皮細胞のリング様配列の中心において結腸液に接触する）。腫瘍組織の染色はまた、主に腫瘍組織内の間質細胞の細胞質領域内で、より小さいサイズの凝集体の強い染色を示す。逐次的切断の染色に４種類の異なる抗Ｒｅｐ抗体を用いることにより、結腸ポリープの粘膜固有層にも同じ凝集体様構造が見える。両者とも、結腸周囲組織及び結腸ポリープについては、Ｒｅｐ特異的抗体検出の最も高い領域がＣＤ６８陽性細胞の検出レベルが最も高い領域と相関しており、特に炎症性単球、循環マクロファージ、又は組織マクロファージのレベルが高い領域におけるＲｅｐ特異的抗原の局在化を指摘している。

【0051】

ＩＨＣ結果の確認のために、患者組織材料の一部を、組織ホモジナイザーを用いて８Ｍ尿素変性溶解緩衝液中で溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。目的の領域を切断し、トリプシン消化し、ＢＭＭＦ１特異的ペプチド標的の存在について質量分析によって分析した。強いＩＨＣシグナルレベルを有する４対（腫瘍及び周囲組織）のセットを、ＩＨＣシグナルを有さない１対と一緒に選択した。ＩＨＣ結果と一致して、４つの強いＩＨＣ陽性周囲組織のみが、１つのＢＭＭＦ１群特異的ペプチド配列の質量スペクトル検出を可能にした。

【0052】

ＩＨＣにおける抗体検出の特異性を確認するために、最も強いＩＨＣシグナル検出を有する５つのサンプルからのＤＮＡ単離物を、ローリングサークル増幅及びＢＭＭＦ−グループ１特異的プライマーを用いたＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定に供して、同じ組織材料中のＢＭＭＦ ＤＮＡの存在を分析した。実際、各ドナー内の５つの最も強いＩＨＣサンプル対（腫瘍及び周囲組織）のセットに基づいて、ＭＳＢＩ１特異的ＤＮＡが、少なくとも１つの組織型（腫瘍又は周囲組織）から単離された。

【0053】

実施例２：ＣＲＣ組織マルチアレイ（ＴＭＡ）の免疫組織化学染色
大腸癌（ＣＲＣ）患者の組織材料におけるＢＭＭＦ１ Ｒｅｐタンパク質抗原の検出を、特異的マウスモノクローナル抗ＢＭＭＦ１ Ｒｅｐ抗体によるＣＲＣ組織マルチアレイ（ＴＭＡ）の免疫組織化学染色に基づいて試験した。したがって、合計２５９人の大腸癌患者を代表するＴＭＡが使用され、全部で患者当たりそれぞれ２つの腫瘍組織スポットと、２つの腫瘍周囲組織領域のスポットが提供された。全患者は２００３年と２００４年にハイデルベルグの大学病院で治療された。ＴＭＡサンプルは、腫瘍疾患ナショナルセンター（ＮＣＴ、ハイデルベルク、ドイツ）の組織バンクから提供され、当該組織バンクの規定、及びＨｅｒｍａｎｎ Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ及びＪｅｎｎｙ Ｃｈａｎｇ−Ｃｌａｕｄｅ（腫瘍疾患ナショナルセンター（ＮＣＴ）ハイデルベルク、ドイツ及びハイデルベルグ大学病院の病理学研究所、ドイツ）の許可によるハイデルベルグ大学の倫理委員会の承認に準拠して行った。

【0054】

組織染色
ＴＭＡを、ＥＤＴＡエピトープ回収及び所定の抗体インキュベーションを用いて、ＢＯＮＤ ＭＡＸマシン（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で完全に自動的に染色した（表２）。検出は、ＤＡＢクロモゲン及びヘマトキシリン対比染色を含む結合ポリマー精密検出キット（ＤＳ９８００ Ｌｅｉｃａ ＤＡＢ Ｋｉｔ）を用いて行った。スライドをデジタルスライドスキャナー（浜松ホトニクス株式会社）でスキャンし、浜松ホトニクスＮＤＰビューアーソフトウェアに基づいて分析した。

【0055】

【表2】

【0056】

ＢＭＭＦシグナル定量
２名の研究者が以下のスコアリング基準に従って組織スポットを独自にスコアリングした。各抗体について、染色された細胞の割合（陽性）及び強度（Ｉ）を決定した。Ｒｅｐ染色では間質染色のみが評価され、腫瘍組織スポット又は腫瘍周囲スポットの陰窩における腫瘍領域における検出されたＢＭＭＦ抗原の優勢な局在が無視できる程度の染色で示された。Ｒｅｐ染色の陽性（ＰＯＳ）は０が全く陽性組織部分を示さず、１が１〜１０％陽性を示し、２が１１〜３０％を示し、３が染色された凝集体を示す個々の組織スポットの３０％を超える、三段階レベルスケールを用いて評価した。ＣＤ６８／マクロファージ染色について、陽性スコアは陰性組織スポットに対して０と設定され、１は＜２０％陽性細胞を示し、２は２０〜６０％を示し、３は陽性細胞の６０％以上を示した。強度（Ｉ）は一般に次のように等級付けされた：０＝反応なし、１＝軽度、２＝強い染色。統計分析のために、免疫反応性スコアＩＲＳを以下のように計算した：

【0057】

ＩＲＳ＝［（Ｉ（検査官１）＋Ｉ（検査官２））／２］＊［（ＰＯＳ（検査官１）＋ＰＯＳ（検査官２））／２］；最小値＝０、最大値＝６。

【0058】

概要を表３に示す。２５９例中、１２例は組織の質が悪く、１例は臨床データが欠落していたため除外した。合計で、２４６人の患者からのデータを、さらなる分析のために処理した。

【0059】

【表3】

【0060】

統計解析
統計解析は、Ｒ−３．５．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）及びＲ−ｓｔｕｄｉｏ２０１６を用いて行った。腫瘍組織と腫瘍周囲組織を比較するために、ウィルコクソンの両側符号付順位検定を行った。免疫染色と臨床データの間の相互依存性は、クラスカル・ウォリス検定を用いて計算した。カプラン・マイヤー法を用いて生存曲線をプロットし、ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いて分析した。ハザード比はＣｏｘ回帰分析により決定した。Ｐ値０．０５未満を統計学的に有意とみなした。

【0061】

結果
合計で、ｎ＝２４６の大腸癌患者についてスコア情報を収集した。腫瘍組織領域のＲｅｐスコアリングでは、患者組織の４９，３％が陽性を示したが、腫瘍周囲組織のスコアリングでは、患者組織の９９，１％が陽性を示した。ＩＲＳ値の対応する分布は、０及び１のＩＲＳ値を有する症例の濃縮を伴う腫瘍組織についての非対称分布を示す（図７）。この傾向は、ＩＲＳ値の濃縮度が３を超える腫瘍周囲スコアリングのＩＲＳ値の分布について反転している（図８）。

【0062】

腫瘍部（図９）及び腫瘍周囲組織領域（図１０）の染色により得られたシグナルの定量化に関しては、ＣＤ６８抗体が９９％を超える患者で陽性を示し、両症例ともＩＲＳ値の均衡した分布を示した。

【0063】

腫瘍周囲組織と腫瘍組織のＲｅｐＩＲＳスコアを比較したところ、解析したＣＲＣ患者の腫瘍周囲組織ではＲｅｐ検出が有意に増加していた（ｐ＝＞２．２ｅ−１６）ことが示唆された（図１１）。

【0064】

本発明者らは、癌誘発のためには結腸陰窩間の粘膜固有層内のＢＭＭＦ抗原の量が慢性局所炎症の誘発に重要であり、拡散ＲＯＳ／ＮＯＳの誘発は最終的に、鍵となる突然変異の発現によって初期ポリープ／腫瘍前駆細胞に変わる可能性のある隣接陰窩の分裂幹細胞及び娘細胞においてランダムな突然変異を誘発すると結論した。したがって、腫瘍周囲のＢＭＭＦレベルとＣＤ６８陽性マクロファージの強度の相関が観察可能であるはずである。実際、対応するＣＲＣ患者内でのＣＤ６８検出のためのＩＲＳ値に対するＲｅｐ検出のためのＩＲＳ値を試験することによって、Ｒｅｐ及びＣＤ６８検出の有意な相関が観察され（クラスカル・ウォリス検定によるｐ＝０．０００４５）、これは、Ｒｅｐのより高い検出レベルがＣＤ６８検出のより高いレベルと相関することを示す（図１２）。

【0065】

大腸癌患者の腫瘍周囲領域におけるＲｅｐ検出の予後スコアを患者生存期間で検証するため、ｎ＝２４３例（大腸癌特異的死亡に基づく７７件、打ち切り１６６件）の集合に基づいて、カプラン・マイヤー曲線を算出し、ＩＲＳ値０〜１．９では「Ｒｅｐ低値」、ＩＲＳ値２〜６では「Ｒｅｐ高値」に群分けした（図１３）。ＣＲＣ患者におけるＲｅｐの高値は、患者の全生存期間の有意な減少と相関する（ｐ＝０．００１７）。

【0066】

Ｒｅｐ値の上昇はハザード比４．７（９５％ＣＩ：１−１９）と相関し、Ｒｅｐ検出と患者生存率の負の相関（ｐ＝０．００４７５）を示し、大腸癌組織におけるＲｅｐ検出の予後スコアを強調している（図１４）。

【0067】

「Ｒｅｐ低値」と評価された患者は、５年及び１０年生存率が９２％であるのに対し、「Ｒｅｐ高値」の患者は５年後７４％、１０年後６５％の生存率を示し、これは２０〜３０％の減少に相当する。「ＣＤ６８高値」と「ＣＤ６８低値」のカプラン・マイヤー解析に基づく生存率解析では両生存曲線間に有意差は認められないことから（ｐ＝０．２７１、ｎ．ｓ．）、Ｒｅｐ検出の予後的効果はＣＤ６８検出では説明できない（図１５）。

【0068】

実施例３：ＣＲＣ患者の組織溶解物の免疫ブロット法によるＢＭＭＦＲｅｐ抗原の検出
同じ患者（例えば、患者４８００Ｐ（腫瘍周囲）又は４８００Ｔ（腫瘍周囲））の腫瘍周囲若しくは腫瘍組織材料、又は４人の個々のドナーの初期ポリープからの組織材料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＢＭＭＦＲｅｐ抗体、特に抗ＲｅｐＡｂ５−２（１：２５０希釈）による免疫検出の前に、シリカビーズを用いた４℃の組織ホモジナイザー中で、プロテアーゼインヒビター（Ｐ８３４０ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の使用により、８Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０中で溶解した。約４２ｋＤａの標的バンドは、腫瘍周囲ＣＲＣ患者サンプル４８００については最も強い強度で、４人の個々の患者の初期ポリープの組織溶解物についてはさらに強いバンドで、はっきりと見えた（図１６）。

【0069】

実施例４：ＢＭＭＦ ＲｅｐＤＮＡのＰＣＲ増幅
さらに、大腸癌患者の腫瘍周囲組織領域を免疫組織化学的に染色（抗ＲｅｐＡｂ３−６）し、ＤＮＡ標本を作製した後にレーザー顕微解剖を行ったところ、検査を行った３人の患者（４７９９、４８０８及び４８０９）すべてにおいてＭＳＢＩ１．１７６ＢＭＭＦ ＤＮＡの全長が同定された。したがって、切開組織を、サーモミキサーにて７５０ｒｐｍで、Ｃｈｅｌｅｘビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃａｔ＃１４２−１２５３）の５％懸濁液２５μｌ、５μｇプロテアーゼと共に一晩インキュベートすることによって、切開組織領域から全ＤＮＡを調製した。懸濁液を最大速度で１０秒間ボルテックスし、次いで９９℃のサーモミキサーに８分間入れた。１μｌの上清を、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｍ０２６９Ｓ、１０Ｕ）、及びＥｘｏ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｒａｎｄｏｍプライマー（サーモフィッシャーサイエンティフィックＳＯ１８１、２５μＭ）、ｄＮＴＰ（各０．７５ｍＭ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．５を用いて、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）した。

【0070】

【表4】

【0071】

ＲＣＡ後、３μｌのＲＣＡ反応を、ＢＭＭＦ特異的背中合わせのプライマーＮｏ（Ｇａｇ ｇａｃ ｇａａ ｔｔａ ａｔａ ｔｔａ ｃａａ ｇｔｃ）及びＸｏ（Ｇｔｔ ｃｔｃ ｇｃｔ ｔｔｔ ｃｔｔ ｇｇｔ ａａ）又はＮｎ（ｇｇａ ｔｔａ ａｔｇ ｃｃａ ａｔｇ ａｔｃ ｃ）及びＸｎ（ｃｔｔ ｔｇｃ ｃｔｇ ｔｔｔ ｃｔｃ ｔｃｇ）でのＰＣＲに使用し、各１０ｐｍｏｌ／５０μｌの反応を、８μｌのｄＮＴＰ、２５μｌのＧＣバッファーＩ、０．５μｌのＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ ＲＲ０２ＡＧ）と一緒に、以下のＰＣＲセットアップを用いた。

【0072】

【表5】

【0073】

必要であれば、標的バンドが不適切なバンド強度を示した場合はいつでも、ＰＣＲ標的をＰＣＲ標的のゲル抽出後に、ＰＣＲ増幅のさらなるサイクルに供した。ＰＣＲ後、約５ｎｇのＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１ ＴＡクローニングベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｋ２０３０４０）へのクローニングのために使用し、続いてＰＣＲインサートの配列決定を行った。

【0074】

【表6-1】

【0075】

【表6-2】

【0076】

【表6-3】

【0077】

参考文献

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]