特許 6987338 ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ生成及びその治療的使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6987338

(24)【登録日】2021年12月3日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ生成及びその治療的使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20211213BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20211213BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0783ZNA

   A61P35/00

   A61P37/06

   A61P29/00

   A61P37/04

   A61K39/39

   A61K39/00 Z

   A61K35/17 Z

【請求項の数】12

【全頁数】55

(21)【出願番号】特願2019-528170(P2019-528170)

(86)(22)【出願日】2017年8月4日

(65)【公表番号】特表2019-530469(P2019-530469A)

(43)【公表日】2019年10月24日

(86)【国際出願番号】EP2017069823

(87)【国際公開番号】WO2018024894

(87)【国際公開日】20180208

【審査請求日】2020年5月12日

(31)【優先権主張番号】62/371,329

(32)【優先日】2016年8月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】16196425.9

(32)【優先日】2016年10月28日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(73)【特許権者】

【識別番号】519038493

【氏名又は名称】メドゥシーヌ・エ・イノヴァシオン

【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＥＣＩＮＥ ＥＴ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ

(73)【特許権者】

【識別番号】520053762

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ドゥ パリ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＰＡＲＩＳ

(73)【特許権者】

【識別番号】595040744

【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】ザグリー，ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ル・ビュアネック，エレーヌ

(72)【発明者】

【氏名】デュシェ，ソフィー

(72)【発明者】

【氏名】シアヴォン，ヴァレリー

(72)【発明者】

【氏名】ベンスーサン，アルマン

【審査官】 馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０１２７３７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２０１４−５２１６０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１６−５１７８９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Lu Y et al，Rapamycin Regulates iTreg Function through CD39 and Runx1 Pathways，J Immunol Res.，2014年，2014(Article ID 989434)，1-8

【文献】 日本血栓止血学会誌，2008年，vol.19, no.5，p.577

【文献】 Baratelli F et al，Prostaglandin E2 induces FOXP3 gene expression and T regulatory cell function in human CD4+ T cells，Journal of Immunology，2005年，175(3)，1483-1490

【文献】 西尾純子，免疫応答の負の制御：免疫恒常性の維持と疾患治療への応用 抗CD3抗体などによる自己免疫疾患の治療戦略，細胞工学，32（12），2013年，1232-1237

【文献】 International Immunology，2007年，vol.19, no.6，p.785-799

【文献】 NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY，2009年，vol.9，p.480-490

【文献】 BLOOD，2007年，vol.110, no.13，p.4293-4302

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／０７８３

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３７／０６

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３７／０４

Ａ６１Ｋ ３９／３９

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ３５／１７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の表現型：ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有するＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団をex vivoで生成するための方法であって、
抗ＣＤ３抗体、抗ＴＣＲαβ抗体、又は少なくとも１つの自己ペプチド抗原でパルスされている寛容原性樹状細胞（ＤＣ）；並びに
以下の作用物質：
ｉ） ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）アクチベーター、
ｉｉ） ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）経路アクチベーター、
ｉｉｉ）ｍＴＯＲインヒビター、並びに
ｉｖ） ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＴＳＬＰの群において選択される少なくとも１つのサイトカイン
の存在下で、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を少なくとも５日間培養することを含み、
前記制御性Ｔ細胞が、トリプトファン、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３及びＩＬ−２を含む培地中において、依然として通常Ｔ細胞の増殖の阻害が可能である、
方法。

【請求項2】

ｃＡＭＰアクチベーターが、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＥＰ２又はＥＰ４アゴニスト、あるいは膜アデニンシクラーゼアクチベーターを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＴＧＦβ経路アクチベーターが、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン及びノーダルを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ワートマニン；テオフィリン；カフェイン；没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、クルクミン、レスベラトロル；ゲニステイン、３，３−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｔｏｒｉｎ１、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−６８７、ＷＹＥ−３５４、ＧＮＥ４７７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＩ−１０３、ＸＬ７６５及びＷＪＤ００８を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

抗ＣＤ３抗体、抗ＴＣＲαβ抗体、又は少なくとも１つの自己ペプチド抗原でパルスされている寛容原性樹状細胞（ＤＣ）
並びに
以下の作用物質：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）アクチベーター、ｉｉ）ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）経路アクチベーター、ｉｉｉ）ｍＴＯＲインヒビター、並びにｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＴＳＬＰの群において選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で、請求項１〜４に記載の生成方法によって取得されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団を少なくとも５日間培養するエクスパンション工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記制御性Ｔ細胞集団が、トリプトファン、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３及びＩＬ−２を含む培地中においてＩＬ−１７の分泌がない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

トリプトファン、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３及びＩＬ−２を含む培地中において、依然として通常Ｔ細胞の増殖の阻害が可能であるex vivo生成ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団であって、以下の表現型：ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する、制御性Ｔ細胞集団。

【請求項8】

以下の表現型：ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＩＬ−１Ｒ１⁻を有する、請求項７に記載のex vivo生成ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団。

【請求項9】

以下の表現型：ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有し；
トリプトファン、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３及びＩＬ−２を含む培地中において、依然として通常Ｔ細胞の増殖の阻害が可能である
ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団と、
少なくとも薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項10】

細胞療法において使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

炎症性疾患若しくは自己免疫疾患の処置において使用するための、又は移植拒絶若しくは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項12】

炎症性疾患若しくは自己免疫疾患の処置において使用するための、又は移植拒絶若しくは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための、医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により生成されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を生成及びエクスパンションするためのex vivo方法並びにその治療的使用に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
ガン細胞特異的制御性Ｔ細胞サブセットに対する抗イディオタイプガンワクチンのための免疫原としての、又は自己免疫疾患及び同種免疫疾患の処置のための養子療法における制御性Ｔ細胞の使用は、多くの課題に関連する。

【0003】

第１に、適切な精製のための特異的細胞マーカー、例えばＦｏｘｐ３タンパク質の欠如は、その核内位置のために利用可能ではない。ＣＤ２５及びＣＤ１２７の組み合わせもまた、純粋な制御性Ｔ細胞の単離に不十分であることが証明されている。純粋性の欠如は、エフェクターＴ細胞のコンタミネーションによって引き起こされ、これは、精製制御性Ｔ細胞の効力を減少させる。

【0004】

第２に、制御性Ｔ細胞ベースの細胞療法のための十分な数の細胞を生成するためのin vitroエクスパンション工程の必要性がある。この外部操作は、制御性Ｔ細胞機能の変化を誘導し、抑制機能の喪失及び炎症促進性サイトカインの産生をもたらす。

【0005】

第３に、末梢血中の抗原特異的制御性Ｔ細胞は低頻度であり、これらの細胞を単離するための適切なペプチド−ＭＨＣ多量体の利用可能性は限定されているので、ヒト末梢血からの抗原特異的制御性Ｔ細胞の単離は困難かつ非実用的である。

【0006】

したがって、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からの制御性Ｔ細胞のin vitro誘導を提供する方法の必要性がある。

【0007】

しかしながら、炎症状況では、制御性Ｔ細胞は、組織炎症を促進するＩＬ−１７及びＩＬ−２１サイトカインを分泌するＴＨ−１７細胞に変質し得ることが示されている(Koenen et al. Blood 2008, 112 (6): 2340-2352)。in vivoにおけるＴＨ−１７細胞への制御性Ｔ細胞の変質は望ましくないので、これは、細胞療法におけるそれらの使用にとって大きな欠点である。

【0008】

したがって、本発明は、炎症条件において依然として安定である（すなわち、ＴＨ１７細胞に変質しない）ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞をex vivoで生成及びエクスパンションするための方法を提供する。

【発明の概要】

【0009】

概要
本発明は、以下の表現型：ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有するＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞をex vivoで生成するための方法であって、
−ＴＣＲαβ細胞アクチベーター並びに以下の作用物質：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）アクチベーター、ｉｉ）ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）経路アクチベーター、ｉｉｉ）ｍＴＯＲインヒビター、並びに場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＴＳＬＰの群において選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を少なくとも５日間培養することを含む方法に関する。

【0010】

一実施態様では、ＴＣＲαβ細胞アクチベーターは、ポリクローナルＴＣＲαβ細胞アクチベーター、好ましくは抗ＣＤ３抗体又は抗ＴＣＲαβ抗体である。

【0011】

本発明の一実施態様では、αβ細胞アクチベーターは、抗原特異的ＴＣＲαβ細胞アクチベーター、好ましくは寛容原性樹状細胞（ＤＣ）であり、少なくとも１つの自己ペプチド抗原でパルスされている。

【0012】

一実施態様によれば、ｃＡＭＰアクチベーターは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＥＰ２又はＥＰ４アゴニスト、膜アデニンシクラーゼアクチベーター又は代謝型グルタミン酸レセプターアゴニストを含む群から選択される。

【0013】

一実施態様では、ＴＧＦβ経路アクチベーターは、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン及びノーダルを含む群から選択される。

【0014】

一実施態様では、ｍＴＯＲインヒビターは、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ワートマニン；テオフィリン；カフェイン；没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、クルクミン、レスベラトロル；ゲニステイン、３，３−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｔｏｒｉｎ１、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−６８７、ＷＹＥ−３５４、ＧＮＥ４７７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＩ−１０３、ＸＬ７６５及びＷＪＤ００８である。

【0015】

一実施態様では、本発明の方法は、αβＴ細胞アクチベーター並びに以下の作用物質：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）アクチベーター、ｉｉ）ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）経路アクチベーター、ｉｉｉ）ｍＴＯＲインヒビター、並びに場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＴＳＬＰの群において選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で、上記生成方法によって取得されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を少なくとも５日間培養するエクスパンション工程をさらに含む。

【0016】

本発明はまた、本発明の方法によって取得可能なex vivo生成ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団に関する。

【0017】

本発明はさらに、本発明の方法によって取得可能なex vivo生成及びエクスパンションＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団に関する。

【0018】

本発明の別の目的は、炎症条件において依然として安定であるex vivo生成ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団である。

【0019】

本発明のさらなる目的は、不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を含む免疫原性産物である。

【0020】

本発明はまた、不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞と、少なくとも薬学的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物に関する。

【0021】

本発明はさらに、不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞と、少なくとも１つのアジュバントとを含むワクチン組成物に関する。

【0022】

本発明の別の目的は、ガンの処置において使用するための本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物に関する。

【0023】

本発明のさらなる目的は、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物である。

【0024】

本発明はまた、細胞療法において使用するための本発明の医薬組成物に関する。

【0025】

本発明はさらに、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患の処置において使用するための、又は移植拒絶若しくは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための上記医薬組成物に関する。

【0026】

定義
本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」は、細胞間接触によって、又はＭＬＲ抑制（混合リンパ球反応）によって抑制活性（すなわち、通常Ｔ細胞の増殖の阻害）が可能な細胞を指す。これらの細胞は、限定されないが、末梢制御性Ｔ細胞、γδ制御性Ｔ細胞及び不変制御性Ｔ細胞を含む異なるサブ集団を含む。

【0027】

本明細書で使用される場合、「不変制御性Ｔ細胞」は、以下の表現型：ＣＤ３^＋Ｖα２４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する細胞を指す。これらの細胞は、ＣＤ１拘束下で非ペプチド脂質抗原を認識する。

【0028】

本明細書で使用される場合、「γδ制御性Ｔ細胞」は、以下の表現型：γδＴＣＲ^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する細胞を指す。これらの細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）拘束なしで非ペプチドホスホ抗原を認識する。

【0029】

本明細書で使用される場合、「ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞」は、以下の表現型：ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する細胞を指す。これらの細胞は、胸腺由来又は末梢性である。これらの細胞は、それらのαβＴＣＲ（Ｔ細胞レセプター）によって同定され得、拘束性ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）分子によって提示されるペプチド（外来ペプチド又は自己ペプチドを含む）を認識し得る。

【0030】

本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、目的が、病理学的なターゲット障害又は症状を予防し又は減速させる（緩和する、軽減する）ことである治療的処置並びに防止的及び予防的手段を指す。処置を必要とするものとしては、障害を既に有するもの、及び障害を有しやすいもの、又は障害を予防すべきものが挙げられる。本発明の治療量のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞又は治療量の不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の投与後、患者が、以下：病原性細胞の数の減少；病原性である全細胞のパーセントの減少；及び／又は特定の疾患若しくは症状に関連する症候の１つ以上のある程度の軽減；罹患率及び死亡率の減少、並びに生活の質の問題の改善の１つ以上の観察可能及び／又は測定可能な低減又は非存在を示す場合、被験体又は哺乳動物は、疾患の処置が成功している。疾患の処置及び改善の成功を評価するための上記パラメータは、医師が精通するルーチンな手順によって容易に測定可能である。

【0031】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、ターゲットに対する有意なマイナスの又は有害な副作用を引き起こさずに治療的応答を誘導することを目的とする、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞又は不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の数を指す。治療有効量は、防止的又は予防的作用のために、処置すべき疾患の発症前に投与され得る。あるいは又は加えて、治療有効量は、治療的作用のために、処置すべき疾患の開始後に投与され得る。

【0032】

本明細書で使用される場合、「治療的応答」は、被験体において、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞療法又はＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞ワクチン接種によって誘導される治療的利益を指す。治療的応答としては、（１）処置すべき疾患の発症の遅延若しくは予防；（２）処置すべき疾患の１つ以上の症候の進行、悪化若しくは増悪の減速若しくは停止；（３）処置すべき疾患の症候の改善の誘発；（４）処置すべき疾患の重症度若しくは発生率の減少；又は（５）処置すべき疾患の治癒という事実が挙げられ得る。

【0033】

本明細書で使用される場合、数字の前の「約」は、前記数字の値の１０％超又は未満を意味する。

【0034】

本明細書で使用される場合、「被験体又は患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。本発明では、被験体及び患者という用語は、同じ意味で使用され得る。非ヒト哺乳動物の例としては、ペット、例えばイヌ、ネコ、家畜ブタ、ウサギ、フェレット、ハムスター、マウス、ラットなど；霊長類、例えばチンパンジー、サルなど；経済的に重要な動物、例えばウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギが挙げられる。一実施態様では、被験体は、医療ケアを受けるのを待っているか、若しくは医療ケアを受けているか、又は医療手順の対象であった／である／になるか、又は疾患の発症についてモニタリングされる。一実施態様では、被験体は、成人（例えば、１８歳超の被験体）である。別の実施態様では、被験体は、子供（例えば、１８歳未満の被験体）である。一実施態様では、被験体は、男性である。別の実施態様では、被験体は、女性である。

【0035】

本明細書で使用される場合、「同種細胞」は、ある被験体（ドナー）から単離されて別の被験体（レシピエント又は宿主）に注入される細胞を指す。

【0036】

本明細書で使用される場合、「自己細胞」は、単離されて同じ被験体（レシピエント又は宿主）に再び注入される細胞を指す。

【0037】

詳細な説明
本発明は、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞をex vivoで生成するための方法に関する。

【0038】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞をex vivoで生成するための方法は、
−ＴＣＲαβアクチベーター並びに以下の作用物質：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）アクチベーター、ｉｉ）ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）経路アクチベーター、ｉｉｉ）ｍＴＯＲインヒビター、並びに場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＴＳＬＰ（胸腺間質性リンパ球新生因子）の群において選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞を少なくとも５日間培養すること、
−それにより、好ましくはナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ^＋）Ｔ細胞から、ex vivoで生成されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の集団を取得すること
を含む。

【0039】

一実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、当技術分野で周知の任意の技術によって、血液サンプルから取得される。一実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、フローサイトメトリーによって、又は例えばＭＡＣＳシステムを使用した陰性選択によって、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）から単離される。

【0040】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋である。

【0041】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋である。

【0042】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋である。

【0043】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0044】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−６Ｒ⁻である。

【0045】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0046】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0047】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ１２７^＋である。

【0048】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ２７^＋である。

【0049】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＣＤ２７^＋である。

【0050】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0051】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−６Ｒ⁻である。

【0052】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0053】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0054】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0055】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻である。

【0056】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0057】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0058】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0059】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻である。

【0060】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0061】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0062】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0063】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0064】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−３３Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0065】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−６Ｒ⁻である。

【0066】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−３３Ｒ⁻ＩＬ−６Ｒ⁻である。

【0067】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0068】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ２７^＋である。

【0069】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ１２７^＋ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0070】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ１２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻である。

【0071】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ１２７^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0072】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ１２７^＋ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0073】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ２７^＋ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0074】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻である。

【0075】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ２７^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0076】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ２７^＋ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0077】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＣＤ２７^＋ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0078】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＣＤ２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻である。

【0079】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＣＤ２７^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0080】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＣＤ２７^＋ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0081】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0082】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0083】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−３３Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0084】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0085】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0086】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0087】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0088】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0089】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−３３Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0090】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0091】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0092】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0093】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0094】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0095】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−３３Ｒ⁻ＩＬ−１Ｒ１⁻である。

【0096】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0097】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0098】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0099】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１Ｒ１⁻ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−２３Ｒ⁻である。

【0100】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１Ｒ１⁻ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0101】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0102】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１Ｒ１⁻ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0103】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ２７^＋ＩＬ−１Ｒ１⁻ＩＬ−６Ｒ⁻ＩＬ−２３Ｒ⁻ＩＬ−３３Ｒ⁻である。

【0104】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、ＴＣＲγδ⁻である。

【0105】

別の実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、Ｖα２４⁻である。

【0106】

一実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、凍結ＰＢＭＣから単離され得る。

【0107】

一実施態様では、単離されたＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞の取得は、任意選択の第１の精製工程によって改善され得る。ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞は、可溶性抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ４０抗体の存在下で、抗原パルス寛容原性ＤＣ（例えば、オボアルブミンパルス寛容原性ＤＣ）によって刺激される。一実施態様では、刺激の時間は、１時間〜２４時間、好ましくは１０時間〜２０時間の範囲であり、より好ましくは約１６時間である。刺激後、例えばＰＢＳで細胞を洗浄し、選別のために抗ＣＤ１５４及び抗ＣＤ４抗体で染色する。精製ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ１５４^＋Ｔ細胞を濃縮し、次の活性化工程に使用し得る。

【0108】

一実施態様では、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞は、αβＴＣＲ細胞アクチベーターの存在下で活性化される。前記αβＴＣＲ細胞アクチベーターは、ポリクローナルαβＴＣＲ細胞アクチベーター又は抗原特異的αβＴＣＲ細胞アクチベーターであり得る。

【0109】

本発明では、ポリクローナルαβＴＣＲ細胞アクチベーターは、ＴＣＲαβアクチベーターである。ＴＣＲαβアクチベーターの例としては、限定されないが、抗ＴＣＲαβ抗体、例えば精製抗ヒトＴＣＲα／β抗体(ref 306702, Biolegend)、抗ヒトαβＴＣＲ抗体(ref 11-9986-41, eBioscience)、抗ヒトＴＣＲαβ(ref 563826, BD Biosciences)、ＴＣＲα／β抗体(ref GTX80083, GeneTex)；抗ＣＤ３抗体、例えば精製抗ヒトＣＤ３抗体(ref 344801, BioLegend)、抗ＣＤ３抗体(ab5690, Abcam)、精製抗ヒトＣＤ３(ref 14-0038-80, eBioscience)、ＣＤ３抗体(ref MA5-17043, Invitrogen antibodies)、ＣＤ３モノクローナル抗体(ref ALX-804-822-C100, Enzo Life Sciences)、ヒトＣＤ３抗体(ref 130-098-162, Miltenyi Biotec)；マイトジェン、例えばヤマゴボウマイトジェン、イオノマイシン、ホルボールミリスチン酸アセタート（ＰＭＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、超抗原、例えばブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＰＥ）、レトロウイルス抗原、連鎖球菌抗原、マイコプラズマ抗原、マイコバクテリウム抗原、ウイルス抗原（例えば、マウス乳ガンウイルス由来の超抗原、狂犬病ウイルス又はヘルペスウイルス）及び内部寄生虫抗原（例えば、原生動物抗原又は蠕虫抗原）が挙げられる。

【0110】

一実施態様では、ポリクローナルＴＣＲαβ細胞アクチベーターは、抗ＴＣＲαβ抗体又は抗ＣＤ３抗体である。

【0111】

一実施態様では、ポリクローナルＴＣＲαβ細胞アクチベーター、好ましくは抗ＴＣＲαβ又は抗ＣＤ３抗体は、培養培地中で可溶性である。別の実施態様では、ポリクローナルＴＣＲαβ細胞アクチベーターは、培養プレートにコーティングされる。

【0112】

一実施態様では、ポリクローナルＴＣＲαβ細胞アクチベーターは、フィーダー細胞、好ましくは自己フィーダー細胞の存在下で使用される。

【0113】

フィーダー細胞としては、限定されないが、ΔＣＤ３細胞（Ｔ細胞枯渇アクセサリー細胞）、照射ＰＢＭＣ、照射ＤＣ、人工ＡＰＣ（抗原提示細胞）、Ｓｆ９細胞、昆虫細胞、異なる被験体由来のＰＢＭＣプール又はＢ細胞プール、ＫＣＤ４０Ｌ細胞、ＥＢＶトランスフォーメーションＢ細胞株及びＥＢＶトランスフォーメーションリンパ芽球細胞（ＬＣＬ）が挙げられる。

【0114】

好ましくは、本発明において使用されるフィーダー細胞は、抗ＣＤ３コーティングビーズとのインキュベーションによってＰＢＭＣから陰性選択によって単離され、次いで、３０００radで照射されたΔＣＤ３細胞である。

【0115】

一実施態様では、Ｔ細胞／フィーダー細胞の比は、約１：１００〜約１：１００００、好ましくは１：１０００〜１：５０００である。本発明の範囲内では、「１：１００〜１：１００００」という表現は、限定されないが、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：１２５０、１：１５００、１：１７５０、１：２０００、１：２２５０、１：２５００、１：２７５０、１：３０００、１：３２５０、１：３５００、１：３７５０、１：４０００、１：４２５０、１：４５００、１：４７５０、１：５０００、１：５２５０、１：５５００、１：５７５０、１：６０００、１：６２５０、１：６５００、１：６７５０、１：７０００、１：７２５０、１：７５００、１：７７５０、１：８０００、１：８２５０、１：８５００、１：８７５０、１：９０００、１：９２５０、１：９５００、１：９７５０及び１：１００００を含む。

【0116】

本発明では、抗原特異的ＴＣＲαβ細胞アクチベーターは、寛容原性樹状細胞（ＤＣ）である。

【0117】

本明細書で使用される場合、「寛容原性ＤＣ」は、寛容を誘導することができるＤＣを指す。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−２３又はＴＮＦαよりも多くの抑制性サイトカイン、例えばＩＬ−１０及びＴＧＦβを分泌することができる。一実施態様では、ＤＣは、それらが比ＩＬ−１０：ＩＬ−１２＞１でＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分泌する場合、寛容原性であると定義される。

【0118】

一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩａ及び／又はＭＨＣクラスＩｂを発現する。ＭＨＣクラスＩａ提示は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子を介した「古典的な」提示を指すのに対して、ＭＨＣクラスＩｂ提示は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ及び／又はＨＬＡ−Ｈ分子を介した「非古典的な」抗原提示を指す。

【0119】

一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、５０％のＭＨＣクラスＩａ分子及び５０％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、４５％のＭＨＣクラスＩａ分子及び５５％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、４０％のＭＨＣクラスＩａ分子及び６０％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、３５％のＭＨＣクラスＩａ分子及び６５％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、３０％のＭＨＣクラスＩａ分子及び７０％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、２５％のＭＨＣクラスＩａ分子及び７５％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、２０％のＭＨＣクラスＩａ分子及び８０％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、１５％のＭＨＣクラスＩａ分子及び８５％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、１０％のＭＨＣクラスＩａ分子及び９０％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、５％のＭＨＣクラスＩａ分子及び９５％のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、ＭＨＣクラスＩｂ分子のみを発現する。

【0120】

一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、５０％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに５０％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、４５％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに５５％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、４０％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに６０％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、３５％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに６５％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、３０％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに７０％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、２５％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに７５％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、２０％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに８０％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、１５％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに８５％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、１０％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに９０％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、５％のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子並びに９５％のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施態様では、寛容原性ＤＣは、それらの表面上で、ＨＬＡ−Ｅ分子のみを発現する。

【0121】

寛容原性ＤＣを取得するための方法は、当技術分野で周知である。例示的な方法は、ＣＤ１４^＋単球からの寛容原性ＤＣの生成である。例えば、未成熟ＤＣの生成のために、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で、又はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮαの存在下で、ＣＤ１４^＋単球を培養する。

【0122】

寛容原性ＤＣの表面上におけるＭＨＣクラスＩａ分子の発現を阻害するか又はＨＬＡ−Ｅ分子の発現を誘導するための方法は周知である。

【0123】

ＴＡＰトランスポーター（抗原プロセシングに関連するトランスポーター）の阻害は、ＭＨＣクラスＩａ分子の発現の減少をもたらし、それにより、寛容原性ＤＣの表面上におけるＨＬＡ−Ｅ分子発現を促進する。

【0124】

小胞体におけるＴＡＰトランスポーターを阻害するための例示的な方法としては、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ−９技術、サイレンシングＲＮＡ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）由来のＵＬ−１０ウイルスタンパク質を有するトランスフェクションＤＣ、又はウイルスタンパク質の使用が挙げられる。

【0125】

ＴＡＰトランスポーターを阻害することができるウイルスタンパク質の例としては、限定されないが、ＨＳＶ−１ ＩＣＰ４７タンパク質、水痘ウイルスＵＬ４９．５タンパク質、サイトメガロウイルスＵＳ６タンパク質又はガンマヘルペスウイルスＥＢＶ ＢＮＬＦ２ａタンパク質が挙げられる。

【0126】

別の方法は、寛容原性ＤＣの表面上におけるＨＬＡ−Ｅ発現を変化させずにＭＨＣクラスＩａ分子の発現を阻害するための化学製品の使用である。化学製品の例としては、限定されないが、５’−メチル−５’−チオアデノシン又はレプトマイシンＢが挙げられる。

【0127】

寛容原性ＤＣは、少なくとも１つの自己ペプチド抗原、改変自己ペプチド抗原、過剰発現自己ペプチド抗原又は外来抗原の存在下でパルスされる。「自己ペプチド抗原」は、制御性Ｔ細胞が由来する体内で通常発現される抗原を意味する。別の実施態様では、自己抗原は、制御性Ｔ細胞が由来する体内で通常発現されるものと同程度であるか、又は別の実施態様ではそれと区別不可能であるが、抗原に直接対応しないものであり得る。別の実施態様では、自己抗原は、体内で発現されると自己反応性Ｔ細胞の養成をもたらし得る抗原を指す。一実施態様では、自己抗原は、自己免疫疾患のターゲットである器官において発現される。一実施態様では、自己抗原は、膵臓、甲状腺、結合組織、腎臓、肺、消化器系又は神経系において発現される。別の実施態様では、自己抗原は、膵臓β細胞上で発現される。

【0128】

自己ペプチド抗原、改変自己ペプチド抗原及び過剰発現自己ペプチド抗原の例としては、限定されないが、インスリン、インスリンβ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ１（ＧＡＤ１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、ＨＳＰ、チログロブリン、核タンパク質、アセチルコリンレセプター、コラーゲン、甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）、ＩＣＡ５１２（ＩＡ−２）及びＩＡ−２β（フォグリン）、カルボキシペプチダーゼＨ、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２、甲状腺ペルオキシダーゼ、ネイティブなＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコインレセプター成分、組織適合抗原、移植片拒絶に関与する抗原、並びに変化ペプチドリガンドの抗原性ペプチドが挙げられる。

【0129】

別の実施態様では、自己ペプチド抗原は、ガン細胞由来の免疫原性アポトーシス小体に由来するか、又は組織溶解物に由来する。

【0130】

ガン細胞は、腫瘍生検に由来し得るか、又は循環ガン細胞のエクスパンションに由来し得る。

【0131】

ガン細胞由来の免疫原性アポトーシス小体は、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンを含むアントラサイクリン；オキサリプラチン、ＵＶＣ若しくはγ線で処置されたアポトーシス小体放出ガン細胞を用いて取得され得るか、又はドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンを含むアントラサイクリン；オキサリプラチン；ＵＶＣ若しくはγ線で処置されたガンから直接単離され得る。

【0132】

組織溶解物の例としては、限定されないが、滑液又は炎症性組織溶解物が挙げられる。

【0133】

「外来抗原」は、それに曝露される哺乳動物にとって内因性でもネイティブでもない１つ又は複数の分子を意味する。外来抗原は、哺乳動物において免疫応答、例えば体液性及び／又はＴ細胞性応答を誘発し得る。一般に、外来抗原は、それに対する抗体の産生をもたらすであろう。外来抗原の例としては、限定されないが、タンパク質（改変タンパク質、例えば糖タンパク質、ムコタンパク質などを含む）、核酸、炭水化物、プロテオグリカン、脂質、ムチン分子、免疫原性治療剤（タンパク質、例えば抗体、特に非ヒトアミノ酸残基を含む抗体、例えば齧歯類、キメラ／ヒト化及び霊長類化抗体を含む）、毒素（ターゲティング分子、例えば抗体に場合によりコンジュゲートされており、ターゲティング分子は免疫原性でもあり得る）、遺伝子治療ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス及びアデノウイルス）、移植片（移植片レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓に移植すべき移植片の抗原性成分及び神経移植片成分を含む）、感染性因子（例えば、細菌及びウイルス又は他の生物、例えば原生生物）、同種抗原（すなわち、同じ種の一部のメンバーに存在するが他のメンバーに存在しない抗原）、例えば血液型の差異、ヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）、血小板抗原、移植器官上で発現される抗原、血液成分、妊娠（Ｒｈ）及び血友病因子（例えば、第ＶＴｆｌ因子及び第ＩＸ因子）が挙げられる。

【0134】

一実施態様では、自己ペプチド抗原又は外来抗原は、可溶性である。

【0135】

一実施態様では、培養物に追加されるｃＡＭＰアクチベーターは、ｃＡＭＰ経路の活性化を可能にする。ｃＡＭＰアクチベーターの例としては、限定されないが、ＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ２）、ＥＰ２又はＥＰ４アゴニスト、膜アデニンシクラーゼアクチベーター、例えばフォルスコリン又は代謝型グルタミン酸レセプターアゴニストが挙げられる。ＰＧＥ２の例としては、限定されないが、ref P5640又はP0409のＰＧＥ２(Sigma-Aldrich)、ref 2296のＰＧＥ２(R&D Systems)、ref 2268のＰＧＥ２(BioVision)、ref 72192のＰＧＥ２(Stemcell)、ref ab144539のＰＧＥ２(Abcam)及びref 14010のＰＧＥ２(Cayman Chemical)が挙げられる。

【0136】

一実施態様では、ｃＡＭＰアクチベーター、好ましくはＰＧＥ２は、０．０１μM〜１０μMの範囲の濃度で使用される。本発明の範囲内では、「０．０１μM〜１０μM」という表現は、限定されないが、０．０２μM、０．０３μM、０．０４μM、０．０５μM、０．０６μM、０．０７μM、０．０８μM、０．０９μM、０．１μM、０．２μM、０．３μM、０．４μM、０．５μM、０．６μM、０．７μM、０．８μM、０．９μM、１μM、１．５μM、２μM、２．５μM、３μM、３．５μM、４μM、４．５μM、５μM、６μM、７μM、８μM、９μMを含む。特定の実施態様では、ＰＧＥ２は、０．０３μM〜１．５μMの範囲の濃度である。

【0137】

一実施態様では、培養物に追加されるＴＧＦβ経路アクチベーターは、ＴＧＦβ経路の活性化を可能にする。ＴＧＦβ経路アクチベーターの例としては、限定されないが、ＴＧＦβファミリー（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン及びノーダルが挙げられる。ＴＧＦβの例としては、限定されないが、ref T7039のＴＧＦβ１(Sigma-Aldrich)、ref T2815のＴＧＦβ２(Sigma-Aldrich)、ref T5425のＴＧＦβ３(Sigma-Aldrich)、ref P01137のヒトＴＧＦβ１(R&D system)、ref 580702のヒトＴＧＦβ１(Biolegend)、ref HZ-1011のＴＧＦβ１(HumanZyme)、ref 14-8348-62のヒトＴＧＦβ１(Affymetrix eBioscience)が挙げられる。

【0138】

一実施態様では、経路アクチベーターは、１ng/ml〜２０ng/mlの範囲の濃度で使用される。本発明の範囲内では、「１ng/ml〜２０ng/ml」という表現は、限定されないが、２ng/ml、２．５ng/ml、３ng/ml、３．５ng/ml、４ng/ml、４．５ng/ml、５ng/ml、５．５ng/ml、６ng/ml、６．５ng/ml、７ng/ml、７．５ng/ml、８ng/ml、８．５ng/ml、９ng/ml、９．５ng/ml、１０ng/ml、１１ng/ml、１２ng/ml、１３ng/ml、１４ng/ml、１５ng/ml、１６ng/ml、１７ng/ml、１８ng/ml、１９ng/mlを含む。特定の実施態様では、ＴＧＦβは、２．５ng/ml〜７．５ng/mlの範囲の濃度である。

【0139】

一実施態様では、培養物に追加されるｍＴＯＲインヒビターは、ｍＴＯＲ経路の阻害を可能にする。ｍＴＯＲインヒビターの例としては、限定されないが、ラパマイシン（シロリムスとも呼ばれる）及びその類似体（ラパログとも呼ばれる）；ワートマニン；テオフィリン；カフェイン；没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）；クルクミン；レスベラトロル；ゲニステイン；３，３−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）；ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）；ＰＰ２４２；ＰＰ３０；Ｔｏｒｉｎ１；Ｋｕ−００６３７９４；ＷＡＹ−６００；ＷＹＥ−６８７；ＷＹＥ−３５４；並びにｍＴＯＲ及びＰＩ３Ｋ二重特異性インヒビター、例えばＧＮＥ４７７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＩ−１０３、ＸＬ７６５及びＷＪＤ００８が挙げられる。ラパマイシンの例としては、限定されないが、ref R0395のラパマイシン(Sigma-Aldrich)、ref S1039のラパマイシン(Selleckchem)、ref 1292のラパマイシン(Tocris)、ref R-5000のラパマイシン(LC Laboratories)、ref tlrl-rapのラパマイシン(InvivoGen)、ref ab120224のラパマイシン(Abcam)、ref R0395のラパマイシン(Sigma-Aldrich)が挙げられる。

【0140】

臨床的に使用されるラパマイシンと同じ化学クラスの化合物の例としては、限定されないが、エベロリムス（コード名RAD001）、テムシロリムス（コード名CCI-779、NSC 683864）、ゾタロリムス（コード名ABT-578）が挙げられる。

【0141】

一実施態様では、ｍＴＯＲインヒビター、好ましくはラパマイシンは、０．１nM〜５０nMの範囲の濃度で使用される。本発明の範囲内では、「０．１nM〜５０nM」という表現は、限定されないが、０．２nM、０．３nM、０．４nM、０．５nM、０．６nM、０．７nM、０．８nM、０．９nM、１nM、２nM、３nM、４nM、５nM、６nM、７nM、８nM、９nM、１０nM、１１nM、１２nM、１３nM、１４nM、１５nM、１６nM、１７nM、１８nM、１９nM、２０nM、２１nM、２２nM、２３nM、２４nM、２５nM、２６nM、２７nM、２８nM、２９nM、３０nM、３１nM、３２nM、３３nM、３４nM、３５nM、３６nM、３７nM、３８nM、３９nM、４０nM、４１nM、４２nM、４３nM、４４nM、４５nM、４６nM、４７nM、４８nM、４９nMを含む。

【0142】

一実施態様では、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＴＳＬＰから選択される少なくとも１つのサイトカインが培養物に追加され得る。

【0143】

一実施態様では、ＩＬ−２は、１０IU/ml〜１０００IU/mlの範囲の濃度で使用される。本発明の範囲内では、「１０IU/ml〜１０００IU/ml」という表現は、限定されないが、１５IU/ml、２０IU/ml、２５IU/ml、３０IU/ml、３５IU/ml、４０IU/ml、４５IU/ml、５０IU/ml、５５IU/ml、６０IU/ml、６５IU/ml、７０IU/ml、７５IU/ml、８０IU/ml、８５IU/ml、９０IU/ml、９５IU/ml、１００IU/ml、１５０IU/ml、２００IU/ml、２５０IU/ml、３００IU/ml、３５０IU/ml、４００IU/ml、４５０IU/ml、５００IU/ml、５５０IU/ml、６００IU/ml、６５０IU/ml、７００IU/ml、７５０IU/ml、８００IU/ml、８５０IU/ml、９００IU/ml、９５０IU/mlを含む。特定の実施態様では、ＩＬ−２は、５０IU/ml〜２５０IU/mlの範囲の濃度で使用される。

【0144】

一実施態様では、ＩＬ−７は、１ng/ml〜１００ng/mlの範囲の濃度で使用される。本発明の範囲内では、「１ng/ml〜１００ng/ml」という表現は、限定されないが、１ng/ml、５ng/ml、１０ng/ml、１５ng/ml、２０ng/ml、２５ng/ml、３０ng/ml、３５ng/ml、４０ng/ml、４５ng/ml、５０ng/ml、５５ng/ml、６０ng/ml、６５ng/ml、７０ng/ml、７５ng/ml、８０ng/ml、８５ng/ml、９０ng/ml、９５ng/ml、１００ng/mlを含む。

【0145】

一実施態様では、ＩＬ−１５は、１ng/ml〜５０ng/mlの範囲の濃度で使用される。本発明の範囲内では、「１ng/ml〜５０ng/ml」という表現は、限定されないが、２ng/ml、３ng/ml、４ng/ml、５ng/ml、６ng/ml、７ng/ml、８ng/ml、９ng/ml、１０ng/ml、１５ng/ml、２０ng/ml、２５ng/ml、３０ng/ml、３５ng/ml、４０ng/ml、４５ng/mlを含む。特定の実施態様では、ＩＬ−１５は、１０ng/ml〜３０ng/mlの範囲の濃度で使用される。

【0146】

一実施態様では、ＴＳＬＰは、１ng/ml〜１００ng/mlの範囲の濃度で使用される。本発明の範囲内では、「１ng/ml〜１００ng/ml」という表現は、限定されないが、１ng/ml、５ng/ml、１０ng/ml、１５ng/ml、２０ng/ml、２５ng/ml、３０ng/ml、３５ng/ml、４０ng/ml、４５ng/ml、５０ng/ml、５５ng/ml、６０ng/ml、６５ng/ml、７０ng/ml、７５ng/ml、８０ng/ml、８５ng/ml、９０ng/ml、９５ng/ml、１００ng/mlを含む。

【0147】

一実施態様では、制御性Ｔ細胞の他の集団の生成を防止するために、中和抗体が培養物に追加され得る。

【0148】

中和抗体の例としては、限定されないが、抗ＩＦＮγ、抗ＩＬ−４及び／又は抗ＩＬ−１２抗体が挙げられる。

【0149】

抗ＩＦＮγ抗体の例としては、限定されないが、Affymetrix eBioscience (Ref 14-7318)、R&D systems (Ref MAB285)、Novus Biologicals (Ref AF-485-NA)が挙げられる。

【0150】

抗ＩＬ−４抗体の例としては、限定されないが、R&D Systems (Ref MAB304、MAB204又はMAB204)、Affymetrix eBioscience (Ref 14-7048)、GeneTex (Ref GTX10755)が挙げられる。

【0151】

抗ＩＬ−１２抗体の例としては、限定されないが、Affymetrix eBioscience (Ref 16-7129又は16-8126)、Biolegend (Ref 508803)、R&D systems (Ref MAB219、AF-219又はAB-219)が挙げられる。

【0152】

一実施態様では、本発明の培養において使用される培養培地は、（ｉ）１つ以上のｐＨ緩衝系；（ｉｉ）無機塩；（ｉｉｉ）微量元素；（ｉｖ）遊離アミノ酸；（ｖ）ビタミン；（ｖｉ）ホルモン；（ｖｉｉ）炭素／エネルギー源を含む。

【0153】

無機塩の例としては、限定されないが、臭化カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、硫酸カルシウム、臭化マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、重炭酸カリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、二硫酸カリウム、リン酸水素二カリウム、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、亜硫酸カリウム、硫酸カリウム、重炭酸ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、二硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸ナトリウム及びそれらの混合物が挙げられる。

【0154】

微量元素の例としては、限定されないが、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、セレン（Ｓｅ）、亜鉛（Ｚｎ）及びそれらの塩が挙げられる。

【0155】

遊離アミノ酸の例としては、限定されないが、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン及びそれらの混合物が挙げられる。

【0156】

ビタミンの例としては、限定されないが、ビオチン（ビタミンＨ）；Ｄ−パントテン酸カルシウム；塩化コリン；葉酸（ビタミンＢ９）；ミオイノシトール；ニコチンアミド；ピリドキサール（ビタミンＢ６）；リボフラビン（ビタミンＢ２）；チアミン（ビタミンＢ１）；コバラミン（ビタミンＢ１２）；アスコルビン酸；α−トコフェロール（ビタミンＥ）及びそれらの混合物が挙げられる。

【0157】

炭素／エネルギー源の例としては、限定されないが、Ｄ−グルコース；ピルビン酸塩；乳酸塩；ＡＴＰ；クレアチン；クレアチンリン酸；及びそれらの混合物が挙げられる。

【0158】

一実施態様では、培養培地は、特にGIBCO（登録商標）のＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）又はGIBCO（登録商標）のＲＰＭＩ１６４０培地を含む群において選択される市販の細胞培養培地である。

【0159】

別の実施態様では、培養培地は、無血清培養培地、例えばGIBCO（登録商標）のＡＩＭ−Ｖ培地、LONZAのＸ−ＶＩＶＯ１０、１５及び２０培地である。

【0160】

別の実施態様では、培養培地は、特にウシ胎仔血清、プールされたヒトＡＢ血清、サイトカイン及び成長因子を含む群において選択されるさらなる化合物；特にペニシリン、ストレプトマイシン及びそれらの混合物を含む群において選択される抗生物質がさらに補充され得る。

【0161】

一実施態様では、培養培地は、ＩＭＤＭである。

【0162】

いくつかの特定の実施態様では、培養培地は、ＩＭＤＭ細胞培養培地；１％（w/w）〜５％（w/w）のウシ胎仔血清；１０IU/ml〜２００IU/mlのペニシリン；１０IU/ml〜２００IU/mlのストレプトマイシン；０．１mM〜１０mMの非必須アミノ酸、特にアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン及びチロシンを含む群において選択されるアミノ酸の混合物；０．５mM〜１０mMのグルタミン、１０mM〜２５mMのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６〜７．８を含む。

【0163】

一実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を生成するための培養は、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間実施される。本発明の範囲内では、「少なくとも５日間」という表現は、限定されないが、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間を含む。

【0164】

一実施態様では、培養培地の一部は、生成培養の経過中に１回、２回、３回、４回又は５回廃棄され、同じ容量の新鮮培養培地と交換される。本発明の範囲内では、「一部」という用語は、培養培地の容量の少なくとも２０％（v/v）、少なくとも２５％（v/v）、少なくとも３０％（v/v）、少なくとも３５％（v/v）、少なくとも４０％（v/v）、少なくとも４５％（v/v）、少なくとも５０％（v/v）、少なくとも５５％（v/v）、少なくとも６０％（v/v）、少なくとも６５％（v/v）、少なくとも７０％（v/v）、少なくとも７５％（v/v）を意味することを意図する。特定の実施態様では、工程ａ）の培養培地の容量の４０％（v/v）〜６０％（v/v）が廃棄される。特定の実施態様では、廃棄される容量は、同一容量の新鮮培養培地と交換される。本発明の範囲内では、「新鮮培養培地」という表現は、いかなるＣＤ３^＋Ｔ細胞とも接触されていない培養培地を指す。

【0165】

一実施態様では、培地は、ｎＴｒｅｇ極性培地である。本発明者らは、少なくとも１つの上記ｃＡＭＰアクチベーター、少なくとも１つの上記ＴＧＦβ経路アクチベーター及び少なくとも１つの上記ｍＴｏｒインヒビターを含むＲＰＭＩ培地などの培地として「ｎＴｒｅｇ極性培地」を定義する。好ましい実施態様では、「ｎＴｒｅｇ極性培地」は、ＴＧＦβ、ラパマイシン及びＰＧＥ２を含むＲＰＭＩ培地を指す。

【0166】

別の実施態様では、培地は、炎症性培地である。本発明者らは、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１β（１０ng/ml）、ＩＬ−６（３０ng/ml）、ＩＬ−２１（５０ng/ml）、ＩＬ−２３（３０ng/ml）、ＩＬ−２（１００UI/ml）などを含むＩＭＤＭなどの培地として「炎症性培地」を定義する。

【0167】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞をex vivoで生成するための方法は、
−自己ΔＣＤ３フィーダー細胞及びコーティング抗ＣＤ３抗体の存在下で、並びに以下の作用物質：ｉ）ＰＧＥ２、ｉｉ）ＴＧＦβ、ｉｉｉ）ラパマイシン、並びに場合によりｉｖ）ＩＬ−２及びＩＬ−１５の群において選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を少なくとも５日間培養すること、
−それにより、ex vivoで生成されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の集団を取得すること
を含む。

【0168】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞をex vivoで生成するための方法は、
−少なくとも１つの自己ペプチド抗原で約２４時間パルスされた寛容原性ＤＣの存在下で、並びにΔＣＤ３フィーダー細胞の存在下で、並びに以下の作用物質：ｉ）ＰＧＥ２、ｉｉ）ＴＧＦβ、ｉｉｉ）ラパマイシン、並びに場合によりｉｖ）ＩＬ−２及びＩＬ−１５の群において選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を少なくとも５日間培養すること、
−それにより、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の集団を取得すること
を含む。

【0169】

本発明はまた、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の生成及びエクスパンションのex vivo方法であって、
−上記のようにＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を生成すること、
−ＴＣＲαβ細胞アクチベーター（好ましくは、自己ΔＣＤ３フィーダー細胞及びコーティング抗ＣＤ３抗体、又はΔＣＤ３フィーダー細胞の存在下、少なくとも１つの自己ペプチド抗原で約２４時間パルスされた寛容原性ＤＣのいずれか）並びに以下の作用物質：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）アクチベーター（好ましくは、ＰＧＥ２）、ｉｉ）ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）経路アクチベーター（好ましくは、ＴＧＦβ）、ｉｉｉ）ｍＴＯＲインヒビター（好ましくは、ラパマイシン）、並びに場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＴＳＬＰの群において選択される少なくとも１つのサイトカイン（好ましくは、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５）の存在下で、生成されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を少なくとも５日間接触させることによってそれらをエクスパンションすること、
−それにより、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞のエクスパンション集団を取得すること
を含むex vivo方法に関する。

【0170】

一実施態様では、ex vivoで生成されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団は、以下の表現型：ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋Ｆｏｘｐ３^＋に基づいて、フローサイトメトリーによって単離される。

【0171】

一実施態様では、このようにして取得された単離されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団は、次いで、ポリクローナルＴ細胞アクチベーターの存在下でこれらの細胞を培養することによって、ex vivoでエクスパンションされる。ポリクローナルαβＴ細胞アクチベーターの例は、本明細書上に列挙されている。あるいは、エクスパンション中に使用され得るポリクローナルαβＴ細胞アクチベーターの他の例としては、限定されないが、マイトジェン、例えばＰＭＡ／イオノマイシン、超抗原、抗ＣＤ３抗体が挙げられる。好ましくは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体はコーティングされる。一実施態様では、ポリクローナルαβＴ細胞アクチベーターは、上記フィーダー細胞の存在下で使用され得る。

【0172】

別の実施態様では、このようにして取得された単離されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団は、次いで、上記抗原特異的ＴＣＲαβ細胞アクチベーターの存在下でこれらの細胞を培養することによって、ex vivoでエクスパンションされる。一実施態様では、抗原特異的ＴＣＲαβ細胞アクチベーターは、上記フィーダー細胞の存在下で使用され得る。

【0173】

一実施態様では、本発明のex vivo生成ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞をエクスパンションするための培養は、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間実施される。本発明の範囲内では、「少なくとも５日間」という表現は、限定されないが、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間以上を含む。

【0174】

一実施態様では、培養培地の一部は、生成培養の経過中に１回、２回、３回、４回又は５回廃棄され、同じ容量の新鮮培養培地と交換される。本発明の範囲内では、「一部」という用語は、培養培地の容量の少なくとも２０％（v/v）、少なくとも２５％（v/v）、少なくとも３０％（v/v）、少なくとも３５％（v/v）、少なくとも４０％（v/v）、少なくとも４５％（v/v）、少なくとも５０％（v/v）、少なくとも５５％（v/v）、少なくとも６０％（v/v）、少なくとも６５％（v/v）、少なくとも７０％（v/v）、少なくとも７５％（v/v）を意味することを意図する。特定の実施態様では、第１の工程の培養培地の容量の４０％（v/v）〜６０％（v/v）が廃棄される。特定の実施態様では、廃棄される容量は、同一容量の新鮮培養培地と交換される。本発明の範囲内では、「新鮮培養培地」という表現は、いかなるＣＤ３＋Ｔ細胞とも接触されていない培養培地を指す。

【0175】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、ＩＭＤＭ−５中、自己ΔＣＤ３フィーダー細胞（細胞 １２５ １０^５個/ml）及びコーティング抗ＣＤ３抗体（２μg/ml）の存在下で、ＰＧＥ２（１μM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１０nM）及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在下で、陰性選択によってＰＢＭＣから取得されたＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋、好ましくはＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞（細胞 ５．１０^３個/ml）を培養することによってex vivoで生成される。１日目に、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を培養物に追加する。３日ごとに、培地容量の半分を廃棄し、ＰＧＥ２（５０nM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１nM）、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含む新鮮培地と交換する。細胞がエクスパンションし始めたら、それらを２日又は３日ごとに分割し、ＰＧＥ２（１μM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１０nM）及びＩＬ−２（１００UI/ml）を含む培地中、△ＣＤ３フィーダー細胞及びコーティング抗ＣＤ３抗体の存在下で９日ごとに培養し得る。

【0176】

別の実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、ＩＭＤＭ−５中、少なくとも１つの自己ペプチド抗原で約２４時間パルスされた寛容原性ＤＣの存在下で、並びにΔＣＤ３フィーダー細胞（細胞 １２５ １０^５個/ml）、ＰＧＥ２（１μM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１０nM）及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在下で、陰性選択によってＰＢＭＣから取得されたＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋、好ましくはＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞（細胞 ５．１０^３個/ml）を培養することによってex vivoで生成される。１日目に、ＩＬ−２（１００UI/ml）、ＩＬ−１５（１０ng/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）を培養物に追加する。３日ごとに、培地容量の半分を廃棄し、ＰＧＥ２（５０nM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１nM）、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含む新鮮培地と交換する。細胞がエクスパンションし始めたら、それらを２日又は３日ごとに分割し、ΔＣＤ３フィーダー細胞並びにＰＧＥ２（１μM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１０nM）及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在下で９日ごとに寛容原性ＤＣで再刺激し得る。

【0177】

この実施態様では、寛容原性ＤＣは、ＧＭＣＳＦ（１００ng/ml）及びＩＬ−４（１０ng/ml）が補充されたＡＩＭＶの存在下で、ＰＢＭＣから単離されたＣＤ１４^＋単球を培養することによって取得された。３日目及び６日目に、培地を廃棄し、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む新鮮培地と交換する。６日目に、自己ペプチド抗原の存在下で、寛容原性ＤＣを２４時間パルスする。

【0178】

本発明はまた、上記ex vivo生成方法によって取得可能なＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に関する。

【0179】

本発明はまた、上記ex vivo生成及びエクスパンション方法によって取得可能なＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に関する。

【0180】

一実施態様では、本発明の生成及びエクスパンション方法によって取得されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の集団は、細胞 少なくとも１０^６個、１０^７個、１０^８個、１０^９個、１０^１０個を含む。

【0181】

一実施態様では、本発明の生成及びエクスパンション方法によって取得されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の集団は、以下の表現型：ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する。

【0182】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型：ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ２５^＋を有する。

【0183】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型：ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＴＬＡ４^＋を有する。

【0184】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型：ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋を有する。

【0185】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型：ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ２５^＋ＣＴＬＡ４^＋を有する。

【0186】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型：ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋を有する。

【0187】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型：ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＴＬＡ４^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋を有する。

【0188】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型：ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ２５^＋ＣＴＬＡ４^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ１２７⁻を有する。

【0189】

一実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、遺伝子Ｆｏｘｐ３の制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を示さない。一実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、遺伝子Ｆｏｘｐ３の制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を示す。一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、少なくとも３０％、４０％、５０％を超えるパーセンテージの遺伝子ＦＯＸＰ３のＴＳＤＲの脱メチル化を示す。プロモーター脱メチル化のパーセンテージを測定するためのプロトコールは、実施例の材料及び方法のパートに示されている。

【0190】

別の実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％を超えるパーセンテージのＦｏｘｐ３プロモーター領域中のアセチル化ヒストンの濃縮を示す。アセチル化ヒストンの濃縮をパーセンテージで測定するためのプロトコールは、実施例の材料及び方法のパートに示されている。

【0191】

本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の集団の表現型特徴の例は、図１に示されている。

【0192】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の前記集団は、ナイーブ制御性Ｔ細胞において測定されたＦｏｘｐ３ ＭＦＩと少なくとも同等の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、Ｆｏｘｐ３を発現する。本明細書で使用される場合、「ナイーブ制御性Ｔ細胞」は、表現型Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻を有するＴ細胞を指す。

【0193】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、少なくとも２０００の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、Ｆｏｘｐ３を発現する。

【0194】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、ナイーブ制御性Ｔ細胞において測定されたＦｏｘｐ３ ＭＦＩの少なくとも２倍又は３倍の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、Ｆｏｘｐ３を発現する。

【0195】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、少なくとも２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、Ｆｏｘｐ３を発現する。

【0196】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団は、Ｆｏｘｐ３を発現する少なくとも６５％のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞を含む。「少なくとも６５％」という表現は、限定されないが、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５２％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％を含む。

【0197】

あるいは、本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、分子の転写（すなわち、ｍＲＮＡの発現）又は分子の翻訳（すなわち、タンパク質の発現）を指し得る。一実施態様では、発現の検出は、細胞内検出に対応し得る。別の実施態様では、発現の検出は、表面検出（すなわち、細胞表面で発現される分子の検出）に対応し得る。別の実施態様では、発現の検出は、細胞外検出（すなわち、分泌の検出）に対応し得る。別の実施態様では、発現の検出は、細胞内検出、表面検出及び／又は細胞外検出に対応し得る。発現レベルを決定するための方法は当業者に周知であり、限定されないが、細胞のトランスクリプトーム（発現が分子の転写に関連する実施態様の場合）又はプロテオーム（発現が細胞傷害性分子の翻訳に関連する実施態様の場合）の決定が挙げられる。

【0198】

本発明の一実施態様では、分子の発現は、ｍＲＮＡレベルで評価される。分子の転写レベルを評価するための方法は、先行技術で周知である。このような方法の例としては、限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ハイブリダイゼーション技術、例えばマイクロアレイの使用など、及びそれらの組み合わせ、例えば限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲによって取得されたアンプリコンのハイブリダイゼーション、シーケンシング、例えば次世代ＤＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）又はＲＮＡ−ｓｅｑ（「ホールトランスクリプトームショットガンシーケンシング」としても公知）などが挙げられる。本発明の別の実施態様では、分子の発現は、タンパク質レベルで評価される。サンプル中のタンパク質レベルを決定するための方法は、当技術分野で周知である。このような方法の例としては、限定されないが、免疫組織化学、マルチプレックス法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光結合免疫吸着測定法（ＦＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。

【0199】

別の実施態様では、少なくとも１つの分子の発現レベルの決定は、分子に対するリガンドの結合を検出及び／又は定量することに対応する。一実施態様では、前記リガンドは、前記分子に特異的な抗体であり、本発明の方法は、前記抗体と前記分子との間に形成された複合体を検出及び／又は定量することを含む。リガンドが、例えば限定されないが、検出可能な分子、例えば抗体定常フラグメント（Ｆｃ）又は蛍光化合物（例えば、シアニン色素、Ａｌｅｘａ色素、量子色素など）と共有結合的にカップリングされている場合、複合体が検出され得る。リガンドが、当業者に周知の異なる手段でタグ付けされている場合にも、複合体が検出され得る。例えば、限定されないが、本発明で使用されるタグは、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、ＨＡＴタグ、３×Ｆｌａｇタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグ及びＸｐｒｅｓｓタグを含むか又はそれらからなる群より選択されるタグであり得る。したがって、リガンドの使用は、一方では、使用されるリガンドに応じて分子の同定及び検出を可能にし、他方では、形成される複合体の定量を可能にする。

【0200】

一実施態様では、分子の発現レベルの決定は、フローサイトメトリー、免疫蛍光又は画像分析、例えばハイコンテント分析によって行われる。好ましくは、分子の発現レベルの決定は，フローサイトメトリーによって行われる。一実施態様では、フローサイトメトリー分析を行う前に、細胞を固定及び透過処理し、それにより、細胞内タンパク質の検出を可能にする。

【0201】

一実施態様では、細胞集団中の分子の発現レベルの決定は、分子を発現する細胞集団の細胞（すなわち、分子について「＋」の細胞）のパーセンテージを決定することを含む。好ましくは、分子を発現する細胞の前記パーセンテージは、ＦＡＣＳによって測定される。

【0202】

「発現する（又は＋）」及び「発現しない（又は−）」という用語は当技術分野で周知であり、目的の細胞マーカーの発現レベルを指し、「＋」に対応する細胞マーカーの発現レベルは高度又は中程度であり、「＋／−」とも称される。「−」に対応する細胞マーカーは、ヌル発現レベルの細胞マーカーであるか、又は前記細胞マーカーを発現する１０％未満の細胞集団も指す。

【0203】

目的の細胞マーカーの発現レベルは、このマーカーに特異的な蛍光標識抗体で染色された細胞集団由来の細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）と、無関係な特異性を有する蛍光標識抗体であって、しかし同じアイソタイプ、同じ蛍光プローブを有し、同じ種に由来する蛍光標識抗体（アイソタイプコントロールと称される）で染色された同じ細胞集団由来の細胞の蛍光強度（ＦＩ）とを比較することによって決定される。このマーカーに特異的な蛍光標識抗体で染色された集団由来の細胞であって、アイソタイプコントロールで染色された細胞と同等のＭＦＩ又はそれよりも低いＭＦＩを示す細胞は、このマーカーを発現しないので、（−）又は陰性と表記される。このマーカーに特異的な蛍光標識抗体で染色された集団由来の細胞であって、アイソタイプコントロールで染色された細胞よりも高いＭＦＩ値を示す細胞は、このマーカーを発現するので、（＋）又は陽性と表記される。

【0204】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ１２７⁻制御性Ｔ細胞の抑制活性と同様の抑制活性が可能である。細胞集団の抑制活性の決定は当技術分野で周知であり、従来のアッセイ、例えば標準的なポリクローナル細胞間接触Ｔｒｅｇ抑制アッセイ、又は実施例に記載されている自己ＭＬＲ抑制アッセイによって実施され得る。

【0205】

本発明の別の目的は、炎症条件に置かれた場合に依然として安定であるＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の集団である。

【0206】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の前記集団は、炎症条件に置かれた場合に依然として安定である。

【0207】

本明細書で使用される場合、「安定」は、ＩＬ−１７の分泌がないか又はＩＬ−１７の分泌が少なく（すなわち、２００ng/ml、１００ng/ml、５０ng/mlよりも低い）、依然として抑制活性（すなわち、実施例に示されているように、通常Ｔ細胞の増殖の阻害）が可能であることを指す。

【0208】

本明細書で使用される場合、「炎症条件」は、芳香族酸、好ましくはトリプトファンが豊富な培地、例えば、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１β（１０ng/ml）、ＩＬ−６（３０ng/ml）、ＩＬ−２１（５０ng/ml）、ＩＬ−２３（３０ng/ml）、ＩＬ−２（１００UI/ml）などを含むＩＭＤＭなどを指す。制御性Ｔ細胞の集団が炎症条件で依然として安定であるかを決定するための方法は、好ましくはコーティングされた抗ＣＤ３（４μg/ml）及び好ましくは可溶性形態の抗ＣＤ２８（４μg/ml）の存在下、上記炎症条件培地中で、制御性Ｔ細胞を培養することを含む。３６時間〜７２時間の培養後、培養上清中のＩＬ−１７の存在を測定する。培養上清中のＩＬ−１７の認識は、当技術分野で公知の従来の方法、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ抗ＩＬ−１７などによって行われ得る。簡潔に言えば、捕捉抗ＩＬ−１７抗体でプレートをコーティングした後、培養上清を希釈系列で各ウェルに追加する。インキュベーション後、検出抗ＩＬ−１７抗体を各ウェルに追加する。ＥＬＩＳＡは、当技術分野で公知の任意の比色手段によって、例えば、ビオチンで標識された検出抗体、ポリストレプトアビジンＨＲＰ増幅システム及びｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液を使用して発色される。２００ng/ml、１００ng/ml、５０ng/mlよりも低いＩＬ−１７レベルは、ＩＬ−１７の分泌がないか又はＩＬ−１７の分泌が少ないことに対応する。

【0209】

理論に縛られるものではないが、本発明者らは、悪性腫瘍細胞の間質が、制御性Ｔ細胞が非常に豊富なＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）であって、特にＮＫ細胞に対して免疫抑制活性を発揮するＴＩＬを含み、おそらくはこれが、局所ガン免疫回避の原因であると主張する。不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、ＴＩＬ中に存在するＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に対する免疫応答を誘導し、それにより、それらの免疫抑制活性を防止し、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞、例えばＮＫ細胞の細胞傷害活性を可能にするための抗原性ターゲットに相当し得る。したがって、本発明者らは、有効成分として不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を含むワクチン組成物を使用することを提案する。

【0210】

本発明の１つの目的は、上記不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる免疫原性産物である。

【0211】

一実施態様では、免疫原性産物は、以下の表現型ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する上記不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0212】

本明細書で使用される場合、免疫原性産物、医薬組成物、ワクチン又は医薬に関して「から本質的になる」という用語は、少なくとも１つの本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団又は抗体が、前記疫原性産物、医薬組成物、ワクチン又は医薬内で生物学的活性を有する唯一の治療剤又は薬剤であることを意味する。

【0213】

一実施態様では、免疫原性産物は、上記方法によってex vivoで生成及び場合によりエクスパンションされた不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞であって、以下の表現型ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する制御性Ｔ細胞を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0214】

本発明の別の目的は、上記免疫原性産物と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤とを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる医薬組成物である。

【0215】

本発明の別の目的は、以下の表現型ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤とを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる医薬組成物である。

【0216】

本発明の別の目的は、上記方法によってex vivoで生成及びエクスパンションされた不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞であって、以下の表現型ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する制御性Ｔ細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤とを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる医薬組成物である。

【0217】

本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、任意の及び全ての従来の溶媒、分散媒、充填剤、固体担体、水溶液、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを指す。ヒトへの投与では、調製物は、規制当局、例えばFDA Office又はEMAが要求する滅菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の基準を満たすべきである。

【0218】

「薬学的に許容し得る」は、医薬組成物の成分が互いに適合性であり、それが投与される被験体にとって有害ではないことを意味する。薬学的に許容し得る賦形剤の例としては、限定されないが、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0219】

本発明の別の目的は、上記免疫原性産物を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるワクチン組成物である。

【0220】

本発明の別の目的は、以下の表現型ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるワクチン組成物である。

【0221】

本発明の別の目的は、上記方法によってex vivoで生成及びエクスパンションされた不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞であって、以下の表現型ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する制御性Ｔ細胞を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるワクチン組成物である。

【0222】

本明細書で使用される場合、「不活性化」Ｔ細胞は、生存可能であるが低下したエフェクター機能を有するか又はエフェクター機能を有しない（すなわち、いかなる病原性能力も喪失している）Ｔ細胞を指す。不活性化Ｔ細胞の細胞表面マーカーの例としては、限定されないが、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、カルレティキュリン及び熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ−９０）が挙げられる。したがって、不活性化Ｔ細胞は、７−ＡＡＤ及び／又はカルレティキュリン及び／又はＨＳＰ−９０を発現する。本発明の不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、それらの抑制活性を喪失しているが、依然として免疫原性である。Ｔ細胞エフェクター機能アッセイの例としては、限定されないが、Ｔ細胞増殖アッセイが挙げられる。Ｔ細胞増殖は、固定Ｔ細胞と非固定Ｔ細胞とを対比して評価され得る。簡潔に言えば、Ｔ細胞増殖アッセイは、固定Ｔ細胞と非固定Ｔ細胞とを対比して、フローサイトメトリーによって、生きている増殖細胞のパーセンテージを決定することを目的とする。ＣＦＳＥ、抗ＣＤ３抗体及び７−ＡＡＤでＴ細胞を染色した後、生きている増殖細胞は、ゲーティングＣＤ３^＋７−ＡＡＤ⁻細胞におけるＣＦＳＥ^ｌｏｗ画分として定義される。

【0223】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、当技術分野で周知の任意の方法によって不活性化される。細胞を不活性化するための方法の例としては、限定されないが、好ましくは約２５００〜３０００radによる照射、及び／又は化学的不活性化、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンＣ若しくはアントラサイクリンへの曝露が挙げられる。

【0224】

一実施態様では、本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。ワクチン組成物において使用され得るアジュバントの例としては、限定されないが、ＩＳＡ５１；エマルジョン、例えばＣＦＡ、ＭＦ５９、モンタニド、ＡＳ０３及びＡＦ０３；ミネラル塩、例えばミョウバン、リン酸カルシウム、鉄塩、ジルコニウム塩及びＡＳ０４；ＴＬＲリガンド、例えばＴＬＲ２リガンド（例えば、外表面プロテインＡ又はＯｓｐＡ）、ＴＬＲ３リガンド（例えば、ポリＩ：Ｃ）、ＴＬＲ４リガンド（例えば、ＭＰＬ及びＧＬＡ）、ＴＬＲ５リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ９リガンド（例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ）；多糖、例えばキチン、キトサン、α−グルカン、β−グルカン、フルクタン、マンナン、デキストラン、レンチナン、イヌリン系アジュバント（例えば、ガンマイヌリン）；ＴＬＲ９及びＳＴＩＮＧリガンド、例えばＫ３ ＣｐＧ及びｃＧＡＭＰが挙げられる。本明細書で使用される場合、「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強し、及び／又はそれを所望の免疫応答にモデュレーションする薬剤を指す。

【0225】

一実施態様では、不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、少なくとも１つの上記自己ペプチド抗原に特異的である。

【0226】

別の実施態様では、不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、ガン細胞のアポトーシス小体上に存在していた少なくとも１つの自己ペプチド抗原に特異的である。

【0227】

一実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物中に存在する不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、ヒトＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞である。

【0228】

一実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物中に存在する不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、自己ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞である。

【0229】

一実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物中に存在する不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、同種ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞である。

【0230】

別の実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物は、患者にパーソナライゼーションされ得る。本明細書で使用される場合、「パーソナライゼーションされた」免疫原性産物又はワクチン組成物は、少なくとも１つの患者特異的エピトープを用いてex vivoで生成及びエクスパンションされたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の使用を指す。この実施態様では、免疫原性産物として又はワクチン組成物中で使用すべきＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、患者から取得されたガン細胞のアポトーシス小体の存在下で、ex vivoで生成及びエクスパンションされ、それにより、少なくとも１つの患者特異的エピトープを提供する。

【0231】

一実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物は、有効成分として不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0232】

一実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物は、有効成分として不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を少なくとも１０^４個、１０^５個、１０^６個、１０^７個、１０^８個、１０^９個、１０^１０個含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0233】

一実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物は、有効成分として不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を約１０^４個、５×１０^４個、１０^５個、５×１０^５個、１０^６個、５×１０^６個、１０^７個、５×１０^７個、１０^８個、５×１０^８個、１０^９個、５×１０^９個、１０^１０個含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0234】

一実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞、不活性化ＭＨＣＩＩ制限性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞、免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物は、凍結される。

【0235】

一実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物は、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射若しくは静脈内注射によって被験体に投与され得るか、又は腫瘍に直接投与され得る。

【0236】

一実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物は、被験体に少なくとも年１回、２回、３回、４回、５回投与され得る。投与計画の例としては、限定されないが、０日目、０日目の４週間後、０日目の８週間後、０日目の１２週間後及び０日目の２４週間後における免疫原性産物又はワクチン組成物の投与が挙げられる。

【0237】

本発明の別の目的は、それを必要とする被験体におけるガンを処置するための方法であって、治療有効量の上記本発明の不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞又は免疫原性産物、医薬組成物若しくはワクチン組成物を該被験体に投与することを含む方法である。

【0238】

本発明の別の目的は、ガンに罹患している被験体のＴＩＬ中に存在するＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に対する免疫応答を誘発するための方法であって、治療有効量の上記本発明の不活性化ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞又は免疫原性産物、医薬組成物若しくはワクチン組成物を該被験体に投与することを含む方法である。

【0239】

本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物で処置され得るガンの例としては、限定されないが、副腎皮質ガン腫、肛門ガン、膀胱ガン、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、松果体腫瘍、視床下部神経膠腫、乳ガン、カルチノイド腫瘍、ガン腫、子宮頸ガン、結腸ガン、子宮内膜ガン、食道ガン、肝外胆管ガン、ユーイング腫瘍（ｐｎｅｔ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼ガン、眼内黒色腫、胆嚢ガン、胃ガン、胚細胞腫瘍、性腺外妊娠性絨毛腫瘍、頭頸部ガン、下咽頭ガン、膵島細胞ガン腫、喉頭ガン、白血病、急性リンパ芽球性白血病、口腔ガン、肝臓ガン、肺ガン、小細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系（原発性）リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞ガン腫、転移性扁平上皮ガン、多発性骨髄腫、形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、上咽頭ガン、神経芽細胞腫、中咽頭ガン、骨肉腫、卵巣上皮ガン、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓ガン、外分泌膵臓ガン、副鼻腔ガン及び鼻腔ガン、副甲状腺ガン、褐色細胞腫ガン、下垂体ガン、形質細胞新生物、横紋筋肉腫、直腸ガン、腎細胞ガン、唾液腺ガン、セザリー症候群、カポジ肉腫、小腸ガン、軟部組織肉腫、胸腺腫、悪性甲状腺ガン、尿道ガン、子宮ガン、肉腫、異常な小児ガン、膣ガン、外陰ガン又はウィルムス腫瘍、化学療法治療に関連する良性症状、例えばループス、関節リウマチ及び皮膚疾患が挙げられる。

【0240】

一実施態様では、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物で処置され得るガンとしては、限定されないが、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガン及び神経膠芽腫が挙げられる。

【0241】

本発明の別の目的は、本発明の免疫原性産物を調製するための方法であって、
−処置すべき被験体由来の生物学的サンプル、好ましくは血液サンプルと、場合により、処置すべき被験体由来の腫瘍サンプルとを提供すること、
−該生物学的サンプルから単離されたＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞から、上記のようにＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞をex vivoで生成及びエクスパンションすること、
−前工程で取得されたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を不活性化すること、
−それにより、本発明の免疫原性産物を取得すること
を含む方法である。

【0242】

好ましい実施態様では、生成及びエクスパンション工程は、寛容原性樹状細胞（ＤＣ）の存在下で行われ、被験体の腫瘍サンプルから取得されたアポトーシス腫瘍小体でパルスされる。

【0243】

本発明の別の目的は、それを必要とする被験体におけるガンを処置するための方法であって、本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物を該被験体に投与することを含む方法である。

【0244】

本発明の別の目的は、それを必要とする被験体におけるガンを処置するための方法であって、
−上記免疫原性産物を調製すること、
−場合により、該免疫原性産物を含む医薬組成物又はワクチン組成物を調製すること、
−場合により、該被験体をプラスマフェレーシスに供すること、
−本発明の免疫原性産物、医薬組成物又はワクチン組成物を該被験体に投与すること
を含む方法である。

【0245】

理論に縛られるものではないが、本発明者らは、免疫抑制機能を発揮するようにコミットされた本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞が、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、Ｂ細胞又は自然ＮＫ細胞を含む自己反応性病原性免疫エフェクター細胞を阻害することができ、そしてこれらは、自己細胞に対してそれらの細胞傷害特性をもはや発揮することができないものであり得ると提案する。

【0246】

本発明の１つの目的は、上記ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞又はＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤とを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる医薬組成物である。

【0247】

本発明の別の目的は、以下の表現型ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有するＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤とを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる医薬組成物である。

【0248】

本発明の別の目的は、上記方法によってex vivoで生成及びエクスパンションされたＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞であって、以下の表現型ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋を有する制御性Ｔ細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤とを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる医薬組成物である。

【0249】

本発明の１つの目的は、養子療法において使用するための、上記ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞若しくはＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団又は医薬組成物である。

【0250】

本発明の別の目的は、炎症性疾患又は自己免疫疾患の処置において使用するための、上記ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞若しくはＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団又は医薬組成物である。

【0251】

炎症性疾患又は自己免疫疾患の例としては、限定されないが、急性播種性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経の神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化性肺胞炎、巨大細胞性動脈炎、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー症候群）、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線形ＩｇＡ病、ループス、ライム慢性病、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、混合性結合組織病、ムーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、パリー・ロンバーグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、タイプＩ、ＩＩ及びＩＩＩ自己免疫性多腺症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切除後症候群、プロゲステロン性皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スサック症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱水疱性皮膚病並びに白斑が挙げられる。

【0252】

炎症性疾患又は自己免疫疾患の例としては、限定されないが、関節リウマチ、１型糖尿病及び多発性硬化症が挙げられる。

【0253】

本発明の別の目的は、移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防において使用するための、上記ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞若しくはＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団又は医薬組成物である。

【0254】

一実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、少なくとも１つの上記自己ペプチド抗原に特異的である。

【0255】

別の実施態様では、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、組織溶解物中に存在していた少なくとも１つの自己ペプチド抗原に特異的である。

【0256】

一実施態様では、本発明の医薬組成物は、有効成分としてＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を少なくとも１０^４個、１０^５個、１０^６個、１０^７個、１０^８個、１０^９個、１０^１０個含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0257】

一実施態様では、本発明の医薬組成物は、有効成分としてＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を約１０^４個、５×１０^４個、１０^５個、５×１０^５個、１０^６個、５×１０^６個、１０^７個、５×１０^７個、１０^８個、５×１０^８個、１０^９個、５×１０^９個、１０^１０個含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0258】

一実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団又は医薬は、凍結される。

【0259】

一実施態様では、本発明の医薬組成物中に存在するＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、ヒトＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞である。

【0260】

一実施態様では、本発明の医薬組成物中に存在するＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、自己ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞である。

【0261】

一実施態様では、本発明の医薬組成物中に存在するＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞は、同種ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞である。

【0262】

一実施態様では、本発明の医薬組成物は、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射又は静脈内注射によって被験体に投与され得る。

【0263】

一実施態様では、本発明の医薬組成物は、被験体に少なくとも週１回、２回、３回、４回、５回投与され得る。

【0264】

別の実施態様では、本発明の医薬組成物は、被験体に少なくとも月１回、２回、３回、４回、５回投与され得る。

【0265】

別の実施態様では、本発明の医薬組成物は、被験体に少なくとも３カ月に１回、２回、３回、４回、５回投与され得る。

【0266】

本発明の別の目的は、それを必要とする被験体における炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置するための方法であって、治療有効量の上記ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞若しくはＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞集団又は医薬組成物を該被験体に投与することを含む方法である。

【0267】

Ｔ細胞ワクチン接種は、クローン型特異的決定基に特異的なＴ細胞を活性化することによって、免疫原性Ｔ細胞を特異的に抑制する制御ネットワークを誘導することが当技術分野で示されている（抗イディオタイプ応答）。加えて、（エルゴトープに対応する）活性化マーカーに対する抗エルゴタイプ応答もまた、ターゲティングされる制御性Ｔ細胞集団の抑制を部分的に占め得る。

【0268】

本発明の別の目的は、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞のＴＣＲ（Ｔ細胞レセプター）を認識する抗体である。

【0269】

一実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞のＴＣＲを認識する抗体は、ＴＣＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（相補性決定領域１、２及び３）の少なくとも１つを認識する。

【0270】

別の実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞のＴＣＲを認識する抗体は、ＴＣＲのＣＤＲ３を認識する。

【0271】

本発明の別の目的は、前記抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤とを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる医薬組成物である。

【0272】

本発明の別の目的は、それを必要とする被験体におけるガンを処置するための前記抗体の使用である。

【0273】

一実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に対する抗体は、上記免疫原性組成物を用いた哺乳動物（ヒトを含む）の免疫化後に産生される抗体からなる。

【0274】

別の実施態様では、抗体はまた、例えば前記哺乳動物（前記ヒトを含む）から取得されたＢ細胞から出発して、それらをコードする関連ＤＮＡ材料をクローニングすることによって取得され得る。

【0275】

別の実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に対する関連リコンビナント抗体を生産するために、抗体はまた、前記哺乳動物（前記ヒトを含む）から収集された抗体のアミノ酸配列を配列決定し、次いで、抗体又はそのＣＤＲを含むその一部をコードするＤＮＡ分子を合成することによって取得され得る。

【0276】

本発明の免疫原性組成物を用いた免疫化による本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に対する抗体の調製は、技術水準の一般的な技術知識を使用して、当業者によって容易に実施され得る。

【0277】

あるいは、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に対する抗体は、それらを産生するヒトＢリンパ球の不死化後に取得され得る；また、それらのｃＤＮＡはクローニングされて、リコンビナントＤＡＮ技術によってそれら又はそれらの誘導体を生産するためにさらに使用され得る。

【0278】

本明細書における「抗体」という用語は、有用な抗原結合特異性を有する分子を指すために使用される。当業者であれば、この用語はまた、同じ又は極めて類似する機能性を依然として示し得る抗体のフラグメント又は誘導体であるポリペプチドをカバーし得ることを容易に認識するであろう。このような抗体フラグメント又は誘導体は、本明細書で使用される抗体という用語によって包含されることを意図する。受動免疫療法の目的のための「抗体」又は「抗体分子」は、本明細書では、全免疫グロブリン分子だけではなく、ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に結合してそれを不活性化する能力を保持するそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び他のフラグメントも意図する。同様に、抗体という用語は、抗体の遺伝子改変誘導体、例えば一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）及びドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む。

【0279】

いくつかの実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に対する抗体は、ポリクローナル抗体からなる。

【0280】

いくつかの実施態様では、本発明のＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に対する抗体は、モノクローナル抗体からなる。

【0281】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書では、任意の単離されたＡｂ、例えば従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマを包含するが、任意の細胞によって産生される単離された単一特異性抗体、例えば哺乳動物細胞株において発現される同一のヒト免疫グロブリンのサンプルなども包含するために使用される。

【0282】

抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは抗原認識に関与するが、これは、初期プロテアーゼ消化実験によって最初に認識された事実である。さらなる確認は、齧歯類抗体の「ヒト化」によって見出された。得られる抗体が齧歯類親抗体の抗原特異性を保持するように、齧歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインに融合し得る(Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855)。抗原特異性が可変ドメインによって付与され、定常ドメインと無関係であることは、全てが１つ以上の可変ドメインを含有する抗体フラグメントの細菌発現を伴う実験から公知である。これらの分子としては、Ｆａｂ様分子(Better et al (1988) Science 240, 1041); Ｆｖ分子(Skerra et al (1988) Science 240, 1038); フレキシブルなオリゴペプチドを介してＶ．ｓｕｂ．Ｈ及びＶ．ｓｕｂ．Ｌパートナードメインが連結された一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子(Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879)並びに単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄａｂ）(Ward et al (1989) Nature 341, 544)が挙げられる。特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な総説は、Winter & Milstein (1991, Nature 349, 293-299)に見られる。

【0283】

「ＳｃＦｖ分子」という用語は、フレキシブルなオリゴペプチドを介してＶＨ及びＶＬパートナードメインが連結された分子を包含する。改変抗体、例えばＳｃＦｖ抗体は、J. Huston et al, (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883及びA. Pluckthun, (1991) "Antibody engineering; Advances from use of E. coli expression systems", Bio/technology 9 (6): 545-51（これらは、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている技術及びアプローチを使用して作製され得る。

【0284】

本明細書に記載されるように反応性である適切なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば、"Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988)及び"Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", S G R Hurrell (CRC Press, 1982)に開示されているものによって調製され得る。

【0285】

さらなる実施態様は、抗原と接触するマウス抗体の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ））がヒト抗体フレームワークに移植されたヒト化抗体を包含する。このような抗体はほぼ完全にヒトのものであり、患者に投与した場合、いかなる有害な抗体反応もほとんど引き起こさない。いくつかのキメラ抗体又はヒト化抗体が治療薬として登録されており、様々な適応症において現在広く使用されている(Borrebaeck & Carlsson, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 1: 404-408)。

【0286】

抗体がヒト化抗体であるならば好ましい。適切に調製された非ヒト抗体は、公知の方法で、例えば、マウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体のフレームワークに挿入することによって「ヒト化」され得る。ヒト化抗体は、Verhoeyen et al (1988) Science, 239, 1534-1536及びKettleborough et al, (1991) Protein Engineering, 14 (7), 773-783に記載されている技術及びアプローチを使用して作製され得る。

【0287】

別の実施態様では、抗体はまた、リコンビナント技術を使用して生産され得る完全ヒト抗体を包含する。典型的には、数十億の異なる抗体を含む大きなライブラリーが使用される。例えばマウス抗体のキメラ化又はヒト化を用いる以前の技術とは対照的に、この技術は、特異的抗体を生成するために動物の免疫化に依拠しない。その代わり、リコンビナントライブラリーは、多数の予め作製された抗体変異体を含み、ライブラリーは、任意の抗原に特異的な少なくとも１つの抗体を有する可能性が高い。

【0288】

投与頻度は、経時的に患者の血清中の抗体価の低下を追跡することによって臨床的に決定され得るが、いずれにしても、年１〜５２回、最も好ましくは年１〜１２回の頻度であり得る。抗体の量は、疾患の重症度、又は血清中の抗体の半減期にしたがって変動し得るが、好ましくは、１〜１０mg/患者kgの範囲内、好ましくは１〜５mg/患者kgの範囲内、最も好ましくは１〜２mg/患者kgの範囲内であろう。

【図面の簡単な説明】

【0289】

【図1】ヒト末梢血（ＰＢＭＣ）と、乳房腫瘍から単離したＴＩＬとにおける可変ＴＣＲ認識によって定義される、ＦＯＸＰ３^＋及びＦＯＸＰ３⁻ＣＤ３^＋Ｔ細胞集団間の異なる頻度及び表現型特徴。

【図2】異なるｎＴｒｅｇ極性培地を用いて、ポリクローナル刺激ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からex vivoで生成したヒトＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるＦｏｘｐ３^＋発現の分析。ＩＬ−２（１００IU/ml）の存在下、プレート結合抗ＣＤ３（４μg/ml）でナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を１２日間刺激した。示されている場合には、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ＲＡＰＡ（１０nM）及びＰＧＥ２（１μM）を追加した。（Ａ）生成した各ｐＴｒｅｇのＦｏｘｐ３発現プロファイルを示すオーバーレイヒストグラム。ＣＤ４^＋Ｔ細胞培養物におけるＦｏｘｐ３の（Ｂ）頻度及び（Ｃ）発現レベル（ＭＦＩによって評価）。

【図3】異なるｎＴｒｅｇ極性培地を用いて生成したヒトＴｒｅｇのin vitro抑制能力の比較分析。標準的なポリクローナルｎＴｒｅｇアッセイを用いて、（Ａ）静止状態及び（Ｂ）炎症状況において、ex vivo生成Ｔｒｅｇの抑制能力を評価した。ＣＦＳＥ標識通常Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）をex vivo生成Ｔｒｅｇと共に異なる比率で共培養した。ＴｒｅｇによるＴｃｏｎｖＣＦＳＥ増殖の阻害率を示した。コントロールとして新鮮Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖを使用した。

【図4】２１日間の培養後のex vivo生成Ａｇ特異的Ｔｒｅｇの表現型。ＩＬ−２及び規定のｎＴｒｅｇ極性培地の存在下、（Ａ）非パルス自己ｔＤＣ又は（Ｂ）ＯＶＡパルス自己ｔＤＣでナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激した。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ３９に対するＡｂを使用して、細胞表面において刺激ＣＤ４^＋Ｔ細胞を染色した。固定及び透過処理した後、Ｆｏｘｐ３及びＣＴＬＡ４を細胞内染色した。

【図5】非刺激ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞によるex vivo生成ＯＶＡ特異的Ｔｒｅｇのコンタミネーション。ＣＤ４５ＲＡ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬ１４、ＣＤ２６及びＣＤ２５で細胞を染色した。

【図6】ＯｖａパルスｔＤＣでプライミングしたナイーブＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋Ｔ細胞のＣＤ１５４発現分析、及びエクスパンションＯｖａ特異的生成ＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３発現。Ａ−材料及び方法に記載されているように、非パルスｔＤＣ又はＯｖａパルスのいずれかで刺激した１６時間後のプライミングナイーブＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋Ｔ細胞におけるＣＤ１５４^＋発現の頻度。Ｂ−ｎＴｒｅｇ極性培地中で２１日間培養した後のex vivo生成Ａｇ特異的ＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３発現。

【図7-1】標準的なポリクローナルｎＴｒｅｇアッセイを用いて評価した、２１日間培養した後のex vivo生成ＯＶＡ特異的Ｔｒｅｇの抑制能力。静止ＣＤ４^＋ナイーブＴ細胞の磁気枯渇後、（Ａ）静止状態及び（Ｂ）炎症状況において、エクスパンションｐＴｒｅｇの抑制能力を評価した。示されているポリクローナル刺激下で、ＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖ（ＴｃｏｎｖＣＦＳＥ）をex vivo生成Ｔｒｅｇと共に異なる比率で共培養した。ＣＦＳＥ希釈アッセイによって、ＴｃｏｎｖＣＦＳＥの増殖を評価した。コントロールとして新鮮Ｔｒｅｇを使用した。

【図7-2】標準的なポリクローナルｎＴｒｅｇアッセイを用いて評価した、２１日間培養した後のex vivo生成ＯＶＡ特異的Ｔｒｅｇの抑制能力。静止ＣＤ４^＋ナイーブＴ細胞の磁気枯渇後、（Ａ）静止状態及び（Ｂ）炎症状況において、エクスパンションｐＴｒｅｇの抑制能力を評価した。示されているポリクローナル刺激下で、ＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖ（ＴｃｏｎｖＣＦＳＥ）をex vivo生成Ｔｒｅｇと共に異なる比率で共培養した。ＣＦＳＥ希釈アッセイによって、ＴｃｏｎｖＣＦＳＥの増殖を評価した。コントロールとして新鮮Ｔｒｅｇを使用した。

【図8】自己ＭＬＲアッセイを用いて評価した、２１日間培養した後のex vivo生成ＯＶＡ特異的Ｔｒｅｇの抑制能力。ＣＤ４^＋ナイーブＴ細胞の磁気枯渇後、（Ａ）低炎症状況及び（Ｂ）高炎症状況において、ex vivo生成Ｔｒｅｇの抑制能力を評価した。示されている刺激下で、ＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖ（ＴｃｏｎｖＣＦＳＥ）をex vivo生成Ｔｒｅｇと共に異なる比率で共培養した。ＣＦＳＥ希釈アッセイによって、ＴｃｏｎｖＣＦＳＥの増殖を評価し、これを増殖指数（ＩＰ）として表す。コントロールとして新鮮Ｔｒｅｇを使用した。

【図9】ＴＧＦβ、ＲＡＰＡ及びＰＧＥ２の組み合わせは、制御活性のみを発揮するようにコミットされた培養Ｔｒｅｇの確立及びエクスパンションを誘導する。ｎＴｒｅｇ又はＴＨ−１７極性培地中で２１日間のex vivo生成後、図７に記載されているように、高炎症状況誘導培地の存在下で、ex vivo生成ＯＶＡ特異的Ｔｒｅｇの抑制能力を評価した。コントロールとして新鮮Ｔｒｅｇを使用した。

【図10】刺激ＯＶＡ−ex vivo生成ＴｒｅｇによるＩＬ−１７産生。（Ａ）ｎＴｒｅｇ極性培地中で最初の２１日間培養した後に誘導した特異的Ｔｒｅｇ、又は（Ｂ）ｎＴｒｅｇ若しくはＴＨ−１７極性培地中で３週間エクスパンションした特異的Ｔｒｅｇを、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−２１及びＩＬ−２３サイトカインを含有するＩＭＤＭ培地中、ａＣＤ３ Ａｂ及びａＣＤ２８ Ａｂで２日間刺激して、ＩＬ−１７産生能力について試験した。ＥＬＩＳＡによって、上清培養物中のＩＬ−１７を検出した。

【図11】異なるｎＴｒｅｇ極性培地を用いて、ポリクローナル刺激又は抗原特異的刺激後の通常又はナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞から、ex vivoでエクスパンションするか又はin vitroで誘導したヒトＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるＩＬ−１Ｒ１発現の分析。以下の制御性Ｔ細胞集団において、フローサイトメトリーによって、ＩＬ−１Ｒ１発現の頻度を評価した：ａ）ＰＢＭＣから単離したex vivo静止Ｔｒｅｇ、ｂ）ポリクローナル刺激を用いた場合の、ＰＢＭＣから単離したＴｒｅｇ由来のex vivoエクスパンションＴｒｅｇ、ｃ）Ｒａｐａ及びＴＧＦβの存在下における、ＰＢＭＣから単離した通常Ｔ細胞由来のポリクローナルin vitro誘導Ｔｒｅｇ、並びにｄ）Ｒａｐａ、ＴＧＦβ及びＰＧＥ２の存在下における、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞から単離したin vitro誘導Ｏｖａ特異的ＣＤ３＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞。本発明者らは、静止Ｔｒｅｇ、ポリクローナルエクスパンションＴｒｅｇ／誘導Ｔｒｅｇ上では、誘導Ｏｖａ特異的ＣＤ３^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−１Ｒ１が優先的に発現されることを見出した。本発明者らはまた、抑制機能の安定性がＩＬ−１Ｒ１発現と逆相関することを観察する。

【図12】ex vivoヒト誘導腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３^＋発現の分析。アポトーシス腫瘍Ａｇパルス寛容原性ＤＣ（ｔＤＣ）を使用して、ＩＬ−２（１００IU/ml）と、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ＰＧＥ２（１μM）及びＲａｐａ（１０nM）から構成されるｎＴｒｅｇ極性培地との存在下で、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞から特異的ｐＴｒｅｇを生成及びエクスパンションした。コントロールとして非ローディングｔＤＣを使用した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞培養物におけるＦｏｘｐ３の（Ａ）頻度及び（Ｂ）発現レベル（ＭＦＩによって評価）。

【図13】特異的病原性ＣＤ４^＋Ｔ細胞（すなわち、腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞）を溶解するように機能的にコミットされた自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞株の生成。以前に記載されているように、古典的な７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞性細胞傷害性アッセイを用いて、その誘導病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを溶解するＣＤ８^＋Ｔ細胞クローンの能力を評価する。簡潔に言えば、刺激の４日後に、病原性ＣＤ４^＋ターゲット細胞又は自己リンパ芽球系をＣＦＳＥで標識し、３×１０^４個/ウェルで９６ウェルＵ底プレートに３回反復で配置した。ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞（５：１のＥ：Ｔ比）を追加し、インキュベーションを３７℃で６時間行った。実験終了時に、７−ＡＡＤで死細胞を標識して、溶解細胞を検出した。FACSCalibur機器を使用して、二重陽性染色ＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤを示す領域に基づいて、ターゲット細胞に対する細胞溶解活性を分析した。ネガティブコントロールにおける自然溶解（％）を差し引いた後、ＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤの両方について陽性の細胞／全ＣＦＳＥ陽性細胞として、ＣＤ８^＋Ｔ細胞クローンの細胞溶解活性（％）を計算した。次いで、以下の式：細胞溶解活性（％）［死ターゲット細胞（％）−自然死（％）］×１００／［１００−自然死（％）］を使用して、細胞溶解活性のパーセンテージを計算した。

【図14】３つの異なる乳ガンサブグループから抽出したＴＩＬ中に存在するリンパ球におけるＦｏｘｐ３^＋発現の分析。ルミナル−Ａ（ｎ＝３）、ルミナルＢ（ｎ＝３）を有する患者、及びトリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）を有する患者（ｎ＝２）由来の腫瘍組織をメスで細分し、コラゲナーゼタイプＩＶで一晩インキュベーションすることによって酵素消化した。単離したＴＩＬ中に存在するリンパ球におけるＦＯＸＰ３マーカーの発現を、フローサイトメトリー分析によって決定した。ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋拘束性Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３発現のパーセンテージの表示。

【実施例】

【0290】

以下の実施例によって、本発明をさらに例証する。

【0291】

材料及び方法
ヒト血液サンプル．健常個体由来の血液サンプルは、Etablissement Francais du Sang (EFS, Paris)に由来するものであった。標準的な手順を使用して、血球細胞を収集する。

【0292】

ヒト腫瘍サンプル．腫瘍組織サンプルは、ルミナルＡ及びルミナルＢ乳ガンを有する患者に由来するものであった(Institut Jean Godinot, Reims)。

【0293】

細胞の精製及び培養
Ficoll-Hypaque (Pharmacia)による密度勾配遠心分離によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する。ＰＢＭＣを新鮮細胞として使用するか、又は液体窒素で凍結保存する。新鮮又は凍結ＰＢＭＣのいずれかから、Ｔ細胞サブセット及びＴ細胞枯渇アクセサリー細胞（ΔＣＤ３細胞）を単離する。抗ＣＤ３コーティングDynabeads (Dynal Biotech)とのインキュベーションによるＰＢＭＣからの陰性選択によって、Ｔ細胞枯渇アクセサリー細胞（ΔＣＤ３細胞）を単離し、３０００radで照射する（ΔＣＤ３フィーダーと称される）。

【0294】

ＣＤ３ビーズ単離キット(Miltenyi Biotec)を用いてＣＤ３^＋Ｔ細胞を陽性選択する。続いて、抗ＣＤ３（ＳＫ７）−ＦＩＴＣ(Becton Dickinson)、抗ＣＤ４５ＲＡ^＋（ＲＥＡ５６２）−ＦＩＴＣ(Miltenyi Biotec)及び抗ＣＤ２７（０３２３）−ＡＰＣ ｅｆｌｕｏｒ７８０(ebioscience)で選択ＣＤ３^＋Ｔ細胞を標識してから、ＣＤ３^＋ＲＡ^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞に選別する。

【0295】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット(Miltenyi Biotecを用いてＣＤ４^＋Ｔ細胞を陰性選択して、純度 ９６〜９９％でＣＤ４^＋Ｔ細胞集団を得る。続いて、抗ＣＤ４（１３Ｂ８．２）−ＦＩＴＣ(Beckman Coulter)、抗ＣＤ２５（４Ｅ３）−ＡＰＣ(Miltenyi Biotec)及び抗ＣＤ１２７（Ｒ３４．３４）−ＰＥ(Beckman Coulter)で選択ＣＤ４^＋Ｔ細胞を標識してから、FACSAria III Cell Sorter (Becton Dickinson)を使用して、ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^−／ｌｏＣＤ２５^ｈｉｇｈ（ｐＴｒｅｇ）及びＣＤ４^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ２５^{ｎｅｇ／ｄｉｍ}［通常ヘルパーＣＤ４ Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）］サブ集団に選別する。

【0296】

ＭＡＣＳシステムを使用して陽性選択によって、ＰＢＭＣからＣＤ１４^＋単球を単離する。

【0297】

磁気濃縮（ＭＡＣＳシステム：ＣＤ４マイクロビーズ）及びＦＡＣｓ選別後、ＰＢＭＣからＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２５⁻ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性（ナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を単離する。選別工程前に、抗ＣＤ４（１３Ｂ８．２）−ＦＩＴＣ(Beckman Coulter)、抗ＣＤ２５（４Ｅ３）−ＡＰＣ(Miltenyi Biotec)及び抗ＣＤ１２７（Ｒ３４．３４）−ＰＥ(Beckman Coulter)、抗ＴＣＲαβ−ＢＶ４２１（ＩＰ２６）(Biolegend)で濃縮ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞を染色する。

【0298】

磁気濃縮（ＭＡＣＳシステム：抗ｉＮＫＴマイクロビーズ及びＦＡＣＳ選別後、ＰＢＭＣからＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４^＋ＣＤ１拘束性Ｔ細胞を単離する。選別工程前に、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１）Ｖ４５０、抗不変ＴＣＲ Ｖα２４−ＪαＱ（６Ｂ１１）−ＰＥ（ｉｎｖ ＴＣＲ Ｖα２４−ＪαＱ(Becton Dickinson)及び抗ＣＤ４５ＲＡ（Ｔ６Ｄ１１）−ＦＩＴＣ(Miltenyi Biotec)で濃縮ＣＤ３^＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４^＋Ｔ細胞を染色する。

【0299】

磁気濃縮（ＭＡＣＳシステム：ＴＣＲγδ^＋Ｔ細胞単離キット）及びＦＡＣＳ選別後、ＰＢＭＣからＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２７^＋ＴＣＲγδ^＋非拘束性Ｔ細胞を単離する。選別工程前に、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１）Ｖ４５０、抗ＴＣＲ ｐａｎγδ^＋ＰＥ（ＩＭＭＵ５１０）(Beckman Coulter)、抗ＣＤ２７−ＡＰＣ ｅｆｌｕｏｒ ７８０（Ｏ３２３）(ebioscience)及び抗ＣＤ４５ＲＡ（Ｔ６Ｄ１１）−ＦＩＴＣ(Miltenyi Biotec)で濃縮ＣＤ３^＋ＴＣＲγδ^＋Ｔ細胞を染色する。

【0300】

２％低酸素状態において、５％ＳＶＦ、１００IU/ml ペニシリン／ストレプトマイシン、１mM ピルビン酸ナトリウム、１mM 非必須アミノ酸、glutamax及び１０mM ＨＥＰＥＳを補充したＩＭＤＭ（ＩＭＤＭ−５培地）中で、Ｔ細胞サブセットを培養する。

【0301】

乳ガン細胞株及び培養．ヒト乳ガン細胞株ＭＣＦ−７は、American Type Culture Collection (USA)から入手した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Invitrogen, USA）中で、細胞を維持する。ＭＣＦ−７細胞を５μg/ml ドキソルビシンで２４時間処置するか、又はγ線照射（２０Gy）によって処置する。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって、アポトーシスの程度をモニタリングする。ＤＣを供給する前に、細胞を十分に洗浄する。

【0302】

ＴＩＬ単離．腫瘍組織をメスで細分し、ロータリーシェーカー上、２mM グルタミン(Gibco)、５０mg/mL ゲンタマイシン及び０．２５％ヒト血清アルブミンを補充した、ＤＭＥＭ高グルコース培地中、コラゲナーゼタイプＩＶ（２mg/mL、Roche Diagnostic GmbH）と３７℃で一晩インキュベーションすることによって酵素消化した。

【0303】

機能的にコミットされたポリクローナルＦＯＸＰ３発現制御性Ｔ細胞のex vivo生成．
機能的にコミットされたポリクローナルＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞のex vivo生成：０日目に、Ｔ細胞を４８ウェルプレートに細胞 ２，５×１０^５個/ウェルで播種し、ΔＣＤ３フィーダー（１Ｍ）の存在下、プレート結合抗ＣＤ３ ｍＡｂ（４μg/ml）で刺激する。ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nMを含むＩＭＤＭ−５培地（５％ＳＶＦ、１００IU/ml ペニシリン／ストレプトマイシン、１mM ピルビン酸ナトリウム、１mM 非必須アミノ酸、glutamax及び１０mM ＨＥＰＥＳを補充したＩＭＤＭ）中で、細胞を培養する。２日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）を培養物に追加する。３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５と交換する。１１日目に、プレート結合抗ＣＤ３ Ａｂ（４μg/ml）で再刺激することによって、これらのＣＤ４^＋Ｔ細胞株をさらにエクスパンションした。ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在下で、再刺激を実施した。次いで、３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５と交換する。２０日目に、フローサイトメトリーによって、エクスパンションＣＤ４^＋Ｔ細胞の表現型を評価した。ＣＤ４５ＲＯ^＋になった刺激ナイーブ通常Ｔ細胞の７５％は、ＦＯＸＰ３^＋を発現する。

【0304】

機能的にコミットされたポリクローナルＦＯＸＰ３発現不変Ｔ細胞のex vivo生成：０日目に、Ｔ細胞を９６ウェルプレートに細胞 １×１０^３個/ウェルで播種し、ΔＣＤ３フィーダー（２．５×１０^５個）の存在下、プレート結合抗ｉｎｖ ＴＣＲ Ｖα２４−ＪαＱ（６Ｂ１１） ｍＡｂ（２μg/ml）で刺激する。ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含むＩＭＤＭ−５培地中で、細胞を培養する。３日ごとに、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を培養物に追加する。１２日目に、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）の存在下、プレート結合抗抗ｉｎｖ ＴＣＲ Ｖα２４−ＪαＱ（６Ｂ１１） ｍＡｂ（２μg/ml）で再刺激することによって、Ｔ細胞をさらにエクスパンションする。次いで、３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５と交換する。２１日目に、フローサイトメトリーによって、細胞を分析する。ＣＤ４５ＲＯ^＋になった刺激ＣＤ３＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４^＋ＲＡ^＋Ｔ細胞の７０％は、Ｆｏｘｐ３^＋を発現する。

【0305】

機能的にコミットされたポリクローナルＦＯＸＰ３発現ＴＣＲγδ^＋Ｔ細胞のex vivo生成：０日目に、Ｔ細胞を９６ウェルプレートに細胞 １×１０^３個/ウェルで播種し、ΔＣＤ３フィーダー（２．５×１０^５個）の存在下、プレート結合抗ＴＣＲγδ ｍＡｂ（２μg/ml）で刺激する。ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含むＩＭＤＭ−５培地（５％ＳＶＦ、１００IU/ml ペニシリン／ストレプトマイシン、１mM ピルビン酸ナトリウム、１mM 非必須アミノ酸、glutamax及び１０mM ＨＥＰＥＳを補充したＩＭＤＭ）中で、細胞を培養する。３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５と交換する。１１日目に、プレート結合抗ｐａｎ ＴＣＲγδ Ａｂ（２μg/ml）で再刺激することによって、Ｔ細胞をさらにエクスパンションした。ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM及びＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）の存在下で、再刺激を実施した。次いで、３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５と交換する。２１日目に、フローサイトメトリーによって、細胞を分析する。ＣＤ４５ＲＯ^＋になった刺激ＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２７^＋ＴＣＲγδ^＋Ｔ細胞の６５％は、Ｆｏｘｐ３^＋を発現する。

【0306】

機能的にコミットされた抗原特異的ＦＯＸＰ３発現Ｔ細胞のex vivo生成：
機能的にコミットされた抗原（オボアルブミン）特異的Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞のex vivo生成：
ａ）ＣＤ１４^＋単球からのオボアルブミンロード寛容原性ＤＣ（寛容原性単球由来ＤＣ（Ｔｏｌ−Ｍｏ−ＤＣ）と称される）のin vitro生成：未成熟ＤＣの生成のために、１００ng/mlリコンビナントヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び１０ng/ml ヒトリコンビナントＩＬ−４を補充した、１ウェル当たりＡＩＭＶ ０，５mlを含有する４８ウェル平底プレート中で、単球を培養する。３日目に、サイトカインを含有する培地 ５００μlを追加した。６日目に、Ｔｏｌ−Ｍｏ−ＤＣを、１）ウェルから取り出し、ＩＭＤＭ−５（５％ＳＶＦ、１００IU/ml ペニシリン／ストレプトマイシン、１mM ピルビン酸ナトリウム、１mM 非必須アミノ酸、glutamax及び１０mM ＨＥＰＥＳを補充したＩＭＤＭ）で２回洗浄し、２）ＩＭＤＭ−５中、４８ウェルプレートのウェルに３×１０^５個/mlの濃度で追加し、３）特異的Ａｇ（ＯＶＡ）を含むＩＭＤＭ−５でパルスする。

【0307】

ｂ）機能的にコミットされた特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞のex vivo生成及びエクスパンション：０日目に、オボアルブミンパルスｔＤＣを、１）ＩＭＤＭ−５で２回洗浄し、２）照射自己フィーダー ２×１０^５個、ＰＧＥ２ １μM及びＲａｐａ １０nMの存在下、ＩＭＤＭ−５中、３×１０^５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに追加する。精製ナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞（事前に凍結したＰＢＭＣからＦＡＣＳによって単離）をパルスｔＤＣに追加する。１日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）を共培養物に追加する。３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/mlを含む新鮮ＩＭＤＭ−５）（Ｔ細胞クローニング培地）と交換する。１２日目に、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）の存在下、ｏｖａパルスｔＤＣで再刺激することによって、これらのＴ細胞をさらにエクスパンションする。Ｔ細胞がエクスパンションし始めたら、Ｔ細胞クローニング培地及び照射フィーダーと共に、それらを２〜３日ごとに分割し得る。２１日目に、フローサイトメトリーによって、細胞を分析する。ＣＤ４５ＲＯ^＋になった刺激ナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞の８５％は、Ｆｏｘｐ３^＋を発現する。刺激培養条件にかかわらず、ｎＴｒｅｇ極性培地中で２１日間エクスパンションした後、Ｏｖａ特異的記憶ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞が、制御活性のみを発揮するようにコミットされることを確認するために、ｎＴｒｅｇ極性培地（ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２及びラパマイシンの組み合わせを含む）又はＴＨ−１７極性培地（ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３サイトカインを含有するＩＭＤＭ培地）中で、ｏｖａ特異的ｐＴｒｅｇをさらに３週間培養する。２１日間エクスパンションしたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞を、４８ウェルプレート中、ΔＣＤ３フィーダー（１Ｍ）の存在下、プレート結合抗ＣＤ３ ｍＡｂ（４μg/ml）で刺激し、３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、新鮮Ｔ細胞クローニング培地又はＴＨ−１７極性培地と２１日間交換する。

【0308】

機能的にコミットされた腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞のex vivo生成：
ａ）ＣＤ１４^＋単球からの腫瘍ロード寛容原性ＤＣ（寛容原性単球由来ＤＣ（ｔＤＣ）と称される）のin vitro生成：１００ng/mlリコンビナントヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び１０ng/ml ヒトリコンビナントＩＬ−４を補充した、１ウェル当たりＡＩＭＶ ０．５mlを含有する４８ウェル平底プレート中で、単球を培養する。３日目に、サイトカインを含有する培地 ５００μlを追加する。５日目に、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng/mL）、ＩＬ−４（１０ng/mL）を含むＡＩＭＶ中で、ｔＤＣの一部をアポトーシスＭＣＦ−７細胞と共に１：２のＤＣ／腫瘍細胞比で２４時間共培養する。９０％ＦＢＳ−１０％ＤＭＳＯ中で、ｔＤＣの別の一部を２×１０^６個/バイアルで凍結する。

【0309】

ｂ）機能的にコミットされた腫瘍抗原特異的Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞のex vivo生成及びエクスパンション：０日目に、腫瘍抗原パルスｔＤＣを、１）ＩＭＤＭ−５で２回洗浄し、２）照射自己フィーダー ２×１０^５個、ＰＧＥ２ １μM及びＲａｐａ １０nMの存在下、ＩＭＤＭ−５中、３×１０^５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに追加する。精製ＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞（事前に凍結したＰＢＭＣからＦＡＣＳによって単離）をパルスｔＤＣに追加する。１日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）を共培養物に追加する。３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５（Ｔ細胞クローニング培地）と交換する。１２日目に、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在下、腫瘍ＡｇパルスｔＤＣで再刺激することによって、これらのＴ細胞をさらにエクスパンションする。Ｔ細胞がエクスパンションし始めたら、Ｔ細胞クローニング培地及び照射フィーダーと共に、それらを２〜３日ごとに分割し得る。２１日目に、フローサイトメトリーによって、細胞を分析する。ＣＤ４５ＲＯ^＋になった刺激ナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞の８８％は、Ｆｏｘｐ３^＋を発現する。

【0310】

機能的にコミットされた腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４^＋ＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞のex vivo生成：
ａ）ＣＤ１４^＋単球からの腫瘍ロード寛容原性ＤＣ（寛容原性単球由来ＤＣ（ｔＤＣ）と称される）のin vitro生成：ＣＤ１ｄを発現する未成熟ＤＣの生成のために、１００ng/mlリコンビナントヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び１０ng/ml ヒトリコンビナントＩＬ−４及びＡＭ５８０（１００nM）を補充した、１ウェル当たりＡＩＭＶ ０．５mlを含有する４８ウェル平底プレート中で、単球を培養する。３日目に、サイトカインを含有する培地 ５００μlを追加する。５日目に、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng/mL）、ＩＬ−４（１０ng/mL）を含むＡＩＭＶ中で、ｔＤＣの一部をアポトーシスＭＣＦ−７細胞と共に１：２のＤＣ／腫瘍細胞比で２４時間共培養する。９０％ＦＢＳ−１０％ＤＭＳＯ中で、ｔＤＣの別の一部を２×１０^６個/バイアルで凍結する。

【0311】

ｂ）機能的にコミットされた腫瘍抗原特異的Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４^＋ＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞のex vivo生成及びエクスパンション：０日目に、腫瘍抗原パルスｔＤＣを、１）ＩＭＤＭ−５で２回洗浄し、２）照射自己フィーダー ２×１０^５個、ＰＧＥ２ １μM及びＲａｐａ １０nMの存在下、ＩＭＤＭ−５中、３×１０^５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに追加する。精製ＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４^＋ＣＤ１拘束性Ｔ細胞（事前に凍結したＰＢＭＣからＦＡＣＳによって単離）をパルスｔＤＣに追加する。１日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）、ＩＬ−１５（１０ng/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）を共培養物に追加する。３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５（Ｔ細胞クローニング培地）と交換する。１２日目に、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）の存在下、腫瘍ＡｇパルスｔＤＣで再刺激することによって、これらのＴ細胞をさらにエクスパンションする。Ｔ細胞がエクスパンションし始めたら、Ｔ細胞クローニング培地及び照射フィーダーと共に、それらを２〜３日ごとに分割し得る。２１日目に、フローサイトメトリーによって、細胞を分析する。ＣＤ４５ＲＯ^＋になった刺激ＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４^＋細胞の７５％は、Ｆｏｘｐ３^＋を発現する。

【0312】

機能的にコミットされたホスホ抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲγδ^＋非拘束性Ｔ細胞のex vivo生成：
ａ）ＣＤ１４^＋単球からの寛容原性ＤＣ（寛容原性単球由来ＤＣ（Ｔｏｌ−Ｍｏ−ＤＣ）と称される）のin vitro生成：未成熟ＤＣの生成のために、１００ng/mlリコンビナントヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び１０ng/ml ヒトリコンビナントＩＬ−４を補充した、１ウェル当たりＡＩＭＶ ０．５mlを含有する４８ウェル平底プレート中で、単球を培養する。３日目に、サイトカインを含有する培地 ５００μlを追加した。６日目に、生成Ｔｏｌ−Ｍｏ−ＤＣをウェルから取り出し、ＩＭＤＭ−５（５％ＳＶＦ、１００IU/ml ペニシリン／ストレプトマイシン、１mM ピルビン酸ナトリウム、１mM 非必須アミノ酸、glutamax及び１０mM ＨＥＰＥＳを補充したＩＭＤＭ）で２回洗浄し、凍結するか、又は機能的にコミットされたホスホ抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲγδ^＋非拘束性Ｔ細胞の生成及びエクスパンションに使用する。

【0313】

ｂ）機能的にコミットされたホスホ抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲγδ^＋非拘束性Ｔ細胞のex vivo生成及びエクスパンション：０日目に、ｔＤＣを、照射自己フィーダー ２×１０^５個、ＰＧＥ２ １μM及びＲａｐａ １０nM及びゾレドロン酸（１００nM）の存在下、ＩＭＤＭ−５中、３×１０^５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに追加する。精製ＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＴＣＲγδ^＋非拘束性Ｔ細胞（事前に凍結したＰＢＭＣからＦＡＣＳによって単離）をパルスｔＤＣに追加する。１日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）、ＩＬ−１５（１０ng/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）を共培養物に追加する。３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５（Ｔ細胞クローニング培地）と交換する。１２日目に、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）、ＩＬ−１５（１０ng/ml）及びゾレドロン酸（１００nM）の存在下、ｔＤＣで再刺激することによって、これらのＴ細胞をさらにエクスパンションする。Ｔ細胞がエクスパンションし始めたら、Ｔ細胞クローニング培地及び照射フィーダーと共に、それらを２〜３日ごとに分割し得る。２１日目に、フローサイトメトリーによって、細胞を分析する。ＣＤ４５ＲＯ^＋になった刺激ＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＴＣＲγδ^＋Ｔ細胞の７５％は、Ｆｏｘｐ３^＋を発現する。

【0314】

機能的にコミットされた腫瘍ホスホ抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲγδ^＋非拘束性Ｔ細胞のex vivo生成：
ａ）ＣＤ１４^＋単球からの腫瘍ロード寛容原性ＤＣ（寛容原性単球由来ＤＣ（ｔＤＣ）と称される）のin vitro生成：１００ng/mlリコンビナントヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び１０ng/ml ヒトリコンビナントＩＬ−４を補充した、１ウェル当たりＡＩＭＶ ０．５mlを含有する４８ウェル平底プレート中で、単球を培養する。３日目に、サイトカインを含有する培地 ５００μlを追加する。５日目に、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng/mL）、ＩＬ−４（１０ng/mL）を含むＡＩＭＶ中で、ｔＤＣの一部をアポトーシスＭＣＦ−７細胞と共に１：２のＤＣ／腫瘍細胞比で２４時間共培養する。９０％ＦＢＳ−１０％ＤＭＳＯ中で、ｔＤＣの別の一部を２×１０^６個/バイアルで凍結する。

【0315】

ｂ）機能的にコミットされた腫瘍ホスホ抗原特異的Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲγδ^＋非拘束性Ｔ細胞のex vivo生成及びエクスパンション：０日目に、腫瘍抗原パルスｔＤＣを、１）ＩＭＤＭ−５で２回洗浄し、２）照射自己フィーダー ２×１０^５個、ＰＧＥ２ １μM及びＲａｐａ １０nMの存在下、ＩＭＤＭ−５中、３×１０^５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに追加する。精製ＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＴＣＲγδ^＋非拘束性Ｔ細胞（事前に凍結したＰＢＭＣからＦＡＣＳによって単離）をパルスｔＤＣに追加する。１日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）を共培養物に追加する。３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５（Ｔ細胞クローニング培地）と交換する。１２日目に、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在下、腫瘍ＡｇパルスｔＤＣで再刺激することによって、これらのＴ細胞をさらにエクスパンションする。Ｔ細胞がエクスパンションし始めたら、Ｔ細胞クローニング培地及び照射フィーダーと共に、それらを２〜３日ごとに分割し得る。２１日目に、フローサイトメトリーによって、細胞を分析する。ＣＤ４５ＲＯ^＋になった刺激ナイーブＣＤ３^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＴＣＲγδ^＋Ｔ細胞の７５％は、Ｆｏｘｐ３^＋を発現する。

【0316】

文献に記載されている古典的なプロトコールによる、ＰＢＭＣから単離したＴｒｅｇ由来のＴｒｅｇのex vivoエクスパンション：
ΔＣＤ３フィーダー（１Ｍ）及びＩＬ−２（１００UI/ml）及びラパマイシン（１００nM）の存在下、プレート結合抗ＣＤ３ ｍＡｂ（４μg/ml）、可溶性抗ＣＤ２８ Ａｂ（４μg/ml）でＣＤ４^＋ＣＤ１２７^−／ｌｏＣＤ２５^ｈｉｇｈ（Ｔｒｅｇ）を刺激する。ＩＭＤＭ−５培地中で、細胞を培養する。

【0317】

文献に記載されている古典的なプロトコールによる、ＰＢＭＣから単離した通常ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞由来のＴｒｅｇのex vivo誘導及び生成：
ΔＣＤ３フィーダー（１Ｍ）、ＴＧＦβ（５ng/ml）及びラパマイシン（１００nM）の存在下、プレート結合抗ＣＤ３ ｍＡｂ（４μg/ml）、可溶性抗ＣＤ２８ Ａｂ（４μg/ml）でＣＤ４^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ２５^{ｎｅｇ／ｄｉｍ}［通常ヘルパーＣＤ４ Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）］を刺激する。ＩＭＤＭ−５培地中で、細胞を培養する。２日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）を培養物に追加する。３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５と交換する。１１日目に、プレート結合抗ＣＤ３ Ａｂ（４μg/ml）及び抗ＣＤ２８ Ａｂで再刺激することによって、これらのＣＤ４^＋Ｔ細胞株をさらにエクスパンションした。ΔＣＤ３フィーダー、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在下で、再刺激を実施した。次いで、３日ごとに、上清容量の半分を廃棄し、ＩＬ−２（１００UI/ml）を含む新鮮ＩＭＤＭ−５と交換する。

【0318】

Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＣＲ□β＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞の改善されたｏｖａ特異的活性化及びエクスパンション：
オボアルブミンパルスｔＤＣを、１）ＩＭＤＭ−５で２回洗浄し、２）照射自己フィーダー ２×１０^５個、ＰＧＥ２ １μM及びＲａｐａ １０nMの存在下、ＩＭＤＭ−５中、３×１０^５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに追加する。可溶性抗ＣＤ２８ Ａｂ（１μg/ml−クローンＣＤ２８．２）及びＣＤ４０−Ａｂ（１μg/ml−クローンＧ２８．５）の存在下で、精製ナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞（事前に凍結したＰＢＭＣからＦＡＣＳによって単離）をパルスｔＤＣに追加する。１６時間の刺激後、細胞をＰＢＳ（０．５％ＢＳＡ）で洗浄し、抗ＣＤ１５４（クローン５Ｃ８）−ＰＥ及び抗ＣＤ４（ＳＫ３）−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ ７１０で１０分間染色する。染色細胞をＰＥコンジュゲートマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)と共にインキュベーションし、ＭＡＣＳカラム(Miltenyi Biotec)を使用することによって濃縮する。次いで、単離したＣＤ１５４＋Ｔ細胞を再刺激し、上記のものと同じ最適条件下でエクスパンションする。

【0319】

ＭＬＲアッセイのための刺激細胞のin vitro生成：未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）の生成のために、２０ng/mlリコンビナントヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び２０ng/ml ヒトリコンビナントＩＬ−４を補充した、１ウェル当たりＲＰＭＩ−５ ０，５mlを含有する４８ウェル平底プレート中で、単球を培養する。３日目に、サイトカインを含有する培地 ５００μlを追加する。５日目に、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ng/mL）、ＩＬ−４（２０ng/mL）及び５％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で、ｉＤＣの一部をアポトーシスＭＣＦ−７細胞と共に１：２のＤＣ／腫瘍細胞比で２４時間共培養する。９０％ＦＢＳ−１０％ＤＭＳＯ中で、ｉＤＣの別の一部を２×１０^６個/バイアルで凍結する。示されている場合、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α；最終２０ng/mL）及びＰＧＥ２（１μM）でパルスＤＣを２日間成熟させる（ｍＤＣ）。いくつかの実験では、ＴＮＦ及びＰＧＥ２（同じ濃度）又はリポ多糖（ＬＰＳ；１０〜１０００ng/mL；Sigma）をＭＬＲに直接追加する。抗原ロードＤＣ刺激剤を３０Gyで照射する。

【0320】

ＭＬＲアッセイのためのＴＡＰ阻害刺激細胞のin vitro生成：上記のように取得した成熟ＤＣに、ＢＨＶ−１由来のＵＬ４９．５遺伝子を含有するｐＧｅｍ４Ｚベクターから合成したＲＮＡ ２０μgをエレクトロポレーションする(ref: Lampen MH, Verweij MC, Querido B, van der Burg SH, Wiertz EJ, van Hall T. CD8+T cell responses against TAP-inhibited cells are readily detected in the human population. J Immunol. 2010 Dec 1;185(11):6508-17.)。

【0321】

アポトーシスＴ細胞−ＤＣ共培養
未成熟ＤＣを単独で、又はアポトーシス細胞（３つのアポトーシス細胞：１つのｉＤＣ）と共に１６時間培養した。次いで、抗ＣＤ３コーティングマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を使用してアポトーシスＴ細胞の免疫磁気枯渇によって、ＤＣを精製し、合成ＲＮＡ ２０μgをエレクトロポレーションし又はエレクトロポレーションせず、２０ng/ml ＧＭ−ＣＳＦ、２０ng/ml ヒトリコンビナントＩＬ−４及び成熟カクテル（ＴＮＦ−α ２０ng/ml及びＰＧＥ２ １μM）を補充したＲＰＭＩ−５中で２４時間インキュベーションした。

【0322】

ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１７検出．
ＥＬＩＳＡによって、培養上清中のＩＬ−１７の存在を測定する。当技術分野で公知の従来の方法、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ抗ＩＬ−１７によって、抗ＩＬ−１７抗体によるＩＬ−１７の認識を行い得る。ＥＬＩＳＡは、当技術分野で公知の任意の比色手段によって、例えば、ビオチンで標識された検出抗体、ポリストレプトアビジンＨＲＰ増幅システム及びｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液を使用して発色される。

【0323】

前記方法の一例は、以下である：
−捕捉抗体、例えば抗ＩＬ１７抗体でプレートをコーティングする、
−ブロッキングバッファー（例えば、ＰＢＳ中２％カゼイン）でプレートを３７℃で９０分間ブロッキングする、
−プレートを希釈系列のＩＬ−１７標準、サンプル又はネガティブコントロールと共に３７℃で９０分間インキュベーションする、
−プレートを検出抗体、例えばビオチン化抗ＩＬ−１７抗体などと共に３７℃で９０分間インキュベーションする、
−プレートをストレプトアビジン−ＨＲＰと共に３７℃で３０分間インキュベーションし、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液を用いて複合体を３０分間発色させる。酵素反応を停止した後、分光光度法によって、得られた色の強度を４９０nmで決定する。

【0324】

当業者であれば、標準曲線による計算後、２００ng/ml、１００ng/ml、５０ng/mlよりも低いＩＬ−１７レベルは、ＩＬ−１７の分泌がないか又はＩＬ−１７の分泌が少ないことに対応すると考える。

【0325】

フローサイトメトリー分析．
ｍＡｂ標識．以下のコンジュゲートｍＡｂを使用する。

【0326】

ａ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞の場合：抗ＣＤ４（ＳＫ３）−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ ７１０、抗ＴＣＲαβ（ＩＰ２６）−ＡＰＣ(ebioscience)、抗ＣＤ２５（Ｂ１．４９．９）−ＰｅＣｙ５５、抗ＣＤ１２７（Ｒ３４．３４）−ＡＰＣ−ＡＦ７００(Beckman Coulter)、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）−ＢＢ５１５抗不変ＴＣＲ Ｖα２４−ＪａＱ（６Ｂ１１）−ＰＥ、抗Ｆｏｘｐ３（２５９Ｄ／Ｃ７）−ＰＥ−ＣＦ５９４及び抗ＣＤ１５２（ＢＮＩ３）−ＢＶ４２１、抗ＣＤ１６１（ＤＸ１２）ＢＶ６０５及び抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ １６．２）ＢＵ３９５(Becton Dickinson)、抗ＴＣＲαβ−ＢＶ４２１（ＩＰ２６）(Biolegend)、抗ＴＣＲ ｐａｎγδ^＋ＰＥ（ＩＭＭＵ５１０）(Beckman Coulter)及び抗ＣＤ２７−ＡＰＣ ｅｆｌｕｏｒ ７８０（Ｏ３２３）(ebioscience)．ＢＳＡ／ＮａＮ_３（０．５％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ_３）を含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で希釈したＡｂの混合物を使用して、表面マーカーについて細胞を染色する（４℃、暗所で３０分間）。ebioscienceから入手したＦＯＸＰ３染色キットを用いて、製造業者の説明書にしたがって、Ｆｏｘｐ３及びＣＴＬＡ−４細胞内染色を実施する。各染色組み合わせのために、適切なアイソタイプコントロールＡｂを使用する。BD FACSDIVA 8.0.1ソフトウェア(Becton Dickinson)を使用してBD LSR FORTESSAフローサイトメーターによって、サンプルを得る。パーセンテージ（％）又は平均蛍光強度（ＭＦＩ）で結果を表す。

【0327】

ｂ）誘導特異的Ｔｒｅｇの場合：モノクローナル抗Ｆｏｘｐ３（２５９Ｄ／Ｃ７）−ＰＥ−ＣＦ５９４ Ａｂ及びポリクローナル抗ＩＬ−１Ｒ１−ＰＥ(R&D system, FAB269P)を用いて、誘導Ｔｒｅｇ上におけるＩＬ−１Ｒ１の存在を評価した。

【0328】

ＣＦＳＥ染色．ＰＢＳ中、１μMカルボキシ−フルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）(CellTrace cell proliferation kit; Molecular Probes/Invitrogen)でＴｃｏｎｖを細胞 １×１０^７個/mLの濃度、３７℃で８分間染色する。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培養培地で細胞を２回洗浄することによって、標識を停止させる。次いで、細胞を所望の濃度で再懸濁し、続いて、増殖アッセイに使用する。

【0329】

７−ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）染色．７−ＡＡＤアッセイを使用して、刺激ＣＦＳＥ標識又は非標識ｎＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖのアポトーシスを決定した。簡潔に言えば、２０μg/mL核色素７−ＡＡＤ(Sigma-Aldrich)で培養細胞を４℃で３０分間染色する。ＦＳＣ／７−ＡＡＤドットプロットは、生細胞（ＦＳＣ^ｈｉｇｈ／７−ＡＡＤ⁻）とアポトーシス細胞（ＦＳＣ^ｈｉｇｈ／７−ＡＡＤ^＋）と、アポトーシス小体（ＦＳＣ^ｌｏｗ／７−ＡＡＤ^＋）と、残屑（（ＦＳＣ^ｌｏｗ／７−ＡＡＤ⁻）とを区別する。生細胞は、ＣＤ３^＋７−ＡＡＤ⁻ＦＳＣ^＋細胞として同定される。

【0330】

機能アッセイ
Ｔ細胞増殖．酸素正常状態において、５％ＦＢＳ、１００IU/ml ペニシリン／ストレプトマイシン、１mM ピルビン酸ナトリウム、１mM 非必須アミノ酸、glutamax及び１０mM ＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ−５培地）中で、ＣＦＳＥ希釈アッセイによって、Ｔ細胞増殖を評価する。共培養完了時に、刺激ＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖを回収し、抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び７−ＡＡＤで共染色し、フローサイトメトリーによって、ゲーティングＣＤ３^＋７−ＡＡＤ⁻細胞における生増殖細胞（ＣＦＳＥ ｌｏｗ画分として定義される）のパーセンテージを決定する。

【0331】

Ｔ細胞アポトーシス誘導：機能的にコミットされた腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞を上記のようにex vivoで生成する。次いで、腫瘍抗原特異的刺激Ｔ細胞を２５４nm（ＵＶ−Ｃ）で照射し（２４０mJ/cm2）、６時間培養してから、未成熟ＤＣと共に共培養した。７−ＡＡＤ染色によって、アポトーシスを確認した。平均して、細胞の７５％は７−ＡＡＤ＋である。

【0332】

標準的なポリクローナル細胞間接触Ｔｒｅｇ抑制アッセイ：規定量のＦｏｘｐ３ Ｔ細胞（血液Ｔｒｅｇ又はex vivo生成Ｔ細胞）の存在下又は非存在下で、レスポンダー細胞として使用するＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖ（４×１０^４個/ウェル）をΔＣＤ３フィーダー（４×１０^４個/ウェル）と共に４〜５日間培養する。完全ＲＰＭＩ培地 ２００μL中、０．２μg/mL 抗ＣＤ３ ｍＡｂでコーティングされた丸底プレート中で、培養を実施する。増殖ＣＦＳＥ ｌｏｗＴ細胞のパーセンテージとして、又は以下：
（１００×［（Ｔｃｏｎｖ ＣＦＳＥ ｌｏｗ細胞のパーセンテージ−ｎＴｒｅｇとの共培養におけるＴｃｏｎｖ ＣＦＳＥ ｌｏｗのパーセンテージ）／Ｔｃｏｎｖ ＣＳＦＥ ｌｏｗ細胞のパーセンテージ
のように計算した抑制のパーセンテージとして、結果を表す。

【0333】

自己ＭＬＲ抑制アッセイ：規定量のＦｏｘｐ３ Ｔ細胞（血液Ｔｒｅｇ又はex vivo生成Ｔ細胞）の存在下又は非存在下で、ＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖ ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞（５×１０^４）を、ＲＰＭＩ−５培地中、パルスｉＤＣ １×１０^４個で、又はＩＬ−２（２０IU/ml）、ＩＬ−１ｂ（１０ng/ml）、ＩＬ−６（３０ng/ml）、ＩＬ−２１（５０ng/ml）及びＩＬ−２３（３０ng/ml）を補充したＩＭＤＭ−５培地中、パルスｍＤＣ ５×１０^３個で５〜６日間刺激する。示されている場合、ＩＬ−２（２０IU/ml）、ＩＬ−１β（１０ng/ml）、ＩＬ−６（３０ng/ml）、ＩＬ−２１（５０ng/ml）及びＩＬ−２３（３０ng/ml）を補充したＩＭＤＭ−５培地中で、培養を実施する。増殖ＣＦＳＥ ｌｏｗＴ細胞のパーセンテージとして、又は以下：
（１００×［（Ｔｃｏｎｖ ＣＦＳＥ ｌｏｗ細胞のパーセンテージ−ｎＴｒｅｇとの共培養におけるＴｃｏｎｖ ＣＦＳＥ ｌｏｗのパーセンテージ）／Ｔｃｏｎｖ ＣＳＦＥ ｌｏｗ細胞のパーセンテージ
のように計算した抑制のパーセンテージとして、結果を表す。

【0334】

ＤＮＡメチル化の測定：古典的には、安定Ｔｒｅｇ遺伝子シグネチャーは、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）の保存された非コード配列２（ＣＮＳ２）内の高度に脱メチル化されたＣｐＧアイランドからなるものであった。Christopher Fuhrman (Fuhrman et al, Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226, 2015, Journal of immunology)によって以前に記載されているように、ゲノムＤＮＡのバイサルファイト処理後に定量的ＰＣＲによって、ＦＯＸＰ３遺伝子のＴＳＤＲ領域のＤＮＡメチル化分析を評価した。簡潔に言えば、必要に応じて、AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen)又はDNeasy tissue kit (Qiagen)を用いて、ヌクレオチドを単離した。EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research)を用いて、ＤＮＡ ５００ngに対して、ゲノムＤＮＡのバイサルファイト処理を実施した。ＤＮＡ標準は、非メチル化バイサルファイト変換ヒトＥｐｉＴｅｃｔコントロールＤＮＡ(Qiagen)又は汎用メチル化バイサルファイト変換ヒトコントロールＤＮＡ(ZymoResearch)のものであった。大量の標準を取得するために、以下の反応：ZymoTaq PreMixバッファー(Zymo Research) ２５μl並びにプライマーＦＯＸＰ３＿ＴＳＤＲｆｗｄ（５’−ＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＡＧＧＧＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＧ−３’配列番号：１）及びＦＯＸＰ３＿ＴＳＤＲｒｅｖ（５’−ＡＡＴＡＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣ−３’−配列番号：２） 各０．５μMを含有する反応容量 ５０μlを使用して、ＴＳＤＲをＰＣＲ増幅した。９５℃で１０分間インキュベーションした後、増幅を以下のように実施した：９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を５０サイクル。QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いて、増幅ＰＣＲ産物を精製した。GE NanoVue spectrophotometer (GE Healthcare Life Sciences)を用いて、精製コントロールＴＳＤＲ ＤＮＡの濃度を決定した。メチル化又は脱メチル化ターゲット配列をターゲティングするプローブを用いて、ＴＳＤＲリアルタイムＰＣＲを実施した。９６ウェルホワイトトレイ中で、Roche LightCycler 480 system (Roche Diagnostics)を用いて、反応を実施した。各反応は、LightCycler 480 Probes Master Mix (Roche) １０μl、バイサルファイト変換ＤＮＡサンプル又は標準 １０ng、各プライマー １μM及び各プローブ １５０nMを含有しており、最終反応容量(final reaction value)は２０μlであった。増幅に使用したプローブは、ＴＳＤＲ−フォワード５’−ＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＴ−３’（配列番号：３）及びＴＳＤＲ−リバース５’−ＣＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号：４）であった。ターゲット配列検出のためのプローブは、ＦＡＭ標識メチル化プローブＦＡＭ−ＣＧＧＴＣＧＧＡＴＧＣＧＴＣ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号：５）又はＶＩＣ標識非メチル化プローブＶＩＣ−ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＴＴＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号：６）であった。全てのサンプルを３回反復で試験した。リアルタイム増幅のプロトコールは、以下のとおりである：９５℃で１０分間の初期変性の後、９５℃で１５秒間及び６１℃で１分間を５０サイクルにサンプルを供した。１４種類の異なる比率の完全メチル化及び脱メチル化テンプレートをリアルタイム標準として使用した。６次多項式を使用して、各サンプルについて、ＴＳＤＲで脱メチル化された細胞のパーセンテージを推定した。

【0335】

ヒストンアセチル化の測定：Ling Lu (Ling Lu et al, PNAS 2014)によって以前に記載されているように、ＣｈＩＰアッセイによって、ＦＯＸＰ３遺伝子の４つの異なる部位のヒストンアセチル化分析を評価した。簡潔に言えば、各処置ｎＴｒｅｇ細胞サンプルの細胞 ５０，０００個を回収し、１％ホルムアルデヒドで架橋し、次いで、溶解バッファー［５０mMトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０mM ＥＤＴＡ、１％（wt/vol）ＳＤＳ、プロテアーゼインヒビターミックス（１：１００希釈；Sigma）、１mM ＰＭＳＦ、２０mM 酪酸Ｎａ］ １２０μLで溶解した。溶解物中のクロマチンを５００〜８００ｂｐのフラグメントに超音波処理し、次いで、ＲＩＰＡ ＣｈＩＰバッファー［１０mMトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．５mM ＥＧＴＡ、１％（vol/vol）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％（wt/vol）ＳＤＳ、０．１％（wt/vol）デオキシコール酸Ｎａ、プロテアーゼインヒビターミックス（１：１００希釈；Sigma）、１mM ＰＭＳＦ及び２０mM 酪酸Ｎａ］ ８００μLで希釈した。DynabeadsプロテインＧ（１０μL；Invitrogen）を、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３(Abcam)又はＨ３Ｋ９ａｃ(Cell Signaling)又は正常ウサギＩｇＧネガティブコントロールＣｈＩＰグレード抗体 １μgと共に別個に２時間インキュベーションした。次いで、前処理抗体−ビーズ複合体を用いて剪断クロマチン １００μLを免疫沈降し、全インプットＤＮＡ抽出のために別の剪断クロマチン １００μLを別個に免疫沈降した。以下のプライマー：プロモーター、５’−ＡＣＣ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＧＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＴＣ−３’（配列番号：７）及び５’−ＣＴＡ ＣＣＴ ＣＣＣ ＴＧＣ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＴ−３’（配列番号：８）；ＣＮＳ１、５’−ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＣＣ ＴＡＴ ＧＴＧ ＴＧＡＴＴ−３’（配列番号：９）及び ５’−ＧＴＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＴＧＣ ＴＡ−３’（配列番号：１０）；ＣＮＳ２、５’−ＧＴＣ ＣＴＣ ＴＣＣ ＡＣＡＡＣＣ ＣＡＡ ＧＡ−３’（配列番号：１１）及び５’−ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＡ−３’（配列番号：１２）；並びにＣＮＳ３、５’−ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＧＡ ＣＣＴ ＴＴＡ ＣＴＧ ＴＧ−３’（配列番号：１３）及び５’−ＡＣＡ ＡＴＡ ＣＧＧ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＴ−３’（配列番号：１４）を用いてリアルタイムＰＣＲによって、免疫沈降ＤＮＡを定量した。

【0336】

古典的な７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞性細胞傷害性アッセイ：上記のようにＣＦＳＥでターゲット細胞を標識し、３×１０４個/ウェルで９６ウェルＵ底プレート中に３回反復で配置した。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（５：１のＥ：Ｔ比）を追加し、インキュベーションを３７℃で６時間行った。実験終了時に、７−ＡＡＤで死細胞を標識して、溶解細胞を検出した。FACSCalibur機器を使用して、二重陽性染色ＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤを示す領域に基づいて、ターゲット細胞に対する細胞溶解活性を分析した。ネガティブコントロールにおける自然溶解（％）を差し引いた後、ＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤの両方について陽性の細胞／全ＣＦＳＥ陽性細胞として、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの細胞溶解活性（％）を計算した。次いで、以下の式：
細胞溶解活性（％）［死ターゲット細胞（％）−自然死（％）］×１００／［１００−自然死（％）］
を使用して、細胞溶解活性のパーセンテージを計算した。

【0337】

結果
ａ）ポリクローナル後のナイーブＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性ＴにおいてＦｏｘｐ３発現を誘導するための最適条件．
ヒトＰＢＭＣから単離したナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２５⁻ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性）から出発して、抑制機能を有するＦｏｘｐ３^＋細胞の分化を誘導する能力について、異なるｎＴｒｅｇ極性培地を評価した。

【0338】

図２は、抗ＣＤ３ ｍＡｂでポリクローナルにex vivo活性化したところ、ナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、それらの刺激培養条件に応じて変動するＦｏｘｐ３レベルを示すことを示している。ＩＬ−２、ＴＧＦβ及びラパマイシン又はＩＬ−２、ＴＧＦβ、ラパマイシン及びＰＧＥ２の組み合わせを含む極性培地は、ＩＬ−２及びＰＧＥ２の組み合わせ又はＩＬ−２のみよりも高いＦｏｘｐ３発現をもたらす（Ｂ）。また、ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ラパマイシン及びＰＧＥ２の組み合わせは、他の組み合わせと比較して、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞において最適強度のＦｏｘｐ３発現をもたらす（Ｃ）。

【0339】

ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２及びラパマイシンの組み合わせを含む極性培地で刺激したナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞のみが、本発明者らのポジティブコントロールに対応する血中ナイーブ制御性Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^{−／ｌｏｗ}ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２５^＋）のものと同様の又はそれよりも高いレベル及び強度のＦｏｘｐ３を発現することは興味深い。

【0340】

次に、本発明者らは、ポリクローナルに刺激したＦｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞の機能的抑制能力を評価した。図３Ａは、標準的なポリクローナル細胞間接触Ｔｒｅｇ抑制アッセイを使用したところ、ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２及びラパマイシンの組み合わせを含むｎＴｒｅｇ極性培地の存在下で、ポリクローナル刺激を使用してex vivoで生成及び２１日間エクスパンションしたＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞が、ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ラパマイシンの組み合わせ（ＰＧＥ２なし）を含むｎＴｒｅｇ極性培地の存在下で生成したもの、及び新鮮ＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞の両方と比較して高い抑制活性を示すことを示している。さらに、図３Ｂは、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３サイトカインを含有する高炎症性培地の存在下で、機能的抑制アッセイを実施したところ、２１日間エクスパンションしたこれらのＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞が依然としてそれらの抑制活性を維持するのに対して、これらの刺激培養条件下では、新鮮ＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞はそれらの抑制能力を喪失したことを示している。

【0341】

ｂ）抗原特異的活性化後のナイーブＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞においてＦｏｘｐ３発現を誘導するための最適条件．
抗原特異的Ｔｒｅｇの抑制能力はポリクローナルＴｒｅｇのものよりもはるかに高いことが研究によって示唆されたので、本発明者らは、刺激培養条件にかかわらず、制御活性のみを発揮するようにコミットされた抗原特異的Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞をex vivoで生成及びエクスパンションするための方法を設定する。

【0342】

図４は、ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２及びラパマイシンの組み合わせを含むｎＴｒｅｇ極性培地の存在下では、ＯＶＡパルス自己ｔＤＣは、ナイーブ通常ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激することができるのに対して（ＣＤ２５の発現増加及びＣＤ４５ＲＡマーカーの喪失）、同じ極性培地の存在下では、非パルス自己ｔＤＣはそれらを刺激することができなかった（ＣＤ２５発現の欠如及びＣＤ４５ＲＡマーカーの持続）ことを示している。さらに、上記ｎＴｒｅｇ極性培地の存在下、ＯＶＡパルス自己ｔＤＣで特異的に活性化及び２１日間エクスパンションした場合、ナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、本発明者らのポジティブコントロールに対応する血中ナイーブ制御性Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^{−／ｌｏｗ}ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２５^＋）によって示されるものと同様のレベル及び強度のＦｏｘｐ３を発現することができる（図５）。

【0343】

Ｆｏｘｐ３を発現するナイーブＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞の抗原特異的活性化及びエクスパンションを改善するために、可溶性抗ＣＤ２８ Ａｂ（１μg/ml）及びＣＤ４０−Ａｂ（１μg/ml）の存在下、ＯＶＡパルス自己ｔＤＣでプライミングした１６時間後、ＣＤ１５４発現ナイーブＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋Ｔ細胞を選別する（図６）。次いで、単離したＣＤ１５４^＋Ｔ細胞を再刺激し、上記のものと同じ最適条件下でエクスパンションする。この戦略を使用して、本発明者らは、高度に特異的に機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞株をex vivoで誘導及び生成することができる。

【0344】

加えて、標準的なポリクローナル細胞間接触Ｔｒｅｇ抑制アッセイ（図７Ａ）及び自己ＭＬＲ抑制アッセイ（図８Ａ）を使用したところ、２１日間エクスパンションしたこれらのｏｖａ特異的ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞は、新鮮Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞と比較して同様の抑制活性を示す。

【0345】

さらに、Ｏｖａ特異的ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞は、炎症促進条件において抑制機能を果たすそれらの能力を維持する。ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３サイトカインを含有する高炎症性培地の存在下で、両機能的抑制アッセイ（図７Ｂ、図８Ｂ）を実施したところ、これらの刺激培養条件下では、新鮮Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞は、それらの抑制能力を喪失するが、２１日間エクスパンションしたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞は依然として、それらの抑制能力を維持する。高炎症状況におけるそれらの抑制能力の維持は、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３サイトカインを含有するＩＭＤＭ培地の存在下、ＣＤ３及びＣＤ２８で刺激した場合、ｎＴｒｅｇ極性培地中で２１日間エクスパンションした後に、それらが低レベルのＩＬ−１７を産生するという事実に起因する可能性がある（図１０Ａ）。

【0346】

刺激培養条件にかかわらず、ｎＴｒｅｇ極性培地中で２１日間エクスパンションした後、Ｏｖａ特異的ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞が、制御活性のみを発揮するようにコミットされることを確認するために、ｎＴｒｅｇ又はＴＨ−１７極性培地（ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３サイトカインを含有するＩＭＤＭ培地）中で、ｏｖａ特異的ｐＴｒｅｇをさらに３週間培養し、１）高炎症状況の存在下におけるそれらの機能的抑制能力について（図９）、並びに２）上記のようにＣＤ３及びＣＤ２８で刺激した場合のそれらのＩＬ−１７産生能力について（図１０）試験した。ｎＴｒｅｇ又はＴＨ−１７極性培地中でさらに２１日間培養した後、Ｏｖａ特異的ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞は依然として、高炎症状況において機能的抑制活性を保持するだけではなく（図９）、低レベルのＬ−１７も産生する（図１０Ｂ）。対照的に、この炎症状況では、新鮮Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞は、それらの抑制機能を喪失するが、ＩＬ−１７を産生する。

【0347】

Ｏｖａ特異的ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞上におけるＩＬ−１Ｒ１発現の欠如は、これらの特異的誘導Ｔｒｅｇが、炎症環境において安定であり有効に機能する理由を説明し得る。実際、図１１に示されているように、本発明者らが、異なるＴｒｅｇ集団：ａ）ＰＢＭＣから単離したex vivo静止Ｔｒｅｇ、ｂ）ポリクローナル刺激を用いた場合の、ＰＢＭＣから単離したＴｒｅｇ由来のex vivoエクスパンションＴｒｅｇ、ｃ）Ｒａｐａ及びＴＧＦβの存在下における、ＰＢＭＣから単離した通常Ｔ細胞由来のポリクローナルin vitro誘導Ｔｒｅｇ、並びにｄ）ＲＡＰＡ、ＴＧＦβ及びＰＧＥ２の存在下における、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から単離したin vitro誘導Ｏｖａ特異的ＣＤ３^＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１Ｒ１の発現を評価したところ、本発明者らは、静止Ｔｒｅｇ、ポリクローナルエクスパンションＴｒｅｇ／誘導Ｔｒｅｇ上では、誘導Ｏｖａ特異的ＣＤ３^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−１Ｒ１が優先的に発現されることを見出した。本発明者らはまた、抑制機能の安定性がＩＬ−１Ｒ１発現と逆相関することを観察する。

【0348】

ｃ−アポトーシスＣＤ４^＋Ｔ細胞ロード樹状細胞を使用した、病原性ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する自己ＣＤ８媒介性Ｔ細胞応答の誘導．
本発明者らは、腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞（腫瘍細胞免疫回避を促す病原性ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を溶解するように機能的にコミットされた自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞株を生成するための実験手順を開発した。

【0349】

最初に、本発明者らは、先に記載されているように、腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３^＋発現ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞を誘導するための最適条件を設定した。図１２は、ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２及びラパマイシンの組み合わせを含むｎＴｒｅｇ極性培地の存在下では、アポトーシス腫瘍細胞株パルス自己ｔＤＣ（「腫瘍ＡｇロードｔＤＣ」）は、抗原特異的刺激ナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞（「ナイーブＴｒｅｇ」）において高レベルのＦｏｘｐ３^＋発現（図１２Ａの頻度及び図１２ＢのＭＦＩ）を誘導することができるが、同じ極性培地の存在下では、非パルス自己ｔＤＣ（「非ロードｔＤＣ」）は、ナイーブ通常ＣＤ４^＋Ｔ細胞においてＦｏｘｐ３^＋発現を誘導することができなかったことを示している。

【0350】

次いで、本発明者らは、自己ＣＤ３^＋ナイーブＴ細胞と共に共培養したアポトーシス病原性ＣＤ４^＋Ｔ細胞をロードした炎症性ＤＣ（ｉｎｆＤＣ）が、樹状細胞をロードするために使用した病原性ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞株の生成を誘導することができる培養系を確立した。図１３は、それぞれアポトーシス病原性ＣＤ４^＋Ｔ細胞ロードｉｎｆＤＣ（「ｍＤＣ」）又はＴＡＰ阻害ＤＣで誘導した２つのＣＤ８^＋クローンが、それらの特異的ターゲット（それらの誘導病原性ＣＤ４^＋Ｔ細胞クローン）を溶解することができることを示している。しかしながら、自己ＥＢＶ細胞株に対して、両ＣＤ８^＋クローンを試験したところ、それらは、このターゲットを溶解することができない。

【0351】

ｄ）ルミナルＢ乳ガンから単離した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＦＯＸＰ３^＋発現Ｔ細胞の存在．
ルミナルＡ及びＢサブタイプは両方とも、エストロゲンレセプター陽性（ＥＲ＋）及び低悪性度であり、ルミナルＡ腫瘍は非常に緩徐に成長し、ルミナルＢ腫瘍はより急速に成長する。ルミナルＡ腫瘍は、最良の予後を有する。ルミナルＢ腫瘍は、臨床転帰不良に関連する。本発明者らは、フローサイトメトリーによって、両ルミナルサブタイプ乳ガンから単離したＴＩＬにおけるリンパ球の表現型を検査したところ、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３発現の存在を見出した。ルミナルＡ乳房腫瘍から抽出したＴＩＬでは、Ｆｏｘｐ３は検出されなかった。また、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＭＨＣＩＩ拘束性Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の高発現率と乳ガンの臨床転帰不良との間には、正の相関が観察される（図１４）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]