6987425 軟骨組織の閉鎖系培養のための方法および装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6987425

(24)【登録日】2021年12月3日

(45)【発行日】2022年1月5日

(54)【発明の名称】軟骨組織の閉鎖系培養のための方法および装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20211220BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20211220BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20211220BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 A

   C12N5/077

   C12M1/00 G

【請求項の数】22

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2018-567582(P2018-567582)

(86)(22)【出願日】2017年6月27日

(65)【公表番号】特表2019-522979(P2019-522979A)

(43)【公表日】2019年8月22日

(86)【国際出願番号】EP2017065916

(87)【国際公開番号】WO2018002091

(87)【国際公開日】20180104

【審査請求日】2020年6月10日

(31)【優先権主張番号】15/197,508

(32)【優先日】2016年6月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】598041463

【氏名又は名称】グローバル・ライフ・サイエンシズ・ソリューションズ・ユーエスエー・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100154922

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 允辰

(74)【代理人】

【識別番号】100207158

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 研二

(72)【発明者】

【氏名】ケスカル，ヴァンダナ

(72)【発明者】

【氏名】グリフィン，ウェストン・ブレイン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，シャオフア

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００８／００２６４１９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２１６４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０１５３４３６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０１６０５７７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００２−５１０４８２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

それぞれが組織ホルダと前記組織ホルダに固定された１または複数の組織サンプル（１３２）を含む、１または複数の密封された可撓性容器（１０６）を保持するように構成されたサンプル支持台（１１０）と、
前記可撓性容器（１０６）を前記サンプル支持台（１１０）の測定位置にそれぞれ配置したときに、各前記可撓性容器（１０６）が自身の上に載置されるように配置される力測定センサ（１０４）と、
前記測定位置に配置したときに、ある軸に沿って移動して、各前記可撓性容器（１０６）と係合かつ係合解除するように構成されたアクチュエータ（１０２）であって、各前記可撓性容器（１０６）と係合すると、これによって前記アクチュエータ（１０２）が変位および対応する変位データを生成し、前記力測定センサ（１０４）が力を測定し、かつ力データを生成するようにしており、前記力データを使用して、組織剛性測定値を生成している、アクチュエータ（１０２）と
を備える、バイオリアクターシステム。

【請求項2】

前記アクチュエータ（１０２）は、運転中、前記可撓性容器（１０６）内の前記組織サンプル（１３２）に圧縮負荷を加えるように構成されている、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項3】

前記サンプル支持台（１１０）は、力測定センサ（１０４）上で、複数の前記組織サンプル（１３２）を順次移動させるように構成された回転台を備える、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項4】

少なくとも１つの前記可撓性容器（１０６）は複数の個別の組織サンプル（１３２）を含み、前記バイオリアクターシステムは、前記個別の組織サンプル（１３２）を前記力測定センサ（１０４）上に別々に配置することができる、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項5】

前記力測定センサ（１０４）は、少なくとも１つのロードセルを備える、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項6】

前記アクチュエータ（１０２）は、各前記可撓性容器（１０６）の上部ローダ部分（１０８）と係合かつ係合解除するように構成され、前記上部ローダ部分（１０８）は、前記アクチュエータ（１０２）によって係合されると前記組織サンプル（１３２）と接触するように構成されている、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項7】

前記サンプル支持台（１１０）を回転させ、かつ前記サンプル支持台（１１０）、または前記サンプル支持台（１１０）に近接する前記バイオリアクターシステムの構成要素を、前記アクチュエータ（１０２）の動作軸に沿って直線的に押し上げたり、押し下げたりするように構成されたサンプル変位機構をさらに含む、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項8】

前記アクチュエータ（１０２）によって加えられる負荷パターンは、各前記組織サンプル（１３２）用に生成された組織剛性測定値に基づいて変化する、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項9】

組織サンプル（１３２）を培養するための方法であって、前記方法は、
組織サンプル（１３２）を組織ホルダ（１１６）に固定するステップと、
前記固定した組織サンプル（１３２）および前記組織ホルダ（１１６）を、可撓性容器（１０６）内に配置するステップと、
培地を前記可撓性容器（１０６）に添加し、かつ前記可撓性容器（１０６）を密封するステップと、
前記可撓性容器（１０６）を負荷装置（１００）の台（１１０）上に配置するステップと、
前記可撓性容器（１０６）の第１の側面と接触して、前記第１の側面と対向する前記可撓性容器（１０６）の第２の側面上に、変化した力センサ読取り値を生成するようにリニアアクチュエータ（１０２）を操作するステップと
を含む、方法。

【請求項10】

前記可撓性容器（１０６）は、前記負荷装置（１００）に対する前記可撓性容器（１０６）の自動押し上げおよび移動を容易にするように構成された、可撓性容器ホルダを備える、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記台（１１０）は、測定位置に対して複数の前記組織サンプル（１３２）を移動させるように構成されている、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記リニアアクチュエータ（１０２）は、変位データおよび力データを生成するためのコマンド入力に応答して、前記可撓性容器（１０６）と係合する、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

前記変位データおよび前記力データに基づいて、組織剛性測定値を計算するステップを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

積層製造法を使用して、前記組織ホルダ（１１６）上に配置される前記組織サンプル（１３２）を生成するか、または前記組織サンプル（１３２）を前記組織ホルダ（１１６）上に直接生成するステップを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項15】

組織ホルダと前記組織ホルダに固定された組織サンプル（１３２）を含む、１または複数の密封された可撓性容器（１０６）を保持するように構成されたサンプル支持台（１１０）と、
前記組織サンプル（１３２）を含む前記可撓性容器（１０６）を前記サンプル支持台（１１０）の測定位置にそれぞれ配置したときに、前記組織サンプル（１３２）が自身の上に載置されるように配置される第１の力測定センサ（１０４）と、
前記第１の力測定センサ（１０４）付近において、前記サンプル支持台（１１０）の面内に、またはこれに平行に配置される第２の力測定センサ（１０４）であって、前記第１の力測定センサ（１０４）および前記第２の力測定センサ（１０４）は使用中、互いに独立して、前記サンプル支持台（１１０）面に垂直な第１の方向に移動できる、第２の力測定センサ（１０４）と、
前記第１の方向のある軸に沿って移動し、かつ各前記可撓性容器（１０６）の前記組織サンプル（１３２）を前記第１の力測定センサ（１０４）上に配置したときに、各前記可撓性容器（１０６）と接触し、かつこれを変位させるように構成されたリニアアクチュエータ（１０２）と
を備える、バイオリアクターシステム。

【請求項16】

前記第１の力測定センサ（１０４）は、円筒形状を有する第１の力センサ（１０４Ａ）を備え、前記第２の力測定センサ（１０４）は、円筒リング形状を有する第２の力センサ（１０４Ｂ）を備え、前記第１の力センサ（１０４Ａ）が、前記第２の力センサ（１０４Ｂ）によって画定される前記円筒リング内に嵌合するようにしている、請求項１５に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項17】

前記バイオリアクターシステムの第１の測定モードにおいて、前記第１の力測定センサ（１０４）は前記サンプル支持台（１１０）と同一平面上に依然としてある、請求項１５に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項18】

前記第１の測定モードにおいて、前記リニアアクチュエータ（１０２）は、少なくとも前記第１の力測定センサ（１０４）に対して前記組織サンプル（１３２）を圧縮して、圧縮力測定値を生成するように構成されている、請求項１７に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項19】

前記バイオリアクターシステムの第２の測定モードにおいて、前記第１の力測定センサ（１０４）は前記サンプル支持台（１１０）の上面および前記第２の力測定センサ（１０４）に対して押し下げられて、凹部を形成する、請求項１８に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項20】

前記第２の測定モードにおいて、前記リニアアクチュエータ（１０２）は、前記組織サンプル（１３２）を圧縮してせん断力（Ｆ_ｓ）測定値を生成するように構成されている、請求項１９に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項21】

前記バイオリアクターシステムは、前記せん断力（Ｆ_ｓ）および前記圧縮力を使用して、ヤング率（Ｅ）およびポアソン比（ｖ）の両方を計算するように構成されている、請求項２０に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項22】

前記バイオリアクターシステムは、各前記組織サンプル（１３２）に直接接触することなく、各前記組織サンプル（１３２）のヤング率（Ｅ）およびポアソン比（ｖ）を非侵襲的に求めるように構成されている、請求項１５に記載のバイオリアクターシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書に開示している主題は組織培養の分野に関し、詳細には軟骨組織培養の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

培養軟骨組織は、半月板（特定の関節に存在する）および椎間板に関連した再建手術での使用を含む、様々な再建手術で使用するために、研究または医学的状況において生育させることができる。培養軟骨組織の現在の製作プロセスは、通常短時間の静置培養と、それに続く一軸圧縮負荷による培養組織の機械的調整とを含む。実際には、市販の負荷装置は研究規模の利用のためのものであり、通常、組織構造および組織の形成をリアルタイムでモニタリングすることの欠如、個々のサンプル測定データをリアルタイムで取得することの欠如、および圧縮弾性率の測定値を取得するために侵襲的検査を行うことを含むが、これらに限定されない欠点を有する。さらに、培養プロセス（たとえば、培地のサンプリング、サンプルの移送、容器への培地の添加など）に関わる手動によるサンプル取り扱いによって、混入が生じる可能性が高まる（すなわち、１０％に至る失敗率）。

【0003】

技術が成熟し、培養から商品化へと移行するにつれて、培養軟骨を培養するための改善された解決策が望まれるであろう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００９／２９８１８０号明細書

【発明の概要】

【0005】

当初に特許請求されている主題の範囲に相応する特定の実施形態を、以下に要約する。これらの実施形態は特許請求する主題の範囲を限定しようとするものではなく、むしろ、これらの実施形態は、実現可能な実施形態の概要を提供しようとするものに過ぎない。実際、本発明は、以下に記載する実施形態に類似している可能性があり、あるいは異なっている可能性がある様々な形態を包含していてもよい。

【0006】

一実施形態では、バイオリアクターシステムを提供する。かかる実施形態では、本バイオリアクターシステムは、それぞれが１または複数の組織サンプルを含む、１または複数の可撓性容器を保持するように構成されたサンプル支持台と、可撓性容器を前記サンプル支持台の測定位置にそれぞれ配置したときに、各前記可撓性容器が自身の上に載置されるように配置される力測定センサと、前記測定位置に配置したときに、ある軸に沿って移動して、各前記可撓性容器と係合かつ係合解除するように構成されたアクチュエータであって、各前記可撓性容器と係合すると、これによって前記アクチュエータが変位および対応する変位データを生成し、前記力測定センサが力を測定し、かつ力データを生成するようにしており、前記データを使用して、組織剛性測定値を生成している、アクチュエータと、を備える。

【0007】

さらに別の実施形態では、組織サンプルを培養するための方法を提供する。本方法によれば、組織サンプルを組織ホルダに固定している。固定した組織サンプルおよび組織ホルダを、可撓性容器内に配置している。培地を可撓性容器に添加し、かつ前記可撓性容器を密封している。可撓性容器を負荷装置の台上に配置している。リニアアクチュエータは、可撓性容器の第１の側面と接触して、前記第１の側面と対向する可撓性容器の第２の側面上に、変化した力センサ読取り値を生成するように動作している。

【0008】

別の実施形態では、バイオリアクターシステムを提供する。かかる実施形態では、本バイオリアクターシステムは、組織サンプルを含む、１または複数の可撓性容器を保持するように構成されたサンプル支持台と、組織サンプルを含む可撓性容器を前記サンプル支持台の測定位置にそれぞれ配置したときに、前記組織サンプルが自身の上に載置されるように配置される第１の力測定センサと、前記第１の力測定センサ付近において、前記サンプル支持台の面内に、またはこれに平行に配置される第２の力測定センサであって、前記第１の力測定センサおよび前記第２の力測定センサは使用中、互いに独立して、前記支持台面に垂直な第１の方向に移動できる、第２の力測定センサと、前記第１の方向のある軸に沿って移動し、かつ各前記可撓性容器の前記組織サンプルを前記第１の力測定センサ上に配置したときに、各前記可撓性容器と接し、かつこれを変位させるように構成されたリニアアクチュエータと、を備える。

【0009】

本発明のこれらおよび他の特徴、態様および利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読解すればより良好に理解され、前記添付の図面においては、図面全体を通して同一の符号は同一の部分を表している。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本開示の態様による、リニアアクチュエータによる係合前における、組織培養で使用するための負荷装置の正面切欠き図を示す。

【図2】本開示の態様による、リニアアクチュエータによる係合後における、請求項１に記載の負荷装置の正面切欠き図を示す。

【図3】本開示の態様による、前記装置において連結解除されたリニアアクチュエータおよび力センサの挿入拡大図を伴う、組織培養で使用するための負荷装置の図を示す。

【図4】本開示の態様による、組織ホルダアセンブリの分解図を示す。

【図5】本開示の態様による、組織ホルダアセンブリの別の分解図を示す。

【図6】本開示の態様による、組織装填プロセスのプロセスフローを示す。

【図7】本開示の態様による、線形回帰法を使用した初期負荷位置の決定を表すグラフを示す。

【図8】本開示の態様による、組織負荷スケジューラの画面の例を示す。

【図9】本開示の態様による、測定方式を設定するための画面の例を示す。

【図10】本開示の態様による、弾性率を測定するための一対の同軸力センサの切欠き側面図およびトップダウン図を示す。

【図11】本開示の態様による、接触弾性率を測定するためのパラメータを示す。

【図12】本開示の態様による、せん断弾性率の定義の態様を示す。

【図13】本開示の態様による、変換したせん断弾性率の定義の態様を示す。

【図14】本開示の態様による、せん断弾性率を測定するためのパラメータを示す。

【図15】本開示の態様による、可撓性容器内の組織サンプルの通常負荷を示す。

【図16】本開示の態様による、接触弾性率を測定する構成を示す。そして

【図17】本開示の態様による、せん断弾性率を測定する構成を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

１または複数の具体的な実施形態を以下に記載する。これらの実施形態の簡潔な説明を提供しようと努力しても、実際の実施形態におけるすべての特徴を本明細書に記載できるわけではない。組織工学または設計プロジェクトなどの、かかる実際のあらゆる実施形態の開発においては、開発者らの特定の目的を達成するために、たとえばシステム関連および業務関連の制約条件への準拠など、実施形態ごとに異なり得る事項に対して、実施形態固有の決定を数多く下さなければならないことを理解すべきである。さらに、かかる開発努力は込み入っていて、多大な時間を必要とするものであるが、本開示の利点を得る当業者にとっては、設計、製作、および製造をこなすことは日常的な業務であり得ることを理解すべきである。

【0012】

本発明の様々な実施形態の要素を導入する場合、冠詞「１つの（ａ）、（ａｎ）」、「この（ｔｈｅ）」、および「前記（ｓａｉｄ）」は、その要素が１または複数存在することを意味するものとする。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は包括的なものであって、列挙した要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味するものとする。さらに、以下の説明におけるあらゆる数値例は非限定的なものであり、したがって追加の数値、範囲および百分率は開示している実施形態の範囲内にあるものとする。

【0013】

軟骨培養に関連する技術が成熟し、培養から商品化へと移行するにつれて、より良好かつ迅速な組織再生のための、工程内軟骨構築物の非侵襲的検査を伴う、組織の自動閉鎖熟成に対する代替解決策が有用となる。本手法は、剛性測定機能を備える負荷プラットフォーム（すなわち、力または負荷を組織サンプルに加えるように構成されたプラットフォーム）上で軟骨組織を固定し、培養し、かつ熟成させるように設計された、閉鎖型または機能的閉鎖型バイオリアクターを取り入れることによって、既存の軟骨培養技術に対して様々な改良をもたらしている。本明細書で使用する場合、「機能的閉鎖」という用語は、本明細書で提供する特定の実施例でより詳細に示しているように、使用される使い捨てキットが明示的に密封されているわけではないことを意味していると理解すべきである。たとえば、キットに関連する容器および／または管は、液体物質または気体を移送するのに使用することができるポートを有していてもよい。液体物質の場合、これらのポートは、限定または最小限のリスクで（たとえば、無針かつ拭き取り可能な滅菌ポートまたは０．２μｍフィルタの使用）物質の添加または採取を支援することができる。入口ガスまたは出口ガスの場合、０．２μｍフィルタを使用することができる。しかしながら、本説明の用途においては、かかるポートまたは他の接続の場の存在は、機能的に閉鎖していると理解されるチャンバ、導管、バッグ、または他のキットにも矛盾しないものである。

【0014】

また、本バイオリアクターを、標準的な組織培養インキュベータ内で機能するように構成することもでき、あるいはベンチトップ培養用の「独立型」システムとして設計することもできる。したがって、組織の熟成を完全に自動化して、労力や、開放式処理に起因する混入の可能性を低減することができる。さらに、本バイオリアクターに組織モニタリング用のセンサを設けることができ、このセンサは剛性データと共に、組織の熟成に対する自動または半自動制御を付与することができる。軟骨剛性の現場での（ｉｎ ｓｉｔｕ）検知を、細胞試験、生化学的試験、および画像化などのためにサンプルを採取することによって、組織の成熟度と相関させてもよい。軟骨剛性と組織の成熟度との関係性に基づいて、剛性測定値を取得して軟骨の成熟度の代用値として使用することができ、これによって侵襲的検査の必要性が排除される。この点を考慮すると、本手法の態様は、ｉｎ ｓｉｔｕ剛性の測定機能を備える一軸負荷バイオリアクターにおける軟骨組織の閉鎖系培養に関する。

【0015】

一例として、特定の実施形態によれば、関節または背部再建、修復、または治療に関連する手術などの移植手術のために作製した軟骨組織を培養し、かつ熟成するために設計された、機能的閉鎖型の一軸負荷バイオリアクターシステムを提供する。システム自体は、２つの構成要素、すなわち一軸負荷の一部である回転台上に載置される機能的閉鎖型可撓性容器（たとえば、少なくとも可撓性側壁を有する容器またはバッグ）と、測定装置（本明細書では「負荷装置」と呼び、一軸方向に沿って負荷または負荷力を加えるように構成されている）とからなる。一実施形態では、機能的閉鎖型滅菌容器は、培地およびガス交換ポート、ならびにｐＨセンサ、酸素センサ、および温度センサなどの、内部生育環境の閉鎖ループ制御を容易にするための様々なセンサを有する。培養中の軟骨組織を固定できるように、可撓性容器をさらに設計してもよい。用途に応じて、可撓性容器が自家細胞療法のために１人（またはそれ以上）の患者サンプルを保持するか、または同種細胞療法用途で複数のサンプルを保持するような可撓性をもたらすように、これを設計してもよい。

【0016】

一実施形態では、負荷装置は軟骨組織に一軸圧縮負荷を加えることができるだけでなく、組織剛性を測定することもできる。このようにして、培養中の組織の非侵襲的モニタリングを、機能的閉鎖型可撓性容器内にサンプルが依然としてある状態で実行することができる。これは、組織に機械的負荷を加えている間は現場での剛性測定を行うことができない、現行の軟骨バイオリアクターとは異なっている。このようにして、サンプルの熟成中に、個々のサンプルの剛性データを取得することができる。力センサがリニアアクチュエータの変位端部と連結されていない状態の、リニアアクチュエータと力センサとが切り離された構成では、作製された使い捨て可撓性容器と共に、可撓性容器の撓み、およびそのフィルム剛性の影響を最小限に抑えることによって、確実に正確な剛性測定が行われるようにしている。標準的な組織培養インキュベータ内に収まる程度に十分コンパクトになるようにバイオリアクターシステムを設計することができるが、使い捨て可撓性容器内の温度とガスの供給とを調節する独立型ベンチトップシステムとしてもこれを構成できる。

【0017】

以下でより詳細に述べているように、本手法の特定の実施形態では、ユーザは組織サンプルを可撓性容器内に固定している。一実施形態では、組織サンプル（複数可）を容器内に、（１）サンプル（複数可）を三次元印刷し、かつ前記サンプル（複数可）を個々の組織ホルダに配置するか、または（２）組織を個々の組織ホルダに直接三次元印刷することによって設置してもよい。本明細書で使用する場合、三次元印刷は、加法的にサンプルを生成する（多層サンプルまたは三次元サンプルの生成など）のに適した、任意の積層製造法または蒸着法を包含していることを理解すべきである。他の実施形態では、圧縮成形脱細胞化マトリックスまたは他の適切な手法を含むが、これらに限定されない他の手段によって、組織サンプルを容器内に設置してもよい。

【0018】

次いで可撓性容器を密封し、ポートを介して必要量の培地を充填し、かつ回転台上にこれを配置する。一実施形態では、組織サンプル（複数可）を一組の半径方向位置の間で移動または回転させてもよく、そのうちの１つは直線力測定値および力測定値が取得される測定位置（すなわち、測定のためにサンプルに負荷する位置）を構成している。かかる実施例では、以下でより詳細に述べているように、ソレノイドを使用して関連する支持台を位置決め高さまで押し上げ、前記台を測定高さまで押し下げることができる次に続くサンプル位置まで回転させることによって、組織サンプル（複数可）を当該位置間で順次移動または回転させてもよい。つまり、台を押し下げたときに、台の下に位置する力センサ（たとえば、ロードセル）上に組織サンプルが載置される一方で、組織バッグが前記台上に載置されることを可能にしている。理解されるように、他の位置および移動方式を代わりに採用してもよい。とりわけ当業者であれば、力センサ上に、かつリニアアクチュエータおよび前記力センサ間の作用線上に、サンプルを配置するのに必要な自由度を達成するための複数の手法が、本明細書で述べているものに加えて存在することを理解するであろう。

【0019】

一実施形態では、次いでリニアアクチュエータは下方に移動する。実施形態に応じて、リニアアクチュエータはピエゾウォーカーまたは積層型リニアモータ、ボイスコイル型リニアモータ、油圧アクチュエータ、送りねじ駆動システム、およびラック・アンド・ピニオンなどであってもよい。リニアアクチュエータが組織と接触する前は、力センサ（たとえば、ロードセル）読取り値は同じままである。したがって、力センサ読取り値の変化は、リニアアクチュエータを使用した組織への負荷が開始されたことを示す。この位置は初期負荷位置として記録される。次いでリニアアクチュエータは、ユーザ入力に従って（たとえば、負荷時間、周波数、振幅、およびオフセット）、組織に周期的に負荷する。負荷中の変位および力をログとして記録し、リアルタイム剛性を計算するためにこれらを使用してもよい。次のサンプルに移行する前に、当該サンプルに指定した時間（ユーザ入力またはコンピュータ入力）負荷する。その後、本プロセスが繰り返される。

【0020】

上記の要約を念頭に置いて、以下の項では、本手法において関連する特定の態様について、さらに詳細な説明を提供する。

【0021】

負荷装置−負荷装置に関して、一実施形態では、負荷装置１００はリニアアクチュエータ１０２と力センサ１０４とを有しており、これらは負荷前（図１）および負荷後（図２）の可撓性容器１０６に関連して図１および図２に示すように、互いから切り離され、かつ対向側に配置されている。図１および図２に示した例では、リニアアクチュエータ１０２は使い捨て可撓性容器１０６の上部ローダキャップ１０９と係合し、次いで可撓性容器１０６を圧縮して組織サンプルに負荷を加えている。図１および図２（または後述する図３および図４）には示していないが、コントローラ（プロセッサベースかつ／または１または複数の特定用途向け集積回路の形態のいずれか）を設けてリニアアクチュエータ１０２および力センサ１０４の一方または両方と通信させ、かつ／または台１１０と通信させて、本明細書で述べているこれらの構成要素を操作させ、なおかつリニアアクチュエータ１０２および力センサ１０４によって生成されたデータを処理させて、本明細書で述べている測定値および／または派生値を計算させてもよい。

【0022】

一実施形態では、組織および培地を収容する使い捨て可撓性容器１０６は、可撓性エチレン−酢酸ビニル（ＥＶＡ）またはポリエチレンフィルム材料で構成されている。他の適切な容器材料には、ＥＶＡのみならず、他の可撓性生体適合性フィルム材料が含まれるが、これらに限定されない。また、本実施例ではフィルムベースの材料を使用して形成された容器１０６を記載しているが、他の実施形態では、代わりに可撓性容器１０６をブロー成形法、熱成形法または圧縮成形法を使用して形成してもよい。図２に示すように、可撓性容器１０６の構造は、これがリニアアクチュエータ１０２による圧縮下にあるときに変形し得る。可撓性容器１０６の上面の変形は、その反力をその４つの側面に伝達し、これは図２の下向きの矢印によって示しているように、台１１０上にさらに伝達される。このように、可撓性容器１０６の剛性は力センサ読取り値に影響を及ぼさない。力センサ１０４は、上部ローダ１０８が組織サンプル１３２と接触し、これによって組織が圧縮下で変形した場合にのみ反応する。結果として、力センサ読取り値は組織に対する真の負荷力となる。

【0023】

リニアアクチュエータ１０２と力センサ１０４（たとえば、ロードセル）とを切り離した構成を有する、負荷装置１００の実施形態を図３に示しており、ここにはリニアアクチュエータ１０２、力センサ１０４、および可撓性容器１０６（図示せず）内で組織サンプルを保持するように構成された組織ホルダ１１６の拡大図を示す差し込み図が含まれている。図３に示す例では、力センサ１０４（たとえば、ロードセル）を、組織ホルダ１１６に加えられた力を力センサに伝達するように構成された、力センサ剛性延長ロッド１１８と関連付けている。さらに図３では、本明細書で述べているように、運転中に台１１０を押し上げ、回転させ、かつ押し下げるために使用される回転モータ１２０（たとえば、ステッピングモータ）およびソレノイド１２２のアセンブリを示している。

【0024】

一実施形態では、リニアアクチュエータ１０２は、たとえば０．２μｍの分解能など、０．１μｍ〜５μｍの範囲の分解能を有する。力センサ１０４は、たとえば９０．９ｍＶ／Ｎの感度など、１８．０〜２００ｍＶ／Ｎの範囲の感度を有していてもよい。一例として、９０．９ｍＶ／Ｎの感度を有する力センサ１０４と共に、０．２μｍの分解能を有するリニアアクチュエータ１０２を使用すると、１０ｋＰａから２００ｋＰａまでの範囲の組織剛性を正確に測定することができ、これは典型的な用途においてこれらの熟成過程に使用される各種タイプの組織の範囲をカバーするものである。本明細書で述べているように、負荷装置１００は、たとえば負荷時間および非負荷時間、周波数、振幅、およびオフセットなどの設定された目標剛性を実現するために、実時間剛性データを使用して負荷パターンを変えることができる。

【0025】

軟骨組織用の組織ホルダアセンブリを有する使い捨て可撓性容器の設計−上記では負荷装置１００に関して述べたが、ここでは可撓性容器１０６についてより詳細に述べるものとする。本明細書で述べているように、特定の実施形態では、個々の組織ホルダは１または複数の組織サンプルを収容することができる。特定の構成によれば、各サンプルは、図４および図５の分解図に示しているように、共通プレートホルダ１３０上に載置される組織ホルダ１１６を有し、この共通プレートホルダ１３０は共通プレートホルダキャップ１３１上に配置されている。

【0026】

可撓性容器１０６（図６のプロセスフローに示す）は、組織ホルダ１１６を挿入するために１つの側面を開放したままの状態で、３つの側面を密封している。実際には、使い捨て可撓性容器１０６とこれに対応する組織ホルダ１１６との両方を、事前にガンマ線滅菌してある。かかる滅菌実施形態では、ユーザは通常、バイオセーフティーキャビネット内でガンマ線滅菌された可撓性容器および組織ホルダを開封する。次いでユーザは、軟骨組織１３２を組織ホルダ１１６上に配置し、その角を組織クランプ１３４によって固定する。細胞と直接接触している可撓性容器１０６および／または組織ホルダ１１６のすべての構成要素は、通常、生体適合性材料を使用して製造されている。ひとたび組織１３２を組織ホルダ１１６上に固定すると、ユーザは組織ホルダ１１６を使い捨て可撓性容器１０６内に挿入することになり、そのステップについては図６のプロセスフローに示している。

【0027】

一実施形態では、図４および図５に示すように、共通プレートホルダ１３０のステンレス鋼（たとえば、ステンレス鋼３１６）製ダウエルピン１４０は、組織ホルダ１１６の対応する穴と位置合わせされている。組織ホルダ１１６内に埋め込まれた磁石を使用して、共通プレートホルダ１３０上のスチールピンに装着させ、組織ホルダ１１６をプレートホルダ１３０に対して固定してもよい。一実施形態では、埋め込まれた磁石とスチールピンとの両方をエポキシ（たとえば、ロックタイトＭ−２１ＨＰエポキシ）で被覆して、スチールピンと磁石とに対して培養物が曝露されるのを防止している。

【0028】

一実施形態では、底部フィルム材料は、共通プレートホルダキャップ１３１が底部フィルム材料を貫通することを可能にするために、対応する穴を有する。共通プレートホルダキャップ１３１は、共通プレートホルダ１３０の穴と嵌合する。共通プレートホルダ１３０、フィルム、および共通プレートホルダキャップ１３１を接合するために、エポキシ（たとえば、Ｍ−２１ＨＰエポキシ）を塗布してもよい。また、エポキシを塗布する場合、フィルムと共通プレートホルダキャップ１３１との間に適切なシールをもたらす。上部ローダキャップ１０９、上部フィルム、および上部ローダ１０８を、同一のまたは同等の手法を使用して互いに接合してもよい。

【0029】

組織アセンブリを使い捨て可撓性容器１０６内に配置した後、ユーザは可撓性容器１０６の開口側面をバー（熱）シーラーで密封し、図６の最終ステップに示しているように、密封端部１４２を形成する。特定の実施形態では、各使い捨て可撓性容器１０６は、少なくとも１つのガス交換ポートと、１つの培地交換ポートとを有する。細胞の増殖を可能にするために、組織１３２を培地に浸す（負荷するかどうかにかかわらず）。

【0030】

本明細書で述べているように、使い捨て可撓性容器１０６は、可撓性容器１０６の底面に装着される１または複数の磁石を有する。これらの磁石は、可撓性容器を台１１０上に保持するのを補助している。可撓性容器の底板は台１１０の穴と位置合わせされている。これにより、リニアアクチュエータ１０２および力センサ１０４に対して、組織１３２が確実に正しい位置に配置されるようになる。リニアアクチュエータ１０２および力センサ１０４の固定軸方向位置に対して複数の組織に順次負荷することができるように、台１１０を回転させる。

【0031】

図３に示すように、一実施形態では、台１１０の上下運動を制御するソレノイドアクチュエータ１２２によって、台１１０を押し上げている。負荷位置などに対して回転位置間で台１１０（およびその内部に組織が載置される、使い捨て可撓性容器１０６）を回転させる回転モータ（たとえば、ステッピングモータ）１２０によって、台１１０を回転させている。負荷位置にあるとき、示しているように台１１０が押し下げられ、これによって使い捨て可撓性容器の底板が力センサ延長ロッド１１８を介して力センサ１０４上に載置されることを可能にしている。（組織の熟成のための）負荷時間中、リニアアクチュエータ１０２は下降し、上部ローダ１０８に接合されている組織上部ローダキャップ１０９と係合している。リニアアクチュエータ１０２は、組織上部ローダ１０８が組織１３２と接触して周期的負荷を加えるまで、組織上部ローダ１０８を動かし続ける。上部ローダ１０８は、非負荷時間中に組織１３２から切り離される。

【0032】

一例として、特定の実施形態の一実施形態をより詳細に説明する。本実施例では、本来高いソレノイド１２２の加減速を平滑化するために使用する、少なくとも２つのエアダンパを設けている。これにより、台１１０が緩やかに押し上げられたり押し下げられたりするので、可撓性容器１０６および内部の組織１３２への機械的衝撃が確実に最小化される。台１１０を定位置に押し下げる前に、ホールセンサを使用して、台１１０が力センサおよびリニアアクチュエータ作用線に対して正しい回転位置にあることを確認してもよい。一例として、一実施形態では、組織１３２を配置している位置の数と同数の磁石が台１１０の下に埋め込まれている。台固定ベース１２４に固定され得るホールセンサの隣に所与の磁石を配置している場合、これによって台１１０が正しい位置に移動したのか、あるいは正しい位置への到達が妨げられたのかを判定することができる。台１１０の正しい位置への到達が妨げられた場合には、
（１）ホールセンサ出力が予期されない状態となり、（２）プログラムが停止し、かつ（３）プログラムがエラーメッセージを出力してユーザに通知する、というイベントが順次発生することになる。スリップリングコネクタを使用して、ソレノイド１２２（台１１０に固定された）と台固定ベース１２４とを電気的に接続してもよい。

【0033】

上記のホールセンサに関する実施形態は、運転中に台１１０を回転させるための手法の一実施例であるが、他の手法も同様に実施可能である。たとえば、各位置でホールセンサを使用する代わりに、回転ステージ（すなわち、台１１０）に連結されたアブソリュートエンコーダを有する回転モータ１２０を代用してもよい。このようにして、動作が妨げられたり、台１１０の最終位置への到達が妨げられたりした場合でも、コントローラはこれを認識することになる。

【0034】

一実施形態では、ソレノイドドライバはピーク・アンド・ホールドドライバ電流方式を実施してその電力消費を低減し、したがってソレノイドアクチュエータ１２２を励磁したときの過度の発熱を回避している。リニアアクチュエータ１０２に対しては、このアクチュエータを、たとえば半球体１０７、および上部ローダキャップ１０９内でこれと嵌合する凹みなどの自己整合機能を使用して、可撓性容器１０６の上部ローダキャップ１０９に連結することができ、これによって、アクチュエータ１０２と可撓性容器１０６との不整合をわずかにすることができる。

【0035】

組織ローダ１００の開始位置を複数の方法によって決定してもよく、そのうちの２つの実施例を本明細書で述べているが、他の手法も同様に適切であり得る。一例として、１つの方法を本明細書では「接点」方式と呼んでいる。「接点」方式に関連するステップは次のとおりである。まず、ユーザは力センサ１０４の出力の閾値電圧を指定する。リニアアクチュエータ１０２は、上部ローダ１０８を一定の低速で駆動する。閾値電圧を適切に選択した状態では、ローダが可撓性容器と係合すると可撓性容器１０６は変形するが、上部ローダが組織と接触しない限り、その変形によって力センサ読取り値が閾値を超えることはない。上部ローダ１０８が組織１３２と接触するとすぐに、力センサ１０４の電圧は上昇し始める。力センサ１０４の出力（または出力の変化）がユーザ指定の閾値に達すると、リニアアクチュエータ１０２は停止し、当該位置が、この特定の組織サンプルの負荷開始位置として記憶される。「接点」方式は、力センサ１０４の読取り値が閾値を超える時点とリニアアクチュエータ１０２の位置が登録される時点との間の遅延時間に起因して、特定の誤差の影響を受ける可能性がある。

【0036】

本明細書に記載の第２の方法は「回帰」方式と呼ばれている。本方式では、「接点」方式で説明したように、リニアアクチュエータ１０２によって駆動される上部ローダ１０８が、組織１３２に対して駆動される。次いで、力センサ１０４の出力がユーザ指定の閾値を超えたとしても、リニアアクチュエータ１０２は組織サンプル１３２を圧縮し続ける。各組織サンプルに対してわずかな変位に及ぶ、リニアアクチュエータ１０２の位置および力センサ１０４の出力が記憶され、力センサ１０４の出力が指定された上限（前記閾値よりも高く設定することができる）に達すると、リニアアクチュエータ１０２は停止する。図７の線形回帰の例において示しているように、線形適合の傾斜およびｙ交差については、リニアアクチュエータの位置（ｘ）およびこれらに対応する力センサの出力（ｙ）を使用して計算している。負荷開始時に組織が一定の剛性を有すると仮定して、この傾斜とｙ交差とを用いて組織サンプル１３２のゼロ負荷位置を計算し、当該位置がこの特定の組織サンプルの負荷開始位置として記憶される。「接点」方式と比較してこの「回帰」方式は、複数の力センサ読取り値と、これらに対応するリニアアクチュエータの位置とを取得し、かつ組織の初期撓みにおける線形剛性を想定することにより、誤差を低減できる可能性がある。したがって、時間遅延によるランダム誤差発生の可能性を低減することができる。

【0037】

組織負荷スケジューラ−上記では本手法の様々な機械的、構造的、かつ動作上の態様について述べたが、さらに別の態様として説明するのはスケジューリング構成要素についてである。一実施形態では、ユーザは、コンピュータに格納され、かつ実行される負荷アプリケーションの形態で設けている組織負荷スケジューラを使用して、負荷シーケンスおよび負荷パターンをスケジュールしている。かかるアプリケーションにおけるサンプル画面の実施例を、図８および図９に提供している。本実施例では、第１のウィンドウ１５０（図８に示す）が最初に表示され、プログラムが実行されるとユーザ入力を促す。これらの画面とウィンドウとを介して、ユーザは任意の特定のサンプルに特定の時刻に負荷するようにスケジュールすることができる。図示の例では、その時刻は順次スケジュールされている。つまり、早い時刻は遅い時刻の前にスケジュールされ得る。スケジューリングアプリケーションの制御下で、台１１０は、指定された時刻に達すると、対応する組織サンプル１３２を、リニアアクチュエータ１０２および力センサ１０４が位置する軸（すなわち、負荷位置）に移動させる。次いで、負荷がスケジュールされている場合、本プログラムは、ユーザ入力（周波数、振幅、およびオフセット）が提供されている場合にはこれを使用し、対応する正弦関数加振を組織１３２に負荷するように、リニアアクチュエータ１０２に命じる。負荷が停止し、リニアアクチュエータ１０２が後退する。時間が次の予定時刻に達すると、台１１０は次のサンプルを負荷位置に移動させ、本プロセスが繰り返される。

【0038】

図９は、メインプログラムのディスプレイ１５２（たとえば、プログラムされた装置か、または専用の装置のフロント・パネル・ディスプレイ）の別実施例を示す。一実装形態では、プログラムの実行中にユーザはプログラムを中断して、測定を実施することができる。一実施形態では、ユーザは、組織の周期的負荷（たとえば、正弦波負荷）から導出される組織剛性の計算値を取得するように、本システムに指示することができる。他の負荷方式の採用により特定数の測定値を取得するために、付加的または代替的な方式をさらに採用してもよく、本プログラムは、順次スケジュールされた負荷時間中のリニアアクチュエータ１０２の位置および力センサ１０４の出力に関するデータの少なくとも一部を自動的に格納する。他の測定方式の例としては、応力緩和と周波数掃引とが挙げられる。たとえば、応力緩和測定を実施する状況では、ユーザは応力緩和測定の度に、所定数のステップ（たとえば、３つのステップ）、それらの各位置、および保持時間を指定することができる。一実施例では、その測定全体を通して位置データおよび力データが自動的に記録される。同様にユーザは、周波数掃引測定の度に、ある周波数の最大数（たとえば、３）、それらの各振幅、掃引時間、およびオフセットを指定できる可能性がある。ここでも、その測定全体を通して位置データおよび力データが自動的に記録され得る。

【0039】

軟骨組織の弾性率の非侵襲的な測定−上記のことを念頭に置いて、組織の弾性率の非侵襲的な測定に関するさらに別の態様について説明する。

【0040】

材料の弾性率を求める従来の方法には、既知の形状サンプルを切断するステップと、前記既知の形状サンプルの応力−歪み特性を検査するステップとが含まれる。これには特定のサンプルサイズが必要とされ、このため、通常サンプルの残りからこれを分離する必要があるということから、典型的には侵襲的である。本手法によれば、特定のサンプル寸法を用意することなく、サンプルの局所的ヤング率およびポアソン比を代わりに測定し、これによってサンプルの大部分から検査用のサンプルを物理的に分離することが回避される。本手法によれば、接触弾性率測定およびせん断弾性率測定の両方を使用して、ヤング率およびポアソン比を求めている。一実施形態では、図１０に示すように、同軸円筒として設けられた力センサ１０４Ａ、１０４Ｂを使用して、これら２つの測定値を取得することができる。図示の例では具体的に、環状構成である第２の円筒形状力センサ１０４Ｂ、すなわち円筒リング内に嵌め込まれた円筒セル１０４として、第１の力センサ１０４Ａを設けている。

【0041】

図１０を参照すると、接触弾性率を測定するために、第１の力センサ１０４Ａの上面（すなわち、測定面）は、第２の力センサ１０４Ｂの上面と同一平面上に依然としてある。リニアアクチュエータ１０２はサンプル１３２を変形させ、第１の力センサ１０４Ａは圧縮力を測定する。

【0042】

せん断弾性率を測定するために、第１の円筒形状力センサ１０４Ａを、台１１０の表面および第２の力センサ１０４Ｂに対して下方に移動させる。このようにして、第２の力センサ１０４Ｂの測定面に対して凹部が形成され、したがってこれを使用してせん断力を測定することができる。これらの２つの力測定値から、ヤング率とポアソン比とを導出することができる。一実施形態では、これらの測定を、たとえばフィルム材料を介して、サンプル１３２と直接接触することなく実行することができる。

【0043】

これらの値および当該計算に関連して、記載した状況の図解図として図１１を参照しながら、接触弾性率を以下のパラメータによって定義することができる。ここでは、ｄは凹部と関連する垂直方向の変位または距離であり、ａは第１の力センサ１０４Ａの半径であり、ｖはポアソン比である。定義により、軸力Ｆ_ａは
（１）Ｆ_ａ＝２ａＥ＊ｄとなる
ここでは、Ｅ＊は接触弾性率であり、
（２）

【0044】

【数1】

となる。

【0045】

鋼（ここでは、リニアアクチュエータの接点１０２を表す）については、Ｅ_１＝２００ＧＰａ、ν_１＝０．３であり、一方、組織サンプル１３２については、Ｅ_２＝１０〜２００ｋＰａ、ν_２≒０．４である。項

【0046】

【数2】

は、項

【0047】

【数3】

よりも数桁低い。したがって、式（２）を

【0048】

【数4】

として近似展開することができる。（１）に

【0049】

【数5】

を代入すると、
（３）

【0050】

【数6】

となる。

【0051】

ここで、Ｅ_２をＥ、ｖ_２をｖとして記述すると、
（４）

【0052】

【数7】

となる。

【0053】

せん断弾性率については、定義により、かつ図１２を参照すると、
（５）

【0054】

【数8】

となる。

【0055】

ここでは、Ｇはせん断弾性率であり、Ｆ_ｓはせん断力であり、残りのパラメータは図１２に示している測定基準および概念に相当しており、ここではＡはサンプル１３２の表面積に相当し、Ｆ_ｓはせん断力に相当し、Δｘは変形に相当し、ｌはサンプルの高さに相当する。

【0056】

これを念頭に置いて、図１３に示すように、標準せん断構成を、ｘ軸を中心に３６０°回転させることについて考察する。本実施例では、図１３において、ｘ軸上の固定長（またはｘ軸上の変形ゼロ）を想定し、変換したせん断弾性率を示している。固定軸が半径ａの固定円筒である場合、せん断弾性率の定義は図１４に示すように構成することができる。次いでこの構成によって、せん断弾性率Ｇを求めることができる。

【0057】

定義により、
（６）Ｅ＝２Ｇ（１＋ｖ）となる。

【0058】

式（５）を式（６）に代入し、Ａ＝２πａ・ｈを与えることによって、
（７）

【0059】

【数9】

となる。

【0060】

ポアソン比νについて式（４）および式（７）を解くと、
（８）

【0061】

【数10】

となる。

【0062】

式（８）を式（７）に代入すると、
（９）

【0063】

【数11】

となる。

【0064】

上記を念頭に置き、構成が既知である場合（すなわち、ｌ、ｄ、およびｈが既知である場合）、軸力Ｆ_ａ、せん断力Ｆ_ｓ、および変形Δｘを測定することにより、ポアソン比νおよびヤング率Ｅを式（８）および式（９）から計算することができる。これに配慮し、かつ上述したことから、軸力Ｆ_ａおよびせん断力Ｆ_ｓを、第１の円筒形状力センサ１０４Ａおよび第２の円筒形状力センサ１０４Ｂそれぞれから読み取ることができると理解する。

【0065】

さらに、特定の実施形態によれば、サンプル１３２と直接接触することなく、フィルム材料（すなわち、可撓性容器１０６）を介して弾性率を測定してもよい。たとえば、図１５は、使い捨て可撓性容器１０６内の組織サンプル１３２における通常負荷の構成を示している。上記の実施例と同様に、組織サンプル１３２は組織ホルダ１１６上に載置されている。図示の例では、上部ローダ１０８は上部プランジャ１７０と共に、両方ともカプラ１０３Ａによって係合されている状態で下降し、組織ホルダ１１６の下での力測定に影響を及ぼすことなく組織１３２に負荷する。第１の力センサ１０４Ａおよび第２の力センサ１０４Ｂの読取りを合わせたものが総負荷力であり、上述したように、組織剛性を求めるためにこれを使用することができる。特定の実施形態では、使い捨て可撓性容器１０６内の構成要素を生体適合性材料で作製している。図示の例から理解することができるように、かかる実施形態では、フィルム（すなわち、可撓性容器１０６）が依然としてシールをもたらすことができる一方で、これを組織ホルダ１１６および上部ローダ１０８の外側に配置している。

【0066】

組織弾性率を測定するためには、軸力（Ｆ_ａ）およびせん断力（Ｆ_ｓ）の両方を、上記のように、圧縮構成およびせん断構成において測定する必要がある。既知の構成での軸力およびせん断力の測定により、２つの式（８）と（９）とを生成し、かつ２つの未知数である組織弾性率とポアソン比とに関して、これらを解くことができる。また、既知の面積または長さにわたって軸力およびせん断力をそれぞれ加えるために、負荷部および測定部を移動可能にするべきである。これを実現するために、一実施形態では、上部ローダ１０８の一部（すなわち、上部伸縮プランジャ１７０）を上部ローダ１０８の残余部分から取り外している。同様に、かかる一実施形態では、組織ホルダ１１６の一部（すなわち、底部伸縮プランジャ１７２）を組織ホルダ１１６の残余部分から取り外している。かかる一実施形態では、上部伸縮プランジャ１７０はリニアアクチュエータ１０２のカプラ１０３Ｂと係合し、プランジャ１７０を上部ローダ１０８とは別に移動させることができる。このようにして、カプラの変動により、上記のように軸力（Ｆ_ａ）およびせん断力（Ｆ_ｓ）を加えること、または組織を熟成させるためにこれに通常負荷を加えることができる。上部伸縮プランジャ１７０とカプラ１０３Ｂとの係合は、磁石（図で北（Ｎ）極および南（Ｓ）極表示によって示しているように）によって制御することができる。カプラ１０３Ｂと上部伸縮プランジャ１７０とにおける磁石間の引力により、上部伸縮プランジャ１７０が、リニアアクチュエータ１０２によって生じる動きに合わせて確実に移動するようになる。上部フィルム１０６の可撓性により、上部ローダ１０８と上部伸縮プランジャ１７０との間の相対運動が可能となる。

【0067】

図１６に示すように、圧縮力測定値を取得するために、第１のリニアアクチュエータ１０２は通常負荷時（カプラ１０３Ａ）とは異なるツール（カプラ１０３Ｂ）と係合し、これにより、第１のリニアアクチュエータ１０２は上部伸縮プランジャ１７０のみを押圧することができる。かかる構成における第１の力センサ１０４Ａおよび第２の力センサ１０４Ｂの読取り値の変化は、軸力Ｆ_ａと等しいとみなすことができる。したがって、上部プランジャ１７０の面積およびリニアアクチュエータ１０２の変位を、軸力Ｆ_ａと共に使用して、組織弾性率とポアソン比とを未知としたままで、ここで式（８）を部分的に完成させる。

【0068】

図１７に示すように、せん断測定のために、第２のリニアアクチュエータ１０２Ｂに連結されている第１の力センサ１０４Ａの後退によって、底部伸縮プランジャ１７２が下方へと引っ張られる。この構成により、第２の力センサ１０４Ｂはせん断力Ｆ_ｓを測定することができる。この場合も、せん断線の長さ（すなわち、底部伸縮プランジャ１７２が嵌合する組織ホルダ１１６の開口部の周囲長）、第１のリニアアクチュエータ１０２の変位、およびせん断力Ｆ_ｓを使用して、組織弾性率とポアソン比とを未知としたままで、ここで式（９）を部分的に完成させる。

【0069】

両方の力測定値を他の幾何学的寸法と共に取得した後、式（８）および式（９）を使用して、上述したポアソン比とヤング率とを計算することができる。図１５から図１７には示していないが、コントローラ（プロセッサベースかつ／または１または複数の特定用途向け集積回路の形態のいずれか）を設けてリニアアクチュエータ（複数可）１０２および力センサ（複数可）１０４の一方または両方と通信させ、かつ／または台１１０と通信させて、本明細書で述べているこれらの構成要素を操作させ、なおかつ力センサ（複数可）１０４によって生成されたデータを処理させて、本明細書で述べている測定値および／または派生値を計算させてもよい。なお、本明細書に記載しているのと同様の方法で多くの実験を行い、種々の測定データ一式を取得することができる。平均化アルゴリズムを適用して、単一測定誤差を低減し、統計的に有意な値を取得することができる。

【0070】

本発明の技術的効果には、リアルタイム剛性の測定機能を備える負荷プラットフォーム（すなわち、力または負荷を組織サンプルに加えるように構成されたプラットフォーム）上で軟骨組織を固定し、培養し、かつ熟成させるように設計された、機能的閉鎖型バイオリアクターが含まれる。本バイオリアクターを、標準的な組織培養インキュベータ内で機能するように構成することもでき、あるいはベンチトップ培養用の「独立型」システムとして設計することもできる。組織の熟成を完全に自動化して、労力や、開放式処理に起因する混入の可能性を低減することができる。さらに、本バイオリアクターに組織モニタリング用のセンサを設けることができ、このセンサはリアルタイム剛性データと共に、組織の熟成に対する閉鎖ループ制御や、非侵襲的な方法での組織の成熟度のモニタリングまたは測定を付与することができる。軟骨剛性のインライン検知を、細胞試験、生化学的試験、および画像化などのためにサンプルを採取することによって、組織の成熟度と相関させてもよい。軟骨剛性と組織の成熟度との関係性に基づいて、剛性測定値を取得して軟骨の成熟度の代用値として使用することができ、これによって侵襲的検査の必要性が排除される。本手法の態様は、リアルタイム剛性の測定機能を備える一軸負荷バイオリアクターにおける軟骨組織の閉鎖系培養に関する。

【0071】

本明細書は、最良の形態を含む実施例を使用して本発明を開示し、また、任意の装置またはシステムの製造および使用と、取り入れた任意の方法の実行とを含む本発明の実施が、当業者に可能となるようにしている。本発明の特許可能な範囲は特許請求の範囲によって定義され、かつ当業者が想到する他の実施例を含むことができる。かかる他の実施例は、それらが、特許請求の範囲の字義通りの文言と異ならない構造要素を有する場合、または、それらが特許請求の範囲の字義通りの文言と実質的な差異がない等価な構造要素を含む場合には、特許請求の範囲内にあるものとする。

【符号の説明】

【0072】

１００ 組織ローダ、負荷装置
１０２ 第１のリニアアクチュエータ、リニアアクチュエータの接点
１０２Ｂ 第２のリニアアクチュエータ
１０３Ａ カプラ
１０３Ｂ カプラ
１０４ 力センサ、円筒セル
１０４Ａ 第１の円筒形状力センサ
１０４Ｂ 第２の円筒形状力センサ
１０６ 使い捨て可撓性容器、上部フィルム
１０７ 半球体
１０８ 組織上部ローダ
１０９ 組織上部ローダキャップ
１１０ 台
１１６ 組織ホルダ
１１８ 力センサ剛性延長ロッド
１２０ 回転モータ
１２２ ソレノイド、ソレノイドアクチュエータ
１２４ 台固定ベース
１３０ 共通プレートホルダ
１３１ 共通プレートホルダキャップ
１３２ 軟骨組織、組織サンプル
１３４ 組織クランプ
１４０ ダウエルピン
１４２ 密封端部
１５０ 第１のウィンドウ
１５２ ディスプレイ
１７０ 上部伸縮プランジャ
１７２ 底部伸縮プランジャ
３１６ ステンレス鋼

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】