特許 6987741 生理活性ポリペプチド結合体の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6987741

(24)【登録日】2021年12月3日

(45)【発行日】2022年1月5日

(54)【発明の名称】生理活性ポリペプチド結合体の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 17/08 20060101AFI20211220BHJP

   C07K 1/30 20060101ALI20211220BHJP

【ＦＩ】

   C07K17/08

   C07K1/30

【請求項の数】22

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2018-503489(P2018-503489)

(86)(22)【出願日】2016年7月22日

(65)【公表番号】特表2018-523646(P2018-523646A)

(43)【公表日】2018年8月23日

(86)【国際出願番号】KR2016008050

(87)【国際公開番号】WO2017018742

(87)【国際公開日】20170202

【審査請求日】2019年6月24日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0105310

(32)【優先日】2015年7月24日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】515022445

【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ムン・ソンチン

(72)【発明者】

【氏名】シン・チョンピョル

(72)【発明者】

【氏名】ホン・ソンヒ

(72)【発明者】

【氏名】キム・デジン

(72)【発明者】

【氏名】クウォン・セチャン

【審査官】 玉井 真人

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５２０８７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５３７５２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−１２７３３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１９２３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３９２３２０９（ＣＮ，Ａ）

【文献】 "生物工学", 2011, 第89巻, pp.254-256

【文献】 "化学と生物", 2015.5.20, Vol.53, pp.368-373

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００− １／３６

Ｃ０７Ｋ １７／００−１７／１４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）生理活性ポリペプチドのアミノ酸残基に非ペプチド性ポリマーを結合させる反応混合物から、非ペプチド性ポリマーが結合されていない生理活性ポリペプチドを、有機溶媒を用いて選択的に沈殿させる段階；及び,
２）前記沈殿物から回収された生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと段階１）の結合反応下で反応させる段階を含む、生理活性ポリペプチド結合体の製造方法であって、
前記生理活性ポリペプチドが、インスリン、エキセンディン、エキセンディン誘導体、またはこれらの組み合わせであり；
前記エキセンディン誘導体が、デス‐アミノ‐ ヒスチジル（ＤＡ）‐ エキセンディン‐４、ベータ‐ヒドロキシ‐イミダゾ‐プロピオニル（ＨＹ）‐エキセンディン‐４、イミダゾ‐アセチル（ＣＡ）‐ エキセンディン‐４及びジメチル‐ヒスチジル（ＤＭ）‐エキセンディン‐４からなる群から選択されるものであり、
前記非ペプチド性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール‐プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルエチルエーテル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであり；
前記非ペプチド性ポリマーが、０．５ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を有し；並びに
前記有機溶媒が、アルコール、ケトン、ニトリルまたはこれらの組み合わせである、
上記製造方法。

【請求項2】

前記段階２）が、沈殿された生理活性ポリペプチドを溶解した後、非ペプチド性ポリマーと結合させる段階を含む、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記段階１）の反応混合物が、反応混合物の総重量に対して結合されていない生理活性ポリペプチドを１０重量％以上含むものである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項4】

前記有機溶媒が、イソプロパノール、エタノール、１‐プロパノール、１‐ブタノール、アセトン、アセトニトリルまたはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項5】

前記段階１）の反応混合物を反応混合物の容積の２〜７倍の容積のイソプロパノールで処理する、請求項４に記載の製造方法。

【請求項6】

前記段階１）の反応混合物を反応混合物の容積の３〜７倍の容積のイソプロパノールで処理する、請求項５に記載の製造方法。

【請求項7】

前記段階２）が、回収された生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと０．５時間〜４．０時間反応させる、請求項１に記載の製造方法。

【請求項8】

前記生理活性ポリペプチドが、エキセンディン、エキセンディン誘導体、またはこれらの組み合わせである、 請求項１に記載の製造方法。

【請求項9】

前記エキセンディン誘導体が、イミダゾ‐アセチル（ＣＡ）‐ エキセンディン‐４である、請求項１に記載の製造方法。

【請求項10】

前記非ペプチド性ポリマーが、エキセンディンまたはエキセンディン誘導体のＬｙｓ２７に結合するものである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項11】

前記非ペプチド性ポリマーが、インスリンのＮ‐末端に結合するものである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項12】

前記非ペプチド性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項13】

前記非ペプチド性ポリマーが、アルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループ、ブチルアルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される１つ以上の反応基を含むものであり、前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルカルボネートまたはそれらの組合せである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項14】

前記非ペプチド性ポリマーが、反応基としてアルデヒドグループを含むものである、請求項１３に記載の製造方法。

【請求項15】

前記アルデヒドグループが、プロピオンアルデヒドグループである、請求項１４に記載の製造方法。

【請求項16】

前記非ペプチド性ポリマーが、０．５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の製造方法。

【請求項17】

前記段階２）の後、生理活性ポリペプチド結合体を分離する段階をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。

【請求項18】

前記分離が、イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる、請求項１７に記載の製造方法。

【請求項19】

前記イオン交換クロマトグラフィーが、高圧イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１８に記載の製造方法。

【請求項20】

請求項１〜１９のいずれか１項に記載の製造方法によって生理活性ポリペプチド結合体を製造する段階；ならびに
前記生理活性ポリペプチド結合体と生理活性担体とを共有結合で結合させて、非ペプチド性ポリマーの両末端がそれぞれ生理活性担体及び生理活性ポリペプチドと結合されたポリペプチド担体結合体を製造する段階、
を含む、生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体の製造方法。

【請求項21】

前記生理活性担体が、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、トランスフェリン、アプタマー、トキシン、ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、多糖類、脂肪酸、及びフィブリノゲンからなる群から選択されるものである、請求項２０に記載の製造方法。

【請求項22】

前記生理活性担体が、免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項２１に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生理活性ポリペプチドが非ペプチド性ポリマーとの共有結合で互いに連結された生理活性ポリペプチドの結合体の製造において、非ペプチド性ポリマーと生理活性ポリペプチドの反応段階を改善して全体の生理活性ポリペプチド結合体の収率を向上させる製造方法であって、具体的には、選択的沈殿法を介して２段階の反応を行い、生理活性ポリペプチド結合体を高収率で製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ペプチドは、一般的に安定性が低くて容易に変性され、体内のタンパク質加水分解酵素によって分解されてその活性を失う。また、相対的にサイズが小さくて腎臓を介して容易に除去されるため、薬理成分としてペプチドを含む医薬品の血中濃度及び力価を維持するためには、ペプチド薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、ほとんどが注射剤の形態であるため、生理活性ペプチドの血中濃度を維持するための頻繁な注射のため、患者の激しい痛みを引き起こすことになる。これらの問題点を克服するための様々な試みとして、ペプチドの薬物の生体膜透過度を増加させて口腔または鼻腔を通じた吸入によるペプチド薬物の体内への伝達；ペプチドを安定化させてタンパク質加水分解酵素による分解を抑制するために、タンパク質加水分解酵素に敏感な特定アミノ酸配列の変更（例えば、ジペプチジルペプチダーゼによる力価の喪失を防ぐためのＧＬＰ‐１アミノ酸配列の変更など）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような溶解度の高い高分子物質をペプチド表面に化学的に付加；及び組換え融合技術を用いた生理活性ポリペプチドとヒト血清アルブミンまたは免疫グロブリン断片（Ｆｃ）との融合タンパク質の製造などがあった。

【0003】

しかし、前記融合タンパク質の製造は、生理活性ペプチドに対する非特異的高分子物質の結合によりペプチドの活性ドメインが隠されることになり、かえって前記ペプチドが十分な活性を示すことができず、これを防止するための位置特異的結合のために低い製造収率を受け入るか、または生理活性ペプチドに人為的操作を加えねばならないという問題があった。

【0004】

このような生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーとの結合体を効果的に製造できない問題点を解消するために、生理活性ポリペプチド結合体の中で最も生理活性に優れた生理活性ポリペプチドの特定の位置に非ペプチド性ポリマーを特異的に修飾する方法（特許文献１）を試してきた。また、生理活性ポリペプチドとヒト血清アルブミンまたは免疫グロブリン断片（Ｆｃ）との融合タンパク質の製造に２つの官能基を有する非ペプチド性ポリマーを用いた結合体の製造において、製造の収率を高めるための様々な方法を試してきた。

【0005】

継続的な研究を重ねた結果、本発明者らは、非ペプチド性ポリマーと生理活性ポリペプチドの１次結合反応後に反応（または、結合）しない生理活性ポリペプチドを選択的沈殿法を介して分離し、２次反応を行って非ペプチド性ポリマー‐生理活性ポリペプチドの結合体を高収率及び高純度で生産することができ、前記結合体を用いると、生理活性ポリペプチド‐生理活性担体の結合体を高収率及び高純度で生産できることを確認し、本発明を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】大韓民国登録特許第１０‐１１６４４５３号

【特許文献2】大韓民国公開特許第１０‐２０１０‐０１０５４９４号

【特許文献3】大韓民国公開特許第１０‐２００９‐０００８１５１号

【特許文献4】大韓民国登録特許第１０‐７７５３４３号

【特許文献5】大韓民国登録特許第１０‐７２５３１４号

【特許文献6】大韓民国登録特許第 １０‐７２５３１５号

【特許文献7】大韓民国登録特許第 １０‐８２４５０５号

【特許文献8】国際公開特許ＷＯ２０１４‐１３３３２４号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の一つの目的は、１）生理活性ポリペプチドのアミノ酸残基に非ペプチド性ポリマーを結合させる反応混合物から、非ペプチド性ポリマーが結合されていない生理活性ポリペプチドを選択的に沈殿させる段階；及び２）前記沈殿物から回収された生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと段階１）の結合反応下で反応させる段階を含む、生理活性ポリペプチド結合体の製造方法を提供することにある。

【0008】

本発明の他の一つの目的は、前記製造方法で製造された生理活性ポリペプチド結合体と生理活性担体とを共有結合で結合させて、非ペプチド性ポリマーの両末端がそれぞれ生理活性担体及び生理活性ポリペプチドと結合されたポリペプチド担体結合体を製造する段階を含む、生理活性ポリペプチド‐生理活性担体の結合体の製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記目的を達成するための本発明の一つの態様は、１）生理活性ポリペプチドのアミノ酸残基に非ペプチド性ポリマーを結合させる反応混合物から、非ペプチド性ポリマーが結合されていない生理活性ポリペプチドを選択的に沈殿させる段階；及び ２）前記沈殿物から回収された生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと段階１）の結合反応下で反応させる段階を含む、生理活性ポリペプチド結合体の製造方法を提供する。

【0010】

本発明の一つの具体例は、前記沈殿された生理活性ポリペプチドを溶解した後、非ペプチド性ポリマーと結合させる段階を含むものである、製造方法を提供する。

【0011】

本発明のもう一つの具体例は、前記段階１）の反応混合物が、反応混合物の総重量に対して結合されていない生理活性ポリペプチドを１０重量％以上含むものであるる、製造方法を提供する。

【0012】

本発明のもう一つの具体例は、前記段階１）の選択的沈殿が、有機溶媒を用いて行われる、製造方法を提供する。

【0013】

本発明のもう一つの具体例は、前記有機溶媒が、イソプロパノールである、製造方法を提供する。

【0014】

本発明のもう一つの具体例は、前記段階１）の反応混合物を反応混合物の容積の２倍以上のイソプロパノールで処理するものである、製造方法を提供する。

【0015】

本発明のもう一つの具体例は、 前記段階１）の反応混合物を反応混合物の容積の３〜７倍のイソプロパノールで処理する、製造方法を提供する。

【0016】

本発明のもう一つの具体例は、前記段階２）が、回収された生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと０．５時間〜４．０時間反応させることである、製造方法を提供する。

【0017】

本発明のもう一つの具体例は、 前記生理活性ポリペプチドが、インスリン分泌ペプチド、血液凝固因子、消化促進ホルモン、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、腸内ホルモン、サイトカイン、酵素、成長因子、ニューロペプチド（neuropeptide）、下垂体ホルモン、視床下部ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド及び生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体からなる群から選択されるものである、製造方法を提供する。

【0018】

本発明のもう一つの具体例は、 前記生理活性ポリペプチドが、赤血球増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、アミリン、ソマトスタチン、ＰＹＹ（peptide YY）、ＮＰＹ（neuropeptide Y）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（corticotropin ）、エレドイシン（eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（oxytocin）、バソプレシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、シクレチン（secretin）、セルモレリン（sermorelin ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類、インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン放出ペプチド（gastric releasing peptide）、モチリン（motilin）、血管作用性腸管ペプチド（vasoactive intestinal peptide）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriuretic peptide; ANP）、バリンナトリウム利尿ペプチド（barin natriuretic peptide; BNP）、Ｃ‐型ナトリウム利尿ペプチド（C‐type natriuretic peptide; CNP）、ニューロキニン（neurokinin）Ａ、ニューロメジン（neuromedin）、レニン（renin）、エンドセリン（endothelin）、サラフォトキシンペプチド（sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（carsomorphin peptide）、デルモルフィン（dermorphin）、ダイノルフィン（dynorphin）、エンドルフィン（endorphin）、エンケファリン（enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ抑制剤、チモポエチン（thymopoietin）、チムリン（thymulin）、チモペンチン（thymopentin）、チモシン（tymosin）、胸腺体液性因子（thymic humoral factor）、アドレノモデュリン（adrenomodullin）、アラトスタチン（allatostatin）、アミロイドベータプロテイン断片（amyloid beta‐protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（bombesin）、オステオカルシン（osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ‐セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ‐１、ＶＣＡＭ‐１、ロイコカイン（leucokine）、クリングル（kringle）‐５、ラミニン（laminin）、インヒビン（inhibin）、ガラニン（galanin）、フィブロネクチン（fibronectin）、パンクレアスタチン（pancreastatin）及びフューゼオン（fuzeon）からなる群から選択されるものである、製造方法を提供する。

【0019】

本発明のもう一つの具体例は、前記生理活性ポリペプチドが、エキセンディン、エキセンディン誘導体、インスリン、インスリン誘導体またはこれらの組み合わせである、製造方法を提供する。

【0020】

本発明のもう一つの具体例は、前記エキセンディン誘導体が、デス‐アミノ‐ ヒスチジル（ＤＡ）‐ エキセンディン‐４、ベータ‐ヒドロキシ‐イミダゾ‐プロピオニル（ＨＹ）‐エキセンディン‐４、イミダゾ‐アセチル（ＣＡ）‐ エキセンディン‐４及びジメチル‐ヒスチジル（ＤＭ）‐エキセンディン‐４からなる群から選択されるものである、製造方法を提供する。

【0021】

本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性ポリマーが、エキセンディンまたはエキセンディン誘導体のＬｙｓ２７に結合するものである、製造方法を提供する。

【0022】

本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性ポリマーが、生理活性ポリペプチドであるインスリンまたはインスリンアナログβ鎖またはその誘導体のＮ‐末端に結合するものである、製造方法を提供する。

【0023】

本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール‐プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、製造方法を提供する。

【0024】

本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、製造方法を提供する。

【0025】

本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性ポリマーが、アルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループ、ブチルアルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される１つ以上の反応基を含むものである、製造方法を提供する。

【0026】

本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性ポリマーが、反応基としてアルデヒドグループを含むものである、製造方法を提供する。

【0027】

本発明のもう一つの具体例は、前記アルデヒドグループが、プロピオンアルデヒドグループである、製造方法を提供する。

【0028】

本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性ポリマーが、５００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの分子量を有する、製造方法を提供する。

【0029】

本発明のもう一つの具体例は、前記段階２）の後、生理活性ポリペプチド結合体を分離する段階をさらに含む、製造方法を提供する。

【0030】

本発明のもう一つの具体例は、前記分離が、イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる、製造方法を提供する。

【0031】

本発明のもう一つの具体例は、前記イオン交換クロマトグラフィーが、高圧イオン交換クロマトグラフィーである、製造方法を提供する。

【0032】

本発明の他の一つの態様は、生理活性ポリペプチドと生理活性担体の結合体（生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体、ポリペプチド‐担体結合体）の製造方法を提供する。前記製造方法は、前記生理活性ポリペプチド結合体の製造方法で製造された生理活性ポリペプチド結合体の非ペプチド性ポリマーと生理活性担体を共有結合で連結して、非ペプチド性ポリマーの両末端がそれぞれ生理活性担体と生理活性ポリペプチドと結合された結合体（生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体、ポリペプチド‐担体結合体）を生成する段階を含む、生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体の製造方法を提供する。

【0033】

本発明の一つの具体例は、前記生理活性担体が、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、トランスフェリン、アプタマー、トキシン、ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、多糖類、脂肪酸、及びフィブリノゲンからなる群から選択されるものである、製造方法を提供する。

【0034】

本発明のもう一つの具体例は、前記生理活性担体が、免疫グロブリンＦｃ領域である、製造方法を提供する。

【発明の効果】

【0035】

本発明の製造方法は、選択的沈殿法を介する２段階の反応により、非ペプチド性ポリマー‐生理活性ポリペプチドの結合体及び生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体を高収率で生産することができ、生体内の活性が比較的高く維持されて、血中半減期が著しく増加した様々なペプチド薬物の持続型剤形の開発に有用に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】選択的沈殿法によるＰＥＧ化製造方法に対する既存のプロセスと改善したプロセスの模式図である。

【図2】イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４（ＣＡ‐エキセンディン‐４）１５ｍｇ/ｍｌの濃度及び３時間の反応条件で反応させたＰＥＧ化反応物をＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いて精製した位置異性体（Positional Isomer）の精製プロファイルである。

【図3】インスリンアナログ、５ｍｇ/ｍｌの濃度及び２時間の反応条件で反応させたＰＥＧ化反応物をＳＰ‐ＨＰカラムを用いて精製した位置異性体の精製プロファイルである。

【図4】イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４ １５ｍｇ/ｍｌの濃度及び３時間の反応条件で反応させたＰＥＧ化反応物に、選択的沈殿のためにイソプロパノール、１‐プロパノール、１‐ブタノール、アセトン及びアセトニトリルを処理して生成された水溶液及び沈殿物の含有物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を介して確認した結果を示した図である。

【図5】インスリンアナログ５ｍｇ/ｍｌの濃度及び２時間の反応条件で反応させたＰＥＧ化反応物に、選択的沈殿のためにイソプロパノール、エタノール、１‐プロパノール、アセトン及びアセトニトリルを処理して生成された水溶液及び沈殿物の含有物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を介して確認した結果を示した図である。

【図6】イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４ １５ｍｇ/ｍｌの濃度及び３時間の反応条件で反応させたＰＥＧ化反応物に、イソプロパノールを処理して沈殿物を除去した後の水溶液の状態をＳＯＵＲＣＥ Ｓ（ＬＲＣ、１５Ｘ１６１ｍｍ 、２８ｍＬ、ＰＡＬＬ）カラムを用いて精製した位置異性体の精製プロファイルである。

【図7】イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４ １５ｍｇ/ｍｌの濃度及び３時間の反応条件で反応させたＰＥＧ化反応物に、イソプロパノールを処理して形成された沈殿物をＰＥＧ化させた後、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いて精製した位置異性体の精製プロファイルである。

【図8】ＰＥＧ化させた反応物及び選択的沈殿法を適用して形成された沈殿物を ＰＥＧ化させた反応物をＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いて精製した位置異性体の精製プロファイルである。

【図9】インスリンアナログ５ｍｇ/ｍｌの濃度及び２時間の反応条件で反応させたＰＥＧ化反応物に、イソプロパノールを処理した後に沈殿物を除去して収得した水溶液からＳＰ‐ＨＰ（Ｈｉｔｒａｐ、５ｍＬｘ４ ｅａｃｈ、２０ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを用いて精製した位置異性体の精製プロファイルである。

【図10】インスリンアナログ５ｍｇ/ｍｌの濃度及び２時間の反応条件で反応させたＰＥＧ化反応物に、イソプロパノールを処理して収得した沈殿物からＳＰ‐ＨＰ（Ｈｉｔｒａｐ、５ｍＬｘ４ ｅａｃｈ、２０ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを用いて精製した位置異性体の精製プロファイルである。

【図11】既存のＰＥＧ化方法に対する選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法の向上された収率を示したグラフである。

【図12】実施例１で製造されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ（ＣＡ‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ）結合体の純度を逆相カラムで分析した結果を示した図である。

【図13】実施例７で製造されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ結合体の純度を逆相カラムで分析した結果を示した図である。

【図14】実施例１で製造されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４のＬｙｓ２７のアミン残基にＰＥＧが結合した位置異性体をペプチドマッピング（Peptide mapping）を介して確認した分析プロファイルである。

【図15】実施例７で製造されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４のＬｙｓ２７のアミン残基にＰＥＧが結合した位置異性体をペプチドマッピング（Peptide mapping）を介して確認した分析プロファイルである。

【図16】実施例１で製造されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ‐免疫グロブリンＦｃ結合体の純度を逆相カラムで分析した結果である。

【図17】実施例７で製造されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ‐免疫グロブリンＦｃ結合体の純度を逆相カラムで分析した結果である。

【図18】選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法を用いて製造したイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ‐免疫グロブリンＦｃ（免疫グロブリンＦｃ‐ＣＡ‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ２７）結合体の収率と既存のＰＥＧ化方法を用いて製造した結合体の収率を比較したグラフである。

【図19】選択的沈殿法を適用（イソプロパノール処理）する前の状態の変化を確認するためのペプチドマッピング（Peptide mapping）の結果を示した図である。

【図20】選択的沈殿法を適用（イソプロパノール処理）した後の状態の変化を確認するためのペプチドマッピング（Peptide mapping）の結果を示した図である。

【図21】選択的沈殿法を適用（イソプロパノール処理）する前後のイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４の１次構造的シーケンシングの状態の変化を確認した図である（ＩＰＡ：イソプロパノール）。

【図22】選択的沈殿法を適用（イソプロパノール処理）する前後のイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４の２次構造の状態の変化を確認した図である（ＩＰＡ：イソプロパノール）。

【図23】選択的沈殿法を適用（イソプロパノール処理）する前後のイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４のｃＡＭＰ実験法により生理活性度を確認した図である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本発明の一つの態様は、 １）生理活性ポリペプチドのアミノ酸残基に非ペプチド性ポリマーを結合させる反応混合物から、非ペプチド性ポリマーが結合されていない生理活性ポリペプチドを選択的に沈殿させる段階；及び２）前記沈殿物から回収された生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと段階１）の結合反応下で反応させる段階を含む、生理活性ポリペプチド結合体の製造方法を提供する。

【0038】

本発明で用語、「生理活性ポリペプチド結合体」は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーの一末端が共有結合で連結された物質を意味する。本発明で、前記生理活性ポリペプチド結合体は非ペプチド性ポリマー‐生理活性ポリペプチド結合体と混用される。

【0039】

本発明の段階１）では、（１次）結合反応混合物で非ペプチド性ポリマーが結合されていない生理活性ポリペプチドを選択的に沈殿させることを特徴とする。前記（１次）結合反応は、非ペプチド性ポリマーと生理活性ポリペプチドを結合、具体的に、特異的に結合、より具体的に、位置特異的に結合させる。

【0040】

本発明で、前記「非ペプチド性ポリマーが結合されていない生理活性ポリペプチド」は、「未反応生理活性ポリペプチド」または「結合されていない生理活性ポリペプチド」と混用される。

【0041】

本発明で用語、「位置特異的」とは、生理活性ポリペプチドのアミノ酸のうち、非ペプチド性ポリマーと結合させようとするアミノ酸位置に非ペプチド性ポリマーが特異的に結合すること、具体的に、リジン残基またはＮ‐末端残基のアミンに特異的に結合することを意味する。このように、位置特異的に非ペプチド性ポリマーを結合させる場合、製造しようとする生理活性が極大化された持続性製剤は、他の物質の存在、目的としない結合体、例えば、生理活性に重要なアミノ酸残基と非ペプチド性ポリマーが結合した結合体による生理活性の減少が防止されうる。例えば、エキセンディン‐４の場合、非ペプチド性ポリマーが生理活性ポリペプチドのＮ‐末端に結合する場合、インビトロ活性が低下する一方、非ペプチド性ポリマーがリジン残基に結合した場合はインビトロ活性が維持される。特に、エキセンディン‐４の１２番目または２７番目のリジン残基の中でも２７番目のリジン残基に非ペプチド性ポリマーが結合される場合、より高いインビトロ活性を示す。

【0042】

したがって、本発明の一態様で、生理活性ポリペプチドがエキセンディンまたはエキセンディン誘導体である場合、前記非ペプチド性ポリマーは位置特異的にエキセンディンまたはエキセンディン誘導体の１２番目または２７番目のリジンに結合することができ、具体的には２７番目のリジンに結合することができるが、これに限定されない。このような、エキセンディンのＰＥＧ化方法は特許文献２に詳細に記述されており、これは参考文献として本発明の範囲に含まれる。

【0043】

本発明で用語、「選択的沈殿」は、非ペプチド性ポリマーと生理活性ポリペプチドを結合させる反応混合物から生成された非ペプチド性ポリマー‐生理活性ポリペプチド結合体は水溶液中に残り、反応しない生理活性ポリペプチドは選択的に沈殿されることを意味する。

【0044】

本発明で、選択的沈殿は前記反応混合物で未反応生理活性ポリペプチドを沈殿させることができれば、制限なく様々な方法を用いてもよい。例えば、広く公知された沈殿方法の実施例は、以下の通りである：
１．塩析（salting out）、
２．等電沈殿（isoionic precipitation）、
３．Ｃ２有機助溶媒沈殿（two‐carbon（C2）organic cosolvent precipitation）、
４．Ｃ４及びＣ５有機助溶媒沈殿（C4 and C5、organic cosolvent precipitation）、段階別分離（phase partitioning）、及びポリペプチド抽出、
５．ポリペプチド排除（polypeptide exclusion）、クラウディング剤[（crowding agents（中性ポリマー）]及び浸透物質（osmolytes）、
６．合成及び半合成の高分子電解質の沈殿（Synthetic and semisynthetic polyelectrolyte precipitation）、
７．金属及びポリフェノールのヘテロポリ陰イオン沈殿（Metallic and polyphenolic heteropolyanion precipitation）、
８．疎水性イオン対（ＨＩＰ）強化リガンド[Hydrophobic ion pairing（HIP）entanglement ligands]、
９．マトリックススタッキングリガンド共同沈殿（Matrix‐stacking‐ligand coprecipitation）、
１０．２価及び３価金属陽イオン沈殿（Di‐ and trivalent metal cation precipitation）。

【0045】

前記選択的沈殿は、前記記載されたそれぞれの方法またはこれらの適切な組み合わせを用いてもよい。

【0046】

具体的に、有機溶媒を前記反応混合物に添加して未反応生理活性ポリペプチドを選択的に沈殿させてもよいが、これに限定されない。

【0047】

また、前記有機溶媒は、具体的に、アルコール、ケトン、ニトリルまたはこれらの組み合わせ、より具体的に、エタノール、イソプロパノール、１‐プロパノール、１‐ブタノール、アセトン、アセトニトリルまたはこれらの組み合わせであってもよいが、これに限定されない。また、前記有機溶媒は、未反応生理活性ポリペプチドの選択的沈殿のために反応混合物に反応混合物体積の２倍以上、具体的には２〜７倍、より具体的に、３〜７、４〜７または５〜７倍、さらに具体的には、３〜７倍添加してもよいが、これに限定されない。

【0048】

本発明で、選択的沈殿に用いられる前記反応混合物は、未反応生理活性ポリペプチドを反応混合物の総重量に対して１０重量％以上、具体的に２０重量％以上含んでもよいが、これに限定されない。

【0049】

本発明で用語、「生理活性ペプチド」は、人体内で生理活性を示すようにする物質を意味する。本発明で、生理活性ペプチドは生理活性を示すことができるペプチドはすべて該当されてもよい。例えば、インスリン分泌ペプチド、血液凝固因子、 消化促進ホルモン、グルカゴン、インスリン、オキシントモジュリン(oxintomodulin)、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、腸内ホルモン、サイトカイン、酵素、成長因子、ニューロペプチド（neuropeptide）、下垂体ホルモン、視床下部ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド及び生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体からなる群から選択されてもよいが、これに限定されない。

【0050】

また、 赤血球増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、アミリン、ソマトスタチン、ＰＹＹ（peptide YY）、ＮＰＹ（neuropeptide Y）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（corticotropin ）、エレドイシン（eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（oxytocin）、バソプレシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、シクレチン（secretin）、セルモレリン（sermorelin ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類、インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン放出ペプチド（gastric releasing peptide）、モチリン（motilin）、血管作用性腸管ペプチド（vasoactive intestinal peptide）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriuretic peptide; ANP）、バリンナトリウム利尿ペプチド（barin natriuretic peptide; BNP）、Ｃ‐型ナトリウム利尿ペプチド（C‐type natriuretic peptide; CNP）、ニューロキニン（neurokinin）Ａ、ニューロメジン（neuromedin）、レニン（renin）、エンドセリン（endothelin）、サラフォトキシンペプチド（sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（carsomorphin peptide）、デルモルフィン（dermorphin）、ダイノルフィン（dynorphin）、エンドルフィン（endorphin）、エンケファリン（enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ抑制剤、チモポエチン（thymopoietin）、チムリン（thymulin）、チモペンチン（thymopentin）、チモシン（tymosin）、胸腺体液性因子（thymic humoral factor）、アドレノモデュリン（adrenomodullin）、アラトスタチン（allatostatin）、アミロイドベータプロテイン断片（amyloid beta‐protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（bombesin）、オステオカルシン（osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ‐セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ‐１、ＶＣＡＭ‐１、ロイコカイン（leucokine）、クリングル（kringle）‐５、ラミニン（laminin）、インヒビン（inhibin）、ガラニン（galanin）、フィブロネクチン（fibronectin）、パンクレアスタチン（pancreastatin）及びフューゼオン（fuzeon）からなる群から選択されてもよいが、これに限定されない。

【0051】

それだけではなく、これらの生理活性ポリペプチドにはポリペプチドが有する生理活性を有するポリペプチドの前駆物質（precursors）、誘導体（derivatives）、断片（fragments）及び変異体（variants）なども含まれる。

【0052】

また、具体的に、前記の生理活性ポリペプチドは、エキセンディン、ＧＬＰ‐１、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン及びその誘導体、またはカルシトニンであってもよいが、これに限定されない。本発明で前記エキセンディン誘導体は、例えば、アミノ酸残基の一部のグループが、化学的に置換（例えば、α-メチル化、α-ヒドロキシ化）、除去（例えば、脱アミノ化）、修飾（例えば、Ｎ-メチル化）またはこれらの組み合わせによって製造されてもよいが、このようなエキセンディン誘導体は、特許文献３に詳しく記述されている。また、前記エキセンディン誘導体は、具体的に、デス‐アミノ‐ヒスチジル（ＤＡ）‐エキセンディン‐４、ベータ‐ヒドロキシ‐イミダゾ‐プロピオニル（ＨＹ）‐エキセンディン‐４、イミダゾ‐アセチル（ＣＡ）‐ エキセンディン‐４及びジメチル‐ヒスチジル（ＤＭ）‐エキセンディン‐４からなる群から選択されてもよいが、これに限定されない。

【0053】

本発明で用語、「非ペプチド性ポリマー」は、繰り返し単位が１つ以上結合された生体適合性ポリマーを意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合ではなく、任意の共有結合を介して互いに連結される。

【0054】

本発明に使用可能な非ペプチド性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、polylactic acid）、ＰＶＰ（Polyvinylpyrrolidone）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸‐グリコール酸、polylactic-glycolic acid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されてもよく、具体的には、ポリエチレングリコールであるが、これに限定されない。当該分野ですでに知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造しうる誘導体も、本発明の範囲に含まれる。

【0055】

前記非ペプチド性ポリマーは、生理活性ポリペプチドが活性を十分に発揮できるように、生体内のタンパク質分解酵素によって容易に切断されない生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のあるポリマーであれば、制限なく用いてもよい。これらの非ペプチド性ポリマーの分子量は、０．５〜１００ｋＤａの範囲、具体的には、０．５〜２０ｋＤａの範囲である。また、前記生理活性ポリペプチドと結合する本発明の非ペプチド性ポリマーは、一種類のポリマーだけでなく、相異する種類のポリマーの組み合わせを用いてもよい。

【0056】

また、本発明で非ペプチド性ポリマーは、一方の末端にのみ反応基を有するか、または両末端に反応基を有してもよい。反応基を両末端に有する非ペプチド性ポリマーの場合、持続型製剤としての機能を可能にする生理活性担体及びタンパク質薬物と結合してもよい。

【0057】

具体的に、前記非ペプチド性ポリマーの末端反応基は、アルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループ、ブチルアルデヒドグループ、マレイミド（maleimide）グループ及びスクシンイミド誘導体（succinimide）からなる群から選択されてもよく、より具体的に、アルデヒドグループ、さらに具体的に、プロピオンアルデヒドグループであってもよいが、これに限定されない。前記スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカルボネートを用いてもよい。特に、前記非ペプチド性ポリマーが末端に反応アルデヒドグループの反応基を有する場合、非特異的反応を最小化し、非ペプチド性ポリマーの末端で生理活性ポリペプチド及び生理活性担体とそれぞれ結合するのに効果的である。また、アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終的な産物は、アミド結合で連結されたものよりもはるかに安定的である。また、アルデヒド反応基は、低いｐＨ、例えばｐＨ２．０〜７．０、具体的には、ｐＨ３．０〜６．０、より具体的には、ｐＨ４．０〜６．０でアミノ末端に選択的に反応することができる。また、アルデヒド反応基は、高いｐＨ、例えば、ｐＨ６．５〜９．０、具体的には、ｐＨ６．５〜８．０、より具体的には、ｐＨ６．５〜７．５の条件では、リジン残基と共有結合を形成することができる。

【0058】

また、本発明で非ペプチド性ポリマーの両末端の反応基は、互いに同じであるか、または異なってもよい。両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性ポリマーとして用いる場合は、公知の化学反応によって、前記ヒドロキシ基を様々な反応基として活性化するか、商業的に入手可能な変形された反応基を有するポリエチレングリコールを用いて製造してもよい。

【0059】

本発明の具体的な一実施例では、前記非ペプチド性ポリマーは末端にアルデヒドグループを有するポリエチレングリコールであり、段階１）の結合反応は、位置特異的ＰＥＧ化であってもよい。前記位置特異的ＰＥＧ化は、当業界に公知された方法、例えば、リジンのε‐アミノ基のようなアミノ基、または生理活性ポリペプチドのＮ‐末端に対する還元的アミン化（reductive amination）によって行われてもよい。

【0060】

本発明で用語、「生理活性ポリペプチド結合体」は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーの一末端が共有結合で連結された物質を意味する。本発明で、生理活性ポリペプチド結合体は非ペプチド性ポリマー‐生理活性ポリペプチド結合体と混用される。

【0061】

また、本発明で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーの反応において、反応モル比は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーが共有結合を形成する限り、制限はないが、生理活性ポリペプチド：非ペプチド性ポリマーが１：１〜１：３０である範囲内で適切に選択されてもよい。

【0062】

また、本発明で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーの反応において、反応時間は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーが共有結合を形成するかぎり、制限はないが、具体的には、０．５〜４．０時間、より具体的には、０．５〜２．０時間であってもよいが、これに限定されない。

【0063】

また、本発明で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーの反応において、反応温度は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーが共有結合を形成する限り、制限はないが、具体的には、０〜１４℃、または１５〜３０℃、より具体的に、４〜８℃または２０〜２５℃であってもよいが、これに限定されない。

【0064】

また、本発明で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーの反応において、生理活性ポリペプチドの濃度は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーが共有結合を形成する限り、制限はないが、具体的に、１〜２５ｍｇ/ｍｌ、より具体的に、５〜１８ｍｇ/ｍｌであってもよいが、これに限定されない。

【0065】

本発明の一態様は、変異されたエキセンディン‐４がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合された生理活性ポリペプチド結合体の製造方法を提供する。本発明の具体的な一実施例では、両末端にアルデヒド官能基を有する、３．４ｋＤａのポリエチレングリコール（例えば、３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧ）を変異されたエキセンディン‐４であるイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４（ＣＡ‐エキセンディン‐４）のＬｙｓ位置にＰＥＧ化させるために、ペプチドとＰＥＧのモル比を約１：７．５、ペプチドの濃度を約５〜１８ｍｇ/ｍｌにして、０．５〜４．０時間に４〜８℃及び２０〜２５℃で還元剤である２０ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride、SCB、NaCNBH3）を添加した１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．５〜７．５緩衝液で反応させることができる。具体的に、ペプチド１５ｍｇ/ｍｌで３時間に４〜８℃で反応させた後、クエン酸ｐＨ２．０緩衝液とＫＣｌ線形濃度勾配方法を適用したＳＯＵＲＣＥ １５Ｓカラムを用いて、前記各反応液からイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧを分離することができる。例えば、本発明者らは、反応混合物から（ＰＥＧ）ｎ‐イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４＋イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ１２）が約１０〜４０％、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧが約４０〜５０％、未反応イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４が約２０〜５０％の含量を占めることを確認した（表１及び２）。

【0066】

また、本発明の他の一態様は、インスリンアナログがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合された生理活性ポリペプチド結合体の製造方法を提供する。前記インスリンアナログは３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧをインスリンアナログのβ鎖のＮ‐末端にＰＥＧ化させるために、ペプチドとＰＥＧのモル比を約１：４、ペプチドの濃度を約５〜１８ｍｇ/ｍｌにして、０．５〜４．０時間に４〜８℃及び２０〜２５℃で還元剤である３〜５ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride、SCB、NaCNBH3）を添加した５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ４．０〜６．０緩衝液で反応させることができる。具体的に、ペプチド５ｍｇ/ｍｌで２時間に４〜８℃で反応させた後、クエン酸ｐＨ３．０緩衝液とＫＣｌ線形濃度勾配方法を適用したＳＰ‐ＨＰカラムを用いて、前記各反応液からインスリンアナログを分離することができる。例えば、本発明者らは、反応混合物で（ＰＥＧ）ｎ‐インスリンアナログが約１０〜２０％、インスリンアナログ‐ＰＥＧが約５０〜６０％、未反応インスリンアナログが約５〜２０％の含量を占めることを確認した。

【0067】

また、本発明の具体的な一実施例では、前記ＣＡ‐エキセンディン‐４またはインスリンアナログのＰＥＧ化された結合体の反応混合物に（反応混合物の体積の）２倍以上、具体的には、３〜７倍のイソプロパノールを添加して反応させた。前記イソプロパノールを処理した反応液で、ＰＥＧ化された結合体（ＣＡ‐エキセンディン‐４またはインスリンアナログの結合体）を含む水溶液と結合してない生理活性ポリペプチドの沈殿物、例えば、ＰＥＧ化されていない未反応イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４または未反応インスリンアナログを分離した（図４及び５）。例えば、水溶液を精製し（図６及び９）、その結果、本発明者らは水溶液に含まれた（ＰＥＧ）ｎ‐イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４＋イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧ （Ｌｙｓ１２）が約１０〜４０％、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧが約４０〜５０％、未反応イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４が約５〜１５％の含量を占めることを確認した。また、分離されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４の沈殿物は１５〜３０％の含量であることを確認した。インスリンアナログの場合、水溶液は１０〜２０％の（ＰＥＧ）ｎ‐インスリンアナログ、５０〜６０％のインスリンアナログ‐ＰＥＧ、及び約５〜１５％の未反応（ＰＥＧ）ｎ‐インスリンアナログを含む。

【0068】

また、本発明の具体的な一実施例では、イソプロパノールの処理前後のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の変化を確認した結果、イソプロパノールの処理前後の両方が同じ状態で（図１９及び２０）、１次構造が同一であり（図２１）、２次構造の含量が同じで（図２２及び表７）、同等の活性を有することが分かった（図２３及び表８）。これにより、イソプロパノールの処理による選択的沈殿法は、生理活性ポリペプチドであるイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４に否定的な影響を及ぼさないことが分かった。

【0069】

本発明でイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧは、イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ２７）、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４（Ｌｙｓ２７）‐ＰＥＧ、ＣＡ‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ及びＣＡ‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ２７）と混用される。

【0070】

本発明の段階２）では、前記段階１）の沈殿物から回収された生理活性ポリペプチドを用いて、非ペプチド性ポリマー‐生理活性ポリペプチド結合体を製造するために、前記生理活性ポリペプチドを非ペプチド性ポリマーと結合させる、２次反応混合物を生成させることを特徴とする。具体的に、前記沈殿された生理活性ポリペプチドを溶解した後、非ペプチド性ポリマーと結合、具体的に、特異的結合、より具体的に、位置特異的に結合させてもよいが、これに限定されない。前記２次反応混合物及び前記１次反応混合物に選択的沈殿法が適用されて形成された水溶液は、製造された非ペプチド性ポリマー‐生理活性ポリペプチド結合体を含有している。

【0071】

本発明で、前記沈殿された生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーの反応条件は、沈殿された生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーが共有結合を形成する限り制限はないが、具体的に、前記段階１）の反応条件で行ってもよい。

【0072】

特に、前記沈殿された生理活性ポリペプチドと非ペプチド性ポリマーの反応時間は、具体的に、０．５〜４．０時間、より具体的には、０．５〜２．０時間であってもよいが、これに限定されない。

【0073】

本発明の具体的な一実施例では、実施例３でイソプロパノールを処理して、選択的沈殿化を介して分離されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４沈殿物の約２０〜３０％を再使用してＰＥＧ化を行った結果、未ＰＥＧ化イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４沈殿物の再ＰＥＧ化反応液の精製結果、前記反応液で（ＰＥＧ）ｎ‐イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４＋イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ１２）が約１５〜４０％、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧが４０〜５０％、未反応イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４が約１０〜４０％の含量を占めることを確認した（図７） 。

【0074】

また、本発明の製造方法は、前記段階２）の後、生理活性ポリペプチド結合体を分離する段階をさらに含んでもよい。この過程は、当業界で知られているクロマトグラフィーのような様々な物質の分離方法を用いて行ってもよい。具体的に、イオン交換クロマトグラフィー、より具体的に、高圧イオン交換クロマトグラフィーを用いてもよいが、これに限定されない。

【0075】

本発明では、前記１次反応混合物、１次反応混合物に選択的沈殿法が適用されて形成された水溶液、２次反応混合物またはこれらの組み合わせから生理活性ポリペプチド結合体を分離してもよい。

【0076】

特に、１次反応混合物に選択的沈殿法が適用されて形成された水溶液及び前記沈殿された生理活性ポリペプチドを用いて形成された２次反応混合物を合わせて、これから生理活性ポリペプチド結合体を分離する場合、１次反応混合物から分離する場合に比べて生理活性ポリペプチド結合体の収率が大幅に増加する。

【0077】

本発明の具体的な一実施例では、１次反応混合物に選択的沈殿法が適用されて形成された水溶液；及び未反応イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４またはインスリンアナログを含有した沈殿物を再溶解してＰＥＧ化反応を行った２次反応混合物を合わせて、クエン酸ｐＨ２．０〜３．０緩衝液とＫＣｌ線形濃度勾配方法を適用したＳＯＵＲＣＥ １５ＳカラムまたはＳＰ‐ＨＰカラムで分離した結果、選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法によって製造されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ結合体の収率が既存のＰＥＧ化方法による収率より非常に高いことを確認した（図１１及び表４）。

【0078】

また、本発明の具体的な一実施例では、既存のＰＥＧ化方法及びイソプロパノールを用いた選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法によるイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の純度が９７％と同等であり、ＰＥＧ化の位置純度も同様であることを確認した（表５）。

【0079】

また、本発明の別の態様は、前記生理活性ポリペプチド結合体の製造方法で製造された生理活性ポリペプチド結合体の非ペプチド性ポリマーと生理活性担体を共有結合で連結して、非ペプチド性ポリマーの両末端がそれぞれ生理活性担体及び生理活性ポリペプチドと結合された結合体を生成する段階を含む、生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体の製造方法を提供する。

【0080】

本発明の具体的な一態様で、選択的沈殿法を介した２段階の位置特異的ＰＥＧ化反応で製造された生理活性ポリペプチドの結合体を用いて、生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体（ポリペプチド‐担体結合体）を高収率及び高純度で生産することができる。前記生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体は、生理活性ポリペプチド結合体とは全く異なる活性、つまり、生理活性ポリペプチドの薬理効果の持続性の延長、治療を希望する病巣のような特定部位のターゲッティングまたは細胞の壊死誘導などの優れた生理活性を有する。

【0081】

本発明で、前記生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体内の非ペプチド性ポリマーは、生理活性ポリペプチドと生理活性担体と結合するために両末端を有する非ペプチド性ポリマーでなければならない。すなわち、前記生理活性ポリペプチド結合体の共有結合されない非ペプチド性ポリマーの末端に生理活性担体を共有結合で連結させて、非ペプチド性ポリマーの両末端がそれぞれ生理活性ポリペプチド及び生理活性担体と結合された生理活性ポリペプチド‐生理活性担体結合体を製造することができる。

【0082】

本発明で用語、「生理活性担体」は、非ペプチド性ポリマーの生理活性ポリペプチドと一緒に結合されて、生理活性ポリペプチドの薬理効果のような生理活性を持続させるか、または特定部位のターゲッティングまたは細胞壊死を誘導させる、前記生理活性ポリペプチドが有する生理活性とは別の付加的な活性を示す生理活性物質を意味する。

【0083】

本発明で用いられる生理活性担体は、前記のような活性を有する物質は制限なく用いられてもよいが、例えば、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、トランスフェリン、アプタマー、トキシン、ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、多糖類、脂肪酸及びフィブリノーゲンなどが挙げられる。具体的には、生理活性担体は、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域またはトランスフェリンであってもよく、より具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域であってもよいが、これに限定されない。

【0084】

本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）の部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。また、天然型の免疫グロブリンＦｃと実質的に同等または向上された効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域のみを除いて、一部または全部の重鎖不変領域１（ＣＨ）及び/または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張された免疫グロブ
リンＦｃ領域であってもよく、リン酸化、硫化、アクリル化、糖化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化及びアミル化などで修飾される免疫グロブリンＦｃ領域などを全て含む。これらの免疫グロブリンＦｃの範囲、製造方法及び免疫グロブリンＦｃを非ペプチド性ポリマー‐生理活性ポリペプチド結合体に共有結合させる方法は、特許文献４〜７等に詳細に記述されており、これらは参考文献として、本発明の範囲に含まれる。

【0085】

本発明の一態様で、生理活性ポリペプチド結合体は、生理活性ポリペプチドの特定アミノ酸に位置特異的に非ペプチド性ポリマーが結合されており、生理活性が最も優れた生理活性ポリペプチド結合体の他の付加的な結合体の生成を最小限に抑えることができる。これにより、薬理学的に価値のある生理活性ポリペプチド結合体の収率を増加させることができるという効果を有する。

【0086】

本発明の具体的な一実施例では、既存のＰＥＧ化方法及びイソプロパノールを用いた選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法によるイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４（Ｌｙｓ２７）‐ＰＥＧ結合体を、それぞれヒト免疫グロブリンＦｃ断片と結合させて、イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐免疫グロブリンＦＣの純度及び収率を分析した結果、純度は２７．６％で同じであるが（表５）、収率は選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法で製造されたイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐免疫グロブリンＦｃ結合体が既存の方法に比べて高いことが分かった。

【0087】

本発明でイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐免疫グロブリンＦＣは、ＣＡ‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ‐免疫グロブリン Ｆｃまたは免疫グロブリンＦＣ‐ＣＡ‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ２７）と混用される。

【0088】

（実施例）
以下、本発明を下記例により詳細に説明する。

【0089】

しかし、これらの例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの例に限定されるものではない。

【0090】

実施例１．イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４（Imidazo‐acetyl exendin-4）のＰＥＧ化及び位置異性体の分離
３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（アルデヒドグループを２つ有している、３．４ｋＤａのＰＥＧ、ＮＯＦ、日本）を用いてイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４（ＣＡ‐エキセンディン‐４、Ｂａｃｈｅｍ、アメリカ）のＬｙｓにＰＥＧ化を行った。

【0091】

３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４のＬｙｓ位置にＰＥＧ化させるために、ペプチドとＰＥＧのモル比を約１：３〜１：３０、ペプチドの濃度を約５〜１８ｍｇ/ｍｌにして０．５〜４．０時間に４〜８℃及び２０〜２５℃で反応させた。この時の反応は、それぞれ１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．５〜７．５緩衝液で行われ、還元剤である２０〜３０ｍＭ ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ_３）を添加して反応させた。具体的な反応条件及び下記のような方法で分離した結果を下記表１及び２に示した。また、具体的には、ペプチド１５ｍｇ/ｍｌで３時間に４〜８℃で反応させた後、下記のような方法で分離した結果を図２に示した。

【0092】

クエン酸ｐＨ２．０〜４．０緩衝液とＫＣｌ線形濃度勾配方法を適用したＳＯＵＲＣＥ １５Ｓカラムを用いて、前記各反応液でマルチＰＥＧ化された形態（下記表１の（ＰＥＧ）ｎ‐イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４）及び未反応形態のような不純物とイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧを分離した。

【0093】

【表1】

【0094】

【表2】

【0095】

その結果、（ＰＥＧ）ｎ‐イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４及びイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ１２）のピークが前方に出て、その後ろにＬｙｓ２７のＰＥＧ化されたピークが出て、未反応イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４のピークが最後に出ることが分かった（図２）。また、（ＰＥＧ）ｎ‐イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４＋イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ１２）が約１０〜４０％、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧが約４０〜５０％、未反応イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４が約１０〜５０％の含量を占めることを確認した。

【0096】

実施例２．インスリンアナログのＰＥＧ化及び位置異性体の分離
３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧを用いて、インスリンアナログ（特許文献８、韓美薬品、韓国）のβ鎖のＮ‐末端にＰＥＧ化を行った。

【0097】

３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧをインスリンアナログのＮ‐末端にＰＥＧ化させるために、ペプチドとＰＥＧのモル比を約１：４、ペプチドの濃度を約５〜１８ｍｇ/ｍｌにして０．５〜４．０時間に４〜８℃及び２０〜２５℃で反応させた。この時の反応は、それぞれ５０ｍＭのクエン酸ナトリウム ｐＨ４．０〜６．０緩衝液で行われ、還元剤である３〜５ｍＭ ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ_３）を添加して反応させた。具体的には、ペプチド５ｍｇ/ｍｌで２時間に４〜８℃で反応させた後、下記のような方法で分離した結果を図３に示した。

【0098】

クエン酸ｐＨ２．０〜４．０緩衝液とＫＣｌ線形濃度勾配方法を適用したＳＰ‐ＨＰカラムを用い、前記各反応液からインスリンアナログ‐ＰＥＧを分離した。

【0099】

その結果、（ＰＥＧ）ｎ‐インスリンアナログのピークが前方に出て、その後ろにＮ‐末端にＰＥＧ化されたピークが出て、未反応インスリンアナログのピークが最後に出ることが分かった（図３）。また、（ＰＥＧ）ｎ‐インスリンアナログが約１０〜２０％、インスリンアナログ‐ＰＥＧが約５０〜６０％、未反応インスリンアナログが約５〜２０％の含量を占めることを確認した。

【0100】

実施例３．有機溶媒を用いた選択的沈殿を介してイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４のＰＥＧ化及び未ＰＥＧ化されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４の分離
３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４（ＣＡ‐エキセンディン‐４、Ｂａｃｈｅｍ、アメリカ）のＬｙｓ位置にＰＥＧ化を行った。

【0101】

反応条件は実施例１と同様であった。ＰＥＧ化反応液にイソプロパノール、１‐プロパノール、１‐ブタノール、アセトン、アセトニトリルを反応液体積の２倍以上添加して反応させた。具体的には、３〜７倍の有機溶媒を処理した。有機溶媒を処理した反応液でＰＥＧ化されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４水溶液とＰＥＧ化されていない未反応イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４沈殿物を分離した（図４）。このうち、水溶液を実施例１と同様の方法で精製し（図６）、精製された各分画の含量を表３に示した。

【0102】

【表3】

【0103】

水溶液に含まれた（ＰＥＧ）ｎ‐イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４＋イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ１２）が約１０〜４０％、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧが約４０〜５０％、未反応イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４が約５〜１５％の含量を占めることを確認した。また、分離されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４沈殿物は１５〜３０％の含量であることを確認した（表３）。

【0104】

実施例４．有機溶媒を用いた選択的沈殿を介してインスリンアナログのＰＥＧ化及び未ＰＥＧ化されたインスリンアナログの分離
３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧを用いてインスリンアナログ（米薬品、韓国）のβ鎖のＮ‐末端にＰＥＧ化を行った。

【0105】

反応条件は実施例２と同じであった。ＰＥＧ化反応液にイソプロパノール、エタノール、１‐プロパノール、アセトン、アセトニトリルを反応液体積の２倍以上添加して反応させた。具体的には、３〜７倍の有機溶媒を処理した。有機溶媒を処理した反応液でＰＥＧ化されたインスリンアナログ水溶液とＰＥＧ化されていない未反応インスリンアナログ沈殿物を分離した（図５）。このうち、水溶液を実施例２と同様の方法で精製した（図９）。

【0106】

実施例５．未ＰＥＧ化されたイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の選択的沈殿物の再ＰＥＧ化及び位置異性体の分離
３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（アルデヒドグループを２つ有しているＰＥＧ、ＮＯＦ、日本）をイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４（ＣＡ‐エキセンディン‐４、Ｂａｃｈｅｍ、アメリカ）のＬｙｓ位置にＰＥＧ化を行い、実施例３と同様の方法でイソプロパノールを処理して、選択的沈殿化を介して分離されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４沈殿物の約２０〜３０％を再使用してＰＥＧ化を行った。

【0107】

３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４沈殿物のＬｙｓにＰＥＧ化させるために、イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４沈殿物とＰＥＧのモル比を１：７．５、イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４沈殿物を再溶解した反応液の濃度を約１５ｍｇ/ｍｌにして０．５〜２．０時間に２０〜２５℃で反応させた。この時の反応は、それぞれ１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５緩衝液で行われ、還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ_３）を添加して反応させた。精製方法は実施例１と同様であった。未ＰＥＧ化されたイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４沈殿物の再ＰＥＧ化反応液の精製結果、（ＰＥＧ）ｎ‐イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４＋イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧ（Ｌｙｓ１２）が約１５〜４０％、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧが４０〜５０％、未反応イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４が約１０〜４０％の含量を占めることを確認し（図７）、１次ＰＥＧ化の結果（表２）と同様の結果を示すことが分かった。

【0108】

実施例６．未ＰＥＧ化されたインスリンアナログの選択沈殿物の再ＰＥＧ化及び位置異性体の分離
３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧをインスリンアナログ（韓美薬品、韓国）のβ鎖のＮ‐末端にＰＥＧ化を行い、実施例４と同様の方法でイソプロパノールを処理して選択的沈殿化を介して分離されたインスリンアナログ沈殿物の約０．５〜１０％を再使用してＰＥＧ化を行った。

【0109】

３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧをインスリンアナログ沈殿物のＮ‐末端にＰＥＧ化をさせるために、インスリンアナログ沈殿物とＰＥＧのモル比を１：４、インスリンアナログ沈殿物を再溶解した反応液の濃度を約５〜１８ｍｇ/ｍｌにして０．５〜４．０時間に４〜８℃で反応させた。この時の反応は、それぞれ５０ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ４．０〜６．０緩衝液で行われ、還元剤である３〜５ｍＭ ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ_３）を添加して反応させた。精製方法は実施例２と同様であった。未ＰＥＧ化されたインスリンアナログ沈殿物の再ＰＥＧ化反応液の精製結果、（ＰＥＧ）ｎ‐インスリンアナログが約０〜１５％、インスリンアナログ‐ＰＥＧが２０〜４０％、未反応インスリンアナログが約３０〜４５％の含量を占めることを確認した（図１０）。

【0110】

実施例７．ＰＥＧ化されたイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の水溶液及び再ＰＥＧ化された沈殿物の混合物から位置異性体の分離後の収率確認
３．４Ｋ ＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４（ＣＡ‐エキセンディン‐４、Ｂａｃｈｅｍ、アメリカ）のＬｙｓ位置にＰＥＧ化を行った。実施例１と同様の方法で反応させて、反応液に実施例３と同様の方法でイソプロパノールを処理して選択的沈殿をさせた後、沈殿物を実施例５と同様の方法で再ＰＥＧ化させた。反応液にイソプロパノールを処理して得られた水溶液と再ＰＥＧ化された沈殿物を合わせて、実施例１と同様の方法で精製して位置異性体を分離した（図８）。

【0111】

精製の結果、（ＰＥＧ）ｎ‐イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４＋イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４（Ｌｙｓ１２）‐ＰＥＧが約２５〜３０％、イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧが約５０〜６０％、未反応イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４が１０〜２０％の含量を占めることを確認した。

【0112】

また、選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法によって製造されたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ結合体の収率を既存のＰＥＧ化方法による収率と比較した結果を図１１及び下記表４に示した。その結果、選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法が既存のＰＥＧ化方法よりも非常に高いイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ結合体の収率を有することを確認した。

【0113】

【表4】

【0114】

実施例８．イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４ＰＥＧ化の位置異性体の分離後の純度確認
既存のＰＥＧ化方法及びイソプロパノールを用いた選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法によるイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の純度の差を確認するために、実施例１及び７の精製溶出液を用いて、それぞれＨＰＬＣ逆相分析（ＲＰ）を行った（図１２及び１３）。

【0115】

その結果、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の従来の方法に該当する実施例１及び選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法に該当する実施例７の純度が９７％で同等であることを確認した（表５）。

【0116】

【表5】

【0117】

実施例９．イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４ＰＥＧ化の位置異性体の分離後のＬｙｓ‐Ｃペプチドマッピング
イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４にＰＥＧが接合された位置を確認するために、タンパク質酵素であるリジン‐Ｃで切断した後、逆相クロマトグラフィーを用いて分析した。実験は、実施例１及び実施例７の精製された各ＰＥＧ結合体；及びイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４をトリエチルアミン‐塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ/Ｌ；ｐＨ７．５）に１ｍｇ/ｍｌの濃度で溶解した後、１０μｌの酵素（０．１ｍｇ/ｍｌ）を添加して、３７℃で４時間反応させた。反応が終了した反応混合物を逆相クロマトグラフィーを用いて分析した（図１４及び１５）。

【0118】

その結果、各反応によるＰＥＧ化位置純度を前記表５に示し、実施例１及び実施例７の精製されたそれぞれのＰＥＧ結合体は同様の純度を有することを確認した。

【0119】

実施例１０.イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、実施例１で得られたイミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４‐ＰＥＧ結合体と韓美薬品（韓国）で購入したヒト免疫グロブリンＦｃ断片を結合させた。イミダゾ‐アセチル‐エキセンディン‐４（Ｌｙｓ２７）‐ＰＥＧ結合体と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：２．５、全体のタンパク質濃度を約１０ｍｇ/ｍｌにして４〜８℃で１２〜１６時間反応させた。反応溶液は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．２を用いて、ここに３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００及び還元剤である５０ｍＭのＮａＣＮＢＨ_３を添加した。結合反応後のカップリング反応液のＨＰＬＣ逆相分析（ＲＰ）の結果（図１６）、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐免疫グロブリンＦｃ結合体の純度は２７．６％であった（表５）。

【0120】

実施例１１．選択的沈殿方法の適用によるイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
実施例７で得られたイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４（Ｌｙｓ２７）‐ＰＥＧ結合体を韓美薬品（韓国）で購入したヒト免疫グロブリンＦｃ断片と結合させた。実施例１０と同様の方法で結合させ、純度を分析した。反応液のＨＰＬＣ逆相分析の結果（図１７）、純度は２７．６％であった（表５）。実施例７による収率向上がイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐免疫グロブリンＦｃ結合体の収率向上に及ぼす結果を実施例１による収率と比較して図１８及び下記表６に示した。その結果、選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法で製造されたイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧ結合体の収率が既存の方法に比べて高いため、選択的沈殿法を適用したＰＥＧ化方法で製造されたイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐ＰＥＧ結合体を用いて、イミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４‐免疫グロブリンＦｃ結合体を製造する場合、既存のＰＥＧ化方法を用いることより収率が高いことが分かった。

【0121】

【表6】

【0122】

実施例１２．選択的沈殿法（イソプロパノールによる）の適用によるイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の純度を確認するためのリジン‐Ｃペプチドマッピング
イソプロパノールの処理前後のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の状態の変化を確認するために、リジン‐Ｃペプチドマッピングを行った。図１９の結果は、イソプロパノール処理前の状態であり、図２０の結果は、選択的沈殿法の適用（イソプロパノール処理）後のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４のマッピング結果である。分析の結果、処理前後の状態の両方は同じ状態であることが分かった。分析方法は実施例９と同様であった。

【0123】

実施例１３．沈殿法（イソプロパノールによる）適用によるイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の純度を確認するためのＬＣ‐Ｍａｓｓ
イソプロパノールの処理前後のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の１次構造であるタンパク質配列を確認するために、ＬＣ‐Ｍａｓｓ分析を行った。分析の結果、選択的沈殿法の適用（イソプロパノール処理）の前後の１次構造が同一であることを確認した（図２１）。

【0124】

実施例１４．沈殿法（イソプロパノールによる）適用によるイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の２次構造を確認するための円偏光解析（CD spectroscopy）
イソプロパノール（ＩＰＡ）の処理前後のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の２次構造の変化を確認するために、ＣＤ分析を行った。分析の結果、選択的沈殿法の適用（イソプロパノール処理）前後の２次構造の含量が同一であることを確認した（図２２及び表７）。

【0125】

【表7】

【0126】

実施例１５．選択的沈殿法の適用前後のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４のインビトロの活性測定
イソプロパノールの処理前後のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の持続型製剤の効力を測定するために、インビトロ細胞活性を測定する方法を用いた。ＧＬＰ‐１のインビトロ活性測定方法は、ＧＬＰ‐１受容体をクローニングしたＣＨＯ細胞を用いて、前記クローニングした細胞株にＧＬＰ‐１を処理することによる細胞内ｃＡＭＰの増加有無を測定する方法である。

【0127】

本試験で用いられたインビトロ活性の測定方法は、ＣＨＯ/ＧＬＰ‐１、エキセンディ
ン‐４と試験物質を濃度別に処理した後、ｃＡＭＰ発生程度を測定してＥＣ_５０値を比較する試験で行った。イソプロパノール処理後のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４の対照群としてイソプロパノール処理前のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４を用いた。インビトロ活性測定の結果を図２３及び表８に示した。その結果、イソプロパノールの処理前後のイミダゾ‐アセチルエキセンディン‐４は同等の活性を有することが分かった。

【0128】

【表8】

【0129】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】