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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6987838
(24)【登録日】2021年12月3日
(45)【発行日】2022年1月5日
(54)【発明の名称】抗菌剤感受性予測のためのフローサイトメトリデータ処理
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/18 20060101AFI20211220BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20211220BHJP
G01N 15/14 20060101ALI20211220BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20211220BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20211220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/18
C12M1/34 C
G01N15/14 C
G01N21/64 F
C12Q1/04
【請求項の数】17
【全頁数】26
(21)【出願番号】特願2019-500445(P2019-500445)
(86)(22)【出願日】2017年7月6日
(65)【公表番号】特表2019-527546(P2019-527546A)
(43)【公表日】2019年10月3日
(86)【国際出願番号】EP2017066903
(87)【国際公開番号】WO2018007504
(87)【国際公開日】20180111
【審査請求日】2020年7月6日
(31)【優先権主張番号】16178636.3
(32)【優先日】2016年7月8日
(33)【優先権主張国】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】304043936
【氏名又は名称】ビオメリュー
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ラムジート， マヘンドラシン
(72)【発明者】
【氏名】マエー， ピエール
(72)【発明者】
【氏名】カネコ， ギャエル
(72)【発明者】
【氏名】シャペル， マルゴー
【審査官】
福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】
特表２０１４−５１５２７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Huang, T.H. et.al.，Rapid cytometric antibiotic susceptibility testing utilizing adaptive multidimensional statistical metrics.，Analytical chemistry，2015年，vol.87, no.3，pp.1941-1949
【文献】
Ramani.R. et.al.，Rapid flow cytometric susceptibility testing of candida albicans.，Journal of clinical microbiology，1997年，vol.35, no.9，pp.2320-2324
【文献】
Chaturvedi, V. et.al.，Collaborative study of the NCCLS and flow cytometry methods for antifungal susceptibility testing of candida albicans.，Journal of clinical microbiology，2004年，vol.42, no.5，pp.2249-2251
【文献】
Gottfredsson, M. et.al.，Characteristics and dynamics of bacterial populations during postantibiotic effect determined by flow cytometry.，Antimicrobial agents and chemotherapy.，1998年，vol.42, no.5，pp.1005-1011
【文献】
Roederer, M. et.al.，Probability binning comparison: A metric for quantitating univariate distribution difference，Probability binning comparison: A metric for quantitating univariate distribution difference，2001年，vol.45，pp.37-46
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０
ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗菌剤の濃度に対する試験微生物の感受性を定量化するための方法であって、
前記試験微生物の集団と前記試験微生物を標的とする生存性蛍光マーカーとを含む２つの液体試料を調製するステップであって、前記液体試料のうちの１つが前記濃度の前記抗菌剤を含み、前記液体試料のうちの他方が前記抗菌剤を含まない、ステップと、
前記試験微生物の前記試料の各々について、フローサイトメータによって、前記試料内の前記微生物の集団の蛍光分布または前方散乱分布または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するステップと、
前記試料の各々について、
取得された前記分布の主モードに対応する第１の座標値、および前記第１の座標値よりも大きい値について取得された前記分布の第１の面積と、
前記第１の座標値と第２の座標値との間の取得された前記分布の第２の面積が、５０％を超える前記第１の面積の所定の割合に等しい、前記第１の座標値よりも大きい前記第２の座標値と
を計算するステップと、
関係、すなわち、
に従って比を計算するステップであって、Ｍｏｄｅ（ＡＴＢ）およびＱＴ（ＡＴＢ）が、それぞれ、前記濃度の抗菌剤ありの場合の前記第１および第２の座標値であり、Ｍｏｄｅ（ｎｏ ＡＴＢ）およびＱＴ（ｎｏ ＡＴＢ）が、それぞれ、前記濃度の抗菌剤なしの場合の前記第１および第２の座標値である、ステップと
を含む方法。
前記試験微生物の集団と前記試験微生物を標的とする生存性蛍光マーカーとを含む２つの液体試料を調製するステップであって、前記液体試料のうちの１つが前記濃度の前記抗菌剤を含み、前記液体試料のうちの他方が前記抗菌剤を含まない、ステップと、
前記試験微生物の前記試料の各々について、フローサイトメータによって、前記試料内の前記微生物の集団の蛍光分布または前方散乱分布または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するステップと、
前記試料の各々について、
取得された前記分布の主モードに対応する第１の座標値、および前記第１の座標値よりも大きい値について取得された前記分布の第１の面積と、
前記第１の座標値と第２の座標値との間の取得された前記分布の第２の面積が、５０％を超える前記第１の面積の所定の割合に等しい、前記第１の座標値よりも大きい前記第２の座標値と
を計算するステップと、
関係、すなわち、
を含む方法。
【請求項2】
高感受性表現型、中間表現型、および耐性表現型の中から、抗菌剤に対する試験微生物の感受性表現型を予測するための方法であって、
Ａ．以下のステップ、すなわち、
ａ．前記抗菌剤の高感受性ブレークポイント濃度および耐性ブレークポイント濃度に基づいて決定された、高感受性表現型微生物と、中間表現型微生物と、耐性表現型微生物とを含む微生物のセットを選択し、前記微生物のセットの感受性表現型のデジタルセットを生成するステップと、
ｂ．前記微生物のセットの各微生物について、前記微生物の集団と、前記微生物を標的とする生存性蛍光マーカーと、前記抗菌剤とを含む液体試料を調製するステップであって、前記液体試料が少なくとも２つの異なる濃度の抗菌剤を含む、ステップと、
ｃ．各試料について、フローサイトメータによって、前記試料内の前記微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するステップと、
ｄ．前記微生物のセットの各微生物について、コンピュータユニットによって、前記微生物について取得された値の前記セットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップであって、前記特徴ベクトルの生成が、前記抗菌剤の前記異なる濃度の各々について、
取得された前記分布の主モードに対応する第１の座標値と、前記第１の座標値よりも大きい値について取得された前記分布の第１の面積とを計算するステップと、
前記第１の座標値と第２の座標値との間の取得された前記分布の第２の面積が、５０％を超える前記第１の面積の所定の割合に等しい、前記第１の座標値よりも大きい前記第２の座標値を計算するステップと、
関係、すなわち、
に従って比を計算するステップであって、Ｍｏｄｅ（ＡＴＢ）およびＱＴ（ＡＴＢ）が、それぞれ、前記濃度の抗菌剤ありの場合の前記第１および第２の座標値であり、Ｍｏｄｅ（ｎｏ ＡＴＢ）およびＱＴ（ｎｏ ＡＴＢ）が、それぞれ、前記濃度の抗菌剤なしの場合の前記第１および第２の座標値である、ステップと
を含む、ステップと、
ｅ．コンピュータユニットによって、前記生成された特徴ベクトルおよび感受性表現型の前記デジタルセットに基づいて、前記抗菌剤に対する前記感受性表現型の予測モデルを学習するステップと、
を含む学習段階と、
Ｂ．以下のステップ、すなわち、
ｆ．前記試験微生物の集団と、前記生存性蛍光マーカーと、前記異なる濃度における前記抗菌剤とを含む液体試料を調製するステップと、
ｇ．前記試験微生物の各試料について、フローサイトメータによって、ステップｃ．において取得された値の前記セットに対応する値のデジタルセットを取得するステップと、
ｈ．コンピュータユニットによって、前記試験微生物について取得された値の前記セットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップであって、前記特徴ベクトルがステップｄ．の前記特徴ベクトルに対応する、ステップと、
ｉ．前記予測モデルを記憶するコンピュータユニットによって、前記モデルを前記試験微生物の前記特徴ベクトルに適用することによって、前記試験微生物の前記感受性表現型を予測するステップと
を含む予測段階と
を含む方法。
Ａ．以下のステップ、すなわち、
ａ．前記抗菌剤の高感受性ブレークポイント濃度および耐性ブレークポイント濃度に基づいて決定された、高感受性表現型微生物と、中間表現型微生物と、耐性表現型微生物とを含む微生物のセットを選択し、前記微生物のセットの感受性表現型のデジタルセットを生成するステップと、
ｂ．前記微生物のセットの各微生物について、前記微生物の集団と、前記微生物を標的とする生存性蛍光マーカーと、前記抗菌剤とを含む液体試料を調製するステップであって、前記液体試料が少なくとも２つの異なる濃度の抗菌剤を含む、ステップと、
ｃ．各試料について、フローサイトメータによって、前記試料内の前記微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するステップと、
ｄ．前記微生物のセットの各微生物について、コンピュータユニットによって、前記微生物について取得された値の前記セットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップであって、前記特徴ベクトルの生成が、前記抗菌剤の前記異なる濃度の各々について、
取得された前記分布の主モードに対応する第１の座標値と、前記第１の座標値よりも大きい値について取得された前記分布の第１の面積とを計算するステップと、
前記第１の座標値と第２の座標値との間の取得された前記分布の第２の面積が、５０％を超える前記第１の面積の所定の割合に等しい、前記第１の座標値よりも大きい前記第２の座標値を計算するステップと、
関係、すなわち、
を含む、ステップと、
ｅ．コンピュータユニットによって、前記生成された特徴ベクトルおよび感受性表現型の前記デジタルセットに基づいて、前記抗菌剤に対する前記感受性表現型の予測モデルを学習するステップと、
を含む学習段階と、
Ｂ．以下のステップ、すなわち、
ｆ．前記試験微生物の集団と、前記生存性蛍光マーカーと、前記異なる濃度における前記抗菌剤とを含む液体試料を調製するステップと、
ｇ．前記試験微生物の各試料について、フローサイトメータによって、ステップｃ．において取得された値の前記セットに対応する値のデジタルセットを取得するステップと、
ｈ．コンピュータユニットによって、前記試験微生物について取得された値の前記セットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップであって、前記特徴ベクトルがステップｄ．の前記特徴ベクトルに対応する、ステップと、
ｉ．前記予測モデルを記憶するコンピュータユニットによって、前記モデルを前記試験微生物の前記特徴ベクトルに適用することによって、前記試験微生物の前記感受性表現型を予測するステップと
を含む予測段階と
を含む方法。
【請求項3】
前記予測モデルが、前記高感受性表現型対前記耐性表現型および中間表現型の第１の予測モデルと、前記耐性表現型対前記高感受性表現型および中間表現型の第２の予測モデルとを含み、前記第１および第２の予測モデルが独立して学習され、
前記第１の予測モデルが前記高感受性表現型を予測せず且つ前記第２の予測モデルが前記耐性表現型を予測しないときに、前記中間表現型が予測される、
請求項２に記載の方法。
前記第１の予測モデルが前記高感受性表現型を予測せず且つ前記第２の予測モデルが前記耐性表現型を予測しないときに、前記中間表現型が予測される、
請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記予測モデルが、前記高感受性表現型対前記耐性表現型および中間表現型の第１の予測モデルと、前記耐性表現型対前記高感受性表現型および中間表現型の第２の予測モデルと、前記中間表現型対前記高感受性表現型および耐性表現型の第３の予測モデルとを含み、前記第１、第２、および第３の予測モデルが独立して学習される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記抗菌剤の前記異なる濃度が、高感受性ブレークポイント濃度と耐性ブレークポイント濃度とを含む範囲を規定する、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記抗菌剤の前記異なる濃度が、それぞれ、前記高感受性ブレークポイント濃度および前記耐性ブレークポイント濃度にある、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記抗菌剤の前記異なる濃度が、少なくとも３つの濃度、より具体的には、少なくとも４つの濃度を含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記抗菌剤の前記異なる濃度のうちの少なくとも１つが、前記高感受性ブレークポイント濃度未満である、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記学習段階において、
前記抗菌剤の前記異なる濃度を含む異なる濃度の第１のセットを選択し、異なる濃度の前記第１のセットのすべての濃度を用いてステップｂ．からｆ．を実行するステップと、
前記生成された特徴ベクトルおよび感受性表現型の前記デジタルセットに基づいて、前記抗菌剤に対する前記感受性表現型の予測モデルを学習するステップであって、前記学習するステップが、前記予測モデルの精度と前記予測モデルの複雑さとをトレードオフするＬ１正則化最適化問題を使用して実行され、前記抗菌剤の前記異なる濃度が、前記Ｌ１正則化最適化問題によって放棄されない濃度の前記第１のセットの濃度である、ステップと
による、前記抗菌剤の前記異なる濃度の選択を含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
前記抗菌剤の前記異なる濃度を含む異なる濃度の第１のセットを選択し、異なる濃度の前記第１のセットのすべての濃度を用いてステップｂ．からｆ．を実行するステップと、
前記生成された特徴ベクトルおよび感受性表現型の前記デジタルセットに基づいて、前記抗菌剤に対する前記感受性表現型の予測モデルを学習するステップであって、前記学習するステップが、前記予測モデルの精度と前記予測モデルの複雑さとをトレードオフするＬ１正則化最適化問題を使用して実行され、前記抗菌剤の前記異なる濃度が、前記Ｌ１正則化最適化問題によって放棄されない濃度の前記第１のセットの濃度である、ステップと
による、前記抗菌剤の前記異なる濃度の選択を含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記Ｌ１正則化最適化問題がＬ１正則化ロジスティック回帰である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記微生物のセットの前記微生物が、異なる種および／または属に属する、請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
高感受性表現型、中間表現型、および耐性表現型の中から、抗菌剤に対する試験微生物の感受性表現型を予測するための方法であって、
ａ．前記試験微生物の集団と、前記試験微生物を標的とする生存性蛍光マーカーと、異なる濃度の前記抗菌剤とを含む液体試料を調製するステップと、
ｂ．前記試験微生物の各試料について、フローサイトメータによって、前記試料中の前記試験微生物の前記集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するステップと、
ｃ．コンピュータユニットによって、前記試験微生物について取得された値の前記セットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップと、
ｄ．予測モデルを記憶するコンピュータユニットによって、前記モデルを前記試験微生物の前記特徴ベクトルに適用することによって、前記試験微生物の前記感受性表現型を予測するステップと
を含み、
前記予測モデルが請求項２から１１のいずれか一項に記載の学習段階に従って学習される、ステップと
を含む方法。
ａ．前記試験微生物の集団と、前記試験微生物を標的とする生存性蛍光マーカーと、異なる濃度の前記抗菌剤とを含む液体試料を調製するステップと、
ｂ．前記試験微生物の各試料について、フローサイトメータによって、前記試料中の前記試験微生物の前記集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するステップと、
ｃ．コンピュータユニットによって、前記試験微生物について取得された値の前記セットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップと、
ｄ．予測モデルを記憶するコンピュータユニットによって、前記モデルを前記試験微生物の前記特徴ベクトルに適用することによって、前記試験微生物の前記感受性表現型を予測するステップと
を含み、
前記予測モデルが請求項２から１１のいずれか一項に記載の学習段階に従って学習される、ステップと
を含む方法。
【請求項13】
取得された前記分布が蛍光分布であり、前記座標値が蛍光値である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記所定の割合が、７０％を超え、好ましくは、７５％、９０％、９５％、または９９％に等しい、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記抗菌剤が抗生物質であり、前記微生物が細菌である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
高感受性表現型、中間表現型、および耐性表現型の中から、抗菌剤に対する試験微生物の感受性表現型を予測するためのシステムであって、
液体試料中の前記試験微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するためのフローサイトメータであって、前記試料が前記試験微生物を標的とする生存性蛍光マーカーと、異なる濃度の前記抗菌剤とを含む、フローサイトメータと、
請求項２から１１のいずれか一項に記載の学習段階に従って学習された予測モデルを記憶し、
前記試験微生物について取得された値の前記セットに基づいて特徴ベクトルを生成し、
前記予測モデルを前記試験微生物の前記特徴ベクトルに適用することによって前記試験微生物の前記感受性表現型を予測する
ように設定されたコンピュータユニットと
を備えるシステム。
液体試料中の前記試験微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するためのフローサイトメータであって、前記試料が前記試験微生物を標的とする生存性蛍光マーカーと、異なる濃度の前記抗菌剤とを含む、フローサイトメータと、
請求項２から１１のいずれか一項に記載の学習段階に従って学習された予測モデルを記憶し、
前記試験微生物について取得された値の前記セットに基づいて特徴ベクトルを生成し、
前記予測モデルを前記試験微生物の前記特徴ベクトルに適用することによって前記試験微生物の前記感受性表現型を予測する
ように設定されたコンピュータユニットと
を備えるシステム。
【請求項17】
コンピュータによって実施される方法を実行するための命令を記憶するコンピュータ可読媒体であって、前記方法が、高感受性表現型、中間表現型、および耐性表現型の中からの、抗菌剤に対する試験微生物の感受性表現型の予測を含み、前記予測が、
試験微生物について取得された値のセットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップであって、前記セットが、フローサイトメータによって取得された液体試料中の前記試験微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む、ステップと、
予測モデルを前記試験微生物の前記特徴ベクトルに適用することによって前記試験微生物の前記感受性表現型を予測するステップと
を含み、
前記予測モデルが、請求項２から１１のいずれか一項に記載の学習段階に従って学習される、コンピュータ可読媒体。
試験微生物について取得された値のセットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップであって、前記セットが、フローサイトメータによって取得された液体試料中の前記試験微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む、ステップと、
予測モデルを前記試験微生物の前記特徴ベクトルに適用することによって前記試験微生物の前記感受性表現型を予測するステップと
を含み、
前記予測モデルが、請求項２から１１のいずれか一項に記載の学習段階に従って学習される、コンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フローサイトメトリを使用する抗菌剤に対する微生物の感受性、具体的には、抗生物質に対する細菌の感受性の予測に関する。
【背景技術】
【0002】
それ自体知られているように、２つの臨界濃度、または「ブレークポイント」が抗菌剤に対して規定され、微生物について測定された最小発育阻止濃度（「ＭＩＣ：ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」）が第１のブレークポイントよりも低い場合、微生物は、前記薬剤に対して高感受性であり、測定されたＭＩＣが第２のブレークポイントよりも高い場合、微生物は、前記薬剤に対して耐性であり、測定されたＭＩＣが中間にある場合、微生物は、前記薬剤に対して中間にある。微生物のＭＩＣを評価し、次いで、抗菌剤に対するその感受性表現型を評価するために実験室で現在使用されるゴールドスタンダードな方法は、通常、増殖阻止の測定に基づく。これらの技法は、微量液体希釈参照法（ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏ−ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）、ならびに、いくつか例を挙げると、Ｅｔｅｓｔ（登録商標）、ディスク拡散、寒天希釈、またはＶＩＴＥＫ２（登録商標）機器のような手動のまたは自動化された代替方法を含む。
【0003】
過去数十年にわたり、初期の細菌生理学的変化がフローサイトメトリ（「ＦＣＭ」）または顕微鏡的／画像化ベースの技法を使用する多数の市販の蛍光マーカーによって視覚化され得ることを研究が示している［１〜５］。よく知られているように、フローサイトメトリは、基本的に、レーザビームを個々に通過する整列された粒子（たとえば、微生物）を運ぶ液体流を生成することと、粒子の各々の前記ビームに対する光学応答、すなわち、蛍光、その前方散乱光、およびその側方散乱光を測定することからなる。特に、ＦＣＭベースの単細胞分析は、抗生物質との接触時の細胞数［６〜１０］および平均蛍光強度［１１、１２］の高速モニタリングを可能にし得る。細胞形態、サイズ、光散乱、および自己蛍光特性における他の抗生物質誘発性変化も、文献［１３〜１５］において以前に報告されているように、ＦＣＭによって検出され得る。最近の特許出願では、細胞増殖の測定を通しての抗生物質高感受性プロファイルの調査が提案されているが、表現型間の判別閾値を規定するためのロバストな分析方法は記載されていない［１６］。これまで、高感受性集団と耐性集団とを区別するために、主に分布平均の比に基づく弱い定量的または任意の閾値のみが使用されてきた。加えて、抗菌剤に対する反応の複雑さに対処するために、蛍光データおよび散乱データのような異なるシグネチャを組み合わせるための努力は、ほとんどなされていない。したがって、高速な抗生物質高感受性試験（「ＡＳＴ：ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ」）のためのＦＣＭの値を示す多くの試みにもかかわらず、ロバストな抗生物質高感受性予測アルゴリズムを構築するためにＦＣＭデータ情報を最大限に利用するロバストな戦略は、依然として欠けている。
【0004】
たとえば、特許出願ＷＯ２０１２／１６４５４７Ａ１［１７］は、ブレークポイント濃度の使用に基づく方法を説明している。簡単に言うと、抗生物質の存在下での高速な培養の後、細菌は、蛍光マーカーを用いて標識され、ＦＣＭによって分析される。染色指数（「ＳＩ：ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎｄｅｘ」）とも呼ばれる、抗生物質処理された細胞と未処理細胞との間の平均蛍光強度（「ＭＦＩ：ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」）の比は、高感受性参照ブレークポイント濃度と耐性参照ブレークポイント濃度の両方について計算される。たとえば、生細胞を標識する蛍光マーカーが使用される場合、感受性株は、抗生物質で処理されたとき、低いＭＦＩ値を示すと予想される。したがって、解釈は以下のようになり、すなわち、ａ）高感受性参照ブレークポイントにおいてＳＩ＜１の場合、株は、抗生物質に対して高感受性であると予測され、ｂ）耐性参照ブレークポイントにおいてＳＩ≧１である場合、株は、耐性であると予測される。反対に、細胞損傷を標識する蛍光マーカーが使用される場合、高感受性株は、高い蛍光値を示すと予測される。その結果、解釈は以下のようになり、すなわち、ａ）高感受性参照ブレークポイントにおいてＳＩ＞１の場合、株は、高感受性株であると予測され、ｂ）耐性参照ブレークポイントにおいてＳＩ≦１の場合、株は、耐性であると予測される。
【0005】
他の研究も同様の手法を使用している［１１］。この方法の主な欠点は、異種集団の小部分から発生する信号を過小評価またはマスクする可能性がある平均分布のみであるＭＦＩ値にのみ基づくことである。加えて、ブレークポイント濃度は、増殖阻止に基づく参照方法によって規定される。しかしながら、それらは、ＦＣＭによって検出される初期変化と必ずしも相関しない。これに関して、他の研究は、亜阻止濃度［６］、ＭＩＣ値を超える濃度［１８、１９］、または高感受性ブレークポイントのみに対応する濃度［１２］を使用して抗生物質の効果を調べている。したがって、ブレークポイント濃度のみに焦点を合わせることによって、他の濃度に関する重要な情報が失われる可能性がある。他の研究は、集団のよりよい識別のために二次元分析に焦点を合わせてきた。実際、二重標識化［１２］の場合、散乱対蛍光［２０、２１］または蛍光１対蛍光２を表す二重パラメータ行列は、集団間の微妙な差異を強調することができる。したがって、識別カットオフ値は、抗生物質との接触時に２Ｄ行列の特定の領域に入る細胞の数または割合から計算される。しかしながら、これらの領域は、しばしば定性的に選択され、それによって、方法のロバスト性を低下させる。最近、適応的にビニングされた散乱標識および蛍光標識の３Ｄ分析に基づくイニシアチブが公開された［１］。現在まで、これは、ＡＳＴのための予測アルゴリズムを構築するためのＦＣＭデータの詳細な処理を示す最先端の研究である。以下にリスト化するように、この方法は、以前の戦略に対していくつかの利点を有し、ａ）ＭＦＩ値と比較して、ビニングされたデータの使用は、上記で論じたように微細な変動の明確な補足を可能にすることができ、ｂ）最も高い分散次元へのビニング戦略の適応は、集団からの最も重要な情報の選択を可能にし、ｃ）３Ｄ多次元分析は、抗生物質誘発性変化のより包括的な調査のために前方散乱、側方散乱、および蛍光データを組み合わせる。しかしながら、この方法は、いくつかの理由のためにロバストな分析を提供できない場合があり、すなわち、− この研究では、著者らは、１／１６×ＭＩＣ濃度における抗生物質で処理された高感受性株を使用して９９％の信頼度における識別閾値を規定している。バーは、高感受性表現型に対してかなり低く設定されているが、それらの予測モデルは、耐性表現型を含まない。実際に、１つの耐性株は、高感受性株を使用して構築された予測モデルを検証するためにのみ使用された。したがって、表現型間の比較を含む識別戦略は、提案されていない。
− 著者らは、中間表現型の検出を説明していない。
− 彼らの予測モデルの潜在的な応用のために、著者らは、彼らの高感受性モデル株のＭＩＣ濃度の使用を提案する。この抗生物質濃度は、より高いＭＩＣ値を示した別の株の感受性プロファイルを明確に検出するのに十分ではなかったので（たとえば、ゲンタマイシン）、この方法は、ロバストではないように思われる。したがって、この文献は、特定の濃度を使用する予測モデルの開発、および異なる濃度を使用する方法の検証について、なにも説明していない。
− この研究で提案された予測モデルは、単一の高感受性株に基づく。株、表現型、ＭＩＣ値などに依存する抗生物質に対する応答の不均一性のため、彼らの方法のロバスト性は、検証することができない。
【0006】
高速な抗生物質高感受性試験（「ＡＳＴ」）についてのＦＣＭにおける多数の研究にもかかわらず、抗菌剤に対する微生物の感受性をロバストな方法で予測する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0007】
特に、ＭＦＩ法は、抗菌剤の微細な影響をロバストに定量化することができない。本発明は、そのような影響のロバストな定量化を提案することを目的とする。
【0008】
この目的のため、本発明の第１の目的は、抗菌剤の濃度に対する試験微生物の感受性を定量化するための方法であって、− 試験微生物の集団と試験微生物を標的とする生存性蛍光マーカーとを含む２つの液体試料を調製するステップであって、前記液体試料のうちの１つが前記濃度の抗菌剤を含み、前記液体試料のうちの他方が抗菌剤を含まない、ステップと、
− 試験微生物の前記試料の各々について、フローサイトメータによって、前記試料内の微生物の集団の蛍光分布または前方散乱分布または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するステップと、
− 前記試料の各々について、
○ 取得された分布の主モードに対応する第１の座標値、および第１の座標値よりも大きい値について取得された分布の第１の面積と、
○ 前記第１の座標値と第２の座標値との間について取得された分布の第２の面積が５０％を超える第１の面積の所定の割合に等しい、前記第１の座標値よりも大きい前記第２の座標値と
を計算するステップと、
− 関係、すなわち、
を含む方法である。
【0009】
言い換えれば、液体試料中に含まれる微生物の集団の一部のみに影響を与える特定の抗菌剤について観測することができるので、比Ｑは、取得された分布の不均一プロファイルを捉えることができる。特に比Ｑが１から逸脱するほど、微生物は、抗菌剤に対してより感受性になる。ＭＦＩ法によれば、試験された微生物は、抗菌剤に対して耐性であると決定されるが、本発明によれば、前記微生物は、感受性であると決定される。
【0010】
本発明は、高速かつロバストな、フローサイトメトリによって抗菌剤に対する微生物の感受性、中間、または耐性の表現型を予測するための方法およびシステムを提供することも目的とする。
【0011】
この目的のため、本発明の第２の目的は、高感受性表現型、中間表現型、および耐性表現型の中から、抗菌剤に対する試験微生物の感受性表現型を予測するための方法であって、Ａ．以下のステップ、すなわち、
ａ．前記表現型が抗菌剤の高感受性ブレークポイント濃度および耐性ブレークポイント濃度に基づいて決定された、高感受性表現型微生物と、中間表現型微生物と、耐性表現型微生物とを含む微生物のセットを選択し、微生物の前記セットの感受性表現型のデジタルセットを生成するステップと、
ｂ．微生物のセットの各微生物について、前記微生物の集団と、前記微生物を標的とする生存性蛍光マーカーと、抗菌剤とを含む液体試料を調製するステップであって、前記液体試料が少なくとも２つの異なる濃度の抗菌剤を含む、ステップと、
ｃ．各試料について、フローサイトメータによって、前記試料内の微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するステップと、
ｄ．微生物のセットの各微生物について、コンピュータユニットによって、前記微生物について取得された値のセットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップであって、特徴ベクトルの生成が、抗菌剤の異なる濃度の各々について、
− 取得された分布の主モードに対応する第１の座標値と、第１の座標値よりも大きい値に関する取得された分布の第１の面積とを計算するステップと、
− 前記第１の座標値と第２の座標値との間の取得された分布の第２の面積が５０％を超える第１の面積の所定の割合に等しい、前記第１の座標値よりも大きい前記第２の座標値を計算するステップと、
− 関係、すなわち、
を含む、ステップと、
ｅ．コンピュータユニットによって、生成された特徴ベクトルおよび感受性表現型のデジタルセットに基づいて、抗菌剤に対する感受性表現型の予測モデルを学習するステップと、
を含む学習段階と、
Ｂ．以下のステップ、すなわち、
ｆ．試験微生物の集団と、生存性蛍光マーカーと、異なる濃度における抗菌剤とを含む液体試料を調製するステップと、
ｇ．試験微生物の各試料について、フローサイトメータによって、ステップｃ）において取得された値のセットに対応する値のデジタルセットを取得するステップと、
ｈ．コンピュータユニットによって、試験微生物について取得された値のセットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップであって、前記特徴ベクトルがステップｄ）の特徴ベクトルに対応する、ステップと、
ｉ．予測モデルを記憶するコンピュータユニットによって、前記モデルを試験微生物の特徴ベクトルに適用することによって、試験微生物の感受性表現型を予測するステップと
を含む予測段階と
を含む方法である。
【0012】
言い換えれば、予測モデルは、それらの表現型に関して多様性を有する、有利には、グラム／種／属に関して大きい多様性を有する微生物、抗菌剤の濃度、および抗菌剤に対する応答に由来するデータの学習セットに基づく。高感受性表現型／中間表現型／耐性表現型の中から表現型感受性を直接決定するロバスト予測モデルは、未知の微生物、たとえば、細菌のフローサイトメトリ測定に由来し得る。
【0013】
一実施形態によれば、− 予測モデルは、高感受性表現型対耐性表現型および中間表現型の第１の予測モデルと、耐性表現型対高感受性表現型および中間表現型の第２のモデルとを含み、第１および第２の表現型モデルは、独立して学習され、
− 中間表現型は、第１の予測モデルが高感受性表現型を予測しないとき、および第２の予測モデルが耐性表現型を予測しないときに予測される。
【0014】
別の実施形態によれば、予測モデルは、高感受性表現型対耐性表現型および中間表現型の第１の予測モデルと、耐性表現型対高感受性表現型および中間表現型の第２のモデルと、中間表現型対高感受性表現型および耐性表現型の第３の予測モデルとを含み、前記第１、第２、および第３の予測モデルは、独立して学習される。
【0015】
一実施形態によれば、抗菌剤の異なる濃度は、高感受性ブレークポイント濃度と耐性ブレークポイント濃度とを含む範囲を規定する。
【0016】
一変形形態によれば、抗菌剤の異なる濃度は、それぞれ、高感受性ブレークポイント濃度および耐性ブレークポイント濃度にある。別の変形形態では、抗菌剤の異なる濃度は、少なくとも３つの濃度、より具体的には、少なくとも４つの濃度を含む。
【0017】
一実施形態によれば、抗菌剤の異なる濃度のうちの少なくとも１つは、高感受性ブレークポイント濃度未満である。
【0018】
一実施形態によれば、方法は、学習段階において、− 抗菌剤の異なる濃度を含む異なる濃度の第１のセットを選択し、異なる濃度の前記第１のセットのすべての濃度を用いてステップｂ）からｆ）を実行するステップと、
− 生成された特徴ベクトルおよび感受性表現型のデジタルセットに基づいて、抗菌剤に対する感受性表現型の予測モデルを学習するステップであって、前記学習することが、予測モデルの精度および予測モデルの複雑さをトレードオフするＬ１正則化最適化問題を使用して実行され、抗菌剤の異なる濃度が、Ｌ１正則化最適化問題によって放棄されない濃度の第１のセットの濃度である、ステップと
による、抗菌剤の異なる濃度の選択を含む。
【0019】
具体的には、Ｌ１正則化最適化問題は、Ｌ１正則化ロジスティック回帰である。
【0020】
一実施形態によれば、値のデジタルセットは、定義済みの蛍光範囲にわたる蛍光分布を含み、特徴ベクトルは、定義済みの蛍光範囲の一部分にわたる蛍光分布のヒストグラムを含む。
【0021】
一実施形態によれば、値のデジタルセットは、定義済みの側方散乱値範囲にわたる側方散乱分布を含み、特徴ベクトルは、定義済みの側方散乱値範囲の一部分にわたる側方散乱分布のヒストグラムを含む。
【0022】
一実施形態によれば、値のデジタルセットは、定義済みの前方散乱値範囲にわたる前方散乱分布を含み、特徴ベクトルは、定義済みの前方散乱値範囲の一部分にわたる前方散乱分布のヒストグラムを含む。
【0023】
具体的には、定義済みの割合は、７０％を超え、好ましくは、７５％、９０％、９５％、または９９％に等しい。
【0024】
一実施形態によれば、微生物のセットの微生物は、異なる種および／または属に属する。
【0025】
一実施形態によれば、抗菌剤は、抗生物質であり、微生物は、細菌である。
【0026】
本発明の別の目的は、高感受性表現型、中間表現型、および耐性表現型の中から、抗菌剤に対する試験微生物の感受性表現型を予測するための方法であって、ａ．試験微生物の集団と、試験微生物を標的とする生存性蛍光マーカーと、異なる濃度の抗菌剤とを含む液体試料を調製するステップと、
ｂ．試験微生物の各試料について、フローサイトメータによって、前記試料中の試験微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するステップと、
ｃ．コンピュータユニットによって、試験微生物について取得された値のセットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップと、
ｄ．予測モデルを記憶するコンピュータユニットによって、前記モデルを試験微生物の特徴ベクトルに適用することによって、試験微生物の感受性表現型を予測するステップであって、予測モデルが上記で説明したように学習段階に従って学習される、ステップと
を含む方法である。
【0027】
本発明の別の目的は、高感受性表現型、中間表現型、および耐性表現型の中から、抗菌剤に対する試験微生物の感受性表現型を予測するためのシステムであって、− 液体試料中の試験微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む値のデジタルセットを取得するためのフローサイトメータであって、前記試料が試験微生物を標的とする生存性蛍光マーカーと、異なる濃度の抗菌剤とを含む、フローサイトメータと、
● 上記で説明したように学習段階に従って学習された予測モデルを記憶し、
● 試験微生物について取得された値のセットに基づいて特徴ベクトルを生成し、
● 予測モデルを試験微生物の特徴ベクトルに適用することによって試験微生物の感受性表現型を予測する
ように設定されたコンピュータユニットと
を備えるシステムである。
【0028】
本発明の別の目的は、コンピュータによって実行される方法を実行するための命令を記憶するコンピュータ可読媒体であって、方法は、高感受性表現型、中間表現型、および耐性表現型の中からの、抗菌剤に対する試験微生物の感受性表現型の予測を含み、前記予測は、− 試験微生物について取得された値のセットに基づいて特徴ベクトルを生成するステップであって、前記セットが、フローサイトメータによって取得された液体試料中の試験微生物の集団の蛍光分布および／または前方散乱分布および／または側方散乱分布を含む、ステップと、
− 予測モデルを試験微生物の特徴ベクトルに適用することによって試験微生物の感受性表現型を予測するステップと
を含み、
予測モデルは、上記で説明したように学習段階に従って学習される。
【0029】
本発明は、添付図面に関連して、以下の非限定的な説明からよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】本発明によるフローサイトメトリシステムの概略図である。
【図2】ＡおよびＢは、本発明による学習段階のフローチャートである。
【図3】試料調製を詳述する本発明によるＦＣＭ−ＡＳＴプロトコルのフローチャートである。
【図4】集団分布プロファイル、および特徴ベクトルを生成するために使用される方法の概略図である。
【図5】表現型予測モデルを構築するために使用される表現型識別戦略の概略図である。
【図6】ゲンタマイシンに対するそれらのＭＩＣに従った株のパネルの概略図である。
【図7】ゲンタマイシンで処理された株の蛍光分布プロファイルの概略図である。
【図8】１Ｄ蛍光予測モデルの性能の概略比較の図である（クオンタイル対ＭＦＩ）。
【図9】セフタジジムに対するそれらのＭＩＣに従った株のパネルの概略図である。
【図10】生成された予測モデルの数を示す表である。
【図11】セフタジジムに対する識別戦略の概略比較の図である。
【図12】セフタジジムに対する予測モデルの分類の表である。
【図13】３Ｄ予測モデル（ＧＳ）およびＶＩＴＥＫ２の性能の概略比較の図である。
【発明を実施するための形態】
【0031】
他に明示的に述べられていない限り、より大きいことは、より大きいかまたは等しいことを意味し、より少ないことは、より少ないかまたは等しいことを意味する。
【0032】
図１を参照すると、フローサイトメトリシステム１０は、フローサイトメータ１２と、予測モデルを学習するためおよび／または抗菌剤に対する微生物の感受性表現型を予測するために、フローサイトメータ１２によって出力されたデータを処理するためのコンピュータユニット１４とを備える。フローサイトメータ１２は、流体システムと、少なくとも１つの光源と、励起光学系と集光光学系とを備える光学システムと、電子システムとを備える。流体システムは、光源のビームが交差するインテロゲーションポイント（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）に液体試料の微生物を１つずつ輸送するように設計される。この時点で、光は、微生物によって散乱および屈折され、光散乱は、それらが検出器によって収集される２つの角度において光学システムによって収集され、すなわち、光源の方向における回折光の測定値である「前方散乱」（ＦＳＣ）、および光ビームから約９０°で収集される「側方散乱」（ＳＳＣ）が収集される。さらに、光源は、微生物の蛍光も光学システムを介して検出器によって取得されるように、蛍光色素を励起するように設計される。液体試料中に含まれる微生物の集団について、ＦＳＣ分布、ＳＳＣ分布および蛍光分布が取得され、フローサイトメータ動作も駆動する電子システム内に記憶される。フローサイトメトリは、よく知られており、さらには詳述されない。たとえば、フローサイトメータは、Ｐａｒｔｅｃ ＧｍｂＨからの「Ｃｙｆｌｏｗ（登録商標）Ｓｐａｃｅフローサイトメータ」である。ＦＳＣ、ＳＳＣ、および蛍光分布は、フローサイトメータ１２によって生成された分布のデジタル処理を実施するように設定される、コンピュータユニット１４、たとえば、パーソナルコンピュータ、タブレット、スマートフォン、サーバ、ならびに、より一般的には、１つもしくは複数のマイクロプロセッサおよび／または１つもしくは複数のマイクロコントローラ、たとえば、デジタル信号プロセッサ、および／またはもう１つのプログラマブル論理デバイスを備える任意のシステムに通信される。コンピュータユニット１４は、取得された分布と、本発明による方法を実行するための命令と、中間計算および最終計算、特に、微生物の抗生物質感受性とを記憶するためのコンピュータメモリ（ＲＡＭ、ＲＯＭ、キャッシュメモリ、大容量メモリ）を備える。コンピュータユニットは、前記感受性をユーザに対して表示するための画面をさらに備える。コンピュータユニットは、フローサイトメータの電子システムとは異なるエンティティとして説明されているが、コンピュータユニットおよび電子システムは、唯一のユニットによって実施され得る。
【0034】
学習段階は、異なる既知の株、具体的には、高感受性表現型（Ｓ）株、中間表現型（Ｉ）株、および耐性表現型（Ｒ）株のセットのＦＳＣ、ＳＳＣ、および蛍光分布における抗生物質感受性表現型パターンを決定することを目的とし、各株の抗生物質に対する感受性表現型は、既知であり、たとえば、ＥＵＣＡＴまたはＣＬＳＩ命名法に従って決定される。有利には、パターンは、可能な限り株から独立しているように決定される。この目的のため、株のセットは、異なる種および／または属からの１００を超える株を含む。
【0035】
学習段階は、したがって、２０において、前記株のセット｛Ｓ１，．．．，Ｓｎ｝（ここでｎは株の数）の選択と、コンピュータユニット１４においてそれらの感受性表現型を、たとえば、デジタル表現型ベクトル（Ｐ１．．．ＰＮ）の形式における表現型を記憶することとによって開始し、ここで、∀ｉ∈［１，ｎ］、Ｐｉは、抗生物質に対する株Ｓｉの感受性表現型であり、すなわち、Ｐｉ＝Ｒ（耐性）、Ｉ（中間）、またはＳ（高感受性）である。抗生物質の抗生物質ブレークポイントＢＰＳ（高感受性ブレークポイント）およびＢＰＲ（耐性ブレークポイント）。
【0036】
次のステップ２２において、異なる濃度｛Ｃ１，．．．，Ｃｍ｝の抗生物質を有する液体試料が、選択された株Ｓｉの各々について調製され、ここで、Ｃ１＝０（抗生物質なし）であり、ｍ＞２は、抗生物質の非ヌル濃度の数である。前記濃度は、コンピュータユニット１４内に記憶される。具体的には、図３に示すように、株の細菌コロニーが増殖され、接種材料を作製するために使用される。１８０ｒｐｍで振盪しながら３５℃において２時間増殖させた後、得られた対数期の細菌培養物は、０．５ＭｃＦにおいて正規化され、異なる濃度｛Ｃ１，．．．，Ｃｍ｝における抗菌剤を補充されたマイクロタイタープレートのウェルに接種するために使用される。３５℃における１時間のインキュベーション後、膜脱分極蛍光マーカー、たとえば、「ＤｉＢＡＣ４（３）」としても知られる（ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）トリメチンオキソノール）が、０．５μｇ／ｍｌの最終濃度においてウェルに添加される。次いで、３５℃におけるマーカーとの追加の１５分のインキュベーションが行われる。濃度｛Ｃ１，．．．，Ｃｍ｝は、範囲［ＢＰＳ，ＢＰＲ］が非ヌル濃度の範囲［Ｃ２，Ｃｍ］に含まれるか、またはそれに等しくなるように選択される。
【0037】
ステップ２４において、フローサイトメータ１２によって各試料についてＦＣＭ取得が実行され、対応するＦＳＣ、ＳＳＣ、および蛍光分布がコンピュータユニット１４内に記憶される。各株Ｓｉについて、および各濃度Ｃｊについて、ＦＳＣ分布「ＦＳＣｉ，ｊ」、ＳＳＣ分布「ＳＳＣｉ，ｊ」、および蛍光分布「Ｆｌｉ，ｊ」が、このようにして、コンピュータユニット１４内に、たとえば、デジタルベクトルの形式で記憶される。
【0038】
２６において、分布｛ＦＳＣｉ，ｊ，ＳＳＣｉ，ｊ，Ｆｌｉ，ｊ｝の各セットについて少なくとも１つの特徴ベクトルＸｉ，ｊを生成するために、コンピュータユニット１４によって前記分布の処理が実行される。生成された特徴ベクトルＸｉ，ｊは、抗生物質とのインキュベーションに続いて細菌集団内に生じる変化を定量化し、後に説明するように表現型パターンを見つけるためにデジタル表現型ベクトル（Ｐ１．．．ＰＮ）と組み合わされる。具体的には、３つの方法、すなわち、平均蛍光強度（ＭＦＩ）法、ビニング法、およびクオンタイル（ＱＴ）法に基づく特徴ベクトル。図４は、集団分布プロファイル、および特徴ベクトルを生成するために使用される方法の概略図である。図４において、「ＡＴＢ」は、非ヌル濃度の抗生物質（Ｃｊ＞ｉ）を有する試料を指し、「ｎｏＡＴＢ」は、抗生物質のない（Ｃ１）試料を指す。
【0039】
平均蛍光強度法では、図４Ｅに示すように、特徴ベクトルＸｉ，ｊは、関係、すなわち、【0040】
図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃにおいて、モノパラメトリックヒストグラムは、抗生物質で処理された細菌集団および未処理の細菌集団について観察された３つの主な蛍光分布を示す。未処理の集団の分布と比較したとき、抗生物質で処理された細菌は、まったくないもしくはわずかな蛍光シフト（Ａ）、集団全体の蛍光シフト（Ｂ）、または集団の１つの小さい部分のみの蛍光シフト（Ｃ）のいずれかを示す。特徴ベクトルＸｉ，ｊが１と異なるほど、株は、抗生物質に対してより感受性である。ＳＳＣおよびＦＳＣについても同様の分布プロファイルが観察され得る（図示せず）。
【0041】
ビニング法は、バイパラメトリックＦＳＣ−ＳＳＣ分布、および蛍光、ＦＳＣ、およびＳＳＣのモノパラメトリック（「１Ｄ」）分布に対して実行される。具体的には、分布（たとえば、蛍光）の範囲は、間隔、または「ビン」に分割され、各ビンにおける分布の強度は、合計、または「ビニング」される。たとえば、図４Ｄを参照すると、バイパラメトリック（「２Ｄ」）ドットプロットは、処理された細菌集団と未処理の細菌集団との間の散乱プロファイルの差を示す。この図では、５×５（２５ビン）のグリッドが２Ｄプロットに適用される。各ビンにおけるイベントの数は、特徴ベクトルとして規定される値のセットを生成するために記録される。ビニングは、この例において示すようにバイパラメトリックＦＳＣ−ＳＳＣ分布に対して、ならびに、蛍光、ＦＳＣ、およびＳＳＣのモノパラメトリック分布に対して実行される。より正確には、これらのベクトルは、以下のようにして得られ、すなわち、− １ＤのＳＳＣまたはＦＳＣ分布のビニング：信号のダイナミックレンジ（たとえば、［１，１００００］）は、対数目盛において５、１０、２０、または４０のビンにカットされる。各ビンに入るイベントの割合は、次いで、分布全体を表すために使用された。
− ２ＤのＳＳＣ／ＦＳＣ分布のビニング：同じ手順が２つの散乱信号によって規定される二次元空間に適用され、したがって、二次元空間は、５×５＝２５、１０×１０＝１００、２０×２０＝４００、または４０×４０＝１６００ビンに離散化される。
− １Ｄ蛍光信号のビニング：そのモードよりも上（すなわち、非ヌル強度における主なｐｉｃよりも上）である分布の一部のみが考慮されるということを注目すべき例外として、１Ｄ散乱信号に関するものと同じ手順が適用される。蛍光分布が、その振幅が大きく変動する可能性があるヌル強度においてピークを示し、したがって、ビニング表現に有害である可能性があるので、分布の残りの部分は、考慮されない。
【0042】
クオンタイル法では、図４Ｆに示すように、クオンタイルのセットの各クオンタイルにおける蛍光値の比が、以下、すなわち、【0043】
クオンタイル法は、抗生物質との接触時の集団の蛍光分布における微細な変化のより効率的な検出を可能にするように設計される。実際に、抗生物質で処理された所与の株について、観察され得る３つの主な分布プロファイルが図４において表されている。集団の小さい部分のみが強い蛍光を示す異種蛍光分布（図４Ｃおよび図４Ｆ）では、信号が非蛍光集団によって支配されるので、ＭＦＩ法は、適切ではない場合がある。この場合、クオンタイル法は、小さい集団から生じる信号を捕捉することを可能にし得る。
【0044】
したがって、１つの濃度の抗生物質で処理された所与の株について、以下の特徴ベクトル、すなわち、− １Ｄ蛍光分布（ビニングデータ）から得られる４セットの値、
− １ＤのＳＳＣ分布（ビニングデータ）から得られる４セットの値、
− １ＤのＦＳＣ分布（ビニングデータ）から得られる４セットの値、
− ２ＤのＦＳＣ−ＳＳＣ分布（ビニングデータ）に対応する４セットの値、
− ＭＦＩの１つの比、
− クオンタイルＱの４つの比、ならびに、
− ２ＤのＦＳＣ−ＳＳＣ分布および１Ｄ蛍光分布の組合せ（３Ｄモデル、ビニングデータ）から得られる１６セットの値
がコンピュータユニット１４によって生成される。
【0045】
学習段階の次のステップ２８において、コンピュータユニットは、濃度セット｛Ｃ１，．．．，Ｃｍ｝の中から、表現型予測に最も関連性のある濃度を選択する。この目的のため、ユニット１４は、具体的には、後に説明するように、Ｌ１正則化最適化問題に基づく教師あり学習を使用して、生成された特徴ベクトルＸｉ，ｊおよび表現型のベクトル（Ｐ１．．．ＰＮ）に基づいて、感受性表現型の少なくとも１つの適応予測モデルを学習する。具体的には、Ｌ１正則化問題は、予測モデルの精度とモデルの複雑さとの間でトレードオフする。濃度の数を減らすことは、未知の株の表現型予測の間の試料調製、フローサイトメトリ取得、およびデータ処理を短縮する。
【0046】
選択された濃度または全体のセット｛Ｃ１，．．．，Ｃｍ｝に基づいて、コンピュータユニット１４は、ステップ３０において、具体的には、教師あり学習、たとえば、サポートベクターマシン（ＳＶＭ：ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ）学習を使用して、生成された特徴ベクトルＸｉ，ｊおよび表現型のベクトル（Ｐ１．．．ＰＮ）に基づいて、感受性表現型の予測モデルを学習する。具体的には、生成された１Ｄ、２Ｄ、および３Ｄ特徴ベクトルのすべては、図５に詳述する３つの異なる表現型識別戦略、すなわち、− ブレークポイントベースの戦略（ＢＰＳ：ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ−ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ）。ＢＰＳ戦略は、それぞれＳ表現型およびＲ表現型を予測する２つの行列に基づく。中間表現型は、それらが２つの行列のいずれにも入らないとき、除去によって予測される。
− グローバル戦略（ＧＳ：ｇｌｏｂａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ）。ＧＳ戦略も、ＳおよびＲについての２つの行列に基づき、中間表現型も、除去によって予測される。ＢＰＳ戦略とは対照的に、ＧＳは、各行列中の２つ以上の抗生物質濃度からのデータを処理することによって予測モデルを構築することができる。
− グローバルマルチクラス戦略（ＧＭＳ：ｇｌｏｂａｌ ｍｕｌｔｉｃｌａｓｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ）。ＧＭＳ戦略は、それぞれＳ表現型、Ｉ表現型、およびＲ表現型を予測する３つの行列に基づく。ＧＳと同様に、ＧＭＳ戦略も、各行列内の２つ以上の抗生物質濃度からのデータを処理することができる。
を使用して処理される。
【0047】
４つの濃度Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４が例示されている図５で説明しているように、（Ａ）ブレークポイントベースの戦略（ＢＰＳ）では、株のＦＣＭ分析に続いて生成された特徴ベクトルは、２つの行列において処理される。第１の行列は、高感受性参照ブレークポイントに対応する濃度の抗生物質との株のインキュベーション後に生成される特徴ベクトル（ＢＰＳに関する特徴ベクトル）を処理する。この行列において、Ｓ表現型をＩ表現型またはＲ表現型と区別するために、カットオフが計算される。第２の行列は、耐性参照ブレークポイントに対応する濃度の抗生物質との株のインキュベーションに続いて生成された特徴ベクトル（ＢＰＲに関する特徴ベクトル）を処理する。この行列において、Ｒ表現型をＳ表現型またはＩ表現型と区別するために、別のカットオフが計算される。第１の行列においてＳとして予測されず、第２の行列においてＲとして予測されない株は、Ｉとして分類される。（Ｂ）グローバル戦略（ＧＳ）も、Ｓ表現型およびＲ表現型をそれぞれ予測する２つの行列に基づく。両方の行列は、調査したすべての濃度（たとえば、Ｃ１からＣ４）の抗生物質との株のインキュベーションに続いて生成された特徴ベクトルを処理する。（Ｃ）グローバルマルチクラス戦略（ＧＭＳ）は、３つの行列に基づく。各表現型は、別個の行列において２つの他の表現型から区別される。この戦略も、調査したすべての抗生物質濃度について生成された特徴ベクトルを処理する。
【0048】
参照微量希釈法によって決定されたＭＩＣ濃度は、特定のプロトコルを使用するＦＣＭによる最も有意な初期変化を誘発する濃度と必ずしも相関しない。これに関して、他のＦＣＭベースの研究は、むしろ、亜阻止濃度［６］またはＭＩＣ値を超える濃度［１８、１９］を使用して抗生物質の効果を調査した。したがって、高感受性ブレークポイント濃度および耐性ブレークポイント濃度を用いてＢＰＳ戦略のみを使用することによって、隣接した抗生物質濃度から生じる重要な情報が見逃される可能性がある。本発明によるグローバル戦略（ＧＳおよびＧＭＳ）において、予測モデルは、もしあれば、表現型間をよりよく区別するのに役立ち得る追加の抗生物質誘発性変化を統合するために、追加の濃度に対して構築される。
【0049】
予測モデルを構築するために、データ表現の性質に応じて２つの異なる戦略が設定され、すなわち、− ＭＦＩまたはクオンタイルベースの指標Ｑによって表される蛍光信号に作用するＢＰＳ戦略について、各微生物は、単一の値によって表され、この値は、それらが異なる抗生物質濃度から計算されたので、Ｓ表現型およびＲ表現型を予測することを担当するモデルを構築するために同じではない。この場合、分類規則は、単純な形式を有し、単にＭＦＩまたはＱに閾値を設定するようになる。この閾値を最適化するために、後に詳述するように、ＲＯＣ曲線分析が使用される。
− すべての他の場合には、各微生物は、いくつかの値（たとえば、ＧＳ戦略およびＧＭＣ戦略に関するいくつかのＭＦＩもしくはＱ値、または、ＢＰＳ戦略、ＧＳ戦略、およびＧＭＣ戦略に関する１つもしくは複数のビニング分布を含むベクトル）によって表された。これらの場合、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムは、後に詳述するように、そのような多次元特徴ベクトルを分類規則に変換する分類規則を学習するためにコンピュータユニットによって実施される。
【0050】
ＢＰＳモデル、ＧＳモデル、およびＧＭＳモデルを構築する手順は、両方の場合で同じであり、すなわち、− ＢＰＳ戦略およびＧＳ戦略について、Ｓ株およびＲ株を識別することを担当する２つのモデルが独立して構築される。両方のモデルは、二項分類モデルであり、第１のモデルは、｛ＩおよびＲ｝株からＳ株を分離しようとするものであり、第２のモデルは、｛ＳおよびＩ｝からＲ株を分離しようとするものである。ＢＰＳ戦略とＧＳ戦略との間の違いは、学習アルゴリズムに提供される情報の量にのみ存在していた。ＢＰＳ戦略に関して、｛Ｒ対Ｓ−Ｉ｝モデルおよび｛Ｓ対Ｒ−Ｉ｝モデルの各々を学習すると考えられる唯一の抗生物質濃度は、関連するブレークポイントに対応したものであった。したがって、これは、各モデルを学習するためにアルゴリズムに提供されたデータが同じではなかったことを意味する。逆に、ＧＳ戦略において、利用可能なすべての抗生物質濃度が各モデルを学習するために考慮される。したがって、これは、各モデルを学習するためにアルゴリズムに提供されたデータが同じであり、ＢＰＳ戦略に提供されたものよりも典型的にはｍ−１倍長く、有利には、ｍ−１＝４（４つの濃度が所与の抗生物質に対して株を特徴付けると考えられる）であることを意味する。
− ＧＭＳ戦略について、Ｒ株、Ｓ株、およびＩ株を直接識別するために、「１対すべて」のＳＶＭマルチクラスモデルが構築される。その目的のため、各々が１つのカテゴリの株を２つの他のカテゴリの株から分離することを担当する３つのモデルが構築される。これは、Ｉ株が除去（ＲにもＳにも分類されなかった株）によって識別される上記の手法とは対照的であった。
【0051】
より効率的な分類規則を構築するために、学習アルゴリズム内に関与するパラメータ、たとえば、多次元信号表現のためのＳＶＭの正則化パラメータ（ときには「Ｃ」と呼ばれる）、受診者動作特性（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線におけるＭＦＩまたはＱ値（単次元表現）において考慮する閾値が最適化される。具体的には、それらのパラメータは、交差検証によって最適化され、その一般的な原理は、以下のように描かれる。− データセットを所定の数Ｋの偶数のサブセット、または「折りたたみ」に分割し、Ｋは、典型的には５または１０に設定される。
− 反復手順を実行し、
○ データのＫのサブセットのうちの１つを残しておき、
○ 最適化するモデルパラメータの異なる値について、（Ｋ−１の）残りのサブセットから分類モデルを学習し、
○ モデルパラメータの異なる値に対応して、異なる候補モデルについて、提出されたサブセットにおける予測を評価する。
− モデルパラメータの異なる候補値についてデータセット全体に対して測定された分類性能を評価し、
− 分類性能を最大化する値を選択する。
【0052】
最終モデルは、次いで、最適なパラメータ値を使用してデータセット全体から構築され、新しい試料に対する予測を行うために使用される。
【0053】
ＢＰＳ、ＧＳ、およびＧＭＣの多次元表現に関与するＳＶＭの正則化パラメータを学習するために、｛１０−４，１０−３．５，１０−３，．．．．，１０３，１０３．５，１０４｝として規定される候補値のグリッドを使用してこの方法を進めた。ＭＦＩおよびＲベースのＢＰＳ戦略の一次元表現の場合、以下のプロセスが実施され、− 候補閾値を規定するために、Ｒ株およびＳ株を残りのものから識別することを担当する２つのモデルの各々についてＲＯＣ曲線が最初に構築され、
− 次いで、｛０．７，０．７５，０．８，０．８５，０．９，０．９５｝の真陽性率（または感受性）に対応する６つの候補閾値が抽出され、陽性クラスは、各モデルによって対象とされるクラス（すなわち、Ｒ株を識別することを担当するモデルにとってＲ、他の１つにとってＳ）に対応する。
【0054】
次のステップ３２において、予測モデルの各々の性能は、その後、ユニット１４によって計算される。具体的には、生成された予測モデルは、交差検証によって評価され、記録された表現型予測誤差の数は、以下、すなわち、− 軽微な誤差（ｍＥ：ｍｉｎｏｒ ｅｒｒｏｒ）＝ＩがＳもしくはＲを予測した、ＳがＩを予測した、またはＲがＩを予測した、
− 大きい誤差（ＭＥ：ｍａｊｏｒ ｅｒｒｏｒ）＝ＳがＲを予測した、
− 非常に大きい誤差（ＶＭＥ：ｖｅｒｙ ｍａｊｏｒ ｅｒｒｏｒ）＝ＲがＳを予測した
のように分類される。
【0055】
検討した様々なモデルの分類性能を評価するために、データセットがＫのサブセットに分割され、反復手順が実行される入れ子式の交差検証方式が実施され、− データセットの（Ｋ−１）のサブセットを使用するモデルに関与するパラメータが最適化される。この目的のために、前述の交差検証手順に頼る。
− 残りのサブセットに対する予測が評価される。
【0056】
この手順は、分類モデルにおける性能を評価するための標準であり、モデル性能の推定においてパラメータ最適化のステップを統合することに関心を有する。実際には、この手順は、データセットのサブセットへのランダムな分割に対してロバストにするため、および、繰り返しにわたって得られる平均性能を考慮するために、数回、たとえば、１０回繰り返される。予測誤差の数に基づくスコアが、コンピュータユニット１４によって、以下の式、すなわち、Ｓｃｏｒｅ＝Ｎｕｍｂｅｒ（ｍＥ）×ｐ１＋Ｎｕｍｂｅｒ（ＭＥ）×ｐ２＋Ｎｕｍｂｅｒ（ＶＭＥ）×ｐ３
を使用して各予測モデルについて計算され、ここで、ｐ１＞ｐ２＞ｐ３は、正数であり、たとえば、それぞれ、１、２、および４に等しい。
【0057】
したがって、予測誤差は、たとえば、米国連邦医薬品局の承認基準において規定されるように、それらの相対的な臨床的重要性に従って評価される。最も低いスコアを示すモデルは、最良予測モデルとして規定される。最良予測モデルは、次いで、ステップ３４において、コンピュータメモリ内に記憶される。
【0058】
濃度選択ステップ２８に戻ると、グローバル戦略（ＧＳおよびＧＳＭ）は、予測モデルの区別能力を改善するために追加の情報を統合することを目的とする。しかしながら、調査されたバグ／薬物の組合せに応じて、追加の濃度は、予測モデルの識別能力を改善、減少、または影響を及ぼさない可能性がある。たとえば、高濃度の抗生物質は、ＦＣＭ分析における情報の損失につながる高感受性細胞の急速な溶解を誘発する可能性がある。耐性ブレークポイント濃度よりも高い濃度は、低いレベルの耐性を示す細胞を損傷し、それらのＦＣＭ耐性プロファイルを高感受性のものに変える可能性がある。本発明のグローバル戦略がＢＰＳよりも優れた予測モデルを提供する場合には、使用されるべき最も関連性のある濃度はなにかという問題が残る。たとえば、４つの濃度（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）が調査される場合、関連性のある濃度の１５の理論的な組合せが所与の抗生物質について可能である。この組合せのうちのどれが最も関連性があるかを評価するために、最も関連性のある濃度のみを考慮する予測モデルを構築するために、Ｌ１正則化ロジスティック回帰、またはＬａｓｓｏロジスティック回帰が実施される。この方法の主な利点は、− （たとえば、試験された４つの濃度のうちの１つのみが最適な識別に関連する場合）試薬の量を減らすこと、
− ＦＣＭ取得の時間を短縮すること（たとえば、ちょうど１つの濃度が関連する場合、より少ないチューブまたはウェルが分析される必要がある）、
− （たとえば、最も関連する濃度が必ずしもブレークポイント濃度ではない場合）最も適切な濃度を選択すること
を可能にし得る。
【0059】
したがって、このツールは、所与のバグ／薬物の組合せおよび所与の生存性マーカーに対するＦＣＭプロトコルの開発を最適化するのを助けることができる。よく知られているように、Ｌ１正則化ロジスティック回帰は、ＳＶＭとよく似ている。主な違いは、異なる正則化関数にある。標準的なＳＶＭは、その重みベクトルのユークリッドまたはＬ２ノルムに関して定義された正則化項を含む（たとえば、｜｜ｗ｜｜２＝（Σ（ｗｉ）２）１／２、ここで、ｗは、ＳＶＭ学習における決定変数のベクトルである）。ユークリッドノルムの代わりにＬ１ノルムを考慮することは、量｜｜ｗ｜｜１＝Σ｜ｗｉ｜を正則化項として考慮することに等しい。両方の定義は、重みの大きさを制限する効果を有し、これは、高次元で学習するのに重要であるが、Ｌ１ペナルティは、小さいだけでなく、正確にゼロに等しくなり得る重みにつながるよく知られている「スパース性」効果を有し、これは、Ｌ２ペナルティでは決して起こらない。結果として、ＳＶＭ（またはロジスティック回帰）においてこのペナルティを使用することは、モデルに関連する変数を自動的に選択することを可能にする。この文脈において、これは、有益ではない可能性がある濃度を自動的に破棄することを可能にする。Ｌ１ペナルティを多変量ＭＦＩおよびＲ表現に適用することは、簡単である。いくつかの抗生物質濃度を収集するビニングデータにＬ１ペナルティを適用するために、「グループラッソ」ペナルティと呼ばれるより高度な分析ツールが実行される。実際、そのビニング表現に対応するすべての特徴が共同でゼロに設定されている場合、濃度が破棄されてもよい。これを達成するために、同じグループ内の所与の濃度から来るすべての特徴を再グループ化するグループ化構造が使用される。グループラッソペナルティは、次いで、グループレベルにおける、したがって、濃度レベルにおけるスパース性を達成する。このアルゴリズムは、たとえば、［２２、２３］において説明されている。
【0060】
ここで、本発明による予測段階について、図２Ｂを参照しながら説明する。この予測段階は、特定の株、たとえば、未知の株、またはその種が知られているが、その感受性表現型が未知である株の感受性表現型を決定することを目的とする。予測段階は、たとえば、臨床検査室に設置された、図１に記載のシステムと類似のシステム、すなわち、フローサイトメータと、学習段階中に選択された予測モデルをメモリ内に記憶する、フローサイトメータに接続されたコンピュータユニットとを備えるシステムを使用して具体化される。フローサイトメータは、有利には、学習段階において使用されるフローサイトメータと同じモデルであり、同じ制御パラメータを用いて動作される。コンピュータユニットは、たとえば、フローサイトメータと同じ場所に配置されたコンピュータ、または、通信ネットワーク、たとえば、インターネットを介してフローサイトメータによって通信されるデータに基づいてクラウドコンピューティングを実行する遠隔地に配置されたサーバであってもよい。
【0061】
予測段階は、ステップ３６において、コンピュータユニット内に記憶された予測モデルに対応する濃度、たとえば、濃度のセット全体、または選択された濃度を用いた、上記で説明したような株の液体試料の調製によって開始する。次に続くステップ３８において、ＦＦＣ分布、ＳＳＣ分布、および蛍光分布が取得され、コンピュータユニット内に記憶される。後者は、次いで、４０において、予測モデルを学習するために使用されたものと同じフォーマットを有する特徴ベクトルを生成し、４２において、コンピュータユニットは、生成された特徴ベクトルに予測モデルを適用し、それによって、試験された株に関する感受性表現型Ｓ、Ｉ、またはＲを出力する。予測の結果は、次いで、ステップ４４において、コンピュータメモリ内に記憶され、および／または画面上に表示される。
【0062】
多種多様な予測モデルの中で最良のモデルを学習するための体系的な手法について説明してきたが、たとえば、どのタイプのモデルが特定の抗生物質に対して最良であるかを事前に知っている場合、学習段階は、単一の予測モデルの学習を実行してもよい。たとえば、図４Ｃに示すように、クオンタイル比は、抗生物質誘発性異種蛍光プロファイルに対して非常に良好な性能を有する。そのような場合、特徴ベクトル生成に必要な分布のみが取得されてもよく、予測モデルの学習および実装に使用される特徴ベクトルのみが生成され（たとえば、クオンタイル比の少なくとも１つ、またはすべてのクオンタイル比）、選択された予測モデルのみが学習され、実装される。
【0063】
さらに、クオンタイル比Ｑは、細菌に対する抗生物質の影響を定量化するために単独で使用され得る。具体的には、この影響を定量化するための方法は、ある濃度の抗生物質を有する第１の試料、および抗生物質を持たない第２の試料の調製を含み、この２つの試料に関する比Ｑのコンピューティングユニットによる計算は、上記で説明されている。比Ｑは、たとえば、記憶し、および／またはユーザに注目させるために画面上に表示してもよい。
【0064】
さらに、クオンタイル法は、ＦＳＣ分布またはＳＳＣ分布に対して実施されてもよい。そのような場合、オプションで、有利には、蛍光マーカーが使用されない。
【0065】
本発明は、以下、すなわち、− 生物学的試料または微生物抽出物からのＦＣＭ−ＡＳＴ、
− 他の生存性マーカーまたはマルチラベリングが使用され得る、
− すべての種および抗生物質／抗真菌薬に適用され得る、
− 誤差の評価は、特定の表現型の予測を強化するために調整され得る、
− クオンタイル法は、ＦＳＣモノパラメトリック分布およびＳＳＣモノパラメトリック分布にも適用され得る、
− クオンタイル法は、異種集団（たとえば、ｈＶＩＳＡ）を検出するためにも使用され得る、
− ビニング法およびクオンタイル法のために５つ以上の構成が調査され得る、
− ３Ｄモデルは、ビニング法から得られた１Ｄ特徴ベクトルを組み合わせることによっても構築され得る、
− ３Ｄモデルは、クオンタイル法またはＭＦＩ法から得られた１Ｄ特徴ベクトルを組み合わせることによっても構築され得る、
− 散乱および蛍光を含む２Ｄモデルも調査され得る、
− 細胞の自己蛍光も、分析のための追加のパラメータとして追加され得る
にも適用される。
【0066】
抗生物質に対する細菌の感受性表現型予測について説明してきたが、本発明は、酵母および真菌にも適用される。
【0067】
表現型予測アルゴリズムの性能評価Ａ．実験１：異種蛍光分布に対するクオンタイルベースの予測モデルの評価
Ａ．ｉ．ゲンタマイシンで処理された株の蛍光分布プロファイル
実験は、以下の行に記載されているように実行された。
− １０７の腸内細菌株のパネル（図６：ゲンタマイシンに対するそれらのＭＩＣに従った株のパネルの分布）が、図３に記載のプロトコルに従って０、２、４、および８ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンで処理され、ＦＣＭによって分析された。すべての株の参照表現型は、ＣＬＳＩブレークポイントに従って、微量液体希釈法によって決定された。
− 蛍光分布は、すべての株について観察され、それらのプロファイルに基づいて分類された。
− 予測モデルは、ＦＣＭデータから生成され、性能は、上記で説明したように評価された。
【0068】
ゲンタマイシンで処理された試料から得られたＦＣＭ蛍光分布は、未処理の試料と比較したとき、３つの主なプロファイルを示した（図７：３つの主なプロファイルＡ、Ｂ、およびＣを表す３つの高感受性株からのスペクトルが示される。１０７の株のパネル内で、３つのプロファイルのうちの１つを示す株の数は、調査された各ゲンタマイシン濃度において、各表現型について示される（表）。灰色で塗りつぶされたセルは、所与の抗生物質濃度についての特定のプロファイルを示す株の最大数を表す）。− プロファイルＡ：蛍光分布のまったくないかまたはわずかなシフト。
− プロファイルＢ：１つの非蛍光集団と小さい蛍光集団とを有する異種分布。
− プロファイルＣ：蛍光分布の著しいシフト。
【0069】
１０７の株のパネル内で、プロファイルの分布は、以下のように概ね評価された（図７、表）。− 高感受性表現型について、最も低いゲンタマイシン濃度（２ｍｇ／Ｌ）で処理されたとき、等しい数の株が、非シフト（プロファイルＡ）または異種蛍光分布（プロファイルＢ）のいずれかを示した。４ｍｇ／Ｌおよび８ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンで処理されたとき、株の大部分は、異種蛍光分布（プロファイルＢ）を示した。
− ほとんどすべて（３７のうち３６）の耐性株は、試験されたすべての濃度においていかなる蛍光シフトも示さなかった（プロファイルＡ）。
− 中間表現型について、最も低い濃度（２ｍｇ／Ｌ）で処理されたとき、より多くの株が蛍光のシフトを示さなかった（プロファイルＡ）。４ｍｇ／Ｌおよび８ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンで処理されたとき、等しい数の株が、非シフト（プロファイルＡ）または異種蛍光分布（プロファイルＢ）のいずれかを示した。
【0070】
これらの観察は、ゲンタマイシンで処理されたとき、高感受性株に関する異種蛍光分布の優勢を示唆する。耐性株の分布プロファイルは、すべての濃度において非常に一貫している。中間株のプロファイルは、使用される濃度に応じてより変化しやすい。
【0071】
Ａ．ｉｉ．クオンタイルベースの予測モデル対ＭＦＩベースの予測モデルの性能上記で仮定したように、ＭＦＩ法の使用は、異種蛍光分布が見出されるとき、適切ではない可能性がある。我々の株のパネル（図７）内の我々の観察と関連して、我々は、クオンタイル法およびＭＦＩ法から生成された特徴ベクトルを使用して構築されたＢＰＳ予測モデルの性能を比較した。
【0072】
交差検証に続いて、我々の結果は、予測モデルの性能が、ＭＦＩと比較したとき、クオンタイル法について有意に高いことを示している。クオンタイルベースの特徴ベクトルを用いて生成された４つの予測モデルのすべては、ＭＦＩデータを用いて構築されたものよりも低いスコア値を示した（図８：クオンタイル特徴ベクトルを用いて生成された４つの予測モデル（ｑ＝０．７５、ｑ＝０．９、ｑ＝０．９５、ｑ＝０．９９）と、ＭＦＩ特徴ベクトルを用いて構築された１つの予測ベクトルとについての誤差の数に対するスコアが示されている。各ヒストグラムについて、平均スコア値および最大スコア値が示されている。スコア値に対応するスケールが左側に示されている。下部における表は、平均スコア値と、予測誤差の平均数（ｍＥ、ＭＥ、およびＶＭＥ）とを示す。株の総数（総数）、高感受性株の総数（総数Ｓ）、および耐性株の総数（総数Ｒ）も示されている）。
【0073】
最良のクオンタイルベースのモデル（ｑ＝０．９５）は、より低いスコアと、３つのタイプの予測誤差のうちのより少ないものとのカテゴリ一致のより高いパーセンテージとを有するＭＦＩベースのモデルよりも著しく優れていた（図８、表）。クオンタイルデータを用いて構築された４つの予測モデルのスコア値はまた、図７に示す小さい蛍光集団と相関され得る双曲線状の曲線として表され得る（プロファイルＢ）。これは、表現型間を識別することにおけるこの小さい集団の高い可能性を裏付ける。我々の結果は、ｑ＝０．９とｑ＝０．９５との間、またはｑ＝０．９５とｑ＝０．９９との間のより詳細な調査が、よりよい性能を有する予測モデルを構築するのに役立つ可能性があることも示唆する。
【0074】
Ｂ．実験２：詳細なＦＣＭ分析、および予測モデルの選択Ｂ．ｉ．識別戦略の性能評価
この実験では、我々は、セフタジジムに対する広い範囲の予測モデルの評価を行った。
− １２８の腸内細菌株（図９：セフタジジムに対するそれらのＭＩＣに従った株のパネルの分布）が、図３に記載のＦＣＭプロトコルを使用して４つの異なる濃度のセフタジジム（１、２、４、および８ｍｇ／Ｌ）を用いて処理されるか、または処理されなかった。
− 上記で説明したように特徴ベクトルを生成するために、ＦＣＭデータが使用された。
− 各戦略（ＢＰＳ、ＧＳ、およびＧＳＭ）について、生成された特徴ベクトルに基づいて７タイプの予測モデルが構築された（図１０：生成された予測モデルの数。「ＦＬ１」は、蛍光を意味する）。
− すべてのモデルの性能は、上記で説明したように交差検証に続いて評価された。
【0075】
図１０に示すように、合計１１１の予測モデルを作る各識別戦略について、３７の予測モデルが生成された。７タイプの予測モデルの各々において最も低いスコアを示す予測モデルが考慮され、それによって、２１のモデルの凝縮された選択を導いた。ＧＳ戦略およびＧＭＳ戦略は、生成された７タイプの予測モデルのすべてについて、ＢＰＳ戦略よりも優れた識別性能（より低い誤差スコア）を示した（図１１：セフタジジムに対する識別戦略の比較。各グラフは、生成された７タイプの予測モデルの各々について得られた最も低いスコアを表す。３つの戦略（ＢＰＳ、ＧＳ、およびＧＳＭ）が比較されている）。− ＧＳ戦略は、４タイプの予測モデル（１Ｄ ＦＬ１ ＱＴ、１Ｄ ＳＳＣビニング、２Ｄ ＦＳＣ−ＳＳＣビニング、および３Ｄ ＦＳＣ−ＳＳＣ−ＦＬ１ビニング）について最も低いスコアを示した。
− ＧＳＭ戦略は、３タイプの予測モデル（１Ｄ ＦＬ１ ＭＦＩ、１Ｄ ＦＬ１ビニング、および１Ｄ ＦＣＳビニング）について最も低いスコアを示した。
【0076】
Ｂ．ｉｉ．セフタジジムに対する最良の予測モデルの選択２１の予測モデルの凝縮された選択は、それらの誤差スコアに従って分類された（図１２：セフタジジムに対する予測モデルの分類。ＢＰ＝ＢＰＳ。Ｇ＝ＧＳ。ＧＭＣ＝ＧＭＳ）。我々の分類によれば、セフタジジムに対する最良の予測モデルは、ＧＳ戦略を用いて構築された３Ｄ ＦＳＣ−ＳＳＣ−ＦＬ１モデルである。我々は、以下のことを観察する。
− １Ｄ ＳＳＣビニング（ＧＳ）予測アルゴリズムも比較的良好な性能を示したことに注目することは、興味深い（図１２）。これは、ＦＬ１およびＦＳＣパラメータが、選択された３Ｄモデルアルゴリズムの識別能力にわずかしか寄与しないことを示唆する。したがって、予測モデルの我々の分析方法および分類は、ＦＣＭ−ＡＳＴプロトコル（１Ｄ ＳＳＣビニング（ＧＳ）モデルには生存性マーカーは必要ない）ならびにＦＣＭ取得パラメータ（ＳＳＣのみ）を大幅に簡略化するのに役立つ可能性がある。一方、我々は、異なる生存性マーカーの使用がさらに優れた予測性能のために３Ｄモデルの識別能力を大幅に改善することができると仮定することができる。
− クオンタイルデータに対して構築された予測モデルは、劣った性能のものである。これは、セフタジジムで処理された株の大部分が均一な蛍光分布を示すことを示唆する。
【0077】
Ｃ．実験３：関連する抗生物質濃度の選択図１２に示すように、セフタジジムに対する最良の予測モデルは、ＧＳ戦略を使用して構築された３Ｄモデルである。このモデルは、４つの濃度のセフタジジム（１、２、４、および８ｍｇ／Ｌ）を処理する。３Ｄモデルの識別能力におけるこれらの濃度の関連性を調べるための努力において、我々は、上記で説明したようにＧＳ戦略に基づいて３Ｄモデルを構築するためにＬａｓｓｏ分析ツールを使用した。
【0078】
Ｌａｓｓｏツールを使用して得られた３Ｄ予測モデルは、ＳＶＭ分析を用いて得られた３Ｄモデルのスコアよりもわずかに高い誤差スコアで比較的良好な性能を示した（図１３：３Ｄ予測モデル（ＧＳ）およびＶＩＴＥＫ２の性能比較。混同行列は、参照表現型と、３ＤモデルおよびｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘからのＶＩＴＥＫ（登録商標）２によって予測された表現型との間の相関性および不一致を示す。下部における表は、平均スコア値と、予測誤差の平均数と（ｍＥ、ＭＥ、およびＶＭＥ）を示す。株の総数（総数）、高感受性株の総数（総数Ｓ）、および耐性株の総数（総数Ｒ）も示されている。Ｌａｓｓｏ分析におけるセフタジジムの無関係の濃度が示されている。）。
【0079】
我々の株のパネルはまた、我々の市販のＶＩＴＥＫ２システムを使用して調査された。比較のため、我々は、他の抗生物質からの結果のより包括的な解釈を通して潜在的な予測誤差を修正するＶＩＴＥ（登録商標）Ｋ２ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｅｘｐｅｒｔ Ｓｙｓｔｅｍを使用しなかった。代わりに、ＶＩＴＥＫ２について示された予測表現型は、セフタジジムについて得られたＭＩＣ値からのみ解釈された。全体として、我々の３Ｄモデルの性能は、ＶＩＴＥＫ（登録商標）２システムの性能と同等であった（図１３）。これは、我々の予測モデルの高い表現型識別力を裏付ける。
【0080】
以下を観察する。− Ｌａｓｓｏを用いて構築された３Ｄモデルは、２つの濃度（２ｍｇ／Ｌおよび８ｍｇ／Ｌ）のみを使用し、これは、我々がセフタジジムのためのＦＣＭ−ＡＳＴ用途の開発に使用されるべき濃度の数を減らすことができることを示唆する。
− 我々のＢＰＳ戦略では、使用される濃度は、高感受性表現型行列において４ｍｇ／Ｌ、耐性表現型行列において８ｍｇ／Ｌである。我々のＬａｓｓｏ分析では、４ｍｇ／Ｌの濃度は、無関係であり、２ｍｇ／Ｌが優先的に使用される。これは、ＦＣＭ調査において最も識別力のある濃度が必ずしもブレークポイント濃度ではないことを裏付ける。これは、なぜＢＰ戦略を使用して構築された３Ｄモデルが３Ｄモデルの最下位の実施であるかを説明する可能性がある（図１３）。
【0081】
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