特許 6987898 標識ヌクレオチドおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6987898

(24)【登録日】2021年12月3日

(45)【発行日】2022年1月5日

(54)【発明の名称】標識ヌクレオチドおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20211220BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20211220BHJP

   C12Q 1/6825 20180101ALI20211220BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/11 Z

   C12M1/00 A

   C12Q1/6825 Z

【請求項の数】24

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2019-571262(P2019-571262)

(86)(22)【出願日】2019年2月13日

(65)【公表番号】特表2020-536487(P2020-536487A)

(43)【公表日】2020年12月17日

(86)【国際出願番号】US2019017830

(87)【国際公開番号】WO2019160937

(87)【国際公開日】20190822

【審査請求日】2020年4月7日

(31)【優先権主張番号】62/710,465

(32)【優先日】2018年2月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514202402

【氏名又は名称】イラミーナ インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100175477

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 林太郎

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー マンデル

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン バーナード

(72)【発明者】

【氏名】ジョン ムーン

(72)【発明者】

【氏名】マリア キャンデラリア ロジャート バチガルポ

【審査官】 長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１７−５２１０８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１７０７１６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１６／１８３２１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５１６８１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１６７９３８（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／１１

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｑ １／６８２５

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヌクレオチド；
前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子；および
前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグであって、前記レドックス活性電荷タグは、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、レドックス活性電荷タグ
を含み、
前記連結分子は、アルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、およびトリアゾールを含む、標識ヌクレオチド。

【請求項2】

前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項１に記載の標識ヌクレオチド。

【請求項3】

前記連結分子は、前記レドックス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む、請求項１または２に記載の標識ヌクレオチド。

【請求項4】

前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領域と相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む、請求項３に記載の標識ヌクレオチド。

【請求項5】

前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合した前記テザー上の前記アクセプター領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは１ヌクレオチド〜１０ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列、または１ペプチド核酸〜１０ペプチド核酸を含有するペプチド核酸配列を含む、請求項４に記載の標識ヌクレオチド。

【請求項6】

前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ
前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、１〜１００の電荷を含む、請求項１〜５の何れかに記載の標識ヌクレオチド。

【請求項7】

前記アルキル鎖は、少なくとも６個の炭素原子を含む、請求項１〜６の何れかに記載の標識ヌクレオチド。

【請求項8】

前記ポリ（エチレングリコール）鎖は、少なくとも３個のエチレングリコール単位を含む、請求項１〜７の何れかに記載の標識ヌクレオチド。

【請求項9】

以下のステップを含む、核酸のシークエンシング方法：
ポリメラーゼがつながった電気伝導性チャネルに鋳型核酸を導入するステップ；
前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチドを導入するステップであって、前記標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチド、前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子およびそれに付着したヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含み、それにより、前記標識ヌクレオチドの１つが前記ポリメラーゼと会合し、前記連結分子は、アルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、およびトリアゾールを含む、ステップ；
前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合している間に、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間のレドックス反応を開始するステップ；および
前記レドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ。

【請求項10】

前記レドックス反応を開始するステップは、前記電気伝導性チャネルに充電電圧を印加することを含み；かつ
前記応答を検出するステップは、前記電気伝導性チャネルに読み取り電圧を印加することを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

以下のステップを更に含む、請求項９または１０に記載の方法：
前記電気伝導性チャネルの前記応答を、前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つの前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付けるステップ；および
前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記会合している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドを識別するステップ。

【請求項12】

前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つから、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記会合している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な新生鎖に取り込まれるステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

請求項１２に記載の方法であって、
前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合するステップ、前記レドックス反応を開始するステップ、前記検出するステップ、前記関連付けるステップ、および前記識別するステップは合わせて、シークエンシングサイクルであり、
前記方法は、以下によって、次のシークエンシングサイクルを行うステップを更に含む：
前記標識ヌクレオチドの次の１つを前記ポリメラーゼと会合させること；
前記標識ヌクレオチドの前記次の１つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間の他のレドックス反応を開始すること；
前記他のレドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの他の応答を検出すること；
前記電気伝導性チャネルの前記他の応答を、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付けること;および
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記標識ヌクレオチドの前記次の１つの前記ヌクレオチドを識別すること。

【請求項14】

以下のステップを更に含む、請求項１３に記載の方法：
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記標識ヌクレオチドの前記次の１つの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な前記新生鎖に取り込まれるステップ；および
前記シークエンシングサイクルを繰り返すステップ。

【請求項15】

前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項９〜１４の何れかに記載の方法。

【請求項16】

前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ
前記レドックス活性電荷タグは、変更された電荷状態で、１〜１００の電荷を含む、請求項９〜１５の何れかに記載の方法。

【請求項17】

前記標識ヌクレオチドは以下を含む、請求項９〜１６の何れかに記載の方法：
前記ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第１標識ヌクレオチド;
前記ヌクレオチドとしてのデオキシグアノシンポリホスフェートおよび第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第２標識ヌクレオチド;
前記ヌクレオチドとしてのデオキシシチジンポリホスフェートおよび第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第３標識ヌクレオチド;ならびに
前記ヌクレオチドとしてのデオキシチミジンポリホスフェートおよび第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第４標識ヌクレオチド；
ここで、前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。

【請求項18】

前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち２つは、変更された電荷状態で、正に帯電していて；かつ前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち他の２つは、前記変更された電荷状態で、負に帯電している、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記標識ヌクレオチドは、低塩緩衝液中に存在する、請求項９〜１８の何れかに記載の方法。

【請求項20】

前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項９〜１９の何れかに記載の方法。

【請求項21】

以下を備える、キット：
電気伝導性チャネルであって、それに付着したテザーを有する電気伝導性チャネルと、
前記テザーを介して、前記電気伝導性チャネルに付着したポリメラーゼと、
を含むフローセル；
前記フローセルに導入される鋳型核酸；
前記フローセルに導入される試薬であって、前記試薬は標識ヌクレオチドを含み、前記標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、
ヌクレオチドと、
前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子であって、前記連結分子は、アルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、およびトリアゾールを含む、連結分子と、
電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグと、
を含む、試薬；および
レドックス反応が前記レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間で起こるとき、前記電気伝導性チャネルからの応答を検出する検出器。

【請求項22】

前記レドックス活性電荷タグは、フェロセン、亜鉛テトラベンゾポルフィリン、コバルトフタロシアニン、トリス−（２，２’−ビピリミジン）ルテニウム、４−フェロセニルベンジルアルコール、５−（４−ヒドロキシメチルフェニル）−１０，１５，２０−トリメシチルポルフィナト亜鉛（ＩＩ）、およびレドックス活性カリックスアレーンからなる群から選択される、請求項２１に記載のキット。

【請求項23】

前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ
前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、１〜１００の電荷を含む、請求項２１または２２に記載のキット。

【請求項24】

前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項２１〜２３の何れかに記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本出願は、２０１８年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７１０，４６５号に対する優先権を主張し、前述の出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

生物学的または化学的研究における様々なプロトコルは、局所的な支持面上または所定の反応チャンバー内において多数の制御された反応を実施することを含む。指定された反応は次いで観察または検出され得、その後の分析は当該反応に関与する化学物質の特性を特定または明らかにするのに役立ち得る。いくつかの例では、当該制御された反応は蛍光を発生し、したがって光学システムが検出のために使用され得る。他の例では、当該制御された反応は電荷、伝導性、またはその他の電気的特性を変化させ、したがって電子回路システムが検出のために使用され得る。

【発明の概要】

【0003】

本明細書で開示される第１の態様は、標識ヌクレオチドである。番号１〜６は、この第１の態様に関する。

【0004】

１．一例では、前記標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド；前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子；および前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグを含み、前記レドックス活性電荷タグは、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される。

【0005】

２．前記標識ヌクレオチドの例（１）では、前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む。

【0006】

３．前記標識ヌクレオチドの例（１）または（２）では、前記連結分子は、前記レドックス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む。

【0007】

４．例（３）では、前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領域と相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む。

【0008】

５．例（４）では、前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合した前記テザー上の前記アクセプター領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列、または約１ペプチド核酸〜約１０ペプチド核酸を含有するペプチド核酸配列を含む。

【0009】

６．前記標識ヌクレオチドの例（１）〜（５）の何れかでは、前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、約１〜約１００の電荷を含む。

【0010】

例（１）〜（６）を含む、本明細書に開示される標識ヌクレオチドの任意の特徴は、任意の所望の方法および／または構成で組み合わされ得るを理解されたい。

【0011】

本明細書で開示される第２の態様は、方法である。番号７〜１８は、この第２の態様に関する。

【0012】

７．一例では、前記方法は、以下のステップを含む：ポリメラーゼがつながった電気伝導性チャネルに鋳型核酸を導入するステップ；前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチドを導入するステップであって、前記標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチドおよびそれに付着したヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含み、それにより、前記標識ヌクレオチドの１つが前記ポリメラーゼと会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ステップ；前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合している間に、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間のレドックス反応を開始するステップ；および前記レドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ。

【0013】

８．前記方法の例（７）では、前記レドックス反応を開始するステップは、前記電気伝導性チャネルに充電電圧を印加することを含み；かつ前記応答を検出するステップは、前記電気伝導性チャネルに読み取り電圧を印加することを含む。

【0014】

９．前記方法（７）または（８）の例は、以下のステップを更に含む：前記電気伝導性チャネルの前記応答を、前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つの前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付ける（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）ステップ；および前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記会合している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドを識別するステップ。

【0015】

１０．例（９）は、前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つから、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記会合している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な新生鎖に取り込まれるステップを更に含む。

【0016】

１１．例（１０）では、前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合するステップ、前記レドックス反応を開始するステップ、前記検出するステップ、前記関連付けるステップ、および前記識別するステップは合わせて、シークエンシングサイクルであり、前記方法は、以下によって、次のシークエンシングサイクルを行うステップを更に含む：前記標識ヌクレオチドの次の１つを前記ポリメラーゼと会合させること；前記標識ヌクレオチドの前記次の１つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間の他のレドックス反応を開始すること；前記他のレドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの他の応答を検出すること；前記電気伝導性チャネルの前記他の応答を、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付ける（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）こと;および前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記標識ヌクレオチドの前記次の１つの前記ヌクレオチドを識別すること。

【0017】

１２．例（１１）は、以下のステップを更に含む：前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記標識ヌクレオチドの前記次の１つの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な前記新生鎖に取り込まれるステップ；および前記シークエンシングサイクルを繰り返すステップ。

【0018】

１３．前記方法の例（７）〜（１２）の何れかでは、前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む。

【0019】

１４．前記方法の例（７）〜（１３）の何れかでは、前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ前記レドックス活性電荷タグは、変更された電荷状態で、約１〜約１００の電荷を含む。

【0020】

１５．前記方法の例（７）〜（１４）の何れかでは、前記標識ヌクレオチドは以下を含む：前記ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第１標識ヌクレオチド;前記ヌクレオチドとしてのデオキシグアノシンポリホスフェートおよび第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第２標識ヌクレオチド;前記ヌクレオチドとしてのデオキシシチジンポリホスフェートおよび第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第３標識ヌクレオチド;ならびに前記ヌクレオチドとしてのデオキシチミジンポリホスフェートおよび第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第４標識ヌクレオチド；ここで、前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。

【0021】

１６．例（１５）では、前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち２つは、変更された電荷状態で、正に帯電していて；かつ前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち他の２つは、前記変更された電荷状態で、負に帯電している。

【0022】

１７．前記方法の例（７）〜（１６）の何れかでは、前記標識ヌクレオチドは、低塩緩衝液中に存在する。

【0023】

１８．前記方法の例（７）〜（１７）の何れかでは、前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである。

【0024】

例（７）〜（１７）を含む、前記方法の任意の特徴は、任意の所望の方法で組み合わされ得ることを理解されたい。更に、この方法および／または前記標識ヌクレオチドの特徴の任意の組み合わせが一緒に使用され得、かつ／または本明細書に開示される例の何れかと組み合わされ得ることを理解されたい。

【0025】

本明細書で開示される第３の態様は、キットである。番号１９〜２２は、この第３の態様に関する。

【0026】

１９．一例では、前記キットは、以下を備える：電気伝導性チャネルであって、それに付着したテザーを有する電気伝導性チャネルと、前記テザーを介して、前記電気伝導性チャネルに付着したポリメラーゼと、を含むフローセル；前記フローセルに導入される鋳型核酸；前記フローセルに導入される試薬であって、前記試薬は標識ヌクレオチドを含み、前記標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチドと、前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子と、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグと、を含む、試薬；およびレドックス反応が前記レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間で起こるとき、前記電気伝導性チャネルからの応答を検出する検出器。

【0027】

２０．前記キットの例（１９）では、前記レドックス活性電荷タグは、フェロセン（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ）、亜鉛テトラベンゾポルフィリン（ｚｉｎｃ ｔｅｔｒａｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、コバルトフタロシアニン（ｃｏｂａｌｔ ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、トリス−（２，２’−ビピリミジン）ルテニウム（ｔｒｉｓ−（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）、４−フェロセニルベンジルアルコール（４−ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、５−（４−ヒドロキシメチルフェニル）−１０，１５，２０−トリメシチルポルフィナト亜鉛（ＩＩ）（５−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１０，１５，２０−ｔｒｉｍｅｓｉｔｙｌｐｏｒｐｈｉｎａｔｏｚｉｎｃ（ＩＩ））、およびレドックス活性カリックスアレーン（ｒｅｄｏｘ−ａｃｔｉｖｅ ｃａｌｉｘａｒｅｎｅ）からなる群から選択される。

【0028】

２１．前記キットの例（１９）または（２０）では、前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、約１〜約１００の電荷を含む。

【0029】

２２．前記キットの例（１９）〜（２１）の何れかでは、前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである。

【0030】

例（１９）〜（２２）を含む、前記キットの任意の特徴は、任意の所望の方法で組み合わされ得るを理解されたい。更に、このキットおよび／または前記方法および／または前記標識ヌクレオチドの特徴の任意の組み合わせが一緒に使用され得、かつ／または本明細書に開示される例の何れかと組み合わされ得ることを理解されたい。

【0031】

更に、前記標識ヌクレオチドの何れかおよび／または前記方法の何れかおよび／または前記キットの任意の特徴が、任意の所望の方法で組み合わされ得、かつ／または本明細書に開示される例の何れかと組み合わされ得ることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0032】

本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照することにより明らかになるであろう。以下の詳細な説明および図面において、同様の参照番号は、おそらく同一ではないが類似の構成要素に対応する。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号または特徴は、それらが現れる他の図面に関連して説明されてもされなくてもよい。

【図1】標識ヌクレオチドの一例の概略図である。

【図2】本明細書に開示されるシステムの一例の概略的な部分斜視図である。

【図3】電荷センサーの電気伝導性チャネルに付着し、且つ電荷に基づいて区別され得る標識ヌクレオチドと会合したポリメラーゼの概略図である。

【図4】本明細書で開示される方法の一例を示すフロー図である。

【図5】シークエンシング法において使用中の標識ヌクレオチドの一例の概略図である（図５Ａ）。テザーと本明細書に開示される標識ヌクレオチドの一例の特異性領域との間の相互作用の一例の概略図である（図５Ｂ）。

【発明を実施するための形態】

【0033】

核酸シークエンシング手順における単一分子検出のために使用され得る標識ヌクレオチドが、本明細書に開示される。単一分子検出において使用されるセンサーは、１つのポリメラーゼが付着した１つの電気伝導性チャネルを有し得る。これにより、個々の各センサーで一度に１つの取り込みイベント（即ち、ポリメラーゼによる新生鎖への塩基の取り込み）を検出することが可能になる。標識ヌクレオチドは、核酸シークエンシング用ならびに核酸および一般的な他の分析物の検出用に使用することができる独自の検出様式を提供する。

【0034】

標識ヌクレオチド１０の一例が、図１に概略的に示されている。示されているように、標識ヌクレオチド１０は、ヌクレオチド１２、ヌクレオチド１２のリン酸基１６に付着した連結分子１４または１４’、および連結分子１４または１４’に付着したレドックス活性電荷タグ１８を含み、レドックス活性電荷タグ１８は、電気伝導性チャネル３２の感知ゾーン（参照番号３１、図３）の近くに維持されるとき、電気伝導性チャネル（参照番号３２、図２）によって酸化または還元される。標識ヌクレオチド１０は、天然ヌクレオチドとは構造的または化学的に異なるため、非天然ヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドとみなすことができる。

【0035】

標識ヌクレオチド１０のヌクレオチド１２は、天然ヌクレオチドであり得る。天然ヌクレオチドは、窒素含有複素環塩基２０、糖２２、および１つ以上のリン酸基１６を含む。天然のヌクレオチドの例は、例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む。リボヌクレオチドでは、糖２２はリボースであり、デオキシリボヌクレオチドでは、糖２２はデオキシリボース、即ちリボースの２’位に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。一例では、ヌクレオチド１２は、いくつかのリン酸基１６（例えば、３リン酸（即ち、γリン酸）、４リン酸、５リン酸、６リン酸など）を含むため、ポリリン酸形態である。複素環塩基２０（即ち、核酸塩基）は、プリン塩基またはピリミジン塩基であることができる。プリン塩基は、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにそれらの修飾誘導体または類似体を含む。ピリミジン塩基は、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、ならびにそれらの修飾誘導体または類似体を含む。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合している。核酸類似体では、リン酸骨格、糖、および核酸塩基のいずれかが変化し得る。核酸類似体の例は、例えば、ユニバーサル塩基またはペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸−糖骨格類似体を含む。

【0036】

標識ヌクレオチド１０はまた、連結分子１４または１４’を含む。いくつかの例では、連結分子（図１において１４として表示）は特異性領域２４を含まない。他の例では、連結分子（図１において１４’として表示）は特異性領域２４を含む。図１に概略的に示されるように、特異性領域２４が連結分子１４’の一部である場合、該領域２４は、レドックス活性電荷タグ１８に化学的に結合する端部に位置し得る。特異性領域２４については、以下で更に説明する。

【0037】

標識ヌクレオチド１０の連結分子１４または１４’は、一端でヌクレオチド１２のリン酸基１６に化学的に結合でき、他端でレドックス活性電荷タグ１８に化学的に結合できる任意の長鎖分子であり得る。連結分子１４または１４’はまた、本明細書に開示されるシステム３０（図２を参照）で使用されるポリメラーゼ２６と相互作用しないように選択され得る。連結分子１４または１４’は、レドックス活性電荷タグ１８が電気伝導性チャネル３２（図２）の感知ゾーン３１（図３）内に存在することを可能にするほど十分に長いように選択される。例として、連結分子１４または１４’は、アルキル鎖、ポリ（エチレングリコール）鎖、アミド基、リン酸基、トリアゾールなどの複素環、ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。アルキル鎖の例は、少なくとも６個の炭素原子を含み得、ポリ（エチレングリコール）鎖の例は、少なくとも３個のエチレングリコール単位を含み得る。

【0038】

以下の例は、連結分子１４、１４’がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、およびトリアゾールを含む、標識ヌクレオチド１０の一例を示す：

【化1】

【0039】

以下の例は、連結分子１４、１４’がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、トリアゾール、およびリン酸基を含む、標識ヌクレオチド１０の別の例を示す：

【化2】

【0040】

以下の例は、連結分子１４、１４’がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、トリアゾール、およびリン酸基を含む、標識ヌクレオチド１０の更に別の例を示す：

【化3】

【0041】

以下の例は、連結分子１４、１４’がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、トリアゾール、リン酸基、およびポリヌクレオチド鎖を含む、標識ヌクレオチド１０の更なる例を示す：

【化4】

【0042】

いくつかの例示的な連結分子１４、１４’を説明したが、他の連結分子１４、１４’を使用しもよいことを理解されたい。

【0043】

図１および前の例に示されるように、標識ヌクレオチド１０のいくつかは、連結分子１４’の一部として特異性領域２４も含み得る。特異性領域２４は、電気伝導性チャネル３２に結合したテザー２８（図２）上のアクセプター領域と相互作用することができる。特異性領域２４は、テザー２８のアクセプター領域に一時的に付着することができるアフィニティータグを含み得る。アフィニティータグの結合親和性は、標識ヌクレオチド１０がポリメラーゼ２６によって保持されているときに、テザー２８上のアクセプター領域に特異性領域２４を結合させるほど十分に強いかもしれないが、取り込みイベント後に（即ち、ポリメラーゼ２６が、αリン酸および連結分子１４、１４’の間、またはαリン酸およびβリン酸の間の結合を自然に切断するときに）アクセプター領域から特異性領域２４をリリースするほど十分に弱いかもしれない。換言すれば、アクセプター領域への特異性領域２４（例えば、アフィニティータグ）のオン速度、およびアクセプター領域からの特異性領域２４（例えば、アフィニティータグ）のオフ速度は、全体的な単一分子感知を改善するために選択され得る。アフィニティータグ／アクセプター領域の相互作用のオン速度は、ヌクレオチド取り込みの前、例えば、特異性領域２４、したがってアフィニティータグの効果的な高濃度のために高くなり得る。この高いオン速度は、アフィニティータグがアクセプター領域に結合している時間の割合を増加させる。切断後、次の標識ヌクレオチド１０がポリメラーゼ２６の活性部位に入るときに、（以前に取り込まれたヌクレオチドのアフィニティータグとアクセプター領域の間の）結合状態が存在する可能性が低いように十分に速く、（アフィニティータグとアクセプター領域の間の）複合体が解離するように、相互作用のオフ速度は十分に高く選択され得る。

【0044】

特定の例では、特異性領域２４はテザー２８上のアクセプター領域にハイブリダイズするため、アフィニティータグは、テザー２８上のアクセプター領域に一時的に付着することができるヌクレオチド配列またはペプチド核酸配列を含み得る（図２）。一例では、アフィニティータグは、約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド、または約１ペプチド核酸〜約１０ペプチド核酸を含有するヌクレオチド配列を含む。他の例では、アフィニティータグは、最大６個のヌクレオチドまたはペプチド核酸を含む。更に別の例では（図５Ｂで更に表示および説明されるように）、特異性領域２４は、ヌクレオチド配列の両側に隣接するイノシンを更に含み得る。更に他の例では、アフィニティータグは、互いに対する親和性または疎水性ポリマーに対する親和性を有するペプチドなどの非核酸部分であり得る。具体的なタンパク質の例はコイルドコイルを含み、当該コイルドコイルは２〜７個のα−ヘリックスがロープの鎖のように一緒にコイル状になっているタンパク質中の構造モチーフである。換言すると、コイルドコイルは、互いに巻き付いてスーパーコイルを形成する２つ以上のα−ヘリックスによって構築される。コイルドコイルの例は、ｃ−Ｆｏｓやｃ−ｊｕｎなどの腫瘍性タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。

【0045】

レドックス活性電荷タグ１８は、例えば、電気伝導性チャネル３２の感知ゾーン３１の近くに維持されたときに、電気伝導性チャネル３２によって酸化（電子を失う）または還元（電子を獲得）されると、その電荷を増加させることができる任意の電荷タグであり得る。電荷タグ１８は、レドックス反応が起こる前に、正味中性（ｎｅｔ ｎｅｕｔｒａｌ）（ゼロ電荷）、またはこの状態に近い（１０電荷以下）場合がある。換言すれば、非酸化状態または非還元状態において、レドックス活性電荷タグ１８は１０以下の電荷を運ぶ。レドックス活性電荷タグ１８によって運ばれる電荷は、標識ヌクレオチド１０のリン酸１６または連結分子１４、１４’のいずれの電荷も含まない。レドックス反応が起こった後、レドックス活性電荷タグ１８の正味の全体電荷（ｎｅｔ ｏｖｅｒａｌｌ ｃｈａｒｇｅ）が変化する（即ち、レドックス活性電荷タグ１８は、より多くの正電荷またはより多くの負電荷（ｍｏｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｓ ｏｒ ｍｏｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｓ）を運ぶ）。一例では、レドックス活性電荷タグ１８は、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み、レドックス活性電荷タグ１８は、酸化状態または還元状態で、約１〜約１００の電荷を含む。非酸化状態または非還元状態におけるレドックス活性電荷タグ１８の電荷数は、酸化状態または還元状態におけるレドックス活性電荷タグ１８の電荷数よりも低いことを理解されたい。別の例では、レドックス活性電荷タグ１８は、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み、レドックス活性電荷タグ１８は、酸化状態または還元状態で、約２０〜約５０の電荷を含む。

【0046】

レドックス活性電荷タグ１８は、レドックス反応を受けることができる任意の配位（すなわち、所定の位置に保持された）金属原子を含み得る。金属原子の例は、鉄、コバルト、ルテニウム、亜鉛、銅、リチウム、銀などを含む。いくつかの具体的な例として、レドックス活性電荷タグ１８は、フェロセン（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ）、亜鉛テトラベンゾポルフィリン（ｚｉｎｃ ｔｅｔｒａｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、コバルトフタロシアニン（ｃｏｂａｌｔ ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、トリス−（２，２’−ビピリミジン）ルテニウム（ｔｒｉｓ−（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）、４−フェロセニルベンジルアルコール（４−ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、５−（４−ヒドロキシメチルフェニル）−１０，１５，２０−トリメシチルポルフィナト亜鉛（ＩＩ）（５−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１０，１５，２０−ｔｒｉｍｅｓｉｔｙｌｐｏｒｐｈｉｎａｔｏｚｉｎｃ（ＩＩ））、およびレドックス活性カリックスアレーンからなる群から選択される。

【0047】

フェロセンは、式Ｆｅ（Ｃ_５Ｈ_５）_２を含む任意の有機金属化合物であり得る。具体例は、フェロセンデンドリマーである：

【化5】

式中、Ｆｅ^２＋は酸化によりＦｅ^３＋になることができ、したがって各「Ｆｅ」に正電荷が導入される。

【0048】

亜鉛テトラベンゾポルフィリン（ｚｉｎｃ ｔｅｔｒａｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）は、以下の構造を有する：

【化6】

式中、Ｒは、Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_６Ｈ_１３、またはＣ_１２Ｈ_２５である。Ｚｎ^１＋は酸化によりＺｎ^２＋になることができ、したがって正電荷が導入される。

【0049】

コバルトフタロシアニン（ｃｏｂａｌｔ ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）の例は、以下を含む：

【化7】

および

【化8】

上記のいずれも溶液中において正味中性（ｎｅｔ ｎｅｕｔｒａｌ）の分子である。酸化されると、Ｃｏ^２＋はＣｏ^３＋になり、各「Ｃｏ」に正電荷が導入される（例えば、最初の構造には１つの正電荷、２番目の構造には５つの正電荷）。−３〜＋５の範囲の酸化状態を有する他のコバルト含有化合物が知られており、負に帯電可能なレドックス活性電荷タグ１８または正に帯電可能なレドックス活性電荷タグ１８として使用され得る。

【0050】

トリス−（２，２’−ビピリミジン）ルテニウム（Ｔｒｉｓ−（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）は、以下の構造を有する：

【化9】

式中、Ｒｕ^２＋は酸化によりＲｕ^３＋になることができ、したがって正電荷が導入される。

【0051】

４−フェロセニルベンジルアルコール（４−ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）は、以下の構造を有する：

【化10】

式中、Ｆｅ^２＋は酸化によりＦｅ^３＋になることができ、したがって正電荷が導入される。

【0052】

５−（４−ヒドロキシメチルフェニル）−１０，１５，２０−トリメシチルポルフィナト亜鉛（ＩＩ）（５−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１０，１５，２０−ｔｒｉｍｅｓｉｔｙｌｐｏｒｐｈｉｎａｔｏｚｉｎｃ（ＩＩ））は、以下の構造を有する：

【化11】

式中、Ｚｎ^２＋は還元によりＺｎ^１＋になることができ、したがって負電荷が導入される。

【0053】

レドックス活性カリックスアレーンのいくつかの例は、以下を含む：

【化12】

【0054】

前述の各レドックス反応は可逆的であり、したがって該化合物は、それらのより高い酸化状態において使用されて、電気伝導性チャネルの感知ゾーン３１内にあるときに還元され得るか、あるいはそれらのより低い酸化状態において使用されて、電気伝導性チャネルの感知ゾーン３１内にあるときに酸化され得る

【0055】

上述のように、本明細書に開示されるレドックス活性電荷タグ１８は、溶液中で中性または中性付近（ｎｅａｒ−ｎｅｕｔｒａｌ）であり得、レドックス反応を受けるまでより大きな電荷を運ばない。かくして、溶液中の標識ヌクレオチド１０は高度に帯電した分子（ｈｉｇｈｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）とはみなされず、（反対に帯電した中性付近のレドックス活性電荷タグ１８を含む）反対に帯電した標識ヌクレオチド１０間の凝集は起こりにくい。

【0056】

標識ヌクレオチド１０は、キットおよび／またはシステム３０（後者の一例は図２に示されている）において使用され得る。キットまたはシステム３０は、電気伝導性チャネル３２を含み得る。電気伝導性チャネル３２は、ウェル、チューブ、チャネル、キュベット、ペトリ皿、ボトルなどの容器内にあってもよく、またはそれら容器の一部であってもよい。適切な容器の別の例は、フローセル３４である。本明細書に記載の実装に適した任意のフローセル構成が使用され得る。いくつかの例示的なフローセルは、イルミナ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されているものである。フローセル３４は、反応成分（例えば、鋳型核酸、標識ヌクレオチド１０など）のそれぞれの電気伝導性チャネル３２への付着中に、またはそれぞれの電気伝導性チャネル３２上の反応成分を用いて行われる後続の反応中に、個々にアドレス可能な電気伝導性チャネル３２のアレイにバルク試薬を送達するのに便利である。核酸シークエンシング反応などのサイクリックプロセス（ｃｙｃｌｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）は、フローセル３４に特に適している。別の特に有用な容器は、マルチウェルプレートまたはマイクロタイタープレート中のウェルである。

【0057】

図２に示される例では、フローセル３４は電気伝導性チャネル３２を含む。本明細書で使用する場合、「電気伝導性チャネル（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ）」という用語は、その表面またはその周囲の電場における摂動を電気信号に変換する検出デバイスの一部を意味することを意図している。例えば、電気伝導性チャネル３２は、反応成分（例えば、標識ヌクレオチド１０）の到着または離脱を電気信号に変換することができる。本明細書に開示される例では、電気伝導性チャネル３２は、標識ヌクレオチド１０のレドックス活性電荷タグ１８との相互作用によって、２つの反応成分（鋳型核酸と標識ヌクレオチド１０のヌクレオチド２０）の間の相互作用を検出可能な信号に変換することもできる。

【0058】

電気伝導性チャネル３２は、電荷センサー３５のチャネルであり得る。電荷センサー３５は、ソース端部Ｓおよびドレイン端部Ｄ、ならびに端部Ｓ、Ｄを接続するチャネル３２を含み得る。チャネル３２は、例えば、チューブ、ワイヤ、プレートなどの任意の適切な形状を有し得る。

【0059】

端部Ｓ、Ｄは、任意の適切な伝導性材料であり得る。適切なソースおよびドレインの材料の例は、コバルト、ケイ化コバルト、ニッケル、ケイ化ニッケル、アルミニウム、タングステン、銅、チタン、モリブデン、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、酸化インジウム亜鉛、金、プラチナ、カーボンなどを含む。

【0060】

電気伝導性チャネル３２は、レドックス活性電荷タグ１８を酸化または還元することができる任意の伝導性（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）材料または半伝導性（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）材料を含み得る。当該材料は、有機材料、無機材料、またはその両方を含み得る。適切なチャネル材料のいくつかの例は、シリコン、カーボン（例えば、グラッシーカーボン、グラフェンなど）、伝導性ポリマーなどのポリマー（例えば、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリ（４−スチレンスルホン酸）をドープしたポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ）など）、金属などを含む。

【0061】

いくつかの例では、電気伝導性チャネル２６はまた、少なくとも１つの寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）をナノスケール（１ｎｍ〜１μｍ未満の範囲）で有するナノ構造であり得る。一例では、この寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）は最大寸法を指す。例として、電気伝導性チャネル２６は、半伝導性ナノ構造、グラフェンナノ構造、金属ナノ構造、および伝導性ポリマーナノ構造であり得る。ナノ構造は、多層または単層ナノチューブ、ナノワイヤ、ナノリボンなどであり得る。

【0062】

例示的な電荷センサー３５は、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）ベースのＦＥＴ、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）ベースのＦＥＴ、シリコンナノワイヤ（ＳｉＮＷ）ＦＥＴ、ポリマーナノワイヤＦＥＴ、グラフェンナノリボンＦＥＴ（およびＭｏＳ_２、シリセンなどの２Ｄ材料から製造された関連ナノリボンＦＥＴ）、トンネルＦＥＴ（ＴＦＥＴ）、および急峻サブスレッショルドスロープデバイス（ｓｔｅｅｐ ｓｕｂｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｌｏｐｅ ｄｅｖｉｃｅｓ）などの電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）である。

【0063】

図２に示される例示的な電荷センサー３５は、ソースＳ、ドレインＤ、およびソースＳとドレインＤとの間の電気伝導性チャネル３２を含むナノ構造ＦＥＴである。電気伝導性チャネル３２は、カーボンナノチューブ、単層カーボンナノチューブ、シリコンナノワイヤ、ポリマーナノワイヤなどであり得る。電気伝導性チャネル３２はゲート端部として機能するため、図２では「Ｇ」としても示されている。本明細書に開示される例では、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２は、標識ヌクレオチド１０のレドックス活性電荷タグ１８のための（電子を供給または受容する）酸化還元電極として機能し得る。より具体的には、レドックス活性電荷タグ１８に電子を移動させるか、またはレドックス活性電荷タグ１８から電子を移動させるために、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２を使用することができる。電子移動は、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２の少なくとも一部の表面上のゲート酸化物（ｇａｔｅ ｏｘｉｄｅ）（図示せず）を通るトンネリングを介して起こり得る。いくつかの例では、ゲート酸化物の厚さは、レドックス活性電荷タグ１８が十分に活性化される前に最小量の接触時間が経過するように、電流移動効率を調整するために使用され得る。接触時間は、電子移動が高い可能性で発生するように、レドックス活性電荷タグ１８がゲートＧ／電気伝導性チャネル３２の十分な近傍内に保持される時間を指し得る。この時間は、レドックス活性電荷タグ１８の種類、ゲート酸化物の厚さ、およびゲートＧ／電気伝導性チャネル３２からの電荷タグ１８の距離を含む多くの要因に依存する。ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２に一時的に接触するが、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２に付着したポリメラーゼ２６と実際には会合していない拡散性の標識ヌクレオチド１０を電荷センサー３５が十分に区別することを保証するために、このことは使用され得る。ポリメラーゼ２６の活性部位と会合しているヌクレオチド１０は、一過性の相互作用が発生する時間よりも有意に長い期間、会合状態にとどまると予想される。例えば、標識ヌクレオチド１０は、数百マイクロ秒から数百ミリ秒の間、ポリメラーゼ活性部位（例えば、ポリメラーゼ２６）と会合したままであり得る。一過性の相互作用は、桁違いに速い拡散タイムスケールで発生する。

【0064】

この例では、ポリメラーゼ２６は、テザー２８によって、電荷センサー３２のゲートＧ／電気伝導性チャネル３２上に固定される。テザー２８は、ポリメラーゼ２６のアンカーとして用いられる。テザー２８は、電子輸送能を示し得る。適切なテザー２８の例は、（例えば、５〜２５のヌクレオチドを有する）核酸鎖、ペプチド、単一炭素鎖、非伝導性または低伝導性のオリゴマーまたはポリマーなどを含む。

【0065】

いくつかの例では、テザー２８は、電荷センサー３５のゲートＧ／電気伝導性チャネル３２から少なくとも１０ｎｍ離れてポリメラーゼ２６を保持する。例えば、ポリメラーゼ２６の電荷および／またはポリメラーゼ２６によって保持された鋳型核酸３６の負電荷を感知することが望ましくない場合に、これは望ましいかもしれない。しかしながら、ポリメラーゼ２６および／または鋳型核酸３６の電荷を感知することが望ましい場合、テザー２８は、電荷センサー３２のゲートＧから約１０ｎｍ未満、約９ｎｍ未満、約８ｎｍ未満、約７ｎｍ未満、約６ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約４ｎｍ未満、約３ｎｍ未満、約２ｎｍ未満、または約１ｎｍ未満にポリメラーゼ２６を保持してもよい。

【0066】

ＦＥＴベースの電荷センサー３５の使用は、以下を可能にし得る：（１）適切に設計されたＦＥＴを用いて、単一分子の感度を達成することができる；および（２）検出された電荷の変化はゲートＧ／電気伝導性チャネル３２の近傍に局在するため、高度な並列化（「多重化可能性（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｉｌｉｔｙ）」とも呼ばれる）が容易になり、（例えば、アレイ中の）隣接する個別にアドレス可能なＦＥＴサイト間のクロストークが回避される。更に、シリコンナノ構造ＦＥＴは、半導体製造施設と適合する（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ）プロセスを使用して製造することができる。

【0067】

キットおよび／またはシステム３０の例は、フローセル３４に導入される鋳型核酸３６、およびフローセル３４に導入される試薬（図２には図示せず）も含み得る。

【0068】

鋳型核酸３６は、配列決定される任意のサンプルであり得、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体から構成され得る。鋳型（または標的）核酸３６の供給源は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または天然源由来の他の核酸であり得る。いくつかの場合、そのような供給源に由来する鋳型核酸３６は、本明細書の方法またはシステム３０で使用する前に増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、またはランダムプライマー増幅（ＲＰＡ）を含むがこれらに限定されない様々な既知の増幅技術のいずれかを使用することができる。本明細書に記載の方法またはシステム３０における使用前の標的核酸２６の増幅は任意であることを理解されたい。そのため、いくつかの例では、鋳型核酸３６は使用前に増幅されないであろう。鋳型／標的核酸は、任意で、合成ライブラリーに由来することができる。合成核酸は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ組成物を有し得るか、またはその類似体であり得る。

【0069】

鋳型核酸３６が由来し得る生物学的試料には、例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄動物、馬、羊、豚、ヤギ、牛、猫、犬、霊長類、ヒトまたは非ヒト霊長類などの哺乳動物；シロイヌナズナ、トウモロコシ、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）、エンバク、小麦、米、キャノーラ、または大豆などの植物；コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）などの藻類；カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）などの線虫；キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、蚊、ショウジョウバエ、ミツバチ、クモなどの昆虫；ゼブラフィッシュなどの魚；爬虫類；カエルやアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）などの両生類；キイロタマホコリカビ（ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）；ニューモシスチス・カリニ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）、酵母、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などの菌類；または熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来するものが含まれる。鋳型核酸３６は、細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）または肺炎マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの原核生物；古細菌；Ｃ型肝炎ウイルス、エボラウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス；またはウイロイド（ｖｉｒｏｉｄ）に由来することもできる。鋳型核酸３６は、上記の生物の均質な培養物または集団、または代替的に、例えばコミュニティまたは生態系における、いくつかの異なる生物のコレクションに由来し得る。

【0070】

更に、鋳型／標的核酸３６は天然源に由来しない場合があるが、既知の技術を使用して合成することができる。本明細書に記載の例で、例えば、遺伝子発現プローブまたは遺伝子型決定プローブ（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅｓ）を合成および使用することができる。

【0071】

いくつかの例では、鋳型／標的核酸３６は、１つ以上のより大きな核酸の断片として得ることができる。断片化は、例えば、噴霧化、超音波処理、化学的切断、酵素的切断、または物理的せん断を含む、当技術分野で知られている様々な技術のいずれかを使用して実行することができる。断片化はまた、より大きな核酸の一部のみをコピーすることによりアンプリコンを生成する特定の増幅技術の使用から生じる場合がある。例えば、ＰＣＲ増幅は、増幅中に隣接プライマーがハイブリダイズする位置の間にある元の鋳型上のヌクレオチド配列の長さによって規定されるサイズを有する断片を生成する。

【0072】

鋳型／標的核酸３６の集団、またはそのアンプリコンは、本明細書に記載の方法、キット、またはシステム３０の特定のアプリケーションのために望ましいまたは適切な平均鎖長を有することができる。例えば、平均鎖長は、約１００，０００ヌクレオチド未満、約５０，０００ヌクレオチド未満、約１０，０００ヌクレオチド未満、約５，０００ヌクレオチド未満、約１，０００ヌクレオチド未満、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満であり得る。代替的または追加的に、平均鎖長は、約１０ヌクレオチド超、約５０ヌクレオチド超、約１００ヌクレオチド超、約５００ヌクレオチド超、約１，０００ヌクレオチド超、約５，０００ヌクレオチド超、約１０，０００ヌクレオチド超、約５０，０００ヌクレオチド超、または約１００，０００ヌクレオチド超であり得る。標的核酸の集団またはそのアンプリコンの平均鎖長は、上記の最大値と最小値の間の範囲内であり得る。

【0073】

いくつかの場合、鋳型／標的核酸３６の集団は、そのメンバーの最大長を有する条件下で生成され得るか、そうでなければそのメンバーの最大長を有するように構成され得る。例えば、メンバーの最大長は、約１００，０００ヌクレオチド未満、約５０，０００ヌクレオチド未満、約１０，０００ヌクレオチド未満、約５，０００ヌクレオチド未満、約１，０００ヌクレオチド未満、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満または約５０ヌクレオチド未満であり得る。代替的または追加的に、鋳型核酸３６の集団、またはそのアンプリコンは、そのメンバーの最小長を有する条件下で生成され得るか、そうでなければそのメンバーの最小長を有するように構成され得る。例えば、メンバーの最小長は、約１０ヌクレオチド超、約５０ヌクレオチド超、約１００ヌクレオチド超、約５００ヌクレオチド超、約１，０００ヌクレオチド超、約５，０００ヌクレオチド超、約１０，０００ヌクレオチド超、約５０，０００ヌクレオチド超、または約１００，０００ヌクレオチド超であり得る。集団中の鋳型核酸３６の最大鎖長および最小鎖長は、上記の最大値と最小値の間の範囲内であり得る。

【0074】

図２に示されるように、シークエンシングされる鋳型核酸３６（例えば、一本鎖ＤＮＡ鎖）は、前述の標識ヌクレオチド１０（図２には表示せず）などの試薬とともに、または該試薬とは別に流体中に導入された後、ポリメラーゼ２６に結合する。

【0075】

鋳型核酸３６および／または試薬（例えば、標識ヌクレオチド１０）は、流体中に存在し、フローセル３４に導入されてもよい。該流体は低塩緩衝液を含み得る。例として、低塩緩衝液は、０ｍＭ超〜約５０ｍＭの塩を含み得る。一例として、低塩緩衝液は、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）中に、最高で５ｍＭのＭｇ^２＋を含む。低塩緩衝液の使用は、感知ゾーン３１（すなわち、デバイ長）が悪影響を受けない、即ち、電荷タグ１８の感知を妨げるほど長すぎないので望ましい場合がある。流体は、反応を促進する酵素などの触媒、その他の添加剤、および溶媒（例えば、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドなど）も含み得る。

【0076】

いくつかの例では、電荷センサー３５に導入される流体において、いくつかの異なる標識ヌクレオチド１０が一緒に使用される場合がある。これらの例では、連結分子１４、１４’が、すべての標識ヌクレオチドの種類で同一であっても、異なっていてもよいことを理解されたい。連結分子１４、１４’の特性、例えば長さおよび剛性は、レドックス反応の速度に影響を与えるように変更することができる。そのような特性は、標識ヌクレオチド１０およびその関連レドックス活性電荷タグ１８（ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｄｏｘ−ａｃｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ ｔａｇ １８）に対して個別に調整され得る。連結分子１４’の特異性領域２４の特性も、レドックス反応の速度に影響を与えるように変更することができる。連結分子１４、１４’は、レドックス活性電荷タグ１８が電気伝導性チャネル３２の近傍にある時間を増減するように変更することができる。そのような変更を使用して、電子移動の速度に影響を与えることができる。そうすることで、拡散性の標識ヌクレオチド１０による、電荷タグ１８と電気伝導性チャネル３２との間の一過性の相互作用が、電子移動を引き起こす可能性を低くすることができる。あるいは、レドックス活性電荷タグ１８を電気伝導性チャネル３２の近傍に、より長い期間、保持することは、電子移動のより高い可能性をもたらし得る。

【0077】

一例では、電荷センサー３５に導入される流体において、４つの異なる標識ヌクレオチド１０が使用され、４つの異なる標識ヌクレオチド１０のそれぞれは、異なるヌクレオチド１２（特に、異なる塩基２０）および異なるヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８を含む。この一例を図３に示す。この例では、標識ヌクレオチド１０は、以下を含む：ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第１標識ヌクレオチド１０Ａ（図３では、４つの正電荷で示されている）；ヌクレオチドとしてのデオキシグアノシンポリホスフェートおよび第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第２標識ヌクレオチド１０Ｇ（図３では、４つの負電荷で示されている）；ヌクレオチドとしてのデオキシチジンポリホスフェートおよび第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第３標識ヌクレオチド１０Ｃ（図３では、２つの負電荷で示されている）；およびヌクレオチドとしてのデオキシチミジンポリホスフェートおよび第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第４標識ヌクレオチド１０Ｔ（図３では、１つの正電荷で示されている）。この例では、第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。

【0078】

図３に示す例では、第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち２つ（例えば、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ）は、変更された電荷状態で（例えば、レドックス反応が起こった後で）正に帯電していて、第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち他の２つ（例えば、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）は、変更された電荷状態で（例えば、レドックス反応が起こった後で）負に帯電している

【0079】

図３に示す例では、ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち２つの上の電荷が同じ（正または負）であっても、該電荷が（例えば、レドックス活性化後に）異なる強度を有するため、ヌクレオチドの異なる種類を区別するためにタグ１８を依然として使用することができる。図３に示す例示的な構成は、単一のテザーハイブリダイゼーション位置および４つの異なるレドックス活性電荷タグ１８に基づく４状態の識別を提供する。具体的には、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰはともに、それらをｄＡＴＰおよびｄＴＴＰと区別する負に帯電したレドックス活性電荷タグ１８を含む；ｄＧＴＰは、ｄＣＴＰの電荷よりも明らかに高い（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｙ ｈｉｇｈｅｒ）電荷のため、ｄＣＴＰと区別することができる。同様に、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰは、ｄＴＴＰ部分と比較してｄＡＴＰ部分の正電荷が高いため、互いに区別することができる。

【0080】

いくつかの例では、負のタグを充電するために必要な電圧が正のタグを放電する可能性があり、その逆もまた然りであるため、同じ流体中で正および負の大きさの両方のレドックス活性電荷タグ１８を使用することは実現不可能かもしれない。そのため、他の例では、一方の極性のレドックス活性電荷タグ１８を含む本明細書に開示される標識ヌクレオチド１０の例を利用すること、および永久帯電した（即ち、レドックスではない）タグを含む他の標識ヌクレオチドを使用することが望ましいかもしれない。永久帯電したタグの例は、例えばリン酸基、ＤＭＴおよび／またはＦＭＯＣなどの負に帯電したタグ；または第一級アミンなどの正に帯電したタグを含む。一例として、１〜３の異なる標識ヌクレオチド１０（レドックス活性電荷タグ１８を含む）を使用することができ、標識ヌクレオチドの残りは、レドックス活性電荷タグ１８ではなく永久帯電したタグを含む。これは、還元条件または酸化条件（両方ではない）が使用される場合に特に有用である。溶液中に比較的高濃度の両方の電荷タイプの大きな部分が同時に存在しないため、これらの場合には凝集が起こらないはずであることを理解されたい。

【0081】

図３はまた、感知ゾーン３１（ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２の周りの影付き領域）を示す。電荷センサー３５は、生物学的に関連性のある塩条件（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓａｌｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、例えば約１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲で操作され得る。そのような塩溶液のデバイスクリーニング長は、約０．３ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲内であり得、感知ゾーン３１をゲートＧの表面の外側の数ｎｍに制限し、しばしば信号レベルを検出限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）にまで低下させ得る。

【0082】

図３では、電気伝導性チャネル３２上にいくつかのつながれたポリメラーゼ２８が示されているが、特定の電荷センサー３５では、１つのポリメラーゼ２８が１つの電気伝導性チャネル３２につながれることを理解されたい。したがって、図３に示す例は、４つの異なるヌクレオチド取り込みイベント中のポリメラーゼ２８、およびそれぞれの取り込みイベント中の異なるレドックス活性電荷タグ１８に対する影響を示している。

【0083】

ここで図４を参照すると、方法の一例が示されている。方法１００は、ポリメラーゼ２６がつながった電気伝導性チャネル３２に鋳型核酸３６を導入するステップ（参照番号１０２）；前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチドを導入するステップであって、前記標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチドおよびそれに付着したヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含み、それにより、前記標識ヌクレオチドの１つが前記ポリメラーゼと会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ステップ（参照番号１０４）；前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合している間に、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間のレドックス反応を開始するステップ（参照番号１０６）；および前記レドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ（参照番号１０８）を含む。方法１００の議論を通して、図５Ａおよび５Ｂも参照される。

【0084】

図５Ａに示すように、電荷センサー３２に導入された鋳型核酸３６は、電荷センサー３２につながれたポリメラーゼ２６によって所定の位置に保持され得る。図５Ａに示される鋳型核酸３６は、ＤＮＡの鋳型鎖であり得る。

【0085】

また、図５Ａに示されるように、標識ヌクレオチド１０は、鋳型核酸３６の標的核酸に相補的な塩基２０を含み得る。標識ヌクレオチド１０は、部分的に（ｉｎ ｐａｒｔ）、鋳型核酸３６にも結合したポリメラーゼ２６によって所定の位置に保持される。存在する場合、標識ヌクレオチド１０の連結分子１４’の特異性領域２４は、テザー２８と相互作用し得る。

【0086】

テザー２８と会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｔｈｅｒ ２８）標識ヌクレオチド１０の一例を図５Ｂに示す。この例では、標識ヌクレオチド１０の連結分子１４’は、テザー２８の一部（たとえば、Ａ、Ｂ、Ｃ）に対して親和性を有する特異性領域２４（例えば、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’）を含む。この特定の例では、特異性領域２４（例えば、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’）は、テザー２８の当該部分（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ）のヌクレオチドまたはペプチド核酸に相補的なヌクレオチドまたはペプチド核酸を含む。別の例では、特異性領域２４およびテザー２８の受容領域は、互いに親和性を有する非核酸部分であってもよい。更に別の例では、特異性領域２４は、疎水性ポリマー（テザー２８の一例）に対して親和性を有する非核酸部分であってもよい。これらの領域間の特異的結合は、標準的なワトソン−クリックの塩基対合から生じ得る。この例では、特異性領域２４は、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’ヌクレオチド配列に隣接するイノシン（Ｉ）も含むことができる。イノシンはユニバーサル塩基であるため、ＤＮＡの４つの天然ヌクレオチドのすべてと対合することができる。かくして、追加の結合相互作用が、テザー２８上の天然ヌクレオチドとユニバーサル塩基（例えば、イノシンＩ）との相互作用から生じ得る。したがって、取り込み中に標識ヌクレオチド１０がポリメラーゼ２６に結合すると、標識ヌクレオチド１０の特異性領域２４とテザー２８との間に相乗的な結合が起こり、標識ヌクレオチド１０とテザー２８の間の相互作用の安定性が大幅に向上する。

【0087】

標識ヌクレオチド１０の連結分子１４が特異性領域２４を含まない場合、標識ヌクレオチド１０はポリメラーゼ２６との相互作用により所定の位置に保持されるであろうことを理解されたい。連結分子１４の長さは、レドックス活性電荷タグ１８がゲートＧ／電気伝導性チャネル３２の感知ゾーン３１内に保持されることを確実にするのを助けることができる。

【0088】

標識ヌクレオチド１０とポリメラーゼ２６との間、または標識ヌクレオチド１０とポリメラーゼ２６およびテザー２８との間の相互作用は、レドックス活性電荷タグ１８が電気伝導性チャネル３２の感知ゾーン３１内に入ることをもたらす。当該相互作用はまた、効率的かつ完全な電荷移動に十分な時間の間、感知ゾーン３１内にレドックス活性電荷タグ１８を維持することを助ける。当該時間は最長で数十ミリ秒であり得る。この比較的長い相互作用は、拡散して電気伝導性チャネル３２に短時間だけ接触し得る、溶液中に存在する他の標識ヌクレオチド１０とは異なる。短時間の相互作用は、十分な電荷移動が起こるほど十分に長くないため、これらの例では、レドックス活性電荷タグ１８は帯電されず、電荷センサー３２によって応答は検出されない。

【0089】

図５Ａに示される例では、標識ヌクレオチドの銅フタロシアニンレドックス活性電荷タグ１８が、電気伝導性チャネル３２から約１ｎｍ〜約２ｎｍ以内の場（ｆｉｅｌｄ）（例えば、感知ゾーン３１）に入る。標識ヌクレオチド１０は所定の位置に保持されているため、レドックス活性電荷タグ１８は、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２によって帯電される位置にある。

【0090】

ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２（例えば、シリコンナノワイヤ、カーボンナノチューブなど）とレドックス活性電荷タグ１８との間のレドックス反応を開始するために、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２に印加される電圧は、レドックス活性電荷タグ１８の酸化電圧または還元電圧に調整され得る。酸化されると、レドックス活性電荷タグ１８は電子を失い、したがってゲートＧ／電気伝導性チャネル３２はレドックス活性電荷タグ１８に正味の正電荷を生成する。還元されると、レドックス活性電荷タグ１８は電子を獲得し、したがってゲートＧ／電気伝導性チャネル３２はレドックス活性電荷タグ１８に正味の負電荷を注入する。レドックス反応の結果として、レドックス活性電荷タグ１８の電荷状態は変更される。この変更されたより高い荷電状態（例えば、荷電される前のレドックス活性電荷タグ１８の状態（非酸化または非還元状態）と比較して）は、電気伝導性チャネル３２の周りの場（ｆｉｅｌｄ）を乱し、検出可能な信号を生成する。

【0091】

レドックス反応中および検出中に電気伝導性チャネル３２に印加される電圧は、使用されるレドックス活性電荷タグ１８に依存し得る。例えば、充電電圧（ｃｈａｒｇｉｎｇ ｖｏｌｔａｇｅ）は読み取り電圧（ｒｅａｄｉｎｇ ｖｏｌｔａｇｅ）と異なっていてもよく、したがって、電気伝導性チャネル３２は充電電圧と読み取り電圧との間を循環（ｃｙｃｌｅ）する場合がある。一例では、レドックス反応を開始するステップは、電気伝導性チャネル３２に充電電圧を印加することを含み、電気伝導性チャネル３２の応答を検出するステップは、電気伝導性チャネル３２に読み取り電圧を印加することを含む。

【0092】

レドックス反応後の電気伝導性チャネル３２の応答は、レドックス活性電荷タグ１８の変更された電荷状態を示している。レドックス活性電荷タグ１８はヌクレオチド特異的である（即ち、特定のタグ１８が特定の塩基２０に対して選択される）ため、レドックス反応後の電気伝導性チャネル３２の応答は、標識ヌクレオチド１０の塩基２０も示し得る。したがって、方法１００は、電気伝導性チャネル３２の応答を、標識ヌクレオチド１０のの前記会合している１つ（即ち、ポリメラーゼ２６と会合している標識ヌクレオチド１０）のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８に関連付けるステップ、およびヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８に基づいて、前記会合しているヌクレオチド１０（即ち、ポリメラーゼ２６と会合している標識ヌクレオチド１０）のヌクレオチド（例えば、塩基２０）を識別するステップも含み得る。

【0093】

前記会合している標識ヌクレオチド１０の塩基２０は、鋳型核酸３６にハイブリダイズされる新生鎖３８取り込まれる。このことは、標識ヌクレオチド１０のリン酸基１６と新たに取り込まれたヌクレオチド塩基２０との間の結合を自然に（ｎａｔｕｒａｌｌｙ）切断する。例えば、新生鎖３８へのヌクレオチド塩基２０の取り込み後、αリン酸と連結分子１６の間の結合、またはαリン酸とβリン酸の間の結合が自然に切断される。その結果、標識ヌクレオチド１０の残部（例えば、成分１４または１４’と１８）は、ヌクレオチド塩基２０から自由に解離し、電気伝導性チャネル３２から自由に離れて拡散し、それにより、電気伝導性チャネル３２の周りの場（ｆｉｅｌｄ）を標識ヌクレオチド１０のポリメラーゼ２６との結合前の状態に戻す。電気伝導性チャネル３２の周囲の場（ｆｉｅｌｄ）がそれぞれ摂動されるとき、および非摂動状態に戻るときの信号の出現および消失は、鋳型核酸３６の新生鎖３８へのヌクレオチド塩基２０の取り込みと相関させることができる。したがって、方法１００の例は、標識ヌクレオチド１０の前記会合している１つ（ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １０）から、ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８および連結分子１４、１４’を（例えば、リン酸基１６で）切断するステップであって、それにより、前記会合している標識ヌクレオチド１０のヌクレオチド塩基２０が、鋳型核酸３６に相補的な新生鎖３８に取り込まれるも含む。切断するステップは、自然な切断が起こるのを待つことを含み得る。連続した標識ヌクレオチド塩基２０の取り込みの間に信号はベースライン状態に戻るため、鋳型鎖３６に沿った新生鎖３８内のホモポリマーセグメント（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔｓ）の検出が可能である。

【0094】

本明細書に開示されるいくつかの例は、電気伝導性チャネル３２の感知ゾーン３１の近くにレドックス活性電荷タグ１８を持ってきてかつ保持するために、単独でまたはテザー２８と組み合わせて、標識ヌクレオチド１０のポリメラーゼ２６への相乗的な結合（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）を利用する。テザー２８と特異性領域２４の間で形成された複合体の安定性は比較的低いため、（特異性領域２４とテザー２８との間の）複合体は、ポリメラーゼ２６にも結合しない標識ヌクレオチド１０では形成されない（即ち、溶液中でフリーの標識ヌクレオチド１０は、テザー２８に実質的に結合しない場合がある）。換言すれば、該複合体のオフ速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）は十分に高く、寿命が短くなり得る。しかしながら、標識ヌクレオチド１０とポリメラーゼ２６の間に安定した会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が形成されると、連結分子１４、１４’の局所濃度がテザー２８の周りで増加し、したがってテザー２８に対する特異性領域２４のオン速度（ｏｎ ｒａｔｅ）が高くなる。このようにして、標識ヌクレオチド１０のポリメラーゼ会合状態（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）では、浮動性（ｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ）標識ヌクレオチド１０の非会合状態と比較して、全体的な会合時間（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）が大幅に増加する。ポリメラーゼ３０に対する標識ヌクレオチド１０の親和性の相乗効果は、単独でまたはテザー２８と組み合わせて、全体的にかなりの（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）結合親和性を可能にする。ヌクレオチド塩基２０の取り込み後のポリメラーゼ２６による自然切断後、該相乗効果が失われ、電荷タグ１８も電気伝導性チャネル３２から解離するであろう。

【0095】

例示的な方法１００では、標識ヌクレオチド１０の１つがポリメラーゼ２８と会合するステップ、前記レドックス反応を開始するステップ、前記検出するステップ、前記応答を関連付けるステップ、および前記取り込まれたヌクレオチド塩基２０を識別するステップは合わせて、シークエンシングサイクルである。方法１００は、ポリメラーゼ２６と会合している別の標識ヌクレオチド１０で、別のシークエンシングサイクルを行うステップを更に含んでもよい。次のシークエンシングサイクルを行うステップは、標識ヌクレオチド１０の次の１つをポリメラーゼ２６と会合させること；標識ヌクレオチド１０の前記次の１つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８の電荷状態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８と電荷センサー３２との間の他のレドックス反応を開始すること；前記他のレドックス反応に応じて、電荷センサー３２の他の応答を検出すること；電荷センサー３２の前記他の応答を、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付ける（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）こと；および前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８に基づいて、標識ヌクレオチド１０の前記次の１つ（即ち、ポリメラーゼ２６に結合している）のヌクレオチド（塩基２０）を識別すること、を含み得る。前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは切断され得、標識ヌクレオチド１０の前記次の１つのヌクレオチド（塩基２０）は、鋳型核酸３６に相補的な新生鎖３８に取り込まれる。シークエンシングサイクルは繰り返され得る。

【0096】

本明細書で開示される例では、波形も利用され得る。波形は、いつそれが異なる酸化還元電位を有するレドックス活性電荷タグ１８の酸化還元電位についての１つ以上の閾値電圧に達するかを決定するために、モニターされ得る。これらの例では、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２を流れる結果として生じる電流の変化は、特定の閾値電圧に関連するレドックス活性電荷タグ１８を含む標識ヌクレオチド１０の塩基２０を識別する情報として使用され得る。

【0097】

本明細書に開示される例では、レドックス活性電荷タグ１８に移動されるまたはレドックス活性電荷タグ１８から移動される電子の数もモニターされ得る。移動された電子の数を使用して、ポリメラーゼ２６と会合したヌクレオチド塩基２０、およびポリメラーゼ２６が新生鎖３８に取り込むヌクレオチド塩基２０を同定することができる。

【0098】

本明細書に開示される標識ヌクレオチド１０およびシステム１０は、様々なアプリケーションのいずれかに使用することができる。図４、図５Ａおよび図５Ｂを参照して説明したように、特に有用なアプリケーションは、単一分子の合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）などの核酸シークエンシングである。単一分子のＳＢＳでは、鋳型核酸３６（例えば、標的核酸またはそのアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長がモニターされ、鋳型３６内のヌクレオチド配列が決定される。基礎となる化学プロセスは、（例えば、本明細書に記載のポリメラーゼ酵素２６により触媒されるような）重合であり得る。特定のポリメラーゼベースの単一分子のＳＢＳの例では、プライマーに付加されたヌクレオチドの順番および種類の検出を使用して鋳型配列を決定できるように、ヌクレオチド（例えば、塩基２０）が鋳型に依存する方法でプライマーに付加される（それにより、プライマーを伸長し、新生鎖３８を形成する）。異なる鋳型３６について発生するイベントが電気伝導性チャネル３２の各々に動作可能に接続された個々の検出器によって区別され得る条件下で、アレイの異なる電気伝導性チャネル３２における複数の異なる鋳型３６を、単一分子ＳＢＳ技術にかけることができる。各電気伝導性チャネル３２（ならびにそのソースおよびドレイン端部Ｓ、Ｄ）は、フローセルの窪みまたはウェル内に配置することができ、このことは、アレイ内において隣接するチャネル３２から１つのチャネル３２を物理的に分離することを助ける。

【0099】

本明細書に開示される標識ヌクレオチド１０、キット、およびシステム３０の他の適切なアプリケーションは、ライゲーションによるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）およびハイブリダイゼーションによるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を含む。本明細書に開示される標識ヌクレオチド１０およびシステム３０の別の有用なアプリケーションは、遺伝子発現解析である。遺伝子発現は、ＲＮＡシークエンシング技術、例えばデジタルＲＮＡシークエンシングと呼ばれるものを使用して検出または定量化することができる。ＲＮＡシークエンシング技術は、光学標識ヌクレオチドの蛍光検出が本明細書に記載の電荷ベースの検出方法で置換され得ることを除いて、上記のような当技術分野で公知のシークエンシング方法論を使用して実施することができる。遺伝子発現はまた、アレイへの直接ハイブリダイゼーションによって実行されるハイブリダイゼーション技術を使用して、またはその産物がアレイ上で検出される多重アッセイを使用して、検出または定量化することができる。これらの方法は、光学標識および蛍光検出を、電荷ベースの検出技術および本明細書に記載のレドックス活性電荷タグ１８で置換することにより、容易に適合させることができる。

【0100】

前述の概念および以下でより詳細に説明される追加の概念の全ての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しない場合）は、本明細書で開示された本発明の主題の一部として企図されることを理解されたい。特に、本開示の最後に現れる特許請求の範囲に記載された主題の全ての組み合わせは、本明細書で開示された本発明の主題の一部として企図される。また、参照により援用される任意の開示にも現れ得る、本明細書で明示的に使用される用語には、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解されたい。

【0101】

本明細書全体にわたる「一例」、「別の例」、「例」などへの言及は、当該例に関連して説明される特定の要素（例えば、機能、構造、および／または特性）が本明細書に記載される少なくとも１つの例に含まれ、他の例には存在しても存在しなくてもよいことを意味する。加えて、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、任意の例について説明された要素は、様々な例において任意の適切な方法で組み合わされ得ることを理解されたい。

【0102】

特許請求の範囲を含む本開示全体で使用される「実質的に」および「約」という用語は、処理のばらつきなどによる小さな変動を記載および説明するために使用される。例えば、それらは、±５％以下、例えば±２％以下、例えば±１％以下、例えば±０．５％以下、例えば±０．２％以下、例えば±０．１％以下、例えば±０．０５％以下を指すことができる。

【0103】

更に、本明細書で提供される範囲には、あたかもそのような値または部分範囲が明示的に列挙されているかのように、述べられた範囲および述べられた範囲内の任意の値または部分範囲が含まれることを理解されたい。例えば、約１電荷〜約１００電荷で表される範囲は、明示的に記載された約１電荷〜１００電荷の制限だけでなく、約５電荷、５０電荷、７５電荷などの個々の値、および約１５電荷〜約８５電荷などの部分範囲も含むと解釈されるべきである。

【0104】

いくつかの例を詳細に説明したが、開示された例は修正され得ることを理解されたい。したがって、前述の説明は非限定的と見なされるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】