特許 6989521 標的化リガンド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6989521

(24)【登録日】2021年12月6日

(45)【発行日】2022年1月5日

(54)【発明の名称】標的化リガンド

(51)【国際特許分類】

   C07H 15/04 20060101AFI20211220BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20211220BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20211220BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20211220BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211220BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20211220BHJP

【ＦＩ】

   C07H15/04 DCSP

   A61K31/713

   A61K47/54

   A61K48/00

   A61P43/00 105

   A61P43/00 111

   !C12N15/113 ZZNA

【請求項の数】29

【全頁数】207

(21)【出願番号】特願2018-555750(P2018-555750)

(86)(22)【出願日】2017年3月7日

(65)【公表番号】特表2019-526527(P2019-526527A)

(43)【公表日】2019年9月19日

(86)【国際出願番号】US2017021147

(87)【国際公開番号】WO2018044350

(87)【国際公開日】20180308

【審査請求日】2020年3月6日

(31)【優先権主張番号】62/383,221

(32)【優先日】2016年9月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/456,339

(32)【優先日】2017年2月8日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512219840

【氏名又は名称】アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】チェン リー

(72)【発明者】

【氏名】タオ ペイ

(72)【発明者】

【氏名】アグニエシュカ グレボッカ

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ローラー

(72)【発明者】

【氏名】フレッド フレイツ

(72)【発明者】

【氏名】エーリヒ アルテンホーファー

(72)【発明者】

【氏名】パンカージ クマール

【審査官】 梅田 隆志

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５０７３９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５０４２９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０１２２２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０９０８１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１５−５３２０９７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ １５／０４

Ａ６１Ｋ ３１／７１３

Ａ６１Ｋ ４７／５４

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下から成る群から選択される構造を有する標的化リガンド；

【化1】

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（構造１００１）；

【化2】

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（構造１００２）；

【化3】

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（構造１００３）；

【化4】

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（構造１００４）；

【化5】

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（構造１００５）；

【化6】

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（構造１００６）；

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００７）；

【化8】

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（構造１００８）；

【化9】

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（構造１００９）；

【化10】

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（構造１０１２）；

【化11】

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（構造１０１４）；

【化12】

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（構造１０１６）；

【化13】

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（構造１０１８）；

【化14】

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（構造１０１９）；

【化15】

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（構造１０２１）；及び

【化16】

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（構造１０２３）
又はその医薬的に許容され得る塩。

【請求項2】

前記構造が、以下から成る群から選択される、請求項１に記載の標的化リガンド：

【化17】

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（構造１００３）；および

【化18】

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（構造１００８）
又はその医薬的に許容され得る塩。

【請求項3】

前記標的化リガンドが、ＲＮＡｉ剤に連結される、請求項１又は２に記載の標的化リガンド。

【請求項4】

前記ＲＮＡｉ剤が、二本鎖である、請求項３に記載の標的化リガンド。

【請求項5】

前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、該ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端にて標的化リガンドに連結される、請求項４に記載の標的化リガンド。

【請求項6】

前記ＲＮＡｉ剤が、ホスファート基、ホスホロチオアート基、またはホスホナート基を介して標的化リガンドのリンカーに連結される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の標的化リガンド。

【請求項7】

請求項１に記載の標的化リガンドが連結されたＲＮＡｉ剤を含む組成物であって、該標的化リガンドに連結されたＲＮＡｉ剤の構造が、以下から成る群から選択される構造によって表される、組成物：

【化19】

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（構造１００１ａ）；

【化20】

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（構造１００２ａ）；

【化21】

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（構造１００３ａ）；

【化22】

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（構造１００４ａ）；

【化23】

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（構造１００５ａ）；

【化24】

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（構造１００６ａ）；

【化25】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００７ａ）；

【化26】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００８ａ）；

【化27】

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（構造１００９ａ）；

【化28】

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（構造１０１２ａ）；

【化29】

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（構造１０１４ａ）；

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１６ａ）；

【化31】

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（構造１０１８ａ）；

【化32】

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（構造１０１９ａ）；

【化33】

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（構造１０２１ａ）；及び

【化34】

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（構造１０２３ａ）
又はその医薬的に許容され得る塩
｛式中、各構造におけるＲは、ＲＮＡｉ剤を含む｝。

【請求項8】

前記標的化リガンドが、ホスファート基、ホスホロチオアート基、またはホスホナート基を介してＲＮＡｉ剤に連結される、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記ＲＮＡｉ剤が、二本鎖ＲＮＡｉ剤である、請求項７又は８に記載の組成物。

【請求項10】

前記標的化リガンドが、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に連結される、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

以下から成る群から選択される構造を有する化合物：

【化35】

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（構造１００１ｂ）；

【化36】

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（構造１００２ｂ）；

【化37】

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（構造１００３ｂ）；

【化38】

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（構造１００４ｂ）；

【化39】

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（構造１００５ｂ）；

【化40】

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（構造１００６ｂ）；

【化41】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００７ｂ）；

【化42】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００８ｂ）；

【化43】

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（構造１００９ｂ）；

【化44】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１２ｂ）；

【化45】

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（構造１０１４ｂ）；

【化46】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１６ｂ）；

【化47】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１８ｂ）；

【化48】

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（構造１０１９ｂ）；

【化49】

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（構造１０２１ｂ）；及び

【化50】

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（構造１０２３ｂ）
又はその医薬的に許容され得る塩。

【請求項12】

対象における標的核酸の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１又は２に記載の標的化リガンドに連結したＲＮＡｉ剤を含む前記医薬組成物。

【請求項13】

治療用化合物を哺乳動物細胞内に導入するための医薬組成物であって、該治療用化合物に連結した、請求項１又は２に記載の標的化リガンドを含む前記医薬組成物。

【請求項14】

前記細胞が対象の体内に存在する、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記対象がヒトである、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記治療用化合物が、ＲＮＡｉ剤である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記ＲＮＡｉ剤が、二本鎖ＲＮＡｉ剤である、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

治療用化合物の投与から恩恵を受けるであろう疾患または障害を治療するための医薬組成物であって、治療用化合物に連結した請求項１又は２に記載の標的化リガンドを含む前記医薬組成物。

【請求項19】

ＲＮＡｉ剤の投与から恩恵を受けるであろう疾患または障害を治療するための医薬の製造における、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。

【請求項20】

ＲＮＡｉ剤の投与から恩恵を受けるであろう疾患または障害を治療するための、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

請求項１又は２に記載の標的化リガンドを含むホスホラミダイト化合物を製造する方法であって：
（ｉ）リンカーのカルボン酸部分または活性化エステルを、分岐点基上に位置する末端アミンに共有結合で連結し、そして、
（ｉｉ）ホスホラミダイト形成試薬を用いたホスフィチル化反応によって、リンカーをホスホラミダイトのリン原子に連結し；それによって、標的化リガンドを含むホスホラミダイト化合物を形成することを含む該方法。

【請求項22】

前記ホスホラミダイト形成試薬が、以下から選択される、請求項２１に記載の方法：

【化51】

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【請求項23】

薬剤として使用するための、治療用化合物に連結された、請求項１又は２に記載の標的化リガンド。

【請求項24】

哺乳動物細胞内に治療用化合物を導入する際に使用するための、対象における標的核酸の発現を阻害するための、または治療用化合物の投与から恩恵を受けるであろう疾患もしくは障害を治療するための、治療用化合物に連結された、請求項１又は２に記載の標的化リガンド。

【請求項25】

前記治療用化合物が、ＲＮＡｉ剤である，請求項２４に記載の標的化リガンド。

【請求項26】

前記ＲＮＡｉ剤が、二本鎖ＲＮＡｉ剤である、請求項２５に記載の標的化リガンド。

【請求項27】

前記標的化リガンドが、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に連結される、請求項２６に記載の標的化リガンド。

【請求項28】

前記ＲＮＡｉ剤が、薬理学的有効量で存在する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項29】

以下から成る群から選択される構造を有する化合物：

【化52】

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（構造１００１ａ（ｉ））；

【化53】

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（構造１００２ａ（ｉ））；

【化54】

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（構造１００３ａ（ｉ））；

【化55】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００４ａ（ｉ））；

【化56】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００５ａ（ｉ））；

【化57】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００６ａ（ｉ））；

【化58】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００７ａ（ｉ））；

【化59】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００８ａ（ｉ））；

【化60】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００９ａ（ｉ））；

【化61】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１２ａ（ｉ））；

【化62】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１４ａ（ｉ））；

【化63】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１６ａ（ｉ））；

【化64】

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（構造１０１８ａ（ｉ））；

【化65】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１９ａ（ｉ））；

【化66】

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（構造１０２１ａ（ｉ））；及び

【化67】

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（構造１０２３ａ（ｉ））
又はその医薬的に許容され得る塩
｛式中、Ｒは、ＲＮＡｉ剤であり、Ｙは、ＯまたはＳであり、そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻またはＮＨ⁻である｝。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月２日に出願された米国特許仮出願第６２／３８３，２２１号および２０１７年２月８日に出願された米国特許仮出願第６２／４５６，３３９号による優先権を主張するものであり、そのそれぞれの内容の全体を参照によって本明細書中に援用する。

【背景技術】

【0002】

背景
多くの化合物が、治療効果を有するかまたは診断目的で有用となるためには、特定位置に（例えば、所望の（単数もしくは複数の）細胞に）送達される必要がある。生体内において治療用化合物を送達することを試みる場合には、こうしたことが頻繁にある。さらに、特定位置に効率的に化合物を送達できることは、該化合物の投与によって引き起こされる可能性がある意図しない結果（標的を外れた効果など）を制限するかまたは潜在的に排除する。生体内の所望の位置に治療用化合物などの化合物の送達を容易にする１つの方法は、標的化リガンドに化合物を連結されたかまたは取り付けることである。

【0003】

標的化リガンドを使用することで標的化され得る治療用化合物のクラスの１つが、オリゴマー化合物である。標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴマー化合物が、生体外および生体内の両方において標的の機能および活性を変更することが示された。標的核酸（ｍＲＮＡなど）を含有する細胞に送達されたとき、オリゴマー化合物は、該標的の発現を調節して、標的核酸の変更された転写または翻訳をもたらすことが示された。特定の事例では、前記オリゴマー化合物は、核酸標的を阻害すること、および／または標的核酸の分解を引き起こすことによって遺伝子の発現を低減し得る。

【0004】

標的核酸がｍＲＮＡであれば、発現阻害オリゴマー化合物がｍＲＮＡ標的の発現を調節し得る１つの機構は、ＲＮＡ干渉による。ＲＮＡ干渉とは、ＲＮＡまたはＲＮＡ様分子（化学的に修飾されたＲＮＡ分子など）が分解によって遺伝子発現を抑制することができる生物学的プロセスである。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を予防するために使用される、進化的に保存された細胞防御機構であると考えられる。

【0005】

合成ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子は、生体内においてＲＮＡ干渉を誘発することが示された。例えば、Elbashirら（Nature 2000, 411, 494-98）は、培養哺乳動物細胞において２１ヌクレオチドの合成ＲＮＡ分子の二本鎖の導入によって引き起こされたＲＮＡｉを記載している。ＲＮＡｉ応答機構を引き起こす可能性のある合成のＲＮＡまたはＲＮＡ様分子のタイプは、修飾ヌクレオチドおよび／または１もしくは複数の非ホスホジエステル結合から成ってもよい。

【0006】

さらに、（修飾ヌクレオチドを含み、かつ、１もしくは複数の非ホスホジエステル結合を有する可能性もある）一本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子は、標的ｍＲＮＡなどの標的核酸の発現を変更する可能性もある。

【発明の概要】

【0007】

概要
ヒト患者または動物などの対象の体内の特定の臓器または組織、例えば、特定の標的部位への治療用化合物の送達を促進する可能性のある標的化リガンドを、本明細書中に開示する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した標的化リガンドは、発現阻害オリゴマー化合物の標的送達を促進し得る。いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、肝臓への発現阻害オリゴマー化合物の送達を促進する。

【0008】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、１もしくは複数の標的化部分、１もしくは複数のテザー、１もしくは複数の分岐点基、および１もしくは複数のリンカーを含むか、それらから成るか、または実質的にそれらから成る。本明細書中に開示した標的化リガンドにおける使用に好適なリンカーは「剛性」リンカーを含み、そしてそれは、１もしくは複数の標的化部分と、それもしくはそれらが連結される治療用化合物との間の潜在的な相互作用を低減するために標的化リガンド全体に十分な安定性および剛性を与える。加えて、本明細書中に開示した標的化リガンドにおける使用に好適な「剛性」リンカーは、ホスホラミダイト化合物（本明細書中では「ホスホラミダイト含有化合物」とも呼ばれる）として標的化リガンドを効率的に合成するのに有用である。

【0009】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、１もしくは複数の標的化部分、１もしくは複数のテザー、およびリンカー置換部分を有する１もしくは複数の分岐点基を含むか、それらから成るか、または実質的にそれらから成る。該リンカー置換部分は、分岐点基内に位置し、１もしくは複数の置換もしくは非置換シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル基、または共有結合で連結されたその組み合わせを含むか、それらから成るか、または実質的にそれらから成る。分岐点基内にリンカー置換部分を有することで、標的化リガンド全体に十分な安定性と剛性を提供することによって、本明細書中に開示した「剛性」リンカーのものに類似した特性を与える。加えて、標的化リガンドにおける使用に好適なリンカー置換部分を有する分岐点基は、ホスホラミダイト化合物として標的化リガンドを効率的に合成するのに有用である。

【0010】

リンカー、分岐点基、１もしくは複数のテザー、および１もしくは複数の標的化部分を含み、式Ｉの構造を含むか、それらから成るか、または実質的にそれらから成る標的化リガンドを本明細書中に開示する：

【0011】

【化1】

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｛式中、ｎは、１〜４の整数（例えば、１か、２、３または４）であり、かつ、式中、該リンカーは、以下から成る群から選択される構造である：

【0012】

【化2】

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【0013】

【化3】

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【0014】

（式中、ｎ’は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、そして、存在する場合、それぞれのＺ’は独立に：Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換もしくは非置換アミノ、カルボキシル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、ハロゲン（例えば、Ｆ）、ヒドロキシル、アミド、置換アミド、シアノ、置換もしくは非置換ケト、置換もしくは非置換アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換アリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換ヘテロアリールオキシカルボニル、またはスルフヒドリルから成る群から選択され）（構造７）；

【0015】

【化4】

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【0016】

（式中、ｎ”は、０、１、２、３、４（例えば、１、２、３、または４）であり、そして、存在する場合、それぞれのＺ”は独立に：Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換もしくは非置換アミノ、カルボキシル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、ハロゲン（例えば、Ｆ）、ヒドロキシル、アミド、置換アミド、シアノ、置換もしくは非置換ケト、置換もしくは非置換アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換アリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換ヘテロアリールオキシカルボニル、またはスルフヒドリルから成る群から選択され）（構造８）；および

【0017】

【化5】

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【0018】

（式中、Ｖは、１もしくは複数の置換もしくは非置換シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘプチル、シクロオクチルなど）、置換もしくは非置換シクロアルケニル（例えば、シクロヘキセニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、シクロヘキサジエニル、シクロペンタジエニル、シクロヘプタジエニル、シクロオクタジエニルなど）、置換もしくは非置換アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ビナフチル、アントラセニルなど）、置換もしくは非置換ヘテロアリール（例えば、ピリジル、ピリミジニル、ピロール、イミダゾール、フラン、ベンゾフラン、インドールなど）、または置換もしくは非置換ヘテロシクリル（例えば、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピロリジンなど）、あるいは任意の、共有結合で連結されたその組み合わせを含む）（構造９）｝。

【0019】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、リンカー置換部分を有する分岐点基を含む。
リンカー置換部分を有する分岐点基、１もしくは複数のテザー、および１もしくは複数の標的化部分を含む、式ＩＩの構造を含むか、それらから成るか、または実質的にそれらから成る標的化リガンドを本明細書中に開示する：

【0020】

【化6】

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【0021】

｛式中、ｎは、１〜４の整数（例えば、１、２、３、または４）であり、そして、式中、１もしくは複数の置換もしくは非置換シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘプチル、シクロオクチルなど）、置換もしくは非置換シクロアルケニル（例えば、シクロヘキセニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、シクロヘキサジエニル、シクロペンタジエニル、シクロヘプタジエニル、シクロオクタジエニルなど）、置換もしくは非置換アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ビナフチル、アントラセニルなど）、置換もしくは非置換ヘテロアリール（例えば、ピリジル、ピリミジニル、ピロール、イミダゾール、フラン、ベンゾフラン、インドールなど）、または置換もしくは非置換ヘテロシクリル（例えば、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピロリジンなど）、あるいは任意のその組み合わせを含む該リンカー置換部分が、分岐点基内に位置する｝。

【0022】

本明細書中に開示した標的化リガンドは、治療用化合物などの化合物、例えば、発現阻害オリゴマー化合物に、例えば、該発現阻害オリゴマー化合物の３’または５’末端に、直接的または間接的に連結され得る。いくつかの実施形態において、前記発現阻害オリゴマー化合物としては、１もしくは複数の修飾ヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記発現阻害オリゴマー化合物は、二本鎖ＲＮＡｉ剤などのＲＮＡｉ剤である。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に連結される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端にて、ホスファート基、ホスホロチオアート基、またはホスホナート基を介してＲＮＡｉ剤に連結される。

【0023】

本明細書中に開示した標的化リガンドは、１もしくは複数の標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、標的化部分としてＮ−アセチルガラクトサミンを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【0024】

【化7】

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（構造１００３）；

【0025】

【化8】

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（構造１００８）；

【0026】

【化9】

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（構造１０２３）；または

【0027】

【化10】

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（構造１０２７）。

【0028】

標的化リガンドおよび発現阻害オリゴマー化合物を含むか、それらから成るか、または実質的にそれらから成る組成物を本明細書中に開示する。標的化リガンドおよびＲＮＡｉ剤を含む組成物を本明細書中に開示する。

【0029】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドおよびＲＮＡｉ剤を含む、本明細書中に開示した組成物は、以下の構造式によって表される構造を有する：

【0030】

【化11】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００２ａ）；

【0031】

【化12】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００３ａ）；

【0032】

【化13】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００５ａ）；

【0033】

【化14】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００８ａ）；

【0034】

【化15】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１２ａ）；または

【0035】

【化16】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０２７ａ）。

【0036】

標的化リガンドを含むホスホラミダイト化合物を本明細書中に開示する。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドを含むホスホラミダイト化合物は、以下の構造式によって表される構造を有する：

【0037】

【化17】

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（構造１００１ｂ）；

【0038】

【化18】

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（構造１００２ｂ）；

【0039】

【化19】

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（構造１００３ｂ）；

【0040】

【化20】

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（構造１００４ｂ）；

【0041】

【化21】

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（構造１００５ｂ）；

【0042】

【化22】

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（構造１００６ｂ）；

【0043】

【化23】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００７ｂ）；

【0044】

【化24】

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（構造１００８ｂ）；

【0045】

【化25】

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（構造１００９ｂ）；

【0046】

【化26】

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（構造１０１０ｂ）；

【0047】

【化27】

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（構造１０１２ｂ）；

【0048】

【化28】

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（構造１０１３ｂ）；

【0049】

【化29】

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（構造１０１４ｂ）；

【0050】

【化30】

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（構造１０１５ｂ）；

【0051】

【化31】

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（構造１０１６ｂ）；

【0052】

【化32】

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（構造１０１７ｂ）；

【0053】

【化33】

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（構造１０１８ｂ）；

【0054】

【化34】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１９ｂ）；

【0055】

【化35】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０２０ｂ）；

【0056】

【化36】

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（構造１０２１ｂ）；

【0057】

【化37】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０２２ｂ）；

【0058】

【化38】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０２３ｂ）；

【0059】

【化39】

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（構造１０２４ｂ）；

【0060】

【化40】

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（構造１０２５ｂ）；

【0061】

【化41】

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（構造１０２６ｂ）；または

【0062】

【化42】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０２７ｂ）。

【0063】

本明細書中に開示した標的化リガンドを含む医薬組成物もまた開示する。
化合物の投与から恩恵を受ける疾患または障害を治療する方法であって、本明細書中に開示した標的化リガンドに連結された化合物を対象に投与することを含む該方法を開示する。
対象における標的核酸の発現を阻害する方法であって、本明細書中に開示した標的化リガンドに連結された発現阻害オリゴマー化合物の治療量を投与することを含む該方法を本明細書中に開示する。
生体内で肝臓に発現阻害オリゴマー化合物を送達する方法であって、本明細書中に開示した標的化リガンドに連結された発現阻害オリゴマー化合物を対象に投与することを含む該方法を本明細書中に開示する。

【0064】

標的化リガンドを含むホスホラミダイト化合物を製造するプロセスまたは方法であって、（ｉ）リンカーを分岐点基に共有結合で連結し、そして（ｉｉ）ホスホラミダイト形成試薬を用いたホスフィチル化（phosphytylation）反応によって、リンカーをホスホラミダイトのリン原子に連結し、それによって、ホスホラミダイト化合物を形成することを含む該方法、を本明細書中に開示する。

【0065】

本明細書中に使用される場合、「連結された」という用語は、二分子間の接続を指すとき、２つの分子が共有結合によってつなぎ合わせられているか、または２つの分子が非共有結合（例えば、水素結合またはイオン結合）を介して結合されていることを意味する。「連結された」という用語が非共有結合を介した二分子間の結合を指すいくつかの例では、２つの異なった分子間の結合は、生理学的に許容し得るバッファー（例えば、ホスファート緩衝生理食塩水）中で１×１０^−４Ｍ未満（例えば、１×１０^−５Ｍ未満、１×１０^−６Ｍ未満、または１×１０^−７Ｍ未満）のＫ_Ｄを有する。

【0066】

本明細書中に使用される場合、「直接的に連結された」という用語は、あらゆる原子または原子群の介在なしに、第二の化合物または基に連結された第一の化合物または基を指す。本明細書中に使用される場合、「間接的に連結された」という用語は、例えば、連結基などの介在基、化合物、または分子によって第二の化合物または基に連結された第一の化合物を指す。特に明記しない限り、本明細書中で使用される「連結された」という用語は、それらの用語が本明細書中に規定されているように「直接的に連結された」と「間接的に連結された」の両方を含む。

【0067】

本明細書中に使用される場合、「オリゴマー化合物」は、約１０〜５０個のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対を含むヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、オリゴマー化合物は、細胞内で発現されている標的核酸または標的遺伝子内のコード配列に対して少なくとも部分的に相補的な核酸塩基配列を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子を発現する細胞への送達時に、前記オリゴマー化合物は、原因となる遺伝子の発現を阻害することができるので、本明細書中で「発現阻害オリゴマー化合物」と呼ばれる。遺伝子発現は、インビトロであってもまたはインビボであっても阻害され得る。「オリゴマー化合物」としては、これだけに限定されるものではないが：オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム、干渉ＲＮＡ分子、およびダイサー基質、が挙げられる。

【0068】

本明細書中に使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、そのそれぞれが独立に修飾されていても、または修飾されていなくてもよい連結されたヌクレオシドのポリマーを意味する。
本明細書中に使用される場合、「一本鎖オリゴヌクレオチド」という用語は、標的ｍＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である、すなわち、哺乳動物の生理的条件（または、インビトロにおける匹敵した条件）下で水素結合形成によって標的ｍＲＮＡにハイブリダイズできる配列を有する一本鎖オリゴマー化合物を意味する。いくつかの実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0069】

本明細書中に使用される場合、「ＲＮＡｉ剤」とは、配列特異的な様式で標的ｍＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物の翻訳を低減するかまたは阻害することができるＲＮＡまたはＲＮＡ様（例えば、化学的に修飾されたＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含む剤を意味する。本明細書中に使用される場合、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉機構を通して機能する（すなわち、哺乳動物細胞のＲＮＡ干渉経路機構（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体またはＲＩＳＣ）との相互作用によりＲＮＡ干渉を引き起こす）か、または（単数もしくは複数の）任意の代替機構もしくは経路によって機能する。その用語が本明細書中に使用されるとき、ＲＮＡｉ剤が主にＲＮＡ干渉機構を通して機能していると考えられるが、開示したＲＮＡｉ剤は、ある特定の経路または作用機序に縛られたり、または制限されたりすることはない。ＲＮＡｉ剤としては、これだけに限定されるものではないが：一本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびダイサー基質が挙げられる。本明細書中に記載したＲＮＡｉ剤は、標的とされたｍＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的な鎖を有するオリゴヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載したＲＮＡｉ剤は、二本鎖であって、かつ、アンチセンス鎖と該アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的なセンス鎖から成る。ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド、および／または１もしくは複数の非ホスホジエステル結合から成ってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載したＲＮＡｉ剤は一本鎖である。

【0070】

本明細書中に使用される場合、「抑制」、「低減」、「阻害」、「下方制御」、または「ノックダウン」という用語は、所定の遺伝子の発現を指すとき、その中で該遺伝子が転写される細胞、細胞群、組織、臓器、または対象における遺伝子から転写されるＲＮＡのレベル、またはｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチド、タンパク質またはタンパク質サブユニットのレベルによって計測される遺伝子の発現が、該細胞、細胞群、組織、臓器、または対象が本明細書中に記載した標的化リガンドに連結されたオリゴマー化合物を用いて治療されたときに、そうした治療を受けなかった第二の細胞、細胞群、組織、臓器、または対象と比較して、低減されることを意味する。
本明細書中に使用される場合、「配列」または「ヌクレオチド配列」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用した文字の連なりを用いて記載した核酸塩基またはヌクレオチドの連なりまたは順序を意味する。

【0071】

本明細書中に使用される場合であって、かつ、別段の指示がなければ、「相補的」という用語は、第二のヌクレオチド配列（例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖）と関連した第一のヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖または標的ｍＲＮＡ）を記載するのに使用されるとき、特定の条件下で、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして（哺乳動物の生理的条件（または、インビトロにおける匹敵する条件）下で塩基対水素結合を形成して）、そして、二本鎖または二重らせん構造を形成する第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を意味する。相補的配列は、ワトソンークリック塩基対または非ワトソンークリック塩基対を含み、かつ、天然もしくは修飾ヌクレオチド、または少なくともハイブリダイズする能力に関する上記要件を実現する範囲で、ヌクレオチド模倣体を含む。

【0072】

本明細書中に使用される場合、「完璧に相補的」または「完全に相補的」とは、第一のポリヌクレオチドの連続配列の塩基のすべて（１００％）が第二のポリヌクレオチドの連続配列の同数の塩基にハイブリダイズすることを意味する。前記連続配列は、第一または第二のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含んでもよい。
本明細書中に使用される場合、「部分的に相補的」とは、ハイブリダイズした核酸塩基配列の対において、第一のポリヌクレオチドの連続配列の塩基のすべてではなく、少なくとも７０％が、第二のポリヌクレオチドの連続配列の同数の塩基にハイブリダイズすることを意味する。

【0073】

本明細書中に使用される場合、「実質的に相補的」とは、ハイブリダイズした核酸塩基配列の対において、第一のポリヌクレオチドの連続配列の塩基のすべてではなく、少なくとも８５％が、第二のポリヌクレオチドの連続配列で同数の塩基にハイブリダイズすることを意味する。
本明細書中に使用される「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖とアンチセンス鎖との間、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡの配列との間、または一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ｍＲＮＡの配列との間で合致する塩基に関して使用されてもよい。

【0074】

本明細書中に使用される場合、「治療する」、「治療」などの用語は、対象の疾患の１もしくは複数の症状の数、重症度、および／または頻度からの解放またはそれらの緩和を提供するために採られた方法またはステップを意味する。
本明細書中に使用される場合、オリゴマー化合物を指すとき、「細胞内に導入」という語句は、細胞内にオリゴマー化合物を機能的に送達することを意味する。「機能的な送達」という語句は、前記オリゴマー化合物が期待された生物学的活性、例えば、遺伝子発現の配列特異的な阻害、を有することができる様式で該オリゴマー化合物を細胞に送達することを意味する。

【0075】

特に明記がない限り、本明細書中で使用される記号

【化43】

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の使用は、（単数もしくは複数の）任意の基が本明細書中に記載した本発明の範囲によるものに連結され得ることを意味する。

【0076】

本明細書中に使用される場合、「異性体」という用語は、同一の分子式を有するが、それらの原子の性質もしくは結合の並びまたは空間内のそれらの原子の配置が異なる化合物を指す。空間内のそれらの原子の配置が異なる異性体は「立体異性体」と呼ばれる。互いに鏡像でない立体異性体は「ジアステレオ異性体」と呼ばれ、そして、重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は「鏡像異性体」、もしくは時には、光学異性体と呼ばれる。４つの非同一置換基に接着された炭素原子は「キラル中心」と呼ばれる。
本明細書中に使用される場合、そこで不斉中心が存在し、それによって、鏡像異性体、ジアステレオマー、または他の立体異性の立体配置を示す各構造に関して、特定の立体構造を有するとして構造が特異的に同定されることなしに、本明細書中に開示した各構造は、それらの光学的に純粋、かつ、ラセミ形態を含めた斯かるすべての見込まれる異性体を表すことを意図する。例えば、本明細書中に開示した構造は、ジアステレオマーの混合物、ならびにただ一つの立体異性体を網羅することを意図する。

【0077】

「置換された」という用語は、本明細書中に使用される場合、示された原子、通常、炭素、酸素、または窒素原子上の任意の１もしくは複数の水素が、示された原子の標準イオン価を超えないことを条件として、本明細書中に規定される任意の基で置換され、そして、該置換が安定化合物をもたらすことを意味する。置換基の制限されることのない例としては、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、シアノ、ヒドロキシル、オキソ、カルボキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アリール、ケト、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、またはハロ（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）が挙げられる。置換基がケトまたはオキソ（すなわち、＝Ｏ）であるとき、原子上の２つの（２）水素が置換される。環の二重結合は、本明細書中に使用される場合、２つの隣接している環原子（例えば、Ｃ＝Ｃ、Ｃ＝Ｎ、Ｎ＝Ｎなど）の間で形成される二重結合である。

【0078】

本開示のいくつかの化合物は、本開示の範囲内に包含されることも意図する互変異性型で存在し得る。「互変異性体」とは、その構造が原子の配置において著しく異なるが、容易かつ急速な平衡状態で存在する化合物である。本開示の化合物が異なった互変異性体として示されてもよいことは、理解されるべきである。化合物が互変異性型を有するとき、すべての互変異性型が該開示の範囲内にあり、かつ、該化合物の名称があらゆる互変異性型を除外しないことを意図することもまた、理解されなければならない。

【0079】

本開示の化合物および医薬的に許容され得る塩は、ケトン−エノール、アミド−ニトリル、ラクタム−ラクチム、ヘテロ環式環（例えば、核酸塩基グアニン、チミン、およびシトシン）のアミド−イミド酸互変異性、アミン−エナミンとエナミン−エナミン、および幾何異性体、ならびにその混合物を含めた１もしくは複数の互変異性型で存在し得る。グルコースと他の糖類によって示される環状鎖互変異性は、同じ分子内のヒドロキシ基（−ＯＨ）と反応して環（環形状）の形態をもたらす、糖鎖分子内のアルデヒド基（−ＣＨＯ）の結果として生じる。すべての斯かる互変異性型が本開示の範囲内に含まれる。互変異性体は、溶液中に互変異性セットの混合物として存在する。固体では、通例、１種類の互変異性体が支配的である。１種類の互変異性体が記載されたとしても、本開示は、本明細書中に開示した化合物のすべての互変異性体を含む。互変異性化により相互転換可能である互変異性体の概念は互変異性と呼ばれる。互変異性では、電子および水素原子の同時シフトが起こる。

【0080】

互変異性化は：塩基：１．脱プロトン反応；２．脱局在化陰イオン（例えば、エノラート）の形成；３．陰イオンの異なった位置でのプロトン化；酸：１．プロトン化；２．脱局在化陽イオンの形成；３．陽イオンに隣接した異なった位置での脱プロトン反応、によって触媒される。

【0081】

本明細書中に使用される場合、「アルキル」という用語は、別段の定めがない限り、１〜１０個の炭素原子を有する、線状または分岐の、脂肪族飽和炭化水素基を指す。例えば、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」としては、線状または分岐配置の、１、２、３、４、５、または６個の炭素を有するアルキル基が挙げられる。本明細書中に使用される場合、「アミノアルキル」という用語は、標準イオン価によって許容される１もしくは複数のアミノ基で任意の位置にて置換された、先に規定されたアルキル基を指す。前記アミノ基は、非置換であっても、一置換であっても、または二置換であってもよい。

【0082】

本明細書中に使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、別段の定めがない限り、３〜１４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の非芳香族炭化水素環基を意味する。シクロアルキルの例としては、これだけに限定されるものではないが、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、２，２−ジメチル−シクロブチル、２−エチル−シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。シクロアルキルは、複数のスピロ環または融合環を含んでもよい。シクロアルキル群は、標準イオン価によって許容される任意の位置にて、任意選択で一置換、二置換、三置換、四置換、または五置換される。

【0083】

本明細書中に使用される場合、「アルケニル」という用語は、別段の定めがない限り、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含み、２〜１０個の炭素原子を有する、線状または分岐の非芳香族炭化水素基を指す。最大５つの炭素−炭素二重結合が、斯かる群に存在し得る。例えば、「Ｃ２−Ｃ６」アルケニルは、２〜６個の炭素原子を有するアルケニルラジカルと規定される。アルケニルの例としては、これだけに限定されるものではないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、およびシクロヘキセニルが挙げられる。アルケニル基の線状、分岐、または環状部分は、二重結合を含んでもよく、および標準イオン価によって許容される任意の位置にて任意選択で一置換、二置換、三置換、四置換、または五置換される、または五置換される。「シクロアルケニル」という用語は、特定の数の炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する単環式炭化水素基を意味する。

【0084】

本明細書中に使用される場合、「アルキニル」という用語は、別段の定めがない限り、２〜１０個の炭素原子を含み、および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、線状または分岐の、炭化水素基を指す。最大５つの炭素−炭素三重結合が存在してもよい。よって、「Ｃ２−Ｃ６アルキニル」は、２〜６個の炭素原子を有するアルキニルラジカルを意味する。アルキニル基の例としては、これだけに限定されるものではないが、エチニル、２−プロピニル、および２−ブチニルが挙げられる。アルキニル基の線状または分岐部分は、標準イオン価によって許容される三重結合を含んでもよく、そして、標準イオン価によって許容される任意の位置にて任意選択で一置換、二置換、三置換、四置換、または五置換される、または五置換される。

【0085】

本明細書中に使用される場合、「アルコキシル」または「アルコキシ」は、酸素架橋によって取り付けられた示された数の炭素原子を伴った、先に規定されるアルキル基を指す。Ｃ_１−６アルコキシは、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、およびＣ_６アルコキシ基を含むことが意図される。Ｃ_１−８アルコキシは、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、およびＣ_８アルコキシ基を含むことが意図される。アルコキシの例としては、これだけに限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｓ−ペントキシ、ｎ−ヘプトキシ、およびｎ−オクトキシが挙げられる。本明細書中に使用される場合、「ケト」とは、カルボニル架橋によって取り付けられた本明細書中に規定される、任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、またはアリール基を指す。ケト基の例としては、これだけに限定されるものではないが、アルカノイル（例えば、アセチル、プロピオニル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル）、アルケノイル（例えば、アクリロイル）、アルキノイル（例えば、エチノイル、プロピノイル、ブチノイル、ペンチノイル、ヘキシノイル）、アリーロイル（例えば、ベンゾイル）、ヘテロアリーロイル（例えば、イミダゾロイル、キノリノイル、ピリジノイル、ピロロイル）が挙げられる。

【0086】

本明細書中に使用される場合、「アルコキシカルボニル」は、カルボニル架橋（すなわち、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル−）によって取り付けられた、先に規定される任意のアルコキシ基を指す。アルコキシカルボニル基の例としては、これだけに限定されるものではないが、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソ−プロポキシカルボニル、ｎ−プロポキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはｎ−ペントキシカルボニルが挙げられる。

【0087】

本明細書中に使用される場合、「アリールオキシカルボニル」は、オキシカルボニル架橋（すなわち、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−）によって取り付けられた、本明細書中に規定される任意のアリール基を指す。アリールオキシカルボニル基の例としては、これだけに限定されるものではないが、フェノキシカルボニルおよびナフチルオキシカルボニルが挙げられる。

【0088】

本明細書中に使用される場合、「ヘテロアリールオキシカルボニル」は、オキシカルボニル架橋（すなわち、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−）によって取り付けられた、本明細書中に規定される任意のヘテロアリール基を指す。ヘテロアリールオキシカルボニル基の例としては、これだけに限定されるものではないが、２−ピリジルオキシカルボニル、２−オキサゾリルオキシカルボニル、４−チアゾリルオキシカルボニル、またはピリミジニルオキシカルボニルが挙げられる。

【0089】

本明細書中に使用される場合、「アリール」または「芳香族」とは、その中の少なくとも１つの環が芳香族である、各環に最大７つの原子から成る任意の安定した単環式または多環式炭素環である。アリール基の例としては、これだけに限定されるものではないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、およびビフェニルが挙げられる。アリール置換基が二環式であり、１つの環が非芳香族である場合では、取り付けには芳香族環を介していることが理解される。アリール基は、標準イオン価によって許容される任意の位置にて、任意選択で一置換、二置換、三置換、四置換、または五置換される。

【0090】

本明細書中に使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、その中の少なくとも１つの環が芳香族であり、およびＯ、Ｎ、およびＳから成る群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、各環に最大７つの原子から成る安定した単環式または多環式環である。ヘテロアリール基の例としては、これだけに限定されるものではないが、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピロラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ベンズイミダゾロニル、ベンズオキサゾロニル、キノリニル、イソキノリニル、ジヒドロイソインドロニル、イミダゾピリジニル、イソインドロニル、インダゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンが挙げられる。「ヘテロアリール」はまた、任意の含窒素ヘテロアリールのＮ−オキシド誘導体を含むこともまた理解される。ヘテロアリール置換基が二環式であり、１つの環が非芳香族であるかまたはヘテロ原子を含まない場合では、取り付けには芳香族環を介するか、またはヘテロ原子含有環を介することが理解される。ヘテロアリール基は、標準イオン価によって許容される任意の位置にて、任意選択で一置換、二置換、三置換、四置換、または五置換される。

【0091】

本明細書中に使用される場合、「複素環化合物」、「複素環式」または「ヘテロシクリル」という用語は、多環式基を含めた、Ｏ、Ｎ、およびＳから成る群から選択される１〜４つのヘテロ原子を含有する３〜１４員の芳香族または非芳香族複素環を意味する。本明細書中に使用される場合、「複素環式」という用語もまた、用語「複素環化合物」および「ヘテロシクリル」と同義であると見なされ、本明細書中に記載した同じ定義を有すると理解される。「ヘテロシクリル」は、上記のヘテロアリールだけでなく、そのジヒドロおよびテトラヒドロ類似体も含む。ヘテロシクリル基の例としては、これだけに限定されるものではないが、そのアゼチジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキソオキサゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリン、オキソピペラジニル、オキソピペリジニル、オキソモルホリニル、イソキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリジノニル、ピリミジル、ピリミジノニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、１、４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピリジン−２−オニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンズオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、ジオキシドチオモルホリニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、およびＮ−オキシドが挙げられる。ヘテロシクリル置換基の取り付けは、炭素原子を介して、またはヘテロ原子を介して起こり得る。ヘテロシクリル基は、標準イオン価によって許容される任意の位置にて、任意選択で一置換、二置換、三置換、四置換、または五置換される。

【0092】

当業者は、本明細書中に開示した化合物および組成物が、該化合物または組成物が置かれる環境によってプロトン化または脱プロトン化状況で特定の原子（例えば、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子）を有することを容易に理解するかまたは認識するであろう。従って、本明細書中に使用される場合、本明細書中に開示した構造は、例えば、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨなどの特定の官能基がプロトン化または脱プロトン化され得ると想定する。本明細書中の開示は、当業者によって容易に理解されるように、環境のｐＨに基づくプロトン化の状況にかかわらず開示した化合物および組成物を網羅することを意図する。

【0093】

本明細書中の請求項で使用される場合、「から成る」という語句は、請求項で指定されていないあらゆる成分、ステップ、または構成要素を除外する。
本明細書中の請求項で使用されるとき、「から実質的に成る」という語句は、請求項の範囲を、指定された材料またはステップ、および請求項に記載されている発明の（単数もしくは複数の）基本的および新規特徴に物質的に影響しないものに限定する。

【0094】

別段の規定がない限り、本明細書中に使用されるすべて技術用語および学術用語は、本願発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載した方法および材料に類似したもしくはそれと同等な方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載されている。本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、それらの全体が参照によって本明細書中に援用される。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が支配するであろう。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例証であり、限定することを意図するものではない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および請求項から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0095】

【図1】図１は、化合物１１（実施例１で以下に記載されており、かつ、本明細書中の構造１００５ｂの化学構造を有する）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図1A】図１Ａは、本明細書中の構造１００４ｂ（実施例１で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図2】図２は、化合物１９（実施例２で以下に記載されており、かつ、本明細書中の構造１００８ｂの化学構造を有する）の^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。

【図2A】図２Ａは、化合物１９の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図2B】図２Ｂは、化合物１４（実施例２で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図2C】図２Ｃは、化合物１５（実施例２で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図2D】図２Ｄは、化合物１６（実施例２で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図2E】図２Ｅは、化合物１７（実施例２で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図2F】図２Ｆは、化合物１８（実施例２で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図3】図３は、化合物３０（実施例３で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図4】図４は、化合物３８（実施例４で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図5】図５は、化合物４４（実施例５で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図6】図６は、化合物４７（実施例６で以下に記載されている）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図7】図７は、ボトル内のＰＥＧリンカー−ＧａｌＮＡｃホスホラミダイト含有化合物（実施例７で以下に記載されている）の写真である。

【図8】図８は、ボトル内の構造１００８ｂのホスホラミダイト含有化合物（実施例７で以下に記載されている）の写真である。

【図9】図９は、ＰＥＧリンカー−ＧａｌＮＡｃ構造（実施例８で以下に記載されている）の^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。

【図10】図１０は、野性型マウスにおける正規化マウス第１２因子（ｍＦ１２）タンパク質レベル（実施例１１で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図11】図１１は、野性型マウスにおける正規化マウス第１２因子（Ｆ１２）タンパク質レベル（実施例１２で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図12】図１２は、Ｌｐ（ａ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける正規化リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））粒子レベル（実施例１３で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図13】図１３は、ａｐｏ（ａ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける正規化ａｐｏ（ａ）レベル（実施例１４で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図14】図１４は、Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウスにおける正規化Ｌｐ（ａ）粒子レベル（実施例１５で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図15】図１５は、野性型マウスにおける正規化マウスＦ１２タンパク質レベル（実施例１６で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図16】図１６は、Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウスにおける正規化Ｌｐ（ａ）粒子レベル（実施例１７で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図17】図１７は、ａｐｏ（ａ）Ｔｇマウスにおける正規化ａｐｏ（ａ）レベル（実施例１８で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図18】図１８は、Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウスにおける正規化Ｌｐ（ａ）粒子レベル（実施例１９で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図19】図１９は、カニクイザルにおける正規化Ｌｐ（ａ）粒子レベル（実施例２０で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図20】図２０は、カニクイザルにおける正規化ｃＦ１２タンパク質レベル（実施例２１で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【図21】図２１は、ＰｉＺトランスジェニックマウスにおける正規化ＡＡＴ（Ｚ−ＡＡＴ）タンパク質レベル（実施例２２で以下に記載されている）を例示するグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0096】

詳細な説明
治療用または診断用化合物などの化合物に連結された標的化リガンドを本明細書中に記載する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した標的化リガンドに連結された化合物は、発現阻害オリゴマー化合物などの治療用化合物を含むか、またはそれらから成る。前記標的化リガンドは、所望の位置の標的核酸または標的遺伝子に対して治療用化合物を標的化するために使用できる。標的化リガンドおよび治療用化合物を含む組成物、例えば標的化リガンドおよび発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る組成物などもまた、本明細書中に記載する。

【0097】

本明細書中に記載した新しい標的化リガンドは、治療用化合物の送達を容易にするための、これまでに知られている標的化リガンドを超える利点を提供する。これらの利点としては、例えば、製造の容易さおよび効率に対する改善が挙げられ、同時にまた、効果的な標的化もしくは生体分布、インビボおよび／またはビトロにおける十分な安定性、そして／あるいは、オリゴヌクレオチド治療薬送達に望ましい他の改善も提供する。該新しい標的化リガンドはまた、ホスホラミダイト化合物としての合成に特に好適であり、そしてそれは、製造のコストおよび負担を削減し、かつ、化合物、特に発現阻害オリゴマー化合物（ＲＮＡｉ剤など）への標的化リガンドの取り付けを簡便にする一方で、類似した、または場合によっては、改善された、治療用化合物の送達および／または有効性を提供する。

【0098】

標的化リガンド
標的化リガンドは、１もしくは複数の標的化基または標的化部分から成り、そしてそれは、それらが連結された化合物の薬物動力学的または生体分布特性を高める、および該複合化組成物の細胞もしくは組織特異的分配または細胞特異的取り込みを改善するのに役立つ可能性がある。一般に、標的化リガンドは、それに連結された治療用化合物の、所望の標的部位への送達を誘導する際の助けとなる。場合によっては、標的化部分は、細胞または細胞受容体に結合して、該治療用化合物の細胞内への侵入を容易にするためにエンドサイトーシスを開始し得る。標的化部分としては、細胞受容体、細胞表面分子または抗体に対して親和性を有する化合物を挙げることができる。標的化部分を含むさまざまな標的化リガンドが、細胞および特定の細胞受容体に剤を標的化するために治療薬および他の化合物に連結され得る。標的化部分のタイプとしては、炭水化物、コレステロールおよびコレステリル基、ならびにステロイドが挙げられる。細胞受容体に結合できる標的化部分としては、ガラクトース、ガラクトース誘導体（Ｎ−アセチル−ガラクトサミンなど）、マンノース、およびマンノース誘導体などのサッカリド；他の炭水化物；グリカン；ハプテン；ビタミン；フォラート；ビオチン；アプタマー；ならびに、例えばＲＧＤ含有ペプチド、インスリン、ＥＧＦ、およびトランスフェリンなどのペプチドが挙げられる。

【0099】

アシアロ糖タンパク受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することが知られている標的化部分は、肝臓へのオリゴマー化合物の送達を誘導する際に特に有用である。アシアロ糖タンパク受容体は、肝細胞を含めた肝臓細胞において豊富に発現される。ＡＳＧＰＲを標的化する細胞受容体標的化部分としては、ガラクトースおよびガラクトース誘導体が挙げられる。特に、２、３、または４つのＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃまたはＮＡＧ）から成るクラスタを含むガラクトース誘導体のクラスタは、肝臓細胞内への特定の化合物の取り込みを容易にできる。オリゴマー化合物に結合されたＧａｌＮＡｃクラスタは、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン糖が肝臓細胞の表面のアシアロ糖タンパク受容体に結合できる肝臓に組成物を誘導するのに役立つ。アシアロ糖タンパク受容体への結合は、受容体介在性エンドサイトーシスを開始し、それによって、該化合物の細胞内への侵入が容易になると考えられる。

【0100】

本明細書中に開示した標的化リガンドは、１、２、３、４、または４つより多くの標的化部分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、分岐点基に連結された１、２、３、４、または４つより多くの標的化部分を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、分岐点基に連結された１、２、３、４、または４つより多くの標的化部分を含み得、ここで、それぞれの標的化部分がテザーを介して分岐点基に連結される。

【0101】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、分岐点基に連結された１、２、３、４、または４つより多くのアシアロ糖タンパク受容体（ＡＳＧＰＲ）標的化部分を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、分岐点基に連結された１、２、３、４、または４つより多くのＡＳＧＰＲの標的化部分を含み得、ここで、それぞれのＡＳＧＰＲ標的化部分がテザーを介して分岐点基に連結される。

【0102】

いくつかの実施形態において、分岐点基はリンカーに連結される。いくつかの実施形態において、分岐点基はリンカー置換部分を含み、かつ、分岐点基は治療用化合物に連結される。いくつかの実施形態において、分岐点基はオリゴマー化合物に連結される。いくつかの実施形態において、分岐点基は発現阻害オリゴマー化合物に連結される。

【0103】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、以下の式Ｉによって表される：

【化44】

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｛式中、ｎは、１〜４の整数（例えば、１、２、３または４）である｝（式Ｉ）。いくつかの実施形態において、式Ｉのｎは１〜３、１〜２、２〜４、２〜３、または３〜４の整数である。

【0104】

式Ｉのリンカーは、リンカーのもう一方の末端の治療用化合物に（または、標的化リガンドがホスホラミダイト化合物として合成されるときには、ホスホラミダイトのリン原子に）リンカーの片端の分岐点基を接続する、（単数もしくは複数の）シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリル基、または共有結合で連結されるその組み合わせから選択される１もしくは複数の置換もしくは非置換部分を含む基である。いくつかの実施形態において、切断可能部分などの１もしくは複数の追加基（ホスファート基またはジスルフィド結合を含む基など）または（単数もしくは複数の）ホスホロチオアートまたはホスホナート連結を形成する基が、治療用化合物とリンカーの間に挿入される。リンカーは、それらが式Ｉの１もしくは複数の標的化部分と、それが連結される治療用化合物との間の相互作用を低減するように標的化リガンド全体に十分な安定性および剛性を与えるという点において「剛性」である。これは、次に、標的部位と標的化部分との相互作用を改善し得る。加えて、本明細書中に開示した標的化リガンドにおける使用のためのリンカーは、ホスホラミダイト化合物として標的化リガンドを合成するために特異的に設計され、そしてそれが、オリゴマー化合物の５’末端への標的化リガンドの効果的な連結を可能にする。

【0105】

式Ｉの分岐点基は、１もしくは複数の標的化部分の（１もしくは複数のテザーを介した）リンカーへの取り付けを可能にする任意の基である。
いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、以下の式ＩＩによって表される：

【0106】

【化45】

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｛式中、ｎは、１〜４の整数（例えば、１、２、３または４）である｝。いくつかの実施形態において、式ＩＩのｎは１〜３、１〜２、２〜４、２〜３、または３〜４の整数である。

【0107】

式ＩＩでは、分岐点基は、リンカー置換部分を介して治療用化合物への（または、標的化リガンドがホスホラミダイト化合物として合成されるときには、ホスホラミダイトのリン原子への）（１もしくは複数のテザーを介した）１もしくは複数の標的化部分の取り付けを可能にする任意の基である。本明細書中に使用される場合、分岐点基は、該分岐点基が（本明細書中に開示した式Ｉの剛性リンカーと同じ機能を満たす、該分岐点基内に、融合された）１もしくは複数の置換もしくは非置換シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリル基、またはその組み合わせを含むとき、リンカー置換部分を含む。

【0108】

式ＩおよびＩＩの１もしくは複数のテザーは、標的化部分と分岐点基との間の連結に柔軟性および／または長さをさらに加え得るスペーサーとして役立つ基である。該テザーは、分岐点基に標的化部分を連結されるのに効果的な方法を提供する。本明細書中に開示した標的化リガンドに関して、それぞれの標的化部分に少なくとも１つのテザーが存在する。いくつかの実施形態において、分岐点基と標的化部分との間には、複数の（すなわち、２以上）のテザーが存在する。

【0109】

式ＩおよびＩＩの標的化部分は、それらが連結される治療用化合物の薬物動力学的または生体分布特性を強化するのに役立つ、ならびに、複合化組成物の細胞または組織特異的分配および細胞特異的取り込みを改善するのに役立つ基である。標的化部分は、細胞受容体もしくは細胞表面分子または抗体に対して親和性を有する化合物を含み得る。標的化部分のタイプとしては、炭水化物、コレステロールおよびコレステリル基、ならびにステロイドが挙げられる。細胞受容体に結合できる標的化部分としては、例えばガラクトース、ガラクトース誘導体（Ｎ−アセチルガラクトサミンなど）、マンノース、マンノース誘導体などのサッカリド；他の炭水化物；グリカン；ハプテン；ビタミン；フォラート；ビオチン；アプタマー；ならびに、例えばＲＧＤ含有ペプチド、インスリン、ＥＧＦ、およびトランスフェリンなどのペプチドが挙げられる。

【0110】

本明細書中に開示した標的化リガンドは、治療用化合物に連結され得る。いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、追加リンカーおよび／または切断可能部分を介して治療用化合物に連結され、そしてそれは、次に、治療用化合物に連結される。いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、治療用化合物自体に結合される。

【0111】

いくつかの実施形態において、治療用化合物はオリゴマー化合物である。いくつかの実施形態において、治療用化合物は、発現阻害オリゴマー化合物である。いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、ＲＮＡｉ剤である。いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、二本鎖ＲＮＡｉ剤である。

【0112】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に直接的または間接的に連結される。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端に直接的または間接的に連結される。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５’末端または３’末端に直接的または間接的に連結される。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、一本鎖ＲＮＡｉ剤の５’末端または３’末端に直接的または間接的に連結される。

【0113】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の末端ヌクレオシドの５’末端にて、ホスファート基、ホスホナート基、ホスホロチオアート基、または他のヌクレオシド間連結基を介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に連結される。

【0114】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、切断可能部分を含む。いくつかの実施形態において、切断可能部分は、ホスファート基または切断され得る他のヌクレオシド間連結基を含むか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、切断可能部分を介して治療用化合物に連結される。

【0115】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、追加基または切断可能部分を含む基に連結される。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、切断可能部分に連結され、そしてそれは、次に、発現阻害オリゴマー化合物に連結される。

【0116】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、ホスホラミダイト化合物である。本明細書中に記載した標的化リガンドを含むホスホラミダイト化合物は、ホスホラミダイト合成について当該技術分野で一般的に知られている方法を使用して、治療用化合物または他の基に標的化リガンドを容易に取り付けるのに有用であり得る。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドを含むホスホラミダイト化合物は、当該技術分野で一般的に知られている方法を使用して、発現阻害オリゴマー化合物に連結される。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンド含有ホスホラミダイトは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に連結される。

【0117】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドに連結される発現阻害オリゴマー化合物は、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに直接的に連結される。いくつかの実施形態において、追加基は、標的化リガンドと一本鎖オリゴヌクレオチドの間に挿入される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤に連結される標的化リガンドは、標的化部分または標的化部分として１若しくは複数のＮ−アセチル−ガラクトサミン糖を含む。

【0118】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物に連結された標的化リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含めたテザーを含む。いくつかの実施形態において、テザーはＰＥＧから成る。いくつかの実施形態において、テザーは、１〜１０個のエチレングリコール単位を有するＰＥＧを含む。いくつかの実施形態において、テザーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のエチレングリコール単位を有するＰＥＧを含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した任意の標的化リガンドに連結される発現阻害オリゴマー化合物は、ＲＮＡｉ剤を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、直接的または間接的に、ＲＮＡｉ剤に連結される。

【0120】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、ＲＮＡｉ剤に直接的に連結される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、（単数もしくは複数の）追加基がＲＮＡｉ剤と標的化リガンドのリンカーとの間に挿入される場合、間接的にＲＮＡｉ剤に連結される。いくつかの実施形態において、第二のリンカーは、前記リンカーと治療用化合物との間に含まれる。

【0121】

リンカー
本明細書中に開示した標的化リガンドは、式Ｉに示す、リンカーを含むか、あるいは、分岐点基は、式ＩＩに示す、リンカー置換部分を含む。
前記リンカーは、片端で分岐点基に連結され、およびもう一方の末端で治療用化合物に（または、該標的化リガンドがホスホラミダイト化合物として合成されるとき、ホスホラミダイトのリン原子に）連結される原子群である。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、片端で分岐点基に連結され、および次に発現阻害オリゴマー化合物に結合される（単数もしくは複数の）基にもう一方の末端で結合される。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、オリゴマー化合物に直接的に連結される。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、切断可能部分に連結され、そしてそれは、次に、オリゴマー化合物に連結される。切断可能部分の例としては、これだけに限定されるものではないが、例えば、ホスファート基、ジスルフィド部分を含めた基、および／または切断され得る他のヌクレオシド間結合が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、切断可能部分に連結されない。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、ホスホロチオアート基またはホスホナート基に連結される。

【0122】

式Ｉによる本明細書中に開示した標的化リガンドに関して、リンカーは「剛性」リンカーである。剛性リンカーは、１もしくは複数の置換もしくは非置換シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリル基、または共有結合で連結されるその組み合わせを含む連結基である。

【0123】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0124】

【化46】

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（構造１）。

【0125】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0126】

【化47】

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（構造２）。

【0127】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0128】

【化48】

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（構造３）。

【0129】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0130】

【化49】

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（構造４）。

【0131】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0132】

【化50】

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（構造５）。

【0133】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0134】

【化51】

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（構造６ａ）。

【0135】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0136】

【化52】

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（構造６ｂ）。

【0137】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0138】

【化53】

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（構造６ｃ）。

【0139】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0140】

【化54】

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（構造６ｄ）。

【0141】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0142】

【化55】

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【0143】

｛式中、ｎ’は、０〜１０（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の整数であり、そして、存在している各Ｚ’に関して、Ｚ’は独立に選択され、かつ、Ｚ’は独立に：Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換もしくは非置換アミノ、カルボキシル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、ハロゲン（例えば、Ｆ）、ヒドロキシル、アミド、置換アミド、シアノ、置換もしくは非置換ケト、置換もしくは非置換アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換アリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換ヘテロアリールオキシカルボニル、およびスルフヒドリルから成る群から選択される｝（構造７）。

【0144】

いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0145】

【化56】

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【0146】

｛式中、ｎ”は、０〜４（例えば、１、２、３または４）の整数であり、そして、存在している各Ｚ”に関して、Ｚ”は独立に選択され、かつ、Ｚ”は独立に：Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換もしくは非置換アミノ、カルボキシル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、ハロゲン（例えば、Ｆ）、ヒドロキシル、アミド、置換アミド、シアノ、置換もしくは非置換ケト、置換もしくは非置換アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換アリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換ヘテロアリールオキシカルボニル、およびスルフヒドリルから成る群から選択される｝（構造８）。
いくつかの実施形態において、式Ｉの標的化リガンドは、次の構造式を有するリンカーを含むか、またはそれらから成る：

【0147】

【化57】

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【0148】

｛式中、Ｖは、１もしくは複数の置換もしくは非置換シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘプチル、シクロオクチルなど）、シクロアルケニル（例えば、シクロヘキセニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、シクロヘキサジエニル、シクロペンタジエニル、シクロヘプタジエニル、シクロオクタジエニルなど）、アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ビナフチル、アントラセニルなど）、ヘテロアリール（例えば、ピリジル、ピリミジニル、ピロール、イミダゾール、フラン、ベンゾフラン、インドールなど）、もしくはヘテロシクリル（例えば、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピロリジンなど）、または任意の、共有結合で連結されたその組み合わせを含むか、またはそれらから成る｝（構造９）。

【0149】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドにおける使用に好適なリンカーは、片端に末端カルボン酸部分（または、その活性化エステル）があり、かつ、もう一方の末端に末端アルコール部分がある剛性構造を含む化合物から作り出される。いくつかの実施形態において、該アルコール部分は、二級アルコールである。いくつかの実施形態において、該アルコール部分は、三級アルコールである。いくつかの実施形態において、該アルコール部分は、一級アルコールである。該カルボン酸部分（またはその活性化エステル）は、分岐点基への取り付けに好適であるが、その一方で、該アルコール部分は、ホスホラミダイト形成試薬を用いたホスフィチル化反応によるホスホラミダイトのリン原子への取り付けに好適である。ホスホラミダイト形成試薬を使用したホスフィチル化反応の例は、本明細書中の実施例に記載されている。本明細書中に開示したリンカー構造は、ホスホラミダイト化合物としての標的化リガンドの調製に好適である。

【0150】

いくつかの実施形態において、前記リンカーは発現阻害オリゴマー化合物、すなわち、二本鎖ＲＮＡｉ剤に連結される。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に連結される。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端に連結される。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の３’末端に連結される。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５’末端に連結される。

【0151】

いくつかの実施形態において、前記リンカーは、切断可能部分に連結される。いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物の末端のホスファート基は、切断可能部分として役立ち得る。いくつかの実施形態において、独立に選択される切断可能部分は、リンカーに連結される。本明細書中に使用される場合、切断可能部分は、細胞外で安定しているが、標的細胞内に入ると切断される基である。切断可能部分は、例えばｐＨなどの特定の条件下で、または分解を促進する分子−もしくはレドックス剤などの特定の切断剤の切断を受けやすい。

【0152】

いくつかの実施形態において、前記切断可能部分は、ｐＨの影響を受けやすい可能性がある。例えば、エンドソームおよびリソソームは、一般的に、ヒト血液（約７．３５〜７．４５のｐＨ）より高い酸性のｐＨ（約４．５〜６．５のｐＨ）を有することが知られており、そのことが切断可能部分の切断を促進し得る。
いくつかの実施形態において、切断可能部分はホスファート基である。ホスファート基は、ホスファート基を分解するかまたは加水分解することが知られている剤によって切断され得る。

【0153】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、式ＩＩに示すように、リンカーの代わりに、リンカー置換基を含む分岐点基を含む。リンカーがリンカー置換部分で置換されるとき、該リンカー置換部分は分岐点基の一部である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示したリンカーおリンカー置換部分は、標的化リガンドの単一異性体のみの取り込みを許容し、そしてそれが、オリゴヌクレオチド治療薬の追加的な利点を提供し得る。

【0154】

分岐点基
本明細書中に開示した標的化リガンドは、少なくとも１つの分岐点基を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドの分岐点基は、リンカーに連結される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドの分岐点基は、片端でリンカーに連結され、および分岐点基は（単数もしくは複数の）他の末端で１若しくは複数のテザーに連結される。いくつかの実施形態において、分岐点基は、（単数もしくは複数の）追加基を介して発現阻害オリゴマー化合物に連結される。いくつかの実施形態において、分岐点基はリンカー置換部分を含み、かつ、発現阻害オリゴマー化合物に連結される。

【0155】

本明細書中に開示した分岐点基は、１若しくは複数の標的化部分の取り付けを許容し、さらに本明細書中に開示したリンカーへの取り付けを許容する任意の基であるか、あるいは、該分岐点基がリンカー置換部分を含む場合には、該分岐点基は、例えば発現阻害オリゴマー化合物などの治療用化合物への取り付けを許容するリンカー置換部分を含む任意の基である。

【0156】

本明細書中に開示した、式Ｉの分岐点基に関して、リンカーへの複合体形成前に、分岐点基を作り出すのに役立つ分岐点基は、リンカーへのそれぞれの所望の連結のための一端のアミン、およびテザーへのそれぞれの所望の連結のための一端のカルボン酸部分（またはその活性化エステル）を有する。

【0157】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドとしては、次の構造式から選択される構造を有する分岐点が挙げられる：

【0158】

【化58】

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。

【0159】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式を有する分岐点を含む：

【化59】

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｛式中、ｎは、１〜２０の整数である｝（構造２０９）。

【0160】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式を有する分岐点を含む：

【化60】

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【0161】

｛式中、ｍは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり、そして、ｎは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）である｝（構造２１０）。

【0162】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する分岐点を含む：

【化61】

[この文献は図面を表示できません]

【0163】

｛式中、ｍは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり；ｎは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり；ｘは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）であり；ｙは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり；ｚは、１〜４の整数（例えば、１、２、３または４）であり；そして、Ｋは、置換もしくは非置換シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘプチル、シクロオクチルなど）、置換もしくは非置換シクロアルケニル（例えば、シクロヘキセニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、シクロヘキサジエニル、シクロペンタジエニル、シクロヘプタジエニル、シクロオクタジエニルなど）、置換もしくは非置換アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ビナフチル、アントラセニルなど）、置換もしくは非置換ヘテロアリール（例えば、ピリジル、ピリミジニル、ピロール、イミダゾール、フラン、ベンゾフラン、インドールなど）、および置換もしくは非置換ヘテロシクリル（例えば、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピロリジンなど）、または共有結合で連結されるその組み合わせから成る群から選択される｝（構造２１１）。

【0164】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式を有する分岐点を含む：

【化62】

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【0165】

｛式中、ｍは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり；ｎは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり；ｘは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）であり；そして、ｙは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）である｝（構造２１２）。

【0166】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式を有する分岐点を含む：

【化63】

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【0167】

｛式中、ｍは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり；ｎは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり；ｘは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）であり；ｙは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）であり；そして、Ｇは、

【0168】

【化64】

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【0169】

；または５、６、７、８、もしくは９原子の環サイズを有する任意の置換もしくは非置換環または複素環式構造、例えば、置換もしくは非置換シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘプチル、シクロオクチルなど）、置換もしくは非置換シクロアルケニル（例えば、シクロヘキセニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、シクロヘキサジエニル、シクロペンタジエニル、シクロヘプタジエニル、シクロオクタジエニルなど）、置換もしくは非置換アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ビナフチル、アントラセニルなど）、置換もしくは非置換ヘテロアリール（例えば、ピリジル、ピリミジニル、ピロール、イミダゾール、フラン、ベンゾフラン、インドールなど）、または置換もしくは非置換ヘテロシクリル（例えば、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピロリジンなど）から成る群から選択される｝（構造２１３）。

【0170】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造を有する分岐点基を含む：

【化65】

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｛式中、ｎは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）である｝（構造２１４）。

【0171】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造を有する分岐点基を含む：

【化66】

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｛式中、ｎは、０〜２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり、そして、Ｑは：

【0172】

【化67】

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から成る群から選択される｝（構造２１５）。

【0173】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造を有する分岐点基を含む：

【化68】

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（構造２１６）。

【0174】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造を有する分岐点基を含む：

【化69】

[この文献は図面を表示できません]

（構造２１７）。

【0175】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造を有する分岐点基を含む：

【化70】

[この文献は図面を表示できません]

（構造２１８）。

【0176】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造を有する分岐点基を含む：

【化71】

[この文献は図面を表示できません]

【0177】

｛式中、ｎは、１〜７から選択される整数（例えば、１、２、３、４、５、６または７）である｝（構造２１９）。いくつかの実施形態において、構造２１９におけるｎは１である。いくつかの実施形態において、構造２１９におけるｎは２である。いくつかの実施形態において、構造２１９におけるｎは３である。いくつかの実施形態において、構造２１９におけるｎは４である。いくつかの実施形態において、構造２１９におけるｎは５である。いくつかの実施形態において、構造２１９におけるｎは６である。いくつかの実施形態において、構造２１９におけるｎは７である。
いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、リンカー置換基を含む分岐点基を含む。

【0178】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するリンカー置換部分を含む分岐点基を含む：

【化72】

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（構造２２０）、または

【0179】

【化73】

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（構造２２１）。

【0180】

テザー
本明細書中に開示した標的化リガンドは、１若しくは複数のテザーを含む。テザーは、分岐点基とそれぞれの標的化部分との間に連結される。いくつかの実施形態において、前記テザーは、片端で標的化リガンドに直接的に、およびもう一方の末端で分岐点基に直接的に連結される。いくつかの実施形態において、前記テザーは、片端で直接的に標的化リガンドに、およびもう片方の末端で間接的に分岐点基に連結される。いくつかの実施形態において、前記テザーは、片端で標的化リガンドに間接的に、およびもう一方の末端で分岐点基に間接的に連結される。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した標的化リガンドは、３つのテザーおよび３つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した標的化リガンドは、４つのテザーおよび４つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した標的化リガンドは、１つのテザーおよび１つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した標的化リガンドは、複数のテザーおよび複数の標的化部分を含む。

【0181】

いくつかの実施形態において、追加テザーまたは他の基が、式Ｉまたは式ＩＩのテザーと標的化部分との間に挿入される。いくつかの実施形態において、第二のテザーが、式Ｉまたは式ＩＩのテザーと標的化部分との間に挿入される。いくつかの実施形態において、第二のテザーと第三のテザーが、式Ｉまたは式ＩＩのテザーと標的化部分との間に挿入される。いくつかの実施形態において、第二、第三、および第四のテザーが、式Ｉまたは式ＩＩのテザーと標的化部分との間に挿入される。本明細書中に開示される場合、あらゆる標的化部分に関して少なくとも１つのテザーが存在する。いくつかの実施形態において、それぞれ標的化部分に関して２つ以上のテザーが存在する。本明細書中に開示した標的化リガンドは、斯かる組成物を網羅することを意図している。

【0182】

いくつかの実施形態において、追加基が、式Ｉまたは式ＩＩのテザーと分岐点基との間に挿入され得る。
本明細書中に開示される場合、前記テザーは、標的化部分と、分岐点基、リンカー、および治療用化合物との間の連結にさらなる柔軟性および／または長さを加え得るスペーサーとして役立つ。いくつかの実施形態において、テザーとしては、アルキル基（シクロアルキル基を含む）、アルケニル基（シクロアルケニル基を含む）、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、またはアラルキニル基が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記テザーとしては、１若しくは複数のヘテロ原子、複素環化合物、ヘテロアリール、アミノ酸、ヌクレオチド、またはサッカリドが挙げられる。

【0183】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、次の構造を有するテザーを含む：

【化74】

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｛式中、ｎは、１〜２０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり、そして、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである｝（構造３０１）。

【0184】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、次の構造を有するテザーを含む：

【化75】

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｛式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである｝（構造３０２）。

【0185】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、次の構造を有するテザーを含む：

【化76】

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（構造３０２ａ）。

【0186】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、次の構造を有するテザーを含む：

【化77】

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｛式中、ｎは、１〜２０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり、およびＸは、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである｝（構造３０３）。

【0187】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、次の構造を有するテザーを含む：

【化78】

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｛式中、ｎは、１〜２０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり、およびＸは、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである｝（構造３０４）。

【0188】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、次の構造を有するテザーを含む：

【化79】

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｛式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである｝（構造３０５）。

【0189】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、次の構造を有するテザーを含む：

【化80】

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｛式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである｝（構造３０６）。

【0190】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、２つ以上のテザーのタイプを含む。いくつかの実施形態において、前記テザーは、フレキシブル親水性スペーサー（例えば、Ｕ．Ｓ．５，８８５，９６８；およびBiessen et al. J. Med. Chem. 1995, 39, 1538-1546、その両方を全体として参照により本明細書中に援用する）として機能し、そして、ＰＥＧスペーサーを含む。他の実施形態において、前記ＰＥＧスペーサーは、１〜２０個のエチレン単位（ＰＥＧ_１〜ＰＥＧ_２０）を有する。例えば、前記ＰＥＧスペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のエチレン単位を有する。

【0191】

標的化部分：
本明細書中に開示した標的化リガンドは、１〜４、または４つより多くの標的化部分を含み得る。
いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、ガラクトースクラスタであってもよい。本明細書中に使用される場合、ガラクトースクラスタリングは、２〜４つの末端ガラクトース誘導体を有する標的化リガンドを含む。本明細書中に使用される場合、ガラクトース誘導体という用語は、ガラクトースのそれと同等かまたはそれを越えるアシアロ糖タンパク受容体に対する親和性を有する、ガラクトースおよびガラクトース誘導体の両方を含む。ガラクトース誘導体は、一種の標的化部分であるサッカリド糖である。末端ガラクトース誘導体は、サッカリドのＣ−１炭素を通してテザーに連結される。

【0192】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、アシアロ糖タンパク受容体に対してそれぞれ親和性を有する３つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体（Ｎ−アセチル−ガラクトサミンなど）から成る。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、標的化部分として３つの末端Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃまたはＮＡＧ）を含む。例えば、構造１００１、１００２、１００４および１００８のそれぞれは、標的化部分としての３つの末端Ｎ−アセチル−ガラクトサミンを有する標的化リガンドである。

【0193】

いくつかの実施形態において、それぞれ標的化部分は、ガラクトサミン誘導体、すなわち、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンを含む。標的化部分として使用され得る、アシアロ糖タンパク受容体に対して親和性を有する他のサッカリドは：ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン、およびＮ−イソ−ブタノイルガラクトサミン、を含めた一覧から選択され得る。アシアロ糖タンパク受容体に対する多くのガラクトース誘導体の親和性は、研究されているか（例えば：Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686を参照、それを全体として参照により本明細書に援用する）、または当該技術分野で周知の、一般的に使用される方法を使用して容易に測定される。

【0194】

いくつかの実施形態において、前記標的化部分は、細胞を標的化する部分である。
いくつかの実施形態において、前記標的化部分は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンを含む：

【化81】

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。

【0195】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、３つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、４つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、１つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、２つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、４つ以上の標的化部分を含む。

【0196】

いくつかの実施形態において、前記標的化部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン、またはＮ−イソ−ブタノイルガラクトサミンのうちの１もしくは複数を含む。

【0197】

例えば、いくつかの実施形態において、構造１００１〜１０２７のいずれかのＮ−アセチル−ガラクトサミン標的化部分は、代替の標的化部分で置換され得る。斯かる代替の標的化部分としては、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン、またはＮ−イソ−ブタノイルガラクトサミンが挙げられる。

【0198】

さらに、いくつかの実施形態において、構造１００１〜１０２７の標的化部分は、例えば、他の炭水化物；グリカン；ハプテン；ビタミン；フォラート；ビオチン；アプタマー；ならびに／あるいは、例えばＲＧＤ含有ペプチド、インスリン、ＥＧＦ、および／またはトランスフェリンなどのペプチドで置換され得る。

【0199】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン三量体の形態である。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン四量体の形態である。

【0200】

代表的な標的化リガンド構造、および標的化リガンドを含むホスホラミダイト化合物
本明細書中に開示した標的化リガンドは、１若しくは複数の標的化部分、テザー、分岐点基、およびリンカーから成り得る。本明細書中に開示した標的化リガンドは、１、２、３、４、または４つより多くの標的化部分から成り得る。

【0201】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、ホスホラミダイト化合物の形態となるように合成される。ホスホラミダイトは、ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成において広く使用される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示したホスホラミダイト含有標的化リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に加えられる。前記標的化リガンドが発現阻害オリゴマー化合物の５’末端に連結されるべきとき、ホスホラミダイトとして標的化リガンドを調製することは、特に有利であり得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、ホスホラミダイトとして前記標的化リガンドを調製することは、該標的化リガンドが発現阻害オリゴマー化合物の５’末端に連結されるとき、最後の成分としての標的化リガンドの連結を許容し（それによって、製造コストを削減する）、ならびに該標的化リガンドが二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に取り付けられるとき、標的化リガンドがＲＩＳＣ内へのセンス鎖の添加を潜在的に遮断することを可能にすることが理解される。発現阻害オリゴマー化合物が二本鎖ＲＮＡｉ剤であるとき、前記標的化リガンドは、該標的化リガンドがＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に連結されるべきとき、ホスホラミダイト化合物として調製され得る。

【0202】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化82】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００１）。

【0203】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化83】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００１ａ）。

【0204】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化84】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻またはＮＨ⁻である｝（構造１００１ａ（ｉ））。

【0205】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化85】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００１ｂ）。

【0206】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化86】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００２）。

【0207】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化87】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００２ａ）。

【0208】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化88】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１００２ａ（ｉ））。

【0209】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化89】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００２ｂ）。

【0210】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化90】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００３）。

【0211】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化91】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００３ａ）。

【0212】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化92】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１００３ａ（ｉ））。

【0213】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化93】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００３ｂ）。

【0214】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化94】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００４）。

【0215】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化95】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００４ａ）。

【0216】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化96】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１００４ａ（ｉ））。

【0217】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化97】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００４ｂ）。

【0218】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化98】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００５）。

【0219】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化99】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００５ａ）。

【0220】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化100】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１００５ａ（ｉ））。

【0221】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化101】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００５ｂ）。

【0222】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化102】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００６）。

【0223】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化103】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００６ａ）。

【0224】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化104】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１００６ａ（ｉ））。

【0225】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化105】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００６ｂ）。

【0226】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化106】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００７）。

【0227】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化107】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００７ａ）。

【0228】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化108】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１００７ａ（ｉ））。

【0229】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化109】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００７ｂ）。

【0230】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化110】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００８）。

【0231】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化111】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００８ａ）。

【0232】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化112】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１００８ａ（ｉ））。

【0233】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化113】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００８ｂ）。

【0234】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化114】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００９）。

【0235】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化115】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１００９ａ）。

【0236】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化116】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１００９ａ（ｉ））。

【0237】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化117】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１００９ｂ）。

【0238】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化118】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１０）。

【0239】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化119】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１０ａ）。

【0240】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化120】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１０ａ（ｉ））。

【0241】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化121】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１０ｂ）。

【0242】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を含む：

【化122】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｊは、１もしくは複数の置換もしくは非置換シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリル基、または共有結合で連結されるその組み合わせを含むか、またはそれらから成り；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；そしてＹ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１１）。

【0243】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化123】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１２）。

【0244】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化124】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１２ａ）。

【0245】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化125】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１２ａ（ｉ））。

【0246】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化126】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１２ｂ）。

【0247】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化127】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１３）。

【0248】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化128】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１３ａ）。

【0249】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化129】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１３ａ（ｉ））。

【0250】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化130】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１３ｂ）。

【0251】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化131】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１４）。

【0252】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化132】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１４ａ）。

【0253】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化133】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１４ａ（ｉ））。

【0254】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化134】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１４ｂ）。

【0255】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化135】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１５）。

【0256】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化136】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１５ａ）。

【0257】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化137】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１５ａ（ｉ））。

【0258】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化138】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１５ｂ）。

【0259】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化139】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１６）。

【0260】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化140】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１６ａ）。

【0261】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化141】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１６ａ（ｉ））。

【0262】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化142】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１６ｂ）。

【0263】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化143】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１７）。

【0264】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化144】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１７ａ）。

【0265】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化145】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１７ａ（ｉ））。

【0266】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化146】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１７ｂ）。

【0267】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化147】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１８）。

【0268】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化148】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１８ａ）。

【0269】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化149】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１８ａ（ｉ））。

【0270】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化150】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１８ｂ）。

【0271】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化151】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１９）。

【0272】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化152】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０１９ａ）。

【0273】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化153】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０１９ａ（ｉ））。

【0274】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化154】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０１９ｂ）。

【0275】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化155】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０２０）。

【0276】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化156】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０２０ａ）。

【0277】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化157】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０２０ａ（ｉ））。

【0278】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化158】

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（構造１０２０ｂ）。

【0279】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化159】

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（構造１０２１）。

【0280】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化160】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０２１ａ）。

【0281】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化161】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０２１ａ（ｉ））。

【0282】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化162】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０２１ｂ）。

【0283】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化163】

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（構造１０２２）。

【0284】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化164】

[この文献は図面を表示できません]

｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０２２ａ）。

【0285】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化165】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０２２ａ（ｉ））。

【0286】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化166】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０２２ｂ）。

【0287】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化167】

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（構造１０２３）。

【0288】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化168】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０２３ａ）。

【0289】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化169】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０２３ａ（ｉ））。

【0290】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化170】

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（構造１０２３ｂ）。

【0291】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示したとおり、分岐点基が少なくとも１つのアリール、シクロアルキル、および／または複素環基を含むのであれば、標的化リガンドのリンカーが不存在であってもよい。分岐点基内に位置する１もしくは複数のアリール、シクロアルキル、および／または複素環基を有することは、リンカー置換基として役立つ。いくつかの実施形態において、分岐点基内の１もしくは複数のアリール、シクロアルキル、および／または複素環基は、分岐点基内の（単数もしくは複数の）中央連絡点と発現阻害オリゴマー化合物との間に配置される。

【0292】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化171】

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（構造１０２４）。

【0293】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化172】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０２４ａ）。

【0294】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化173】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０２４ａ（ｉ））。

【0295】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化174】

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（構造１０２４ｂ）。

【0296】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化175】

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（構造１０２５）。

【0297】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化176】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０２５ａ）。

【0298】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化177】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０２５ａ（ｉ））。

【0299】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化178】

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（構造１０２５ｂ）。

【0300】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化179】

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（構造１０２６）。

【0301】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化180】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０２６ａ）。

【0302】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化181】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０２６ａ（ｉ））。

【0303】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化182】

[この文献は図面を表示できません]

（構造１０２６ｂ）。

【0304】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有する：

【化183】

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（構造１０２７）。

【0305】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化184】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物を含むか、またはそれらから成る｝（構造１０２７ａ）。

【0306】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、標的化リガンドに連結され、かつ、次の構造式によって表される構造を有する：

【化185】

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｛式中、Ｒは、発現阻害オリゴマー化合物から成るか、またはそれらを含み；Ｙは、ＯまたはＳであり；そして、Ｙ’は、Ｏ⁻、Ｓ⁻、またはＮＨ⁻である｝（構造１０２７ａ（ｉ））。

【0307】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、次の構造式によって表される構造を有するホスホラミダイト含有化合物である：

【化186】

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（構造１０２７ｂ）。

【0308】

いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、ガラクトースクラスタの形態である。本明細書中に使用される場合、ガラクトースクラスタリングは、２〜４つの末端ガラクトース誘導体を有する標的化リガンドを含む。本明細書中に使用される場合、ガラクトース誘導体という用語は、ガラクトースのそれと同等かまたはそれを越えるアシアロ糖タンパク受容体に対する親和性を有する、ガラクトースおよびガラクトース誘導体の両方を含む。ガラクトース誘導体は、一種の標的化部分であるサッカリド糖である。末端ガラクトース誘導体は、サッカリドのＣ−１炭素を通してテザーに連結されてもよい。

【0309】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、アシアロ糖タンパク受容体に対してそれぞれ親和性を有する３つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体（Ｎ−アセチル−ガラクトサミンなど）から成る。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、標的化部分として３つの末端Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃまたはＮＡＧ）を含む。

【0310】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、アシアロ糖タンパク受容体に対してそれぞれ親和性を有する４つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体（Ｎ−アセチル−ガラクトサミンなどの）から成る。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、標的化部分として４つの末端Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃまたはＮＡＧ）を含む。

【0311】

いくつかの実施形態において、それぞれ標的化部分は、ガラクトサミン誘導体、すなわち、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンを含む。標的化部分として使用され得る、アシアロ糖タンパク受容体に対して親和性を有する他のサッカリドは：ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン、およびＮ−イソ−ブタノイルガラクトサミン、を含めた一覧から選択され得る。アシアロ糖タンパク受容体に対する多くのガラクトース誘導体の親和性は、研究されているか（例えば：Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686を参照）、または当該技術分野で周知の、一般的に使用される方法を使用して容易に測定される。

【0312】

３つの末端Ｎ−アセチル−ガラクトサミンを指すとき、当該技術分野で一般的に使用される用語としては、三分岐型（tri-antennary）、三価、および三量体が挙げられる。
４つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミンを指すとき、当該技術分野で一般的に使用される用語としては、四分岐型（tetra-antennary）、四価、および四量体が挙げられる。

【0313】

オリゴマー化合物
本明細書中に開示した標的化リガンドは、オリゴマー化合物に連結され得る。いくつかの実施形態において、前記オリゴマー化合物は、発現阻害オリゴマー化合物である。いくつかの実施形態において、前記発現阻害オリゴマー化合物は、ＲＮＡｉ剤である。いくつかの実施形態において、前記発現阻害オリゴマー化合物は、二本鎖ＲＮＡｉ剤である。いくつかの実施形態において、前記発現阻害オリゴマー化合物は、一本鎖オリゴヌクレオチドである。前記発現阻害オリゴマー化合物は、当該技術分野で一般的に使用される方法を使用することで合成され得る。

【0314】

前記発現阻害オリゴマー化合物は、１若しくは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド塩基（または、核酸塩基）は、すべての核酸の構成要素であり、かつ、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を含む複素環式ピリミジンまたはプリン化合物である。本明細書中に使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド模倣体、脱塩基部位、または代用置換部分を含み得る。本明細書中に使用される場合、「修飾ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（２’−ヒドロキシルヌクレオチド）以外のヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体、脱塩基部位、または代用置換部分である。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドとしては、２’−修飾ヌクレオチド（すなわち、５員糖環の２’位置にてヒドロキシル基以外の基を有するヌクレオチド）を含む。修飾ヌクレオチドとしては、これだけに限定されるものではないが：２’−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（本明細書中ではヌクレオチド配列内の小文字「ｎ」とも表される）、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド（本明細書中ではＮｆと表され、また、本明細書中に２’−フルオロヌクレオチドとも表される）、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書中ではｄＮとも表される）、２’−メトキシエチル（２’−Ｏ−２−メトキシルエチル）ヌクレオチド（本明細書中ではＮＭまたは２’−ＭＯＥとも表される）、２’−アミノヌクレオチド、２’−アルキルヌクレオチド、３’−３’連結（反転）ヌクレオチド（本明細書中ではｉｎｖｄＮ、ｉｎｖＮ、ｉｎｖｎ、ｉｎｖＸとも表される）、ヌクレオチドを含む非天然型塩基、ロックされたヌクレオチド、架橋ヌクレオチド、ペプチド核酸、２’、３’−セコヌクレオチド模倣体（ロックされていない核酸塩基類似体、本明細書中ではＮ_ＵＮＡまたはＮＵＮＡとも表される）、ロックされたヌクレオチド（本明細書中ではＮ_ＬＮＡまたはＮＬＮＡとも表される）、３’−Ｏ−メトキシ（２’−ヌクレオチド間連結）ヌクレオチド（本明細書中では３’−ＯＭｅｎとも表される）、２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド（本明細書中ではＮｆＡＮＡまたはＮｆ_ＡＮＡとも表される）、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホナートデオキシリボヌクレオチド（本明細書中ではｖｐｄＮとも表される）、ビニルホスホナートヌクレオチド、および脱塩基ヌクレオチド（本明細書中ではＸまたはＡｂとも表される）が挙げられる。一様に修飾されることは、所定の化合物のすべての位置において必要とされるわけでない。逆に、２つ以上の修飾が、ただ一つの発現阻害オリゴマー化合物の中に、またはその単一ヌクレオチドの中にさえ組み込まれ得る。前記発現阻害オリゴマー化合物は、当該技術分野で知られている方法によって合成および／または修飾され得る。各ヌクレオチドの修飾は、他のヌクレオチドの修飾から独立している。

【0315】

修飾核酸塩基としては、合成および天然型核酸塩基、例えば、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、Ｎ−２−、Ｎ−６−、Ｏ−６−置換プリン（例えば、２−アミノプロピルアデニン）、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾ−シトシン、６−アゾ−チミン、５−ウラシル（偽ウラシル）４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−置換ウラシルおよびシトシン（例えば、５−ハロウラシルおよびシトシン（例えば、５−ブロムウラシルおよび５−ブロモシトシン）、５−トリフルオロメチルウラシル、５−トリフルオロメチルシトシン）、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−アザグアニン、３−デアザグアニン、および３−アザグアニンが挙げられる。

【0316】

本明細書中に記載した発現阻害オリゴマー化合物において、任意の修飾ヌクレオチドは、ホスファート含有または非ホスファート含有共有結合性ヌクレオシド間結合によって連結され得る。修飾ヌクレオシド間結合または骨格としては、これだけに限定されるものではないが、５’−ホスホロチオアート（本明細書中ではヌクレオチドの前の小文字「ｓ」とも表され、ｓＮ、ｓｎ、ｓＮｆ、またはｓｄＮとも表される）、キラルホスホロチオアート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含めたホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキル−ホスホナート、チオノアルキル−ホスホトリエステル、モルホリノ連結、通常３’−５’連結を有するボラノホスホナート、ボラノホスホナートの２’−５’連結類似体、ならびに逆極性を有するボラノホスホナートが挙げられ、ここで、ヌクレオシド単位の隣接対は、３’−５’から５’−３’にまたは２’−５’から５’−２’に連結される。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合または骨格は、リン原子を欠いている。リン原子を欠いている修飾ヌクレオシド間結合としては、これだけに限定されるものではないが、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、混合性ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または１若しくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間連結が挙げられる。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間骨格としては、これだけに限定されるものではないが、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルフォン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン−含有骨格、スルファマート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホナートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混成Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ_２成分を有する他の骨格が挙げられる。

【0317】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物は、二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、少なくとも部分的に互いに相補的な（少なくとも７０％相補的な）センス鎖とアンチセンス鎖とを含む。前記アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡの配列に対して完全に相補的（１００％相補的）であるか、または少なくとも実質的に相補的（少なくとも８５％相補的）である配列を有する領域を含む。二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の長さは、それぞれ１６〜３０ヌクレオチドの長さであり得る。前記センスおよびアンチセンス鎖は同じ長さであっても、またはそれらが異なった長さであってもいずれでもよい。いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、長さが約１９ヌクレオチドであるが、それに対して、前記アンチセンス鎖は長さが約２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、前記センス鎖は長さが約２１ヌクレオチドであるが、それに対して、前記アンチセンス鎖は長さが約２３ヌクレオチドである。他の実施形態において、前記センスとアンチセンス鎖は、それぞれ独立に長さが１７〜２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センスとアンチセンス鎖の両方が、長さがそれぞれ２１〜２６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、前記センスとアンチセンス鎖の両方が、長さがそれぞれ２６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、前記センスとアンチセンス鎖は、それぞれ独立に長さが１７〜２６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチドの二本鎖の長さを有する。前記センス鎖とアンチセンス鎖との間の完全または実質的に相補的なこの領域は、長さが典型的には１５〜２５ヌクレオチド（例えば、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド）であり、該アンチセンス鎖の５’末端または５’末端付近で起こる。

【0318】

本明細書中に開示したリガンドに結合される発現阻害オリゴマー化合物は、任意選択かつ独立に、（延長として）追加の１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドをコア配列の３’末端、５’末端、または３’および５’末端の両方に含む。これらの追加的ヌクレオチドは、存在する場合、前記標的化されているｍＲＮＡの対応配列に対して相補的であっても、またはそうでなくてもよい。

【0319】

いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤が本明細書中に開示した標的化リガンドに結合されるとき、追加のセンス鎖追加ヌクレオチドは、存在する場合、前記標的化されているｍＲＮＡの対応配列に対して同一であっても、またはそうでなくてもよい。それが存在する場合、前記追加のアンチセンス鎖追加ヌクレオチドは、それが存在する場合、前記センス鎖の対応する追加ヌクレオチドに対して相補的であっても、またはそうでなくてもよい。
二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖をセンス鎖とアニーリングすることによって形成できる。

【0320】

いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの３’または５’末端にてＲＮＡｉ剤に連結される。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、センス鎖の５’末端に連結される。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、センス鎖の３’末端に連結される。いくつかの実施形態において、前記標的化リガンドは、不安定結合、切断可能結合、または可逆的結合を介してＲＮＡｉ剤に連結される。いくつかの実施形態において、前記不安定結合、切断可能結合、または可逆的結合は、前記ＲＮＡｉ剤と標的化リガンドとの間に追加された切断可能部分に含まれる。

【0321】

いくつかの実施形態において、前記発現阻害オリゴマー化合物は、一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの発現を阻害するためにＲＮＡ干渉機構を利用する。いくつかの実施形態において、前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉以外の機構を通して標的核酸発現を低減する際に活性である。

【0322】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物に結合された前述の標的化リガンドが投与される対象における標的の遺伝子発現レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルは、投与前の対象または標的化リガンド複合体を与えていない対象に対して、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％低減される。前記対象の遺伝子発現レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルは、該対象の細胞、細胞群、および／または組織において低減され得る。いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物に結合された前述の標的化リガンドが投与された対象のタンパク質レベルは、前記標的化リガンド複合体を投与する前の対象または前記標的化リガンド複合体を与えていない対象に対して、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％低減される。前記対象のタンパク質レベルは、該対象の細胞、細胞群、組織、血液、および／または他の体液で低減され得る。遺伝子発現、ｍＲＮＡ、またはタンパク質レベルにおける低減は、当該技術分野で知られている任意の方法でも評価できる。ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルの低減または減少は、本明細書中では、標的化された遺伝子の発現を阻害すること、減少すること、または低減することともみなされる。

【0323】

開示される標的化リガンドと共に使用される特異的発現阻害オリゴマー化合物が、当該技術分野で知られている。特に、多数の参照文献が、肝臓への組成物の送達のために本明細書中に開示した標的化リガンドに結合され得る発現阻害オリゴマー化合物を開示する。制限されることのない例としては、Compositions and Methods for Inhibiting Gene Expression of LPAと題された米国特許出願第１５／２８１，３０９号（上記文献を全体として参照により本明細書に援用する）が挙げられ、本明細書中に開示した標的化リガンドと共に使用するのに好適である（リポタンパク質（ａ）粒子の部分であるａｐｏ（ａ）タンパク質、それによるリポタンパク質（ａ）粒子（Ｌｐ（ａ））の発現を阻害するための）ヒトアポリポタンパク質（ａ）遺伝子［ＬＰＡ］を標的化する様々な二本鎖発現阻害オリゴマー化合物を開示する。前記ａｐｏ（ａ）遺伝子［ＬＰＡ］は、ヒトおよびヒト以外の霊長動物の肝臓で主に発現される。同様に、例えば、RNAi Therapy for Hepatitis B Virus Infectionと題された米国特許出願第１５／２２９，３１４号（上記文献もまた全体として参照により本明細書に援用する）は、本明細書中に開示した標的化リガンドとの使用に好適である、Ｂ型肝炎ウイルスを標的化する様々な二本鎖発現阻害オリゴマー化合物を開示している。前記Ｂ型肝炎ウイルスは、厳密な肝指向性の、二本鎖ＤＮＡ含有ウイルスであり、ヘパドナウイルス科のファミリーに属する、ヘパドナウイルスの一員に分類される。さらに、別の例として、Compositions and Methods for Inhibiting Gene Expression of Factor XIIと題された、米国特許出願第１５／２２９，３１４号（上記文献を全体として参照により本明細書に援用する）は、本明細書中に開示した標的化リガンドとの使用に好適である、第ＸＩＩ因子（または、第１２因子、Ｆ１２）遺伝子を標的化する様々な二本鎖発現阻害オリゴマー化合物を開示している。第ＸＩＩ因子は、主に肝臓で発現されて、血液で見つけられたセリンプロテアーゼである。さらに、別の例として、Compositions and Methods for Inhibiting Gene Expression of Alpha-1 AntiTrypsinと題された、米国特許出願第１４／７４０，３０７号（上記文献を全体として参照により本明細書に援用する）は、本明細書中に開示した標的化リガンドとの使用に好適である、α−１アンチトリプシン（または、ＡＡＴ）遺伝子を標的化する様々な二本鎖発現阻害オリゴマー化合物を開示している。ＡＡＴは、セルピンスーパーファミリーの属するプロテアーゼインヒビターであり、通常ＡＡＴタンパク質は、肝細胞によって肝臓で主に合成され、そして、血中に分泌される。さらに、Organic Compositions to Treat APOC3-Related Diseasesと題されたＷＯ２０１６／０１１２３（上記文献を全体として参照により本明細書に援用する）は、本明細書中に開示した標的化リガンドとの使用に好適である、ヒトアポリポタンパク質ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）を標的化する様々な二本鎖発現阻害オリゴマー化合物を開示している。アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩは、トリグリセリドに富む粒子の肝臓取り込みを阻害すると考えられるリポタンパク質の構成要素である。本明細書中に開示した標的化リガンドとの使用に好適であり得る、発現阻害オリゴマー化合物を含めた様々な治療用化合物を開示している更なる参照文献もまた、当該技術分野で見つけることができる。これらとしては、これだけに限定されるものではないが、肝臓に対して標的化することが望ましい組成物が挙げられる。

【0324】

医薬組成物と処方
本明細書中に開示した標的化リガンドは、オリゴマー化合物に連結されるとき、該化合物の投与から恩恵を受けるであろう疾患または障害に罹患している対象（例えば、ヒトまたは哺乳動物）を治療するために使用できる。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドは、発現阻害オリゴマー化合物に連結されるとき、標的ｍＲＮＡの発現の低減または阻害から恩恵を受けるであろう疾患または障害に罹患している対象（例えば、ヒト）を治療するために使用できる。前記対象は、本明細書中に開示した標的化リガンドに連結される、ＲＮＡｉ剤などの任意の１若しくは複数の発現阻害オリゴマー化合物の治療的有効量を投与される。前記対象は、ヒト、患者、またはヒト患者である可能性がある。前記対象は、成人、思春期の人、小児、または幼児であってもよい。発現阻害オリゴマー化合物に連結された標的化リガンドを含む前述の医薬組成物は、疾患の治療療法のための方法を提供するために使用できる。斯かる方法は、ヒトまたは動物への、本明細書中に記載した医薬組成物の投与を含む。

【0325】

本明細書中に開示した医薬組成物および方法は、細胞、細胞群、組織、または対象の標的ｍＲＮＡのレベルを減少させ得：前記対象に、標的化リガンドに連結される、本明細書中に記載した発現阻害オリゴマー化合物の治療的有効量を投与し、それによって、対象の標的ｍＲＮＡの発現を阻害する。いくつかの実施形態において、前記対象は、前記標的細胞または組織における標的遺伝子の病原性上方制御を有すると以前に同定された。

【0326】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、標的化リガンドに連結される、少なくとも１つの発現阻害オリゴマー化合物を含む。これらの医薬組成物は、標的細胞、細胞群、組織、または生物体における前記標的ｍＲＮＡの発現の阻害において特に有用である。前記医薬組成物は、標的ｍＲＮＡのレベルの低減、または標的遺伝子の発現の阻害から恩恵を受けるであろう疾患または障害に罹患している対象を治療するために使用される。前記医薬組成物は、標的ｍＲＮＡのレベルの低減、または標的遺伝子の発現の阻害から恩恵を受けるであろう疾患または障害を発症する危険性のある対象を治療するために使用できる。一実施形態において、前記方法は、治療される対象に対して、ＲＮＡｉ剤などの発現阻害オリゴマー化合物に連結した、本明細書中に記載した標的化リガンドを含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、１若しくは複数の医薬的に許容される賦形剤（ビヒクル、担体、希釈剤、および／または送達ポリマーを含む）は、発現阻害オリゴマー化合物に連結された標的化リガンドを含む医薬組成物に加えられ、それによって、ヒトに対するインビボ送達に好適な医薬製剤を形成する。

【0327】

いくつかの実施形態において、発現阻害オリゴマー化合物に連結された標的化リガンドを含む前述の医薬組成物は、標的ｍＲＮＡの発現に関連している臨床像を治療するかまたは管理するために使用される。または、いくつかの実施形態において、１もしくは複数の医薬組成物の治療的または予防的有効量が、斯かる治療、予防またはマネジメントを必要としている対象に投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマー化合物に共有結合で連結された任意の複合化リガンドの投与は、対象の疾患の症状の数、重症度、および／または頻度を減少させるのに使用できる。

【0328】

発現阻害オリゴマー化合物に連結された標的化リガンドを含む前述の医薬組成物が、標的ｍＲＮＡの発現の低減または阻害から恩恵を受けるであろう疾患または障害に罹患している対象における少なくとも１つの症状を治療するために使用できる。いくつかの実施形態において、前記対象は、本明細書中に記載した標的化リガンドに連結されたＲＮＡｉ剤などの発現阻害オリゴマー化合物を含む１若しくは複数の医薬組成物の治療的有効量を投与され、それによって、該症状が治療される。他の実施形態において、前記対象は、１もしくは複数の発現阻害オリゴマー化合物の予防的有効量を投与され、それによって、少なくとも１つの症状が予防される。

【0329】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドに連結された発現阻害オリゴマー化合物が投与される対象における標的ｍＲＮＡの発現またはそのレベルは、医薬組成物を与えていない対象に対して、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％低減される。前記対象における遺伝子発現レベルは、該対象の細胞、細胞群、および／または組織で低減され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡのレベルが低減される。他の実施形態において、発現タンパク質レベルが低減される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示した標的化リガンドに連結された発現阻害オリゴマー化合物が投与される対象のタンパク質のレベルは、医薬組成物を与えていない対象に対して、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％低減される。発現、ｍＲＮＡレベル、またはタンパク質レベルにおける低減は、当該技術分野で知られている任意の方法によって評価できる。ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルの低減または減少は、本明細書中では、標的ＲＮＡの低減もしくは減少、または標的ｍＲＮＡの発現を阻害することもしくは低減することと言われる。

【0330】

投与経路は、発現阻害オリゴマー化合物を身体と接触させる経路である。一般に、哺乳動物の治療のための薬剤および核酸を投与する方法は、当該技術分野で周知であり、かつ、本明細書中に記載した組成物の投与に適用できる。本明細書中に記載した標的化リガンドに連結された発現阻害オリゴマー化合物は、特定の経路に適切に適合させて調製物によって任意の好適な経路を介して投与できる。よって、本明細書中に記載した医薬組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、関節内、または腹腔内に注射によって投与できる。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した医薬組成物は、吸入を介して投与される。

【0331】

本明細書中に記載した標的化リガンドに連結された発現阻害オリゴマー化合物を含む医薬組成物は、当該技術分野で知られているオリゴヌクレオチド送達技術を使用することで細胞、細胞群、腫瘍、組織、または対象に送達できる。一般に、（インビトロまたはインビボにおける）核酸分子を送達するための当該技術分野で認識されている任意の好適な方法が、本明細書中に記載した組成物を用いた使用に適合させることができる。例えば、送達は、局所的投与、（例えば、直接注入、移植、または局部投与）、全身投与、あるいは、頭蓋内（例えば、脳室内、脳実質内、およびくも膜下腔内）、筋肉内、経皮的、気道（エアゾール）、経鼻、経口、直腸、または局所（頬側および舌下を含む）投与を含めた、皮下、静脈、腹腔、または非経口経路によることができる。特定の実施形態において、前記組成物は、皮下、または静脈内注入または注射によって投与される。

【0332】

従って、いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した医薬組成物は、１もしくは複数の医薬的に許容される賦形剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した医薬組成物は、対象への投与のために処方できる。

【0333】

本明細書中に使用される場合、医薬組成物または薬物は、薬理学的有効量の、１若しくは複数の前述の治療用化合物および少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含む。医薬的に許容される賦形剤（賦形剤）とは、薬物送達システムに意図的に含まれる、医薬品有効成分（ＡＰＩ、治療薬、例えば、Ｆ１２ ＲＮＡｉ剤）以外の物質である。賦形剤は、意図された投薬量にて治療効果を発揮しないか、または発揮することが意図されていない。賦形剤は、ａ）製造中に前記薬物送達システムの加工の助けとなる、ｂ）安定性、生物学的利用能またはＡＰＩの患者の受容性を保護、補助、または強化、ｃ）生成物の同定を助ける、および／またはｄ）保管もしくは使用中のＡＰＩの送達の総合的な安全性、有効性のその他の特質を強化するように機能し得る。医薬的に許容される賦形剤は、不活性物質であっても、またはそうでなくてもよい。

【0334】

賦形剤としては、これだけに限定されるものではないが：吸収促進薬、固結防止剤、泡止め剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝化剤、担体、被覆剤、着色料、送達増強剤、送達ポリマー、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、鎖延長剤、増量剤、香味料、流動促進剤、湿潤剤、滑沢剤、オイル、ポリマー、保存料、生理食塩水、塩、溶媒、糖、懸濁化剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、撥水剤、および湿潤剤が挙げられる。

【0335】

注射用途に好適な医薬組成物としては、無菌の水性溶液（水に可溶性である場合）または分散液、および無菌の注射溶液または分散液の即時調製用の無菌の粉末が挙げられる。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理的塩類溶液、静菌性水、Cremophor ELTM（ＢＡＳＦ、Parsippany, NJ）またはホスファート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。それは、製造および保管の条件下で安定していなければならず、さらに、細菌や真菌などの微生物の混入作用に対して保護されなければならない。前記担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、ならびに好適なその混合物を含めた溶媒または分散媒質であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆の使用によって、分散液の場合には、必要な粒度の維持管理によって、および界面活性化剤の使用によって維持できる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトールやソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを含むことは望ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアホスファートアルミニウムおよびゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。

【0336】

滅菌注射可能溶液は、必要に応じて、先に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせとともに、適当な溶媒中で必要な量の活性化合物を組み込み、続いて、濾過滅菌することによって、調製され得る。一般的に、分散液は、基本的な分散媒と、先に列挙される成分から必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥することを含み、これによって、あらかじめ滅菌濾過したその溶液から、活性化合物および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。

【0337】

関節内投与に好適な処方は、微結晶性形態、例えば、微結晶の水性懸濁液の形態で存在し得る薬剤の無菌の水性製剤の形態であってもよい。リポゾーム製剤または生分解性ポリマー系が、関節内および眼投与の両方に向けて薬剤を提供するためにも使用できる。

【0338】

目の治療を含めた局所投与に好適な処方としては、液状または準液状製剤、例えば塗布剤、ローション、ゲル、外用薬、水中油または油中水型乳剤（例えばクリーム、軟膏剤もしくはペースト剤など）など；あるいは点眼薬などの溶液または懸濁液、が挙げられる。皮膚表面への局所投与のための処方は、例えばローション、クリーム、軟膏剤または石鹸などの皮膚科学的に許容される担体で薬剤を分散することによって調製できる。適用を局在化し、かつ、除去を妨げるために皮膚を覆うフィルムまたは層を形成することができる担体は有効である。内部組織の表面への局所投与に関して、前記剤は、液状組織接着剤または組織表面への吸着を促進することが知られている他の物質中に分散されることができる。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノーゲン／トロンビン溶液が、有益となるように使用できる。あるいは、ペクチン含有処方などの組織被覆溶液が使用できる。

【0339】

吸入治療に関して、スプレー缶、ネブライザー、またはアトマイザーを用いて分注される散剤（自己噴射型またはスプレー処方）の吸入が使用できる。斯かる処方は、散剤吸入デバイスまたは自己噴射型散剤分注処方からの肺内投与のための微細粉末の形態であってよい。自己噴射型溶液およびスプレー処方の場合、効果は、所望のスプレー特性を有する（すなわち、所望の粒度を有するスプレーは生じさせることができる）弁を選択することによって、または制御された粒度に懸濁された散剤として有効成分を組み込むことによって達成できる。吸入による投与に関して、前記化合物はまた、好適な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有している加圧型コンテナもしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアゾールスプレーの形態でも送達できる。全身投与はまた、経粘膜または経皮的手段によっても可能である。経粘膜または経皮投与に関して、透過するべき障壁に対して適当な湿潤剤が、処方に使用できる。斯かる湿潤剤は、一般的に、当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与のために、洗浄薬および胆汁酸塩が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって達成できる。経皮投与に関して、活性化合物は、典型的に、当該技術分野で一般的に知られている軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームに処方される。

【0340】

前記活性化合物は、移植片およびマイクロカプセル化された送達系を含む徐放性処方物等の、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護する担体を用いて調製できる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーが使用されてもよい。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。リポソーム懸濁物もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に既知の方法に従って調製することができる。

【0341】

経口または非経口組成物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で処方されてもよい。本明細書で使用される投薬単位形態は、治療される対象に対する単位投薬量として好適な物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の固有の特徴、および達成されるべき治療効果、および個人の治療のための斯かる活性化合物を合成する当該技術分野における固有の制限によって決定され、かつ直接依存する。さらに、投与は、ボーラスの定期的な注射によってできるか、または外部リザーバ（例えば、静脈内バッグ）からの静脈内、筋肉内、または腹腔内投与によってより連続しておこなわれることができる。

【0342】

本開示の方法に関連して、ファーマコゲノミクス（すなわち、個人の遺伝子型と、外来化合物または薬剤に対するその個人の応答との相関に関する研究）が検討され得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的活性薬物の用量と血中濃度との関係を変更することによって、重度の毒性または治療不全につながる可能性がある。よって、医師または臨床医は、薬剤を投与するか決定する、ならびに該薬剤を用いた治療の投薬量および／または治療計画を調整する際に関連ファーマコゲノミクス研究で得た知識を適用することを検討できる。

【0343】

医薬組成物は、医薬組成物の中で一般的に見出された他の追加成分を含むことができる。斯かる追加成分としては、これだけに限定されるものではないが、止痒剤、収斂剤、局部麻酔剤、または抗炎症薬（例えば、抗ヒスタミン剤、ジフェンヒドラミンなど）が挙げられる。本明細書中に規定したＲＮＡｉ剤を発現するかまたは含む細胞、組織または摘出臓器が「医薬組成物」として使用され得ることもまた、想像される。本明細書中に使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」、または単に「有効量」は、薬理学的、または治療学的または予防的結果を生じさせるようなＲＮＡｉ剤の量を指す。

【0344】

一般的に、活性化合物の有効量は、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、約１．０〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内にある。いくつかの実施形態において、活性化合物の有効量は、１用量あたり約０．２５〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内にある。いくつかの実施形態において、有効成分の有効量は、１用量あたり約０．５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。投与される量もまた、患者の総合的な健康状態、送達される化合物の相対的生物学的効率、薬剤の処方、処方中の賦形剤の存在およびタイプ、ならびに投与経路といった変数に依存する可能性がある。また、投与された初回投与量は、所望の血中濃度または組織レベルを早急に達成するために、高レベルの上を超えて増量されてもよいか、または初回投与量は最適条件よりわずかであってもよいことも、理解すべきである。

【0345】

疾患の治療または疾患の治療のための薬物または組成物の形成に関して、標的化リガンドに連結されたＲＮＡｉ剤などの発現阻害オリゴマー化合物を含む、本明細書中に記載の医薬組成物は、賦形剤、またはこれだけに限定されるものではないが：第二のまたはその他の発現阻害オリゴマー化合物、小分子薬剤、抗体、抗体フラグメント、および／またはワクチンを含めた第二の治療薬または治療と組み合わせられ得る。

【0346】

前述の標的化リガンドは、発現阻害オリゴマー化合物に連結されるとき、および医薬的に許容される賦形剤またはアジュバントに加えられるとき、キット、コンテナ、パック、またはディスペンサーにパッケージされることができる。本明細書中に記載した医薬組成物は、充填済みシリンジまたはバイアルにパッケージされることができる。
先に提供した実施形態は、次の制限されることのない例を用いてここで例示される。

【実施例】

【0347】

以下の実施例は、本明細書中に開示した特定の実施形態を限定するものではなく、例示することを意図している。
次の実施例の合成に関する実験的詳細に使用される略語の一部を以下に規定する：ｈまたは時間＝時間；ｍｉｎ＝分；ｍｏｌ＝モル；ｍｍｏｌ＝ミリモル；Ｍ＝モル；μＭ＝マイクロモル；ｇ＝グラム；μｇ＝マイクログラム；ｒｔまたはＲＴ＝室温；Ｌ＝リットル；ｍＬ＝ミリリットル；ｗｔ＝重量；Ｅｔ_２Ｏ＝ジエチルエーテル；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド；ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル；Ｅｔ_３ＮまたはＴＥａ＝トリエチルアミン；ｉ−Ｐｒ_２ＮＥｔ、ＤＩＰＥＡまたはＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；ＣＨ_２Ｃｌ_２またはＤＣＭ＝塩化メチレン；ＣＨＣｌ_３＝クロロホルム；ＣＤＣｌ_３＝重水素化クロロホルム；ＣＣｌ_４＝四塩化炭素；ＭｅＯＨ＝メタノール；ＥｔＯＨ＝エタノール；ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＢＯＣ＝ｔ−ブトキシカルボニル；ＣＢＺ＝ベンジルオキシカルボニル；ＴＢＳ＝ｔ−ブチルジメチルシリル；ＴＢＳＣｌ＝ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；ＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジン；ＮａＮ_３＝アジ化ナトリウム；Ｎａ_２ＳＯ_４＝硫酸ナトリウム；ＮａＨＣＯ_３＝重炭酸ナトリウム；ＮａＯＨ＝水酸化ナトリウム；ＭｇＳＯ_４＝硫酸マグネシウム；Ｋ_２ＣＯ_３＝炭酸カリウム；ＫＯＨ＝水酸化カリウム；ＮＨ_４ＯＨ＝水酸化アンモニウム；ＮＨ_４Ｃｌ＝塩化アンモニウム；ＳｉＯ_２＝シリカ；Ｐｄ−Ｃ＝パラジウム炭素；ＨＣｌ＝塩化水素または塩酸；ＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルホリン；Ｈ_２＝水素ガス；ＫＦ＝フッ化カリウム；ＥＤＣ−ＨＣｌ＝Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド；ＭＴＢＥ＝メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル；ＭｅＯＨ＝メタノール；Ａｒ＝アルゴン；ＳｉＯ_２＝シリカ；ＲＴ＝保持時間。

【0348】

さらに、本明細書中に開示した標的化リガンドとの使用に好適な、発現阻害オリゴマー化合物の例を、以下の実施例内のさまざまな表中に記載する。以下の表記を、本明細書中に開示した表中に記載する配列に関して修飾ヌクレオチドを示すのに使用する：

【0349】

Ｎ ＝ ２’−ＯＨ（非修飾）リボヌクレオチド（ｆまたはｄ指示のない大文字）
ｎ ＝ ２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド
ｎｆ ＝ ２’−フルオロ修飾ヌクレオチド
ｄＮ ＝ ２’−デオキシヌクレオチド
Ｎ_ＵＮＡ ＝ ２’，３’−セコヌクレオチド模倣体（ロックされていない核酸塩基類似体）
Ｎ_ＬＮＡ ＝ ロックされたヌクレオチド
Ｎｆ_ＡＮＡ ＝ ２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド
ＮＭ ＝ ２’−メトキシエチルヌクレオチド
ＸまたはＡｂ ＝ 脱塩基リボース
Ｒ ＝ リビトール
（ｉｎｖｄＮ） ＝ 反転デオキシリボヌクレオチド（３’−３’結合ヌクレオチド）
（ｉｎｖＡｂ） ＝ 反転脱塩基ヌクレオチド
（ｉｎｖＸ） ＝ 反転脱塩基ヌクレオチド
（ｉｎｖｎ） ＝ 反転２’−ＯＭｅヌクレオチド
ｓ ＝ ホスホロチオアート基結合ヌクレオチド
ｖｐｄＮ ＝ ビニルホスホナートデオキシリボヌクレオチド
（３’ＯＭｅｎ）＝ ３’−ＯＭｅヌクレオチド
（５Ｍｅ−Ｎｆ）＝ ５’−Ｍｅ，２’−フルオロヌクレオチド
ｃＰｒｐ ＝ シクロプロピルホスホナート
本開示の化合物は、当業者に知られている合成化学技術を使用して作製できる。

【0350】

実施例１．標的化リガンド、ホスホラミダイト化合物、構造１００５ｂ、１００４ｂ、および１００２ｂの合成
構造１００５ｂ、構造１００４ｂ、および構造１００２ｂのホスホラミダイト含有化合物を、４−ｃｉｓ−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（本明細書中では化合物８）を化合物、構造１００５ｂを合成するのに使用した、４−ｔｒａｎｓ−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（本明細書中では化合物８ａ）を化合物、構造１００４ｂを合成するのに使用した、および４−ｃｉｓ−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸と（本明細書中では化合物８）と４−ｔｒａｎｓ−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（本明細書中では化合物８ａ）の混合物を化合物、構造１００２ｂを合成するのに使用したという相違のみで、以下の手順に従って合成した。

【0351】

１）２−アミノ−３−［４−（｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝メチル）フェニル］プロパン酸（化合物２）の調製

【化187】

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【0352】

炭酸銅塩基（１．６７グラム（ｇ）、７．５９ｍｍｏｌ）を、水（１００ｍＬ）中の１（７．００ｇ、３０．３４ｍｍｏｌ）の溶液にゆっくり加えた。得られた混合物を、溶解が観察されるまで８０℃に加熱した。得られた濃紺色の溶液を、２５〜３０℃に冷まし、次に、水（１０ｍＬ）中の溶液としての水酸化ナトリウム（１．２１ｇ、３０．３４ｍｍｏｌ）で処理し、そしてそれが、アミノ酸−銅複合体の沈殿をもたらした。懸濁液を周囲温度にて１時間撹拌し、その後、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のクロロギ酸ベンジル（６．２１ｇ、３６．４１ｍｍｏｌ）の溶液を５分間にわたって滴下して処理した。混合物を、１〜２時間撹拌し、次に、濾過した。濡れたケーキを、ＥｔＯＡｃ中で粉砕し、再度、濾過して、脱水するのを助けた。次に、青色の固形物を、２００ｍＬの水が入ったフラスコに加え、１０ｍＬの濃ＨＣｌで処理した。スラリーを、１８時間撹拌し、次に、濾過し、そして、水で洗浄し、白色の固形物として４．５ｇの化合物２を得た（４５％の収率、９５のＡＰ）。Ｒ_Ｔ＝５．８分。

【0353】

２）三酸（化合物３）の調製

【化188】

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【0354】

１．５ＭのＮａＯＨ（１００ｍＬ）中の２（６．００ｇ、１８．２７ｍｍｏｌ）のスラリーを、その時点で溶液が形成される６０℃に加熱した。次に、溶液を、１．５ＭのＮａＯＨ（２０ｍＬ）で溶解したブロモ酢酸（１０．１５ｇ、７３．２０ｍｍｏｌ）の溶液で処理した。溶液を、６０℃にて２時間撹拌した（ＨＰＬＣによると２＝ＮＭＴ５％）。反応が完了した時点で、溶液を、１０℃に冷まし、そして、ｐＨ＝１．７に達するまで、１ＭのＨＣｌを加えた。スラリーを２〜３時間静置し、その後、濾過し、そして、脱イオン水で洗浄した。固形物を真空で乾燥させて、３．０１ｇの三酸３（５０％、９４のＡＰ）を得た。Ｒ_Ｔ＝６．９４分。

【0355】

３）ＴＦＰエステル（化合物４）の調製

【化189】

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【0356】

ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の３（３．００ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）と２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（３．９９ｇ、２４．３０ｍｍｏｌ）の溶液を１０℃に冷やし、分割したＮ−（３−ジエチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（４．６６ｇ、２４．３０ｍｍｏｌ）で５分間にわたり処理した。次に、溶液を、２０分間にわたって周囲温度まで加温し、３時間撹拌した。完了後に（３＜１０のＡＰ）、反応混合物を、飽和重炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）で洗浄し、続いて塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、そして、ロータリーエバポレターにより濃縮した。得られたオイルを、５−２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンの溶媒グラジエントを使用したフラッシュカラムにより精製して、無色のオイルとして２．６ｇの４を得た（４０％、９４のＡＰ）。Ｒ_Ｔ＝１２．９９分

【0357】

４）アミントシラート（化合物５）の調製

【化190】

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【0358】

適切な大きさの圧力反応器に、ＴＨＦと、それに続く、ＣｂＺ保護アミン（１．０ｅｑ、ＮＡＧＺ）とｐ−ＴｓＯＨ−Ｈ_２Ｏ（１．０当量）を充填する（１０倍量）。溶液を窒素で３回脱気する。１０％のＰｄ／Ｃ（５．０ｗｔ％）を充填し、次に、窒素で３回脱気する。水素で３回脱気する。水素を４０〜５０ｐｓｉの圧力まで充填する。２０〜３０℃にて３時間撹拌し、次に、窒素で３回脱気し、ＩＰＣアッセイようにサンプル抽出する（仕様≦０．５％のＮＡＧ−Ｚ、仕様が満たされない場合には、４０〜５０ｐｓｉのＨ_２下で１〜２時間撹拌し、その後、再アッセイする）。珪藻土を通して濾過して触媒を取り除き、ＴＨＦ（４倍量）で洗浄する。合わせた濾液を濃縮し、Ｔｉ≦４０℃を維持しながら、減圧下で約２倍量まで洗浄する。ＤＣＭ（３．８倍量）で希釈し、その後、２倍量まで再び濃縮する。ＤＣＭ希釈と再濃縮を繰り返し、その後、ＤＣＭ（３．８倍量）で希釈する。ＫＦ分析用にサンプル抽出する（仕様ＫＦ≦０．０５％、ＫＦ仕様が満たされない場合には、濃度とＤＣＭでの希釈を繰り返す）。ＫＦ仕様を満たした後、溶液を、白色の泡沫状固形物まで濃縮する。１００％の未修正収率。ｐ−ＴｓＯＨ−Ｈ_２Ｏの代わりにトリフルオロ酢酸を用いる類似反応もまた実施してもよく、互換的に使用できる。

【0359】

５）トリ−ＮＡＧ（化合物６）の調製

【化191】

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【0360】

活性化エステル４（２．１５ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）とアミントシラート５（４．１０ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２２ｍＬ）中に溶解し、１０℃に冷やした。次に、溶液を、５分間にわたりトリエチルアミン（１．３７ｇ、１３．５４ｍｍｏｌ）を滴下して処理し、その後、周囲温度まで加温し、そして、２時間保持した。反応混合物を、飽和重炭酸ナトリウム（１０ｍＬ）と、それに続いて塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。溶液を、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして、ロータリーエバポレターにより濃縮して、無色のオイルを得た。検査後に、〜１０％のデスアシル不純物をＨＰＬＣによって検出した。不純物を、未希釈の無水酢酸（９０ｍＬ）とトリエチルアミン（６ｍＬ）中で１時間撹拌して、再アシル化した。次に、無水酢酸を減圧下で取り除き、得られたオイルを、ジクロロメタン中に再溶解し、そして、重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。溶液を、オイルまで濃縮し、そして、グラジエント溶出（２．５−２５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を使用したフラッシュクロマトグラフィーを介して精製して、白色の固形物として１．９８ｇの６を得た（４７％、９６のＡＰ）。Ｒ_Ｔ＝７．５７分；デスアシル不純物＝７．１８分

【0361】

６）アミン塩（化合物７）の調製

【化192】

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【0362】

保護アミン６（１．９８ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（２０２ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を、無水エタノール（３０ｍＬ）中に溶解し、そして、窒素雰囲気下に置いた。フラスコに、５％のパラジウム炭素（１９８ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）を加え、そして、そのフラスコを、真空下に置き、水素で数回逆充填した（back-filled）。ひとたび水素雰囲気下で、反応物を周囲温度にて撹拌すれば、４時間以内にまたはＨＰＬＣによって開始物質が検出されなくなるまで、完了されることがわかった。触媒を、セライトのベッドを通して濾過し、そして、濾液を、０．２ミクロンのメンブランフィルターに通して、微粒子を取り除いた。溶液を、減圧下で濃縮乾固して、灰色の固形物として２．０１ｇの７を得た（１００％、９８のＡＰ）。Ｒ_Ｔ＝５．８２；ｐ−トルエンスルホン酸Ｒ_Ｔ＝２．４および３．１分

【0363】

７）活性化リンカー（化合物９および９ａ）の調製

【化193】

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【0364】

ｃｉｓ−４−ヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸８（合成に関しては、構造１００５）（４．００ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）と２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（５．５３ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）を、２４ｍＬのジクロロメタン中に溶解し、そして、０℃に冷やした。［先に述べたように、ｃｉｓ−４−ヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸（化合物８）を、構造１００５を処方するためのリンカーとして使用する一方で、ｔｒａｎｓ−４ヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸（化合物８ｂ）は、ｃｉｓ−異性体と置換してもよく、そしてそれが、合成の残りのための同じ手順に従った、構造１００４ｂの合成に通じる：

【0365】

【化194】

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］。

【0366】

この溶液に、ＥＤＣ−ＨＣｌ（６．３８ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を、２２℃まで加温し、そして、１２時間撹拌した。反応を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）でクエンチし、そして、層を分離した。有機層を、飽和塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させた。乾燥剤を濾過し、そして、溶液を、約２０ｍＬまで濃縮し、そしてそれは、ゆっくりと固まった（種晶が促進する）。固形物を、５％のＭＴＢＥ／ヘキサン（５０ｍＬ）でスラリー化し、そして、濾過して、６９％の収率および９５％の純度で５．６ｇの生成物９を得た。

【0367】

８）リンカー連結（化合物１０の調製）

【化195】

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【0368】

ＮＡＧアミン塩７（５．００ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）と２，３，５，６−テトラフルオロフェニルｃｉｓ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシラート９（１．６８ｇ、５．７７ｍｍｏｌ）を、２５ｍＬのジクロロメタン中に溶解し、そして、０℃に冷やした。この溶液に、トリエチルアミン（１．６０ｍＬ、１１．５５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を、室温まで加温し、ＨＰＬＣによって観察しながら、５時間撹拌した。反応を、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３５ｍＬ）でクエンチし、そして、層を分離した。有機層を、飽和塩水（３５ｍＬ）で洗浄し、そして、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させた。乾燥剤を濾過し、そして、溶液を、グラジエント溶出（０−２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を使用したフラッシュクロマトグラフィーを介して濃縮および精製して、白色の固形物として３．９０ｇの化合物１０を与えた（８０％）。Ｒ_Ｔ＝６．１６分。あるいは、次の実施例２に示すように、ＴＦＰエステルを使用せずにリンカーの直接連結を実施することもできる。

【0369】

９）化合物１１の調製

【化196】

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【0370】

化合物１０（１．８７ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬのジクロロメタンと２−シアノエチル中に溶解し、そして、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホラミダイト（０．８４ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を５℃に冷ました。この溶液に、４，５−ジシアノイミジアゾール（０．０２６ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温まで加温し、そして、１時間撹拌した。次に、変換の程度をＨＰＬＣによってチェックした（開始物質の２〜％の残留を示した）。追加の２−シアノエチル，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホラミダイト（０．１４ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を加え、そして、反応物を、さらに２．５時間撹拌した（著しい変化はＨＰＬＣでは観察されなかった）。反応を、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）でクエンチし、そして、層を分離した。有機層を、ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）、そして飽和塩水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、そして、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させた。乾燥剤を濾過し、そして、溶液を濃縮して、白色の固形物として２．３４ｇの化合物１１を得た。

【0371】

１００ｍｇの未精製の１１を、３０分間、ジクロロメタン中の２％のトリエチルアミンでシリカゲル充填カラムを最初に溶出し、続いて、そのカラムに未精製の１１を添加し、そして、グラジエント溶出（０−２０％の２％ トリエチルアミン：メタノール／２％ トリエチルアミン：ジクロロメタン）を使用して精製することによるフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。最終生成物である化合物１１（本明細書中に規定させる構造１００５ｂの化学構造を有する）を２％のトリエチルアミン：ジクロロメタン（画分２）中に溶出して、８０ｍｇの白色の固形物を得た。

【0372】

図１は、化合物１１（本明細書中の構造１００５ｂ）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
図１Ａは、先のステップ７に説明する代替合成に続く、化合物１１のｔｒａｎｓ異性体（本明細書中の構造１００４ｂ）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0373】

実施例２．標的化リガンド、ホスホラミダイト含有化合物、構造１００８ｂの合成
１）トリ−ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−γ−グルタミル］−Ｌ−グルタミン酸（化合物１４）の調製

【0374】

【化197】

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【0375】

熱電対、磁気撹拌子、窒素入口、および粉末用漏斗を備えた、窒素でフラッシュした、２５０ｍＬの３つ口平底フラスコに、１２（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＴＨＦ（１００ｍＬ、１０ｖｏｌ．）を加えた。得られた溶液を、撹拌し、そして、Ｎ−メチルモルホリン（７．８２ｍＬ、７１．１５ｍｍｏｌ、２．４当量）を加えた（反応混合物のＫＦ：１６３ｐｐｍ）。

【0376】

粉末用漏斗をゴム隔壁に置き換え、そして、前記混合物を、氷浴を使用して０℃に冷却した。ポット温度を４．０℃未満に維持したまま、クロロギ酸イソブチル（ｉＢｕＣＯＣｌ、３．８５ｍＬ、４．０５ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ、１．０当量）を、シリンジによって、反応混合物に滴下して１０分間かけて加えた。添加に続いて、その混合物をさらに４０分間撹拌し、そして、前記隔壁を粉末用漏斗に置き換えた。前記反応混合物に、４．０℃未満のポット温度を維持しながら、１５分間かけて１３（８．７６７ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ、１．０当量）を分割して加えた（発熱性の添加）。１３の添加に続いて、氷浴および粉末用漏斗を取り外し、そして、残りの一連のステップ中、反応物を周囲温度に加温した。１３の添加に続いて、透明で、無色の溶液を２５分間静置した。

【0377】

反応物のサンプル（９８μＬを、５ｍＬメスフラスコ内で５．０ｍＬのＡＣＮに希釈）を、１３の添加開始の４０分後に採取し、そして、ＲＰ−ＨＰＬＣによって変換パーセントに関して分析した。１２の２３％が残っていることがわかったので、反応の６０分後に、追加のｉＢｕＣＯＣｌ（１．１６ｍＬ、１．２１ｇ、３０ｍｏｌ％）および１３（２．６３ｇ、３０ｍｏｌ％）を連続して加えた。サンプルがＨＰＬＣによって９９％超の変換を示すまで、前記溶液をさらに６０分間寝かせた。総反応時間は、１３の最初の添加開始から２．５時間であった。

【0378】

前記反応液を、氷浴中で３℃に冷却した０．５ＭのＨＣｌ_（ａｑ）（１２５ｍＬ）の撹拌溶液に注ぎ入れ、約５分間撹拌した。クエンチした反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ、１０ｖｏｌ．；ＮＭＭの完全除去のために確実に水層が酸性であることをチェックする）で抽出し、層を分離し、有機相を塩水（１００ｍＬ、１０ｖｏｌ．）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、粗目フリット漏斗を介して５００ｍＬの平底フラスコ内に濾過し、そして、真空中で濃縮し、再度、粘度が高い無色のオイルを得た。前記オイルを、ＭＴＢＥ（１００ｍＬ、１０ｖｏｌ．）中に溶解し、そして、真空中で濃縮し、再度、粘度が高い無色のオイルを得た。

【0379】

撹拌したオイル（〜６００ｒｐｍ）に、ヘキサン（１００ｍＬ、１０ｖｏｌ．）を加えた。白色のもやが溶液中に現れ、その後それは、さらなる撹拌によって見えなくなった。種晶を加え、そして、その混合物を４０分間撹拌し、その間に、白色結晶をゆっくり形成した。

【0380】

２０分以内では、スラリーは撹拌を妨害できるくらい濃く、そして、追加のヘキサン（５０ｍＬ、５ｖｏｌ．）を加えた。４０分後に、スラリーを、粗目フリット漏斗を介して濾過し、ヘキサン（それぞれ〜１０ｍＬ）で３回洗浄し、そして、１時間漏斗内で風乾し、微細な白色粉末（１５．６４ｇ、９１％）として１４を得た。図２Ｂは、化合物１４に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0381】

１）Ｎ−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−γ−グルタミル］−Ｌ−グルタミン酸（１５）の調製

【0382】

【化198】

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【0383】

オーバーヘッドスターラー、粉末用漏斗、熱電対、および加熱マントルを備えた、３０００ｍＬの３つ口平底フラスコに、３（７２．５７ｇ、１２５．４ｍｍｏｌ）およびギ酸（試薬用グレード、＞９５％、１．４５Ｌ、２０体積当量）を加えた。粉末用漏斗を、Ｎ_２入口を備えた栓で置き換え、そして、得られた溶液を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって観察しながら、４５℃に加熱し、１時間撹拌した。２．０面積％未満のモノ−ｔ−ブチルエステルが残っているとき、反応が完了したと考えた。

【0384】

反応物のサンプルをギ酸添加の６０分後に採取し、そして、そのサンプルを、残っているモノ−ｔ−ブチルエステルのパーセンテージに関してＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。前記分析は、９０分後に１．８％のモノ−ｔ−Ｂｕエステルが残っていることを示したので、反応物を室温に冷ました。

【0385】

反応物を、トルエンおよびアセトニトリル（ＡＣＮ、それぞれ１５００ｍＬ）で希釈し、そして、混合物を真空中で濃縮した。ギ酸を、１：１ ＡＣＮ：トルエン（〜６００ｍＬ）で、そして、ＡＣＮ（それぞれ〜５００ｍＬ）で２回、共沸により取り除いた。前記物質を高真空で一晩乾燥させて、白色の泡沫状固体化合物（５４．３ｇ、定量収量、２５４ｎｍにて９６．８面積％）を得た。図２Ｃは、化合物１５に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0386】

３）トリ−ＮＡＧ−ビス−Ｇｌｕ−ＮＨＺ（化合物１６）の調製

【化199】

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【0387】

１リットルの平底フラスコに、ＮＡＧ−アミンｐ−トシラート塩（５、５９．１９ｇ、９７．６ｍｍｏｌ、４．１３当量）およびＺ−ビス−Ｇｌｕ三酸塩基（１５、１０．０１ｇ、２３．６ｍｍｏｌ補正純度、１．０当量）を加えた。前記混合物を、アセトニトリル（５００ｍＬ；溶液のＫＦ＝１２８３ｐｐｍ）中に溶解し、そして、真空中で濃縮して、共沸により水を取り除いた。残渣を、新しいアセトニトリル（４００ｍＬ）中に溶解し、撹拌子を入れ、そして、熱電対を備えた、窒素フラッシュした１リットルの３つ口平底フラスコに移した。水分含量を、ＫＦ（２５７ｐｐｍ）によって計測した。

【0388】

窒素下で撹拌した溶液に、粉末用漏斗を介してＴＢＴＵ（２８．２０ｇ、８７．８ｍｍｏｌ、３．７当量）を加えた。反応温度を２５℃未満に維持したまま、ＤＩＰＥＡ（３４．０ｍＬ、２５．２ｇ、８．０当量）を、シリンジによって２０分間かけて滴下して加えた（５℃の発熱を添加中に観察した）。混合物を、ＨＰＬＣで観察しながら、ＤＩＰＥＡ添加の開始から２時間撹拌した。７８分時点の分析では、開始物質の完全な消費を示した。

【0389】

２時間後に、真空中で溶媒を取り除いた。得られた粘度の高いオイルを、ジクロロメタン（１０００ｍＬ）中に溶解し、１．０ＮのＨＣｌ_（ａｑ）（３×５００ｍＬ）で洗浄し、ＮａＨＣＯ_{３（ａｑ）}（３×５００ｍＬ）で飽和状態にした。有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、真空中で濃縮して、オフホワイト色の蝋質固形物（３３．５ｇ）を得た。

【0390】

フラッシュカラムクロマトグラフィーを、３３０ｇのISCO RediSep Rf Goldシリカカラムを使用したISCO CombiFlash自動化精製システムにより実施した。原料を、ＣＨＣｌ_３（〜２００ｍＬ）中の溶液として添加した。溶出液Ａ：ＣＨＣｌ_３；溶出液Ｂ：ＭｅＯＨから成る勾配を成すグラジエントを利用し、合計３６の画分を回収した（それぞれ２５０〜５００ｍＬ）。生成物含有画分を濃縮し、１８．７５ｇの１６（９７．０％の純度）を得た。混合画分では１２．２ｇの１６（７８．８％の純度）を得た。
図２Ｄは、化合物１６に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0391】

４）トリ−ＮＡＧ−ビス−Ｇｌｕ−ＮＨ_２（化合物１７）の調製

【化200】

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【0392】

撹拌子が入っている１０００ｍＬの３つ口平底フラスコにメタノール（２００ｍＬ、１３ｖｏｌ．）を充填した。撹拌溶媒に、化合物１６（１５．４４ｇ、９．０２ｍｍｏｌ補正純度）を加え、続いて、追加のメタノール（２００ｍＬ、１３ｖｏｌ．）とトリフルオロ酢酸（１．４０ｍＬ、１８．１ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。混合物を約１０分間撹拌した。混合物に、１０％のＰｄ／Ｃ（５０％湿量基準、１．５４７ｇ、１０％ ｗ／ｗ）を加えた。ヘッドスペースを、水素ガス（バルーン）でフラッシュし、そして、混合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣで観察しながら、周囲温度にて２時間撹拌した。

【0393】

７５分後に、反応物からサンプル抽出し（１００μＬ）、そして、１ｍＬシリンジフイルター（１０ｍｍ、０．１μｍのＧＨＰ膜）内で１：１アセトニトリル：Ｈ_２Ｏ（９００μＬ）と混合した。ＨＰＬＣクロマトグラムは、開始物質の残留がない、９６面積％超の純度を示した。次に、反応混合物を、窒素でフラッシュし、セライトベッドを通して１０００ｍＬの清潔な平底フラスコ内に濾過した。反応器を、メタノール（５０ｍＬ）とジクロロメタン（５０ｍＬ）ですすぎ、そして、すすぎ液もまた濾過した。わずかに濁った濾液を、真空中で部分的に濃縮した。セライトベッドの追加のすすぎを、メタノール（５０ｍＬ）とジクロロメタン（５０ｍＬ）を使用して実施した；これらを、残渣と組み合わせて、０．２μｍのＧＨＰメンブランフィルターを通して別の１０００ｍＬの清潔な平底フラスコ内に濾過した。トルエン副産物を共沸により取り除けるように、膜をアセトニトリル（５０ｍＬ）ですすいだ。溶液を真空中で濃縮して、オフホワイト色の泡沫状固形物として１７（１４．１５ｇ、ＨＰＬＣにより９７．３面積％純度）を得た。
図２Ｅは、化合物１７に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0394】

５）トリ−ＮＡＧ−ビス−Ｇｌｕ−ＮＨ−リンカー（化合物１８）の調製

【化201】

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【0395】

磁気撹拌、熱電対、および窒素ブランケットを備えた５００ｍＬの３つ口平底フラスコに、１７（９３．７％純度、２０．００ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（１５０ｍＬ）を充填した。撹拌溶液に、ｃｉｓ−４−ヒドロキシシクロヘキサン−１−カルボン酸（１．７３０ｇ、１２．０ｍｍｏｌ、１．０５当量）を加え、続いて、ＴＢＴＵ（４．０３６ｇ、１２．６ｍｍｏｌ、１．１０当量）を加えた。溶液を、氷−塩水浴を使用して−９℃に冷やし、そして、内部温度を−５℃未満に維持しながら、ＤＩＰＥＡ（６．９７ｍＬ、５．１７ｇ、４０．０ｍｍｏｌ、３．５当量）を７分間にわたり滴下して加えた。１．７℃の発熱を添加中に観察した。ＤＩＰＥＡの添加が完了した時点で、反応物を−９℃にて９０分間撹拌し、そしてその時点で、ＨＰＬＣ分析（方法Ｂ）は、１７の完全な消費を示した。

【0396】

１１０分後に、反応を、飽和ＮＨ_４Ｃｌ_（ａｑ）（４００ｍＬ）の添加によってクエンチした。層を分離し、そして、水層をジクロロメタン（２ｘ２００ｍＬ）によって抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＨＣＯ_{３（ａｑ）}と塩水（４００ｍＬ）の１：１混合物で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、真空中で約１２５ｍＬまで濃縮した。少量のメタノールを、溶解性を確保するために使用した。得られたオイルを、撹拌ＭＴＢＥが（１６００ｍＬ）が入った３Ｌの平底フラスコに、細流で加え、白色の沈殿物を形成した。ジクロロメタン（〜２０ｍＬ）とＭＴＢＥ（〜２００ｍＬ）を用いた起源フラスコのすすぎ液をスラリーに加え、次に、それを、１時間寝かせ（age）、その後、６００ｍＬの粗目ガラスフリット漏斗を通して真空濾過した。濡れたケーキを、漏斗内でＭＴＢＥ（２×２００ｍＬ）中に再スラリー化し、濾過し、そして、恒量まで高真空ラインにより乾燥させて、白色の粉末として未精製の１８を得た（１６．２２ｇ、８６％の未修正収率）。

【0397】

未精製の１８（１７．１６ｇ、以前のロットと合わせた）を、３３０ｇのISCO RediSep Rf Goldシリカカラムを使用したISCO CombiFlash EZPrep自動化精製システムにより精製した。原料を、８％のＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（〜１６０ｍＬ）中の溶液として添加した。溶出液Ａ：ＣＨ_２Ｃｌ_２；溶出液Ｂ：５０％のＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２のグラジエントを、３３の画分を生じさせるのに利用した。生成物含有画分を濃縮して、１０．１３ｇ（９８．１％の純度、５９％の回収率）の１８を得た。混合画分を貯留して、追加の６．５２ｇ（８６．１％の純度）の１８を得、そしてそれを再精製できる。
図２Ｆは、化合物１８に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0398】

６）標的化リガンド、ホスホラミダイト（化合物１９）の調製

【化202】

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【0399】

化合物１８（１３．０ｇ、７．８７ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（１９５ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下に置いた。この混合物に、ＤＩＰＥＡ（４．１１ｍＬ、２３．６１ｍｍｏｌ）と、無水ジクロロメタン（５ｍＬ）中の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロジアミダイト（２．４５ｍＬ、１１．０２ｍｍｏｌ）の溶液を、５分間にわたり滴下して加えた。反応混合物を、ＨＰＬＣで観察しながら（＜１％のＳＭ残留）、室温にて１時間撹拌した。反応を、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１５０ｍＬ）でクエンチした。有機層を分離し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１×１５０ｍＬ）、および塩水（１×１５０ｍＬ）で洗浄し、そして、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させた。乾燥剤が濾過し、溶液を、シリカカラムをジクロロメタン（＋１％のトリエチルアミン）で３０分間最初に処理し、続いて、そのカラムに未精製の最終生成物、化合物１９（本明細書中の構造１００８の化学構造を有する）を添加し、そして、３０分間にわたりグラジエント溶出（０−２０％ ＭｅＯＨ（＋１％のＴＥＡ）／ＣＨ_２Ｃｌ_２（＋１％のＴＥＡ））を使用して精製することによるフラッシュクロマトグラフィーを介して濃縮し、精製して、白色の固形物として１１．１ｇの化合物１９を得た（７６％の収率、純度９６．６％）。

【0400】

図２は、化合物１９に関する^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを示す。図２Ａは、化合物１９に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。図２および図２Ａは共に、化合物１９の構造（本明細書中の構造１００８ｂ）と一致する。

【0401】

実施例３．標的化リガンド、ホスホラミダイト含有化合物、構造１０２５の合成
１）化合物２１の調製

【化203】

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【0402】

ＭｅＯＨ（３５０ｍＬ）中の化合物２０（４０ｇ、２２１ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、０〜５℃にて滴下してＳＯＣｌ_２（５２．５ｇ、４４２ｍｍｏｌ、３２ｍＬ、２．００ｅｑ）を加えた。溶液を、６０℃に加熱し、そして、１６時間撹拌した。ＴＬＣ（５滴のＨＯＡｃを伴ったＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝５／１、Ｒｆ＝０．４３）は、消費した開始材料を示し、およびＬＣＭＳ（ＥＴ１２４５２−６−Ｐ１Ａ）は、形成された生成物を示した。混合物を減圧下で濃縮し、白色の固形物として未精製の化合物２１（５２．４ｇ、未精製）を得た。

【0403】

¹H NMR: (ET12452-6-p1c DMSO Bruker_B_400MHz) δ 9.45 (s, 1 H), 8.55 (br s, 3 H), 7.00 (br d, J = 8.0 Hz, 2 H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 4.17 (br s, 1 H), 3.67 (s, 3 H), 3.01 (qd, J = 14.2, 6.5 Hz, 2 H)

【0404】

２）化合物２２の調製

【化204】

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【0405】

ＭｅＯＨ（２３０ｍＬ）中の化合物２１（５２．４ｇ、２２６ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、０℃にて滴下してＴＥＡ（６８．７ｇ、６７９ｍｍｏｌ、９４ｍＬ、３．００ｅｑ）、Ｂｏｃ_２Ｏ（５９．２ｇ、２７１ｍｍｏｌ、６２．４ｍＬ、１．２０ｅｑ）を加え、その混合物を、０℃にて０．５時間撹拌し、その後、２５℃にて１６時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１／１、Ｒｆ＝０．８０）は新しい主要スポットを示したので、大部分の開始材料が消費された。混合物を濃縮し、その後、シリカカラム（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１：１）によって精製して、白色の固形物として化合物２２（５７．４ｇ、８６％の収率）を得た。

【0406】

¹H NMR: (ET12452-8-p1g CDCl3 Bruker_B_400MHz) δ 6.97 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 6.74 (br d, J = 8.0 Hz, 2 H), 5.65 (br s, 1 H), 5.01 (br d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.49 - 4.59 (m, 1 H), 3.72 (s, 3 H), 2.92 - 3.09 (m, 2 H), 1.43 (s, 9 H)。

【0407】

３）化合物２３の調製

【化205】

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【0408】

アセトン（１７０ｍＬ）中に溶解した化合物２２（３５ｇ、１１９ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（２１．３ｇ、１５４ｍｍｏｌ、１．３０ｅｑ）とＢｎＢｒ（２４．３ｇ、１４２ｍｍｏｌ、１６．９ｍＬ、１．２０ｅｑ）を加え、その反応混合物を、還流温度（６０℃）にて１４時間加熱した。ＴＬＣ（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝３／１、Ｒｆ＝０．８０）は、開始材料が消費されたことおよび新しいスポットが形成されたことを示した。Ｈ_２Ｏ（５００ｍＬ）を５℃にて混合物に加え、０．５時間撹拌し、その後、濾過し、Ｈ_２Ｏ（８０ｍＬ^＊３）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、白色の固形物として化合物２３（４３ｇ、８８％の収率、９３％の純度）を得た。

【0409】

¹H NMR: (ET12452-9-p1a CDCl3 Bruker_B_400MHz) δ 7.31 - 7.46 (m, 5 H), 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 6.91 (d, J = 9.0 Hz, 2 H), 5.05 (s, 2 H), 4.97 (br d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.50 - 4.60 (m, 1 H), 3.72 (s, 3 H), 2.96 - 3.11 (m, 2 H), 1.43 (s, 9 H)

【0410】

４）化合物２４の調製

【化206】

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【0411】

ＥｔＯＡｃ（２１５ｍＬ）中の化合物２３（４３ｇ、１１２ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（４Ｍ、２１５ｍＬ、７．７１ｅｑ）を滴下し加え、その混合物を２５℃にて９時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝３／１、Ｒｆ＝０．１０）は、開始材料が消費されたことおよび新しいポットが形成されたことを示した。混合物を、濾過し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ^＊３）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、白色の固形物として化合物２４（３５ｇ、９７％の収率、９９％の純度）を得た。

【0412】

¹H NMR: (ET12452-12-p1a MeOD Varian_D_400MHz) δ 7.40 - 7.45 (m, 2 H), 7.34 - 7.39 (m, 2 H), 7.29 - 7.33 (m, 1 H), 7.17 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 5.09 (s, 2 H), 4.26 (dd, J = 7.3, 6.0 Hz, 1 H), 3.81 (s, 3 H), 3.07 - 3.23 (m, 2 H)

【0413】

５）化合物２６の調製

【化207】

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【0414】

化合物２４（１５．５ｇ、４８．２ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を、ＣＨ_３ＣＮ（４０ｍＬ）とＮａＯＨ（１．５Ｍ、７０．６ｍＬ、２．２０ｅｑ）中に溶解し、次に、化合物２５（１３．４ｇ、９６．３ｍｍｏｌ、６．９４ｍＬ、２．００ｅｑ）を１５℃にて加えた、ｐＨチェック：〜２．５。次に、４ＮのＮａＯＨをｐＨ＝１３まで加えた。溶液を７０℃に加熱した。３０分後、ｐＨが６未満に下がり、４ＮのＮａＯＨ（ｐＨ１１〜１３）で再び調整した。追加の化合物２５（６．６９ｇ、４８．２ｍｍｏｌ、３．４７ｍＬ、１．００ｅｑ）を、分割して加え（二回）、その都度、ｐＨを１１〜１３に調整した。混合物を７０℃にて１４時間加熱した。ＬＣＭＳ（ＥＴ１２４５２−３０−Ｐ１Ａ、Ｒｔ＝０．７４９分）は、生成物が形成されたことを示した。混合物を１５℃に冷まし、次に、４ＮのＨＣｌでｐＨ１に調整し、濾過し、そして、Ｈ_２Ｏ（８０ｍＬ^＊２）で洗浄し、乾燥させた。残渣を、ＴＨＦ（６００ｍＬ）で溶解し、次に、ＥＴ１２４５２−２７、ＥＴ１２４５２−１９のバッチと共に６分の１に濃縮し、次に、ＤＣＭ（５００ｍＬ）と共に撹拌し、そして、濾過し、フイルターを乾燥させて、白色の固形物として化合物２６（３５．５ｇ、８７％の収率、９７％の純度）を得た。

【0415】

¹H NMR: (ET12452-30-p1r MeOD Varian_D_400MHz) δ 7.40 - 7.45 (m, 2 H), 7.36 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.27 - 7.32 (m, 1 H), 7.17 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 6.91 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 5.49 (s, 1 H), 5.05 (s, 2 H), 3.71 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 3.61 (s, 4 H), 3.07 (dd, J = 14.1, 7.5 Hz, 1 H), 2.86 - 2.96 (m, 1 H), 2.03 (s, 2 H)

【0416】

６）化合物２７の調製

【化208】

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【0417】

ピリジン（２５０ｍＬ）中の化合物２６（１５ｇ、３８．７ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）、化合物２６Ａ（２５．７ｇ、１５５ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）の溶液に、ＥＤＣＩ（２９．７ｇ、１５５ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）を５℃にて加えた。混合物を３０℃にて１２時間撹拌した。ＬＣＭＳ（ＥＴ１２４５２−５９−Ｐ１Ａ、Ｒｔ＝１．０５３分）は、主として生成物を示した。混合物を、濃縮し、その後、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３（８０ｍＬ^＊４）、塩水（８０ｍＬ^＊２）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮した。残渣を、シリカカラム（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝３：１、Ｒｆ＝０．７５）によって精製し、化合物２６Ａを伴った生成物を得、その後、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３（８０ｍＬ^＊４）および塩水（８０ｍＬ^＊２）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮して、オフホワイト色のゴムとして化合物２７（１９．８ｇ、６１％の収率）を得た。

【0418】

¹H NMR: (ET12452-59-p1g CDCl3 Bruker_B_400MHz) δ 7.36 - 7.46 (m, 4 H), 7.30 - 7.35 (m, 1 H), 7.24 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 6.97 - 7.07 (m, 3 H), 6.94 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 5.05 (s, 2 H), 4.13 - 4.26 (m, 5 H), 3.25 (d, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.06 (s, 1 H), 1.25 - 1.29 (m, 1 H)

【0419】

７）化合物２７−２の調製

【化209】

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【0420】

化合物２７−１（２３０ｇ、１．５３ｍｏｌ、２０５ｍＬ、１．００ｅｑ）を、Ｎ_２雰囲気下で乾燥ＤＣＭ（１．６Ｌ）に溶解した。溶液を、氷浴で０℃に冷やし、そして、ＴＥＡ（２３２ｇ、２．３ｍｏｌ、３１８ｍＬ、１．５０ｅｑ）を加えた。それに続いて、ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のＴｏｓＣｌ（２３３ｇ、１．２２ｍｏｌ、０．８０ｅｑ）を、冷やした反応混合物に加えた。添加後に、溶液を、２０℃まで加温し、そして、５時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１：１、Ｒｆ＝０．１５）は、開始材料が消費されたことを示し、およびＨＰＬＣ（ＥＴ１２４５２−１５−Ｐ１Ｌ、Ｒｔ＝１．７１分）は、２つのピークを示した。反応混合物を、０℃にてＨ_２Ｏ（５００ｍＬ）の添加によってクエンチし、次に、２つの反応物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（８００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、Ｈ_２Ｏ（１Ｌ）および塩水（１Ｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮した。残渣を、シリカカラム（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１：１）によって精製し、黄色のオイルとして化合物２７−２（３３８ｇ、３６％の収率）を得た。

【0421】

¹H NMR: (ET12452-15-p1z1 CDCl3 Bruker_B_400MHz) δ 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.34 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 4.12 - 4.19 (m, 2 H), 3.67 - 3.72 (m, 4 H), 3.60 (s, 4 H), 3.55 - 3.58 (m, 2 H), 2.44 (s, 3 H), 2.32 (s, 1 H)

【0422】

８）化合物２７−３Ａの調製

【化210】

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【0423】

化合物２７−３−１（２３０ｇ、５９１ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を、２０℃にてＤＣＭ（７００ｍＬ）中に懸濁し、ＴＭＳＯＴｆ（１９７ｇ、８８６ｍｍｏｌ、１６０ｍＬ、１．５０ｅｑ）をＮ_２下で加えた。混合物の色がピンク色に変化した。混合物を、５０℃に加熱し、そして、１．５時間撹拌した。次に、反応混合物を、２０℃に冷やし、そして、１４時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０：１、Ｒｆ＝０．６）は、開始材料が消費されたことを示した。混合物を、０〜５℃にてＮａＨＣＯ_３水溶液（６００ｍＬ）中に注ぎ入れ、そして、１５分間撹拌した。混合物の色が黄色に変化した。混合物を、ＤＣＭ（５００ｍＬ）で抽出し、ＮａＨＣＯ_３水溶液（５００ｍＬ）、水（５００ｍＬ^＊２）および塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮して、茶色のオイルとして化合物２７−３Ａ（１８９ｇ、９２％の未精製の純度）を得た。

【0424】

¹H NMR: (ET12452-28-p1c CDCl3 Varian_D_400MHz) δ 6.00 (d, J = 6.6 Hz, 1 H), 5.47 (t, J = 3.0 Hz, 1 H), 4.91 (dd, J = 7.5, 3.3 Hz, 1 H), 4.17 - 4.28 (m, 2 H), 4.08 - 4.14 (m, 1 H), 3.97 - 4.03 (m, 1 H), 2.13 (s, 3 H), 2.05 - 2.09 (m, 9 H)

【0425】

９）化合物２７−４Ａの調製

【化211】

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【0426】

ＤＣＭ（１．５Ｌ）中の化合物２７−３Ａ（１８９ｇ、５７４ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）、化合物７−２（１４０ｇ、４６０ｍｍｏｌ、０．８０ｅｑ）および4A MOLECULAR SIEVE（１５０ｇ）の混合物に、Ｎ_２雰囲気下でＴＭＳＯＴｆ（６３．８ｇ、２８７ｍｍｏｌ、５１．９ｍＬ、０．５０ｅｑ）を加え、混合物を２５℃にて８時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０：１、Ｒｆ＝０．４６）は、開始材料が消費されたことを示し、およびＬＣＭＳ（ＥＴ１２４５２−３５−Ｐ１Ａ、Ｒｔ＝０．７６分）は、生成物が形成されたことを示した。混合物を、濾過して、シーブを取り除き、その後、冷ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０００ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭで抽出し（８００ｍＬ^＊２）、分離した有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３（８００ｍＬ）、Ｈ_２Ｏ（８００ｍＬ^＊２）および塩水（８００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮した。次に、シリカカラム（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０：１）によって精製して、黄色のオイルとして化合物２７−４Ａ（２８５ｇ、７３％の収率）を得た。

【0427】

¹H NMR: (ET12452-35-p1g CDCl3 Varian_D_400MHz) δ 7.81 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 6.30 (br d, J = 9.5 Hz, 1 H), 5.28 - 5.35 (m, 1 H), 5.08 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 1 H), 4.81 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 4.09 - 4.29 (m, 5 H), 3.86 - 3.98 (m, 3 H), 3.68 - 3.81 (m, 3 H), 3.56 - 3.66 (m, 5 H), 2.46 (s, 3 H), 2.16 (s, 3 H), 2.04 (s, 3 H), 1.98 (s, 3 H), 1.95 (s, 3 H)

【0428】

１０）化合物２７−４の調製

【化212】

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【0429】

ＤＭＳＯ（１．４Ｌ）中の化合物２７−４Ａ（２８５ｇ、４５０ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、１０℃にてＮａＮ_３（３８．１ｇ、５８６ｍｍｏｌ、１．３０ｅｑ）を加え、そして、その混合物を６０℃にて１６時間撹拌した。ＬＣＭＳ（ＥＴ１２４５２−３７−Ｐ１Ａ、Ｒｔ＝０．６７分）は、生成物が形成されたことおよび開始材料が消費されたことを示した。混合物を、Ｈ_２Ｏ（１５００ｍＬ）中に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ^＊５）で抽出し、Ｈ_２Ｏ（８００ｍＬ^＊３）および塩水（^＊８００ｍＬ、３）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、および濃縮して、赤色のオイルとして化合物２７−４（１６８ｇ、未精製）を得た。

【0430】

¹H NMR: (ET12452-37-p1c CDCl3 Bruker_B_400MHz) δ 6.12 (br d, J = 9.4 Hz, 1 H), 5.32 (d, J = 2.9 Hz, 1 H), 5.06 (dd, J = 11.3, 3.4 Hz, 1 H), 4.78 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 4.08 - 4.27 (m, 5 H), 3.82 - 3.94 (m, 3 H), 3.61 - 3.77 (m, 10 H), 3.45 - 3.50 (m, 2 H), 2.16 (s, 3 H), 2.05 (d, J = 1.5 Hz, 5 H), 1.99 (d, J = 4.5 Hz, 6 H), 1.26 (t, J = 7.2 Hz, 2 H)

【0431】

１１）化合物２７Ａの調製

【化213】

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【0432】

ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（４：１）（６４０ｍＬ）中の化合物２７−４（７９ｇ、１５６ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、Ｐｄ（ＯＨ）_２／Ｃ（７．９ｇ）を加え、その混合物を、Ｈ_２（３０ｐｓｉ）雰囲気下で１５℃にて４時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０：１）は、開始材料が消費されたことを示し、およびＬＣＭＳ（ＥＴ１２４５２−５３−Ｐ１Ｃ、Ｒｔ＝２．５５分）は、生成物が形成されたことを示した。２つの並行した反応を、セライトで濾過し、ＤＣＭ（５００ｍＬ^＊５）およびＭｅＯＨ（２００ｍＬ^＊３）で洗浄し、濃縮して、こげ茶色のオイルとして化合物２７Ａ（１４０ｇ、未精製）を得た。

【0433】

¹H NMR: (ET12452-53-p1c CDCl3 Varian_D_400MHz) δ 7.02 (br d, J = 9.3 Hz, 1 H), 5.29 - 5.34 (m, 1 H), 5.09 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 1 H), 4.80 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 4.09 - 4.24 (m, 3 H), 3.82 - 3.95 (m, 3 H), 3.52 - 3.70 (m, 10 H), 2.91 (td, J = 5.2, 2.8 Hz, 1 H), 2.15 (s, 3 H), 2.05 (s, 4 H), 1.98 (d, J = 6.4 Hz, 6 H)

【0434】

１２）化合物２８の調製

【化214】

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【0435】

ＴＥＡ（１２．１ｇ、１１９ｍｍｏｌ、１６．５ｍＬ、５．００ｅｑ）を、ＤＣＭ（１６０ｍＬ）中の化合物２７（１９．８ｇ、２３．８ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）と化合物２７Ａ（５７ｇ、１１９ｍｍｏｌ、５．００ｅｑ）を含有する撹拌溶液に加えた。それを３０℃にて１６時間撹拌した。ＬＣＭＳ（ＥＴ１２４５２−６４−Ｐ１Ａ、Ｒｔ＝１．２１分）は、生成物が形成したことを示した。ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、そして、飽和ＮａＨＣＯ_３／飽和塩水（１：１、２×８０ｍＬ）で洗浄した。有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮して、茶色の固形物として未精製の生成物を得た。

【0436】

未精製の生成物を、Ａｃ_２Ｏ（４２ｍＬ）、ＣＨ_３ＣＮ（６２．５ｍＬ）およびＰｙ（８２．３ｇ、１．０４ｍｏｌ、８４ｍＬ、２３．９６ｅｑ）で溶解し、混合物を２５℃にて１２時間撹拌した。ＨＰＬＣ（ＥＴ１２４５２−６５−Ｐ１Ａ、Ｒｔ＝２．５４分）は、ほとんど生成物を示した。ＣＨ_３ＣＮを留去し、その後、ＤＣＭ（４００ｍＬ）で希釈し、そして、飽和ＮａＨＣＯ_３（１００ｍＬ^＊４）で洗浄した。有機層を、分離し、そして、０．１ＭのＨＣｌ／飽和塩水（１：１、１００ｍＬ^＊４）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮した。残渣を、シリカカラム（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０：１、Ｒｆ＝０．４５）によって精製し、生成物を得、その後、ｐ−ＨＰＬＣ（カラム：Phenomenex Gemini C18 ２５０^＊５０ｍｍ^＊１０μｍ；移動相：［水（１０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３）−ＡＣＮ］；Ｂ％：２５％−５５％、２３分）によってさらに精製して、黄色の固形物としての化合物２８（２８．８ｇ、５８％の収率、９８％の純度）を得た。

【0437】

¹H NMR: (ET12452-65-p1j DMSO Varian_D_400MHz) δ 8.00 - 8.09 (m, 3 H), 7.81 (d, J = 9.0 Hz, 3 H), 7.29 - 7.45 (m, 5 H), 7.10 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 6.89 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 3 H), 5.04 (s, 2 H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 3 H), 4.54 (d, J = 8.4 Hz, 3 H), 4.02 (s, 9 H), 3.83 - 3.92 (m, 3 H), 3.73 - 3.81 (m, 3 H), 3.53 - 3.61 (m, 4 H), 3.44 - 3.52 (m, 17 H), 3.42 (br d, J = 4.4 Hz, 2 H), 3.35 - 3.40 (m, 6 H), 3.07 - 3.27 (m, 11 H), 2.74 - 2.87 (m, 2 H), 2.09 (s, 9 H), 1.99 (s, 10 H), 1.89 (s, 9 H), 1.77 (s, 9 H)

【0438】

１３）化合物２９の調製

【化215】

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【0439】

ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の化合物２８（９．７ｇ、５．４８ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、乾燥Ｐｄ／Ｃ（５．５ｇ、５．４８ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を、Ｈ_２雰囲気下（５０ｐｓｉ）で４０℃にて６．５時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０：１、Ｒｆ＝０．３）は、開始材料が消費されたことを示した。２つの並行反応物を、濾過し、ＴＨＦ（３００ｍＬ^＊４）およびＤＣＭ（２００ｍＬ^＊３）で洗浄し、そして、濃縮した。残渣を、ＥＴ１２４５２−７８のバッチを用いたｐ−ＨＰＬＣ（カラム：Phenomenex Gemini C18 ２５０^＊５０ｍｍ^＊１０μｍ；移動相：［水（０．１％のＴＦＡ）−ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％−４５％、２０分）によって精製し、白色の固形物として化合物２９（１４ｇ、６３％の収率）を得た。

【0440】

¹H NMR: (ET12452-80-p1j DMSO Varian_D_400MHz) δ 9.19 (s, 1 H), 7.99 - 8.10 (m, 3 H), 7.83 (d, J = 9.3 Hz, 3 H), 6.95 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 5.76 (s, 2 H), 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 3 H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 3 H), 4.54 (d, J = 8.6 Hz, 3 H), 4.03 (s, 9 H), 3.83 - 3.92 (m, 3 H), 3.73 - 3.81 (m, 3 H), 3.53 - 3.61 (m, 4 H), 3.44 - 3.52 (m, 16 H), 3.43 (br d, J = 4.4 Hz, 3 H), 3.36 - 3.39 (m, 3 H), 3.26 - 3.33 (m, 4 H), 3.05 - 3.24 (m, 9 H), 2.65 - 2.82 (m, 2 H), 2.10 (s, 9 H), 2.00 (s, 9 H), 1.89 (s, 9 H), 1.77 (s, 9 H)

【0441】

１４）化合物３０の調製

【化216】

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【0442】

化合物２９（８ｇ、４．７７ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を、ＤＣＭ（６５ｍＬ）で溶解し、そして、化合物２９Ａ（２．８８ｇ、９．５４ｍｍｏｌ、３ｍＬ、２．００ｅｑ）を加えた。得られた溶液を５℃に冷やした。この溶液に、２Ｈテトラゾール（０．４５Ｍ、１１．７ｍＬ、１．１０ｅｑ）を加えた。溶液を、１５℃まで加温し、そして、３．５時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝５：１、Ｒｆ＝０．５２）は、開始材料が消費されたことを示し、およびＨＰＬＣ（ＥＴ１２４５２−８２−Ｐ１Ａ、Ｒｔ＝２．６９分）は、生成物が形成されたことを示した。ＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ_３（３０ｍＬ）でクエンチし、その水溶液を、ＤＣＭで抽出し（３０ｍＬ^＊２）、合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３（３０ｍＬ^＊２）、Ｈ_２Ｏ（３０ｍＬ）および塩水（３０ｍＬ^＊２）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮した。残渣を、ＤＣＭ（３０ｍＬ）で溶解し、その後、ヘキサン（１５０ｍＬ）を０℃にて滴下して加え、１５分間撹拌し、その後、冷やし、有機層を注ぎ出し、そして、オイルを、ＤＣＭ（３０ｍＬ）で再び溶解し、ヘキサン（１５０ｍＬ）を滴下して加え、その手順を７回繰り返し、減圧下で乾燥させて、白色の固形物として化合物３０（５．５ｇ、５５％の収率）を得た。

【0443】

¹H NMR: (ET12452-83-p1b DMSO Varian_D_400MHz) δ 7.97 - 8.09 (m, 3 H), 7.78 (d, J = 9.3 Hz, 3 H), 7.06 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 6.86 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 5.73 (s, 2 H), 5.18 (d, J = 3.3 Hz, 3 H), 4.94 (dd, J = 11.1, 3.4 Hz, 3 H), 4.51 (d, J = 8.4 Hz, 3 H), 3.99 (s, 9 H), 3.79 - 3.89 (m, 4 H), 3.70 - 3.78 (m, 4 H), 3.59 - 3.69 (m, 2 H), 3.49 - 3.58 (m, 4 H), 3.44 (s, 16 H), 3.40 (br d, J = 4.2 Hz, 3 H), 3.32 - 3.37 (m, 5 H), 3.24 - 3.28 (m, 1 H), 3.05 - 3.22 (m, 9 H), 2.78 (br t, J = 5.8 Hz, 4 H), 2.07 (s, 9 H), 1.96 (s, 9 H), 1.86 (s, 9 H), 1.74 (s, 9 H), 1.15 (d, J = 6.8 Hz, 6 H), 1.09 (d, J = 6.8 Hz, 6 H)
図３は、化合物３０（本明細書中の構造１０２５ｂ）に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
実施例４：標的化リガンド、ホスホラミダイト含有化合物、構造１０１４ｂの合成

【0444】

１）化合物３２の調製

【化217】

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【0445】

ＡＣＮ（２６０．００ｍＬ）中の化合物３１（２４．７１ｇ、８７．８５ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）、化合物３１Ａ、ＥＤＣＩ（３９．０７ｇ、２０３．８２ｍｍｏｌ、２．３２ｅｑ）、ピリジン（１９．３９ｇ、２４５．１１ｍｍｏｌ、１９．７９ｍＬ、２．７９ｅｑ）の溶液を、２５℃にて２時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル／酢酸エチル＝１／１、所望の生成物；Ｒｆ＝０．７）は、所望の生成物が形成されたことを示した。混合物を、３００ｍＬのＥｔＯＡｃに加え、ＮａＨＣＯ_３（１００ｍＬ^＊２）、１００ｍＬの塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させ、濾過し、そして、濃縮して、残渣を得た。未精製の生成物を、シリカカラム（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１〜３／１）で精製して、黄色のオイルとして化合物３２（６０．００ｇ、７９．２５ｍｍｏｌ、９０．２０％の収率、９７．１９％の純度）を得た。

【0446】

¹H NMR: (ET12600-89-p1a DMSO Varian_D_400MHz) δ ppm 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.27-7.38 (m, 5H), 4.99 (s, 2H), 4.26-4.42 (m, 3H), 3.80-4.15 (m, 8H), 2.27 (br s, 2H), 1.78-1.88 (m, 1H), 1.66 (br dd, J = 14.4, 7.2 Hz, 1H), 1.37-1.41 (m, 35H)

【0447】

２）化合物３３の調製

【化218】

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【0448】

ギ酸（８００．００ｍＬ）中の化合物３２（４５．００ｇ、６１．１５ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液を、４５℃にて６時間撹拌した。ＬＣＭＳ（ｅｔ１２６００−９０−ｐ１ａ、ＭＳ＝５１１）は、所望の生成物が形成されたことを示した。混合物を濃縮して、残渣を得た。残渣を１０００ｍＬのＤＣＭで洗浄して、白色の固形物として化合物３３（３０．００ｇ、５４．７１ｍｍｏｌ、８９．４７％の収率、９３．２７％の純度）を得た。

【0449】

¹H NMR: (ET12600-90-p1a DMSO Bruker_B_400MHz) δ 12.75 (br s, 3H), 7.53 (br d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.29-7.38 (m, 5H), 4.99 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 4.27-4.38 (m, 2H), 4.12 (br s, 2H), 3.84-4.07 (m, 6H), 2.30 (br t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.07 (s, 1H), 1.59-1.88 (m, 2H), 1.39 (t, J = 5.6 Hz, 1H)

【0450】

３）化合物３４の調製

【化219】

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【0451】

ＡＣＮ（９０ｍＬ）中の化合物３３（１５ｇ、２９．３３ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）、化合物３３Ａ（２９．２２ｇ、１７５．９８ｍｍｏｌ、６．００ｅｑ）、ピリジン（１１．６０ｇ、１４６．６５ｍｍｏｌ、１１．８４ｍＬ、５．００ｅｑ）の溶液に、ＥＤＣＩ（２８．１１ｇ、１４６．６５ｍｍｏｌ、５．００ｅｑ）を加え、その後、その混合物を２５℃１時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル／酢酸エチル＝３／１）は、所望の生成物が形成されたことを示した。混合物に５００ｍＬのＤＣＭを加え、ＮａＨＣＯ_３（２００ｍＬ^＊２）、１００ｍＬの塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮して、残渣を得た。シリカカラム（石油エーテル／酢酸エチル＝４／１）で精製し、黄色の固形物としての化合物３４（２８ｇ）を得た。

【0452】

４）化合物３５の調製

【化220】

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【0453】

ＤＣＭ（１４０ｍＬ）中の化合物３４（１６．５７ｇ、１５．０１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、化合物３４Ａの溶液に、ＴＥＡ（９．１２ｇ、９０．０８ｍｍｏｌ、１２．４９ｍＬ、６．００ｅｑ）を加え、その後、その混合物を２５℃にて１６時間撹拌した。ＬＣＭＳ（ｅｔ１２６００−９８−ｐ１ｇ）は、所望の生成物が形成されたことを示した。混合物を、２００ｍＬのＤＣＭに注ぎ、１００ｍＬのＮａＨＣＯ_３、１００ｍＬの塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させ、濾過し、そして、濃縮して、残渣を得た。調製用ＨＰＬＣ（カラム： Phenomenex Gemini C18 ２５０^＊５０ １０ｕ；移動相：［水（１０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３）−ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％−４５％、２０分）で精製して、黄色の固形物として化合物５（１１ｇ、４．６５ｍｍｏｌ、３０．９８％の収率、９９．５％の純度）を得た。

【0454】

¹H NMR: (ET12600-98-p1a1 DMSO Varian_D_400MHz) δ 8.65-8.71 (m, 1H), 8.51 (br s, 1H), 8.18-8.25 (m, 1H), 8.11 (br s, 1H), 7.80 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.47 (br d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.28-7.40 (m, 5H), 5.75 (s, 4H), 5.22 (d, J = 3.2 Hz, 4H), 4.95-5.03 (m, 6H), 4.55 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 3.98-4.06 (m, 15H), 3.88 (dt, J = 11.2, 8.8 Hz, 7H), 3.78 (dt, J=10, 5.2 Hz, 5H), 3.54-3.62 (m, 6H), 3.46-3.53 (m, 25H), 3.41 (q, J = 5.6 Hz, 9H), 3.23 (br dd, J = 11.6, 5.6 Hz, 8H), 2.10 (s, 12H), 2.00 (s, 12H), 1.89 (s, 12H), 1.77 (s, 12H)

【0455】

５）化合物３６の調製

【化221】

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【0456】

ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の化合物３５（１０ｇ、４．２５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ＴＦＡ（４８４．５２ｍｇ、４．２５ｍｍｏｌ、３１４．６２μＬ、１ｅｑ）の溶液に、１０％のＰｄ（ＯＨ）_２／Ｃ（３．００ｇ）を加え、その後、その混合物を、Ｈ_２（５０Ｐｓｉ）下で２０℃にて４時間撹拌した。ＬＣＭＳ（ｅｔ１２６００−１０７−ｐ１ａ、Ｒｔ＝２．１９５）は、所望の生成物が形成されたことを示した。混合物を、濾過し、そして、濃縮して、黄色の固形物としての化合物３６（３．６０ｍｍｏｌ、８ｇ、８４．８４％の収率）を得た。

【0457】

¹H NMR: (ET12600-107-p1a DMSO Varian_D_400MHz) δ 8.68 (br t, J = 5.2 Hz, 1H), 8.46 (br t, J = 5.2 Hz, 1H), 8.21-8.27 (m, 1H), 8.15 (br d, J = 5.6 Hz, 2H), 7.84 (br d, J = 9.2 Hz, 4H), 5.22 (d, J = 3.2 Hz, 4H), 4.98 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 4H), 4.56 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 4.24 (br s, 1H), 3.99-4.14 (m, 23H), 3.84-3.94 (m, 7H), 3.74-3.83 (m, 5H), 3.55-3.62 (m, 5H), 3.51 (s, 25H), 3.38-3.46 (m, 9H), 3.20-3.30 (m, 9H), 3.17 (d, J = 5.2 Hz, 14H), 2.11 (s, 12H), 2.00 (s, 13H), 1.89 (s, 12H), 1.78 (s, 12H)

【0458】

６）化合物３７の調製

【化222】

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【0459】

バッチに関しては並行であった。ＤＣＭ（６ｍＬ）中の化合物３６（２ｇ、８５７．１８μｍｏｌ、１．００ｅｑ、ＴＦＡ）、化合物３６Ａ（６２６．２３ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ、２．５０ｅｑ）の溶液に、ＴＥＡ（３１２．２６ｍｇ、３．０９ｍｍｏｌ、４２７．７５μＬ、３．６０ｅｑ）を加え、その後、その混合物を２５℃にて１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは、所望の生成物が形成されたことを示した。すべての反応混合物を合わせ、２００ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、３０ｍＬのＮａＨＣＯ_３上に注ぎ、３０ｍＬの塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させ、濾過し、そして、濃縮して、残渣を得た。調製用ＨＰＬＣ（カラム： Phenomenex Gemini C18 ２５０^＊５０ １０ｕ；移動相：［水（１０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３）−ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％−４５％、２０分）で精製して、白色の固形物として化合物３７（３．２０ｍｍｏｌ、７．５ｇ、９３．２７％の収率）を得た。

【0460】

¹H NMR: (ET12600-111-p1a DMSO Varian_D_400MHz) δ 8.66 (s, 1H), 8.51 (br s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.91 (br d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.80 (d, J=9.2 Hz, 4H), 5.22 (d, J =3.2 Hz, 4H), 4.98 (dd, J=11.2, 3.2 Hz, 4H), 4.55 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 4.47 (br s, 1H), 4.30 (s, 1H), 4.25 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.03 (s, 11H), 3.97 (br s, 2H), 3.84-3.92 (m, 7H), 3.73-3.82 (m, 6H), 3.55-3.62 (m, 5H), 3.47-3.54 (m, 24H), 3.41 (q, J = 5.6 Hz, 9H), 3.23 (br dd, J = 11.2, 5.6 Hz, 8H), 2.19 (br s, 1H), 2.10 (s, 12H), 2.00 (s, 13H), 1.89 (s, 12H), 1.77 (s, 13H), 1.61 (br s, 3H), 1.40 (br d, J=11.2 Hz, 4H)

【0461】

８）化合物３８の調製

【化223】

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【0462】

ＤＣＭ（２６．４ｍＬ）中の化合物３７（４．４ｇ、１．８８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）および化合物３７Ａ（１．１３ｇ、３．７５ｍｍｏｌ、１．１９ｍＬ、２ｅｑ）を加えた。得られた溶液を５℃に冷やした。この溶液に、２Ｈテトラゾール（０．４５Ｍ、４．５９ｍＬ、１．１ｅｑ）を加えた。溶液を２０℃まで加温し、そして、２時間撹拌した。混合物を、１００ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、２０ｍＬのＮａＨＣＯ_３でクエンチし、ＤＣＭ（５０ｍＬ^＊２）で抽出し、２０ｍＬのＮａＨＣＯ_３、２０ｍＬの塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させ、濾過し、そして、濃縮して、残渣を得た。残渣を、ＤＣＭ（２５ｍＬ、０．２％のＴＥＡ）で溶解し、その後、ヘキサン（１２５ｍＬ、０．２％のＴＥＡ）を０℃にて滴下して加え、１５分間撹拌し、その後、冷やし、有機層を注ぎ出し、そして、オイルをＤＣＭ（３０ｍＬ）で再び溶解し、ヘキサン（１５０ｍＬ）を滴下して加え、手順を３回繰り返し、減圧下で乾燥させた。２０ｍＬのＤＣＭを白色の固形物に加え、それを３０℃にて減圧下で乾燥させて、白色の固形物として３８（４．８ｇ、１．８３ｍｍｏｌ、６７．３４％の収率、９７．１５％の純度）を得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ−ｉＰｒ_２Ｎ］^＋/２、１２２２．８。

【0463】

¹H NMR: (DMSO, Varian_400MHz) δ 8.67 (br s, 1H), 8.52 (br s, 1H), 8.20 (br s, 1H), 8.08 (br s, 1H), 7.98 (br d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.79 (br d, J=9.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J=3.2 Hz, 4H), 4.98 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 4H), 4.55 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 4.47 (br s, 1H), 4.29 (br d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.94-4.11 (m, 16H), 3.83-3.94 (m, 8H), 3.78 (br dd, J = 10.4, 5.2 Hz, 6H), 3.64-3.74 (m, 3H), 3.54-3.63 (m, 8H), 3.50 (br s, 26H), 3.36-3.44 (m, 9H), 3.14-3.29 (m, 9H), 2.75 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.15-2.27 (m, 4H), 2.10 (s, 13H), 2.00 (s, 13H), 1.82-1.95 (m, 15H), 1.77 (s, 14H), 1.59-1.73 (m, 4H), 1.45 (br d, J = 14.4Hz, 4H), 1.14 (d, J = 6.4 Hz, 12H)

【0464】

図４は、化合物３８（本明細書中の構造１０１４ｂ）に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0465】

実施例５：標的化リガンド、ホスホラミダイト化合物、構造１００６ｂおよび１００７ｂの合成
構造１００６ｂおよび構造１００７ｂのホスホラミダイト含有化合物を、４−ｃｉｓ−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（本明細書中では化合物８）を構造１００６ｂを合成するのに使用した、および４−ｔｒａｎｓ−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（本明細書中では化合物８ａ）を構造１００７ｂを合成するのに使用したという相違のみで、以下の同じ手順に従って合成した。

【0466】

１）化合物４１の調製

【化224】

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【0467】

ＡＣＮ（３ｍＬ）中のＺ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）−ＯＨ３９（４４５ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミノジアセタート４０（３４０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３１９ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ、１．２３ｅｑ）およびＰｙ（３ｅｑ、０．３３ｍＬ）の溶液を、ＲＴにて１時間撹拌し、酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ_３（２×）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、そして、留去した。次に、未精製物を、ＤＣＭ（５ｍＬ）中に溶解し、そして、ＴＦＡ（５ｍＬ）を加えた。それを、ＲＴにて１６時間撹拌し、その後、留去した。フォーム／沈殿物が形成されるまで、酢酸エチルを加え、留去した４×。未精製の４１を、ＴＦＰ活性化ステップにそのまま使用した。Ｒｔ＝３．７８分、９０％の純度。ＬＣＭＳ（ＥＳ、Ｍ／ｚ）：３７９．０［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0468】

２）化合物４２の調製

【化225】

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【0469】

ＡＣＮ（３．５ｍＬ）中の未精製の三酸４１（〜１．３０ｍｍｏｌ）、ＴＦＰ（７ｅｑ、９．１０ｍｍｏｌ、１．５１ｇ）、ＴＥＡ（４ｅｑ、０．７２３ｍＬ）およびＥＤＣ（３．３ｅｑ、４．２９ｍｍｏｌ、０．８２ｇ）の溶液を、ＲＴにて１時間撹拌し、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮し、そして、シリカカラムで精製した。生成物である活性化トリ−ＴＦＰエステルを、ｈｅｘ（５−２０％）中のＡｃＯＥｔで溶出して、微量のＴＦＰと共に、５５０ｍｇの生成物を得た。Ｒｔ＝７．０６分。

【0470】

ＴＥＡ（４００μＬ、２．９ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（６ｍＬ）中のトリ−ＴＦＰエステル（５４０ｍｇ、０．６４２ｍｍｏｌ）とＧａｌＮａｃ−Ｐｅｇ_３−ＮＨ_２ＸＴｓＯＨ（２．８９ｍｍｏｌ、１．８８ｇ）を含有した撹拌溶液に加えた。それを、ＲＴにて１６時間撹拌し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３／飽和塩水（１：１、２×１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて、留去して、白色の固形物が残った。固形物を、ＤＣＭ中に溶解し、そして、シリカカラムで精製した。ＤＣＭ（０−１０％）中のＭｅＯＨを用いた溶出で、７４８ｍｇ、９５．４％の純度および〜１００ｍｇ、８０％の純度のトリ−ＧａｌＮＡｃ４２、３６％の収率、２ステップ、を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ、Ｍ／ｚ）：１７７７．５［Ｍ］^＋、Ｒｔ＝４．６７分。

【0471】

３）化合物４３の調製

【化226】

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【0472】

１０％のＰｄ／Ｃ、活性化マトリックス（３０ｍｇ）を、ＴＨＦ（４ｍＬ）とＴＦＥ（４ｍＬ）中のＣｂｚ保護アミン４２（７１５ｍｇ、０．４０２ｍｍｏｌ）とＴｓＯＨ（７４．５ｍｇ、０．４０２ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。次に、水素雰囲気（バルーン）を、水素での引き込み真空（pulling vacuum）および逆充填（back filling）によって構築した。それを、水素雰囲気下で２４時間撹拌し、セライトを通して濾過し、ＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で洗浄し、そして、留去して、白色の固形物としてアルコールＣが残った。ＬＣＭＳ（ＥＳ、Ｍ／ｚ）：１６４４．２［Ｍ＋Ｈ］^＋、Ｒｔ＝４．６７分。

【0473】

脱保護中間体（０．４ｍｍｏｌ）および４−ｃｉｓ−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸のＴＦＰエステル（３５０ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２．５ｍＬ）中に溶解し、そして、ＴＥＡ（３．５ｅｑ、０．１９５ｍＬ）を加えた。それをＲＴにて１６時間撹拌した。次に、それを、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、そして、飽和ＮａＨＣＯ_３／飽和塩水（１：１、１００ｍＬ×２）で洗浄した。有機相を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮し、そして、シリカカラムで精製した。生成物を、ＤＣＭ中のＭｅＯＨ（２−２０％）で溶出して、４３０ｍｇの＞９５％の純度の４３、６１％の収率を得た。Ｒｔ＝４．２０分。ＬＣＭＳ：（ＥＳ、Ｍ／ｚ）：１７７１．２６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0474】

４）化合物４４の調製

【化227】

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【0475】

２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．５ｅｑ、１１０μＬ、０．３４３ｍｍｏｌ）を、０℃にて無水ＤＣＭ（２．４ｍＬ）中のアルコール４３（４０５ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ、真空乾燥）とテトラゾール（０．５０ｅｑ、０．２５ｍＬ、０．１１２ｍｍｏｌ、ＡＣＮ中に０．４５Ｍ）の撹拌溶液に加えた。それを、ＲＴにて１時間撹拌し、そして、追加のテトラゾール（０．１２５ｍｌ）と２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．１０ｍＬ）を加えた。撹拌を３０分間続け、次に、それを、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、そして、飽和ＮａＨＣＯ_３／飽和塩水（１：１、２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４／ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、留去し、その後、無水ＤＣＭで溶解し、再び留去して、白色の固形物４４、４０８ｍｇが残った、ＨＰＬＣ純度９２％、８３％の収率。ＬＣＭＳ：（ＥＳ、Ｍ／ｚ）：１８７０．４［Ｍ−ｉＰｒ_２Ｎ］^＋。
図５は、化合物４４に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す（本明細書中の構造１００７ｂ）。

【0476】

実施例６：標的化リガンド、ホスホラミダイト含有化合物、構造１０２７ｂの合成
１）化合物４５の調製

【化228】

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【0477】

ＴＥＡ（５．３ｍｍｏｌ、０．７３５ｍＬ、４．００ｅｑ）を、ＤＣＭ（９ｍＬ）中の化合物２７（１．１ｇ、１．３２ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）と化合物４５Ａ（３．２０ｇ、５．２９ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）を含有する撹拌溶液に加えた。それを３０℃にて１６時間撹拌した。ＬＣＭＳ（ＥＴ１２４５２−６４−Ｐ１Ａ、Ｒｔ＝１．２１分）は、生成物が形成したことを示した。ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、そして、飽和ＮａＨＣＯ_３／飽和塩水（１：１、２×８０ｍＬ）で洗浄した。有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮して、茶色の固形物として未精製の生成物を得た。

【0478】

未精製の生成物を、Ａｃ_２Ｏ（３ｍＬ）、ＣＨ_３ＣＮ（６ｍＬ）およびＰｙ（６ｍＬ）で溶解し、そして、混合物を２５℃にて１６時間撹拌した。ＣＨ_３ＣＮを留去し、その後、それを、ＤＣＭで希釈し、そして、飽和ＮａＨＣＯ_３で４回洗浄した。有機層を、分離し、そして、０．１ＭのＨＣｌ／飽和塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮した。残渣を、シリカカラム（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０：１、Ｒｆ＝０．４５）によって精製して、白色の固形物として生成物４５（１．４７ｇ、６８％の収率、９６％の純度）を得た。

【0479】

４）化合物４６の調製

【化229】

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【0480】

ＴＨＦ／ＴＦＥ（１：１、５ｍＬ）中の化合物４５（１．４２５ｇ、０．８７１ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、１０％のＰｄ／Ｃ（２４ｍｇ）を加え、そして、その混合物をＨ_２雰囲気下で４０℃にて３０時間撹拌した。ＴＬＣ（１０：１、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝Ｒｆ＝０．３）は、開始材料が消費されたことを示した。それを、濾過し、ＴＨＦ（５ｍＬ×３）、ＤＣＭ（５ｍＬ×３）で洗浄し、そして、濃縮した。残渣をシリカカラムで精製した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶出して、白色の固形物として化合物４６（１．０１３ｇ、７５％の収率、９５％の純度）を得た。ＬＣＭＳ：（ＥＳ、Ｍ／ｚ）：１５４７．５［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0481】

５）化合物４７の調製

【化230】

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【0482】

化合物４６（９７０ｍｇ、０．６２７ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）をＤＣＭ（４．２ｍＬ）中に溶解し、そして、化合物４６Ａ（０．９４１ｍｍｏｌ、０．２９８ｍＬ、１．５ｅｑ）を加えた。得られた溶液を５℃に冷やし、ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）（２３．１ｍｇ、０．１８８ｍｍｏｌ、０．３ｅｑ）。溶液を、１５℃まで加温し、そして、２時間撹拌した。ＴＬＣ（５：１、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝Ｒｆ＝０．５２）は、開始材料が消費されたことを示し、およびＨＰＬＣは、生成物が形成されたことを示した。それを、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３（３０ｍＬ）、Ｈ_２Ｏ（３０ｍＬ）および塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、そして、濃縮した。残渣を、ＤＣＭ（２ｍＬ）で溶解し、ヘキサン（１２０ｍＬ）に加えた。白色の沈殿物を濾過して、白色の固形物として化合物４７（０．９７５ｇ、９３％の収率、８２％の収率）を得た。ＬＣＭＳ：（ＥＳ、Ｍ／ｚ）：１７４７．５［Ｍ＋Ｈ］^＋。
図６は、化合物４７に関する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す（本明細書中の構造１０２７ｂ）。

【0483】

実施例７．標的化リガンド、ホスホラミダイト含有化合物、構造１０２６ｂの合成
１）三酸４９の調製

【化231】

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【0484】

１．５ＭのＮａＯＨ（１００ｍＬ）中の４−ブロモ−アヒルリゾチームフェニルアラニンヒドロクロリド（５．０ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ブロモ酢酸（８．１７ｇ、５８．８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を、１時間６０℃に加熱し、そして、水酸化ナトリウムペレットの添加によってｐＨを１２より高く維持した。完了時に、反応物を１５℃に冷まし、ｐＨを１．７５〜２．００に調整し、そして、濾過可能な固形物が観察されるようになるまで、オイル状懸濁液を２時間寝かせた。固形物は、濾過し、水で数回洗浄して、白色の固形物（６．０ｇ、９３％の収率）の分離がもたらされた。

【0485】

２）ビアリール三酸５０の調製

【化232】

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【0486】

アリールブロミド４９（４．２ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）とボロン酸５０（２．８ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ／水（１６８ｍＬ）の１：１混合物中に溶解し、そして、１０分間脱気した。その溶液を、炭酸カリウム（８．０ｇ、１１６．２ｍｍｏｌ）とＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（０．４７６ｇ、０．６ｍｍｏｌ）で処理し、そして、反応器を、窒素雰囲気下に置いて、５時間４０℃に加熱した。完了時に、ｐＨを１２に調整し、そして、水相を２×（２０ｍＬ）酢酸エチルで洗浄した。次に、ｐＨを１．７５〜２．００に調整し、そして、１５℃に冷ました。得られた固形物を、濾過し、水で数回洗浄してすべての無機物を取り除いて、５１（４．８ｇ、８９％の収率）を得た。

【0487】

１）トリ−ＴＦＰエステル５２の調製

【化233】

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【0488】

ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の三酸５１（５．０ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）とテトラフルオロフェノール（６．５ｇ、３８．８ｍｍｏｌ）のスラリーを、０℃に冷やし、そして、ＥＤＣヒドロクロリド（７．４５ｇ、３８．８ｍｍｏｌ）で処理した。スラリーを、周囲温度まで暖め、そして、１８時間撹拌した。反応完了時に、反応物を水で洗浄し、有機層を、オイルまで濃縮し、シリカカラムで精製して、ＴＦＰエステル５２（１．６３ｇ、１６％の収率）を得た。

【0489】

２）トリ−ＮＡＧ保護アルコール５４の調製

【化234】

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【0490】

ジクロロメタン（５ｍＬ）中のトリ−ＴＦＰエステル５２（１．００ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）とＮＡＧアミントシラート５３（２．１５ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃に冷やし、そして、トリエチルアミン（０．６６ｇ、６．６ｍｍｏｌ）で処理した。溶液を、２時間にわたり周囲温度まで加温した。完了時に、反応混合物を、水で洗浄し、オイルまで濃縮した。未精製のオイルを、無水酢酸（３０ｍＬ）中に溶解し、そして、その溶液を、１ｍＬのトリエチルアミンで処理した。３時間後に、有機層を高真空下で取り除き、オイル５４（１．７ｇ、８５％の収率）を得た。

【0491】

３）フェノール５５の調製

【化235】

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【0492】

ベンジル保護アルコール５４（２．０ｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を、エタノール（２３ｍＬ）中に溶解し、そして、窒素雰囲気下に置いた。溶液に、１０％のＰｄ／Ｃ（０．７ｇ、３０ｍｏｌ％）を加えた。スラリーを、周囲温度にて８時間撹拌し、そして、触媒をセライトパッドによって取り除いた。有機層を高真空下で取り除いて、白色の固形物５５（１．４ｇ、７４％の収率）を得た。

【0493】

４）化合物５６の調製

【化236】

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【0494】

ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のフェノール５５（１．３ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）とホスホラミダイト試薬（０．３６４ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃に冷やし、そして、４，５−ジシアノイミダゾールで処理し、その後、２時間にわたって周囲温度まで加温した。完了時に、反応混合物を、飽和重炭酸ナトリウム（１０ｍＬ）で、続いて、水（１０ｍＬ）で洗浄し、そして、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機層を減圧下で濃縮して、白色の固形物（１．４ｇ、９３％の収率）を得た。

【0495】

実施例７の化合物５６は、本明細書中の構造１０２６ｂである。
実施例８．標的化リガンド、ホスホラミダイト含有化合物の物理特性
本明細書中に開示した剛性リンカー構造を有していない特定のＧａｌＮＡｃリガンドホスホラミダイト化合物は、多くの共通溶媒中でのゲル化傾向を示した。

【0496】

構造１００８ｂの、同じ標的化部分（Ｎ−アセチル−ガラクトサミン）、テザー、および分岐点基を有するＧａｌＮＡｃ構造の挙動を例示する写真を図７に添付したが、本明細書中に開示した構造１００８ｂの剛性リンカーの代わりにＰＥＧリンカーを含む。ＰＥＧリンカー−ＧａｌＮＡｃホスホラミダイト化合物を、モレキュラーシーブ上、０．１Ｍ希釈にて、ＡＣＮ：ＤＭＦの３：１混合物中に１２時間保持した。ＰＥＧリンカー−ＧａｌＮＡｃは、この高度に極性の溶媒系中で顕著なゲル化を示す。このＰＥＧリンカー−ＧａｌＮＡｃホスホラミダイト化合物に関して、溶解性を維持するために、ＡＣＮ：ＤＭＦの
１：１までの混合物を使用する必要がある。

【0497】

ＤＭＦなどの高度に極性の溶媒を必要とすることなく、アセトニトリル中に０．０５Ｍで完全に溶解されるホスホラミダイト化合物、構造１００８ｂを示す写真を、図８に添付する。ＰＥＧリンカー−ＧａｌＮＡｃ構築物と異なって、構造１００８ｂの剛性リンカーを含むホスホラミダイト化合物は、溶解性を維持するために高度に極性の溶媒の危険性がないか、またはそれを必要としない。より低い濃度にてボトル中で溶解されるにもかかわらず、これは、本明細書中に開示された剛性リンカーを含む構造が、オリゴヌクレオチド合成に典型的に使用される共通溶媒中により可溶性であり、かつ、ゲル化を予防するために高度に極性の溶媒の添加を必要としないことの例証となる。

【0498】

実施例９．標的化リガンド、ホスホラミダイト含有化合物の純度
実施例２で先に述べたように、図２Ａは、構造１００８ｂのホスホラミダイト化合物の^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを示す。図２Ａは、ホスホラミダイトの正しいシフトを表す単一ピークを示す。加水分解ピークを含めた他のピークは示されず、そしてそれは、高度に純粋な化合物を示す。

【0499】

図９は、ＰＥＧリンカー−ＧａｌＮＡｃ構造の^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを示し、そしてそれは、別の方法では、構造１００８ｂと同じ分岐点、テザー、および標的化部分を含む。それに関して図９のスペクトルが得られたホスホラミダイトの化学構造は、図９に示されている。
図９は複数の不純物ピークを示し、そしてそれは、加水分解された副産物が存在するように見えるピークを含む。

【0500】

実施例１０．オリゴヌクレオチド組成合成
Ａ．合成
ＲＮＡｉ剤を、オリゴヌクレオチド合成で使用される固相上のホスホラミダイト技術に従って合成された。スケールに応じて、MerMade96E（Bioautomation）またはMerMadel2（Bioautomation）を使用した。合成は、制御細孔ガラス（ＣＰＧ、５００Åまたは６００Å、Prime Synthesis, Aston, PA, USAから得られる）からなる固体支持体上で行った。すべてのＲＮＡ、２’−修飾ＲＮＡ、およびＵＮＡホスホラミダイトは、Thermo Fisher Scientific（Milwaukee, WI, USA）から購入した。具体的には、以下の２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトを使用した：（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（ベジゾイル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシ−トリチル−Ｎ４−（アセチル）−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイト、（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−（イソブチリル）−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイト。標的化リガンド含有ホスホラミダイトを、無水ジクロロメタンまたは無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解したが、他のすべてのアミダイトを無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、そして、モレキュラーシーブ（３Å）を加えた。活性化剤溶液として５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）または５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）を使用した。カップリング時間は１０分（ＲＮＡ）、１５分（標的化リガンド）、９０秒（２’ＯＭｅ）、および６０秒（２’Ｆ）であった。ホスホロチオエート結合を導入するために、無水アセトニトリル中の３−フェニル１，２，４−ジチアゾリン−５−オン（POS、Poly Org, Inc., Leominster, MA, USAから入手した）の１００ｍＭ溶液を使用した。

【0501】

Ｂ．支持体に結合したオリゴマーの切断と脱保護
固相合成の終了後、乾燥した固体支持体を、水中の４０ｗｔ％メチルアミンと２８％水酸化アンモニウム溶液（Aldrich）の１：１容量溶液で３０℃で２時間処理した。溶液を蒸発させ、固体残渣を水で復元した（下記参照）。

【0502】

Ｃ．精製
未精製オリゴマーを、TKSgel SuperQ-5PW1 3uカラムおよびShimadzu LC-8システムを使用した陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製した。緩衝液Ａは２０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０であり、２０％のアセトニトリルを含有し、緩衝液Ｂは緩衝液Ａと同じであるが１．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した。２６０ｎｍにおけるＵＶトレースを記録した。適切な画分を貯留し、次に１００ｍＭの重炭酸アンモニウムｐＨ６．７および２０％のアセトニトリルから成る泳動バッファーと共に、セファデックスＧ‐２５媒体を充填したGE Healthcare XK16/40カラムを使用したサイズ排除ＨＰＬＣに流した。

【0503】

Ｄ．アニーリング
０．２×ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることにより相補鎖を混合して、ＲＮＡｉ剤を形成した。この溶液を７０℃のサーモミキサーに入れ、９５℃に加熱し、９５℃で５分間保持し、ゆっくりと室温まで冷却した。一部のＲＮＡｉ剤を凍結乾燥し、−１５〜−２５℃で保存した。二本鎖濃度は、０．２×ＰＢＳ中で紫外−可視分光計で溶液の吸光度を測定することにより決定した。次に２６０ｎｍでの溶液の吸光度に変換係数および希釈率を掛けて、二本鎖濃度を決定した。特に断りのない限り、すべての変換係数は０．０３７ｍｇ／（ｍＬ・ｃｍ）であった。いくつかの実験では、変換係数を、実験的に決定された吸光係数から計算した。

【0504】

実施例１１．野性型マウスにおける、Ｆ１２発現阻害オリゴマー化合物を使用したＧａｌＮＡｃ標的化リガンドの３’および５’センス鎖付着部位の比較
センス鎖の３’および５’末端の間のＧａｌＮＡｃリガンドの付着部位における差を評価するために、以下の表１に示した配列を有する、Ｆ１２（本明細書中でＦ１２ ＲＮＡｉ剤とも呼ばれる）に向けられた発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）を調製した：

【0505】

表１．実施例１１のＦ１２発現阻害オリゴマー化合物（ＲＮＡｉ剤二本鎖）

【表1】

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【0506】

上記の、表１では、以下の表記を使用する：

【0507】

（ＮＡＧ１５）＝

【化237】

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【0508】

（ＮＡＧ１８）＝

【化238】

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【0509】

Ｆ１２ ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１０に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0510】

それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ１５）または（ＮＡＧ１８））に連結したＦ１２ ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。

【0511】

それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ１５）または（ＮＡＧ１８））に連結したＦ１２ ＲＮＡｉ剤を、ＳＣ注射によって送達した。１日目に、生理食塩水、または緩衝化生理食塩水中の２種類のＦ１２ ＲＮＡｉ剤（ＡＤ０２８０３またはＡＤ０２８０７）のうちの一方の３ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量のいずれかを含む、２００μｌ溶液／２０ｇマウスのＳＣ注射を、背部の肩間の弛んだ皮膚に投与した。１処置群あたり三（３）匹の野性型マウスが存在する。先に示したとおり、ＡＤ０２８０３は、センス鎖の３’末端に取り付けられた（ＮＡＧ１５）を含むが、それに対して、ＡＤ２８０７は、センス鎖の５’末端に取り付けられた（ＮＡＧ１８）を含む。

【0512】

ノックダウンを観察するために、治療したマウスの血清サンプルを、８、１５、２２、および２９日目に採取した。内部に発現したmF12 alphaLISA（登録商標）（Perkin Elmer）によって、血清中の循環マウスＦ１２タンパク質（ｍＦ１２）レベルを定量化することによって、ノックダウンを計測した。特定の採血日における発現を、それと同じ日付の生理食塩水対照群の平均に対して正規化した。

【0513】

図１０はこの試験の結果を示す。最も低いとき（２２日目）には、ＡＤ０２８０３は、循環Ｆ１２レベルの約７０％の低減を示したが、それに対して、ＡＤ０２８０７は、８０％超の低減を示した。２９日目にて、ＡＤ２８０７処置マウスと比較して、ＡＤ０２８０３処置マウスがベースラインへのより早い復帰を示したので、該データはまたノックダウン効果の長さの差も示している。これらのデータは、センス鎖の５’末端におけるＧａｌＮＡｃリガンドの連結が、３’センス鎖における連結より優れていることを裏付けている。

【0514】

実施例１２．野性型マウスにおける、Ｆ１２発現阻害オリゴマー化合物を使用したＧａｌＮＡｃ標的化リガンドの３’および５’センス鎖付着部位の更なる比較
二本鎖の発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）のセンス鎖の３’および５’末端のＧａｌＮＡｃリガンドの付着部位を更に評価するために、以下の表３に示した配列を有する、Ｆ１２に向けられた組成物を調製した：

【0515】

表２．実施例１２のＦ１２発現阻害オリゴマー化合物（ＲＮＡｉ剤二本鎖）

【表2】

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【0516】

上記の、表２では、以下の表記を使用する：

【0517】

（ＮＡＧ２０）＝

【化239】

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【0518】

Ｆ１２ ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１０に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0519】

それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ２０））に連結したＦ１２ ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。

【0520】

それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ２０））に連結したＦ１２ ＲＮＡｉ剤を、ＳＣ注射によって送達した。１日目に、生理食塩水、または緩衝化生理食塩水中の２種類のＦ１２ ＲＮＡｉ剤（ＡＤ０２８１５またはＡＤ０２８１６）のうちの一方の３ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量のいずれかを含む、２００μｌ溶液／２０ｇマウスのＳＣ注射を、背部の肩間の弛んだ皮膚に投与した。１処置群あたり三（３）匹の野性型マウスが存在する。表２で先に示したとおり、ＡＤ２８１５は、センス鎖の５’末端に取り付けられた（ＮＡＧ２０）を含むが、それに対して、ＡＤ０２８１６は、センス鎖の３’末端に取り付けられた（ＮＡＧ２０）を含む。

【0521】

ノックダウンを観察するために、治療したマウスの血清サンプルを、８、１５、２２、および２９日目に採取した。内部に発現したmF12 alphaLISA（登録商標）（Perkin Elmer）によって、血清中の循環マウスＦ１２タンパク質（ｍＦ１２）レベルを定量化することによって、ノックダウンを計測した。特定の採血日における発現を、それと同じ日付の生理食塩水対照群の平均に対して正規化した。

【0522】

図１１はこの実験の結果を示す。最も低いとき（２２日目）には、ＡＤ０２８１６は、循環Ｆ１２タンパク質レベルの約６０％の低減を示したが、それに対して、ＡＤ０２８１５は、７９％の低減を示した。２９日目において、ＡＤ０２８１５処置マウスは、生理食塩水レベルから７１％のノックダウンを示したが、それに対して、ＡＤ０２８１６処置マウスは、４０％のノックダウンを示す。これらのデータは、センス鎖の５’末端におけるＧａｌＮＡｃリガンドの連結を支持している。

【0523】

実施例１３．Ｌｐ（ａ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける、構造１００３の標的化リガンドに連結したＬｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）
以下の表３に示した配列を有する、Ｌｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖Ｌｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤）を調製した：

【0524】

表３．実施例１３のＬＰ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）

【表3】

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【0525】

上記の、表３では、以下の表記を使用する：

【0526】

（ＮＡＧ２５）＝

【化240】

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【0527】

（ＮＡＧ２９）＝

【化241】

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【0528】

（ＮＡＧ２９）は、本明細書中で構造１００３によって表される化学構造を有する。
Ｌｐ（ａ） ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１０に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0529】

Ｌｐ（ａ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウス（Frazer KA et al 1995, Nature Genetics 9:424-431）を、インビボにおいて複合化Ｎ−アセチル−ガラクトサミンリガンドを伴った二本鎖ＲＮＡｉ剤の有効性を評価するために使用した。このマウスは、５’および３’の追加配列を伴った（ａｐｏ（ａ）タンパク質をコードする）完全なＬＰＡ遺伝子を含有するＹＡＣ含有からヒトａｐｏ（ａ）、ならびにヒトａｐｏＢ−１００を発現し、それによって、ヒト化Ｌｐ（ａ）粒子（これ以降「Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウス」とも呼ばれる）を産生する（Callow MJ et al 1994, PNAS 91:2130-2134）。

【0530】

それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ２５）または（ＮＡＧ２９））に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。

【0531】

センス鎖の５’末端にてそれぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ２５）または（ＮＡＧ２９））に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、ＳＣ注射によって送達した。１日目に、生理食塩水、または緩衝化生理食塩水中のそれぞれのＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤（ＡＤ０３５４７またはＡＤ０３５４９）のうちの一方の１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量のいずれかを含む、２００μｌ溶液／２０ｇマウスのＳＣ注射を、背部の肩間の弛んだ皮膚に投与した。１処置群あたり四（４）匹のＬｐ（ａ）Ｔｇマウスが存在する。

【0532】

処置マウスからの血清サンプルを、−１（投与前）、５、１１、１６、２２、２９、および３６日目に採取した。血清中の循環Ｌｐ（ａ）粒子レベルを計算することによって、ノックダウンを測定した。Ｌｐ（ａ）粒子レベルを、製造業者の推奨に従って、Cobas（登録商標）Integra400（Roche Diagnostics）により計測した。正規化のために、ある時点での各動物に関するＬｐ（ａ）レベルを、（この場合、−１日目における）その動物の投与前発現レベルで割って、「−１日目に対して正規化した」発現率を決定した。次に、生理食塩水対照群におけるすべてのマウスに関する平均「−１日目に対して正規化した」比によって個々の動物に関する「−１日目に対して正規化した」比率を割ることによって、特定の時点での発現を生理食塩水対照群に対して正規化した。これは、対照群における発現に対して正規化したそれぞれの時点に対する発現をもたらした。実験誤差を標準偏差として示す。

【0533】

結果を図１２に示す。ＡＤ０３５４９（ＮＡＧ２５）は、最も低いとき（１６日目）７１％のノックダウンを示し、そして、ＡＤ０３５４７（ＮＡＧ２９）は、最も低いとき（１１日目）８１％のノックダウンを示した。両トリガーは、最低の時点以降、３６日目に２６％未満のノックダウンを有する、類似した回復カーブを示した。これらのデータは、実施例１３に示したＧａｌＮＡｃリガンドが、単回の１ｍｇ／ｋｇの用量を用いたＬｐ（ａ）Ｔｇマウスにおいて、初期ノックダウン活性とノックダウンの持続性の両方で共通点があることを裏付けている。

【0534】

実施例１４．構造１００２および１００４の標的化リガンドに連結したＬｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）の投与後のａｐｏ（ａ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおけるＡｐｏ（ａ）ノックダウン
以下の表４に示した配列を有する、Ｌｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖Ｌｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤）を調製した：

【0535】

表４．実施例１４のＬＰ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）

【表4】

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【0536】

先の表４では、以下の表記を使用する：

【0537】

（ＮＡＧ２８）＝

【化242】

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【0538】

（ＮＡＧ３０）＝

【化243】

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【0539】

さらに、（ＮＡＧ２５）は、先の実施例１３に示したものと同じ構造を有する。（ＮＡＧ２８）は、本明細書中の構造１００２に表される化学構造を有する。（ＮＡＧ３０）は、本明細書中の構造１００４に表される化学構造を有する。（ＮＡＧ２８）は、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−異性体の混合物を含む一方で、（ＮＡＧ３０）は、ｔｒａｎｓ−異性体に排他的である。

【0540】

Ｌｐ（ａ） ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１４に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0541】

Ａｐｏ（ａ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを、インビボにおいて複合化Ｎ−アセチル−ガラクトサミンリガンドを伴った二本鎖ＲＮＡｉ剤の有効性を評価するために使用した。Ａｐｏ（ａ）Ｔｇマウス（Frazer KA et al 1995, Nature Genetics 9:424-431）は、５’および３’の両方の追加配列を伴った（ａｐｏ（ａ）タンパク質をコードする）完全なＬＰＡ遺伝子を含有するＹＡＣ含有からヒトａｐｏ（ａ）（これ以降「ａｐｏ（ａ）Ｔｇマウス」とも呼ばれる）を産生する。

【0542】

それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２８）、または（ＮＡＧ３０））に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。
センス鎖の５’末端にてそれぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２８）、または（ＮＡＧ３０））に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、ＳＣ注射によって送達した。１日目に、ＳＣ注射は、生理食塩水、または緩衝化生理食塩水中のＲＮＡｉ剤（ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５３８、またはＡＤ０３５４０）の０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量のいずれかを含む、２００μｌ溶液／２０ｇマウスを、背部の肩間の弛んだ皮膚に投与した。１処置群あたり三（３）匹のａｐｏ（ａ）Ｔｇマウスが存在する。

【0543】

処置マウスからの血清サンプルを、−１（投与前）、８、１５、２２、および２９日目に採取した。ａｐｏ（ａ）のELISA（Abcam）を使用して、マウスからの血清をアッセイすることによって、ノックダウンを測定した。Ｌｐ（ａ）粒子レベルを、製造業者の推奨に従って、Cobas（登録商標）Integra400（Roche Diagnostics）により計測した。正規化のために、ある時点での各動物に関するＬｐ（ａ）レベルを、（この場合、−１日目における）その動物の投与前発現レベルで割って、「−１日目に対して正規化した」発現率を決定した。次に、生理食塩水対照群におけるすべてのマウスに関する平均「−１日目に対して正規化した」比によって個々の動物に関する「−１日目に対して正規化した」比率を割ることによって、特定の時点での発現を生理食塩水対照群に対して正規化した。これは、対照群における発現に対して正規化したそれぞれの時点に対する発現をもたらした。実験誤差を、平均の標準誤差として示す。

【0544】

結果を図１３に示す。最も低いときは、試験したすべてのＲＮＡｉについて１５日目であった。最も低いときでは、ＡＤ０３５３６はａｐｏ（ａ）タンパク質の７４％のノックダウンを示し、ＡＤ０３５３８はａｐｏ（ａ）タンパク質の７４％のノックダウンを示し、およびＡＤ０３５４０はａｐｏ（ａ）タンパク質の７１％のノックダウンを示した。２９日目に、たった１６％のノックダウンを示したＡＤ０３５３６（ＮＡＧ２５含有）を除いて、すべてのＲＮＡｉ剤が、ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの＞４８％のノックダウンを示す。これらのデータは、ＮＡＧ構造が初期ノックダウン活性に関して、２９日目において数字的により優れたノックダウンを示すリンカー構造ＮＡＧ２８およびＮＡＧ３０を含有するＲＮＡｉ剤と同様に機能することを裏づけている。

【0545】

実施例１５．構造１００５および１００８の標的化リガンドに連結したＬｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）の投与後のＬｐ（ａ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおけるＬｐ（ａ）ノックダウン
以下の表５に示した配列を有する、Ｌｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖Ｌｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤）を調製した：

【0546】

表５．実施例１５のＬＰ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）

【表5】

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【0547】

先の表５では、以下の表記を使用する：

【0548】

（ＮＡＧ３１）＝

【化244】

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【0549】

（ＮＡＧ３７）＝

【化245】

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【0550】

さらに、（ＮＡＧ２５）は、先に実施例１３に示したものと同じ構造である。
（ＮＡＧ３１）は、本明細書中の構造１００５に表される化学構造を有する。（ＮＡＧ３７）は、本明細書中の構造１００８に表される化学構造を有する。
Ｌｐ（ａ） ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１０に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0551】

Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウスを、インビボにおいて複合化Ｎ−アセチル−ガラクトサミンリガンドを伴った二本鎖ＲＮＡｉ剤の有効性を評価するために使用した。
それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ３１）または（ＮＡＧ３７））に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。
それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ３１）、または（ＮＡＧ３７））に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、ＳＣ注射によって送達した。１日目に、ＳＣ注射を、生理食塩水、または緩衝化生理食塩水中のＲＮＡｉ剤（ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３６２９またはＡＤ０４１７０）の３ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量のいずれかを、２００μｌ溶液／２０ｇマウスにて、背部の肩間の弛んだ皮膚に投与した。１処置群あたり四（４）匹のＬｐ（ａ）Ｔｇマウスが存在する。

【0552】

処置マウスからの血清サンプルを、−１（投与前）、８、１５、２２、２９、および３６日目に採取した。血清中の循環Ｌｐ（ａ）粒子レベルを計算することによって、ノックダウンを測定した。Ｌｐ（ａ）粒子レベルを、製造業者の推奨に従って、Cobas（登録商標）Integra400（Roche Diagnostics）により計測した。正規化のために、ある時点での各動物に関するＬｐ（ａ）レベルを、（この場合、−１日目における）その動物の投与前発現レベルで割って、「−１日目に対して正規化した」発現率を決定した。次に、生理食塩水対照群におけるすべてのマウスに関する平均「−１日目に対して正規化した」比によって個々の動物に関する「−１日目に対して正規化した」比率を割ることによって、特定の時点での発現を生理食塩水対照群に対して正規化した。これは、対照群における発現に対して正規化したそれぞれの時点に対する発現をもたらした。実験誤差を標準偏差として示す。

【0553】

得られたデータを図１４に示す。ＡＤ０３５３６は、最低のとき（１５日目）Ｌｐ（ａ）レベルの９５％のノックダウンを示し、そして、３６日目に７６％のノックダウンを維持した。ＡＤ０３６２９は、最低のとき（８日目）Ｌｐ（ａ）レベルの９７％のノックダウンを示し、そして、３６日目に９０％のノックダウンを維持した。ＡＤ０４１７０は、最低のとき（８日目）Ｌｐ（ａ）レベルの９７％のノックダウンを示し、そして、３６日目に７８％のノックダウンを維持した。

【0554】

実施例１６：構造１００５、１００８、１０２５、および１０２７構造１００３の標的化リガンドに連結したＦ１２発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）の投与後の、野生型マウスにおけるＦ１２ノックダウン
ＧａｌＮＡｃ標的化リガンド（ＮＡＧ２５）［ＡＤ０４１６２］；（ＮＡＧ３７）［ＡＤ０４６２３］；（ＮＡＧ３１）［ＡＤ０４５１２］；（ＮＡＧ３３）［ＡＤ０４６５０］または（ＮＡＧ３８）［ＡＤ０４６５１］に、ホスホロチオアート連結によって５’末端にて結合した、Ｆ１２発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖Ｆ１２ ＲＮＡｉ剤）を調製した。それぞれ二本鎖ＲＮＡｉ剤が、Ｆ１２を対象とした。
以下の表記は、ＧａｌＮＡｃ標的化リガンド構造について使用される：

【0555】

（ＮＡＧ２５）＝

【化246】

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【0556】

（ＮＡＧ３１）＝

【化247】

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【0557】

（ＮＡＧ３３）＝

【化248】

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【0558】

（ＮＡＧ３７）＝

【化249】

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【0559】

（ＮＡＧ３８）＝

【化250】

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【0560】

（ＮＡＧ３１）は、本明細書中の構造１００５によって表される化学構造を有する。（ＮＡＧ３３）は、本明細書中の構造１０２５によって表される化学構造を有する。（ＮＡＧ３７）は、本明細書中の構造１００８によって表される化学構造を有する。（ＮＡＧ３８）は、本明細書中の構造１０２７によって表される化学構造を有する。
配列および修飾パターンは、先に示したように、Ｆ１２ ＲＮＡｉ剤のそれぞれのセンス鎖の５’末端に位置するＧａｌＮＡｃ標的化リガンド構造に存在する組成物の相違のみで、ＡＤ０４１６２、ＡＤ０４６２３、ＡＤ０４５１２、ＡＤ０４６５０、およびＡＤ０４６５１に関して同一であった。

【0561】

Ｆ１２ ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１６に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0562】

それぞれのＧａｌＮＡｃ標的化リガンド（すなわち、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３７）、または（ＮＡＧ３８））に結合したＦ１２ ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。

【0563】

それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３７）、または（ＮＡＧ３８））に連結されるＦ１２ ＲＮＡｉ剤を、ＳＣ注射によって送達した。１日目に、生理食塩水、または緩衝化生理食塩水中の５種類の二本鎖（ＡＤ０４１６２、ＡＤ０４６２３、ＡＤ０４５１２、ＡＤ０４６５０、およびＡＤ０４６５１）のうちのいずれか１つの１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量のいずれかを含む、２００μｌ溶液／２０ｇマウスのＳＣ注射を、背部の肩間の弛んだ皮膚に投与した。１処置群あたり四（４）匹の野性型マウスが存在する。先に示したとおり、ＡＤ０４１６２は構造（ＮＡＧ２５）を含み、ＡＤ０４６２３は構造（ＮＡＧ３７）を含み、ＡＤ０４５１２は構造（ＮＡＧ３１）を含み、ＡＤ０４６５０は構造（ＮＡＧ３３）を含み、およびＡＤ０４６５１は構造（ＮＡＧ３８）を含む。すべてのＧａｌＮＡｃ標的化リガンドが、それぞれの個別のＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に取り付けられる。

【0564】

ノックダウンを観察するために、治療したマウスの血清サンプルを、−１（投与前）、８、１５および２２日目に採取した。内部に発現したmF12 alphaLISA（登録商標）（Perkin Elmer）によって、血清中の循環マウスＦ１２タンパク質（ｍＦ１２）レベルを定量化することによって、ノックダウンを計測した。それぞれの時点における各動物のｍＦ１２レベルを、その動物における前処理発現レベルで割って、「投与前に対して正規化した」発現率を決定した。次に、個々の動物に関する「投与前日に対して正規化した」比率を、生理食塩水対照群のすべてのマウスの平均「投与前日に対して正規化した」比率で割ることによって、特定の時点における発現を、生理食塩水対照群に対して正規化した。これは、対照群の発現に対して正規化されたそれぞれの時点における発現をもたらした。実験誤差を標準偏差として示す。

【0565】

この試験からの結果を図１５に示す。最も低いときは、試験したすべてのＲＮＡｉ剤で８日目であった。最低時には、ＡＤ０４１６２はｍＦ１２の９０％のノックダウンを示し、ＡＤ０４６２３はｍＦ１２の９４％のノックダウンを示し、ＡＤ０４５１２はｍＦ１２の９４％のノックダウンを示し、ＡＤ０４６５０はｍＦ１２の９２％のノックダウンを示し、およびＡＤ０４６５１はｍＦ１２の８７％のノックダウンを示した。２２日目にて、たった７４％のノックダウンを示したＡＤ０４１６２（ＮＡＧ２５含有）を除いて、ＲＮＡｉ剤のすべてが、＞８２％のｍＦ１２レベルのノックダウンを示す。これらのデータは、ＮＡＧ構造が初期ノックダウン活性に関して、２２日目にて数字的により優れたｍＦ１２ノックダウンを示す本明細書中に開示した剛性リンカー構造またはリンカー置換部分（すなわち、ＮＡＧ３１、ＮＡＧ３３、ＮＡＧ３７、およびＮＡＧ３８）を含有するＲＮＡｉ剤と同様に機能することを裏づけている。

【0566】

実施例１７．Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウスにおける、構造１００４および１００５の標的化リガンドに連結したＬｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）
以下の表６に示した配列を有する、Ｌｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖Ｌｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤）を調製した：

【0567】

表６．実施例１７のＬＰ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）

【表6】

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【0568】

表６では、（ＮＡＧ３０）は、先の実施例１４で示したのと同じ化学構造であり、および（ＮＡＧ３１）は、先に実施例１５で示したのと同じ化学構造である。ＮＡＧ３０は、本明細書中の構造１００４によって表される化学構造を有する。ＮＡＧ３１は、本明細書中の構造１００５によって表される化学構造を有する。

【0569】

Ｌｐ（ａ） ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１０に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0570】

Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウスを、インビボにおいて複合化Ｎ−アセチル−ガラクトサミンリガンドを伴った二本鎖ＲＮＡｉ剤の有効性を評価するために使用した。

【0571】

それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、ＮＡＧ３０またはＮＡＧ３１）に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。

【0572】

センス鎖の５’末端にてそれぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、ＮＡＧ３０またはＮＡＧ３１）に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、ＳＣ注射によって送達した。１日目に、生理食塩水、または緩衝化生理食塩水中のＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤（ＡＤ０３６２９またはＡＤ０３５４０）のうちの一方の１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量のいずれかを含む、２００μｌ溶液／２０ｇマウスのＳＣ注射を、背部の肩間の弛んだ皮膚に投与した。１処置群あたり四（４）匹のＬｐ（ａ）Ｔｇマウスが存在する。

【0573】

処置マウスからの血清サンプルを、−１（投与前）、８、１５、２２、２９、３６および４３日目に採取した。血清中の循環Ｌｐ（ａ）粒子レベルを計算することによって、ノックダウンを測定した。Ｌｐ（ａ）粒子レベルを、製造業者の推奨に従って、Cobas（登録商標）Integra400（Roche Diagnostics）により計測した。正規化のために、ある時点での各動物に関するＬｐ（ａ）レベルを、（この場合、−１日目における）その動物の投与前発現レベルで割って、「−１日目に対して正規化した」発現率を決定した。次に、生理食塩水対照群におけるすべてのマウスに関する平均「−１日目に対して正規化した」比によって個々の動物に関する「−１日目に対して正規化した」比率を割ることによって、特定の時点での発現を生理食塩水対照群に対して正規化した。これは、対照群における発現に対して正規化したそれぞれの時点に対する発現をもたらした。実験誤差を標準偏差として示す。

【0574】

結果を図１６に示す。最も低いときは、試験した両ＲＮＡｉ剤について１５日目であった。ＡＤ０３６２９は、最も低いときでは、Ｌｐ（ａ）レベルの８９％のノックダウンを示したが、一方で、ＡＤ０３５４０は、最も低いときには、Ｌｐ（ａ）レベルの８５％のノックダウンを示した。両ＲＮＡｉ剤とも、３６日目までに類似の回復カーブを示した。しかしながら、４３日目には、ＡＤ０３５４０が、Ｌｐ（ａ）レベルの１６％のノックダウンを示したのに対して、ＡＤ０３６２９は、Ｌｐ（ａ）レベルの５５％のノックダウンを示した。

【0575】

実施例１８．構造１００７、１０２５、および１０２６の標的化リガンドに連結したＬｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物の投与後のａｐｏ（ａ）ＴｇマウスにおけるＡｐｏ（ａ）ノックダウン
以下の表７に示した配列を有する、Ｌｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）を調製した：

【0576】

表７．実施例１８のＬＰ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）

【表7】

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【0577】

先の表７では、以下の表記を使用する：

【0578】

（ＮＡＧ３３）＝

【化251】

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【0579】

（ＮＡＧ３４）＝

【化252】

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【0580】

（ＮＡＧ３５）＝

【化253】

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【0581】

（ＮＡＧ３３）は、本明細書中の構造１０２５によって表される化学構造を有する。（ＮＡＧ３４）は、本明細書中の構造１０２６によって表される化学構造を有する。（ＮＡＧ３５）は、本明細書中の構造１００７によって表される化学構造を有する。

【0582】

Ｌｐ（ａ） ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１８に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0583】

Ａｐｏ（ａ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを、インビボにおいて複合化Ｎ−アセチル−ガラクトサミンリガンドを伴った二本鎖ＲＮＡｉ剤の有効性を評価するために使用した。

【0584】

それぞれのＧａｌＮＡｃリガンド（すなわち、ＮＡＧ３３、ＮＡＧ３４またはＮＡＧ３５）に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。
それぞれのＧａｌＮＡｃ標的化リガンド（すなわち、ＮＡＧ３３、ＮＡＧ３４またはＮＡＧ３５）に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、ＳＣ注射によって投与した。１日目に、ＳＣ注射は、生理食塩水、または緩衝化生理食塩水中のＲＮＡｉ剤（ＡＤ０３７２１、ＡＤ０３７２２、またはＡＤ０３７２３）の１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量のいずれかを含む、２００μｌ溶液／２０ｇマウスを、背部の肩間の弛んだ皮膚に投与した。１処置群あたり三（３）匹のａｐｏ（ａ）Ｔｇマウスが存在する。

【0585】

処置マウスからの血清サンプルを、−１（投与前）、８、１５、２２、および２９日目に採取した。血清中の循環ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルをアッセイすることによってノックダウンを測定した。血清中のヒトａｐｏ（ａ）タンパク質レベルは、ａｐｏ（ａ）のELISA（Abcam）を使用して、マウスからの血清をアッセイすることによって観察した。Ｌｐ（ａ）粒子レベルを、製造業者の推奨に従って、Cobas（登録商標）Integra400（Roche Diagnostics）により計測した。正規化のために、ある時点での各動物に関するＬｐ（ａ）レベルを、（この場合、−１日目における）その動物の投与前発現レベルで割って、「−１日目に対して正規化した」発現率を決定した。次に、生理食塩水対照群におけるすべてのマウスに関する平均「−１日目に対して正規化した」比によって個々の動物に関する「−１日目に対して正規化した」比率を割ることによって、特定の時点での発現を生理食塩水対照群に対して正規化した。実験誤差を、平均の標準誤差として示す。

【0586】

得られたデータを図１７に示す。最も低いときは、試験したすべてのＲＮＡｉ剤について１５日目であった。ＡＤ０３７２１は、最も低いときでは、ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの９１％のノックダウンを示し、およびＡＤ０３７２２は、最も低いときでは、ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの８１％のノックダウンを示し、そして一方、ＡＤ０３７２３は、最も低いときでは、ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの９０％のノックダウンを示した。ＡＤ０３７２１およびＡＤ０３７２２処置マウスの両方が、各時点にてほとんど同一のノックダウンを示し、その一方で、ＡＤ０３７２３処置マウスは、試験した各時点にて数字的により低いノックダウンを示し、処理後のａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの回復は、類似の軌跡を示した。例えば、２９日目に、ＡＤ０３７２１処置マウスはａｐｏ（ａ）レベルの７６％のノックダウンを示し、ＡＤ０３７２３処置マウスはａｐｏ（ａ）レベルの８３％のノックダウンを示し、そして一方、ＡＤ０３７２２処置マウスはａｐｏ（ａ）レベルの６１％のノックダウンを示した。これらのデータは、構造ＮＡＧ３３およびＮＡＧ３５を含有するＲＮＡｉ剤が２９日目に数字的により優れたノックダウンを示して、ＮＡＧ３３、ＮＡＧ３４およびＮＡＧ３５構造すべてがノックダウン活性を示すことを裏づけている。

【0587】

実施例１９．Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウスにおける、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇにて投与される、構造１００８の標的化リガンドに連結したＬＰ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）の用量応答
本明細書中に記載したＬｐ（ａ）トランスジェニックマウスを、インビボにおいてＮ−アセチル−ガラクトサミンリガンドを結合した二本鎖ＲＮＡｉ剤の有効性を評価するのに使用した。実施例１５で先に記載した、二本鎖ＩＤ：ＡＤ０４１７０を有するＬｐ（ａ）に対するＲＮＡｉ剤を製造した。先に記載したように、Ｌｐ（ａ）二本鎖ＩＤ：ＡＤ０４１７０は、センス鎖の５’末端にて取り付けられた（ＮＡＧ３７）標的化リガンド（構造１００８）を含む。

【0588】

Ｌｐ（ａ） ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１０に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0589】

標的化リガンド構造１００８に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。

【0590】

標的化リガンド構造１００８に連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射によって投与した。１日目に、生理食塩水、または緩衝化生理食塩水中のＲＮＡｉ剤の１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）または緩衝化生理食塩水中のＲＮＡｉ剤の３ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のいずれかの用量を含む、２００μｌ溶液／２０ｇマウスのＳＣ注射を、背部の肩間の弛んだ皮膚におこなった。

【0591】

対照血清（処理前）サンプルを、１日目に注射前のマウスから採取した。Ｌｐ（ａ）粒子レベルを、製造業者の推奨に従って、Cobas（登録商標）Integra400（Roche Diagnostics）により決定した。正規化のために、ある時点での各動物に関するＬｐ（ａ）レベルを、（この場合、−１日目における）その動物の処理前発現レベルで割って、「−１日目に対して正規化した」発現率を決定した。次に、生理食塩水対照群におけるすべてのマウスに関する平均「−１日目に対して正規化した」比によって個々の動物に関する「−１日目に対して正規化した」比率を割ることによって、特定の時点での発現を生理食塩水対照群に対して正規化した。これは、対照群における発現に対して正規化したそれぞれの時点に対する発現をもたらした。実験誤差を標準偏差として示す。

【0592】

結果を図１８に示す。図１８に示すように、用量依存的相関は、全時点にわたってＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤に関して明らかである。

【0593】

実施例２０：カニクイザルにおける、構造１００３および１００４の標的化リガンドに連結したＬＰ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）
以下の表８に示した配列を有する、Ｌｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）を調製した：

【0594】

表８．実施例２０のＬｐ（ａ）発現阻害オリゴマー化合物（ＲＮＡｉ剤二本鎖）

【表8】

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【0595】

Ｌｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤、ＡＤ０３５４７は、実施例１３に示したものと同じであり、かつ、（ＮＡＧ２９）に結合される。Ｌｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤、ＡＤ３６６８は、（ＮＡＧ３０）に結合された。（ＮＡＧ３０）は、実施例１４に示した化学構造を有する。（ＮＡＧ２９）は、本明細書中の構造１００３によって表される。（ＮＡＧ３０）は、本明細書中の構造１００４によって表される。

【0596】

Ｌｐ（ａ） ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）またはMerMade12（登録商標）（Bioautomation）のいずれかを使用したオリゴヌクレオチド合成に使用される固相におけるホスホラミダイト技術に従って合成し、そして、相補鎖を、本明細書中に一般的に実施例１０に記載の方法に従って、０．２×ＰＢＳ（ホスファート緩衝化生理食塩水、１×、Corning, Cellgro）中で等モルＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を組み合わせることによって混合して、二本鎖を形成した。

【0597】

構造１００３または構造１００４を有する本明細書中に開示した標的化リガンドに結合したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を、作製し、そして、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーと組み合わせた。

【0598】

対照血清（処理前）サンプルを、１４、７、および１日目（投薬前）に注射前のカニクイザルから採取した。Ｌｐ（ａ）粒子レベルを、製造業者の推奨に従って、Cobas（登録商標）Integra400（Roche Diagnostics）により決定した。正規化のために、ある時点での各動物に関するＬｐ（ａ）レベルを、（この場合、１４、７、および１日目（投薬前）における）その動物の処理前発現レベルの平均で割って、「投与前に対して正規化した」発現率を決定した。

【0599】

１日目に、カニクイザルマカク（カニクイザル）霊長動物に、３ｍｇ／ｋｇのＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤、ＡＤ０３６６８またはＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤、ＡＤ０３５４７のいずれかを、本明細書中に開示した標的化リガンドに連結したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤を用いて、皮下注射した。１処置群あたり、二（２）匹のサルに投与した。

【0600】

結果を図１９に報告する。構造１００３（ＡＤ０３５４７）または構造１００４（ＡＤ０３６６８）のいずれかに結合したＬｐ（ａ）ＲＮＡｉトリガーは、カニクイザルにおいてノックダウンを示した。

【0601】

実施例２１：カニクイザルにおける、構造１００８の標的化リガンドに連結したＦ１２発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）
Ｆ１２に合わせて異なる配列を有し、かつ、センス鎖の５’末端でＧａｌＮＡｃ標的化リガンド構造１００８［（ＮＡＧ３７）］に連結されたＦ１２ＲＮＡｉ剤を、作製し、そして、皮下（ＳＣ）注射のために当該技術分野で知られている医薬的に許容されるバッファーに組み合わせた。

【0602】

１日目に、カニクイザルマカク（カニクイザル）霊長動物に、３ｍｇ／ｋｇの、異なる配列構造および異なる修飾パターンを有する六（６）種類の異なるＬｐ（ａ）ＲＮＡｉ剤：ＡＤ０４６２３、ＡＤ０４６２４、ＡＤ０４６２５、ＡＤ０４６２６、ＡＤ０４６２７、またはＡＤ０４６２８のうちの１つを皮下に注射した。１処置群あたり二（２）匹のサルに投薬した。

【0603】

ノックダウンを観察するために、処置したカニクイザルからの血清サンプルを、−７日目および１日目（投与前）、ならびに８、１５、および２２日目に採取した。ノックダウンを、ヒトＦ１２のELISAキット（Molecular Innovations）によって血清中の循環ｃｙｎｏ Ｆ１２タンパク質（ｃＦ１２）レベルを定量化することによって計測した。それぞれの時点における各動物のｃＦ１２レベルを、その動物における発現の処置前レベル（−７日目と１日目の平均）で割って、「投与前に対して正規化した」発現率を決定した。実験誤差を標準偏差として示す。

【0604】

図２０に結果を示す。ＡＤ０４６２５およびＡＤ０４６２３が、計測した全時点にわたって最大のノックダウンを示して、ＮＡＧ３７（構造１００８）に連結されたそれぞれＦ１２ ＲＮＡｉ剤は、カニクイザルにおいてノックダウンを示した。

【0605】

実施例２２：ＰｉＺトランスジェニックマウスにおける、構造１００８の標的化リガンドに連結したα−１アンチトリプシン発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）
インビボにおいてα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）遺伝子に向けられたＲＮＡｉ剤を評価するために、トランスジェニックＰｉＺマウス・モデル（ＰｉＺマウス）を使用した。ＰｉＺマウスは、ヒトＰｉＺ ＡＡＴ変異対立遺伝子およびモデルヒトＡＡＴＤ（Carlson et al., Journal of Clinical Investigation 1989）を有する。

【0606】

以下の表９に示した配列を有する、ＡＡＴ発現阻害オリゴマー化合物（二本鎖ＲＮＡｉ剤）を調製した：

【0607】

表９．実施例２２のＡＡＴ発現阻害オリゴマー化合物（ＲＮＡｉ剤二本鎖）

【表9】

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【0608】

（ＮＡＧ３７）は、先の実施例１６に示した化学構造を有する。
ＡＡＴ ＲＮＡｉ剤を、医薬的に許容される生理食塩バッファー中で調製し、そして、ＡＡＴ遺伝子発現のノックダウンを評価するために、ＰｉＺマウスには、背部の肩間の弛んだ皮膚内に、２００μｌの溶液／２０ｇマウスの皮下（ＳＣ）注射によって投与した。各マウスのは、３ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のＡＤ０４４６３の単回ＳＣ投与量を与えた。３匹のマウスに、ＡＡＴ ＲＮＡｉ剤を投与した（ｎ＝３）。

【0609】

血漿サンプルを、−１日目、１日目（投与前）、８日目、および１５日目のＡＡＴ（Ｚ−ＡＡＴ）タンパク質レベルについて描図し、そして、分析した。ＡＡＴレベルを、１日目（投与前）のＡＡＴ血漿レベルに対して正規化した。タンパク質レベルを、ELISAキットによって血漿中の循環ヒトＺ−ＡＡＴレベルを定量化することによって計測した。

【0610】

平均した正規化ＡＡＴ（Ｚ−ＡＡＴ）レベルを図２１に示す。本明細書中の構造１００８の標的化リガンドに連結したＡＡＴ ＲＮＡｉ剤は、ＰｉＺトランスジェニックマウスにおいてノックダウンを示した。

【0611】

他の実施形態
本発明を、その詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は例示を意図するものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の請求項の範囲内である。

【図1】

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【図1A】

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【図2】

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【図2A】

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【図2B】

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【図2C】

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【図2D】

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【図2E】

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【図2F】

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【図3】

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【図4】

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【図5】

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【図6】

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【図7】

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【図8】

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【図9】

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【図10】

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【図11】

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【図12】

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【図13】

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【図14】

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【図15】

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【図16】

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【図17】

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【図18】

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【図19】

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【図20】

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【図21】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]