特許 6989523 操作された抗原提示細胞及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6989523

(24)【登録日】2021年12月6日

(45)【発行日】2022年1月5日

(54)【発明の名称】操作された抗原提示細胞及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20211220BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20211220BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20211220BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20211220BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20211220BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20211220BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20211220BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211220BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211220BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20211220BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20211220BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20211220BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20211220BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALN20211220BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20211220BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20211220BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 Z

   C07K19/00ZNA

   C07K16/30

   C07K14/705

   C12N15/13

   C12N15/12

   C12N15/85 Z

   C12N5/10

   A61P35/00

   A61K48/00

   A61P37/04

   A61K35/15 Z

   A61K47/68

   !C12N5/0784

   !C12N5/0786

   !A61K39/395 T

【請求項の数】25

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2018-558493(P2018-558493)

(86)(22)【出願日】2017年2月1日

(65)【公表番号】特表2019-511244(P2019-511244A)

(43)【公表日】2019年4月25日

(86)【国際出願番号】EP2017052145

(87)【国際公開番号】WO2017134100

(87)【国際公開日】20170810

【審査請求日】2020年1月24日

(31)【優先権主張番号】16153966.3

(32)【優先日】2016年2月2日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】516041704

【氏名又は名称】エコール ポリテクニーク フェデラル ド ローザンヌ （エペエフエル）

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】デ パルマ，ミシェル

(72)【発明者】

【氏名】スクアドリト，マリオ レオナルド

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０９２０２４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２０１２−５０４９７０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

(i)癌細胞の膜分子に特異的な細胞外抗体ドメインであって、前記膜分子が癌関連抗原である、前記細胞外抗体ドメイン、
(ii)抗原提示細胞において発現された場合に、該抗原提示細胞の膜に細胞外小胞内在化受容体(EVIR)を固定するためのタンパク質ドメインであって、
前記タンパク質ドメインは、
1つの膜貫通ドメイン、又は細胞内ドメイン及び/若しくは細胞外非ヒンジドメインにより互いに連結された2〜7つの膜貫通ドメインと、
少なくとも1つの細胞内ドメインと、
を含み、
前記タンパク質ドメインは、神経成長因子受容体(NGFR)、C-Cケモカイン受容体5型(CCR5)及びP-セレクチン糖タンパク質-1リガンド受容体(SELPLG)に由来する配列から選択される、
前記タンパク質ドメイン、並びに
(iii)任意選択で、抗原提示細胞において発現された場合、該抗原提示細胞の細胞膜への細胞外小胞内在化受容体(EVIR)の輸送を増大させる細胞膜輸送ドメイン
を含む、組換え細胞外小胞内在化受容体(EVIR)。

【請求項2】

細胞外抗体ドメインがscFvである、請求項１記載のEVIR。

【請求項3】

細胞外抗体ドメインがヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)に特異的な抗体又はそのフラグメントの配列を含む、請求項１又は２記載のEVIR。

【請求項4】

細胞外抗体ドメインがチロシナーゼ関連タンパク質-1(TYRP1)、癌胎児性抗原(CEA)、メソテリン、PMEL(gp100)、ガングリオシド(GD2、GD3)、又はムチンに特異的な抗体又はそのフラグメントの配列を含む、請求項１又は２記載のEVIR。

【請求項5】

細胞外抗体ドメインが配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から選択される配列又はその相同な変異体を含み、前記変異体は元のアミノ酸配列と少なくとも90％同一であり、且つ前記腫瘍関連抗原に結合し、且つ該腫瘍関連抗原に対する特異性を有する、アミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載のEVIR。

【請求項6】

細胞外抗体ドメインがチロシナーゼ関連タンパク質-1(TYRP1)又はガングリオシド(GD2)に特異的な抗体又はそのフラグメントの配列を含む、請求項４記載のEVIR。

【請求項7】

細胞外抗体ドメインが配列番号１１３及び配列番号１１４から選択される配列を含む、請求項６記載のEVIR。

【請求項8】

タンパク質ドメインが、配列番号３１、配列番号３９及び配列番号４１の配列又はその相同な変異体から選択され、前記変異体は元のアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載のEVIR。

【請求項9】

IgKドメインを含む細胞膜輸送ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか１項記載のEVIR。

【請求項10】

配列番号４２のIgKドメイン又はその相同な変異体を含む細胞膜輸送ドメインを含み、前記変異体は元のアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項９記載のEVIR。

【請求項11】

配列番号５４、配列番号６２及び配列番号６４から選択されるアミノ酸配列又はその相同な変異体を含み、前記変異体は元のアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３、５又は８〜１０のいずれか１項記載のEVIR。

【請求項12】

配列番号１３２及び配列番号１３３から選択されるアミノ酸配列又はその相同な変異体を含み、前記変異体は元のアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜２、４、６〜７又は８〜１０のいずれか１項記載のEVIR。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれか１項記載のEVIRをコードする単離された核酸。

【請求項14】

配列番号６５、配列番号７３及び配列番号７５から選択される配列を含む、請求項１３記載の単離された核酸。

【請求項15】

配列番号１３０及び配列番号１３１から選択される配列を含む、請求項１３記載の単離された核酸。

【請求項16】

請求項１３〜１５のいずれか１項記載の少なくとも1つの核酸を含むベクター。

【請求項17】

単球、マクロファージ及び/又は樹状細胞における生存、分化、増殖、活性化、成熟、貪食作用、エンドサイトーシス、抗原プロセシング及び提示、T細胞動員を促進する機能性タンパク質、或いは抗原提示細胞(APC)の分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質か、又はT細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸をさらに含む、請求項１６記載のベクター。

【請求項18】

抗原提示細胞(APC)又はその幹/前駆細胞において、請求項１〜１２のいずれか１項記載の少なくとも1つのEVIRの発現を誘導するex vivoでの方法であって、
(i)前記細胞に、請求項１〜１２のいずれか１項記載の少なくとも1つのEVIRをコードするベクターをex vivoで形質導入するステップ、及び、
(ii)細胞分化、成熟又は活性化を任意選択で誘導するステップ
を含む、前記方法。

【請求項19】

ベクターが請求項１３〜１５のいずれか１項記載の核酸を含むか、又は請求項１６若しくは１７記載のベクターである、請求項１８記載の方法。

【請求項20】

請求項１〜１２のいずれか１項記載の少なくとも1つのEVIRを発現する単離された抗原提示細胞(APC)又はその幹細胞若しくは前駆細胞。

【請求項21】

EVIR発現TAA提示細胞を調製するex vivoでの方法であって、
(i)癌の対象から得られた少なくとも1つの癌細胞又は少なくとも1つの癌細胞由来細胞外小胞(EV)を提供するステップ、
(ii)請求項２０記載のEVIR発現細胞を提供するステップ、
(iii)(ii)で提供されたEVIR発現細胞を、(i)で提供された少なくとも1つの癌細胞又はEVとex vivoで接触させるステップ、
(iv)ステップ(iii)から前記EVIR発現細胞を回収するステップ
を含み、
(iv)で得られた細胞が、前記対象に投与された場合に、EVIRを発現せず(iii)のように処理した細胞と比較して、前記癌の対象由来のT細胞腫瘍関連抗原(TAA)を提示する増大された能力を有する、
前記方法。

【請求項22】

請求項１〜１２のいずれか１項記載の少なくとも1つのEVIRをコードする少なくとも1つのベクター又は請求項２０記載の細胞又は請求項１８若しくは２１記載の方法から取得可能な細胞と少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤又はそれらの賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項23】

前記組成物がワクチン組成物である、請求項２２記載の医薬組成物。

【請求項24】

癌の予防及び/又は処置において使用するための、請求項２２又は２３記載の医薬組成物。

【請求項25】

請求項１〜１２のいずれか１項記載の少なくとも1つのEVIR、又は請求項１６若しくは１７記載の少なくとも1つの組換え発現ベクター、又は請求項２０記載の少なくとも1つのEVIR発現細胞を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞外小胞内在化受容体(extracellular vesicle internalizing receptor)を発現する細胞を含むワクチン、並びにがんを予防及び/又は処置する免疫療法におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫療法は、感染、炎症状態及び変性状態、並びにがんを含めた様々なヒト疾患の処置及び予防においてますます重要性が増大している。がんにおいて、免疫療法は、がん細胞又は腫瘍の他の細胞成分の攻撃に患者自身の免疫系を刺激することを含んでいる(Waldmann et al., 2003, Nat Med, 9: 269-277; Miller et al., 2015, Cancer Cell, 27(4):439-49)。がんの処置に現在使用されている主なタイプの免疫療法は、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、及びがんワクチンの使用を含む(Miller et al., 2015、前掲)。

【0003】

がん関連の適用において、免疫療法は、がん細胞が正常細胞によっては発現されない(又はより低レベルで発現される)それらの表面分子上で発現すること、またそれが免疫系によって検出され得るという仮定に基づいている。これらの分子はがん抗原として公知であり、多くの場合、タンパク質(正常若しくは変異型)、又は他の高分子、例えば炭水化物及び脂質である。過去10年間に、腫瘍タンパク質のプロセシングに由来する増加し続ける分子が腫瘍関連抗原(TAA)として同定され、分類された。いわゆる能動免疫療法は、TAAを標的とすることによって免疫系が腫瘍細胞を攻撃するように関与するよう使用される。TAAは、CD8＋細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を含めた種々の細胞タイプによって認識され得る。CTLによってがん細胞が認識された後、続いてこれらはがん細胞の排除に関与し得る。

【0004】

免疫療法アプローチについての現在の研究の主要目標の1つは、患者に、可能性のある又は公知のTAAをワクチン接種することにより、がん特異的CTLを誘発又は増大することである。開発され治験に移されたアプローチには、ここではAPC-TAAと呼ばれる、ex vivoでTAAロードされた抗原提示細胞(APC)による養子免疫療法が含まれる。実際、強力で持続性のある抗腫瘍免疫の生成には、プロフェッショナルAPC、例えば樹状細胞(DC)などによるTAAのCTLへの提示が必要である(Palucka et al, 2012, Nat Rev Cancer, 12(4):265-77)。DCは、患者から得られた造血前駆細胞又は単球を、特定のサイトカイン/増殖因子の組み合わせと培養することによってex vivoで生成される。生成されたら、DCは、患者におけるAPC-TAAの再注入前に、ex vivoで全腫瘍溶解物又は特異的TAAに曝露される。過去10年間、マウスにおける前臨床試験及びいくつかの臨床試験により、この手順の安全性、腫瘍抗原には特異的である循環性CD4⁺ T細胞及びCD8^＋ T細胞の増殖を誘導するその能力、並びに一部の患者における客観的な臨床反応が示された(Palucka et al., 2012、前掲)。現在、ホルモン療法によってはもはや救済されない重度の前立腺がんの処置に、米国ではAPC-TAAワクチンであるSipuleucel-T(Provenge(登録商標))のみが承認されている(Gardner et al., 2012, Hum Vaccin Immunother, 8(4): 534-9)。この例は、定着がんを処置する能動免疫法の実現可能性を証明している。

【0005】

しかし、ex vivoで培養されたAPC-TAAの使用は、典型的には労働集約的であり(APCを単離し、ex vivoで操作し、次いで再注入する必要がある)、高価であり、一般に各患者に個体化されない(Kastenmueller et al., 2014, Nat Rev Immunol., 14(10):705-11)。代替のワクチン接種アプローチは、ex vivoで操作を行うことなく、選択したTAAをAPCにin vivoで標的化することからなる(Palucka et al., 2012, 前掲; Kastenmueller et al., 2014、前掲)。これは、いくつかの手段によって、例えば、選択したTAAにも融合されるAPC受容体(例えばCD205、CLEC9A、CD11c)に特異的な抗体で構成されるキメラタンパク質を使用することによって達成することができる。キメラタンパク質はAPCを標的とし、TAAの内在化、プロセシング、及びAPCによるT細胞への提示を促進することができる。しかし、これらのアプローチはあまり効果的ではなく、ただ1つのTAAのみを送達することができる。さらに、標的化APCによるCTLの誘導はまた、DCの成熟及び/又は活性化シグナルの提供を必要とするが、その理由はその非存在が抗原特異的耐性を誘導し得るからである(Kastenmueller et al., 2014、前掲)。

【0006】

アプローチの1つにおいて、DCが、がん細胞溶解産物又は細胞外小胞(EV)にex vivoで暴露され、次いで、対象に接種して戻され、抗原特異性のT細胞を活性化し、抗腫瘍免疫応答を誘導した(Gu et al., 2015, Intern Journal of Cancer, 136, E74-84)。別のアプローチは、抗がん胎児性抗原(CEA)キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作された単球/マクロファージ、又は抗HER2(ヒト上皮増殖因子受容体2)CARを発現するように操作されたDCを使用し、がん細胞をin vitro及びin vivoで直接標的化し、溶解させた(Biglari et al., 2006, Gene therapy, 13: 602-610; Wei et al., 2008, Cancer research, 68: 3854-62)。異なるタイプのアプローチにおいて、CTL又はナチュラルキラー(NK)細胞は、特定のTAAに対して設計されたCARを発現するように操作された。次いで、CAR操作されたT細胞又はNK細胞は、特異的抗原を発現するがん細胞を認識し、それらを死滅させた(Ahmed et al., 2015, Journal of clinical oncology, 33, 1688-1696; Schonfeld et al., 2015, Molecular therapy, 23, 330-338)。しかし、前述のアプローチの有効性は、再注入された場合、操作された細胞が固形腫瘍に送達される能力によって制限される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、依然として、個別化された、しかし同時に広範囲の患者に対して適用可能な方法で、複数の既知及び未知のTAAに特異的な、強力かつ広範なT細胞応答を誘導することができる抗腫瘍ワクチンの開発が求められている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、がん細胞によって発現される表面分子に対する新規の細胞外小胞内在化受容体(EVIR)の設計、及び新規EVIRを安定的に発現するためのAPC、例えば単球、マクロファージ、DC又はB細胞の遺伝子操作に基づいている。本発明はさらに、本発明のEVIRを発現するように操作されたAPCが、表面分子-陽性がん細胞に由来するが表面分子-陰性細胞ではない、任意のがん細胞由来の粒子又は膜を含めた細胞外小胞(EV)を、細胞接触とは無関係に、効率的に取り込み及び/又は内在化するという知見に基づいている。さらに、EVIR発現APCによるEV取り込みが、選択された表面分子とは無関係であるが起原のがん細胞に関係しているTAAの提示を有利に増強し、TAA特異的T細胞の増殖を促進し、それによりがんの処置又は診断の有望なツールが提供されることが確認された。

【0009】

本発明の一態様は、少なくとも1つのがん細胞表面分子に対する組換えEVIRに関する。

【0010】

本発明の別の態様は、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子に関する。

【0011】

別の態様において、本発明は、本発明によるEVIRをコードする核酸分子を含む組換えベクターを提供する。

【0012】

本発明の別の態様は、本発明の少なくとも1つのEVIRを発現する単離された細胞、特にAPC、及びその組成物に関する。

【0013】

本発明の別の態様は、APC又はそれらの幹/前駆細胞において本発明の少なくとも1つのEVIRの発現を誘導するex vivoでの方法(すなわち、培養における)であって、
(i)前記細胞に、本発明によるベクターをex vivoで形質導入するステップ、及び、
(ii)APCの細胞分化、成熟又は活性化を任意選択で誘導するステップ
を含む、方法を提供する。

【0014】

本発明の別の態様は、EVIR発現TAA提示細胞を調製するex vivoでの方法であって、
(i)がんの対象から得られた少なくとも1つのがん細胞又は少なくとも1つのがん細胞由来EVを提供するステップ、
(ii)本発明のEVIR発現細胞を提供するステップ、
(iii)(ii)で提供されたEVIR発現細胞を、(i)で提供された前記の少なくとも1つのがん細胞又はEVとex vivoで接触させるステップ、
(iv)ステップ(iii)で得られた細胞を回収するステップ
を含み、
(iv)で得られた細胞が、前記対象に投与された場合に、EVIRを発現せず(iii)のように処理した細胞と比較して、前記のがんの対象由来のTAAを提示する増大された能力を有する、
方法を提供する。

【0015】

本発明の別の態様は、単離されたEVIR発現細胞、又は本発明による方法によって得ることができるEVIR発現TAA提示細胞に関する。

【0016】

本発明の別の態様は、医薬として使用する本発明によるEVIR発現細胞、EVIR発現TAA提示細胞又は組換えベクターに関する。

【0017】

本発明の別の態様は、本発明の細胞、又は本発明による少なくとも1つの組換えベクター、及び少なくとも1つのその薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。

【0018】

本発明の別の態様は、がんの予防及び/又は処置において使用する本発明によるEVIR発現細胞、EVIR発現TAA提示細胞、又は組換えベクターに関する。

【0019】

本発明の別の態様は、がんを予防及び/又は処置する医薬組成物を調製するための単離されたEVIR発現細胞又は単離されたEVIR発現TAA提示細胞の使用に関する。

【0020】

本発明の別の態様は、本発明によるEVIR発現細胞又はEVIR発現TAA提示細胞を含む、ワクチン組成物を提供する。

【0021】

本発明の別の態様は、がんの対象由来の新規TAAを同定するex vivoでの方法であって、
(i)対象のAPC若しくはその幹/前駆細胞又は本発明によるEVIR発現細胞の形質導入を誘導する適切な条件下で、本発明によるEVIRをコードするベクターが投与された前記対象から得たEVIR発現APCを提供するステップ、或いは、
(ii)EVIR発現APCが、がんの対象から得た少なくとも1つのがん細胞又は少なくとも1つのがん細胞由来EVとex vivoで接触された、EVIR発現APCを提供するステップ、及び、
(iii)ペプチドが新規TAAを含む、(i)又は(ii)で提供された細胞においてMHCI又はMHCII分子にロードされたペプチドを同定するステップ
を含む、方法を提供する。

【0022】

本発明の別の態様は、がんの対象由来の新規T細胞受容体(TCR)を同定するex vivoでの方法であって、
(i)対象のAPC若しくはその幹/前駆細胞又は本発明によるEVIR発現細胞の形質導入を誘導する適切な条件下で、本発明によるEVIRをコードするベクターが投与された対象から得た腫瘍から単離されたT細胞を提供するステップ、又は、
(ii)EVIR発現TAA提示APCが同一のがんの対象のTAAを提示する、本発明の方法によって得られたEVA発現TAA提示APCとex vivoで接触させたがんの対象から単離されたT細胞を提供するステップ、及び、
(iii)ステップ(i)又は(ii)で提供した、単離されたT細胞からT細胞受容体(TCR)を配列決定するステップ
を含む、方法を提供する。

【0023】

本発明の別の態様は、それを必要とする対象において、APC又はその幹/前駆細胞での本発明の少なくとも1つのEVIRの発現をin vivoで誘導する方法であって、
(i)本発明によるEVIRをコードするベクターを前記対象に、対象のAPC又はその幹/前駆細胞のin vivoでの前記ベクターによる形質導入を誘導する適切な条件下で投与するステップ、及び、
(ii)任意選択で、APCの分化、成熟又は活性化をin vivoで誘導するステップ
を含む、方法を提供する。

【0024】

本発明の別の態様は、有効量の本発明によるEVIR発現細胞又は少なくとも1つの組換えベクターを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、がんを予防及び/又は処置する方法を提供する。

【0025】

本発明の別の態様は、有効量のEVIR発現TAA提示細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、がんを予防及び/又は処置する方法に関する。

【0026】

本発明の別の態様は、本発明による少なくとも1つのEVIR、又は少なくとも1つの組換え発現ベクター、又は少なくとも1つのEVIR発現細胞を含む、本発明による方法を実施するキットを提供する。

【0027】

統計的p値は、Prism(GraphPad Software)で算出され、図面では以下のように示されている。^*p<0.05、^**p<0.01、^***p<0.001。
本発明はまた、以下に関する。
［項目１］
(i)がん細胞の膜分子に特異的な細胞外抗体ドメイン、
(ii)少なくとも1つの膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含むタンパク質ドメイン、並びに
(iii)任意選択で、抗原提示細胞において発現された場合、抗原提示細胞の細胞膜への細胞外小胞内在化受容体(EVIR)の輸送を増大させる細胞膜輸送ドメイン
を含む、組換え細胞外小胞内在化受容体(EVIR)。
［項目２］
細胞外抗体ドメインがscFvである、項目1に記載のEVIR。
［項目３］
細胞外抗体ドメインがヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)に特異的な抗体又はそのフラグメントの配列を含む、項目1又は2に記載のEVIR。
［項目４］
細胞外抗体ドメインがチロシナーゼ関連タンパク質-1(TYRP1)、がん胎児性抗原(CEA)、メソテリン、PMEL(gp100)、ガングリオシド(GD2、GD3)、又はムチンに特異的な抗体又はそのフラグメントの配列を含む、項目1又は2に記載のEVIR。
［項目５］
細胞外抗体ドメインが配列番号27、配列番号28、配列番号29及び配列番号30から選択される配列又はその変異体を含む、項目1〜3のいずれか一項に記載のEVIR。
［項目６］
細胞外抗体ドメインがチロシナーゼ関連タンパク質-1(TYRP1)又はガングリオシド(GD2)に特異的な抗体又はそのフラグメントの配列を含む、項目4に記載のEVIR。
［項目７］
細胞外抗体ドメインが配列番号113及び配列番号114から選択される配列を含む、項目6に記載のEVIR。
［項目８］
タンパク質ドメインが配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40及び配列番号41又はその変異体から選択される、項目1〜7のいずれか一項に記載のEVIR。
［項目９］
IgKドメインを含む細胞膜輸送ドメインを含む、項目1〜8のいずれか一項に記載のEVIR。
［項目１０］
配列番号42のIgKドメイン又はその誘導体を含む細胞膜輸送ドメインを含む、項目9に記載のEVIR。
［項目１１］
配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63及び配列番号64から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、項目1〜3、5、8又は9〜10のいずれか一項に記載のEVIR。
［項目１２］
配列番号132及び配列番号133から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、項目1〜2、4、6〜8又は9〜10のいずれか一項に記載のEVIR。
［項目１３］
項目1〜12のいずれか一項に記載のEVIRをコードする単離された核酸配列。
［項目１４］
配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74及び配列番号75から選択される配列又はそれらの変異体を含む、項目13に記載の単離された核酸。
［項目１５］
配列番号130及び配列番号131から選択される配列又はそれらの変異体を含む、項目13に記載の単離された核酸。
［項目１６］
項目13〜15のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸配列を含むベクター。
［項目１７］
単球、マクロファージ及び/又は樹状細胞における生存、分化、増殖、活性化、成熟、貪食作用、エンドサイトーシス、抗原プロセシング及び提示、T細胞動員を促進する機能性タンパク質、或いは抗原提示細胞(APC)の分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質か、又はT細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸をさらに含む、項目16に記載のベクター。
［項目１８］
抗原提示細胞(APC)又はそれらの幹/前駆細胞において、項目1〜12のいずれか一項に記載の少なくとも1つのEVIRの発現を誘導するex vivoでの方法であって、
(i)前記細胞に、項目1〜12のいずれか一項に記載の少なくとも1つのEVIRをコードするベクターをex vivoで形質導入するステップ、及び、
(ii)細胞分化、成熟又は活性化を任意選択で誘導するステップ
を含む、前記方法。
［項目１９］
ベクターが項目13〜15のいずれか一項に記載の核酸配列を含むか、又は項目16若しくは17に記載のベクターである、項目18に記載の方法。
［項目２０］
項目1〜12のいずれか一項に記載の少なくとも1つのEVIRを発現する単離された抗原提示細胞(APC)又はそれらの幹細胞若しくは前駆細胞。
［項目２１］
EVIR発現TAA提示細胞を調製するex vivoでの方法であって、
(i)がんの対象から得られた少なくとも1つのがん細胞又は少なくとも1つのがん細胞由来EVを提供するステップ、
(ii)項目20に記載のEVIR発現細胞を提供するステップ、
(iii)(ii)で提供されたEVIR発現細胞を、(i)で提供された前記の少なくとも1つのがん細胞又はEVとex vivoで接触させるステップ、
(iv)ステップ(iii)で得られた細胞を回収するステップ
を含み、
(iv)で得られた細胞が、前記対象に投与された場合に、EVIRを発現せず(iii)のように処理した細胞と比較して、前記のがんの対象由来のTAAを提示する増大された能力を有する、
前記方法。
［項目２２］
項目1〜12のいずれか一項に記載の少なくとも1つのEVIRをコードする少なくとも1つのベクター又は項目20に記載の細胞又は項目18若しくは21に記載の方法から取得可能な細胞、及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤又はそれらの賦形剤を含む医薬組成物。
［項目２３］
前記組成物がワクチン組成物である、項目22に記載の医薬組成物。
［項目２４］
がんの予防及び/又は処置において使用するための、項目22又は23に記載の医薬組成物。
［項目２５］
項目1〜12のいずれか一項に記載の少なくとも1つのEVIR、又は項目16若しくは17に記載の少なくとも1つの組換え発現ベクター、又は項目20に記載の少なくとも1つのEVIR発現細胞を含むキット。
［項目２６］
有効量の項目20に記載のEVIR発現細胞又は項目16若しくは17に記載の少なくとも1つの組換えベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを予防及び/又は処置する方法。
［項目２７］
それを必要とする対象において、APC又はその幹/前駆細胞での項目1〜12のいずれか一項に記載の少なくとも1つのEVIRの発現をin vivoで誘導する方法であって、
(i)項目16又は17に記載のEVIRをコードするベクターを前記対象に、対象のAPC又はその幹/前駆細胞のin vivoでの前記ベクターによる形質導入を誘導する適切な条件下で投与するステップ、及び
(ii)任意選択で、APCの分化、成熟又は活性化をin vivoで誘導するステップ
を含む、前記方法。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】EVIRを発現するLVを示す図である。代表的なEVIR(例えば、抗HER2)及び第2の遺伝子、この場合、緑色蛍光タンパク質(GFP)を同時に発現させるために使用される双方向性プロウイルスLVの概略図。

【図2】細胞形質導入後のEVIRの発現を示す図である。非形質導入(UT;F(ab')2陽性細胞は検出されず、P388D1細胞からのシグナルはノイズを表す)であるか、対照又はEVIR-N LV(実施例1に記載されている設計)を形質導入した293T、P388D1及びiBMMにおいてフローサイトメトリー(抗F(ab')2染色)によって分析された、F(ab')2陽性細胞(平均±SEM、n=5)のパーセンテージとして測定した抗HER2 EVIR-N発現。

【図3-1】細胞形質導入後の異なるシグナルドメインを有するEVIRの発現を示す図である。A:P388D1及びiBMMにおけるフローサイトメトリー(抗F(ab')2染色)によって分析された、F(ab')2陽性細胞(平均±SEM、n=5)のパーセンテージとして測定した抗HER2 EVIR発現。B:実施例2に記載されているように、抗F(ab')2抗体で染色した対照、EVIR-N、EVIR-T又はEVIR-G LVを形質導入したiBMMの免疫蛍光分析の代表的画像。

【図3-2】図３−１の続きである。

【図4】EVIR発現細胞の持続性を示す図である。データは、実施例2に記載されているフローサイトメトリーによって測定した、対照又は抗HER2 EVIR LVの形質導入から36日間にわたるGFP陽性細胞(A:iBMM、B:P388D1)のパーセンテージを示す。

【図5】共培養アッセイを示す図である。A:HER2⁺又はHER2^-(非形質導入、UT)mTq+MC38細胞の共培養のフローサイトメトリー分析によって測定された、総iBMM内のmCherry⁺、GFP⁺、GFP⁺ mTq⁺又はmCherry⁺ mTq⁺ iBMMのパーセンテージ(平均±SEM、n=3)(100%として示す)。iBMMは、実施例3に記載のように、抗HER2 EVIR発現LVが形質導入されているか(EVIR)、形質導入されていない(対照)いずれかである。mCherry+mTq+及びGFP+mTq+は、MC38細胞に結合するiBMMを表す、mCherry及びmTq、又はGFP及びmTqについて陽性事象を示す。B:異なる比(10:1、1:1又は1:10)での、EVIR-N又は対照-形質導入P388D1細胞とHER2-形質導入又はUT mCherry+MC38細胞の間の結合事象のパーセンテージ(平均±SEM、n=3)。

【図6-1】抗HER2 EVIRによるEV取り込みを示す図である。A:実施例4に記載のように、抗HER2抗体で染色したHER2⁺ MC38細胞由来EVのフローサイトメトリー分析の代表的なヒストグラム。B:HER2⁺又はHER2^-(UT) mCherry+MC38細胞から単離されたEVで未処理又は処理した抗HER2 EVIR-N⁺ iBMMにおけるmCherry発現のフローサイトメトリー分析(中央蛍光強度、MFI;平均±SEM、n=2)。Tukeyの多重比較試験による一元配置ANOVAによる統計分析。C:抗HER2 EVIRを発現し、HER2⁺/mCherry⁺ MC38由来EV(1)又はHER2^-/mCherry+MC38細胞(2)から単離されたEVで処理したiBMMにおけるmCherryのMFIの時間経過分析。p<0.001、二元ANOVA統計分析。D:HER2⁺/mCherry⁺MC38細胞から単離されたEVで処理した抗HER2 EVIR-N⁺ iBMMの免疫蛍光画像。E:未処理又はHER2+/mCherry+又はHER2^-/mCherry+(mCherry+として明示)MC38細胞由来のEVで処理した、対照EVIR(対照⁺ BMDC)又は抗HER2 EVIR(EVIR-N⁺ BMDC)のいずれかを発現する、BMDCのmCherry MFI。Tukeyの多重比較検定による二元配置ANOVAによる統計分析。F:HER2⁺ mCherry+MC38細胞から単離されたEVの濃度を増加させて処理した抗HER2 EVIR-N⁺又は対照EVIR⁺ BMDCにおけるmCherry蛍光のフローサイトメトリー分析(平均±SEM、n=3)。

【図6-2】図６−１の続きである。

【図7】異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有するEVIRを示す図である。未処理又は実施例4に記載されているHER2+又はHER2^-(UT) mCherry+MC38細胞から単離されたEVで処理した抗HER2 EVIR形質導入iBMMのmCherry MFIのサイトメトリー分析(平均±SEM、n=2)。Tukeyの多重比較検定による二元配置ANOVAによる統計分析。

【図8-1】実施例5に記載されているT細胞増殖アッセイを示す図である。A₁:HER2⁺0VA⁺ MC38細胞から単離されたEVの存在下で、対照EVIR(対照⁺)又は抗HER2 EVIR-N(EVIR-N⁺)のいずれかを発現するBMDCと培養した後の増殖サイクル数(A_2-3における「ピーク」)を測定するための、細胞トレーサーで標識した増殖OT-I T細胞のパーセンテージ。増殖T細胞のパーセンテージは、各ピークが1つの細胞分裂を示す図A_2-3の各「ピーク」(1-6)を分析することによって得た。B₁:細胞トレーサーで標識され、HER2⁺ OVA⁺ MC38細胞から単離されたEVと24時間前処理した対照EVIR(対照⁺)又は抗HER2 EVIR-N(EVIR-N⁺)のいずれかを発現するBMDCと培養した、増殖OT-I T細胞のパーセンテージ。(A₁-B₁:複数比較のためのSidak事後試験訂正(平均±SEM、n=3)を用いた二元配置ANOVA統計分析)。A_2-3:対照+(A₂)又は抗HER2 EVIR-N+(A₃)BMDCをEVと共に培養した後のT細胞増殖サイクルを示す代表的なヒストグラム。B_2-3:EVで前処理した対照+(B₂)又は抗HER2 EVIR-N+(B₃)BMDCとの培養後のT細胞増殖サイクルを示す代表的なヒストグラム。シダックの多重比較検定を用いた二元配置ANOVAによるA₁及びB₁の統計分析。C_1-3:HER2⁺ 0VA⁺ EV(C₁)、対照+BMDC(C₂)又はEVなしの抗HER2 EVIR-N+BMDM(C₃)への暴露後のT細胞増殖を示す代表的なヒストグラム。D:対照又は抗HER2 EVIR-Nのいずれかを発現し、HER2⁺ OVA⁺ MC38細胞から単離されたEVの濃度を増加させて処理したBMDCと培養した後の、細胞トレーサーで標識したCD8⁺ OT-I T細胞の増殖。データポイントは3つの独立した生物学的複製を示す。

【図8-2】図８−１の続きである。

【図9-1】実施例6に記載されている、2つの異なるメラノーマ特異的表面抗原、DG2及びTYRP1に対するEVIRを示す図である。A:未処理又はGD2⁺/mCherry⁺又はGD2^-/mCherry⁺ MC38細胞由来のEVで処理した、対照⁺又はEVIR-N2⁺ iBMMのmCherry MFI(平均±SEM、n=3)。B:未処理又はTYRP1⁺又はTYRP1^- B16メラノーマ細胞から単離されたEVで処理した、対照⁺又はEVIR-N1 iBMMにおけるCellTracker(商標)BlueのMFI(平均±SEM、n=3)。Tukeyの多重比較検定による二元配置ANOVAによる統計分析。C:対照又はEVIR-N1のいずれかを発現し、TYRP1⁺ OVA⁺ B16メラノーマ細胞から単離されたEVで処理したBMDCと培養した後の、細胞トレーサー標識した増殖CD8⁺ OT-I T細胞の数(平均±SEM、n=3)。スチューデントt検定による統計分析。

【図9-2】図９−１の続きである。

【図10】実施例7に記載されている、APCの分化、活性化及び提示、及び/又はT細胞動員に有利な因子とのEVIRの双方向LVによる形質導入を示す図である。A:対照EVIR単独、EVIR-N単独をコードするLV、又はEVIR-Nと指示したタンパク質(CXCL9、CSF2、IFNγ、CD40、LIN28)の1つの両方をコードする双方向LVを細胞形質導入後の、EVIR⁺ BMDCによりHER2⁺又はHER2^- mCherry⁺MC38細胞から単離されたEVのmCherry取り込み。データは、EVIR当たり3回の形質導入反復の平均を表す(生物学的反復;平均±SEM、n=3)。Tukeyの多重比較試験による一元配置ANOVAによる統計分析。B:対照EVIR単独、EVIR-N単独、又は指示したタンパク質(CXCL9、CSF2、IFNy、CD40、LIN28)の1つとのEVIR-NをコードするLVを細胞形質導入した後の、BMDCにおけるEVIR⁺の発現。データは、技術的複製物を表す(平均±SEM、n=3)。C-D:対照EVIR単独、EVIR-N単独、又はLIN28とのEVIR-Nを形質導入したBMDCにおけるCCR7(C)又はCD86(D)の発現(平均±SEM、n=3)。データは、EVIR当たり3回の形質導入反復の平均を表す(生物学的反復;平均±SEM、n=3)。Tukeyの多重比較試験による一元配置ANOVAによる統計分析。

【図11】実施例11に記載されているT細胞増殖アッセイを示す図である。A_1-2:データは、B2M遺伝子が無傷(A₁)又はCRISPR形質導入によって破壊された(A₂)、指示したMC38細胞のフローサイトメトリー分析を示す。B:データは、MHCI欠損B2M^-マウスから単離し、対照EVIR又はEVIR-Nのいずれかを発現するBMDCと培養した後の、細胞トレーサーで標識したCD8⁺ OT-I T細胞のフローサイトメトリー分析を示す。培養物は、B2M-成熟(B2M⁺)又は欠損(B2M^-) HER2⁺ OVA⁺ MC38がん細胞のいずれかから単離されたEVで処理した。

【図12】実施例12に記載されている腫瘍ワクチン接種試験を示す図である。MC38腫瘍注射後7日目及び14日目に、PBSで皮下注射した(DCなし;n=4)、又は対照EVIR(CTRL DC;n=7)若しくは抗HER2 EVIR(EVIR-DC;n=9)を発現するいずれかのDCでワクチン接種した、同系マウスにおけるHER2⁺ MC38の腫瘍増殖。

【図13】この例示は、がん細胞(1)の膜結合分子に特異的な細胞外抗体ドメイン、例えばscFv(11)、少なくとも1つの膜貫通ドメイン(3)及び少なくとも1つの細胞内ドメイン(4)を含むタンパク質ドメイン(2)を含む、本発明のEVIRの構築物のいくつかの概略的かつ総括的な例を示す。タンパク質ドメインは、膜貫通ドメイン(3)を細胞外抗体ドメイン(1)に連結するヒンジドメイン(21)を含み得る。タンパク質ドメイン(2)は、1つの膜貫通ドメイン(3)及び1つの細胞内ドメイン(4)、例えば、左側及び中央に示されている例、又は各々の1つ以上のいずれかを含むように変化させることができ、ここで、膜貫通ドメイン(3)は、右側に示した例のように、細胞外側で細胞外非ヒンジドメイン(32)によって、及び細胞内側で2つ以上の細胞内ドメイン(4)によって互いに連結される。さらに、EVIRは、細胞外抗体ドメイン(1)に連結されている細胞膜輸送ドメイン(5)を含む。細胞内ドメイン(4)はまた、シグナル伝達配列(41)も含み得る。本発明の構築物の特定の名称は、本発明のどのタイプの構築物下にそれらが分類されているかを示している。

【発明を実施するための形態】

【0029】

詳細な説明
本明細書で言及されている用語「抗体」とは、抗原に結合するポリペプチドを意味する。これには、全抗体及び任意の抗原結合フラグメントが含まれる。用語「抗体」はその最も広義の意味で使用され、本発明の特徴的特性、特に標的抗原に、より詳細にはがん細胞の膜結合性分子に結合する能力が保持される限り、モノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などを含む。抗体及びそれらのフラグメントの例としては、可変ドメインフラグメント(抗体の単一アームのVH及びVLドメインからなる「Fv」)、Fabフラグメント(VH、VL、CH1及びCLドメインからなる一価のフラグメント)、Fab2フラグメント(二価)、Fab3フラグメント(三価)、Fab'フラグメント(ヒンジ領域を有するFab)、F(ab')2フラグメント(ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント)、Fdフラグメント(VHドメイン及びCH1ドメインからなる)、rIgG(還元型IgG又は半IgG)、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディー、一価抗体、2つ以上の抗体のフラグメントを含む二価抗体又は多価抗体、一本鎖可変フラグメント(ScFv)、ビス-scFv(二重特異性)、及び抗体の誘導体、例えば、ジスルフィド安定化Fvフラグメント、CDR含有ペプチド、並びに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント(Holliger et al., 2005, Nature Biotechnology, 23(9): 1126-1136)が挙げられる。

【0030】

本明細書で使用される場合の「膜結合性分子」又は「表面分子」という用語は、脂質二重層に物理的に埋め込まれているか、又は特定の条件下で細胞膜に永久的に又は一時的に結合若しくは固定されている任意の分子を意味する。この分子は、原形質膜又は細胞内膜を含めた、がん細胞の任意の膜と結合し得る。これらの分子は様々な機能を果たすことができ、限定するものではないが、糖タンパク質、膜受容体タンパク質、輸送タンパク質、膜酵素、細胞接着分子及びそれらの変異形態を含めた異なる機能群に属する。これらの分子は、がん細胞の原形質膜で、又はがん細胞由来粒子と結合した任意の膜、例えば細胞外小胞(EV)のいずれかで発現し得る。この用語は、既知の及び未知のがん細胞膜結合性分子を含む。膜結合性分子の例としては、限定するものではないが、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)、チロシナーゼ関連タンパク質-1(TYRP1)、がん胎児性抗原(CEA)、メソテリン、PMEL(gp100)、ガングリオシド(GD2、GD3)、及びムチンが挙げられる。

【0031】

用語「細胞外小胞内在化受容体」又は「EVIR」は、がん細胞又は任意のがん細胞由来の粒子/小胞によって発現される表面分子に対する組換え受容体を意味する。本発明によるEVIRは、「細胞外抗体ドメイン」、「タンパク質ドメイン」及び任意選択で「細胞膜へのEVIR輸送を増大させるドメイン」と呼ばれる以下のエレメントを含む。

【0032】

用語「細胞外抗体ドメイン」とは、がん細胞又はがん細胞由来の粒子/小胞によって発現される任意の膜結合性分子に対する特異性を有する任意の抗体ドメインを意味する。本発明による抗体ドメインの例としては、限定するものではないが、とりわけ(i)抗HER2 scFv、例えばCHA21(Zhou et al., 2011, The Journal of Biological Chemistry, 286: 31676-31683)、トラスツズマブベースscFv(Morgan et al., 2010, Mol Ther. , 18(4):843-51)、ペルツズマブベースscFv(Franklin et al., 2004, Cancer Cell, 5(4):317-28)、及びFRP5ベースscFv(Ahmed et al., 2009, Mol Ther., 17(10):1779-87)、(ii) 抗GD2 scFv(Newik et al., 2016, Mol Ther Oncolytics, 68:139-152)、又は、(iii)抗TYRP1 scFv(Saenger et al., 2008, Cancer Res, 68(23); 9884-91)等が挙げられる。

【0033】

用語「膜貫通ドメイン」及び「細胞内ドメイン」は、細胞表面にEVIRの「細胞外抗体ドメイン」を固定し、細胞質に拡張するポリペプチドを含む、本発明のEVIRのタンパク質フラグメントの部分を意味する。特定の態様によれば、本発明によるEVIRの膜貫通ドメインは、EVIRが抗原提示細胞膜に固定することを可能にし得る。特定の態様によれば、本発明によるEVIRの細胞内ドメインは、シグナル伝達能力又は非シグナル伝達能力を有することができる。

【0034】

特に、タンパク質ドメインを形成する「膜貫通ドメイン」及び「細胞内ドメイン」は、それらが由来する天然膜結合タンパク質からの対応するドメインであってもよいし、いくつかのトランケーション、及び/又は細胞膜へのそれらの固定能力に影響しない相同な配列修飾、例えば、内在性シグナルペプチドの除去を介した、それらに由来するドメインであってもよい。例えば、特定の態様によれば、タンパク質ドメインは、例えば、特定の膜タンパク質、例えばCCR1、-2、-4及び-5で確認される、細胞外「非ヒンジ」ドメイン(天然膜タンパク質中の2つの「膜貫通ドメイン」を架橋するペプチドフラグメント)によって互いに連結されている2つ以上の膜貫通ドメインを含み得る。EVIRの細胞内ドメインがシグナル伝達能力を有する(例えば、シグナル伝達ペプチド部分を含む)場合、「シグナル伝達ドメイン」と呼ぶことができ、また、EVIRの細胞内ドメインがシグナル伝達能力を有していない場合、「不活性細胞内ドメイン」と呼ぶことができる。特定の態様によれば、タンパク質ドメインは、細胞内ドメインによって連結されている2つ以上の膜貫通ドメインを含み得る。EVIR、特に様々なタイプのタンパク質ドメインに関する構築物の様々な例を図13に示す。本発明によるEVIRのタンパク質ドメインは、「膜貫通ドメイン」、「細胞内ドメイン」を含み、任意選択でさらに、同一の又は異なるタンパク質に由来する膜貫通ドメインを連結している「細胞外非ヒンジドメイン」を含み得る。膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、及び任意選択の細胞外非ヒンジドメインは、以下の機能:細胞生存、分化、増殖、活性化、成熟、貪食作用、エンドサイトーシス、抗原プロセシング及び提示、T細胞動員、特に他の機能の少なくとも1つを誘導する任意のタンパク質に由来し得る。好ましくは、それは、単球及び/又はマクロファージ及び/又はDC細胞の生存、分化、増殖、活性化、成熟、貪食作用、エンドサイトーシス、抗原プロセシング及び提示、T細胞動員、特に他の機能を誘導する任意のタンパク質フラグメントを含む(Holliger et al., 2005、前掲; Palucka et al., 2012、前掲; Kastenmueller et al.、前掲)。タンパク質ドメイン、又は膜貫通/細胞内の非ヒンジドメイン、及び任意選択のそれらの細胞外非ヒンジドメインの例は、膜結合性タンパク質のドメイン、例えば、増殖因子受容体、Fcγ受容体ファミリー、トール様受容体、C-Cケモカイン受容体、並びに任意の細胞表面上で発現され、単球及び/又はマクロファージ及び/又はDC細胞の生存、分化、増殖、活性化、成熟、貪食作用、エンドサイトーシス、抗原プロセシング及び提示、T細胞動員及び特に他の機能を促進し得る天然又は組換えの他のタンパク質分子が挙げられる。これらのドメインの特定の例としては、FcγRIIIA受容体(先天性免疫系の細胞によって発現されるFcγ受容体ファミリーのメンバー)、受容体チロシンキナーゼ(FLT3、CD135とも呼ばれる)、トール様受容体4(TLR4)、C-Cケモカイン受容体2型(CCR2)、インテグリンベータ鎖ベータ2受容体(ITGB2)、コロニー刺激因子-2受容体B(CSF2RB)、C-Cケモカイン受容体1型(CCR1)、C-Cケモカイン受容体5型(CCR5)、ケモカイン受容体CXCR4、及びP-セレクチン糖タンパク質-1リガンド受容体(SELPLG)、又はヒト神経成長因子受容体(NGFR)のフラグメントが挙げられる。

【0035】

タンパク質ドメインは、「膜貫通ドメイン」と本発明のEVIRの「細胞外抗体ドメイン」とを架橋することにより、組換え受容体に可撓性を提供するペプチドフラグメントである「ヒンジ領域」を含んでいてもよい(Sadelain et al., 2013, Cancer Discov, 3(4):388-98)。特定の実施形態において、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、及びヒンジ領域を含むタンパク質ドメインは、膜結合性タンパク質から細胞外ドメインを単に除去することによって得られ、それから膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは本明細書に例示されているように誘導される。この場合、ヒンジ領域は、膜結合タンパク質の膜貫通ドメインと元の細胞外ドメインを自然に連結しているペプチド領域に相当する。

【0036】

本発明のEVIRはまた、細胞性又はウイルス性のいずれかの任意のタンパク質フラグメントを意味する、「細胞膜輸送ドメイン」を含有していてもよく、これはEVIRの細胞膜への局在化(sorting)を増大させる。非限定的な例は、例えば、EVIRのN末端に挿入されたIgKドメインである(von Heijne et al., 2006, Nat Rev Mol Cell Biol., 7:909-18)。

【0037】

本明細書で言及されている用語「抗原提示細胞」又は「APC」とは、表面上に組織適合性主複合体(MHC)と複合体を形成した異種抗原を提示する細胞を意味する。このプロセスは、抗原提示として知られている。またこれらの細胞は、時に「アクセサリー細胞」と呼ばれることもある。T細胞は、それらのT細胞受容体(TCR)を使用してこれらの複合体を認識し、それによりAPCは抗原をプロセシングしT細胞にそれらを提示する。APCの例としては、限定するものではないが、樹状細胞(DC)、単球、マクロファージ、特定のB細胞、及び特定の活性化上皮細胞が挙げられる。

【0038】

用語「造血細胞」は、単球、マクロファージ及び樹状細胞を含めた、成熟血液細胞に分化する能力を有する細胞を意味し、造血幹細胞(HSC)及び造血前駆細胞(HPC)を含む。

【0039】

用語「EVIR発現TAA提示細胞」は、本発明では、本明細書によるEVIRを発現し、また任意選択で、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るか、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質を発現する細胞を意味し、これは、がん細胞及び/又はがん細胞由来粒子、例えばEVと接触した後、がん細胞及び/又はがん細胞由来粒子を内在化し、TAAをプロセシングし、その結果、TAA提示がEVIRを発現する抗原提示細胞内で達成される。

【0040】

用語「細胞外小胞」又は「EV」は、本明細書では、がん細胞由来の任意の膜含有粒子又はフラグメントを意味する。EVは、腫瘍起原のエキソソーム、微小胞、微粒子、アポトーシス小体、細胞破壊片、膜断片及び同様の細胞内材料を含んでいてもよく、したがって、既知の及び未知の腫瘍抗原と結合し得る。操作されたAPCとEVを融合した後、EV結合した腫瘍抗原は、操作されたAPCによってT細胞に提示され、がんに対する免疫応答が開始される。EVは、記載されているようにして単離することができる(Squadrito et al., 2014, Cell Rep, 8(5):1432-46; Thery et al., 2006, Curr Protoc Cell Biol, Chapter 3; Unit 3:22)。APCによる腫瘍抗原の提示は、Villadangos et al., 2014, Immunity, 29(3):352-61に記載されているように、APCのMHCI又はMHCII分子上でのプロセシング及び抗原のローディング後に起こり得る(従来提示及び交差提示)が、また、Scholzel et al., 2014, J Hepatol. , 61(3):600-8に記載されているように、クロスドレッシング(cross-dressing)によるEV由来抗原/MHC複合体の直接提示によっても起こり得る。

【0041】

本明細書で定義されている用語「がん」又は「腫瘍」とは、身体の他の部分に浸潤又は拡散する可能性のある、異常細胞増殖を伴う疾患である。用語「がん」とは、限定するものではないが、癌腫(例えば、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん及び大腸がんなど)、メラノーマ、肉腫(例えば、骨肉腫、軟骨がん、神経がんなど)、リンパ腫及び白血病(造血器がん)、胚細胞腫瘍(例えば、精上皮腫及び未分化胚細胞腫など)、並びに芽細胞腫により例示される疾患を指す。

【0042】

本明細書で使用される場合、「処置」及び「処置する」などは、一般に、所望する薬理学的及び生理学的効果を得ることを意味する。これらの効果は、疾患、その徴候又は状態の予防若しくは部分的予防の点からは予防的であってよく、及び/又は疾患、状態、徴候の部分的若しくは完全治癒、又はその疾患に起因する副作用の点からは治療的であってもよい。本明細書で使用される場合の用語「処置」とは、哺乳動物、特にヒトにおけるがんの任意の処置を網羅し、疾患を抑制すること、すなわち、その発生を阻止すること、又はその疾患を緩和すること、すなわち、その疾患及び/又はその徴候又は状態の軽減をもたらすこと、例えば、障害の病状軽減又は治療を含む。特に、本発明による細胞、方法、使用、製剤及び組成物は、早期がんの患者におけるがんの処置、及び/又は進行期若しくは転移期へとがんが進行することを予防し、がんの病期及び患者の予後を改善することにおいて有用である。特に、がんの予防及び/又は処置は、本発明による細胞の投与を含み得る。

【0043】

本発明による処置又は方法の用語「有効性」とは、本発明による使用又は方法に応答する疾患又は状態の経過における変化に基づいて測定することができる。例えば、本発明による処置又は方法の有効性は、病気の徴候又は症状に対するその影響によって測定することができる。患者が部分的又は完全な緩和、又は望ましくない病気の症状の軽減を経験した場合に、応答が達成される。特定の実施形態によれば、有効性は、がん細胞に対して誘発された免疫応答を測定することによって、例えば、腫瘍特異的T細胞を分析することによって、又はがん細胞の死滅及び/又は腫瘍の増殖、進行及び播種の阻害を評価することによって測定することができる。

【0044】

本明細書で使用される場合の用語「有効量」とは、前記細胞が投与されている対象の疾患の徴候の検出可能な低減を誘発する、本発明による少なくとも1つの細胞又はその医薬製剤の量を意味し、これらの徴候は、例えば、固形腫瘍の質量の減少を含み得る。

【0045】

本明細書で使用される場合の用語「対象」とは、哺乳動物を意味する。例えば、本発明で考えられる哺乳動物としては、ヒト、霊長類、家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、実験室齧歯類、他のペットなどが挙げられる。

【0046】

本明細書で使用される場合の用語「変異体」とは、元のペプチド配列と実質的に相同であるが、1つ以上の欠失、挿入又は置換により元の配列とは異なる少なくとも1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。実質的に相同とは、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%上記で開示した元のアミノ酸配列と同一である、変異アミノ酸配列を意味する。2つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、目視検査及び/又は数学的計算によって、或いは配列比較に使用される既知のコンピュータープログラム、例えばClustalパッケージバージョン1.83など使用して配列情報を比較することによって、より容易に決定することができる。変異体は、少なくとも1つの保存的に置換されたアミノ酸を有する配列を含むことができ、このことは、所与のアミノ酸残基が同様の物理化学的特性を有する残基により置換されていることを意味する。一般的に、元のポリペプチドに存在する1つ以上のアミノ酸に対する置換は、保存的になされるものとする。保存的置換の例としては、1つの脂肪族残基の他の残基、例えばIle、Val、Leu若しくはAlaとの相互置換、又は1つの極性残基の他の残基への置換、例えばLysとArg;GluとAsp;若しくはGlnとAsnとの間の置換が挙げられる。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する全領域の置換は周知である(Kyte, et al, 1982, J. MoI. Biol., 157: 105-131)。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、天然アミノ酸残基を、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんど又は全く影響を及ぼさないような非天然残基で置換することを含むことができる。所望するアミノ酸置換は(保存的又は非保存的のいずれであっても)、そのような置換が望まれる時点で当業者により決定され得る。

【0047】

本発明によるEVIR
本発明の細胞外小胞内在化受容体(EVIR)は、
(i)がん細胞の膜結合性分子に特異的な細胞外抗体ドメイン、
(ii)少なくとも1つの膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含むタンパク質ドメイン、
(iii)任意選択で、抗原提示細胞の細胞膜へのEVIRの輸送を増大させる細胞膜輸送ドメイン
を含む。

【0048】

本発明の細胞外小胞内在化受容体は、
(i)がん細胞の膜結合性分子に特異的な細胞外抗体ドメイン、
(ii)1つの膜貫通ドメイン及び1つの細胞内ドメインを含むタンパク質ドメイン、
(iii)任意選択で、抗原提示細胞の細胞膜へのEVIRの輸送を増大させる細胞膜輸送ドメイン
を含む。

【0049】

特定の実施形態において、タンパク質ドメインが細胞外抗体ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジ領域をさらに含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0050】

特定の実施形態において、タンパク質ドメインが少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ又は少なくとも7つの膜貫通ドメイン(例えば7つの膜貫通ドメイン)を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0051】

さらに特定の実施形態において、タンパク質ドメインが、本発明のEVIRの細胞内ドメイン及び/又は細胞外非ヒンジドメインによって一緒に連結されている少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ又は少なくとも7つの膜貫通ドメインを含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0052】

特定の実施形態において、タンパク質ドメインが少なくとも2つ、少なくとも3つ、又は少なくとも4つの細胞内ドメイン(例えば4つの細胞内ドメイン)を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0053】

さらに特定の実施形態において、タンパク質ドメインが少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの細胞内ドメインにより一緒に連結されており、任意選択で、細胞外の少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの非ヒンジドメインによりさらに一緒に連結されている、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ又は少なくとも7つの膜貫通ドメインを含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0054】

特定の実施形態において、TGなどのDNA操作を容易にするアミノ酸配列(例えばクローニング部位)をさらに含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0055】

特定の実施形態において、DNA操作を容易にするアミノ酸配列(例えばクローニング部位)が配列番号104のものである、本発明によるEVIRを提供する。

【0056】

特定の実施形態において、DNA操作を容易にするアミノ酸配列が膜貫通ドメインと細胞外抗体ドメインとの間に存在する、本発明によるEVIRを提供する。

【0057】

特定の実施形態において、細胞外抗体ドメインがscFvである、本発明によるEVIRを提供する。

【0058】

さらに特定の実施形態において、細胞外抗体ドメインが、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)に特異的である抗体の配列又はそれらのフラグメントを含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0059】

別のさらなる特定の実施形態において、細胞外抗体ドメインが、限定するものではないが、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)、チロシナーゼ関連タンパク質-1(TYRP1)、がん胎児性抗原(CEA)、メソテリン、PMEL(gp100)、ガングリオシド(GD2、GD3)、及びムチンを含めた、腫瘍関連抗原に対応する少なくとも1つのがん細胞膜結合性分子に特異的な抗体の配列を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0060】

さらに特定の実施形態において、細胞外抗体ドメインが抗ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)に特異的な抗体の配列を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0061】

別のさらに特定の実施形態において、細胞外抗体ドメインがチロシナーゼ関連タンパク質-1(TYRP1)に特異的な抗体の配列を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0062】

別のさらに特定の実施形態において、細胞外抗体ドメインがガングリオシドGD2(GD2)に特異的な抗体の配列を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0063】

さらに特定の実施形態において、抗ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)の配列がCHA21の配列(配列番号27)又はその変異体を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0064】

別のさらに特定の実施形態において、抗ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)の配列がトラスツズマブベースscFvの配列(配列番号28)又はその変異体を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0065】

別のさらに特定の実施形態において、抗ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)の配列がペルツズマブベースscFvの配列(配列番号29)又はその変異体を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0066】

別のさらに特定の実施形態において、抗ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)の配列がFRP5ベースscFvの配列(配列番号30)又はその変異体を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0067】

別のさらに特定の実施形態において、抗チロシナーゼ関連タンパク質-1(TYRP1)の配列がTA99ベース抗TYRP1 scFvの配列(配列番号113)又はその変異体を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0068】

別のさらに特定の実施形態において、抗ガングリオシドGD2(GD2)の配列が14G2aベース抗GD2 scFvの配列(配列番号114)又はその変異体を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0069】

特定の実施形態において、タンパク質ドメインが骨髄性細胞によって発現される膜貫通受容体のフラグメントである、本発明によるEVIRを提供する。

【0070】

特定の実施形態において、タンパク質ドメインが、骨髄性細胞によって発現されるGタンパク質共役受容体、そのフラグメント又は変異体を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0071】

特定の実施形態において、タンパク質ドメインが、骨髄性細胞によって発現される、7回膜貫通ドメイン受容体、そのフラグメント又は変異体を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0072】

さらに特定の実施形態において、増殖因子受容体、Fcγ受容体ファミリー、トール様受容体、C-Cケモカイン受容体、或いは、単球及び/又はマクロファージ及び/又はDC細胞の生存、分化、増殖、活性化、成熟、貪食作用、エンドサイトーシス、抗原プロセシング及び提示、T細胞動員、特に他の機能を促進し得る他のシグナル伝達受容体から選択される受容体由来の少なくとも1つの膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含み、任意選択で少なくとも1つの細胞外非ヒンジドメイン、任意選択でヒンジドメインを含むタンパク質ドメインを含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0073】

さらに特定の実施形態において、タンパク質ドメインが、ヒト神経成長因子受容体(配列番号31のタンパク質ドメイン)、FcγRIIIA受容体(配列番号32のタンパク質ドメイン)、受容体チロシンキナーゼFLT3(配列番号33のタンパク質ドメイン)、トール様受容体4(配列番号34のタンパク質ドメイン)、C-Cケモカイン受容体2型(配列番号35のタンパク質ドメイン)、インテグリンベータ鎖ベータ2受容体(配列番号36のタンパク質ドメイン)、コロニー刺激因子-2受容体B(CSF2RB)(配列番号37のタンパク質ドメイン)、ケモカイン受容体CCR1(配列番号38のタンパク質ドメイン)、ケモカイン受容体CCR5(配列番号39のタンパク質ドメイン)、ケモカイン受容体CXCR4(配列番号40のタンパク質ドメイン)及びP-セレクチン糖タンパク質-1リガンド受容体(配列番号41のタンパク質ドメイン)、又はその変異体から選択される受容体由来のヒンジドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0074】

さらに特定の実施形態において、タンパク質ドメインが配列番号35、配列番号38、配列番号39及び配列番号40、又はそのフラグメント若しくは変異体から選択される、本発明によるEVIRを提供する。

【0075】

さらに特定の実施形態において、本明細書に記載されているタンパク質のアイソフォームに由来のタンパク質ドメインを含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0076】

さらに特定の実施形態において、タンパク質ドメインが配列番号79、配列番号82、配列番号85、配列番号88、配列番号91、配列番号92、配列番号95、配列番号98、配列番号99、配列番号100及び配列番号101、又はその変異体から選択されるヒンジドメインを含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0077】

さらに特定の実施形態において、タンパク質ドメインが配列番号80、配列番号83、配列番号86、配列番号89、配列番号93)、配列番号96、及び配列番号102、又はその変異体から選択される膜貫通ドメインを含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0078】

さらに特定の実施形態において、タンパク質ドメインが配列番号81、配列番号84、配列番号87、配列番号90、配列番号94、配列番号97、及び配列番号103、又はその変異体から選択される細胞内ドメインを含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0079】

さらに特定の実施形態において、タンパク質ドメインがヒト神経成長因子受容体、ケモカイン受容体CCR5及びP-セレクチン糖タンパク質-1リガンド受容体から選択される受容体に由来する、本発明によるEVIRを提供する。

【0080】

さらにより特定の実施形態において、タンパク質ドメインが配列番号31、39及び41から選択される配列又はその変異体を含む、本発明によるEVIRを提供する。

【0081】

特定の実施形態によれば、本発明によるEVIRは、細胞膜輸送ドメインを、例えばEVIR配列のN末端に含む。

【0082】

さらに特定の実施形態において、本発明によるEVIRは、IgKドメイン(von Heijne, 2006、前掲)を含む細胞膜輸送ドメインを含む。

【0083】

さらに特定の実施形態によれば、本発明によるEVIRは、配列番号42の細胞膜輸送ドメイン又はその変異体を含む。

【0084】

本発明によるEVIRは、以下の実施例において記載されているように、ポリペプチド発現に関する分子クローニングの任意の公知の方法によって得ることができる。

【0085】

さらに特定の実施形態によれば、本発明のEVIRは、
(i)配列番号27のアミノ酸配列を含む抗HER2 CHA21、
(ii)配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40及び配列番号41から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質ドメイン、
(iii)任意選択で、配列番号104のDNA操作を容易にするアミノ酸配列、並びに、
(iv)配列番号42の細胞膜輸送ドメインIgK
を含む。

【0086】

さらに特定の実施形態によれば、本発明のEVIRは、
(i)配列番号113のアミノ酸配列を含む抗TYRP1、
(ii)配列番号31のアミノ酸配列を含むタンパク質ドメイン、
(iii)任意選択で、配列番号104のDNA操作を容易にするアミノ酸配列、及び、
(iv)配列番号42の細胞膜輸送ドメインIgK
を含む。

【0087】

さらに特定の実施形態によれば、本発明のEVIRは、
(i)配列番号114のアミノ酸配列を含む抗GD2、
(ii)配列番号31のアミノ酸配列を含むタンパク質ドメイン、
(iii)任意選択で、配列番号104のDNA操作を容易にするアミノ酸配列、及び、
(iv)配列番号42の細胞膜輸送ドメインIgK
を含む。

【0088】

さらに特定の実施形態によれば、本発明によるEVIRは、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63及び配列番号64、又はその変異体から選択されるアミノ酸配列を有する。

【0089】

さらに特定の実施形態によれば、本発明によるEVIRは、配列番号132のアミノ酸配列又はその変異体を有する。

【0090】

さらに特定の実施形態によれば、本発明によるEVIRは、配列番号133のアミノ酸配列又はその変異体を有する。

【0091】

さらに特定の実施形態によれば、本発明のEVIRのタンパク質ドメインは、
(i)配列番号79、配列番号82、配列番号85、配列番号88、配列番号92、配列番号95及び101から選択されるアミノ酸配列を含むヒンジドメイン、
(ii)配列番号80、配列番号83、配列番号86、配列番号89、配列番号93、配列番号96及び配列番号102から選択されるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン、
(iii)配列番号81、配列番号84、配列番号87、配列番号90、配列番号94、配列番号97及び配列番号103から選択されるアミノ酸配列を含む細胞内ドメイン
を含む。

【0092】

本発明の核酸
本発明によるEVIRをコードする単離された核酸は、例えば、天然のDNA若しくはRNA、又は組換え若しくは合成のDNA、RNA若しくはLNA、又は本発明による核酸分子のいずれかを単独で若しくは組み合わせて含む、組換え核酸分子であり得る。特定の実施形態において、本発明による核酸分子はcDNAである。

【0093】

特定の実施形態において、細胞外抗体ドメインが、限定するものではないが、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)、チロシナーゼ関連タンパク質-1(TYRP1)、がん胎児性抗原(CEA)、メソテリン、PMEL(gp100)、ガングリオシド(GD2、GD3)及びムチンを含めた、腫瘍関連抗原に対応する少なくとも1つのがん細胞膜結合性分子に特異的な抗体の配列を含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子を提供する。

【0094】

さらに特定の実施形態において、CHA21配列からなる細胞外抗体ドメインを含む本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号1又はその変異体を含む、核酸分子を提供する。

【0095】

さらに特定の実施形態において、CHA21配列からなる細胞外抗体ドメインを含む本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号1を含む、核酸分子を提供する。

【0096】

さらに特定の実施形態において、CHA21配列からなる細胞外抗体ドメインを含む本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号128を含む、核酸分子を提供する。

【0097】

別のさらに特定の実施形態において、トラスツズマブベースscFvからなる細胞外抗体ドメインを含む本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号76を含む、核酸分子を提供する。

【0098】

別のさらに特定の実施形態において、ペルツズマブベースscFv配列からなる細胞外抗体ドメインを含む本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号77を含む、核酸分子を提供する。

【0099】

別のさらに特定の実施形態において、FRP5ベースscFv配列からなる細胞外抗体ドメインを含む本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号78を含む、核酸分子を提供する。

【0100】

別のさらに特定の実施形態において、抗TYRP1 scFv配列からなる細胞外抗体ドメインを含む本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号111を含む、核酸分子を提供する。

【0101】

さらに特定の実施形態において、抗GD2 scFv配列からなる細胞外抗体ドメインを含む本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号112を含む、核酸分子を提供する。

【0102】

さらに特定の実施形態において、ヒト神経成長因子受容体(配列番号43)、FcγRIIIA受容体(配列番号44)、受容体チロシンキナーゼ(配列番号45)、トール様受容体4(配列番号46)、C-Cケモカイン受容体2型(配列番号47)、インテグリンベータ鎖ベータ2受容体(配列番号48)、コロニー刺激因子-2受容体B(配列番号49)、ケモカイン受容体CCR1(配列番号50)、ケモカイン受容体CCR5(配列番号51)、ケモカイン受容体CXCR4(配列番号52)、及びP-セレクチン糖タンパク質-1リガンド受容体(配列番号53)から選択される受容体由来の少なくとも1つの膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子を提供する。

【0103】

別の実施形態において、IgKドメインを含む細胞膜輸送ドメインを含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号2、特に配列番号129を含み、前記EVIRをコードする単離された核酸分子が、CHA21からなる細胞外抗体ドメインをコードする核酸配列(配列番号1)をさらに含む、核酸分子を提供する。

【0104】

別の実施形態において、IgKドメインを含む細胞膜輸送ドメインを含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号129を含み、前記EVIRをコードする単離された核酸分子が、CHA21からなる細胞外抗体ドメインをコードする核酸配列(配列番号128)をさらに含む、核酸分子を提供する。

【0105】

別の実施形態において、IgKドメインを含む細胞膜輸送ドメインを含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号105を含み、前記EVIRをコードする単離された核酸分子が、配列番号76のトラスツズマブベースscFvからなる細胞外抗体ドメイン又は配列番号78のFRP5ベースscFv配列からなる細胞外抗体ドメインをさらに含む、核酸分子を提供する。

【0106】

別の実施形態において、IgKドメインを含む細胞膜輸送ドメインを含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号106を含み、前記EVIRをコードする単離された核酸分子が、配列番号77のペルツズマブベースscFv配列からなる細胞外抗体ドメインをさらに含む、核酸分子を提供する。

【0107】

特定の実施形態において、DNA操作を容易にするアミノ酸配列(例えばクローニング部位)を含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子を提供する。

【0108】

特定の実施形態において、DNA操作を容易にするアミノ酸配列(例えばクローニング部位)を含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子が配列番号107又は配列番号108を含む、核酸分子を提供する。

【0109】

別の実施形態によれば、細胞、好ましくは単球、マクロファージ及び/又はDCにおいて、生存、分化、増殖、活性化、成熟、貪食作用、エンドサイトーシス、M1分極、抗原プロセシング及び提示、T細胞動員、特に他の機能を促進する機能性タンパク質、又はAPCの分化、生存、活性化、及び/又は交差提示(例えばCD40(分化のクラスター40))、GM-CSF(CSF2、コロニー刺激因子2)、I型及びII型インターフェロン(例えばインターフェロンガンマ(IFNγ)、LIN28、若しくはRab34)を誘導し得るか、T細胞(例えば、IL-2又はCXCL9(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド9))を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質をコードする核酸配列を含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子が提供される。

【0110】

別の実施形態によれば、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示(例えばCD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、若しくはRab34)を誘導し得るか、T細胞(例えば、IL-2又はCXCL9)を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子が提供される。

【0111】

別の実施形態によれば、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得る機能性タンパク質、例えばLIN28(Lin28遺伝子によってコードされているタンパク質)をコードする核酸配列を含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子が提供される。

【0112】

別の実施形態によれば、配列番号117(CXCL9)、配列番号120(GM-CSF)、配列番号123(IFNγ)、配列番号126(LIN28)及び配列番号127(CD40)から選択される、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質をコードする核酸配列を含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸分子が提供される。

【0113】

さらに特定の実施形態によれば、本発明のEVIRをコードする単離された核酸は、
(i)抗HER2 CHA21をコードする配列番号1の核酸配列又はその変異体、
(ii)配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52及び配列番号53、又はその変異体から選択されるタンパク質ドメインをコードする核酸配列、並びに、
(iii)細胞膜輸送ドメインIgKをコードする配列番号2の核酸配列又はその変異体
を含む。

【0114】

さらに特定の実施形態によれば、本発明のEVIRをコードする単離された核酸は、
(i)抗TYRP1をコードする配列番号111の核酸配列又はその変異体、
(ii)配列番号43のタンパク質ドメインをコードする核酸配列又はその変異体、及び、
(iii)細胞膜輸送ドメインIgKをコードする配列番号109の核酸配列又はその変異体
を含む。

【0115】

さらに特定の実施形態によれば、本発明のEVIRをコードする単離された核酸は、
(i)抗GD2をコードする配列番号112の核酸配列又はその変異体、
(ii)配列番号43のタンパク質ドメインをコードする核酸配列又はその変異体、及び、
(iii)細胞膜輸送ドメインIgKをコードする配列番号110の核酸配列又はその変異体
を含む。

【0116】

さらに特定の実施形態によれば、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74及び配列番号75から選択される本発明によるEVIRをコードする単離された核酸が提供される。

【0117】

さらに特定の実施形態によれば、配列番号130及び配列番号131から選択される、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸が提供される。

【0118】

さらに特定の実施形態において、本発明のタンパク質ドメインをコードするオルソロガスなヒト配列を含む、本発明によるEVIRをコードする単離された核酸を提供する。

【0119】

細胞形質導入のベクター及び方法
一実施形態において、本発明は、本発明による核酸分子を含む組換え発現ベクターであって、ベクターが任意選択で発現制御配列を含み、前記核酸分子に作動可能に連結されている、コードされた配列を真核生物宿主細胞において発現させることができる、ベクターを提供する。

【0120】

限定するものではないが、染色体、エピソーム、プラスミド及びウイルス由来ベクターを含めた、多数の発現系を使用することができる。より詳しくは、使用される組換えベクターは、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウィルス、パピローマウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、キツネポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)由来であり得る。これらの組換えベクターは、同様にコスミド又はファージミド誘導体であってもよい。

【0121】

一実施形態において、組換えベクターは、レトロウイルスベクター(複製可能及び複製欠損レトロウイルスベクターの両方)、レンチウイルスベクター、特に双方向レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ベクターから選択される任意のウイルスベクターである。

【0122】

特定の実施形態において、組換えベクターはレトロウイルスベクターである。

【0123】

一実施形態において、本発明は、本発明の1つ以上のEVIR配列をコードする核酸分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。

【0124】

一実施形態において、本発明は、細胞、好ましくは単球、マクロファージ及び/又はDCにおいて、生存、分化、増殖、活性化、成熟、貪食作用、エンドサイトーシス、抗原プロセシング及び提示、T細胞動員、特に他の機能を促進する機能性タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。

【0125】

一実施形態において、本発明は、本発明の1つ又は2つ以上のEVIR配列をコードする核酸分子を含み、さらに、細胞、好ましくは単球、マクロファージ及び/又はDCにおいて、生存、分化、増殖、活性化、成熟、貪食作用、エンドサイトーシス、抗原プロセシング及び提示、T細胞動員、特に他の機能を促進する機能性タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸分子をさらに含む、組換え発現ベクターを提供する。

【0126】

特定の実施形態によれば、本発明による発現ベクターはまた、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えばCD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)をコードしていてもよい。

【0127】

特定の実施形態によれば、本発明は、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えばCD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)をコードする核酸分子を含む、組換え発現ベクターが提供される。

【0128】

別の実施形態において、双方向性又は2シストロン性発現ベクターを使用して、本発明による少なくとも1つのEVIRを、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えばCD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)と一緒に共発現させることができる。

【0129】

核酸配列は、当業者に周知の方法、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001に記載されている方法によって、組換え発現ベクターに挿入することができる。

【0130】

組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドの発現及び転写、並びに本発明のEVIRの翻訳を許可、調節又は制御するヌクレオチド配列を含むことができ、それらの配列は使用される宿主細胞に従って選択される。例えば、本発明の核酸分子によってコードされているEVIRが膜に向かうように、適切な分泌シグナルを組換えベクターに組み込むことができる。

【0131】

さらなる実施形態において、本発明による組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0132】

宿主細胞における組換えベクターの導入は、当業者に周知の方法、例えば、Basic Methods in Molecular Biology, Davis et al., 2^nd ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995、及びMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 前掲に記載されているような方法、例えば、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入又は感染などによって行うことができる。

【0133】

別の実施形態において、本発明は、任意選択で、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えばCD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)と共に、EVIRを発現することができるAPCを産生する方法であって、細胞を本発明によるベクター又は核酸と接触させることを含む、方法を提供する。

【0134】

一実施形態によれば、本発明によるEVIRは、任意選択で、前記タンパク質と共時発現されるか、或いは、前記タンパク質の発現は、独立ベクターを使用することによりEVIRを発現するAPCにおいて達成される。

【0135】

特定の態様によれば、APC又はその幹/前駆細胞において、本発明の少なくとも1つのEVIRの発現を誘導するex vivoでの方法(すなわち、培養における)であって、
(i)前記細胞に、本発明によるベクターをex vivoで形質導入するステップ、及び、
(ii)任意選択で、APCの分化、成熟又は活性化を誘導するステップ
を含み、
本発明によるEVIRが、前記APC細胞において、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えば、CD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)と共に発現される、方法が提供される。

【0136】

本発明の別の態様は、本発明の少なくとも1つのEVIRの発現を、その必要のある対象のAPC又はその幹/前駆細胞においてin vivoで誘導する方法であって、
(i)本発明によるEVIRをコードするベクターを、対象のAPC又はその幹/前駆細胞のin vivoでの前記ベクターによる形質導入の誘導に適した条件下で、前記対象に投与するステップ、及び、
(ii)任意選択で、APCの分化、成熟又は活性化をin vivoで誘導するステップ
を含み、
本発明によるEVIRが、前記APC細胞においてin vivoで、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えば、CD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)と共に発現される、方法を提供する。

【0137】

EVIRは、レンチウイルスベクター(又は代替ウイルスベクター若しくは非ウイルスベクター)を使用して、前記EVIRをコードする本発明のベクターの単離されたAPC(若しくはその前駆体)に対するex vivo送達、又は全身(例えば静脈内)のいずれかを介したin vivo送達、又は局所(例えば、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ節等)送達のいずれかでAPCに送達することができる。

【0138】

特に、本発明は、本発明による少なくとも1つのEVIRを発現する抗原提示細胞又はその任意の幹細胞若しくは前駆細胞を産生する方法であって、前記APC又はその幹細胞若しくは前駆細胞、特にDC、単球又はマクロファージを、本発明によるベクター又は核酸とex vivo又はin vivoのいずれかで接触させることを含む、方法を提供する。

【0139】

EVIR発現APC
一実施形態によれば、本発明は、本発明による少なくとも1つのEVIRを発現する抗原提示細胞を提供する。

【0140】

一実施形態によれば、本発明は、本発明による1つのEVIRを発現する細胞を提供する。

【0141】

さらなる実施形態によれば、本発明は、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えば、CD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)と共に、少なくともEVIRを発現する細胞を提供する。

【0142】

特定の実施形態によれば、本発明は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つの本発明の異なるEVIRを発現する細胞を提供する。

【0143】

特定の実施形態によれば、本発明は、少なくとも1つの本発明によるEVIR、例えば、本発明の約1〜約3つの異なるEVIRを発現する細胞を提供する。

【0144】

一実施形態によれば、少なくとも1つの本発明のEVIRを発現するAPCを含む細胞組成物であって、少なくとも1%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%のAPC、特に単球、マクロファージ又はDCが本発明の少なくとも1つのEVIRを発現する、細胞組成物が提供される。

【0145】

さらなる実施形態によれば、少なくとも1%の細胞集団が本発明の少なくとも1つのEVIRを発現する、本発明の細胞組成物が提供される。

【0146】

別の実施形態によれば、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えば、CD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)と共に、少なくともEVIRを発現するAPCを含む、細胞組成物が提供される。

【0147】

一実施形態によれば、EVIRの発現が、本発明のベクターによる送達後、少なくとも数時間持続する、本発明の細胞組成物が提供される。

【0148】

一実施形態によれば、少なくとも1%の細胞集団が本発明の少なくとも1つのEVIRを発現し、前記発現が、本発明のベクターによる送達後、少なくとも数時間持続する、本発明の細胞組成物が提供される。

【0149】

一実施形態によれば、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えば、CD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)の発現が、本発明のベクターによる送達後、少なくとも数時間持続する、本発明の細胞組成物が提供される。

【0150】

一実施形態によれば、EVIRの発現レベル及び時間は、フローサイトメトリー、タンパク質分析又は核酸増幅などの方法によって測定することができる。

【0151】

別の実施形態によれば、本発明は、本発明による細胞であって、前記細胞が、造血幹/前駆細胞を含めた、単球、マクロファージ又は樹状細胞に分化する能力を有する造血細胞である、細胞を提供する。

【0152】

別の実施形態によれば、本発明は、本発明による細胞であって、前記細胞が造血幹細胞及び前駆細胞から選択される、細胞を提供する。

【0153】

別の実施形態によれば、本発明は、本発明による細胞であって、前記細胞が抗原提示細胞(APC)である、細胞を提供する。

【0154】

別の実施形態によれば、本発明は、本発明による細胞であって、前記細胞が単球、マクロファージ又は樹状細胞から選択されるAPCである、細胞を提供する。

【0155】

別の実施形態において、本発明は、少なくとも1つのEVIRを発現する細胞であって、前記細胞が、APCの分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得る少なくとも1つのタンパク質(例えば、CD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得る少なくとも1つのタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)をさらに発現する、細胞を提供する。

【0156】

本発明の少なくとも1つのEVIRを発現する細胞において共発現される場合、CD40は抗原提示細胞及びT細胞活性化を増大するように作用し得ること、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)は、抗原提示細胞及びT細胞の成熟及び活性化を増大するように作用し得ること、LIN28は、microRNA Let-7の成熟を阻止し、マクロファージ及びDCによる活性化及び抗原提示を促進すること(Baer et al., 2016, Nat Cell Biol., 18(7):790-802)、Rab34は、抗原交差提示を増大するように作用し得ること、GM-CSF(CSF2)は、抗原提示細胞及び樹状細胞の分化、成熟及び活性化を増大するように作用し得ること、IL-2は、T細胞増殖を増大するように作用し得ること、CXCL9は、T細胞動員を増大するように作用し得ることを理解されたい。

【0157】

別の実施形態において、本発明は、EVを細胞の細胞質に内在化させることができるEVIR発現細胞を提供する。

【0158】

別の実施形態において、本発明は、本発明のEVIRを発現しない同じ細胞と比較して、がん細胞由来EVの内在化能力が増大され、その特性ががん細胞との接触とは無関係である、EVIR発現細胞を提供する。

【0159】

別の実施形態において、本発明は、EVIRを発現しない細胞と比較して、がん細胞由来EVの内在化が速く、その特性ががん細胞との接触とは無関係である、EVIR発現細胞を提供する。

【0160】

一実施形態によれば、EVIR発現細胞によるEVの内在化レベル及びキネティックスは、フローサイトメトリー及びタンパク質分析などの方法によって測定することができる。

【0161】

別の実施形態において、本発明は、取り込み、プロセシング、T細胞腫瘍関連抗原(TAA)への提示が、それらのTAAの事前同定を必要とすることなく可能である、EVIR発現細胞を提供する。

【0162】

別の実施形態において、本発明は、CD8^＋ T細胞へのTAA交差提示を容易にする、EVIR発現細胞を提供する。

【0163】

別の実施形態において、本発明は、EVIRを発現しない細胞と比較して、EV結合TAAのT細胞に対する提示が(TAAのレパートリーの観点から、また各TAAの量の観点から)増大されたEVIR発現細胞を提供する。

【0164】

一実施形態によれば、本発明の細胞によって達成されるT細胞へのTAAの提示レベルは、フローサイトメトリー、タンパク質分析、及びT細胞増殖/活性化アッセイなどの方法によって測定することができる。

【0165】

別の実施形態において、本発明は、T細胞増殖を誘導する本発明による細胞を提供する。

【0166】

別の実施形態において、本発明は、EVIRを発現しない細胞と比較して、T細胞増殖を誘導する能力が増大された本発明による細胞を提供する。

【0167】

一実施形態によれば、T細胞増殖は、フローサイトメトリー、細胞周期分析、T細胞抑制及び混合白血球反応(MLR)などの方法によって測定することができる。

【0168】

本発明による方法及び使用
本発明は、任意選択で、本発明による抗原提示細胞(APC)又はその幹細胞若しくは前駆細胞において、分化、生存、活性化及び/又は交差提示を誘導し得るタンパク質(例えば、CD40、GM-CSF(CSF2)、I型及びII型インターフェロン(例えばIFNγ)、LIN28、若しくはRab34)か、T細胞を誘引及び/又は活性化し得るタンパク質(例えば、IL-2又はCXCL9)と共に、EVIRの発現を誘導する方法を提供する。

【0169】

本発明の特定の1つの方法において、APC分化は、当業者に周知の細胞培養条件下で、APC前駆体、例えば単球を暴露することを含む方法に従って実施することができる。

【0170】

特定の実施形態において、本発明は、APCにおいてEVIRの発現を誘導する方法であって、前記細胞に、本発明によるベクターをトランスフェクト又は形質導入するステップを含む、方法を提供する。

【0171】

別の実施形態において、本発明によるEVIR発現TAA提示細胞を調製するex vivoでの方法であって、提供されるEVが、腫瘍又は血液サンプルのいずれかから単離された腫瘍由来の粒子、例えばエキソソーム及び他の小胞である、方法を提供する。

【0172】

別の実施形態において、本発明によるEVIR発現TAA提示細胞を調製するex vivoでの方法であって、APC及びがん細胞又はEVが共培養され、EVがex-vivo培養されたがん細胞に由来する、方法を提供する。

【0173】

特定の実施形態によれば、本発明によるEVIR発現TAA提示細胞は、がんの対象に注入することができるが、任意選択で、APCの分化、成熟又は活性化をin vivoで誘導することができ、本発明による治療法において有用であり得る。

【0174】

一実施形態において、本発明のEVIR発現細胞においてTAAの提示を誘導するin vivoでの方法であって、EVIR発現ベクターを、全身経路(例えば、静脈内)又は局所経路(例えば、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ節等)を介してがんの対象に送達するステップを含む、方法を提供する。

【0175】

別の実施形態において、対象のがん細胞に免疫応答を誘導する方法であって、本発明によるEVIR発現ベクター又は細胞を、それを必要とする患者に投与するステップを含み、前記EVIR発現ベクター又は細胞が単独で投与されるか、がん細胞との共培養において前処理されるか、がん細胞由来のEV、特にエキソソームとの共培養において前処理されるか、或いは別の抗がん治療と組み合わせて投与される、方法を提供する。DCワクチン接種手順で使用される標準的な手順を使用することができる。

【0176】

特定の実施形態において、がん細胞又はがん細胞由来のEVは自己由来であり、すなわち、処置しようとする患者起源である。

【0177】

特定の実施形態において、APC又は幹/前駆細胞は自己由来であり、すなわち、処置しようとする患者起源である。

【0178】

特定の実施形態において、本発明は、本発明によるMHCI又はMHCII分子にロードされた新規TAAを同定する方法であって、新規TAAの同定がプロテオミクス法によって実施される、方法を提供する。

【0179】

別の態様において、本発明は、がんを処置及び/又は予防するワクチンの調製における本発明による細胞の使用を提供する。

【0180】

特定の態様によれば、本発明のEVIRは、遊離の(ロードされていない)TAAを含む、がん細胞由来のEVの取り込みに有用である。

【0181】

別の特定の態様によれば、本発明のEVIRは、MHCI又はMHCII分子に既にロードされたTAAを含む、がん細胞由来のEVの取り込みに有用である。

【0182】

本発明の別の態様は、本発明の少なくとも1つのEVIRを発現し、MHCI又はMHCII分子を介してロードされていないTAAを提示し得る、単離された細胞に関する。

【0183】

本発明の別の態様は、本発明の少なくとも1つのEVIRを発現し、MHCI又はMHCII分子に既にロードされたTAAを提示し得る、単離された細胞を提供する。

【0184】

APC-TAAを使用する現時点での既存のアプローチは、内生的に、すなわち患者の体内において、また患者の腫瘍に由来したTAAを取り込み、提示するようにAPCに指示する設計はされておらず、その代り、腫瘍由来の材料へのex vivoでの暴露に依存していることに留意されたい。したがって、本発明によるEVIR発現ベクター又は細胞、及びそれらを使用する方法は、免疫療法並びに/或いはがんの予防及び/又は処置における既存のアプローチよりも特段に有利である。

【0185】

本発明による組成物
本発明による医薬組成物又は製剤は、本明細書に記載されているEVIR発現ベクター又は細胞を含有する医薬製剤として投与することができる。

【0186】

本発明の別の態様は、本発明の細胞、並びにin vivoでのAPCの分化、成熟及び/又は活性化を促進し得る少なくとも1つの薬学的に許容される薬剤を含む、医薬組成物を提供する。

【0187】

本発明は、対象、好ましくは哺乳動物の対象、最も好ましくはがんに罹患しているヒト患者を処置する組成物としての医薬又は治療用細胞及び方法を提供する。

【0188】

本発明の細胞又はその製剤は、本明細書に記載されているいずれかの形態の本発明による1つ以上の共助剤(co-agent)を含み得る医薬製剤として投与することができる。本発明による組成物は、従来使用されているアジュバント、担体、希釈剤又は賦形剤と共に、医薬組成物及びその単位用量の形態に入れられ、そのような形態において、固体、例えば錠剤又は充填カプセルとして、又は液体、例えば溶液、懸濁液、エマルション、エリキシルとして、又はそれらが充填されているカプセルとして、経口使用のすべて、又は注射又は連続注入による非経口使用の滅菌注射溶液の形態として用いることができる。注射用組成物は、典型的には、注射可能な無菌生理食塩水若しくはリン酸緩衝化生理食塩水、又は当分野で公知の他の注射用担体をベースとする。このような医薬組成物及びその単位剤形は、追加の活性化合物又は成分の有無にかかわらず、従来の比率で成分を含むことができ、そのような単位剤形は、使用しようとする用量範囲に相応する任意の適切な有効量の有効成分を含有し得る。

【0189】

本発明の組成物は、限定するものではないが、水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルション、シロップ及びエリキシルを含めた液体製剤であってもよい。本組成物はまた、使用前に、水又は他の適切なビヒクルで再構成する乾燥製品として製剤化することができる。このような液体製剤は、限定するものではないが、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル及び保存剤を含めた添加剤を含有することができる。懸濁剤としては、限定するものではないが、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース/糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、及び水素化食用油脂が挙げられる。乳化剤としては、限定するものではないが、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン及びアラビアゴムが挙げられる。防腐剤としては、限定するものではないが、メチル又はプロピルp-ヒドロキシベンゾエート及びソルビン酸が挙げられる。分散剤又は湿潤剤としては、限定するものではないが、ポリ(エチレングリコール)、グリセロール、ウシ血清アルブミン、Tween(登録商標)、Span(登録商標)が挙げられる。

【0190】

本発明の組成物はまた、デポー製剤として製剤化することもでき、これは移植又は筋肉内注射によって投与することができる。

【0191】

本発明の化合物はまた、持続放出形態又は持続放出薬物送達システムで投与することもできる。

【0192】

特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、静脈内使用のものである。

【0193】

特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、腫瘍内使用のものである。

【0194】

特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、皮下使用のものである。

【0195】

特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、胸腔内使用のものである。

【0196】

特定の態様によれば、本発明の組成物はワクチン組成物である。

【0197】

特定の態様によれば、ワクチン組成物は、CpGオリゴヌクレオチド(シトシン三リン酸デオキシヌクレオチド(「C」)に続いてグアニン三リン酸デオキシヌクレオチド(「G」)を含む短い一本鎖合成DNA分子、「p」は連続するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を意味する)、ジフテリア毒素、増殖因子(非限定的な例:M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)、GM-CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)、FLT3(FMS様チロシンキナーゼ-3)、及び/又はサイトカイン(非限定的な例:IFNγ(インターフェロンガンマ)、CXCL9(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド9)、IL12(インターロイキン12)、IL2(インターロイキン2)、IL-4(インターロイキン4))の中から選択される1つ以上の共助剤を含み得る。

【0198】

別の特定の態様において、本発明による組成物は、単回投与による送達に適合する。

【0199】

特定の実施形態によれば、本発明の組成物は獣医学用組成物である。

【0200】

さらなる材料及び製剤化の処理技術などは、Remingtonの"The Science and Practice of Pharmacy", 22^ndEdition, 2012, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkinsの第5部に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れる。

【0201】

別の態様において、本発明は、本発明によるベクターを含む組成物を提供する。

【0202】

別の態様において、本発明は、本発明によるEVIR発現細胞を含む組成物を提供する。

【0203】

投与方式
本発明による細胞及びその製剤は、非経口、静脈内、腫瘍内、皮下、皮膚内、直腸内、手術中の直接組織灌流、又はそれらの組み合わせを含めた任意の方法で投与することができる。非経口投与としては、限定するものではないが、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下及び筋肉内が挙げられる。本発明の組成物はまた、インプラントの形態で投与することができ、これは組成物の徐放及び徐放性i.v.輸液を可能にする。

【0204】

組み合わせ
本発明によれば、本発明のベクター及び細胞並びにその医薬製剤は、単独で、或いはがんの予防及び/又は処置に有用な共助剤、例えば、適応性のある免疫系の腫瘍に対する活性を増大する治療抗体(例えば、抗PD1、抗PDL1、抗CTLA4抗体など)、先天性免疫系の腫瘍に対する活性を増大する治療抗体若しくはTLRアゴニスト(例えば抗CD40抗体)、内在性単球、マクロファージ又は樹状細胞を枯渇させる治療抗体若しくは小分子阻害物質(例えば抗CSF1R阻害物質)と組み合わせて投与することができ、したがって、本発明のEVIR発現細胞によるEVの移植及び取り込みに有利である。

【0205】

また本発明による細胞は、本出願で定義されているように、がん細胞死滅及びがん細胞由来のEVの放出を増大させる既知の化学療法、放射線療法と組み合わせることもできる。

【0206】

本発明は、本発明によるベクター若しくは細胞、その医薬製剤又は組成物の投与を包含し、前記ベクター若しくは細胞又は組成物は、治療有効量のがんの予防及び/又は処置に有用な他の治療レジメン、共助剤の前に、それらと同時に又は逐次的に、個体に投与される。

【0207】

前記共助剤と同時に投与される、本発明による細胞若しくは組成物、又はその医薬製剤は、同一か異なる組成物(複数可)で、同一か異なる投与経路(複数可)によって投与することができる。

【0208】

キット
本発明の別の態様によれば、本発明による少なくとも1つの組換え発現ベクター及び/又は少なくとも1つの細胞、並びに任意選択で説明材料を含むキットが提供される。

【0209】

別のさらなる実施形態によれば、本発明によるキットは、少なくとも1つの組換え発現ベクターを含み、さらに、抗原提示細胞又はその幹/前駆細胞に、前記組換え発現ベクターを形質導入する少なくとも1つの薬剤を含む。

【0210】

別のさらなる実施形態によれば、本発明によるキットは、本発明によると少なくとも1つの細胞を含み、さらに、前記細胞、及び/又は前記細胞とがん細胞のがん由来EVとの培養物を保存する少なくとも1つの薬剤を含む。

【0211】

患者
一実施形態において、本発明による患者は、任意のタイプのがんに罹患している。一実施形態において、本発明による患者は、非転移性及び転移性を含めた任意のステージの任意のタイプのがんに罹患している。

【0212】

特定の実施形態において、本発明による患者は、癌腫、肉腫、メラノーマ、脳腫瘍、血液がん、又は任意の前がん性若しくは悪性新生物に罹患している。

【0213】

本明細書で引用されている参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み入れる。本発明は、本発明の個別の態様の単なる例示とする、本明細書に記載の特定の実施形態及び図面によって範囲が限定的されることはなく、また機能的に同等の方法及び構成要素は本発明の範囲内である。

【実施例】

【0214】

以下の略語はそれぞれ以下の定義を意味する:
293T細胞(ヒト胎児腎臓細胞);B4GALNT1(ベータ-1,4-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ1、GD2シンターゼ);B16細胞(マウスメラノーマ腫瘍細胞株);BM(骨髄);BMDC(骨髄由来樹状細胞);BMDM(骨髄由来マクロファージ);CCR1(ケモカイン受容体1型);CCR2(C-Cケモカイン受容体2型);CCR5(ケモカイン受容体5型);CSF2(コロニー刺激因子2);CSF2RB(コロニー刺激因子-2受容体B);CXCR4(ケモカイン受容体CXCR4);CD40(分化のクラスター40);DC(樹状細胞);CXCL9(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド9);EC(細胞外ドメイン);EV(細胞外小胞);dLNGFR(トランケート型ヒト低親和性神経成長因子受容体);EVIR(細胞外小胞内在化受容体);FLT3(受容体チロシンキナーゼ);GD2(ガングリオシドGD2);GFP(緑色蛍光タンパク質);iBMM(不死化マウス骨髄由来マクロファージ);IC(細胞内ドメイン);IFNγ(インターフェロンγ);ITGB2(インテグリンベータ鎖ベータ2受容体);LIN28(LIN28遺伝子によりコードされているタンパク質);LV(レンチウイルスベクター);MC38(結腸癌細胞株);mTq(ターコイズ蛍光タンパク質);OVA(オボアルブミン);MFI(平均蛍光強度);P388D1(リンパ腫から単離されたマウス単球細胞株);PM(腹膜マクロファージ);SELPLG(P-セレクチン糖タンパク質-1リガンド受容体);SFFV(脾限局巣形成ウイルス);ST8SIA1(ST8アルファ-N-アセチルノイラミニドアルファ-2,8-シアリルトランスフェラーゼ1、GD3シンターゼ);TLR4(トール様受容体4);TM(膜貫通ドメイン);TYRP1(チロシナーゼ関連タンパク質-1);UT(非形質導入)。

【0215】

[実施例1]
細胞外小胞内在化受容体の設計
11種の異なるEVIR分子を以下のように設計した。
EVIRのクローニング設計
11種の膜貫通受容体を選択し、それらの細胞内(IC)ドメイン、膜貫通(TM)ドメイン及びショート細胞外(EC)ドメインを、CHA21と呼ばれるHER2特異的scFvのDNAコード配列(配列番号128)(がん細胞の表面分子に特異的な細胞外抗体ドメイン)と組み合わせてクローニングした。

【0216】

選択された膜貫通受容体由来のDNAコード配列は、ヒト神経成長因子受容体(dLNGFR、配列番号43)、FcγRIIIA受容体(先天性免疫系の細胞によって発現されるFcγ受容体ファミリーのメンバー、配列番号44)、受容体チロシンキナーゼ(FLT3、配列番号45)、トール様受容体4(TLR4、配列番号46)、C-Cケモカイン受容体2型(CCR2、配列番号47)、インテグリンベータ鎖ベータ2受容体(ITGB2、配列番号48)、コロニー刺激因子-2受容体B(CSF2RB、配列番号49)、ケモカイン受容体CCR1(配列番号50)、ケモカイン受容体CCR5(配列番号51)、ケモカイン受容体CXCR4(配列番号52)、P-セレクチン糖タンパク質-1リガンド受容体(SELPLG、配列番号53)であった。

【0217】

マウス最適化CHA21をコードするDNA配列(配列番号128)は、GeneArt(登録商標)(Life Technologies)から得た。IgKシグナルドメインのコードDNA配列(配列番号129)を組み込み、受容体の膜への輸送を増加させた。高効率Kozak配列及びクローニング用の制限部位を含有するリンカー配列(配列番号3)を、EVIRコード配列の5'末端に組み込んだ。制限酵素部位及び停止コドン(配列番号4)を、STOPコドン、EVIRの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインのDNA配列の前で、クローニング用のscFv配列の3'末端に組み込んだ。

【0218】

FcγRIIIaのDNAコード配列は、GeneArt(登録商標)(Life Technologies)から得た。リンカー配列は、FcγRIIIaコード配列の5'(配列番号5)及び3'(配列番号6)末端の配列に付加した。

【0219】

dLNGFRのDNAコード配列は、dLNGFR及びGFPを発現するレンチウイルスベクター(LV)からPCRによって得た(Amendola et al., 2005, Nat biotechnol, 23(1): 108-16)。Agel及びMluIに対する制限部位を含有するプライマーは、表1に明示したように使用した。FLT3のDNAコード配列は、実施例2に記載されているBM由来DCのcDNAからPCRにより取得し、Agel及びXhoIに対する制限部位を含有するプライマーを使用した。マウスTlr4、Ccr2、Itgb2、Csf2rb、Ccr1、Ccr5、Cxcr4、Selplg受容体のDNAコード配列は、実施例2に記載されている腹腔マクロファージのcDNAからPCRにより取得し、AgeI、XmaI、MluI及びSalIに対する制限部位を含有するプライマーを使用した。

【0220】

【表1】

【0221】

CHA21をコードする合成DNA配列は、脾限局巣形成ウイルス(SFFV)プロモーター及びWPRE安定化配列(Squadrito et al., 2012, Cell Rep, 1(2): 141-54)を含むLVに挿入した。この目的のため、CHA21をBamHI及びXhoIと共に含むプラスミド、並びにSFFV.miR-511-3p.OFP.WPRE(Squadrito et al., 2012、前掲)を含むプラスミドをBamHI及びSalIで消化した。次いで、選択した受容体のIC、TM及びECドメインを、対応するプライマー中に存在する制限酵素で、上記のPCR産物を消化することにより挿入した。

【0222】

EVIR発現を追跡するため、得られたSFFV.EVIR.WPRE配列は、EcoRV及びAvrII制限部位を含むSFFV.EVIRカセットでhPGK.dLNGFRカセットを置き換えることにより、双方向LV(Amendola et al., 2005、前掲)にクローニングした。この双方向LVにおいて、GFPはミニマルサイトメガロウイルスプロモーター(mCMV)の転写制御下で発現される。

【0223】

骨髄由来マクロファージ(BMDM)又は腹腔マクロファージのいずれかから得た全RNAは、製造業者の指示のとおり、miRNeasy RNAキット(Qiagen)を使用することにより単離した。次いで、製造業者の指示のとおり、Vilo逆転写酵素(Life Technologies)を使用してcDNAを得た。cDNA又はプラスミドは、製造業者の指示のとおり、Pfu ultra II(Agilent Technologies)ポリメラーゼを使用し、PCRにより増幅させた。プライマーは上記に記載されている。PCRはSensoQuest GmbH labcyclerで実施し、High Pure PCR産物精製キット(Roche)を使用して精製した。アンプリコンを1%アガロースゲルでランニングさせた後、Jetquickゲル抽出スピンキット(Genomed)を使用してそれらを抽出した。MiniPrepは、NucleoSpinプラスミドキット(Macherey-Nagel)を使用して実施した。

【0224】

EVIRを発現させるため、ミニマルサイトメガロウイルス(mCMV)プロモーターの転写制御下で、アンチセンス方向にGFP配列を発現し、脾限局巣形成ウイルス(SFFV)プロモーターの転写制御下で、センス方向に抗HER2 EVIRを発現する双方向レンチウイルスベクター(LV)を使用した(図1)。得られたLVを同定し、EVIRの細胞内成分(細胞外ドメイン、CHA21、定常)によって以下のように命名した:EVIR-N(dLNGFR-CHA21)、EVIR-G(FcγRIIIa-CHA21)、EVIR-F(FLT3-CHA21)、EVIR-T(TLR4-CHA2)、EVIR-C2(CCR2-CHA21)、EVIR-I(ITGB2-CHA21)、EVIR-C(CSF2RB-CHA21)、EVIR-C1(CCR1-CHA21)、EVIR-C5(CCR5-CHA21)、EVIR-CX(CXCR4-CHA21)、EVIR-S(SELPLG-CHA21)。

【0225】

[実施例2]
抗HER2 EVIRの発現及び安定性
異なる細胞におけるEVIRの安定性及び発現プロファイルを試験した。

【0226】

不死化マウス骨髄(BM)由来のマクロファージ(iBMM)は、既に記載されている(Squadrito et al., 2014, Cell Rep., 8(5):1432-46)。

【0227】

簡潔に説明すると、細胞は、マウスBM細胞に、癌原遺伝子SV40ラージT抗原を発現するLVを形質導入することによって得た。iBMMは、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、50ng/ml)を補充したマクロファージ無血清培地(SFM培地、Life Technologies)中で培養した。次いで、M-CSF(50ng/ml)、20%ウシ胎児血清(FBS、EuroClone Group)、5.5mLのL-グルタミン(Life Technologies)、及び5.5mlのペニシリン-ストレプトマイシン(Life Technologies)を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM、Sigma-Aldrich)中でiBMMを培養した。

【0228】

マウス単球細胞株(P388D1)及び結腸癌細胞株(MC38)は、上述したように、10%FBS、グルタミン及びペニシリン-ストレプトマイシンを補充したIMDM中で培養した。

【0229】

腹腔マクロファージ(PM)、骨髄由来樹状細胞(BMDC)及び骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、5〜6週のBL6C57マウスから単離した。

【0230】

PMは、安楽死させたマウスの腹膜をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗い流すことにより得た。M-CSF(50ng/ml)を補充したIMDMを含むプレートに細胞を播種し、1時間後に非接着細胞を廃棄した。BMDM及びBMDCは、PBSで大腿骨及び脛骨を洗い流すことにより得た。次いで、BMDMについては、M-CSF(50ng Preprotech)を、又はBMDCについてはGM-CSF(100ng、Preprotech)をそれぞれ補充したIMDM又はRoswell Park Memorial Institute (RPMI)培地で、BM細胞を8日間培養した。

【0231】

293T細胞のトランスフェクション及び細胞形質導入によるレンチウイルスベクターの産生
水疱性口内炎ウイルス(VSV)-偽型の第3世代レンチウイルスは、既に記載されているように(De Palma et al., 2002, Methods in enzymology, 346: 514-529)、ヒト胎児性腎臓細胞(293T)への一過性4プラスミド同時トランスフェクションによって産生した。簡潔に説明すると、900万個の293T細胞を15cmの皿に播種し、24時間後に20mlの培地中でトランスフェクションした。トランスフェクションの2時間前に培地を変えた。1プレート当たり、エンベロープENVプラスミド(VSV-G、9μg)、pMDLg/pRREプラスミド(12.5μg)、REVプラスミド(6.25μg)、pADVANTAGE(15μg)及び転移プラスミド(32μg)を用いてプラスミドDNA混合物を調製した。125μlの2.5M CaCl₂をプラスミド混合物に添加し、0.1 TE/dH₂O(2:1)を使用して1125μlの最終容量を得た。この溶液を全速でボルテックスしながら、1125μlの2×HBS溶液(pH7.12)を滴下添加した。最後のHBS及びプラスミド溶液を細胞上に速やかに移した。培地を12〜14時間後に交換し、1皿当たり16mlの新鮮な培地を加えた。細胞上清を30時間後に回収し、濾過し(0.22μm)、SW31Tiローターを備えたBeckman超遠心分離機を使用し、20℃で2時間、22,000rpmで超遠心分離することにより濃縮した。試薬組成物は以下のとおりであった:2×HBS(281mM NaCl、100mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES緩衝液)、1.5mM Na₂HPO₄)、0.1×TE緩衝液(10mMトリス(pH8.0)、蒸留H₂Oで1:10に希釈した1mM EDTA(pH8.0)。LVのストックは-80℃で維持した。

【0232】

LV(すべて蛍光タンパク質を発現する)は、形質導入の前日に6ウェルプレートに播種した100,000個の293T細胞に対して10-3〜10-7の範囲で希釈することにより力価測定した細胞であった。陽性細胞のパーセンテージは、形質導入の4〜7日後にフローサイトメトリーによって測定した。力価は、式:TU/ml=「細胞数」^*「陽性細胞パーセンテージ」/100/「希釈率」を適用して計算した。式で使用した「陽性細胞パーセンテージ」は、常に、値が15%未満の最も低い希釈率であった。293T、P388D1及びiBMMは、10⁶〜10⁷の形質導入単位(TU/ml)の範囲のLV用量で形質導入された。二重形質導入の実験(例えば、HER2発現LV及びmCherry発現LV)において、連続形質導入は、i)細胞にHER2発現LVを形質導入し、ii)細胞を洗浄し、再度プレーティングし、iii)最初の形質導入の5〜7日後、細胞にmCherry-発現LVを形質導入して実施した。

【0233】

iBMMの免疫蛍光分析
EVIR/対照-形質導入iBMMを、フィブロネクチン(200μg/μl、Peprotech)で被覆したガラスカバースライドに播種した。培地を除去した翌日、細胞をPBSで1分間、3回洗浄した。iBMMを4%パラホルムアルデヒド(PFA)中、室温で暗所にて15分間、固定した。PFAを除去した後、PBSによる洗浄を1分間3回実施した。次いで、細胞をブロッキング溶液(PBS中、0.1%トリトン及び10%正常ヤギ血清(NGS))中で30分間インキュベートした。次いで、Alexa Fluor 647(Jackson ImmunoResearch)とコンジュゲートさせた抗F(ab')2抗体を含む染色溶液をブロッキング溶液で調製した。1ウェル当たり200μlの染色溶液を4時間添加した。染色溶液を除去し、スライドをPBS 3×で3分間洗浄した。ブロッキング溶液中のPhalloidin-Alexa Fluor 546(Life Technologies)を20分間添加した。次いで、スライドをPBSで3回洗浄し、最後に4'，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を10分間添加し、3分間5回洗浄した。DAKOマウント培地を加え、サンプルを室温で一晩乾燥させた。画像は、共焦点顕微鏡法(Zeiss LSM 700 INVERT)によって得た。

【0234】

フローサイトメトリー分析
形質導入及び細胞培養の後、細胞をトリプシンで分離し、フローサイトメトリー分析前に適切な抗体で染色した。

【0235】

EVIR-Nの発現を確認するため、ヒト腎臓細胞(293T細胞)、不死化骨髄マクロファージ(iBMM)及び単球(P388D1細胞)に、EVIR-N LV、又は対照LVとして、(細胞外scFvドメインなしで)GFP及びdLNGFRを発現する双方向LVを形質導入した。EVIR-N発現を測定するため、形質導入した細胞を、EVIRのscFvドメインを認識する抗F(ab')2抗体で染色した。すべての細胞タイプにおけるEVIR-Nの顕著な表面発現が観察された(図2)。

【0236】

iBMMの免疫蛍光染色分析により、細胞表面での顕著なEVIR-N発現が確認された(図3B)。

【0237】

EVIR-N発現単球/iBMMの長期間(形質導入後5週間)にわたる安定性を分析した。形質導入された細胞の持続性を示すGFP発現は、5週間の時間ウィンドウの間、P388D1及びiBMM細胞の両方において安定的であった(図4)。

【0238】

膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む個別のタンパク質ドメインのレパートリーを特徴とするさらなるEVIR(上記で列挙したもの)を試験した。抗HER2 EVIRが持続的に発現され得るか否かを調べるため、本発明者らは、形質導入したiBMM及びP388D1単球に、様々なGFP/EVIR及び対照のGFP/dLNGFR LVを形質導入した。フローサイトメトリーは、細胞膜での異なるEVIRの不均一な発現を示し、これは、試験したEVIR又は細胞タイプに依存した(図3A)。EVIR-Nはいずれの細胞タイプによっても顕著に発現されたが、他のEVIR、例えば、EVIR-C、EVIR-CX及びEVIR-Iなどはあまり効率的に発現されなかった。いくつかのEVIRは、2つの細胞タイプの間で差異のある発現を示し、例えば、EVIR-Gは、P388D1細胞において高度に発現されたが、iBMMではそれほど発現されなかった。EVIR-N、EVIR-G、EVIR-T又は対照LVを形質導入したiBMMの免疫蛍光分析は、これらのEVIRが様々なレベルであるにもかかわらず検出可能に発現されることをさらに示した(図3B)。長期間(形質導入後5週間)にわたるEVIR発現の安定性を調べた。ほとんどのEVIRにおいて、GFP発現は、5週間の時間ウィンドウの間、iBMM及びP388D1細胞株において安定的であった(図4)。少なくとも1%の任意の細胞タイプ、好ましくは単球、マクロファージ又は樹状細胞(DC)の集団がEVIRを発現する場合、またこの発現が形質導入後数週間検出可能である場合、EVIRの良好な発現が達成されることに留意されたい。

【0239】

まとめると、これらの結果は、LVを使用して、単球及びマクロファージ系細胞を含めた、いくつかの細胞タイプの膜上の抗HER2 EVIRを安定的に発現させることができることを示唆している。

【0240】

[実施例3]
抗HER2 EVIRは、がん細胞への単球/マクロファージの結合を増大する
単球/マクロファージの結合に対する細胞内のEVIR発現を試験した。

【0241】

共培養における結合アッセイ
HER2を発現するターコイズ蛍光タンパク質(mTq)陽性MC38は、mTq⁺MC38に、PGKのGFPコード配列を置換することによって得られたHER2発現LVを形質導入することによって得た。Leto et al., 2015(Clin Cancer Res. 21(24):5519-31)に記載されているHER2コード配列を有するGFP LVは、Amendola et al., 2005(Nat biotechnol, 23(1): 108-16)に記載されているとおりである。HER2形質導入又は非形質導入のmTq+MC38は、標準プロトコルに従って分離し、24ウェルプレート(Corning Costar)に20,000細胞/ウェルで播種した。24時間後、mCherry又はGFP(EVIR)発現LVのいずれかを形質導入したiBMMを、標準プロトコルに従い分離した。20,000個のmCherry+及びGFP+の細胞を約1:1の比率で混合し、mTq+MC38細胞の上に播種した。共培養の24時間後、両細胞タイプをトリプシンで分離し、7-AADで染色し、フローサイトメトリー(LSRII、BD)により分析した。

【0242】

懸濁液における結合アッセイ
対照又はEVIR-N LV及びmCherry MC38(HER2-LVを形質導入又はUT)のいずれかを形質導入したP388D1を分離し、標準プロトコルに従い洗浄し、最終体積30μl中5,000細胞/μlの濃度になるようにIMDMに再懸濁した。0.5mlチューブ(エッペンドルフ)中で、細胞を異なる比率(1:10、1:1及び10:1)で混合し、3時間20rpmで回転ホイールに置いた。細胞の混合物を暗所で4℃にて保持し、受容体の内在化及び蛍光スケルチを回避した。インキュベーション時間の後、30μlの7-AAD 2Xを加え、細胞懸濁液をフローサイトメトリー(LSRII、BD)により分析した。

【0243】

EVIR-N発現がHER2発現がん細胞への単球/マクロファージ結合を促進するか否かを試験した。この目的のため、結腸がんMC38細胞に、HER2発現LVの有無にかかわらず、ターコイズ蛍光タンパク質(mTq)発現LVに形質導入した。これ以降HER2⁺ mTq⁺ MC38細胞と称する二重形質導入MC38細胞は、69% HER2/mTq二重陽性であったが、対照mTq+MC38細胞は79% mTq陽性であった。並行して、iBMMに、EVIR-N/GFP又はmCherry発現LV(これ以降、それぞれ、EVIR⁺ GFP⁺、及びmCherry+iBMMと称する)のいずれかを形質導入した。iBMMの形質導入効率は、それぞれEVIR-N/GFP及びmCherry発現LVについて78%及び97%であった。次に、HER2⁺ mTq⁺又はmTq⁺ MC38細胞のいずれかとのEVIR-N⁺GFP⁺及びmCherry⁺ iBMM(1:1)の混合集団を高密度で共培養した。このアッセイにおいて、mTq+GFP+又はmTq+mCherry+二重陽性細胞の存在は、iBMMとMC38がん細胞との間の結合/凝集の指標である。EVIR-N⁺ GFP⁺ iBMMは、HER2⁺mTq⁺ MC38細胞に効率的に結合することができることが確認された。mTq⁺GFP⁺事象の発生は、EVIR-N発現iBMM及びHER2⁺ MC38がん細胞が共培養物中に存在する場合にのみ存在した(図5A)。反対に、mCherry+iBMMは、mTq⁺又はHER2⁺mTq⁺MC38細胞のいずれにも結合せず、このことは、マクロファージが抗HER2 EVIR-Nを介してMC38がん細胞に特異的に結合することを示唆している。さらに、EVIR-N⁺GFP⁺ iBMMは、HER2陰性MC38細胞に結合せず、このことは、HER2ががん細胞の表面上に発現される場合にのみ結合が生じることを示唆している。mTq⁺GFP⁺二重陽性事象のレトロゲーティングは、それらが物理的パラメータープロットの非一重項細胞領域に入り、結合/凝集を示し、二重蛍光源として細胞貪食を排除することを示した。

【0244】

次に、EVIR-N発現P388D1細胞が細胞懸濁アッセイにおいてもHER2⁺ MC38細胞に迅速に結合できるか否かを調べた。この目的のため、まず、HER2⁺又はHER2^- MC38細胞に、LV発現mCherryを形質導入した。次に、P388D1細胞に、EVIR-N又は対照LV(いずれもGFPを発現する)を形質導入した。形質導入の数日後、HER2を発現又は非発現するmCheery⁺ MC38細胞を、4℃で2時間、EVIR-N又はdLNGFRのいずれかを発現するGFP+P388D1細胞と共インキュベートし、食作用又は非特異的結合を回避した。共培養でiBMMを用いて得られたデータと一致して、EVIR-Nの発現が、低単球濃度及び高単球濃度の両方で、HER2陽性がん細胞へのP388D1細胞の結合を大幅に増大することが確認された(図5B)。細胞の共焦点分析は、フローサイトメトリーによって測定された二重陽性事象の大部分が、実際に両方の細胞タイプを含む凝集体であることを明確にした。

【0245】

次に、共培養実験は、上記のような、HER2発現MC38細胞へのEVIR発現iBMMの結合をアッセイするために実施した。特にEVIR-N、EVIR-C2、EVIR-F、EVIR-C1又はEVIR-C5を使用した場合、EVIR⁺ GFP⁺ iBMMは、HER2+mTq+MC38細胞に効率的に結合できることが確認された(図5A)。

【0246】

これらの結果は、単球/マクロファージによって発現される抗HER2 EVIRが、HER2-がん細胞へのそれらの結合を促進することを明らかにしている。

【0247】

[実施例4]
抗HER2 EVIRは、EV内在化を介して腫瘍抗原取り込みを増大する
次に、単球、マクロファージ又は他のAPCによって発現される抗HER2 EVIRが、がん細胞由来細胞外小胞(EV)に含まれる腫瘍関連抗原(TAA)の取り込みを、がん細胞との接触とは無関係に、特異的に増大できるかどうかを試験した。

【0248】

EV精製、測定、細胞処理
事前にSW32Tiローターを備えたBeckman超遠心分離機で4℃、28,000rpmで16時間超遠心分離した、500万個のHER2⁺/UT mCherry⁺MC38細胞又はHER2⁺/UTオボアルブミン(OVA)⁺ MC38を、10%FBS(Life Technologies)を補充した16mlのIMDM培地を入れた15cmプレートに播種した。72時間後、培地を回収し、500gで5分間、2000gで5分間、最後に4600g×20分間の3段階の分画遠心分離によってデブリを除去した。次いで、上清を上記のように、しかし1〜10時間、超遠心分離した。ペレットを、36ml培地用の80μlのPBSに再懸濁した。次いで、EVをPBSで1:1000に希釈し、NanoSight装置(Malvern Instrument)を使用し、標準プロトコルを用いて定量した。EVの濃度は、0.8×10⁷〜6×10⁹粒子/μlの範囲であった。

【0249】

mCherry導入を測定する実験において、1ウェル当たり2万個のiBMM又はBMDCを、24ウェルプレート(Corning)でそれぞれの培養培地500μlに播種した。次いで、培地中の細胞に2×10⁹EV粒子/500μlを添加した。インキュベーション後(5分〜48時間の範囲)、細胞をフローサイトメトリー(LSRII、BD)により分析した。mCherryを免疫蛍光によって測定する実験において、iBMMは、方法で記載しているように播種し、1×10⁹EV粒子/250μlで処理した。EV濃度を増加させてEV取り込みを測定する実験においては、BMDCを平底96ウェルプレート(10,000細胞/200μl培地/ウェル)に播種し、0.8×10⁷個、4×10⁷個、2×10⁸個、1×10⁹個、3×10⁹個又は6×10⁹個のmCherry⁺ EVで処理した。

【0250】

がん細胞が、免疫原性TAAを含み得る、エキソソーム又は微小胞を含むEVを放出することが次第に認識されてきている(Zeelenberget al., 2011, Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950), 187: 1281-1288)。抗HER2 EVIR-NがHER2陽性がん細胞に効率的に結合する能力に基づき、EVIR-N発現APCもまた、がん細胞由来EVに結合し、それらを内在化し、EV由来TAAを提示すると仮定された。mCheery⁺、HER2陽性又は陰性MC38細胞から放出されたEVを単離した。NS3000装置(Malvern)を使用するナノサイト分析によって、MC38細胞により条件付けされた培地中のEV(直径:100〜400nm、平均約150nm)の存在を確認した。さらに、EVのフローサイトメトリー分析によって、HER2⁺ MC38細胞由来のEV中のHER2の十分検出可能な発現が示された(図6A)。次に、EVIR-N⁺GFP⁺ iBMMを、HER2⁺ mCheery⁺又はHER2^- mCheery⁺ MC38細胞から単離したEVの適合量で処理した。処置の24時間後、HER2⁺ mCheery⁺ MC38細胞由来EVに曝露された場合、HER2^- mCheery⁺EVと比較して、EVIR-N⁺ GFP⁺ iBMMはより高いmCherry平均蛍光強度(MFI)を示した(図6B)。また、EVIR-N発現iBMMは、48時間以内の飽和に関する証拠なしに、対照(EVIR-N^-)iBMMよりも速くHER2+mCheery+MC38細胞由来EVを取り込むことが確認された(図6C)。EVが内在化したか否か、又はiBMMの細胞表面に結合されたままであるか否かを調べるために、EV処理したiBMMを共焦点顕微鏡法で分析した。mCherryシグナルは、細胞質と共局在し、このことはEVIR-N発現iBMMによるHER2+EVの内在化を示唆していることが確認された(図6D)。注目すべきことに、EV内在化は、mTq+MC38細胞を使用した共培養実験においても確認された。

【0251】

次に、EVIR-Nが樹状細胞(DC)によるがん細胞由来EVの内在化を促進するかどうかを調べた。BMDCに、EVIR-N又は対照LVのいずれかを形質導入した。次いで、形質導入したBMDCを、mCheery⁺ HER2⁺又はmCheery⁺ HER2^- MC38細胞のいずれかから単離したEVで処理した。iBMMにおける所見と一致して、EVIR-N⁺ BMDCは、広範囲のEV用量(図6F)にわたって、対照細胞(図6E)よりも多くのがん細胞由来HER2⁺ EVを内在化した。さらに、他のEVIRを発現するiBMMは、特にEVIR-N、EVIR-C5及びEVIR-Sを使用した場合(図7)、対照HER^-mCheery⁺ MC38細胞由来のEVよりも速くHER2⁺ mCheery⁺ MC38細胞由来のEVを内在化した。

【0252】

まとめると、これらの結果は、抗HER2 EVIRがマクロファージ又はDCによるがん細胞由来EVの取り込みを増大することを示唆している。

【0253】

[実施例5]
抗HER2 EVIRは、APCによるTAA提示を増大する
EVIR-N発現DCによるEV内在化の増大が、無関係のTAAの提示増加と関連しているかどうかを試験した。

【0254】

OT-I T細胞増殖アッセイ
OT-I CD8⁺ T細胞は、MHCクラスI拘束性オボアルブミン特異的CD8⁺T細胞(OT-I細胞)を産生する、OT-I TCRトランスジェニックマウス系統から得た(Hogquist, et al., 1994、前掲)。CD8⁺ OT-I T細胞は、OT-I BL6/C57マウスら得た脾臓から精製した。まず、本発明者らは、抗CD 11cマイクロビーズ(Miltenyi biotech)を備えた自動MACSセパレータを使用することにより、CD11c⁺細胞を枯渇させた。続いて、本発明者は、抗CD8マイクロビーズ(Miltenyi biotech)を使用してCD8⁺ T細胞を確実に選択した。OT-I CD8⁺ T細胞は、製造業者の指示に従い、Cell Tracer-violet(Life Technologies)により染色した。2×10⁵個の精製OT-I T細胞は、2×10⁴個のEVIR/対照形質導入BMDCと共に、平底96ウェルプレート中で共培養した。HER2を形質導入した又はUTのOVA MC38細胞から単離したEVを、0日目にBMDC及びT細胞と共にウェルに加え、3日間維持した。プレインキュベーション実験においては、BMDCは、MC38細胞から単離したEVと共に24時間インキュベートし、次いでPBSで洗浄し、OT-I T細胞に加えた。CD8 T細胞の増殖は、CD8⁺ CD11b^- 7AAD^- T細胞に対してゲート制御するフローサイトメトリー(LSRII、BD)により3日目に測定した。使用した抗体は以下のとおりであった:ヤギ抗F(ab')2-Alexa Fluor 647(Jackson ImmunoResearch)、抗HER2^-Alexa Fluor 647(BioLegend、24B2)、抗CD8-PE(BioLegend、53-6.7)、抗CD11b-APC-Cy7(BioLegend、M1/70)、抗Fc(BD、2.4G2)。OT-I CD8 T細胞増殖を測定する実験において、8×10⁹個/mlのEV粒子は、実施例4の方法に記載されているように、BMDC又はBMDC+T細胞に添加した。異なる濃度のEVでOT-I CD8 T細胞増殖を測定する実験において、EVを実施例4に記載のように添加した。

【0255】

OVAを発現するMC38細胞にHER2発現LVを形質導入した。並行して、MHCI拘束性抗OVA TCRを発現するOT-Iマウス由来のCD8⁺ T細胞を単離した。MC38から単離したHER2⁺ OVA⁺ EVは、(i)EVIR-N又はdLNGFRのいずれかを発現するGFP⁺ BMDC、及び(ii)細胞トレーサー染色したOT-I CD8⁺ T細胞の存在下で、72時間共培養した。注目すべきことに、他の共培養条件と比較して、OT-IT細胞をEVIR-N発現BMDC及びHER2⁺OVA⁺ EVと一緒に共培養した場合、有意に増大したT細胞増殖が観察された(図8A)。

【0256】

EVIR-N+BMDCががん細胞由来のEVからOVA抗原を獲得するか否かを理解するために、以下の細胞、(i)HER2⁺ 0VA⁺ EVで前処理したEVIR-N又はdLNGFRのいずれかを発現するGFP+BMDC、及び(ii)トレーサー染色したOT-I CD8+T細胞を72時間、共培養した。前処理したEVIR-N⁺ BMDMの存在下において、他の条件と比較して、増大したOT-I CD8⁺ T細胞増殖が観察された(図8B)。注目すべきことに、OT-I CD8+T細胞をBMDCの非存在下でHER2+OVA+EVで処理した場合、又はOT-I CD8+T細胞を、EVIR-N又はdLNGFRのいずれかを発現するGFP⁺ BMDCと共培養した場合、OT-I CD8+T細胞の増殖は観察されなかった(図8C)。さらに、EVIR発現BMDCが刺激したOT-I CD8⁺ Tの増殖は、低EV用量を用量応答アッセイにおいて使用した場合でも観察された(図8D)。

【0257】

これらの結果は、DC及びBMDCによるEVIR-N発現が、T細胞にEV結合TAAを取り込み、プロセシングし、提示するそれらの能力を大幅に増大させることを示唆している。

【0258】

[実施例6]
EVIR-N2及びEVIR-N1はAPCによるEV取り込みを増大し、がん特異的T細胞増殖を促進する
2つの異なるメラノーマ特異的表面抗原、DG2及びTYRP1に対するさらなるEVIRを設計した。メラノーマ細胞上で発現されるガングリオシドGD2に特異的なEVIR-N2を設計した。GD2は、例えば、GD2特異的CAR-T細胞を設計するためのメラノーマ免疫療法の標的としてこれまで用いられてきている(Yvon et al., Clin Cancer Res. 2009, 15(18):5852-60)。次に、メラノーマ細胞上で発現されるメラノーマ抗原TYRP1に特異的なEVIR-N1を設計した(Saenger et al., 2008, Cancer Res, 68(23); 9884-91)。EVIR-N1及びEVIR-N2がAPCによるEV取り込みを増大し、がん特異的T細胞増殖を促進するか否かを試験した。

【0259】

EVIR-N1及びEVIR-N2のクローニング設計
マウス最適化TA99 scFv(配列番号111;抗TYRP1)及びマウス最適化14G2a scFv(配列番号112;抗GD2)コードDNA配列は、GeneArt(登録商標)(Life Technologies)から得た。両scFv配列について、IgKシグナルドメイン(EVIR-N1については配列番号109及びEVIR-N2については配列番号110)のコードDNA配列を組み込み、キメラ受容体の細胞膜への輸送を増加させた。高効率Kozak配列及び制限部位を含有するリンカー配列(配列番号3)は、EVIRコード配列の5'末端に組み込んだ。AgeIの制限酵素部位をscFv配列の3'末端に組み込み、(DNA配列の残りのフレーム内で)EVIRの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをクローニングした。次いで、IgK-抗HER2 scFv CHA21配列を、EVIR-NレンチウイルスにおいてIgK-抗TYRP1 scFv TA99又はIgK-抗-GD2 scFv 14G2a配列でそれぞれ置き換え、切断したヒト神経増殖因子受容体由来のDNAコード配列(dLNGFR、配列番号43)を実施例1に記載のようにして両構築物に使用した。

【0260】

TYRP1⁺細胞及びGD2⁺細胞の調製
TYRP1⁺ B16は、B16細胞(ネズミ黒色腫腫瘍細胞株)にマウスTYRP1発現LVを形質導入することにより得た。TYRP1配列は、鋳型としてのB16細胞由来のcDNA及び特異的プライマー(配列番号134のTYRP1 Fw及び配列番号135のTYRP1 Rv)を使用し、PCRにより得た。GD2⁺mCherry⁺ MC38細胞は、GD2合成に関与する酵素、B4GALNT1(ベータ-1,4-N-アセチル-ガラクトサミニルトランスフェラーゼ1、GD2シンターゼ)及びST8SIA1(ST8アルファ-N-アセチルノイラミニドアルファ-2,8-シアリルトランスフェラーゼ1、GD3シンターゼ)を発現するLVをmCherry⁺MC38細胞に形質導入することによって得た(Dall'Olio et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1840(9):2752-64)。マウス最適化GD2及びGD3シンターゼDNA配列は、GeneArt(登録商標)(Life Technologies)から得た。GD2⁺mCherry⁺ MC38及びTYRP1⁺ B16由来のEVは、実施例4に記載したようにして得た。

【0261】

測定及び細胞処理は実施例4に記載のとおりである。

【0262】

OT-I T細胞増殖アッセイは実施例5に記載のとおりである。

【0263】

図9A〜Bに示したように、GD2及びTYRP1に特異的なEVIR(それぞれEVIR-N2及びEVIR-N1)は、それぞれの餌抗原を発現するEVの操作されたiBMMによる取り込みを増大したが、それは、EVIR-N2⁺及びEVIR-N1⁺iBMMが、対照細胞よりも多量のがん細胞由来GD2⁺ EV及びTYRP1⁺ EVを内在化したからである(図9A、B)。さらに、EVIR-N1を発現するように操作されたBMDCは、OVA⁺ TYRP1⁺メラノーマ細胞(OVA⁺ TYRP1⁺ B16)から得たEVと共インキュベートした場合、対照EVIRを発現するように操作したBMDCと比較して、OT-I CD8⁺ T細胞増殖を増大させた(図9C)。

【0264】

これらのデータは、EVIRが、メラノーマ細胞を含めたがん細胞によって発現される様々な表面抗原に対して設計され得ることを示している。

【0265】

[実施例7]
EVIRはAPC刺激因子と共にAPCに同時送達することができる
EVIRSとAPC刺激因子との共発現は以下のように試験した。

【0266】

APC刺激因子:Cxcl9(配列番号117)、Csf2(配列番号120)及びIFNγ(配列番号123)のDNAコード配列は、実施例2に記載のようにして腹腔マクロファージのcDNAからPCRによって取得し、XmaI、Sal及びNheIの制限部位を含有するプライマーを使用した(表2)。Lin28のDNAコード配列(配列番号126)は、マウス栄養膜細胞由来のcDNAからPCRによって取得し(Baer et al., 2016、前掲)、また、XmaI、Sal及びNheIの制限部位を含有するプライマーを使用した(表2)。CD40のDNAコード配列(配列番号127)は、GeneArt(登録商標)(Life Technologies)から取得した。次いで、これらのAPC刺激因子のDNAコード配列は、ミニマルCMVプロモーターの転写制御下で、実施例1に記載されている双方向LV(Amendola et al., 2005、前掲)のGFPコード配列を置き換えることによりクローニングした。

【0267】

EVの精製、測定及び細胞処理は実施例4に記載のとおりである。

【0268】

EVIR発現の測定は、実施例2に記載のとおりである。

【0269】

表面分子CD86及びCCR7の発現のフローサイトメトリー分析は、実施例2に記載のとおりである。

【0270】

【表2】

【0271】

図10A〜Bに示すように、APCの分化、活性化及び提示、及び/又はT細胞動員を増強するタンパク質の共発現は、EVIRの発現又はBMDCにおけるEV取り込みを促進するその能力を損なうことはなかった。さらに(図10C〜D)、Let-7 miRNA活性を阻害するタンパク質であるLIN28の同時形質導入は、APC活性化を示す表面分子のBMDC、例えばCD86(分化のクラスター86)及びCCR7(C-Cケモカイン受容体7型)における発現を増加させることがわかった。

【0272】

まとめると、これらのデータは、EVIRと共にアクセサリータンパク質を同時送達した場合、EV内在化活性を損なわないだけでなく、APC機能を増大させるのにも役立つことを示唆している。

【0273】

[実施例8]
EVIRは、がん細胞からAPCへのMHC-抗原複合体の移動を促進することができる
がん細胞からAPCへのMHCI-抗原複合体の可能性のあるEVIR介在性移動を以下のように試験した。

【0274】

がん細胞におけるMHCI発現の破壊
B2mを破壊し、がん細胞におけるMHCI発現を停止させるために、本発明者らは、CRISPR/Cas9系に基づく自己誘導性LVを作製した。本発明者らは、リバースtTA(rtTA)及び選択マーカー(ピューロマイシン)を発現するTetO-CAS9 LVも得た。このLVをさらに改変して、U6プロモーター駆動抗B2m一本鎖ガイドRNA(sgRNA)配列(配列番号136)を含め、これをTetO-CAS9発現カセットの上流にクローニングし、ドキシサイクリン-自己誘導性LV:U6-sgRNA.TetO-CAS9.Pgk-PURO/2A/rtTA LVを得た。

【0275】

B2M欠損EVは、HER2⁺ OVA⁺ MC38がん細胞に上記のLVを形質導入することにより得た。形質導入したHER2⁺ OVA⁺MC38細胞を、ピューロマイシン(2μg/ml)及びドキシサイクリン(1μg/ml)を含む細胞培地で3日間培養し、CRISPR/Cas9系を活性化させ、破壊したB2m遺伝子を有する細胞のクローン集団を選抜した(図11A)。次いで、EVを実施例4に記載したように精製した。

【0276】

この実験において、BMDCは、MHCI/抗原複合体を提示する能力を欠損する、B2M^-/-マウスのBMから単離した(Koller et al., 1990, Science, 248(4960):1227-30)。次いで、MHCI欠損B2M^- BMDCに、対照EVIR又はEVIR-Nのいずれかを形質導入し、実施例5に記載されているようにT細胞増殖アッセイでアッセイした。

【0277】

APCが遺伝的に改変されて交差提示能が欠損している特定の実験条件下では、がん細胞由来EVからEVIR発現APCへのMHC複合体の直接的移動は、T細胞増殖を促進するのに十分であった(図11B)。MHCI欠損BMDC及びOT-I T細胞とOVA+HER2+EVとの共インキュベーションは、EVIR-N(対照EVIRに対する)の存在下においてT細胞増殖を増加させ、MHCIクロスドレッシングの増大を示唆している(図11B、上部パネル)。一方、上記のLV(U6-sgRNA.TetO-CAS9.Pgk-PURO/2A/rtTA)を使用するがん細胞におけるB2Mの破壊は、精製EVからのクロスドレッシングを完全に阻止し、この現象の特異性を証明している(図11B、下のパネル)。

【0278】

これらの結果は、がん細胞由来のEVからEVIR発現APCへのMHC複合体の直接的移動が、APCにおける内在性MHCIの非存在下において、T細胞増殖を促進するのに十分であり得ることを支持している。

【0279】

[実施例9]
EVIR操作されたAPCは、マウスにおける腫瘍増殖を阻害する
EVIRの作用は、EVIR-N DCベースワクチン接種実験を用いて、in vivoで試験した。

【0280】

DCは、同系マウスのBMから取得し、LVを形質導入し、LPS(リポ多糖、10ng/ml)で活性化した後、小さな定着腫瘍を有するマウス(DCなしではn=4匹、CTRL-DCでは7匹、EVIR DCでは9匹のマウス/群)にそれらを接種した(10⁷個の細胞の2連続DC用量、1週間間隔)。

【0281】

EVIR-N形質導入DCの皮下、腫瘍周囲の展開が、対照のEVIR形質導入DCと比較して、MC38-HER2腫瘍の増殖を阻害することが確認された(図12)。対照のEVIR形質導入DCも腫瘍増殖を遅延させたが、EVIR-N形質導入DCは、腫瘍制御を有意に改善し、EVIR操作したDCの優れた抗腫瘍活性を証明した。

【0282】

これらのデータは、EVIR操作APCがin vivoで腫瘍増殖の阻害を増大させ得ることを証明している。

【0283】

配列表
抗HER2 scFv CHA21の核酸配列
配列番号1:
GGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGC
IgKドメインの核酸配列
配列番号2:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGG
S5_BamHI_Kozakの核酸配列
配列番号3: GGATCCGCCACC
S3_BamHI_AgeI_MluI_SalI_stop_XhoIの核酸配列
配列番号4: ACCGGTACGCGTGTCGACTGACTCGAG
S5_FCgRIIIa_BamHI_Kozak.start_AgeIの核酸配列
配列番号5: GGATCCGCCACCATGACCGGT
S3_FCgRIIIa_MluI_SalI_stop_XhoIの核酸配列
配列番号6: ACGCGTGTCGACTGACTCGAG
dLNGFR_Fw_AgeIの核酸配列
配列番号7: AAAAAACCGGTCTTCTGGGGGTGTCCCTTG
dLNGFR_Rv_MluIの核酸配列
配列番号8: AAAAAACGCGTAGTTAGCCTCCCCCATCTCC
FLT3_Fw_AgeIの核酸配列
配列番号9: AAAAAACCGGTCCAGGCCCCTTCCCTTTCATC
FLT3_Rv_XhoIの核酸配列
配列番号10: AAAAACTCGAGAGAGGCGAGGCTAATCTTGG
Tlr4_Fw_AgeIの核酸配列
配列番号11: AAAAAACCGGTCAGCTGTATTCCCTCAGCACT
Tlr4_Rv_SalIの核酸配列
配列番号12: AAAAAGTCGACTGGGTTTAGGCCCCAGAGTT
Ccr2_Fw_AgeIの核酸配列
配列番号13: AAAAAACCGGTATGGAAGACAATAATATGTTACCTC
Ccr2_Rv_MluIの核酸配列
配列番号14: AAAAAACGCGTATGTACAAACTGCTCCCTCC
Itgb2_Fw_AgeIの核酸配列
配列番号15: AAAAAACCGGTAATGCACGGCTGGTAGAGTG
Itgb2_Rv_MluIの核酸配列
配列番号16: AAAAAACGCGTGGGGGTCACATCTGCTTGAT
Csf2rb_Fw_AgeIの核酸配列
配列番号17: AAAAAACCGGTACTCAGAAGATGGCTTACTCATTCA
Csf2rb_Rv_MluIの核酸配列
配列番号18: AAAAAACGCGTTGGTGAGATTGGGAGGAGAC
Ccr1_Fw_AgeIの核酸配列
配列番号19: AAAAAACCGGTACTCCATGCCAAAAGACTGCT
Ccr1_Rv_MluIの核酸配列
配列番号20: AAAAAACGCGTACCTTCCTTGGTTGACACCTATG
Ccr5_Fw_AgeIの核酸配列
配列番号21: AAAAAACCGGTATGTCAGCACCCTGCCAAAAA
Ccr5_Rv_MluIの核酸配列
配列番号22: AAAAAACGCGTCATTCCTACTCCCAAGCTGCAT
Cxcr4_Fw_XmaIの核酸配列
配列番号23: AAAAACCCGGGTTCCGGGATGAAAACGTCCA
Cxcr4_Rv_MluIの核酸配列
配列番号24: AAAAAACGCGTTGCATAAGTGTTAGCTGGAGTG
Selplg_Fw_AgeIの核酸配列
配列番号25: AAAAAACCGGTATTGCCACCACTGACCCTA
Selplg_Rv_MluIの核酸配列
配列番号26: AAAAAACGCGTGCAAAGGTCTCGCTTAGGTG
抗HER2 CHA21のアミノ酸配列
配列番号27:
DIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSS
抗HER2トラスツズマブベースscFvのアミノ酸配列
配列番号28:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGTGTRX
抗HER2ペルツズマブベースscFvのアミノ酸配列
配列番号29:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYW
抗HER2 FRP5ベースscFvのアミノ酸配列
配列番号30:
QVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYPFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTSTGESTFADDFKGRFDFSLETSANTAYLQINNLKSEDMATYFCARWEVYHGYVPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSHKFLSTSVGDRVSITCKASQDVYNAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRYTGVPSRFTGSGSGPDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQHFRTPFTFGSGTKLEIKRX
dLNGFR由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号31:
LLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWNRGIL
FcγRIIIA由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号32:
HENSELLIPKATHNDSGSYFCRGLIGHNNKSSASFRISLGDPGSPSMFPPWHQITFCLLIGLLFAIDTVLYFSVRRGLQSPVADYEEPKIQWSKEPQDKTRVD
FLT3由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号33:
PGPFPFIQDNISFYATIGLCLPFIVVLIVLICHKYKKQFRYESQLQMIQVTGPLDNEYFYVDFRDYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGRVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSCEKEALMSELKMMTHLGHHDNIVNLLGACTLSGPVYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQAHSNSSMPGSREVQLHPPLDQLSGFNGNLIHSEDEIEYENQKRLAEEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDILSDSSYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQSGFKMEQPFYATEGIYFVMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLAEAEEAMYQNMGGNVPEHPSIYQNRRPLSREAGSEPPSPQAQVKIHGERS
TLR4由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号34:
QLYSLSTLDCSFNRIETSKGILQHFPKSLAFFNLTNNSVACICEHQKFLQWVKEQKQFLVNVEQMTCATPVEMNTSLVLDFNNSTCYMYKTIISVSVVSVIVVSTVAFLIYHFYFHLILIAGCKKYSRGESIYDAFVIYSSQNEDWVRNELVKNLEEGVPRFHLCLHYRDFIPGVAIAANIIQEGFHKSRKVIVVVSRHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRSGIIFIVLEKVEKSLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDNPLGRHIFWRRLKNALLDGKASNPEQTAEEEQETATWT
CCR2由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号35:
MEDNNMLPQFIHGILSTSHSLFTRSIQELDEGATTPYDYDDGEPCHKTSVKQIGAWILPPLYSLVFIFGFVGNMLVIIILIGCKKLKSMTDIYLLNLAISDLLFLLTLPFWAHYAANEWVFGNIMCKVFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVITSVVTWVVAVFASLPGIIFTKSKQDDHHYTCGPYFTQLWKNFQTIMRNILSLILPLLVMVICYSGILHTLFRCRNEKKRHRAVRLIFAIMIVYFLFWTPYNIVLFLTTFQESLGMSNCVIDKHLDQAMQVTETLGMTHCCINPVIYAFVGEKFRRYLSIFFRKHIAKRLCKQCPVFYRETADRVSSTFTPSTGEQEVSVGL
ITGB2由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号36:
NARLVECSGRGHCQCNRCICDEGYQPPMCEDCPSCGSHCRDNHTSCAECLKFDKGPFEKNCSVQCAGMTLQTIPLKKKPCKERDSEGCWITYTLQQKDGRNIYNIHVEDSLECVKGPNVAAIVGGTVVGVVLIGVLLLVIWKALTHLTDLREYRRFEKEKLKSQWNNDNPLFKSATTTVMNPKFAES
CSF2RB由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号37:
TQKMAYSFIEHTFQVQYKKKSDSWEDSKTENLDRAHSMDLSQLEPDTSYCARVRVKPISNYDGIWSKWSEEYTWKTDWVMPTLWIVLILVFLILTLLLILRFGCVSVYRTYRKWKEKIPNPSKSLLFQDGGKGLWPPGSMAAFATKNPALQGPQSRLLAEQQGESYAHLEDNNVSPLTIEDPNIIRVPPSGPDTTPAASSESTEQLPNVQVEGPTPNRPRKQLPSFDFNGPYLGPPQSHSLPDLPDQLGSPQVGGSLKPALPGSLEYMCLPPGGQAQLVPLSQVMGQGQAMDVQCGSSLETSGSPSVEPKENPPVELSMEEQEARDNPVTLPISSGGPEGSMMASDYVTPGDPVLTLPTGPLSTSLGPSLGLPSAQSPRLCLKLPRVPSGSPALGPPGFEDYVELPPSVSQAAKSPPGHPAPPVASSPTVIPGEPREEVGPASPHPEGLLVLQQVGDYCFLPGLGPGSLSPHSKPPSPSLCSETEDLVQDLSVKKFPYQPMPQAPAIQFFKSLKHQDYLSLPPWDNSQSGKVC
CCR1由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号38:
TPCQKTAVRAFGAGLLPPLYSLVFIIGVVGNVLVILVLMQHRRLQSMTSIYLFNLAVSDLVFLFTLPFWIDYKLKDDWIFGDAMCKLLSGFYYLGLYSEIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALRARTVTFGIITSIITWALAILASMPALYFFKAQWEFTHRTCSPHFPYKSLKQWKRFQALKLNLLGLILPLLVMIICYAGIIRILLRRPSEKKVKAVRLIFAITLLFFLLWTPYNLSVFVSAFQDVLFTNQCEQSKQLDLAMQVTEVIAYTHCCVNPIIYVFVGERFWKYLRQLFQRHVAIPLAKWLPFLSVDQLERTSSISPSTGEHELSAGF
CCR5由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号39:
MSAPCQKINVKQIAAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMMVFLILISCKKLKSVTDIYLLNLAISDLLFLLTLPFWAHYAANEWVFGNIMCKVFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKVRTVNFGVITSVVTWAVAVFASLPEIIFTRSQKEGFHYTCSPHFPHTQYHFWKSFQTLKMVILSLILPLLVMVICYSGILHTLFRCRNEKKRHRAVRLIFAIMIVYFLFWTPYNIVLLLTTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQATETLGMTHCCLNPVIYAFVGEKFRSYLSVFFRKHIVKRFCKRCSIFQQDNPDRASSVYTRSTGEHEVSTGL
CXCR4由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号40:
FRDENVHFNRIFLPTIYFIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAMADWYFGKFLCKAVHIIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKAVYVGVWIPALLLTIPDFIFADVSQGDISQGDDRYICDRLYPDSLWMVVFQFQHIMVGLVLPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYVGISIDSFILLGVIKQGCDFESIVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKSSAQHALNSMSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS
SELPLG由来のタンパク質ドメインのアミノ酸配列
配列番号41:
IATTDPTAPGTGGTAVGMLSTDSATQWSLTSVETVQPASTEVETSQPAPMEAETSQPAPMEAETSQPAPMEADTSKPAPTEAETSKPAPTEAETSQPAPNEAETSKPAPTEAETSKPAPTEAETTQLPRIQAVKTLFTTSAATEVPSTEPTTMETASTESNESTIFLGPSVTHLPDSGLKKGLIVTPGNSPAPTLPGSSDLIPVKQCLLIILILASLATIFLVCTVVLAVRLSRKTHMYPVRNYSPTEMICISSLLPEGGDGAPVTANGGLPKVQDLKTEPSGDRDGDDLTLHSFLP
IgKドメインのアミノ酸配列
配列番号42: MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG
dLNGFR由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号43:
CTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGCCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGTGGAACAGGGGGATCCTCTAG
FcγRIIIA由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号44:
CACGAGAACTCCGAACTGCTGATTCCTAAGGCAACTCACAACGACTCCGGCTCCTATTTCTGTAGAGGGCTGATTGGACATAACAACAAGAGCTCCGCCTCATTCAGGATTAGCCTGGGCGACCCAGGGTCTCCCAGTATGTTCCCCCCTTGGCACCAGATCACCTTTTGCCTGCTGATTGGACTGCTGTTCGCTATCGATACAGTGCTGTACTTTTCTGTCCGGAGAGGCCTGCAGTCACCCGTGGCAGATTACGAAGAACCCAAGATTCAGTGGAGCAAGGAGCCCCAGGATAAGACGCGTGTCGACTGA
FLT3由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号45:
CCAGGCCCCTTCCCTTTCATCCAAGACAACATCTCCTTCTATGCGACCATTGGGCTCTGTCTCCCCTTCATTGTTGTTCTCATTGTGTTGATCTGCCACAAATACAAAAAGCAATTTAGGTACGAGAGTCAGCTGCAGATGATCCAGGTGACTGGCCCCCTGGATAACGAGTACTTCTACGTTGACTTCAGGGACTATGAATATGACCTTAAGTGGGAGTTCCCGAGAGAGAACTTAGAGTTTGGGAAGGTCCTGGGGTCTGGCGCTTTCGGGAGGGTGATGAACGCCACGGCCTATGGCATTAGTAAAACGGGAGTCTCAATTCAGGTGGCGGTGAAGATGCTAAAAGAGAAAGCTGACAGCTGTGAAAAAGAAGCTCTCATGTCGGAGCTCAAAATGATGACCCACCTGGGACACCATGACAACATCGTGAATCTGCTGGGGGCATGCACACTGTCAGGGCCAGTGTACTTGATTTTTGAATATTGTTGCTATGGTGACCTCCTCAACTACCTAAGAAGTAAAAGAGAGAAGTTTCACAGGACATGGACAGAGATTTTTAAGGAACATAATTTCAGTTTTTACCCTACTTTCCAGGCACATTCAAATTCCAGCATGCCTGGTTCACGAGAAGTTCAGTTACACCCGCCCTTGGATCAGCTCTCAGGGTTCAATGGGAATTTAATTCATTCTGAAGATGAGATTGAATATGAAAACCAGAAGAGGCTGGCAGAAGAAGAGGAGGAAGATTTGAACGTGCTGACGTTTGAAGACCTCCTTTGCTTTGCGTACCAAGTGGCCAAAGGCATGGAATTCCTGGAGTTCAAGTCGTGTGTCCACAGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTGTTGGTCACCCACGGGAAGGTGGTGAAGATCTGTGACTTTGGACTGGCCCGAGACATCCTGAGCGACTCCAGCTACGTCGTCAGGGGCAACGCACGGCTGCCGGTGAAGTGGATGGCACCTGAGAGCTTATTTGAAGGGATCTACACAATCAAGAGTGACGTCTGGTCCTACGGCATCCTTCTCTGGGAGATATTTTCACTGGGTGTGAACCCTTACCCTGGCATTCCTGTCGACGCTAACTTCTATAAACTGATTCAGAGTGGATTTAAAATGGAGCAGCCATTCTATGCCACAGAAGGGATATACTTTGTAATGCAATCCTGCTGGGCTTTTGACTCAAGGAAGCGGCCATCCTTCCCCAACCTGACTTCATTTTTAGGATGTCAGCTGGCAGAGGCAGAAGAAGCGATGTATCAGAACATGGGTGGCAACGTCCCAGAACATCCATCCATCTACCAAAACAGGCGGCCCCTCAGCAGAGAGGCAGGCTCAGAGCCGCCATCGCCACAGGCCCAGGTGAAGATTCACGGAGAAAGAAGTTAG
TLR4由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号46:
CAGCTGTATTCCCTCAGCACTCTTGATTGCAGTTTCAATCGCATAGAGACATCTAAAGGAATACTGCAACATTTTCCAAAGAGTCTAGCCTTCTTCAATCTTACTAACAATTCTGTTGCTTGTATATGTGAACATCAGAAATTCCTGCAGTGGGTCAAGGAACAGAAGCAGTTCTTGGTGAATGTTGAACAAATGACATGTGCAACACCTGTAGAGATGAATACCTCCTTAGTGTTGGATTTTAATAATTCTACCTGTTATATGTACAAGACAATCATCAGTGTGTCAGTGGTCAGTGTGATTGTGGTATCCACTGTAGCATTTCTGATATACCACTTCTATTTTCACCTGATACTTATTGCTGGCTGTAAAAAGTACAGCAGAGGAGAAAGCATCTATGATGCATTTGTGATCTACTCGAGTCAGAATGAGGACTGGGTGAGAAATGAGCTGGTAAAGAATTTAGAAGAAGGAGTGCCCCGCTTTCACCTCTGCCTTCACTACAGAGACTTTATTCCTGGTGTAGCCATTGCTGCCAACATCATCCAGGAAGGCTTCCACAAGAGCCGGAAGGTTATTGTGGTAGTGTCTAGACACTTTATTCAGAGCCGTTGGTGTATCTTTGAATATGAGATTGCTCAAACATGGCAGTTTCTGAGCAGCCGCTCTGGCATCATCTTCATTGTCCTTGAGAAGGTTGAGAAGTCCCTGCTGAGGCAGCAGGTGGAATTGTATCGCCTTCTTAGCAGAAACACCTACCTGGAATGGGAGGACAATCCTCTGGGGAGGCACATCTTCTGGAGAAGACTTAAAAATGCCCTATTGGATGGAAAAGCCTCGAATCCTGAGCAAACAGCAGAGGAAGAACAAGAAACGGCAACTTGGACCTGA
CCR2由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号47:
ATGGAAGACAATAATATGTTACCTCAGTTCATCCATGGCATACTATCAACATCTCATTCTCTATTTACACGAAGTATCCAAGAGCTTGATGAAGGGGCCACCACACCGTATGACTACGATGATGGTGAGCCTTGTCATAAAACCAGTGTGAAGCAAATTGGAGCTTGGATCCTGCCTCCACTCTACTCCCTGGTATTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGTTGGTCATTATAATTCTGATAGGCTGTAAAAAGCTGAAGAGCATGACTGATATCTATCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGCTCTTCCTGCTCACATTACCATTCTGGGCTCACTATGCTGCAAATGAGTGGGTCTTTGGGAATATAATGTGTAAAGTATTCACAGGGCTCTATCACATTGGTTATTTTGGTGGAATCTTTTTCATTATCCTCCTGACAATTGATAGGTACTTGGCTATTGTTCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACAGTTACCTTTGGGGTGATAACAAGTGTAGTCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCCTCTCTACCAGGAATCATATTTACTAAATCCAAACAAGATGATCACCATTACACCTGTGGCCCTTATTTTACACAACTATGGAAGAATTTCCAAACAATAATGAGAAATATCTTGAGCCTGATCCTGCCTCTACTTGTCATGGTCATCTGCTACTCAGGAATTCTCCACACCCTGTTTCGCTGTAGGAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTCATCTTTGCCATCATGATTGTCTACTTTCTCTTCTGGACTCCATACAATATTGTTCTCTTCTTGACCACCTTCCAGGAATCCTTGGGAATGAGTAACTGTGTGATTGACAAGCACTTAGACCAGGCCATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGAATGACACACTGCTGCATTAATCCTGTCATTTATGCCTTTGTTGGAGAGAAGTTCCGAAGGTATCTCTCCATATTTTTCAGAAAGCACATTGCTAAACGTCTCTGCAAACAGTGCCCAGTTTTCTATAGGGAGACAGCAGATCGAGTGAGCTCTACATTCACTCCTTCCACTGGGGAGCAAGAGGTCTCGGTTGGGTTGTAA
ITGB2由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号48:
AATGCACGGCTGGTAGAGTGCAGTGGCCGTGGCCACTGCCAATGCAACAGGTGCATATGTGACGAAGGCTACCAGCCACCGATGTGTGAGGATTGTCCCAGCTGTGGCTCGCACTGCAGGGACAACCACACCTCTTGTGCCGAGTGCCTGAAGTTTGATAAGGGCCCTTTTGAGAAGAACTGTAGTGTTCAGTGTGCTGGTATGACGCTGCAGACTATCCCTTTGAAGAAAAAGCCCTGCAAGGAGAGGGACTCGGAAGGCTGTTGGATAACTTACACTTTGCAGCAGAAGGACGGAAGGAACATTTACAACATCCATGTGGAGGACAGTCTAGAGTGTGTGAAGGGCCCCAATGTGGCTGCCATCGTAGGGGGCACCGTGGTAGGTGTCGTACTGATTGGTGTCCTCCTCCTGGTCATCTGGAAGGCCCTGACCCACCTGACTGACCTCAGGGAGTACAGGCGCTTTGAGAAGGAGAAACTCAAGTCCCAATGGAACAATGACAACCCCCTCTTCAAGAGTGCTACGACAACGGTCATGAACCCCAAGTTTGCTGAAAGCTAG
CSF2RB由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号49:
ACTCAGAAGATGGCTTACTCATTCATTGAGCACACATTCCAGGTCCAGTACAAGAAGAAATCGGACAGCTGGGAGGACAGCAAGACAGAGAACCTAGATCGAGCCCATAGCATGGACCTCTCCCAGCTGGAGCCAGACACCTCATACTGCGCCAGGGTGAGGGTCAAGCCCATCTCTAACTACGATGGGATCTGGAGCAAGTGGAGCGAAGAGTACACTTGGAAGACTGACTGGGTGATGCCCACGCTGTGGATAGTCCTCATCCTGGTCTTTCTCATCCTCACCTTGCTCCTGATCCTTCGCTTTGGCTGTGTCTCTGTATACAGGACGTACAGGAAGTGGAAGGAAAAGATCCCCAACCCCAGCAAGAGCCTCCTGTTCCAGGATGGAGGTAAAGGTCTCTGGCCTCCTGGCAGCATGGCAGCCTTCGCCACTAAGAACCCCGCTCTCCAGGGGCCACAGAGCAGGCTTCTTGCTGAGCAACAGGGGGAGTCATATGCACATTTGGAAGACAACAACGTGTCACCTCTCACTATAGAGGACCCTAATATAATTCGAGTTCCACCATCCGGGCCTGATACAACCCCAGCTGCCTCATCCGAATCCACAGAGCAACTTCCCAATGTTCAAGTAGAGGGACCAACTCCTAACAGACCTAGGAAGCAATTACCCAGCTTTGACTTCAATGGGCCCTACCTGGGGCCTCCCCAATCCCACTCTCTGCCTGATCTCCCAGACCAGCTGGGTTCCCCCCAGGTGGGTGGGAGCCTGAAGCCAGCACTGCCAGGCTCCTTGGAGTACATGTGTCTGCCCCCTGGAGGTCAAGCGCAACTGGTTCCATTGTCCCAGGTGATGGGGCAGGGCCAGGCTATGGATGTGCAGTGTGGGTCCAGCCTGGAGACCTCAGGGAGCCCTTCTGTGGAGCCAAAGGAGAACCCTCCAGTTGAGCTGAGCATGGAGGAACAGGAGGCACGGGACAACCCAGTGACTCTGCCCATAAGCTCTGGGGGCCCTGAGGGCAGTATGATGGCCTCTGATTATGTCACTCCTGGAGATCCGGTGCTCACTCTGCCCACAGGGCCCCTGTCTACCTCTCTGGGCCCCTCTCTAGGGTTGCCCTCAGCCCAAAGCCCCCGTCTCTGTCTTAAGCTGCCCAGGGTCCCCTCTGGAAGCCCAGCTCTAGGGCCACCAGGGTTTGAGGACTATGTGGAGCTGCCTCCAAGTGTGAGCCAGGCTGCCAAGTCCCCTCCAGGCCATCCTGCTCCTCCTGTGGCAAGCAGCCCCACAGTGATCCCAGGAGAGCCCAGGGAGGAAGTGGGCCCAGCATCCCCACATCCCGAAGGCCTCCTTGTTCTTCAGCAGGTTGGGGACTACTGCTTCCTCCCTGGCCTGGGACCTGGCTCCCTCTCACCACACAGTAAGCCACCCTCTCCAAGTCTGTGTTCTGAGACTGAGGACCTAGTCCAGGACTTGTCTGTCAAAAAGTTTCCCTATCAGCCCATGCCCCAGGCGCCAGCCATTCAGTTTTTCAAGTCCCTAAAGCATCAGGACTACCTGTCCCTGCCCCCTTGGGACAATAGCCAGTCTGGGAAGGTGTGCTGA
CCR1由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号50:
ACTCCATGCCAAAAGACTGCTGTAAGAGCCTTTGGGGCTGGACTCCTGCCCCCCCTGTATTCTCTAGTGTTCATCATTGGAGTGGTGGGCAATGTCCTAGTGATTCTGGTGCTCATGCAGCATAGGAGGCTTCAAAGCATGACCAGCATCTACCTGTTCAACCTGGCTGTCTCTGATCTGGTCTTCCTTTTCACTTTACCTTTCTGGATTGACTACAAGTTGAAAGACGACTGGATTTTTGGTGATGCCATGTGCAAGCTTCTCTCTGGGTTTTATTACCTGGGTTTATACAGTGAGATCTTCTTTATCATCCTGTTGACGATTGACAGATACCTGGCCATTGTCCATGCTGTGTTTGCCCTGAGGGCCCGAACTGTTACTTTTGGCATCATCACCAGTATTATCACCTGGGCCCTAGCCATCTTAGCTTCCATGCCTGCCTTATACTTTTTTAAGGCCCAGTGGGAGTTCACTCACCGTACCTGTAGCCCTCATTTCCCCTACAAGAGCCTGAAGCAGTGGAAGAGGTTTCAAGCTCTAAAGCTAAACCTTCTTGGACTAATTTTGCCTCTGTTAGTCATGATAATCTGCTATGCAGGGATCATCAGAATTCTGCTCAGAAGACCCAGTGAGAAGAAGGTCAAAGCCGTGCGTCTGATATTTGCTATTACTCTTCTATTCTTCCTCCTCTGGACCCCCTACAATCTGAGTGTATTTGTTTCTGCTTTCCAAGATGTTCTATTCACCAATCAGTGTGAGCAGAGTAAGCAACTGGACCTGGCCATGCAGGTGACTGAGGTGATTGCCTACACCCACTGTTGTGTCAACCCAATCATTTATGTTTTTGTGGGTGAACGGTTCTGGAAGTACCTTCGGCAGCTGTTTCAAAGGCATGTGGCTATACCACTGGCAAAATGGCTGCCCTTCCTCTCTGTGGACCAACTAGAAAGGACCAGTTCTATATCTCCATCCACAGGAGAACATGAGCTCTCTGCTGGCTTCTGA
CCR5由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号51:
ATGTCAGCACCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAACAAATTGCGGCTCAGCTCCTGCCCCCACTCTACTCCCTGGTATTCATCTTTGGTTTTGTGGGTAACATGATGGTCTTCCTCATCTTGATAAGCTGCAAAAAGCTGAAGAGCGTGACTGATATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGCTCTTCCTGCTCACACTACCATTCTGGGCTCACTATGCTGCAAATGAGTGGGTCTTTGGGAACATAATGTGTAAAGTATTCACAGGGCTCTATCACATTGGTTATTTTGGTGGAATCTTCTTCATTATCCTCCTGACAATTGATAGGTACTTGGCTATTGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGTCAGAACGGTCAACTTTGGGGTGATAACAAGTGTAGTCACTTGGGCGGTGGCTGTGTTTGCCTCTCTCCCAGAAATAATCTTTACCAGATCTCAGAAAGAAGGTTTTCATTATACATGCAGTCCTCATTTTCCACACACTCAGTATCATTTCTGGAAGAGTTTCCAAACATTAAAGATGGTCATCTTGAGCCTGATCCTGCCTCTACTTGTCATGGTCATCTGCTACTCAGGAATTCTCCACACCCTGTTTCGCTGTAGGAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTCATCTTTGCCATCATGATTGTCTACTTTCTCTTCTGGACTCCCTACAACATTGTCCTCCTCCTGACCACCTTCCAGGAATTCTTTGGACTGAATAACTGCAGTAGTTCTAATAGACTAGACCAGGCCATGCAGGCAACAGAGACTCTTGGAATGACACACTGCTGCCTAAACCCTGTCATCTATGCCTTTGTTGGAGAGAAGTTCCGGAGTTATCTCTCAGTGTTCTTCCGAAAACACATTGTCAAACGCTTTTGCAAACGGTGTTCAATTTTCCAGCAAGACAATCCTGATCGTGCAAGCTCAGTCTATACCCGATCCACAGGAGAACATGAAGTTTCTACTGGTTTATGA
CXCR4由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号52:
TTCCGGGATGAAAACGTCCATTTCAATAGGATCTTCCTGCCCACCATCTACTTCATCATCTTCTTGACTGGCATAGTCGGCAATGGATTGGTGATCCTGGTCATGGGTTACCAGAAGAAGCTAAGGAGCATGACGGACAAGTACCGGCTGCACCTGTCAGTGGCTGACCTCCTCTTTGTCATCACACTCCCCTTCTGGGCAGTTGATGCCATGGCTGACTGGTACTTTGGGAAATTTTTGTGTAAGGCTGTCCATATCATCTACACTGTCAACCTCTACAGCAGCGTTCTCATCCTGGCCTTCATCAGCCTGGACCGGTACCTCGCTATTGTCCACGCCACCAACAGTCAGAGGCCAAGGAAACTGCTGGCTGAAAAGGCAGTCTATGTGGGCGTCTGGATCCCAGCCCTCCTCCTGACTATACCTGACTTCATCTTTGCCGACGTCAGCCAGGGGGACATCAGTCAGGGGGATGACAGGTACATCTGTGACCGCCTTTACCCCGATAGCCTGTGGATGGTGGTGTTTCAATTCCAGCATATAATGGTGGGTCTCGTCCTGCCCGGCATCGTCATCCTCTCCTGTTACTGCATCATCATCTCTAAGCTGTCACACTCCAAGGGCCACCAGAAGCGCAAGGCCCTCAAGACGACAGTCATCCTCATCCTAGCTTTCTTTGCCTGCTGGCTGCCATATTATGTGGGGATCAGCATCGACTCCTTCATCCTTTTGGGGGTCATCAAGCAAGGATGTGACTTCGAGAGCATCGTGCACAAGTGGATCTCCATCACAGAGGCCCTCGCCTTCTTCCACTGTTGCCTGAACCCCATCCTCTATGCCTTCCTCGGGGCCAAGTTCAAAAGCTCTGCCCAGCATGCACTCAACTCCATGAGCAGAGGCTCCAGCCTCAAGATCCTTTCCAAAGGAAAGCGGGGTGGACACTCTTCCGTCTCCACGGAGTCAGAATCCTCCAGTTTTCACTCCAGCTAA
SELPLG由来のタンパク質ドメインの核酸配列
配列番号53:
ATTGCCACCACTGACCCTACTGCCCCAGGTACAGGAGGGACAGCTGTTGGGATGCTGAGCACAGACTCTGCCACACAGTGGAGTCTAACCTCAGTAGAGACCGTCCAACCAGCATCCACAGAGGTAGAGACCTCGCAGCCAGCACCCATGGAGGCAGAGACCTCGCAGCCAGCACCCATGGAGGCAGAGACCTCGCAGCCAGCACCCATGGAGGCAGACACCTCAAAGCCAGCACCCACGGAGGCAGAGACCTCAAAGCCAGCACCCACGGAGGCAGAGACCTCTCAGCCAGCACCCAACGAGGCAGAGACCTCAAAACCAGCACCCACGGAGGCAGAGACCTCAAAACCAGCACCCACGGAGGCAGAGACCACCCAGCTTCCCAGGATTCAGGCTGTAAAAACTCTGTTTACAACGTCTGCAGCCACCGAAGTCCCTTCCACAGAACCTACCACCATGGAGACGGCGTCCACAGAGTCTAACGAGTCTACCATCTTCCTTGGGCCATCCGTGACTCACTTACCTGACAGCGGCCTGAAGAAAGGGCTGATTGTGACCCCTGGGAATTCACCTGCCCCAACCCTGCCAGGGAGTTCAGATCTCATCCCGGTGAAGCAATGTCTGCTGATTATCCTCATCTTGGCTTCTCTGGCCACCATCTTCCTCGTGTGCACAGTGGTGCTGGCGGTCCGTCTGTCCCGTAAGACCCACATGTACCCAGTGCGGAACTACTCCCCCACGGAGATGATCTGCATCTCGTCCCTGCTACCTGAGGGGGGAGACGGGGCCCCTGTCACAGCCAATGGGGGCCTGCCCAAGGTCCAGGACCTGAAGACAGAGCCCAGTGGGGACCGGGATGGGGACGACCTCACCCTGCACAGCTTCCTCCCTTAG
EVIR-Nのアミノ酸配列
配列番号54:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWNRGIL
EVIR-Gのアミノ酸配列
配列番号55:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGHENSELLIPKATHNDSGSYFCRGLIGHNNKSSASFRISLGDPGSPSMFPPWHQITFCLLIGLLFAIDTVLYFSVRRGLQSPVADYEEPKIQWSKEPQDKTRVD
EVIR-Fのアミノ酸配列
配列番号56:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGPGPFPFIQDNISFYATIGLCLPFIVVLIVLICHKYKKQFRYESQLQMIQVTGPLDNEYFYVDFRDYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGRVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSCEKEALMSELKMMTHLGHHDNIVNLLGACTLSGPVYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQAHSNSSMPGSREVQLHPPLDQLSGFNGNLIHSEDEIEYENQKRLAEEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDILSDSSYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQSGFKMEQPFYATEGIYFVMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLAEAEEAMYQNMGGNVPEHPSIYQNRRPLSREAGSEPPSPQAQVKIHGERS
EVIR-Tのアミノ酸配列
配列番号57:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGQLYSLSTLDCSFNRIETSKGILQHFPKSLAFFNLTNNSVACICEHQKFLQWVKEQKQFLVNVEQMTCATPVEMNTSLVLDFNNSTCYMYKTIISVSVVSVIVVSTVAFLIYHFYFHLILIAGCKKYSRGESIYDAFVIYSSQNEDWVRNELVKNLEEGVPRFHLCLHYRDFIPGVAIAANIIQEGFHKSRKVIVVVSRHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRSGIIFIVLEKVEKSLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDNPLGRHIFWRRLKNALLDGKASNPEQTAEEEQETATWT
EVIR-C2のアミノ酸配列
配列番号58:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGMEDNNMLPQFIHGILSTSHSLFTRSIQELDEGATTPYDYDDGEPCHKTSVKQIGAWILPPLYSLVFIFGFVGNMLVIIILIGCKKLKSMTDIYLLNLAISDLLFLLTLPFWAHYAANEWVFGNIMCKVFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVITSVVTWVVAVFASLPGIIFTKSKQDDHHYTCGPYFTQLWKNFQTIMRNILSLILPLLVMVICYSGILHTLFRCRNEKKRHRAVRLIFAIMIVYFLFWTPYNIVLFLTTFQESLGMSNCVIDKHLDQAMQVTETLGMTHCCINPVIYAFVGEKFRRYLSIFFRKHIAKRLCKQCPVFYRETADRVSSTFTPSTGEQEVSVGL
EVIR-Iのアミノ酸配列
配列番号59:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGNARLVECSGRGHCQCNRCICDEGYQPPMCEDCPSCGSHCRDNHTSCAECLKFDKGPFEKNCSVQCAGMTLQTIPLKKKPCKERDSEGCWITYTLQQKDGRNIYNIHVEDSLECVKGPNVAAIVGGTVVGVVLIGVLLLVIWKALTHLTDLREYRRFEKEKLKSQWNNDNPLFKSATTTVMNPKFAES
EVIR-Cのアミノ酸配列
配列番号60:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGTQKMAYSFIEHTFQVQYKKKSDSWEDSKTENLDRAHSMDLSQLEPDTSYCARVRVKPISNYDGIWSKWSEEYTWKTDWVMPTLWIVLILVFLILTLLLILRFGCVSVYRTYRKWKEKIPNPSKSLLFQDGGKGLWPPGSMAAFATKNPALQGPQSRLLAEQQGESYAHLEDNNVSPLTIEDPNIIRVPPSGPDTTPAASSESTEQLPNVQVEGPTPNRPRKQLPSFDFNGPYLGPPQSHSLPDLPDQLGSPQVGGSLKPALPGSLEYMCLPPGGQAQLVPLSQVMGQGQAMDVQCGSSLETSGSPSVEPKENPPVELSMEEQEARDNPVTLPISSGGPEGSMMASDYVTPGDPVLTLPTGPLSTSLGPSLGLPSAQSPRLCLKLPRVPSGSPALGPPGFEDYVELPPSVSQAAKSPPGHPAPPVASSPTVIPGEPREEVGPASPHPEGLLVLQQVGDYCFLPGLGPGSLSPHSKPPSPSLCSETEDLVQDLSVKKFPYQPMPQAPAIQFFKSLKHQDYLSLPPWDNSQSGKVC
EVIR-C1のアミノ酸配列
配列番号61:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGTPCQKTAVRAFGAGLLPPLYSLVFIIGVVGNVLVILVLMQHRRLQSMTSIYLFNLAVSDLVFLFTLPFWIDYKLKDDWIFGDAMCKLLSGFYYLGLYSEIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALRARTVTFGIITSIITWALAILASMPALYFFKAQWEFTHRTCSPHFPYKSLKQWKRFQALKLNLLGLILPLLVMIICYAGIIRILLRRPSEKKVKAVRLIFAITLLFFLLWTPYNLSVFVSAFQDVLFTNQCEQSKQLDLAMQVTEVIAYTHCCVNPIIYVFVGERFWKYLRQLFQRHVAIPLAKWLPFLSVDQLERTSSISPSTGEHELSAGF
EVIR-C5のアミノ酸配列
配列番号62:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGMSAPCQKINVKQIAAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMMVFLILISCKKLKSVTDIYLLNLAISDLLFLLTLPFWAHYAANEWVFGNIMCKVFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKVRTVNFGVITSVVTWAVAVFASLPEIIFTRSQKEGFHYTCSPHFPHTQYHFWKSFQTLKMVILSLILPLLVMVICYSGILHTLFRCRNEKKRHRAVRLIFAIMIVYFLFWTPYNIVLLLTTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQATETLGMTHCCLNPVIYAFVGEKFRSYLSVFFRKHIVKRFCKRCSIFQQDNPDRASSVYTRSTGEHEVSTGL
EVIR-CXのアミノ酸配列
配列番号63:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGFRDENVHFNRIFLPTIYFIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAMADWYFGKFLCKAVHIIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKAVYVGVWIPALLLTIPDFIFADVSQGDISQGDDRYICDRLYPDSLWMVVFQFQHIMVGLVLPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYVGISIDSFILLGVIKQGCDFESIVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKSSAQHALNSMSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS
EVIR-Sのアミノ酸配列
配列番号64:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKFKNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSSTGIATTDPTAPGTGGTAVGMLSTDSATQWSLTSVETVQPASTEVETSQPAPMEAETSQPAPMEAETSQPAPMEADTSKPAPTEAETSKPAPTEAETSQPAPNEAETSKPAPTEAETSKPAPTEAETTQLPRIQAVKTLFTTSAATEVPSTEPTTMETASTESNESTIFLGPSVTHLPDSGLKKGLIVTPGNSPAPTLPGSSDLIPVKQCLLIILILASLATIFLVCTVVLAVRLSRKTHMYPVRNYSPTEMICISSLLPEGGDGAPVTANGGLPKVQDLKTEPSGDRDGDDLTLHSFLP
EVIR-Nの核酸配列
配列番号65:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGCCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGTGGAACAGGGGGATCCTCTAG
EVIR-Gの核酸配列
配列番号66:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTCACGAGAACTCCGAACTGCTGATTCCTAAGGCAACTCACAACGACTCCGGCTCCTATTTCTGTAGAGGGCTGATTGGACATAACAACAAGAGCTCCGCCTCATTCAGGATTAGCCTGGGCGACCCAGGGTCTCCCAGTATGTTCCCCCCTTGGCACCAGATCACCTTTTGCCTGCTGATTGGACTGCTGTTCGCTATCGATACAGTGCTGTACTTTTCTGTCCGGAGAGGCCTGCAGTCACCCGTGGCAGATTACGAAGAACCCAAGATTCAGTGGAGCAAGGAGCCCCAGGATAAGACGCGTGTCGACTGA
EVIR-Fの核酸配列
配列番号67:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTCCAGGCCCCTTCCCTTTCATCCAAGACAACATCTCCTTCTATGCGACCATTGGGCTCTGTCTCCCCTTCATTGTTGTTCTCATTGTGTTGATCTGCCACAAATACAAAAAGCAATTTAGGTACGAGAGTCAGCTGCAGATGATCCAGGTGACTGGCCCCCTGGATAACGAGTACTTCTACGTTGACTTCAGGGACTATGAATATGACCTTAAGTGGGAGTTCCCGAGAGAGAACTTAGAGTTTGGGAAGGTCCTGGGGTCTGGCGCTTTCGGGAGGGTGATGAACGCCACGGCCTATGGCATTAGTAAAACGGGAGTCTCAATTCAGGTGGCGGTGAAGATGCTAAAAGAGAAAGCTGACAGCTGTGAAAAAGAAGCTCTCATGTCGGAGCTCAAAATGATGACCCACCTGGGACACCATGACAACATCGTGAATCTGCTGGGGGCATGCACACTGTCAGGGCCAGTGTACTTGATTTTTGAATATTGTTGCTATGGTGACCTCCTCAACTACCTAAGAAGTAAAAGAGAGAAGTTTCACAGGACATGGACAGAGATTTTTAAGGAACATAATTTCAGTTTTTACCCTACTTTCCAGGCACATTCAAATTCCAGCATGCCTGGTTCACGAGAAGTTCAGTTACACCCGCCCTTGGATCAGCTCTCAGGGTTCAATGGGAATTTAATTCATTCTGAAGATGAGATTGAATATGAAAACCAGAAGAGGCTGGCAGAAGAAGAGGAGGAAGATTTGAACGTGCTGACGTTTGAAGACCTCCTTTGCTTTGCGTACCAAGTGGCCAAAGGCATGGAATTCCTGGAGTTCAAGTCGTGTGTCCACAGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTGTTGGTCACCCACGGGAAGGTGGTGAAGATCTGTGACTTTGGACTGGCCCGAGACATCCTGAGCGACTCCAGCTACGTCGTCAGGGGCAACGCACGGCTGCCGGTGAAGTGGATGGCACCTGAGAGCTTATTTGAAGGGATCTACACAATCAAGAGTGACGTCTGGTCCTACGGCATCCTTCTCTGGGAGATATTTTCACTGGGTGTGAACCCTTACCCTGGCATTCCTGTCGACGCTAACTTCTATAAACTGATTCAGAGTGGATTTAAAATGGAGCAGCCATTCTATGCCACAGAAGGGATATACTTTGTAATGCAATCCTGCTGGGCTTTTGACTCAAGGAAGCGGCCATCCTTCCCCAACCTGACTTCATTTTTAGGATGTCAGCTGGCAGAGGCAGAAGAAGCGATGTATCAGAACATGGGTGGCAACGTCCCAGAACATCCATCCATCTACCAAAACAGGCGGCCCCTCAGCAGAGAGGCAGGCTCAGAGCCGCCATCGCCACAGGCCCAGGTGAAGATTCACGGAGAAAGAAGTTAG
EVIR-Tの核酸配列
配列番号68:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTCAGCTGTATTCCCTCAGCACTCTTGATTGCAGTTTCAATCGCATAGAGACATCTAAAGGAATACTGCAACATTTTCCAAAGAGTCTAGCCTTCTTCAATCTTACTAACAATTCTGTTGCTTGTATATGTGAACATCAGAAATTCCTGCAGTGGGTCAAGGAACAGAAGCAGTTCTTGGTGAATGTTGAACAAATGACATGTGCAACACCTGTAGAGATGAATACCTCCTTAGTGTTGGATTTTAATAATTCTACCTGTTATATGTACAAGACAATCATCAGTGTGTCAGTGGTCAGTGTGATTGTGGTATCCACTGTAGCATTTCTGATATACCACTTCTATTTTCACCTGATACTTATTGCTGGCTGTAAAAAGTACAGCAGAGGAGAAAGCATCTATGATGCATTTGTGATCTACTCGAGTCAGAATGAGGACTGGGTGAGAAATGAGCTGGTAAAGAATTTAGAAGAAGGAGTGCCCCGCTTTCACCTCTGCCTTCACTACAGAGACTTTATTCCTGGTGTAGCCATTGCTGCCAACATCATCCAGGAAGGCTTCCACAAGAGCCGGAAGGTTATTGTGGTAGTGTCTAGACACTTTATTCAGAGCCGTTGGTGTATCTTTGAATATGAGATTGCTCAAACATGGCAGTTTCTGAGCAGCCGCTCTGGCATCATCTTCATTGTCCTTGAGAAGGTTGAGAAGTCCCTGCTGAGGCAGCAGGTGGAATTGTATCGCCTTCTTAGCAGAAACACCTACCTGGAATGGGAGGACAATCCTCTGGGGAGGCACATCTTCTGGAGAAGACTTAAAAATGCCCTATTGGATGGAAAAGCCTCGAATCCTGAGCAAACAGCAGAGGAAGAACAAGAAACGGCAACTTGGACCTGA
EVIR-C2の核酸配列
配列番号69:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTATGGAAGACAATAATATGTTACCTCAGTTCATCCATGGCATACTATCAACATCTCATTCTCTATTTACACGAAGTATCCAAGAGCTTGATGAAGGGGCCACCACACCGTATGACTACGATGATGGTGAGCCTTGTCATAAAACCAGTGTGAAGCAAATTGGAGCTTGGATCCTGCCTCCACTCTACTCCCTGGTATTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGTTGGTCATTATAATTCTGATAGGCTGTAAAAAGCTGAAGAGCATGACTGATATCTATCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGCTCTTCCTGCTCACATTACCATTCTGGGCTCACTATGCTGCAAATGAGTGGGTCTTTGGGAATATAATGTGTAAAGTATTCACAGGGCTCTATCACATTGGTTATTTTGGTGGAATCTTTTTCATTATCCTCCTGACAATTGATAGGTACTTGGCTATTGTTCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACAGTTACCTTTGGGGTGATAACAAGTGTAGTCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCCTCTCTACCAGGAATCATATTTACTAAATCCAAACAAGATGATCACCATTACACCTGTGGCCCTTATTTTACACAACTATGGAAGAATTTCCAAACAATAATGAGAAATATCTTGAGCCTGATCCTGCCTCTACTTGTCATGGTCATCTGCTACTCAGGAATTCTCCACACCCTGTTTCGCTGTAGGAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTCATCTTTGCCATCATGATTGTCTACTTTCTCTTCTGGACTCCATACAATATTGTTCTCTTCTTGACCACCTTCCAGGAATCCTTGGGAATGAGTAACTGTGTGATTGACAAGCACTTAGACCAGGCCATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGAATGACACACTGCTGCATTAATCCTGTCATTTATGCCTTTGTTGGAGAGAAGTTCCGAAGGTATCTCTCCATATTTTTCAGAAAGCACATTGCTAAACGTCTCTGCAAACAGTGCCCAGTTTTCTATAGGGAGACAGCAGATCGAGTGAGCTCTACATTCACTCCTTCCACTGGGGAGCAAGAGGTCTCGGTTGGGTTGTAA
EVIR-Iの核酸配列
配列番号70:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTAATGCACGGCTGGTAGAGTGCAGTGGCCGTGGCCACTGCCAATGCAACAGGTGCATATGTGACGAAGGCTACCAGCCACCGATGTGTGAGGATTGTCCCAGCTGTGGCTCGCACTGCAGGGACAACCACACCTCTTGTGCCGAGTGCCTGAAGTTTGATAAGGGCCCTTTTGAGAAGAACTGTAGTGTTCAGTGTGCTGGTATGACGCTGCAGACTATCCCTTTGAAGAAAAAGCCCTGCAAGGAGAGGGACTCGGAAGGCTGTTGGATAACTTACACTTTGCAGCAGAAGGACGGAAGGAACATTTACAACATCCATGTGGAGGACAGTCTAGAGTGTGTGAAGGGCCCCAATGTGGCTGCCATCGTAGGGGGCACCGTGGTAGGTGTCGTACTGATTGGTGTCCTCCTCCTGGTCATCTGGAAGGCCCTGACCCACCTGACTGACCTCAGGGAGTACAGGCGCTTTGAGAAGGAGAAACTCAAGTCCCAATGGAACAATGACAACCCCCTCTTCAAGAGTGCTACGACAACGGTCATGAACCCCAAGTTTGCTGAAAGCTAG
EVIR-Cの核酸配列
配列番号71:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTACTCAGAAGATGGCTTACTCATTCATTGAGCACACATTCCAGGTCCAGTACAAGAAGAAATCGGACAGCTGGGAGGACAGCAAGACAGAGAACCTAGATCGAGCCCATAGCATGGACCTCTCCCAGCTGGAGCCAGACACCTCATACTGCGCCAGGGTGAGGGTCAAGCCCATCTCTAACTACGATGGGATCTGGAGCAAGTGGAGCGAAGAGTACACTTGGAAGACTGACTGGGTGATGCCCACGCTGTGGATAGTCCTCATCCTGGTCTTTCTCATCCTCACCTTGCTCCTGATCCTTCGCTTTGGCTGTGTCTCTGTATACAGGACGTACAGGAAGTGGAAGGAAAAGATCCCCAACCCCAGCAAGAGCCTCCTGTTCCAGGATGGAGGTAAAGGTCTCTGGCCTCCTGGCAGCATGGCAGCCTTCGCCACTAAGAACCCCGCTCTCCAGGGGCCACAGAGCAGGCTTCTTGCTGAGCAACAGGGGGAGTCATATGCACATTTGGAAGACAACAACGTGTCACCTCTCACTATAGAGGACCCTAATATAATTCGAGTTCCACCATCCGGGCCTGATACAACCCCAGCTGCCTCATCCGAATCCACAGAGCAACTTCCCAATGTTCAAGTAGAGGGACCAACTCCTAACAGACCTAGGAAGCAATTACCCAGCTTTGACTTCAATGGGCCCTACCTGGGGCCTCCCCAATCCCACTCTCTGCCTGATCTCCCAGACCAGCTGGGTTCCCCCCAGGTGGGTGGGAGCCTGAAGCCAGCACTGCCAGGCTCCTTGGAGTACATGTGTCTGCCCCCTGGAGGTCAAGCGCAACTGGTTCCATTGTCCCAGGTGATGGGGCAGGGCCAGGCTATGGATGTGCAGTGTGGGTCCAGCCTGGAGACCTCAGGGAGCCCTTCTGTGGAGCCAAAGGAGAACCCTCCAGTTGAGCTGAGCATGGAGGAACAGGAGGCACGGGACAACCCAGTGACTCTGCCCATAAGCTCTGGGGGCCCTGAGGGCAGTATGATGGCCTCTGATTATGTCACTCCTGGAGATCCGGTGCTCACTCTGCCCACAGGGCCCCTGTCTACCTCTCTGGGCCCCTCTCTAGGGTTGCCCTCAGCCCAAAGCCCCCGTCTCTGTCTTAAGCTGCCCAGGGTCCCCTCTGGAAGCCCAGCTCTAGGGCCACCAGGGTTTGAGGACTATGTGGAGCTGCCTCCAAGTGTGAGCCAGGCTGCCAAGTCCCCTCCAGGCCATCCTGCTCCTCCTGTGGCAAGCAGCCCCACAGTGATCCCAGGAGAGCCCAGGGAGGAAGTGGGCCCAGCATCCCCACATCCCGAAGGCCTCCTTGTTCTTCAGCAGGTTGGGGACTACTGCTTCCTCCCTGGCCTGGGACCTGGCTCCCTCTCACCACACAGTAAGCCACCCTCTCCAAGTCTGTGTTCTGAGACTGAGGACCTAGTCCAGGACTTGTCTGTCAAAAAGTTTCCCTATCAGCCCATGCCCCAGGCGCCAGCCATTCAGTTTTTCAAGTCCCTAAAGCATCAGGACTACCTGTCCCTGCCCCCTTGGGACAATAGCCAGTCTGGGAAGGTGTGCTGA
EVIR-C1の核酸配列
配列番号72:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTACTCCATGCCAAAAGACTGCTGTAAGAGCCTTTGGGGCTGGACTCCTGCCCCCCCTGTATTCTCTAGTGTTCATCATTGGAGTGGTGGGCAATGTCCTAGTGATTCTGGTGCTCATGCAGCATAGGAGGCTTCAAAGCATGACCAGCATCTACCTGTTCAACCTGGCTGTCTCTGATCTGGTCTTCCTTTTCACTTTACCTTTCTGGATTGACTACAAGTTGAAAGACGACTGGATTTTTGGTGATGCCATGTGCAAGCTTCTCTCTGGGTTTTATTACCTGGGTTTATACAGTGAGATCTTCTTTATCATCCTGTTGACGATTGACAGATACCTGGCCATTGTCCATGCTGTGTTTGCCCTGAGGGCCCGAACTGTTACTTTTGGCATCATCACCAGTATTATCACCTGGGCCCTAGCCATCTTAGCTTCCATGCCTGCCTTATACTTTTTTAAGGCCCAGTGGGAGTTCACTCACCGTACCTGTAGCCCTCATTTCCCCTACAAGAGCCTGAAGCAGTGGAAGAGGTTTCAAGCTCTAAAGCTAAACCTTCTTGGACTAATTTTGCCTCTGTTAGTCATGATAATCTGCTATGCAGGGATCATCAGAATTCTGCTCAGAAGACCCAGTGAGAAGAAGGTCAAAGCCGTGCGTCTGATATTTGCTATTACTCTTCTATTCTTCCTCCTCTGGACCCCCTACAATCTGAGTGTATTTGTTTCTGCTTTCCAAGATGTTCTATTCACCAATCAGTGTGAGCAGAGTAAGCAACTGGACCTGGCCATGCAGGTGACTGAGGTGATTGCCTACACCCACTGTTGTGTCAACCCAATCATTTATGTTTTTGTGGGTGAACGGTTCTGGAAGTACCTTCGGCAGCTGTTTCAAAGGCATGTGGCTATACCACTGGCAAAATGGCTGCCCTTCCTCTCTGTGGACCAACTAGAAAGGACCAGTTCTATATCTCCATCCACAGGAGAACATGAGCTCTCTGCTGGCTTCTGA
EVIR-C5の核酸配列
配列番号73:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTATGTCAGCACCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAACAAATTGCGGCTCAGCTCCTGCCCCCACTCTACTCCCTGGTATTCATCTTTGGTTTTGTGGGTAACATGATGGTCTTCCTCATCTTGATAAGCTGCAAAAAGCTGAAGAGCGTGACTGATATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGCTCTTCCTGCTCACACTACCATTCTGGGCTCACTATGCTGCAAATGAGTGGGTCTTTGGGAACATAATGTGTAAAGTATTCACAGGGCTCTATCACATTGGTTATTTTGGTGGAATCTTCTTCATTATCCTCCTGACAATTGATAGGTACTTGGCTATTGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGTCAGAACGGTCAACTTTGGGGTGATAACAAGTGTAGTCACTTGGGCGGTGGCTGTGTTTGCCTCTCTCCCAGAAATAATCTTTACCAGATCTCAGAAAGAAGGTTTTCATTATACATGCAGTCCTCATTTTCCACACACTCAGTATCATTTCTGGAAGAGTTTCCAAACATTAAAGATGGTCATCTTGAGCCTGATCCTGCCTCTACTTGTCATGGTCATCTGCTACTCAGGAATTCTCCACACCCTGTTTCGCTGTAGGAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTCATCTTTGCCATCATGATTGTCTACTTTCTCTTCTGGACTCCCTACAACATTGTCCTCCTCCTGACCACCTTCCAGGAATTCTTTGGACTGAATAACTGCAGTAGTTCTAATAGACTAGACCAGGCCATGCAGGCAACAGAGACTCTTGGAATGACACACTGCTGCCTAAACCCTGTCATCTATGCCTTTGTTGGAGAGAAGTTCCGGAGTTATCTCTCAGTGTTCTTCCGAAAACACATTGTCAAACGCTTTTGCAAACGGTGTTCAATTTTCCAGCAAGACAATCCTGATCGTGCAAGCTCAGTCTATACCCGATCCACAGGAGAACATGAAGTTTCTACTGGTTTATGA
EVIR-CXの核酸配列
配列番号74:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGGTTCCGGGATGAAAACGTCCATTTCAATAGGATCTTCCTGCCCACCATCTACTTCATCATCTTCTTGACTGGCATAGTCGGCAATGGATTGGTGATCCTGGTCATGGGTTACCAGAAGAAGCTAAGGAGCATGACGGACAAGTACCGGCTGCACCTGTCAGTGGCTGACCTCCTCTTTGTCATCACACTCCCCTTCTGGGCAGTTGATGCCATGGCTGACTGGTACTTTGGGAAATTTTTGTGTAAGGCTGTCCATATCATCTACACTGTCAACCTCTACAGCAGCGTTCTCATCCTGGCCTTCATCAGCCTGGACCGGTACCTCGCTATTGTCCACGCCACCAACAGTCAGAGGCCAAGGAAACTGCTGGCTGAAAAGGCAGTCTATGTGGGCGTCTGGATCCCAGCCCTCCTCCTGACTATACCTGACTTCATCTTTGCCGACGTCAGCCAGGGGGACATCAGTCAGGGGGATGACAGGTACATCTGTGACCGCCTTTACCCCGATAGCCTGTGGATGGTGGTGTTTCAATTCCAGCATATAATGGTGGGTCTCGTCCTGCCCGGCATCGTCATCCTCTCCTGTTACTGCATCATCATCTCTAAGCTGTCACACTCCAAGGGCCACCAGAAGCGCAAGGCCCTCAAGACGACAGTCATCCTCATCCTAGCTTTCTTTGCCTGCTGGCTGCCATATTATGTGGGGATCAGCATCGACTCCTTCATCCTTTTGGGGGTCATCAAGCAAGGATGTGACTTCGAGAGCATCGTGCACAAGTGGATCTCCATCACAGAGGCCCTCGCCTTCTTCCACTGTTGCCTGAACCCCATCCTCTATGCCTTCCTCGGGGCCAAGTTCAAAAGCTCTGCCCAGCATGCACTCAACTCCATGAGCAGAGGCTCCAGCCTCAAGATCCTTTCCAAAGGAAAGCGGGGTGGACACTCTTCCGTCTCCACGGAGTCAGAATCCTCCAGTTTTCACTCCAGCTAA
EVIR-Sの核酸配列
配列番号75:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGGGATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGCACCGGTATTGCCACCACTGACCCTACTGCCCCAGGTACAGGAGGGACAGCTGTTGGGATGCTGAGCACAGACTCTGCCACACAGTGGAGTCTAACCTCAGTAGAGACCGTCCAACCAGCATCCACAGAGGTAGAGACCTCGCAGCCAGCACCCATGGAGGCAGAGACCTCGCAGCCAGCACCCATGGAGGCAGAGACCTCGCAGCCAGCACCCATGGAGGCAGACACCTCAAAGCCAGCACCCACGGAGGCAGAGACCTCAAAGCCAGCACCCACGGAGGCAGAGACCTCTCAGCCAGCACCCAACGAGGCAGAGACCTCAAAACCAGCACCCACGGAGGCAGAGACCTCAAAACCAGCACCCACGGAGGCAGAGACCACCCAGCTTCCCAGGATTCAGGCTGTAAAAACTCTGTTTACAACGTCTGCAGCCACCGAAGTCCCTTCCACAGAACCTACCACCATGGAGACGGCGTCCACAGAGTCTAACGAGTCTACCATCTTCCTTGGGCCATCCGTGACTCACTTACCTGACAGCGGCCTGAAGAAAGGGCTGATTGTGACCCCTGGGAATTCACCTGCCCCAACCCTGCCAGGGAGTTCAGATCTCATCCCGGTGAAGCAATGTCTGCTGATTATCCTCATCTTGGCTTCTCTGGCCACCATCTTCCTCGTGTGCACAGTGGTGCTGGCGGTCCGTCTGTCCCGTAAGACCCACATGTACCCAGTGCGGAACTACTCCCCCACGGAGATGATCTGCATCTCGTCCCTGCTACCTGAGGGGGGAGACGGGGCCCCTGTCACAGCCAATGGGGGCCTGCCCAAGGTCCAGGACCTGAAGACAGAGCCCAGTGGGGACCGGGATGGGGACGACCTCACCCTGCACAGCTTCCTCCCTTAG
抗HER2 scFvトラスツズマブの核酸配列
配列番号76:
GATATTCAGATGACCCAGTCCCCCAGCTCCCTGTCAGCAAGCGTGGGCGACCGAGTCACTATCACCTGCCGAGCTAGCCAGGATGTGAACACCGCAGTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCCAAGCTGCTCATCTACTCCGCCTCTTTCCTGTATTCAGGAGTGCCAAGCAGGTTTAGTGGCTCAAGAAGCGGAACTGACTTCACACTGACTATCTCTAGTCTCCAGCCCGAGGATTTTGCAACCTACTATTGCCAGCAGCACTATACCACACCCCCTACCTTCGGTCAGGGCACAAAAGTGGAAATTAAGCGGACCGGCTCCACATCTGGAAGTGGGAAGCCCGGTTCCGGCGAGGGATCTGAAGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGAGGAGGACTCGTGCAGCCTGGTGGCAGTCTGAGGCTCTCATGTGCCGCTAGCGGCTTCAACATCAAAGACACATACATTCATTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGGAAGGGTCTGGAATGGGTCGCACGAATCTATCCAACTAATGGGTACACCCGATATGCTGACTCTGTGAAAGGCAGGTTCACAATTTCCGCCGATACATCTAAGAACACTGCTTACCTGCAGATGAATAGTCTCAGAGCTGAGGATACTGCAGTCTACTATTGTAGCCGGTGGGGAGGGGATGGCTTCTATGCTATGGATGTCTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACTGTCTCAAGTGGTACCGGTACGCGTG
抗HER2 scFvペルツズマブの核酸配列
配列番号77:
GATATTCAGATGACCCAGAGCCCAAGCTCCCTGTCAGCTAGCGTGGGCGACCGAGTCACCATCACATGCAAAGCCAGTCAGGATGTGTCAATTGGCGTCGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAAGCTCCTAAGCTGCTCATCTATTCCGCATCTTACAGGTACACAGGCGTGCCCTCTCGCTTCAGTGGTTCAGGCAGCGGAACTGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTCCAGCCTGAGGATTTCGCAACCTACTATTGTCAGCAGTACTATATCTACCCATATACCTTTGGGCAGGGTACAAAAGTGGAAATTAAGAGAACAGTCGCAGCTCCAGGAGGAGGAGGTAGCGGAGGAGGGGGTTCCGGCGGAGGGGGTTCTGGCGGAGGGGGTAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGAGGAGGACTCGTGCAGCCTGGTGGCAGCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGCTTCACCTTCACCGACTACACCATGGATTGGGTGCGGCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGACGTCAACCCCAATTCCGGAGGGTCTATCTACAACCAGAGGTTCAAAGGAAGGTTCACCCTGAGTGTGGATCGATCAAAGAACACCCTGTATCTCCAGATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACAGCCGTCTATTATTGTGCAAGAAACCTGGGTCCATCATTTTATTTTGACTATTGG
抗HER2 scFv FRP5の核酸配列
配列番号78:
CAGGTCCAGCTCCAGCAGTCAGGTCCAGAACTCAAGAAGCCAGGGGAAACAGTCAAAATCTCATGTAAAGCCTCAGGATACCCATTCACTAACTATGGGATGAATTGGGTGAAGCAGGCACCTGGCCAGGGACTGAAATGGATGGGTTGGATCAACACTAGCACCGGGGAGTCCACATTCGCCGACGATTTTAAGGGCCGGTTCGACTTTTCTCTCGAAACCAGTGCAAATACAGCCTATCTGCAGATTAACAATCTCAAATCCGAGGATATGGCCACCTACTTCTGCGCTCGCTGGGAAGTGTACCACGGATATGTCCCATACTGGGGGCAGGGTACCACAGTGACAGTCAGCTCCGGAGGAGGAGGTTCAGGAGGAGGAGGTAGCGGAGGAGGAGGTTCCGACATCCAGCTGACACAGTCTCATAAGTTTCTCTCCACTTCTGTGGGCGACAGGGTCTCTATTACCTGTAAAGCTAGTCAGGATGTGTATAACGCCGTCGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCTAAACTGCTCATCTATAGCGCCTCTAGTAGGTACACTGGAGTGCCAAGCAGATTCACCGGCAGTGGATCAGGGCCCGACTTCACCTTCACCATTTCAAGCGTGCAGGCTGAGGATCTGGCAGTCTACTTTTGCCAGCAGCATTTTCGCACCCCTTTCACCTTTGGAAGCGGGACTAAACTGGAGATTAAGAGGA
dLNGFR由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号79:
LLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN
dLNGFR由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号80:
LIPVYCSILAAVVVGLVAYIAF
dLNGFR由来の細胞内ドメインのアミノ酸配列
配列番号81:
KRWNRGIL
FCγRIIIA由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号82:
HENSELLIPKATHNDSGSYFCRGLIGHNNKSSASFRISLGDPGSPSMFPP
FcγRIIIA由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号83:
WHQITFCLLIGLLFAIDTVLYF
FCγRIIIA由来の細胞内ドメインのアミノ酸配列
配列番号84:
SVRRGLQSPVADYEEPKIQWSKEPQDKTRVD
FLT3由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号85:
PGPFPFIQDN
FLT3由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号86:
ISFYATIGLCLPFIVVLIVLIC
FLT3由来の細胞内ドメインのアミノ酸配列
配列番号87:
HKYKKQFRYESQLQMIQVTGPLDNEYFYVDFRDYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGRVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSCEKEALMSELKMMTHLGHHDNIVNLLGACTLSGPVYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQAHSNSSMPGSREVQLHPPLDQLSGFNGNLIHSEDEIEYENQKRLAEEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDILSDSSYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQSGFKMEQPFYATEGIYFVMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLAEAEEAMYQNMGGNVPEHPSIYQNRRPLSREAGSEPPSPQAQVKIHGERS
TLR4由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号88:
QLYSLSTLDCSFNRIETSKGILQHFPKSLAFFNLTNNSVACICEHQKFLQWVKEQKQFLVNVEQMTCATPVEMNTSLVLDFNNSTCYMYKTIISVSVVS
TLR4由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号89:
VIVVSTVAFLIYHFYFHLILI
TLR4由来の細胞内ドメインのアミノ酸配列
配列番号90:
AGCKKYSRGESIYDAFVIYSSQNEDWVRNELVKNLEEGVPRFHLCLHYRDFIPGVAIAANIIQEGFHKSRKVIVVVSRHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRSGIIFIVLEKVEKSLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDNPLGRHIFWRRLKNALLDGKASNPEQTAEEEQETATWT
CCR2由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号91:
MEDNNMLPQFIHGILSTSHSLFTRSIQELDEGATTPYDYDDGEPCHKTSVKQIGA
ITGB2由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号92:
NARLVECSGRGHCQCNRCICDEGYQPPMCEDCPSCGSHCRDNHTSCAECLKFDKGPFEKNCSVQCAGMTLQTIPLKKKPCKERDSEGCWITYTLQQKDGRNIYNIHVEDSLECVKGPN
ITGB2由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号93:
VAAIVGGTVVGVVLIGVLLLVIW
ITGB2由来の細胞内ドメインのアミノ酸配列
配列番号94:
KALTHLTDLREYRRFEKEKLKSQWNNDNPLFKSATTTVMNPKFAES
CSF2RB由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号95:
TQKMAYSFIEHTFQVQYKKKSDSWEDSKTENLDRAHSMDLSQLEPDTSYCARVRVKPISNYDGIWSKWSEEYTWKTDW
CSF2RB由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号96:
VMPTLWIVLILVFLILTLLLIL
CSF2RB由来の細胞内ドメインのアミノ酸配列
配列番号97:
RFGCVSVYRTYRKWKEKIPNPSKSLLFQDGGKGLWPPGSMAAFATKNPALQGPQSRLLAEQQGESYAHLEDNNVSPLTIEDPNIIRVPPSGPDTTPAASSESTEQLPNVQVEGPTPNRPRKQLPSFDFNGPYLGPPQSHSLPDLPDQLGSPQVGGSLKPALPGSLEYMCLPPGGQAQLVPLSQVMGQGQAMDVQCGSSLETSGSPSVEPKENPPVELSMEEQEARDNPVTLPISSGGPEGSMMASDYVTPGDPVLTLPTGPLSTSLGPSLGLPSAQSPRLCLKLPRVPSGSPALGPPGFEDYVELPPSVSQAAKSPPGHPAPPVASSPTVIPGEPREEVGPASPHPEGLLVLQQVGDYCFLPGLGPGSLSPHSKPPSPSLCSETEDLVQDLSVKKFPYQPMPQAPAIQFFKSLKHQDYLSLPPWDNSQSGKVC
CCR1由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号98:
TPCQKTAVRAFGA
CCR5由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号99:
MSAPCQKINVKQIAA
CXCR4由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号100:
FRDENVHFNR
SELPLG由来のヒンジドメインのアミノ酸配列
配列番号101:
IATTDPTAPGTGGTAVGMLSTDSATQWSLTSVETVQPASTEVETSQPAPMEAETSQPAPMEAETSQPAPMEADTSKPAPTEAETSKPAPTEAETSQPAPNEAETSKPAPTEAETSKPAPTEAETTQLPRIQAVKTLFTTSAATEVPSTEPTTMETASTESNESTIFLGPSVTHLPDSGLKKGLIVTPGNSPAPTLPGSSDLIPVKQC
SELPLG由来の膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号102:
LLIILILASLATIFLVCTVVL
SELPLG由来の細胞内ドメインのアミノ酸配列
配列番号103:
AVRLSRKTHMYPVRNYSPTEMICISSLLPEGGDGAPVTANGGLPKVQDLKTEPSGDRDGDDLTLHSFLP
DNA操作を容易にするペプチドのアミノ酸配列
配列番号104:
TG
IgKドメイン(FRP5及びトラスツズマブの場合)の核酸配列
配列番号105: ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCTCTTTCCTCCTCATTTCCGCCTCAGTGATTATGTCAAGGGGG
IgKドメイン(ペルツズマブの場合)の核酸配列
配列番号106: ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCTCCTTTCTCCTCATTTCAGCCAGCGTGATTATGTCTCGGGGG
DNA操作を容易にするペプチドの核酸配列
配列番号107:
ACCGGT
DNA操作を容易にするペプチドの核酸配列
配列番号108:
ACCGGG
IgKドメイン(EVIR-N1の場合)の核酸配列
配列番号109:
ATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCTCCGCCAGCGTGATCATGAGCAGAGGC
IgKドメイン(EVIR-N2の場合)の核酸配列
配列番号110:
ATGGATTTTCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCTCCGCCAGCGTGATCATGAGCAGAGGC
抗TYRP1 scFv TA99の核酸配列
配列番号111:
GACATCCAGATGAGCCAGAGCCCTGCCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGAGACAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCGGCAACATCTACAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCAGGGCAAGAGCCCCCATCTGCTGGTGTACGACGCCAAGACACTGGCCGACGGCGTGCCCTCTAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCCAGTACAGCCTGAAGATCAGCTCCCTGCAGACCGAGGACTCCGGCAACTACTACTGCCAGCACTTCTGGTCCCTGCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCTGGGGGCGGAGGAAGTGGCGGGGGAGGATCTGAAGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCTGAGCTCGTGCGACCTGGCGCTCTCGTGAAGCTGAGCTGCAAGACCAGCGGCTTCAATATCAAGGACTACTTCCTGCACTGGGTGCGACAGAGGCCTGACCAGGGCCTGGAATGGATCGGCTGGATCAACCCCGACAACGGCAACACCGTGTACGACCCTAAGTTCCAGGGCACCGCCAGCCTGACAGCCGACACAAGCTCCAACACAGTGTACCTGCAGCTGAGCGGCCTGACCTCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCACCAGAAGAGACTACACCTACGAGAAGGCCGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGAACAACCGTGACCGTGTCC
抗GD2 scFv 14G2aの核酸配列
配列番号112:
GAAGTTCAGCTGCTGCAGAGCGGACCCGAACTGGAAAAACCTGGCGCCTCCGTGATGATCAGCTGCAAGGCCTCTGGCAGCTCCTTCACCGGCTACAACATGAACTGGGTCCGACAGAACATCGGCAAGAGCCTGGAATGGATCGGCGCCATCGATCCTTACTACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAGAGCCACACTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACAGCCTACATGCATCTGAAGTCCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGTGTCCGGCATGGAATACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACAGTCTCTTCTGGCGGCGGTGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATGTGGTCATGACACAGACCCCTCTGAGCCTGCCTGTGTCTCTGGGAGATCAGGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGAAACGGCAACACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCCACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCTCTGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTTCTGTAGCCAGAGCACACACGTGCCACCTCTGACATTTGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTG
TA99ベース抗TYRP1 scFvのアミノ酸配列
配列番号113:
DIQMSQSPASLSASVGETVTITCRASGNIYNYLAWYQQKQGKSPHLLVYDAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKISSLQTEDSGNYYCQHFWSLPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKTSGFNIKDYFLHWVRQRPDQGLEWIGWINPDNGNTVYDPKFQGTASLTADTSSNTVYLQLSGLTSEDTAVYFCTRRDYTYEKAALDYWGQGTTVTVS
14G2aベース抗GD2 scFvのアミノ酸配列
配列番号114:
EVQLLQSGPELEKPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLEL
Cxcl9_Fw_XmaIの核酸配列
配列番号115: AAAAACCCGGGTCACTCCAACACAGTGACTC
Cxcl9_Rv_SalI/NheIの核酸配列
配列番号116: AAAAAGTCGACGCTAGCCAGGGTGCTTGTTGGTAAAGT
Cxcl9の核酸配列
配列番号117:
tcactccaacacagtgactcaatagaactcagctctgccatgaagtccgctgttcttttcctcttgggcatcatcttcctggagcagtgtggagttcgaggaaccctagtgataaggaatgcacgatgctcctgcatcagcaccagccgaggcacgatccactacaaatccctcaaagacctcaaacagtttgccccaagccccaattgcaacaaaactgaaatcattgctacactgaagaacggagatcaaacctgcctagatccggactcggcaaatgtgaagaagctgatgaaagaatgggaaaagaagatcagccaaaagaaaaagcaaaagagggggaaaaaacatcaaaagaacatgaaaaacagaaaacccaaaacaccccaaagtcgtcgtcgttcaaggaagactacataagagaccattactttaccaacaagcaccctg
GM-CSF_Fw_XmaIの核酸配列
配列番号118: AAAAACCCGGGCAGAGAGAAAGGCTAAGGTCC
GM-CSF_Rv_SalI/NheIの核酸配列
配列番号119: AAAAAGTCGACGCTAGCAGTCTGAGAAGCTGGATT
GM-CSFの核酸配列
配列番号120: CAGAGAGAAAGGCTAAGGTCCTGAGGAGGATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAATGAGGAAGCCCAGGCCAGCTCTGAATCCAGCTTCTCAGACT
IFNγ_Fw_XmaIの核酸配列
配列番号121: AAAAACCCGGGAGTTCTGGGCTTCTCCTCCT
IFNγ_Rv_SalI/NheIの核酸配列
配列番号122: AAAAAGTCGACGCTAGCGACAATCTCTTCCCCACCCC
IFNγの核酸配列
配列番号123: AGTTCTGGGCTTCTCCTCCTGCGGCCTAGCTCTGAGACAATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCTCATGGCTGTTTCTGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTTTAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGAACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTACCTCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTCATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCATTCATGAGTATTGCCAAGTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATTCAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTCAGGAAGCGGAAAAGGAGTCGCTGCTGATTCGGGGTGGGGAAGAGATTGTC
LIN28_Fw_BamHIの核酸配列
配列番号124: AAAAAGGATCCCTTTGCCTCCGGACTTCTCTGG
LIN28_Rv_SalIの核酸配列
配列番号125: AAAAAGTCGACAAAGACAGGGTGACACTGGGA
LIN28(PstI及びSmaI-マウス栄養膜細胞)の核酸配列
配列番号126: CTTTGCCTCCGGACTTCTCTGGGGCCAGCAGCCGCCCGACCTGGGGCCCGGGGCCACGGGCTCAGCAGACGACCATGGGCTCGGTGTCCAACCAGCAGTTTGCAGGTGGCTGCGCCAAGGCAGCGGAGAAGGCGCCAGAGGAGGCGCCGCCTGACGCGGCCCGAGCGGCAGACGAGCCGCAGCTGCTGCACGGGGCCGGCATCTGTAAGTGGTTCAACGTGCGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCTATGACCGCCCGCGCTGGGGTCGCGCTCGACCCCCCGGTGGACGTCTTTGTGCACCAGAGCAAGCTGCACATGGAAGGGTTCCGAAGCCTCAAGGAGGGTGAGGCGGTGGAGTTCACCTTTAAGAAGTCTGCCAAGGGTCTGGAATCCATCCGTGTCACTGGCCCTGGTGGTGTGTTCTGTATTGGAAGTGAGCGGCGGCCAAAGGGGAAGAACATGCAGAAGCGAAGATCCAAAGGAGACAGGTGCTACAACTGCGGTGGGCTAGACCATCATGCCAAGGAATGCAAGCTGCCACCCCAGCCCAAGAAGTGCCACTTTTGCCAAAGCATCAACCATATGGTGGCCTCGTGTCCACTGAAGGCCCAGCAGGGCCCCAGTTCTCAGGGAAAGCCTGCCTACTTCCGGGAGGAAGAGGAAGAGATCCACAGCCCTGCCCTGCTCCCAGAAGCCCAGAATTGAGGCCCAGGAGTCAGGGTTATTCTTTGGCTAATGGGGAGTTTAAGGAAAGAGGCATCAATCTGCAGAGTGGAGAAAGTGGGGGTAAGGGTGGGTTGCGTGGGTAGCTTGCACTGCCGTGTCTCAGGCCGGGGTTCCCAGTGTCACCCTGTCTTT
CD40(AfeI/NheI-平滑化双方向性のGeneArt CD40平滑部位(SmaI-AgeI-平滑化))の核酸配列
配列番号:127:
GCCACCATGGTCTCTCTCCCTCGGCTGTGTGCTCTGTGGGGTTGTCTGCTCACCGCTGTGCATCTCGGCCAGTGTGTGACTTGTTCTGATAAACAGTACCTGCATGACGGGCAGTGCTGTGATCTGTGCCAGCCCGGTTCTAGGCTCACCAGTCATTGTACAGCCCTGGAGAAGACTCAGTGCCACCCTTGTGACTCAGGGGAGTTCAGCGCTCAGTGGAACCGAGAAATTAGGTGCCACCAGCATAGACACTGTGAGCCTAATCAGGGGCTGCGGGTGAAGAAAGAGGGTACCGCAGAAAGTGACACTGTCTGCACCTGTAAGGAGGGCCAGCATTGCACCTCAAAAGATTGCGAAGCTTGTGCACAGCACACACCTTGTATCCCAGGCTTCGGAGTGATGGAGATGGCTACTGAAACCACAGACACCGTGTGCCACCCATGTCCCGTCGGATTCTTTTCTAACCAGAGCTCCCTCTTTGAGAAGTGCTATCCATGGACAAGCTGTGAGGATAAGAACCTGGAAGTGCTCCAGAAAGGCACATCCCAGACTAATGTCATTTGCGGACTGAAATCTCGGATGCGCGCCCTGCTCGTGATCCCAGTGGTCATGGGCATCCTCATTACTATCTTCGGAGTGTTTCTGTACATTAAGAAAGTGGTCAAGAAACCCAAGGACAACGAGATCCTCCCACCTGCAGCTAGGAGACAGGACCCCCAGGAGATGGAAGATTATCCTGGACATAATACAGCAGCCCCAGTGCAGGAAACTCTGCACGGGTGTCAGCCCGTCACCCAGGAGGATGGCAAGGAAAGCAGAATCTCCGTCCAGGAAAGGCAGGTCACTGATAGCATCGCACTCCGCCCACTCGTCTGA
抗HER2 scFv CHA21 (1)の核酸配列
配列番号128:
GATATTGTCCTCACACAGACTCCCAGCTCCCTGCCTGTGTCCGTCGGAGAGAAAGTGACCATGACATGCAAGTCTAGTCAGACACTGCTCTACTCTAACAATCAGAAGAACTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCCAAGCTGCTCATCTCCTGGGCTTTCACCCGGAAATCCGGGGTGCCTGACCGCTTCACAGGTAGCGGCTCCGGAACTGATTTTACTCTGACCATTGGATCTGTGAAGGCAGAGGACCTCGCCGTCTACTATTGCCAGCAGTACAGTAATTATCCATGGACTTTTGGCGGAGGGACCAGGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGAGGAGGGTCCGGTGGAGGAGGGTCTGGTGGAGGAGGGAGTGGTGGAGGAGGGTCAGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAAGTGGTCAAAACTGGAGCTTCAGTCAAAATCAGCTGTAAGGCATCTGGGTACAGCTTCACCGGCTACTTCATCAACTGGGTGAAGAAAAATTCAGGGAAGAGCCCTGAGTGGATCGGCCACATTTCAAGCTCCTACGCCACAAGCACTTACAACCAGAAGTTCAAAAATAAGGCCGCTTTTACCGTGGACACATCTAGTTCAACCGCCTTCATGCAGCTGAACTCCCTCACATCTGAAGATAGTGCTGTGTACTATTGTGTCAGGAGCGGCAACTACGAAGAATATGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGGACCTCCGTGACTGTCTCAAGC
IgKドメイン(1)の核酸配列
配列番号129:
ATGGATTTTCAGGTCCAGATTTTCTCCTTCCTCCTCATTTCAGCCAGCGTCATTATGTCTCGGGGG
EVIR-N1の核酸配列
配列番号130:
ATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCTCCGCCAGCGTGATCATGAGCAGAGGCGACATCCAGATGAGCCAGAGCCCTGCCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGAGACAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCGGCAACATCTACAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCAGGGCAAGAGCCCCCATCTGCTGGTGTACGACGCCAAGACACTGGCCGACGGCGTGCCCTCTAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCCAGTACAGCCTGAAGATCAGCTCCCTGCAGACCGAGGACTCCGGCAACTACTACTGCCAGCACTTCTGGTCCCTGCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCTGGGGGCGGAGGAAGTGGCGGGGGAGGATCTGAAGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCTGAGCTCGTGCGACCTGGCGCTCTCGTGAAGCTGAGCTGCAAGACCAGCGGCTTCAATATCAAGGACTACTTCCTGCACTGGGTGCGACAGAGGCCTGACCAGGGCCTGGAATGGATCGGCTGGATCAACCCCGACAACGGCAACACCGTGTACGACCCTAAGTTCCAGGGCACCGCCAGCCTGACAGCCGACACAAGCTCCAACACAGTGTACCTGCAGCTGAGCGGCCTGACCTCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCACCAGAAGAGACTACACCTACGAGAAGGCCGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGAACAACCGTGACCGTGTCCACCGGTCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGCCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGTGGAACAGGGGGATCCTCTAG
EVIR-N2の核酸配列
配列番号131:
ATGGATTTTCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCTCCGCCAGCGTGATCATGAGCAGAGGCGAAGTTCAGCTGCTGCAGAGCGGACCCGAACTGGAAAAACCTGGCGCCTCCGTGATGATCAGCTGCAAGGCCTCTGGCAGCTCCTTCACCGGCTACAACATGAACTGGGTCCGACAGAACATCGGCAAGAGCCTGGAATGGATCGGCGCCATCGATCCTTACTACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAGAGCCACACTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACAGCCTACATGCATCTGAAGTCCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGTGTCCGGCATGGAATACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACAGTCTCTTCTGGCGGCGGTGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATGTGGTCATGACACAGACCCCTCTGAGCCTGCCTGTGTCTCTGGGAGATCAGGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGAAACGGCAACACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCCACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCTCTGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTTCTGTAGCCAGAGCACACACGTGCCACCTCTGACATTTGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTGACCGGTCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGCCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGTGGAACAGGGGGATCCTCTAG
EVIR-N1のアミノ酸配列
配列番号132:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMSQSPASLSASVGETVTITCRASGNIYNYLAWYQQKQGKSPHLLVYDAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKISSLQTEDSGNYYCQHFWSLPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKTSGFNIKDYFLHWVRQRPDQGLEWIGWINPDNGNTVYDPKFQGTASLTADTSSNTVYLQLSGLTSEDTAVYFCTRRDYTYEKAALDYWGQGTTVTVSTGLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWNRGIL
EVIR-N2のアミノ酸配列
配列番号133:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGEVQLLQSGPELEKPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELTGLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWNRGIL
TYRP1 Fwの核酸配列
配列番号134: AAAAAAACCGGTGACCTGTGTTCTGAACTCTTGC
TYRP1 Rvの核酸配列
配列番号135: AAAAAAGTCGACACTGTCATCACTGGAGAGCA
抗B2m gRNAの核酸配列
配列番号136:
GGTCGTCAGCATGGCTCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]