特許 6989528 ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の変異型３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素及びそれを含む方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6989528

(24)【登録日】2021年12月6日

(45)【発行日】2022年1月5日

(54)【発明の名称】ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の変異型３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素及びそれを含む方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20211220BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20211220BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20211220BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20211220BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211220BHJP

   C12Q 1/32 20060101ALI20211220BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20211220BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20211220BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/53ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12Q1/32

   C12N9/04 Z

   C12M1/34 E

【請求項の数】15

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2018-560256(P2018-560256)

(86)(22)【出願日】2017年2月9日

(65)【公表番号】特表2019-511245(P2019-511245A)

(43)【公表日】2019年4月25日

(86)【国際出願番号】EP2017052855

(87)【国際公開番号】WO2017137491

(87)【国際公開日】20170817

【審査請求日】2020年2月7日

(31)【優先権主張番号】16000321.6

(32)【優先日】2016年2月9日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100166165

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 英直

(72)【発明者】

【氏名】ダニエラ ベック

(72)【発明者】

【氏名】マラ ベーニッツ−ドゥラト

(72)【発明者】

【氏名】ペーター クラッチュ

(72)【発明者】

【氏名】トーマス シュトライデル

(72)【発明者】

【氏名】カリーナ ホルン

【審査官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１１−３１８４３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１６−５０２６５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−３３９３８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０２６８０４３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−１５２０９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Accession No. A0A0N9NPT3, Confluentimicrobium sp. EMB200-NS6, 20-JAN-2016, entry version 1, Jin H.M., Jeong H.I., Kim K.H., Jeon C.O.，Database UniProt/Swisss-Prot[online]，2016年01月20日，https://www.uniprot.org/uniprot/A0A0N9NPT3.txt?version=1

【文献】 Accession No. A0A0D6B253, Rhodobacter sulfidophilus, 09-DEC-2015, entry version 5. , Nagao N.，Database UniProt/Swisss-Prot[online]，2015年12月09日，https://www.uniprot.org/uniprot/A0A0D6B253.txt?version=5

【文献】 Cloning and functional expression of the D-β-hydroxybutyrate dehydrogenase gene of Rhodobacter sp. DSMZ 12077.，Applied Microbiology and Biotechnology，1999年

【文献】 Accession No. Q9XDL3, Rhodobacter sp. DSM 12077, 09-DEC-2015, entry version 58., Krueger K., Lang G., Engel A.M.，Database UniProt/Swisss-Prot[online]，2015年12月09日，https://www.uniprot.org/uniprot/Q9XDL3.txt?version=58

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

Ｃ１２Ｎ ９／００−９９

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｑ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＣＡＰＬＵＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能が向上したロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の変異型３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素（３−ＨＢＤＨ）において、前記変異型が、配列番号１（ロドバクター・スフェロイデス由来の３−ＨＢＤＨ；野生型３−ＨＢＤＨ）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ前記変異型が、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に配列番号１の位置２５０に対応する位置にて少なくとも１つのアミノ酸置換を伴いここで配列番号１の位置２５０に対応する位置においてアミノ酸が、Ｍｅｔ（２５０Ｍｅｔ）又はＩｌｅ（２５０Ｉｌｅ）で置換される、変異型３−ＨＢＤＨ。

【請求項2】

配列番号１の位置２５０に対応する位置においてアミノ酸がＭｅｔ（２５０Ｍｅｔ）で置換される、請求項１に記載の変異型３−ＨＢＤＨ。

【請求項3】

前記変異型が、配列番号１の位置６６、１０９、１１３、１２５、１４０、１４４、１４５、１９５、１９７、２１７、２２３、２３２、２３９及び／又は２５７、特に、配列番号１の少なくとも位置１２５、１４４及び／又は２３２、より具体的には少なくとも配列番号１の位置１２５及び／又は１４４に対応する１つ以上の位置に少なくとも１つの更なるアミノ酸置換を伴う、請求項１又は２に記載の変異型３−ＨＢＤＨ。

【請求項4】

以下に対応する位置のアミノ酸は、
− 配列番号１の位置６６が、Ｔｙｒ（６６Ｔｙｒ）、又はＡｓｎ（６６Ａｓｎ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１０９が、Ｇｌｕ（１０９Ｇｌｕ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１１３が、Ｔｈｒ（１１３Ｔｈｒ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１２５が、Ｐｈｅ（１２５Ｐｈｅ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１４０が、Ｖａｌ（１４０Ｖａｌ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１４４が、Ａｒｇ（１４４Ａｒｇ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１４５が、Ｇｌｙ（１４５Ｇｌｙ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１９５が、Ｇｌｎ（１９５Ｇｌｎ）又はＬｅｕ（１９５Ｌｅｕ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１９７が、Ｉｌｅ（１９７Ｉｌｅ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２１７が、Ｖａｌ（２１７Ｖａｌ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２２３が、Ｖａｌ（２２３Ｖａｌ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２３２が、Ｃｙｓ（２３２Ｃｙｓ）、Ｔｙｒ（２３２Ｔｙｒ）、又はＴｒｐ（２３２Ｔｒｐ）、特に２３２Ｃｙｓで置換されているか；
− 配列番号１の位置２３９が、Ｔｙｒ（２３９Ｔｙｒ）、又はＴｒｐ（２３９Ｔｒｐ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２５０が、Ｍｅｔ（２５０Ｍｅｔ）で置換されているか；且つ／あるいは
− 配列番号１の位置２５７が、Ｍｅｔ（２５７Ｍｅｔ）、又はＧｌｎ（２５７Ｇｌｎ）で置換されている、請求項３に記載の変異型３−ＨＢＤＨ。

【請求項5】

以下に対応する位置のアミノ酸は、
− 配列番号１の位置３７が、Ｔｙｒ（３７Ｔｙｒ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２０２が、Ｇｌｙ（２０２Ｇｌｙ）で置換されているか；且つ／あるいは
− 配列番号１の位置２３０が、Ｌｅｕ（２３０Ｌｅｕ）で置換され；
とりわけ２５０Ｍｅｔと組み合わせて用いられるものである、請求項４に記載の変異型。

【請求項6】

ａ）変異型３−ＨＢＤＨは以下の突然変異
− １２５Ｐｈｅ；
− １４４Ａｒｇ；
− ２３２Ｃｙｓ；
− ２５０Ｍｅｔ；
− ２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ２０２Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、１４５Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；且つ／あるいは
− ３７Ｔｙｒ、１９５Ｇｌｎ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔを有し、これらの突然変異は配列番号１の位置に対応し、あるいは
ｂ）変異型３−ＨＢＤＨの突然変異は
− ２５０Ｍｅｔ；
− ２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ２０２Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、１４５Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；あるいは
− ３７Ｔｙｒ、１９５Ｇｌｎ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔだけに限られていて、これらの突然変異は配列番号１の位置に対応している、請求項３から５のいずれか一項に記載の変異型３−ＨＢＤＨ。

【請求項7】

前記変異型３−ＨＢＤＨが、任意の配列番号１〜１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそのアミノ酸配列からなり、前記変異型３−ＨＢＤＨが、とりわけ配列番号５〜１１からなる群から選択される配列を含むか又はその配列からなる、請求項１から６のいずれか一項に記載の変異型３−ＨＢＤＨ。

【請求項8】

野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能が増強されており、
− 安定性、特に熱安定性が野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強され；且つ／あるいは
− 基質、特に３−ヒドロキシブチレートの親和性が、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強され；且つ／あるいは
− 補因子（特にＮＡＤ又はその誘導体、特に誘導体がカルバＮＡＤである）の親和性が、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強される、請求項１から７のいずれか一項に記載の変異型３−ＨＢＤＨ。

【請求項9】

前記変異型３−ＨＢＤＨは、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に少なくとも２倍安定性が増強され、好ましくは少なくとも３倍安定性が増強され、好ましくは少なくとも４倍安定性が増強され、より好ましくは少なくとも５倍安定性が増強されていることを特徴とし；且つ／あるいは前記変異型３−ＨＢＤＨの基質及び／又は補因子の親和性が野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強され、とりわけ、（ｉ）３−ヒドロキシブチレート及び／又は（ｉｉ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはその機能的に活性な誘導体の親和性が増強され、且つ／あるいはとりわけ基質及び／又は補因子の親和性が少なくとも５％、より具体的には少なくとも１０％、更により具体的には少なくとも１５％又は２０％増強されていることを特徴とする、請求項８に記載の変異型３−ＨＢＤＨ。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項に記載の変異型３−ＨＢＤＨをコードする核酸。

【請求項11】

請求項１から９のいずれか一項に記載の変異型３−ＨＢＤＨ、又は請求項１０に記載の核酸を含む細胞。

【請求項12】

ａ）３−ＨＢＤＨの活性に資する条件下にて試料を請求項１から９のいずれか一項に記載の変異型３−ＨＢＤＨに接触させる工程と；
ｂ）３−ヒドロキシブチレートをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はその機能的に活性な誘導体と反応させる工程と；
ｃ）ＮＡＤもしくはその誘導体の酸化還元状態の変化を判別する工程と；
を含み、これにより、試料中の３−ヒドロキシブチレートの濃度を定量する、方法。

【請求項13】

ａ）ＮＡＤもしくはその誘導体の酸化還元状態の変化を判別する工程が、（ｉ）ＮＡＤもしくその誘導体、又は（ｉｉ）ＮＡＤＨもしくはその誘導体の濃度を定量することを含み；且つ／あるいは
ｂ）前記ＮＡＤもしくはその誘導体の酸化還元状態の変化を判別する工程が、電気化学的又は光学的であり；且つ／あるいは
ｃ）前記方法が、アセトアセテートもしくはアセトンの量又は濃度を定量することを更に含み；且つ／あるいは
ｄ）前記グルコースの量又は濃度を定量することを更に含み；且つ／あるいは
ｅ）前記ＮＡＤの機能的に活性な誘導体がカルバＮＡＤであり；且つ／あるいは
ｆ）前記変異型３−ＨＢＤＨが、センサー、試験ストリップ、試験エレメント、試験ストリップデバイス又は液体試験の一部であり；且つ／あるいは
ｇ）前記試料が体液、特に血液試料又は尿試料である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

請求項１から９のいずれか一項に記載の変異型３−ＨＢＤＨ、及び任意で、前記定量を行うのに必要とされる更なる構成要素を含む、試料中の３−ヒドロキシブチレートの量又は濃度を定量するためのデバイス。

【請求項15】

ａ）前記デバイスがセンサー、好ましくは電気化学センサーもしくは光学センサー、又は試験ストリップ、特に試験ストリップであるか又はそれを具備し；且つ／あるいは
ｂ）前記デバイスが、前記試料中のグルコースの量もしくは濃度を定量することを更に可能にする、請求項１４に記載のデバイス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能が向上した変異型３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素（３−ＨＢＤＨ）、変異型３−ＨＢＤＨをコードする核酸、変異型３−ＨＢＤＨを含む細胞又は核酸のほか、試料中の３−ヒドロキシブチレートの量もしくは濃度を定量する方法、及び試料中の３−ヒドロキシブチレートの量もしくは濃度を定量するためのデバイスに関する。

【背景技術】

【0002】

ケトン体は、肝臓において主に脂肪酸の酸化により産生され、エネルギー源として使えるように末梢組織に移出される。他の実質的な非グルコースから取り出されるエネルギー源を有さない脳にとって、ケトン体は特に重要である。主要なケトン体としては、３−ヒドロキシブチレート及びアセトアセテートの２種類がある。生化学的には、ケトン体代謝の異常は、ケトーシス、低ケトーシス性低血糖、及び３−ヒドロキシブチレート／アセトアセテート比の異常という、３つのカテゴリに細分される場合がある。

【0003】

３−ヒドロキシブチレート／アセトアセテート比の増強が異常な場合、低酸素症の虚血又は他の原因に起因する肝細胞ミトコンドリアの非酸化状態を意味するのが通例である。

【0004】

ケトーシスが存在している場合、エネルギー代謝が活性化されていること、及び脂質分解の経路全体が無傷であることを意味するのが通例である。ケトーシスは、稀な例ではあるが、ケトン体が利用不可能なことを反映するものである。絶食中、長期間の運動後、及び高脂肪食が消費されたときにはケトーシスは正常である。新生児期、幼児期及び妊娠中のように、脂質エネルギー代謝が特に活発な時期には、ケトーシスが発症し易い。

【0005】

ケトーシスの病理学的原因としては、糖尿病、小児期のケトン性低血糖症、コルチコステロイド又は成長ホルモン欠乏症、アルコールもしくはサリチル酸塩による中毒症、及び幾つかの先天性代謝異常が挙げられる。

【0006】

ケトン体の形成が増加するのは、脂肪分解が増加した場合、例えばインスリン欠乏（真性糖尿病、特にＩ型糖尿病）の場合、グルカゴン濃度が増加した場合、及び絶食状態にある場合である。そのような場合、７ｍｇ／ｄｌ未満の正常な生理学的濃度が１０倍以上に増強されている可能性がある。過去数か年間にわたって、３−ヒドロキシブチレートがインスリン療法のモニタリング用パラメータとして極めて信頼し得るものであることが立証されてきた。

【0007】

低血糖症患者においてケトーシスが存在しない場合は異常であり、高インスリン症又は脂肪エネルギー代謝の先天性異常の診断を受けることを提案する。

【0008】

したがって、ケトン体は、特に糖尿病に対する診断標的として興味深い。したがって、ケトン体、特に３−ヒドロキシブチレート用の堅牢で敏感な試験系に対する継続的なニーズが存在する。３−ヒドロキシブチレートとアセトン又はアセトアセテートとの比は、通常３：１である。ケトアシドーシスにおいて、この比率は６：１から１２：１へと増強される。３−ＨＢＤＨは、３−ヒドロキシブチレートの定量試験の開発を必然的に可能にするものが、好適である。

【発明の概要】

【0009】

ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素が、種々の変異体の性能を向上させたこと、特に基質及び／又は補因子に対する熱安定性及び／又は親和性を増強させたことが、明らかにされた。これは驚くべき発見であった。実施例に示すように、野生型酵素には、変異体の基質及び／又は補因子に対する熱安定性及び／又は親和性を野生型酵素と相対的に増強させるための変異を可能にする、多くの部位が存在する。

【発明を実施するための形態】

【0010】

野生型３−ＨＢＤＨ中にかなりの量のアミノ酸があり、それらアミノ酸の置換によって、結果として得られた変異体の性能が野生型ＨＢＤＨと相対的に増強したことが、本発明者らによって同定された（例えば、実施例の表１Ａ及び表１Ｂを参照）。とりわけ、アミノ酸の置換によって熱安定性が増強され、任意で、基質及び／又は補因子（３−ヒドロキシブチレート及び／又はＮＡＤもしくはＮＡＤの誘導体、例えば、カルバＮＡＤ）に対する親和性が増強される可能性がある。これらの部位の好適な例としては、配列番号１の位置６６、１０９、１１３、１２５、１４０、１４４、１４５、１９５、１９７、２１７、２２３、２３２、２３９、２５０及び／又は２５７が挙げられる。上記及び更なる部位において突然変異を組み合わせることによって、変異型３−ＨＢＤＨの性能を更に増強させ得る（表２Ａ及び表２Ｂを参照）。これらの変異体の特に好適な例としては、突然変異を伴うもの（下記の略語の定義について）が挙げられる。
− １２５Ｐｈｅ；
− １４４Ａｒｇ；
− ２３２Ｃｙｓ；
− ２５０Ｍｅｔ；
− ２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ２０２Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、１４５Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；あるいは
− ３７Ｔｙｒ、１９５Ｇｌｎ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ（実施例を参照）。

【0011】

したがって、第１の態様において本発明は、野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能が向上している、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の変異型３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素（３−ＨＢＤＨ）に関する。ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の変異型３−ＨＢＤＨは、野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能が向上しているものであり、配列番号１（ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の３−ＨＢＤＨ；野生型３−ＨＢＤＨ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ野生型３−ＨＢＤＨと相対的に配列番号１の位置２５０に対応する位置にて少なくとも１つのアミノ酸置換を伴うものであることが、好ましい。より好ましくは、以下の対応する位置（配列番号１の）アミノ酸位置２５０が、Ｍｅｔ（２５０Ｍｅｔ）又はＩｌｅ（２５０Ｉｌｅ）で、特にＭｅｔ（２５０Ｍｅｔ）で置換される。その位置及び置換は、変異型３−ＨＢＤＨの性能を向上させるために有利であることが立証されており（表１Ａ及び表１Ｂを参照）、更なる突然変異と組み合わせられる場合もある（表２Ａ及び表２Ｂを参照）。したがって、特に好適な変異型としては、以下の突然変異を伴うものが挙げられる。
− ２５０Ｍｅｔ；
− ２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ２０２Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、１４５Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；あるいは
− ３７Ｔｙｒ、１９５Ｇｌｎ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ（実施例を参照）。

【0012】

３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素（別称：３−ＨＢＤＨ、ＥＣ１．１．１．３０）は、酸化還元酵素の系統群に属し、３−ヒドロキシブタノエート／３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／３−ヒドロキシブチル酸（３−ＨＢ）の立体特異的酸化を補因子としてのＮＡＤ又は誘導体を用いて触媒することによってアセトアセテートを生ずる酵素である、という点で特異的である。

【数1】

【0013】

この酵素クラスの系統的な名前は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタノエート：ＮＡＤ⁺酸化還元酵素である。他の通称としては、ＮＡＤ⁺−β−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、ヒドキシブチレート酸化還元酵素、β−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、Ｄ−β−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、β−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、３−Ｄ−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、及びβ−ヒドロキシブチリック脱水素酵素が挙げられる。この酵素は、ケトン体及びブタン酸代謝の合成ならびに分解に関与し、血液試料等の試料中のケトン体を判別する目的に使用される場合もある。

【0014】

「野生型３−ＨＢＤＨ」という用語は、概ね天然起源の３−ＨＢＤＨに関する。紅色光合成細菌ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の野生型３−ＨＢＤＨは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）においてクローンされ、独国特許出願公開第１９８１５６８５（Ａ１）号明細書（１９９９年）に更に詳述されている。しかしながら、この酵素は安定性が相当に低い（そのため貯蔵寿命が短い）ことを特徴とし、この点では生物工学、生物医学及び診断用途に不利である。とりわけ、予備調製済みの酵素の使用が意図されている場合、貯蔵寿命が短いと酵素の適用性に対して悪影響が及ぶ。これには、通例、大規模に調製・貯蔵された後、例えば小規模化されたバッチで市場投入される酵素調製物、キット、試験ストリップ等のような、とりわけ市販製品が含まれる。加えて、基質及び／又は補因子に対する酵素の親和性を増強させることが望しいのは明らかである。親和性及び／又は安定性が増強された場合、工学的応用及びデバイスにおける酵素の性能が増強される。概してロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に由来する野生型３−ＨＢＤＨの、遍く容認されているアミノ酸配列は、配列番号１として後述されている。

【0015】

「ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の変異型３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素（３−ＨＢＤＨ）」という用語は、３−ＨＢＤＨ酵素に関し、この酵素のアミノ酸配列は、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の野生型３−ＨＢＤＨ、特に配列番号１のアミノ酸配列（少なくとも１つの突然変異によるもの、すなわち１つ以上のアミノ酸の置換、付加、欠失又はこれらの組み合わせ、特に少なくとも１つの置換によるもの）とは異なる。

【0016】

「野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能が向上した」という用語は、変異型酵素に対し、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能が向上していることを意味する。突然変異型酵素の性能が向上した場合、特定の基質又は補因子の濃度において、任意の条件（例えば、貯蔵後、特定のｐＨで、特定の緩衝液を用い、選択された温度で、特定の補因子（例えばカルバＮＡＤ）を用いて、３−ＨＢをアセトアセテートに変換した際に活性が増強された等）の場合、性能が向上したことになる。性能の向上は、とりわけ、１つ以上の基質／補因子（例えば、カルバＮＡＤ及び／又は３−ＨＢ）に対する安定性（例えば熱安定性）及び／又は親和性の増大であると言える。所与の条件（例えば、補因子又は基質の貯蔵、緩衝液条件、温度、濃度）にてストレスを受けた際、これらの条件下でストレスを受けない場合の活性、及び／又は変異酵素の相対的な活性（すなわち、部分飽和濃度での活性／飽和濃度での活性）が増強された場合等と相対的に、変異体酵素によって３−ＨＢがアセトアセテートに変換されるときに、例えば、相対的な残存活性が比較的高い場合に、性能が改善されることが好ましい。

【0017】

ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の野生型３−ＨＢＤＨの配列は、配列番号１として示してある。

【0018】

【化1】

【0019】

したがって、天然起源の野生型３−ＨＢＤＨの好ましい実施例は、配列番号１として上記されている。

【0020】

１つ以上の突然変異が、野生型配列（特に、配列番号１の配列）に導入された場合、変異型３−ＨＢＤＨが得られる。本発明の変異型３−ＨＢＤＨに関して言うと、変異体は機能的に活性であり、野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能の向上が明らかであることが注目される。これは、変異体が、３−ＨＢからアセトアセテートへの変換の酵素的機能を維持していることを意味する。加えて、少なくとも基質及び／又は補因子に対する安定性、ならびに任意で、酵素の親和性が増強することが好ましい。変異体は、１つ以上のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失、特に少なくとも１つ以上の置換による、野生型３−ＨＢＤＨとは異なる。

【0021】

本発明による変異型３−ＨＢＤＨの配列は、（任意で、本明細書で指定された置換に加えて）１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加、特に１つ以上の置換、特に１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。

【0022】

本発明の一実施形態において、本発明による変異型３−ＨＢＤＨは、１つ以上のアミノ酸置換、とりわけ限られた数の置換（例えば、最高５０個、４０個、３０個、２０個、特に１０個のアミノ酸置換）を含む場合がある。好適な置換は、実施例、特に表に示してある。実施例において３−ＨＢＤＨの性能を向上させるために好適であると同定された全ての置換は、本発明において、単独で、又は互いに組み合わせて使用される場合もあれば、且つ／あるいは更なる置換、例えば、保存的置換と組み合わせて使用される場合もある。「保存的アミノ酸置換」とは、残基が、類似の側鎖を有する異なる残基で置換されることを意味する。したがって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸が、同一又は類似の規定クラスのアミノ酸で置換されることを含む。例を挙げれば、限定されるものではないが、脂肪族側鎖を有する或るアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンで置換され得；ヒドロキシル側鎖を有する或るアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えばセリン及びトレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有する或るアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンで置換され；塩基性側鎖を有する或るアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばリジン及びアルギニンで置換され；酸性側鎖を持つアミノ酸は酸性側鎖を持つ別のアミノ酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸で置換され；且つ疎水性又は親水性アミノ酸は、別の疎水性又は親水性アミノ酸でそれぞれ置換される。保存的アミノ酸置換の例には、以下に列挙されているものが含まれる。

【0023】

【表1】

【0024】

本発明の一実施形態において、本発明による変異型３−ＨＢＤＨは、１つ以上のアミノ酸付加、とりわけ少数（例えば、最高５０個、４０個、３０個、２０個、特に１０個のアミノ酸）の内部アミノ酸付加を含む場合がある。代替的に、変異型３−ＨＢＤＨを、本発明の変異型３−ＨＢＤＨを含む融合タンパク質に化合することによって、付加を達成できる。

【0025】

融合タンパク質は、２つ以上の元々別個のタンパク質又はペプチドの結合によって生じたタンパク質である。この手順によって、結果として、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を備えるポリペプチドが生ずる。したがって、３−ＨＢＤＨの意図された用途に応じて、更なるペプチド又はタンパク質との化合によって、融合タンパク質を得ることができる。タンパク質は、リンカー又はスペーサーを介して融合される場合があり、これにより、タンパク質が独立に折り畳まれ、且つ予期されたとおりに挙動する可能性が高まる。リンカーによってタンパク質の精製を可能にする場合は特に、タンパク質又はペプチド融合物中のリンカーが、２つの別個のタンパク質の遊離を可能にするプロテアーゼもしくは化学薬剤の開裂部位で時には工学操作されることがある。二量体又は多量体の融合タンパク質は、人工タンパク質の二量体化又は多量体化（例えば、ストレプトアビジンもしくはロイシンジッパー）を誘導するペプチドドメインの元のタンパク質との融合を介して遺伝子工学によって製造される場合もあれば、それらのタンパク質に毒素又は抗体を付着させることによって、融合タンパク質を製造する場合もある。他の融合には、シグナル配列の付加、例えば脂質化シグナル、配列、分泌シグナル配列、グリコシル化シグナル配列、転座シグナルペプチド等の付加が含まれる。

【0026】

本発明の融合タンパク質はタグを含むことが好ましい。タンパク質にタグを付着させる目的は、例えば、精製を容易にする、タンパク質における適切な折り畳みを助ける、タンパク質の沈殿を防ぐ、クロマトグラフィー特性を変更する、タンパク質を修飾する、又はタンパク質をマークもしくは標識する等、多岐にわたっている。タグの例としては、Ａｒｇ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｌａｇ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｖ５−ペプチド−タグ、ＧＳＴ−タグ及びｃ−Ｍｙｃ−タグが挙げられる。

【0027】

本発明の一実施形態において、本発明による変異型３−ＨＢＤＨは、１つ以上のアミノ酸欠失、とりわけＮ末端及び／又はＣ末端の欠失を含む場合がある。アミノ酸の欠失は少数、例えば、最高５０個、４０個、３０個、２０個、特に１０個であり得る。

【0028】

別の実施形態において、本発明による変異型３−ＨＢＤＨの配列は、好ましくは本明細書中に明記されている置換以外にも、上記に定義されているような１つ以上の欠失、置換又は付加の組み合わせを含む場合がある。

【0029】

本発明の好ましい実施形態において、変異型３−ＨＢＤＨは、配列番号１（ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の３−ＨＢＤＨ；野生型３−ＨＢＤＨ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0030】

本明細書において、「少なくとも８０％同一」又は「少なくとも８０％の配列同一性」という用語は、本発明による変異型３−ＨＢＤＨの配列は、１００アミノ酸鎖以内、少なくとも８０アミノ酸残基が、対応する野生型配列の配列と同一であることを特徴とするアミノ酸配列を有することを意味する。したがって、他のパーセンテージの配列同一性が定義してある。

【0031】

本発明による配列同一性は、例えば、配列比較の形態での配列アラインメント方法によって判別できる。配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知であり、例えばＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ （１９８８）に記載されている多様なプログラム及びアライメントアルゴリズムが包含される。そのうえ、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）をはじめとする幾つかの情報源から、ならびにインターネット上で入手可能であり、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと関連して使用可能である。本発明による変異体の、例えば配列番号１のアミノ酸配列との同一性パーセンテージは、典型的には、標準設定のＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｂｌａｓｔｐを使用して、特徴付けられる。代替的に、配列同一性を、標準設定のＧＥＮＥｉｏｕｓソフトウェアを使用して定量することもできる。例えば、フリーエンドギャップをアライメントタイプとするグローバルアライメントプロトコル、及びコストマトリックスとしてのＢｌｏｓｕｍ６２を使用して、Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（バージョンＲ８）で、アライメント結果を導出できる。

【0032】

上記に詳述されているように、一実施形態において、本発明の変異型３−ＨＢＤＨは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、変異型３−ＨＢＤＨが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそのアミノ酸配列からなる。配列同一性は、上述したように定量できる。

【0033】

別の好ましい実施形態において、本発明の変異型は、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号１の位置６６、１０９、１１３、１２５、１４０、１４４、１４５、１９５、１９７、２１７、２２３、２３２、２３９、２５０及び／又は２５７、特に少なくとも配列番号１の位置１２５、１４４、２３２及び／又は２５０、より具体的には少なくとも配列番号１の位置１２５、１４４、及び／又は２５０、特に、配列番号１の少なくとも位置２５０に対応する１つ以上の位置にある。実施例において、配列番号１の上の位置に対応する位置のアミノ酸の置換によって、基質及び／又は補因子に対する安定性及び／又は親和性が増強される（例えば、表１Ａ及び表１Ｂを参照）。これらの位置での置換は、互いに組み合わせて使用できる（実施例も参照のこと）。

【0034】

好ましくは、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の変異型３−３−ＨＢＤＨは、野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能が向上しており、配列番号１（ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の３−ＨＢＤＨ；野生型３−ＨＢＤＨ）に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、位置２５０、好ましくは配列番号１の２５０Ｍｅｔに対応する位置にて野生型３−ＨＢＤＨと相対的に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、且つ少なくとも１つの更なるアミノ酸置換を有し、配列番号１の位置６６、１０９、１１３、１２５、１４０、１４４、１４５、１９５、１９７、２１７、２２３、２３２、２３９及び／又は２５７、特に少なくとも配列番号１の位置１２５、１４４及び／又は２３２、より具体的には配列番号１の少なくとも位置１２５及び／又は１４４に対応する１つ以上の位置にある。

【0035】

本発明の変異型３−ＨＢＤＨの置換のとりわけ好適な例を、以下に示す。
− 配列番号１の位置６６が、Ｔｙｒ（６６Ｔｙｒ）、又はＡｓｎ（６６Ａｓｎ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１０９が、Ｇｌｕ（１０９Ｇｌｕ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１１３が、Ｔｈｒ（１１３Ｔｈｒ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１２５が、Ｐｈｅ（１２５Ｐｈｅ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１４０が、Ｖａｌ（１４０Ｖａｌ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１４４が、Ａｒｇ（１４４Ａｒｇ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１４５が、Ｇｌｙ（１４５Ｇｌｙ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１９５が、Ｇｌｎ（１９５Ｇｌｎ）又はＬｅｕ（１９５Ｌｅｕ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置１９７が、Ｉｌｅ（１９７Ｉｌｅ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２１７が、Ｖａｌ（２１７Ｖａｌ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２２３が、Ｖａｌ（２２３Ｖａｌ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２３２が、Ｃｙｓ（２３２Ｃｙｓ）、Ｔｙｒ（２３２Ｔｙｒ）、又はＴｒｐ（２３２Ｔｒｐ）、特に２３２Ｃｙｓで置換されているか；
− 配列番号１の位置２３９が、Ｔｙｒ（２３９Ｔｙｒ）、又はＴｒｐ（２３９Ｔｒｐ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２５０が、Ｍｅｔ（２５０Ｍｅｔ）で置換されているか；且つ／あるいは
− 配列番号１の位置２５７が、Ｍｅｔ（２５７Ｍｅｔ）、又はＧｌｎ（２５７Ｇｌｎ）で置換されている。

【0036】

更に、上記の置換は、以下の置換のうちの１つ以上と組み合わせてもよい。
− 配列番号１の位置３７が、Ｔｙｒ（３７Ｔｙｒ）で置換されているか；
− 配列番号１の位置２０２が、Ｇｌｙ（２０２Ｇｌｙ）で置換されているか；且つ／あるいは
− 配列番号１の位置２３０が、Ｌｅｕ（２３０Ｌｅｕ）で置換されていて；
これらは２５０Ｍｅｔと組み合わせられていることが好ましい。

【0037】

とりわけ好ましい本発明の実施形態において、
ａ） 変異型３−ＨＢＤＨは、少なくとも配列番号１の位置に対応する突然変異１２５Ｐｈｅ、１４４Ａｒｇ、２３２Ｃｙｓ、及び／又は２５０Ｍｅｔ、特に１２５Ｐｈｅ、１４４Ａｒｇ、及び／又は２５０Ｍｅｔ、より具体的には２５０Ｍｅｔを有するか；あるいは
ｂ） 変異型３−ＨＢＤＨは以下の突然変異
− １２５Ｐｈｅ；
− １４４Ａｒｇ；
− ２３２Ｃｙｓ；
− ２５０Ｍｅｔ；
− ２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ２０２Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、１４５Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；且つ／あるいは
− ３７Ｔｙｒ、１９５Ｇｌｎ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔを有し、これらの突然変異は配列番号１の位置に対応し、あるいは
ｃ） 変異型３−ＨＢＤＨの変異型は
− １２５Ｐｈｅ；
− １４４Ａｒｇ；
− ２３２Ｃｙｓ；
− ２５０Ｍｅｔ；
− ２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ２０２Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、１４５Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；あるいは
− ３７Ｔｙｒ、１９５Ｇｌｎ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔだけに限られていて、これらの突然変異は配列番号１の位置に対応している。

【0038】

更により特に好ましい本発明の実施形態において、変異型は、配列番号１（ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の３−ＨＢＤＨ；野生型３−ＨＢＤＨ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に、位置２５０、好ましくは配列番号１の２５０Ｍｅｔに対応する位置にて少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、且つ
ａ） 少なくとも配列番号１の位置に対する対応する突然変異１２５Ｐｈｅ、１４４Ａｒｇ、及び／又は２３２Ｃｙｓ、とりわけ１２５Ｐｈｅ及び／又は１４４Ａｒｇを有し；あるいは
ｂ） 変異型３−ＨＢＤＨは以下の突然変異
− １２５Ｐｈｅ；
− １４４Ａｒｇ；
− ２３２Ｃｙｓ；
− ２５０Ｍｅｔ；
− ２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ２０２Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、１４５Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；且つ／あるいは
− ３７Ｔｙｒ、１９５Ｇｌｎ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔを有し、これらの突然変異は配列番号１の位置に対応し、あるいは
ｃ） 変異型３−ＨＢＤＨの変異型は以下のものだけに限られ、これらは
− ２５０Ｍｅｔ；
− ２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ２０２Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；
− ３７Ｔｙｒ、１４５Ｇｌｙ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔ；あるいは
− ３７Ｔｙｒ、１９５Ｇｌｎ、２３０Ｌｅｕ及び２５０Ｍｅｔであり、配列番号１の位置に対応している。

【0039】

本発明の好ましい実施形態において、変異型３−ＨＢＤＨが、配列番号１〜１１のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそのアミノ酸配列からなり、特に、変異型３−ＨＢＤＨが、配列番号２〜１１からなる群から選択される配列を含むか又はその配列からなる。

【0040】

上記に詳述されているように、配列番号１の配列は、野生型３−ＨＢＤＨに関する。配列番号２〜１１の配列は、好ましい変異型の配列である。配列番号５〜１１の配列は、極めて好ましい変異型の配列である。当該の変異型の配列及び行われている置換を、セクション「配列」に示す。配列同一性は、上述したように定量できる。

【0041】

本発明の好ましい実施形態では、野生型３−ＨＢＤＨに対し相対的に性能が向上しており、
− 安定性、特に熱安定性が野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強され；且つ／あるいは
− 基質、特に３−ヒドロキシブチレートの親和性が、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強され；且つ／あるいは
− 補因子の親和性（特にＮＡＤ又はその誘導体、特に誘導体がカルバＮＡＤである）が、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強されている。

【0042】

「安定性、特に熱安定性が野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強された」という用語は、変異型３−ＨＢＤＨが、特定の条件下で、特に高温では（酵素）活性の損失が抑えられる傾向のあることを意味する。それらの触媒としての完全な可能性の維持を目指して、変性機序の回避等、酵素の安定化は、バイオテクノロジーにおいて重要な目標とされている。酵素安定化は、酵素の適用数の増加に起因して顕著に重要である。安定性が増強されば、ユーザビリティの持続化（例えば、保管時間の長期化、ユーザビリティの長期化等）が可能となる。野生型と相対的に変異体の安定性の増強は、例えば、特定の条件（高温、乾燥、緩衝液、又は塩等）（絶対的な残存活性）に暴露された後に、両方の酵素（野生型及び変異体）の残存活性を比較することによって定量できる。代替的に、変異体によって例えば３−ＨＢがアセトアセテートに変換される際の相対的な残存活性が改善された場合、野生型と比較して安定性が増強されている。相対的な残存活性は、所与の条件（例えば、貯蔵時間、温度）で貯蔵した後の残存又は残留酸性度を、貯蔵前の初期活性と比較することによって定量できる。代替的に、変異体が、例えば３−ＨＢをアセトアセテートに変換する際の活性が、野生型酵素よりも高ければ、安定性が改善される。相対的な残存活性は、所与の条件（例えば貯蔵時間、温度）で貯蔵された後の野生型酵素及び変異体酵素の残存活性又は残留活性を比較することによって、定量できる。

【0043】

酵素活性及びその定量という用語は、当業者に周知である。酵素活性は概ね、時間当たりの基質の変換量として定義される。酵素活性のＳＩ単位は、カタール（１カタール＝１ｍｏｌ ｓ^-1）である。実用性が高く且つ繁用されている値は、酵素単位（Ｕ）＝１μｍｏｌ ｍｉｎ^-1である。１Ｕは、１６．６７ナノカタールに対し、１分当たり１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量として定義される。酵素の比活性は、総タンパク質１ミリグラム当たりの酵素の活性である（μｍｏｌ ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1で表される）。

【0044】

酵素活性は、経時的な基質もしくは補因子の消費量、又は生成物形成を測定するアッセイで定量できる。基質及び生成物の濃度を測定する多数の異なる方法が存在し、多くの酵素は、当業者に公知の数種の方法でアッセイできる。本発明において、当該の３−ＨＢＤＨは、例えば、３−ヒドロキシブチレート及び補因子、例えば、ＮＡＤもしくはその誘導体（そのカルバＮＡＤ等）と共にインキュベートし、補因子の、ＮＡＤからＮＡＤＨへの変換、又はカルバＮＡＤからカルバＮＡＤＨへの変換をモニタリングする。モニタリングは、例えば、３４０ｎｍでの吸光度を測定することによって実行できる。酵素活性は、得られた１分間当たりの吸収の変化（ｄＥ／ｍｉｎ）で表される。詳細については、実施例２を参照のこと。

【0045】

本発明の好ましい実施形態において、突然変異を伴わない各３−ＨＢＤＨに対する変異型３−ＨＢＤＨの安定性の増強は、それぞれの野生型に対する半減期（ｔ_1/2（野生型））と相対的な変異型の半減期（ｔ_1/2（変異型））の増分として表すことができる。酵素の半減期（ｔ_1/2）は、元の活性の５０％（ｔ＝０における活性）が失われてから残りの活性が５０％になるまでの時間を示す。したがって、安定性が増強されると、それぞれの野生型と相対的に変異型の半減期が延長する。安定性の増加は、ｔ_1/2（変異型）／ｔ_1/2（野生型）として求めることができる。半減期の延長率は、［ｔ_1/2（変異型）／ｔ_1/2（野生型）−１］×１００として求めることができる。

【0046】

本発明の極めて好ましい実施形態では、突然変異を伴わないそれぞれの３−ＨＢＤＨに対する変異３−ＨＢＤＨの安定性の増加を定量し、ストレスインキュベーション／貯蔵前の初期活性と相対的なストレスインキュベーション後の残存活性として表すことができる（例えば、６４℃で３０分間、実施例に記載されている他の任意の条件）である（実施例を参照）。これに関して、酵素反応を（例えば、室温で３４０ｎｍにて５分間）モニタリングすることもできるし、各試料について時間当たりの吸収の変化（例えば、ｄＥ／ｍｉｎ）を計算することもできる。ストレスを受けた試料について得られた値を、それぞれのストレスを受けない試料（値を１００％活性に設定）と比較し、活性率（（ｄＥ／ｍｉｎ（ストレスを受けた試料）／ｄＥ／ｍｉｎ（ストレスを受けない試料）×１００）で計算される。したがって、変異体の値が、野生型酵素で得られた値を上回った場合、熱安定性が向上したことを表す。安定性の増強が認められるのは、［変異体の残存活性率（％）］−［野生型の残存活性率（％）］が０を上回った場合である。代替的に、変異体の残存活性は、活性率（パーセント数）として表すことができ、次式：［変異体の残存活性率（％）］／［野生型の残存活性率（％）］×１００％として計算できる。結果値が１００％を超える場合、野生型に対する変異体の安定性は増強されている。安定性を定量するための特定の好適な試験については、実施例２にて詳述する。この実施例によれば、安定性を残存活性として表すことができ、［ｄＥ／ｍｉｎ（ストレスを受けた試料）］／［ｄＥ／ｍｉｎ（ストレスを受けなかった試料）］×１００として計算できる。更なる詳細については、実施例２に示す。野生型酵素を使用して得られた値よりも、変異体を使用して得られた値の方が高い場合、変異体の安定性が増強されたことを表す。

【0047】

好ましくは、安定性は、少なくとも１０％、２０％、３０％又は４０％、好ましくは少なくとも５０％、７５％又は１００％、更により好ましくは少なくとも１２５％、１５０％、１７５％又は２００％、特に２５０％、及び最も好ましくは３００％増強された。

【0048】

しかも、酵素反応を高い温度で遂行することに商業上の利益が存在する。したがって、変異型の熱安定性を増強することが好ましい。これは、温度上昇に対する耐性は、変異体の方が野生型よりも高いことを意味する。熱安定性の増強は、とりわけ実施例、例えば、実施例２及び実施例３に示すようにして、定量できる。概して、変異型及び野生型酵素を、規定の時間（例えば、１０分又は３０分）、高温（例えば、５４℃又は６４℃のような５０℃を超える温度）で予備インキュベートした後、３−ＨＢをアセトアセテートに変換する際の残存活性を、野生型酵素の残存活性と比較する。変異体の残存活性が、野生型の残存活性よりも高い場合、変異体の熱安定性は増強されている。

【0049】

熱安定性の増分を定量するのに好適な方法については、実施例で詳述する。ストレス条件の例示的条件を、５０〜９０℃、特に５０〜６４℃にて（例えば、５０℃、５４℃もしくは６４℃）３０分間予備インキュベートし、以後、６２．２２ｍＭの３−ヒドロキシブチレート；４．１５ｍＭのｃＮＡＤ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ９．０又は１５０ｍＭの３−ヒドロキシブチレート；５ｍＭのｃＮＡＤ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；７０ｍＭのＭｏｐｓ ｐＨ７．５にて試験を実施することとしてもよい。

【0050】

「基質、特に３−ヒドロキシブチレートの親和性が、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強された」という用語は、アセトアセテートに変換される基質３−ヒドロキシブチル酸／３−ヒドロキシブチレート／３−ヒドロキシブタノエート（３−ＨＢ）に対する変異型の親和性が増強されていることを意味する。定量のために、酵素反応をモニタリングしてもよいし（例えば、室温で３４０ｎｍにて５分間）、試料ごとにｄＥ／分を計算することもできる。変異体の親和性は、野生型と比較して増強されている。変異体は、例えば、基質、特に３−ＨＢに対する親和性が絶対的又は相対的に高い。野生型と比較した変異体の親和性は、両方の酵素（野生型及び変異体）の絶対的な親和性（絶対比較）を比較することによって定量される場合があり、活性率（（ｄＥ／ｍｉｎ（変異型）／ｄＥ（野生型））×１００）（％）で計算される場合がある。代替的に、野生型と比較した変異体の親和性は、両方の酵素（野生型及び変異体）の相対的な親和性の比較（相対的な比較）によって定量できる。野生型又は変異体の相対的な親和性は、飽和基質濃度での親和性を基準として相対的に、準飽和基質濃度での親和性を設定することによって定量できる。実施例２及び実施例３に詳述されるように、基質の量を減少させた活性アッセイにおいて（すなわち、準飽和濃度で）、例えば、１．９４ｍＭの３−ヒドロキシブチレート（更なる例示的な条件：４．１５ｍＭのｃＮＡＤ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ９．０）を用い、３−ヒドロキシブチレートに対する親和性を定量できる。親和性を定量するための特定の好適な試験については、実施例２にて詳述する。これによれば、親和性は、相対的な活性として表すことができ、［ｄＥ／ｍｉｎ（準飽和基質濃度）］／［ｄＥ／ｍｉｎ（飽和基質濃度）］×１００として計算できる。更なる詳細については、実施例２に示す。野生型酵素を使用して得られた値よりも、変異体を使用して得られた値の方が高い場合、変異体の親和性が増強されたことを表す。

【0051】

親和性の増大は、Ｋｍ値の減少と相関する。ミカエリス定数Ｋｍは、酵素反応速度が半最大になったときの基質濃度、すなわち酵素に対する基質の親和性の逆数である。

【0052】

「補因子の親和性、特に、ＮＡＤ又はその誘導体の親和性、特に誘導体はカルバＮＡＤであり、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に増強された」という用語は、３−ＨＢをアセトアセテートに変換するのに必要な補因子（ＮＡＤ又はその誘導体、特にカルバＮＡＤ）に対する変異型の親和性が増強されていることを意味する。実施例２及び実施例３に詳述されるように、補因子に対する親和性は、補因子の量を減少させた活性アッセイ（すなわち、飽和未満）において、例えば、０．０３２ｍＭのｃＮＡＤ（更なる例示的な条件：６２．２２ｍＭの３−ヒドロキシブチレート；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ９．０）又は０．５ｍＭのｃＮＡＤで定量できる。基質の親和性に関して与えられた上記の詳細は、補因子の親和性に類似して適用可能である。親和性を定量するための特定の好適な試験については、実施例２にて詳述する。

【0053】

とりわけ、本発明の変異型３−ＨＢＤＨは、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に少なくとも２倍安定性が増強され、好ましくは少なくとも３倍安定性が増強され、好ましくは少なくとも４倍安定性が増強され、より好ましくは少なくとも５倍安定性が高いことを特徴とし；且つ／あるいは、変異型３−ＨＢＤＨは、野生型３−ＨＢＤＨと相対的に基質及び／又は補因子の親和性が増強され、（ｉ）３−ヒドロキシブチレート及び／又は（ｉｉ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はその機能的に活性な誘導体のとりわけ親和性が増強され、且つ／あるいはとりわけ、基質及び／又は補因子の親和性は、少なくとも５％、より具体的には少なくとも１０％、更により具体的には少なくとも１５％又は２０％高いことを特徴とする。

【0054】

別の態様において、本発明は、上述されている本発明の変異型３−ＨＢＤＨをコードする核酸に関する。

【0055】

本明細書において「核酸」という用語は概して、本発明の変異型３−ＨＢＤＨをコードする、可変長であってもよい任意のヌクレオチド分子に関する。本発明の核酸の例としては、限定されるものではないが、プラスミド、ベクター、又は標準的な分子生物学手順（例えば、イオン交換クロマトグラフィー等）によって単離できる任意の種類のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ断片が挙げられる。本発明の核酸は、特定の細胞もしくは生物を形質移入又は形質導入する目的で使用される場合がある。

【0056】

本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ又はｃＲＮＡのようなＲＮＡの形態であってもよいし、あるいは例えば、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態（クローン化によって得られたもの、又は化学合成技術によって、又はこれらの組み合わせによって生成されたもの）であってもよい。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖又は一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても知られているコード鎖であってもよいし、又はアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。また、本明細書中に使用されている核酸分子は、とりわけ、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡの混合物であるＤＮＡ、ならびに一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖領域又はより典型的には二本鎖領域もしくは三本鎖領域、又は一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子も指す。加えて、本明細書中で使用されている核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域を意味する。

【0057】

付加的に、核酸は、１つ以上の修飾塩基を含む場合がある。また、そのような核酸には、例えばリボース−リン酸主鎖中に、生理学的環境におけるそのような分子の安定性及び半減期を延長させ得る修飾を含めてもよい。したがって、安定性又は他の理由で修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡは、その特徴が本明細書中で意図されているようなものである「核酸分子」である。そのうえ、イノシンのような異常な塩基又はトリチル化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡは、わずか２例にすぎないが、本発明の文脈の範囲内にある核酸分子である。当業者に公知の多くの有用な用途に役立つ多種多様な改変が、ＤＮＡ及びＲＮＡに対してなされてきたことが理解されるであろう。本明細書中で使用されている核酸分子という用語には、化学的、酵素的又は代謝的に修飾された核酸分子の形態、ならびに、特に単純及び複雑な細胞を含む、ウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡならびにＲＮＡの化学的形態が包含される。

【0058】

更に、本発明の変異型３−ＨＢＤＨをコードする核酸分子は、標準的なクローニング技術のような標準技術を使用して、調節配列、リーダー配列、異種マーカー配列又は異種コード配列のような任意の所望の配列に機能的に連結され、融合タンパク質を作製する場合がある。

【0059】

本発明の核酸は当初、エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ及び／又はポリメラーゼ及び／又はリガーゼ及び／又はリコンビナーゼによる核酸の操作、あるいは当業者に公知の他の核酸生成方法で概して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は培養中の細胞中で形成できる。

【0060】

本発明の核酸を、発現ベクターに含めることができ、そうすることによって、この核酸が、宿主細胞中で核酸の発現を促進できるプロモータ配列に作動可能に連結されるようになる。

【0061】

本明細書において、「発現ベクター」という用語は概して、関心対象のタンパク質を細胞内で発現させるために使用できる任意の種類の核酸分子を指す（本発明の核酸に関しては、上記の詳細も参照）。特に、本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞、細菌細胞及び酵母細胞を含むがこれらに限定されない特定の宿主細胞内でタンパク質を発現させるのに適した、当業者に公知の任意のプラスミド又はベクターとして差し支えない。本発明の発現構築物はまた、本発明の３−ＨＢＤＨをコードする核酸であって、それぞれのベクターに引き続きクローニングして発現を保証するのに使用される核酸とすることもできる。タンパク質発現用のプラスミド及びベクターは当該技術分野において周知であり、例えばＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）、又はＭｏＢｉＴｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）等、多様な供給業者から商業的に購入できる。タンパク質発現方法は当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載されている。

【0062】

ベクターは、宿主細胞において、例えば、複製起点、１つ以上の治療用遺伝子及び／又は選択マーカー遺伝子、ならびに、当該技術分野において公知の他の遺伝子エレメント、例えばコードされたタンパク質の転写、翻訳及び／又は分泌を指図する制御エレメント等の複製を可能にする核酸配列を、追加的に含み得る。このベクターを用い、細胞への形質導入、形質転換もしくは感染を行い、細胞に固有の核酸、及び／又はタンパク質以外のタンパク質を発現させることが可能である。ベクターは、任意で、核酸がウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティング等の細胞への侵入を達成する一助となる材料を含む。標準的な分子生物学技術によるタンパク質発現に関しては、多くのタイプの該当する発現ベクターが、当該技術分野において公知である。そのようなベクターは、昆虫類、例えば、バキュロウイルス発現系、又は酵母、真菌、細菌もしくはウイルス発現系を含む、従来のベクター型の中から選択される。当該技術分野において多数のタイプが公知となっている他の適切な発現ベクターも、この用途に使用できる。そのような発現ベクターを得るための方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， ｓｕｐｒａを参照のこと）。

【0063】

上記に詳述されているように、本発明の変異型３−ＨＢＤＨをコードする核酸は、タンパク質を確実に発現させるように、宿主細胞内でのタンパク質の発現を駆動するのに適した配列に作動可能に連結されている。しかしながら、本発明の範囲内に包含されているように、請求された発現構築物が、タンパク質を確実に発現させるために、以後に好適な発現ベクターにクローン化される中間産物を表し得る。本発明の発現ベクターは、全ての種類の核酸配列を更に含み得る。それらの核酸配列としては、限定されるものではないが、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナー及びスプライスアクセプターシグナルのほか、介在配列、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、薬剤耐性遺伝子、又はこれらに類するものが挙げられる。任意で、薬物耐性遺伝子は、細胞周期特異的又は細胞周期非依存のいずれかであり得る内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結される場合がある。

【0064】

本明細書において「作動可能に連結される」という用語は概して、遺伝子エレメントは、意図された目的に合わせて機能するように配置され、例えば、転写がプロモータによって開始され、且つ本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を通って進行することを意味する。すなわち、ＲＮＡポリメラーゼは、融合タンパク質をコードする配列をｍＲＮＡに転写し、ｍＲＮＡをスプライシングしてタンパク質に翻訳する。

【0065】

本発明との関連において用いられる「プロモータ配列」という用語は概して、下流のコード配列に作動可能に連結された任意の種類の調節ＤＮＡ配列を指し、前記プロモータはＲＮＡポリメラーゼに結合し、細胞内のコードされたオープンリーディングフレームの転写を開始し、それにより前記下流のコード配列の発現を駆動する。本発明のプロモータ配列は、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、細胞周期特異的プロモータ、及び細胞型特異的プロモータを含むが、これらに限定されない、当業者に公知の任意の種類のプロモータ配列とされる場合がある。

【0066】

本発明の別の態様は、本発明の変異型３−ＨＢＤＨ、又は本発明の核酸を含む細胞に関する。本発明の一実施形態において、変異型を含む細胞は、本発明との関連において用いられる。この細胞は、宿主細胞であることが好ましい。本発明の「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術に適用するのに適した任意の種類の生物とすることができ、限定されないが、１種以上の組換えタンパク質を発現するのに適したあらゆる種類の細菌及び酵母株が挙げられる。宿主細胞の例としては、例えば、多様な枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株が挙げられる。多様な大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細菌宿主細胞は当業者に公知であり、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＣＡ， ＵＳＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＷＩ， ＵＳＡ）又はＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）等、多様な供給業者から商業的に購入できるＤＨ５−α、ＨＢ１０１、ＭＶ１１９０、ＪＭ１０９、ＪＭ１０１、又はＸＬ−１Ｂｌｕｅ等の株が挙げられるが、これらに限定されない。また、とりわけ好適な宿主細胞は、実施例に記載されているもの、言い換えれば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞である。宿主細胞として使用可能な枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株としては、例えば、ＭｏＢｉＴｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている１０１２野生型：ｌｅｕＡ８ ｍｅｔＢ５ ｔｒｐＣ２ ｈｓｄＲＭ１及び１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ：ｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−）等が挙げられる。

【0067】

本発明による宿主細胞の培養は、当業者に公知の常法である。つまり、本発明の変異型３−ＨＢＤＨをコードする核酸は、好適な宿主細胞に導入して組換え手段によって、これらのタンパク質を産生できる。これらの宿主細胞は、任意の種類の好適な細胞とすることができ、例えば、容易に培養できる大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のような細菌細胞とすることが好ましい。第１の工程では、それぞれの遺伝子を好適なプラスミドベクターにクローニングすることを、このアプローチに含めてもよい。プラスミドベクターは、遺伝子クローニング用に広く使用されており、コンピテントにされた細菌細胞に容易に導入（すなわち形質転換）できる。タンパク質がそれぞれの宿主細胞内で発現した後、この細胞を、化学的又は機械的細胞溶解のいずれかによって破壊できることは当業者に周知である。この細胞溶解としては、限定されないが、例えば、低張塩処理、界面活性剤処理、ホモゲナイズ、又は超音波処理が挙げられる。

【0068】

別の態様において、本発明は、試料中の３−ヒドロキシブチレートの量又は濃度を定量する方法に関し、前記方法が、
ａ）３−ＨＢＤＨの活性に資する条件下にて試料を、本発明の変異型３−ＨＢＤＨに接触させる工程と；
ｂ）３−ヒドロキシブチレートをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はその機能的に活性な誘導体と反応させる工程と；
ｃ）ＮＡＤもしくはその誘導体の酸化還元状態の変化を判別する工程と；
を含み、これにより、試料中の３−ヒドロキシブチレートの濃度を定量する、方法。

【0069】

上記の方法は、３−ＨＢＤＨを用い、以下のスキームに従って３−ＨＢからアセトアセテートへの変換を触媒できるという事実に基づく。

【数2】

【0070】

本発明の方法の第１の工程では、試料を本発明の３−ＨＢＤＨと接触させる。試料と変異型３−ＨＢＤＨとの接触は、直接的に（例えば、液体アッセイ中で）、又は間接的に（例えば、試料（検体を含む）の一部のみを３−ＨＢＤＨと接触させるセンサー系内で）為される場合がある。

【0071】

３−ＨＢＤＨの活性に資する条件下、すなわち酵素で３−ＨＢをアセトアセテートに変換する条件下にて、接触を遂行すべきことは明白である。インキュベーション工程は、約５秒〜数時間、好ましくは約１０秒〜約１０分と変動し得るのに対し、インキュベーション時間は、アッセイ形式、溶液の容量、濃度等に依存する。アッセイは、周囲温度で遂行されるか又は他の試験形式での所要温度（例えば、３０℃又は３７℃のような２５℃〜３８℃）にて同時的に遂行されるのが通例であるが、１０℃〜４０℃のような温度範囲で実施される場合もある。

【0072】

任意で、酵素を、試料との接触に先立って支持層中に固定化又は不動化することによって、アッセイを促進する場合もある。支持層の例としては、例えば、マイクロタイタープレート、ガラス顕微鏡スライドもしくはカバースリップ、スティック、ビーズ、又はマイクロビーズ、膜（例えば、試験ストリップ中に使用されるもの）及びバイオセンサーの層の形態の、ガラス又はプラスチックが挙げられる。

【0073】

試料は、３−ＨＢが含有されている疑いのある任意の試料、特に被験者から採取された試料である場合がある。「被験者から採取された試料」という用語は、任意の所与の被験者（特に、ヒト）から単離された、あらゆる生物学的流体、排泄物及び組織を含む。本発明との関連において、そのような試料としては、血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、精液、精漿、精漿液、前立腺液、排泄物、涙、唾液、汗、生検、腹水、脳脊髄液、乳汁、リンパ液、気管支及び他の洗浄試料、又は組織抽出試料が挙げられる。好ましくは、被験者は、動物（ヒトを含む）、より好ましくは哺乳動物、更により好ましくはヒトである。試料は、体液、特に血液試料又は尿試料であることが好ましい。

【0074】

血液試料は典型的に、本発明との関連において使用するのに好ましい試験試料である。この用途では、血液が静脈から、通常は肘の内側又は手の後ろ又は指先から採血される場合がある。とりわけ乳児又は幼児では、ランセットと呼ばれる鋭利な器具を用い、皮膚を穿刺して出血させる場合がある。例えば、ピペットもしくはカニューレに、又はスライドもしくは試験ストリップ上に血液を採取できる。

【0075】

３−ＨＢ（存在する場合）の接触及び変換後、３−ＨＢＤＨによって媒介されたＮＡＤの酸化還元状態の変化又は誘導体を定量し、それにより、試料中の３−ＨＢを定量する。ＮＡＤＨもしくはその誘導体の生成量、及びＮＡＤ又はその誘導体の消費量は、試料中に存在する３−ＨＢの量と相関することが明白である。したがって、ＮＡＤの酸化還元状態の変化ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＨの量もしくは濃度、ならびに２つの比率を定量すること含む。同じことは、ＮＡＤ誘導体にも当てはまる。

【0076】

ＮＡＤＨ／ＮＡＤ又はその誘導体を判別する方法は、当該技術分野において様々な種類のものが公知であり、これらのいずれも使用できる。

【0077】

ＮＡＤＨ／ＮＡＤもしくはその誘導体を定量する例示的な方法としては、電気化学的方法が挙げられる（例えば、米国特許第６，５４１，２１６（Ｂ１）号明細書に記載されている）又は光学的方法（例えば、３４０ｎｍもしくは３６５ｎｍ等の吸光度によるＮＡＤＨ／ＮＡＤ変換を測定することにより、又は、ルシフェリンを生ずる還元酵素ベースのアッセイによって光学的に定量化される）。電気化学的方法が使用される場合、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ又はその誘導体は、ａ）測定電極上で直接反応し得るか、あるいはｂ）第１段階において、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ又はその誘導体が、追加のレドックス中間体物質と反応すると、この中間体物質が、その酸化還元状態を規定された関係ＮＡＤＨ／ＮＡＤ又はその誘導体の酸化還元状態に変換し、後続の段階では、このレドックス中間体が、測定電極上で反応する。

【0078】

ＮＡＤ及びＮＡＤＰは両方とも塩基不安定分子であり、その分解経路は、文献に記載されている（例えば、Ｎ．Ｊ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｙｒｉｄｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｅｎｚｙｍｅｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｌｏｎｄｏｎ １９８２， Ｊ． Ｅｖｅｒｅｓｅ， Ｂ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｋ． Ｙｏｎ， Ｅｄｉｔｏｒｓ， ｃｈａｐｔｅｒ ３， ｐａｇｅｓ ５６−６５を参照）。したがって、ＮＡＤＨ／ＮＡＤの誘導体が開発されてきており、その市販品が出回っている。一部の誘導体は、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｅｎｚｙｍｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｌｏｎｄｏｎ １９８２ ， Ｅｄｓ．Ｊ． Ｅｖｅｒｅｓｅ， Ｂ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｋ． Ｙｏｕ， Ｃｈａｐｔｅｒ ４、国際公開第０１／９４３７０（Ａ）号パンフレット、国際公開第９８／３３９３６（Ａ）号パンフレット、及び米国特許第５，８０１，００６（Ｂ１）号明細書に記載されている。

【0079】

好ましくはカルバＮＡＤであり（ｃＮＡＤ）はＮＡＤの誘導体として使用されている。カルバＮＡＤにおいて、リボースは炭素環式糖単位で置換される。カルバＮＡＤの構造（Ｉ）は以下のとおりである。

【0080】

【化2】

【0081】

本化合物、その製造及び使用については、国際公開第２００７／０１２４９４（Ａ）号パンフレット、国際公開第２０１１／０１２２７０（Ａ）号パンフレット、及び国際公開第２０１４／１９５３６３（Ａ）号パンフレットに詳述されている。本発明の補因子は、カルバＮＡＤであることが好ましい。本発明の一実施形態において、補因子はＮＡＤの機能的に活性な誘導体であり、その補因子について言及している国際公開第２０１１／０１２２７０（Ａ）号パンフレットの式ＩＩＩにおいて開示されている。本発明の一実施形態において、ＮＡＤＰはＮＡＤの代わりに使用される。

【0082】

本発明の方法は、例えばキュベット中でいわゆる液体試験もしくは湿潤試験にて、又は適当な試薬担体上でいわゆる乾式試験として遂行でき、このため、必要な試験試薬は固体担体の中もしくは上に存在し、好ましくは吸収性材料又は膨潤性材料である。

【0083】

代替的に又は付加的に、３−ＨＢＤＨは、センサー、試験ストリップ、試験エレメント、試験ストリップデバイス又は液体試験の一部とされる場合がある。

【0084】

センサーは、物理的／化学的な量を測定し、これを観察者又は器具で読み取ることができる信号に変換するための実体である。本発明において、３−ＨＢＤＨはセンサーの一部とされる場合がある。センサーは、３−ＨＢ及びＮＡＤもしくはその誘導体をアセトアセテート、ならびにＮＡＤＨもしくはその誘導体に変換し、これを色の変化又は表示された値等の信号に更に変換して、例えば、ディスプレイ又はモニター上に表示する。

【0085】

一実施形態において、センサーは、３−ＨＢＤＨと、試料の３−ＨＢを定量するための電流測定デバイスとを含む場合がある。また、電気化学フローセルに共役された微小透析システムを使用して、試料中又は被験者における３−ＨＢを連続的にモニタリングすることもできる。フローセルの作用電極は、電極表面上のレドックスポリマーフィルム中に固定化された３−ＨＢＤＨを用いて調製できる。電気化学３−ＨＢセンサーを微量透析に直接共役することにより、試料アリコートを、ポストカラムオキシダーゼ酵素反応器を有する液体クロマトグラフィーシステムに移す必要がなくなる。微量透析プローブからの透析液中の３−ＨＢは、他の酸化可能な種からの有意な干渉をいっさい受けることなしに、酵素電極にて選択的に検出できる。更に、当該技術分野において酵素共役型バイオセンサーが記載されてきた。これによれば、３−ＨＢＤＨは、例えば、３−ＨＢＤＨ／グラファイト混合物を電気メッキグラファイトパッド上にプリントすることによって、あるいは炭素粒子、白金化炭素粒子、炭素／炭素複合体上に変異型３−ＨＢＤＨを吸着又は固定化させて、二酸化マンガン粒子、ガラス状炭素もしくはカーボンペースト電極等と混合する。

【0086】

試験ストリップ又は試験要素は、試料中の標的物質の存在及び／又は量を定量するために使用される、分析デバイス又は診断デバイスである。標準試験ストリップには、試験と接触したときに反応する（例えば、色が変化する）試薬を含む１つ以上の異なる反応ゾーン又はパッドを、含めてもよい。試験ストリップは、多くの実施形態において、例えば米国特許第６，５４１，２１６（Ｂ１）号明細書、欧州特許第２６２４４５（Ｂ）号明細書及び米国特許第４８１６２２４（Ｂ１）号明細書において公知となっている。定量方法を遂行するために必要な１つ以上の試薬（例えば、酵素）が固体担体層の上又は中に存在することは、遍く公知である。担体層として、分析対象となる試料液体によって湿潤される特に好ましい吸収性材料及び／又は膨潤性材料が存在し、例としては、ゼラチン、セルロース及び合成繊維フリース層が挙げられる。

【0087】

本発明の３−ＨＢＤＨを、液体試験の一部としてもよい。液体試験は、試験成分が液体媒体中で反応する試験である。実験室分析の分野において、液体試薬は水を主成分とするものが通例であり、例えば、関与する酵素の活性を提供するための緩衝塩溶液とされる。液体は通常、特定の意図された用途に適応する。液体試験を実施するためには、全ての試験成分を液体中に溶解し、混合する（又はその逆も同様である）。そのような試験を実施するための典型的な容器としては、バイアル、マルチウェルプレート、キュベット、容器、試薬カップ、チューブ等が挙げられる。

【0088】

本発明の一実施形態において、本発明の３−ＨＢＤＨは固定化される場合がある。固定化の典型的な方法としては、膜等への共有結合、ポリマー内でのカプセル化、支持マトリックスへの架橋、又はゾル−ゲルマトリックス（例えば、シリケートガラスのようなガラス）内での固定化、あるいは多孔性基材上への吸着が挙げられる。酵素を固定化するための好適な方法は当該技術分野において公知である（例えば、Ｌｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ ６８： １０９−１１４を参照のこと）。

【0089】

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、グルコースの量又は濃度を定量する工程を更に含む。本発明の別の実施形態において、前記方法は、アセトン及び／又はアセトアセテートの量もしくは濃度を定量する工程；ならびに／あるいはグルコースの量もしくは濃度を定量する工程を含む。これらの化合物の定量は、上記の疾患及び医学的状態の診断に特に関連する。これらの化合物を定量するための方法は、当該技術分野において周知である。加えて、複数の検体を分析するためのシステム及び方法は、国際公開第２０１４／０６８０２４（Ａ）号パンフレットで公知である。

【0090】

したがって、本発明の方法は、以下：
ａ）ＮＡＤもしくはその誘導体の酸化還元状態の変化を判別する工程が、（ｉ）ＮＡＤもしくその誘導体、又は（ｉｉ）ＮＡＤＨもしくはその誘導体の濃度を定量することを含み；且つ／あるいは
ｂ）前記ＮＡＤもしくはその誘導体の酸化還元状態の変化を判別する工程が、電気化学的又は光学的であり；且つ／あるいは
ｃ）前記方法が、アセトアセテートもしくはアセトンの量又は濃度を定量することを更に含み；且つ／あるいは
ｄ）前記方法が、グルコースの量又は濃度を定量することを更に含み；且つ／あるいは
ｅ）前記ＮＡＤの誘導体がカルバＮＡＤであり；且つ／あるいは
ｆ）前記変異型３−ＨＢＤＨが、センサー、試験ストリップ、試験エレメント、試験ストリップデバイス又は液体試験の一部であり；且つ／あるいは
ｇ）前記試料が体液、特に血液試料又は尿試料であることを更に特徴とすることが好ましい。

【0091】

更に別の態様において、本発明は、試料中の３−ヒドロキシブチレートの量もしくは濃度を定量するための、本発明の変異型３−ＨＢＤＨの使用に関する。

【0092】

本発明の使用に関しては、本態様にも適用可能である、本開示の他の態様に関連して使用される用語、実施例及び特定の実施形態を参照する。とりわけ、本発明の方法について詳述されているように、本発明による変異型３−ＨＢＤＨを使用できる。

【0093】

更に、別の態様において、本発明は、本発明の変異型３−ＨＢＤＨ、及び任意で、前記定量を行うのに必要とされる更なる構成要素を含む、試料中の３−ヒドロキシブチレートの量又は濃度を定量するためのデバイスに関する。

【0094】

本発明のデバイスに関しては、本態様にも適用可能である、本開示の他の態様に関連して使用される用語、実施例、及び特定の実施形態を参照する。とりわけ、上記に詳述されているように、本発明による変異型３−ＨＢＤＨを使用できる。

【0095】

本発明の３−ＨＢＤＨを、試料中の３−ＨＢを測定するためのデバイスの一部としてもよいし、本デバイスは、この目的に適した任意のデバイスとすることも、３−ＨＢを定量するために使用できる機械又は工具とすることもできる。本デバイスは、センサーとするのが好ましく、好適には電気化学センサー又は試験ストリップである。例示的なデバイスとしては、上述されているもの以外に、後述のものもある。

【0096】

本デバイスは、例えばセンサーであってもよい。生物学的成分（ここでは本発明による３−ＨＢＤＨ）と検出器成分、特に物理化学的な検出器成分とを組み合わせた検体を検出するための分析デバイスであるバイオセンサーである。

【0097】

バイオセンサーは、特に血液由来の生物学的試料からの様々な検体（３−ＨＢを含む）の濃度を定量するのに特に有用である。電気化学試験ストリップ形式に基づく例示的なバイオセンサーは、米国特許第５，４１３，６９０（Ｂ１）号明細書；同第５，７６２，７７０（Ｂ１）号明細書及び同第５，９９７，８１７（Ｂ１）号明細書に記載されている。

【0098】

本発明の（バイオ）センサーにおいて、３−ＨＢＤＨ及びＮＡＤ又は誘導体の存在下でアセトアセテートに変換された３−ＨＢ、ならびにＮＡＤ又は誘導体の酸化還元状態の変化は、トランスデューサ又は検出素子によってモニタリングできる。

【0099】

とりわけ、３−ＨＢセンサーは、グルコース、アセトン、アセトアセテート、コレステロール、トリグリセリド、尿素、血液ガス又は電解質等を定量するための、他のセンサーと組み合わせて用いられる場合がある。本発明の変異型３−ＨＢＤＨは、これらの複数の検体デバイスにおいても使用できることが明白である。

【0100】

上記に詳述されているように、センサーは、電気化学センサー又は光学センサーであることが、好ましい。電気化学センサーは、化学信号（ここでは３−ＨＢの存在）から電気信号（例えば、電流）への変換に基づくものである。好適な電極は、電気信号としてのＮＡＤＨ又はその誘導体の３−ＨＢ媒介生成物を測定できる。

【0101】

好適な光学センサーは、ＮＡＤ又はその誘導体の酸化還元状態における３−ＨＢＤＨ媒介変化を測定できる。シグナルは、光のＮＡＤ／ＮＡＤＨ媒介吸光度／発光である場合がある。

【0102】

本発明のデバイスは、本発明の３−ＨＢＤＨに加えて、前記定量に必要であるか、又は前記定量に役立つ１つ以上の更なる成分（例えば、他の試薬）を含み得る。これらの成分は、本発明の方法及びデバイスの文脈において記載された成分のいずれかであり得る。加えて、これは、取扱説明書、ランセットデバイス、毛細管ピペット、更なる酵素、基質及び／又は対照溶液等を含み得る。

【0103】

好ましくは、本発明のデバイスは、デバイスは、センサー、好ましくは電気化学センサーもしくは光学センサー、又は試験片、特に試験片であるか、又はそれらを含み、且つ／あるいは試料中のグルコースの量もしくは濃度を定量することを可能にすることを特徴とする。本発明のデバイスに関しては、上述の用語、実施例及び特定の実施形態についても言及する。

【0104】

別途定義されていない限り、本明細書中に使用されている全ての技術用語、科学用語、及び頭字語は、本発明の分野における当業者が概して理解するのと同じ意味を有する。分子生物学における汎用用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９４ （ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）； Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４ （ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）； 及びＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５ （ＩＳＢＮ １ −５６０８１ −５６９−８）で見つけることができる。

【0105】

本明細書中に記載されている特定の方法、プロトコル、及び試薬は変更される可能性があるので、本発明はこれらに限定されない。本発明の実施に際して、本明細書中に記載されているものと類似又は等価な任意の方法及び材料を使用できるが、好ましい方法及び材料は本明細書中に記載されている。更に、本明細書中に使用されている用語は、専ら特定の実施形態を説明することを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。

【0106】

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上別の意味が明示されていない限り、複数の参照を含む。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」及び「包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈すべきである。同様に、「又は」という用語は、文脈上別の意味に解釈すべきことが明示されていない限り、「及び」を含むことが意図されている。「複数」という用語は、２つ以上であることを指す。

【0107】

以下の実施例は、本発明の多様な実施形態を例証することを意図したものである。そのため、考察された特定の修正は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく様々な均等物、変更、及び修正を行うことができることは当業者にとって明らかであり、したがって、そのような均等な実施形態を本明細書中に含めるべきことを理解する必要がある。

【実施例】

【0108】

実施例１：３−ＨＢＤＨ変異型のライブラリの確立
ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の３−ヒドロキシブチレート脱水素酵素（３−ＨＢＤＨ）遺伝子（データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｄ０ＶＷＱ０）を合成し、ベクターｐＫＫｔ５内でクローンして、分子生物学における繁用の方法により大腸菌（E. coli）株ＸＬ−１Ｂｌｕｅ内で変形させる。

【0109】

飽和突然変異誘発を酵素の多くのアミノ酸位置に適用した。突然変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ２００５１８）を使用して、ランダムに合成されたプライマーを適用することによって達成された。

【0110】

突然変異誘発用に使用される５’−及び３’−プライマーは互いに相補的であり、アミノ酸交換のため中心位置にＮＮＮ（ランダムに合成されたヌクレオチド）が含有されていた。この無作為に作成されたコドンは、各末端で１２〜１６ヌクレオチドに隣接していた。これらヌクレオチドの配列は、ｃＤＮＡ鎖、又はアミノ酸置換のためのコドンに隣接する相補的なｃＤＮＡ鎖と同一であった。突然変異した遺伝子を形質転換させ、寒天プレート上で３７℃にて一晩培養して、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株Ｘｌ−Ｂｌｕｅ内で変異型ライブラリによって作製される。

【0111】

実施例２：１回目の突然変異誘発（単一アミノ酸置換を伴う変異型）による３−ＨＢＤＨ変異型の特性の判別
３−ＨＢＤＨ変異型のライブラリを、実施例１に記載されているように生成し、以下の酵素特性についてスクリーニングした。
− 熱安定性
− ３−ヒドロキシブチレートに対する親和性
− ｃ−ＮＡＤ（カルバＮＡＤ＝人工補因子に対する親和性、米国特許出願公開第２０１２０１３００６２（Ａ１）号明細書を参照）

【0112】

上記の寒天プレート上の変異体コロニーを、２００μｌのＬＢ−アンピシリン−培地／穴を含有するマイクロタイタープレート（ｍｔｐ）中でピックし、３７℃で一晩インキュベートした。これらのプレートをマスタープレートと呼んだ。各アミノ酸位置について、２つのマスタープレートをピックして、全ての可能な交換が含まれることを確認した。

【0113】

各マスタープレートから、４０μｌ試料／キャビティを、２００μｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；５００ｍＭのＮａＣｌ；２００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ９．０；２％Ｂ−パー／キャビティ（Ｂ−ＰＥＲ＝バクテリアタンパク質抽出試薬ピアス番号７８２４８）含有のｍｔｐに移し、４０℃にて３０分間インキュベートして細胞を破壊した。このプレートを作業プレートと呼んだ。

【0114】

作業プレートから、４×２０μｌ試料／キャビティを４つの空のｍｔｐｓに移した。これらのうちの１つを６２．２２ｍＭの３−ヒドロキシブチレート；４．１５ｍＭのｃＮＡＤ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ９．０にて室温で試験し、基準測定と呼んだ。他のｍｔｐをそれぞれ異なる条件下で試験し、得られた値を、パーセントで表された基準プレートと比較した。

【0115】

測定対象パラメータは、以下のとおり：
− 熱安定性：Ｍｔｐを（特に明記しない限り）５０℃で３０分間インキュベートし、以後に６２．２２ｍＭの３−ヒドロキシブチレート；４．１５ｍＭのｃＮＡＤ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ９．０にて試験した。
− ３−ヒドロキシブチレートに対する親和性：基質の量を減少させた活性アッセイ（すなわち、基質飽和未満）。測定には、１．９４ｍＭの３−ヒドロキシブチレート；４．１５ｍＭのｃＮＡＤ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ９．０を用いた。
− ｃＮＡＤに対する親和性：補因子の量を減少させた活性アッセイ（すなわち、飽和未満）。測定には、６２．２２ｍＭの３−ヒドロキシブチレート；０．０３２ｍＭのｃＮＡＤ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ９．０を用いた。

【0116】

室温で３４０ｎｍにて５分間、酵素反応をモニタリングし、各作業プレートの各キャビティについてｄＥ／ｍｉｎを計算した。基準測定からの値を１００％活性に設定した。他の３つのプレートで得られた値（３−ヒドロキシブチレート又はｃＮＡＤに対する熱安定性、親和性）を基準と比較し、活性の百分率（（ｄＥ／ｍｉｎパラメータ／ｄＥ／ｍｉｎ基準）×１００）で計算した。各マスタープレートには、変異体だけでなく、特性の改善又は劣化に関する評価が良好化されるように対照としての野生型酵素も含まれていた。

【0117】

残存活性として表される熱安定性を、次式として計算した。

【0118】

【数3】

【0119】

野生型酵素を使用して得られた値よりも、変異体を使用して得られた値の方が高い場合、変異体の熱安定性が増強されたことを表す。したがって、活性比率として表される基質の親和性を計算した。

【0120】

【数4】

【0121】

基質の親和性が高い変異体は、基質の親和性が低い変異体よりも少ない基質（基質飽和未満のもの）と反応した場合に、活性の増強を示す。野生型酵素を使用して得られた値よりも、変異体を使用して得られた値の方が高い場合、変異体に対する基質の親和性が増強されたことを表す。

【0122】

したがって、活性比率として表される補因子の親和性を計算した。

【0123】

【数5】

【0124】

０．００１ ｄＥ／ｍｉｎ未満のデータをゼロに設定し、結果として「ゼロ」値が得られた。

【0125】

野生型酵素に対する結果は、表１Ａ及び表１Ｂに要約されている。

【0126】

１回目の飽和突然変異誘発において、以下の変異体が見出された。

【0127】

【表1A-1】

【表1A-2】

【0128】

【表1B】

【0129】

熱安定性の向上は、多くの場合、基質及び／又は補因子に対する親和性に影響を及ぼすことを表に示す。安定性及び親和性の両方のパラメータを向上させる４つの位置、すなわち、配列番号１の位置１２５、１４４、２３２及び２５０が見出された。

【0130】

追加の見出された位置の組み合わせによって、更なる最適化用の交換を伴う例示的な変異体Ｖ２５０Ｍを選択した。

【0131】

実施例３：２回目の突然変異誘発による３−ＨＢＤＨ変異型（アミノ酸置換、及び任意で、更なるアミノ酸置換を伴う変異型Ｖ２５０Ｍ／Ｉ）のスクリーニング
特に明記しない限り、実験を実施例２に詳述されているようにして遂行した。２回目の突然変異誘発において、選択された置換を変異体ＷＴ＋Ｖ２５０Ｍと組み合わせた。結果は、表２Ａ及び表２Ｂに要約されている。

【0132】

【表2A】

【0133】

複数の置換によって安定性が更に増強されたものを（Ｖ２５０Ｍ以外に）、表２Ａに示してある。変異型ＷＴ＋Ｇ２３０Ｌ＋Ｖ２５０Ｍ、ＷＴ＋Ｆ３７Ｙ＋Ｖ２５０Ｍ、ＷＴ＋Ｆ３７Ｙ＋Ｇ２３０Ｌ＋Ｖ２５０Ｍ及びＷＴ＋Ｄ２０２Ｇ＋Ｇ２３０Ｌ＋Ｖ２５０Ｍは、３−ＨＢに対しても良好な親和性を示すという点で、特に興味深い。

【0134】

例示的な変異体ＷＴ＋Ｆ３７Ｙ＋Ｇ２３０Ｌ＋Ｖ２５０Ｍを、他の見つかった位置と更に組み合わせた。その結果の要約が、表２Ｂである。

【0135】

【表2B】

【0136】

表２Ｂに、置換Ｐ１９５Ｑ又はＡ１４５Ｇを加えれば、変異体ＷＴ＋Ｆ３７Ｙ＋Ｇ２３０Ｌ＋Ｖ２５０Ｍの安定性が更に増強される可能性のあること、ならびに、３−ＨＢ及びｃＮＡＤに対する許容可能な親和性を示してある。

【0137】

【化3】

【化4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]