特開 2022-10141 アデノ随伴ウイルス第ＶＩＩＩ因子ベクター、関連ウイルス粒子、及びそれらを含む治療的製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022010141

(43)【公開日】2022-01-14

(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルス第ＶＩＩＩ因子ベクター、関連ウイルス粒子、及びそれらを含む治療的製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20220106BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220106BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20220106BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20220106BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20220106BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20220106BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20220106BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20220106BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

A61K9/08 ZNA

A61K9/10

A61K31/573

A61K47/02

A61K47/10

A61K47/26

A61K48/00

A61P7/04

C12N15/864 100Z

C12N15/12

C12N7/01

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021181755

(22)【出願日】2021-11-08

(62)【分割の表示】P 2018515603の分割

【原出願日】2016-09-23

(31)【優先権主張番号】62/323,182

(32)【優先日】2016-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/232,242

(32)【優先日】2015-09-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/365,544

(32)【優先日】2016-07-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】506136483

【氏名又は名称】バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】スチュアート バンティング

(72)【発明者】

【氏名】ピーター キャメロン コロシ

(72)【発明者】

【氏名】エルノ パンゴール

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA11

4C076AA16

4C076BB13

4C076CC14

4C076DD23D

4C076DD26Z

4C076DD38

4C076EE23F

4C076FF13

4C076FF14

4C076FF16

4C076FF61

4C084AA13

4C084MA05

4C084MA16

4C084MA66

4C084ZA53

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA10

4C086DA10

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA16

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA53

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA10

4C087BC83

4C087MA05

4C087MA16

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA53

(57)【要約】

【課題】アデノ随伴ウイルス第ＶＩＩＩ因子ベクター、関連ウイルス粒子、及びそれらを含む治療的製剤の提供。
【解決手段】本発明は、高い発現活性を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ベクター及び完全長または切断型の機能性ＦＶＩＩＩタンパク質を発現するＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを含む、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩをコード／発現するベクター及びウイルスを提供する。本発明は、本明細書に記載されるＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを作製する方法、かかるベクターを含むか、またはそれを発現する組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルス粒子、それらを含む関連薬学的製剤、及びその治療的使用にも関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１５年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／２３２，２４２号、２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，１８２号、及び２０１６年７月２２に出願された米国仮特許出願第６２／３６５，５４４号の優先権利益を主張し、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、高い発現活性を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ベクター及び完全長または切断型の機能性ＦＶＩＩＩタンパク質を発現するＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを含む、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターに関する。本発明は、本明細書に記載されるＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを作製する方法、かかるベクターを含むか、またはそれを発現する組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルス粒子、それらを含む関連薬学的製剤、及びその治療的使用にも関する。

【背景技術】

【0003】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及びいくつかの他の霊長類種に感染する、小型の複製欠損の無エンベロープの動物ウイルスである。ＡＡＶのいくつかの特徴により、このウイルスは遺伝子治療による治療用タンパク質の送達のための魅力的なビヒクルとなっており、例えば、ＡＡＶが、ヒト疾患を引き起こすことが知られておらず、軽度の免疫応答を誘導すること、ならびにＡＡＶベクターが、宿主細胞ゲノム内への組込みなしに分裂細胞及び静止細胞の両方に感染可能であることが挙げられる。ＡＡＶを用いる遺伝子治療ベクターは、いくつかの臨床試験で、例えば、血友病Ｂの治療のためのヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の肝臓への送達への使用が成功している（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：２３５７－２３６５，２０１１）。

【0004】

しかしながら、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターにはいくつかの欠点がある。具体的には、ＡＡＶベクターのクローニング容量が、当該ウイルスのＤＮＡパッケージング容量の影響により、限定されている。野生型ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７キロ塩基（ｋｂ）である。実際には、最大約５．０ｋｂのＡＡＶゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子の中に完全にパッケージングされている（すなわち、完全長である）と思われる。ＡＡＶベクター内の核酸ゲノムは約１４５塩基のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を２つ有していなければならないという要件により、ＡＡＶベクターのＤＮＡパッケージング容量は、最大約４．４ｋｂのタンパク質コード配列がカプシド形成され得る。

【0005】

このサイズ制限により、巨大な治療用遺伝子、すなわち、約４．４ｋｂ長よりも長い遺伝子は、一般に、ＡＡＶベクターでの使用に適していない。そのような治療用遺伝子の１つは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子であり、この遺伝子は、Ｎ末端からＣ末端へ、１９アミノ酸のシグナルペプチド、及び３つの巨大ドメイン（すなわち、重鎖またはＡドメイン、中央またはＢドメイン、及び軽鎖またはＣドメイン）を含む、２３３２アミノ酸のポリペプチドをコードする約７．０ｋｂのｍＲＮＡを有する。ＦＶＩＩＩにおけるＡＡＶベクターのサイズ制限を克服するために使用された戦略の１つは、一方のＡＡＶベクターが重鎖またはＡドメインをコードし、もう一方のＡＡＶベクターが軽鎖またはＣドメインをコードする、２つのＡＡＶベクターを使用することであった（例えば、Ｃｏｕｔｕらの米国特許第６，２２１，３４９号、同第６，２００，５６０号、及び同第７，３５１，５７７号を参照のこと）。このサイズ制限を回避する別の戦略は、タンパク質の中央部分またはＢドメインが欠失しており、ＳＱ配列として知られている１４アミノ酸リンカーで置換されているＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクターを作製することであった（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１７：７９８－８０７，２０１１、及びＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－３３４４，２０１３）。

【0006】

５．０ｋｂよりも長いＡＡＶゲノムを有するＡＡＶベクターが文献で報告されているが、これらの場合の多くで、コードされた遺伝子の５’末端または３’末端が切断されていると思われる（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．１８：６－８，２０１０及びＧｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇｉｎ．Ｒｅｖ．２４：１６５－１７８，２００７）。しかしながら、ＡＡＶ感染細胞において、５’末端切断及び３’末端切断を有する核酸の間で、重複した相同組換えが生じる結果、当該巨大タンパク質をコードする「完全な」核酸が作製され、それにより、機能的な完全長遺伝子が再構築されることが示されている。

【0007】

血友病Ａを治療するための遺伝子治療法において有用な、機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする新規のＡＡＶベクター、及びそれを含む組換えＡＡＶウイルスが必要とされている。したがって、本発明は、組換えＡＡＶウイルスが治療用タンパク質をコードする核酸全体をカプシド形成することにより（すなわち、完全にパッケージングされたＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター）、ゲノムのサイズ超過という上記の問題を回避するような、または、切断されていてもされていなくてもよい機能的に活性な第ＶＩＩＩ因子タンパク質を少なくとも生成するような、機能的に活性なＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクターに関する。本発明はまた、高いＦＶＩＩＩ発現活性を有するＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの産生に関する。最後に、本発明は、本明細書に記載されるＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター、関連する薬学的製剤、及び血友病Ａに罹患している対象における血友病Ａの治療のための関連する投与の方法にうちのいずれかを含む、ＡＡＶ第ＶＩＩＩ因子ベクター及び／または組換え第ＶＩＩＩ因子ＡＡＶ粒子／ウイルスを含む薬学的製剤に関する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許第６，２２１，３４９号明細書

【特許文献2】米国特許第６，２００，５６０号明細書

【特許文献3】米国特許第７，３５１，５７７号明細書

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：２３５７－２３６５，２０１１

【非特許文献2】Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１７：７９８－８０７，２０１１

【非特許文献3】ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－３３４４，２０１３

【非特許文献4】Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．１８：６－８，２０１０

【非特許文献5】Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇｉｎ．Ｒｅｖ．２４：１６５－１７８，２００７

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、機能的に活性なＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクター（本明細書では「ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター」と称される）を提供する。本発明の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスの非自然発生する誘導体を含み、これに、機能性ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列が導入されている。機能的に活性なＦＶＩＩＩをコードするゲノムは、好ましくは、７．０ｋｂ長以下、より好ましくは６．５ｋｂ長以下、さらにより好ましくは６．０ｋｂ長以下、さらにより好ましくは５．５ｋｂ長以下、さらにより好ましくは５．０ｋｂ長以下であり、増強されたプロモーター機能を有する。

【0011】

本明細書で使用される場合、「機能的に活性なＦＶＩＩＩ」は、培養細胞において発現される場合のインビトロにおいて、または細胞もしくは体組織において発現される場合のインビボにおいて、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の機能性を有するＦＶＩＩＩタンパク質である。これには、例えば、機能的に血液凝固カスケードの一因となること、及び血友病Ａに罹患している対象における血液が凝固するのにかかる時間を短縮することが含まれる。野生型ＦＶＩＩＩは、凝固カスケードを介した血液凝固に関与しており、活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）の補助因子として働いて、カルシウムイオン及びリン脂質の存在下で、第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化ＦＸ（ＦＸａ）に変換する錯体を形成する。したがって、機能的に活性なＦＶＩＩＩは、ＦＩＸａとの錯体を形成し得、この錯体はＦＸをＦＸａに変換し得る。機能的に活性なＦＶＩＩＩタンパク質の一例は、ＷＯ２０１５／０３８６２５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、ＦＶＩＩＩ ＳＱタンパク質である。

【0012】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶウイルスゲノムに異種である転写調節エレメント、すなわち、１つ以上のプロモーター及び／またはエンハンサー、ならびに任意に、ポリアデニル化配列及び／または当該タンパク質コード配列のエクソン間に挿入された１つ以上のイントロンに動作可能に連結されたタンパク質コード配列（好ましくは機能性第ＶＩＩＩコード配列）に隣接している、ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列及びＡＡＶ３’ＩＴＲを有する、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸を指す。一本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルス粒子のゲノム中に存在する核酸を指し、本明細書に開示される核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかであり得る。このような一本鎖核酸のサイズは、塩基単位で提供される。二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター核酸を発現または遺伝子導入するために使用される、プラスミド、例えば、ｐＵＣ１９のＤＮＡ中、または二本鎖ウイルス、例えば、バキュロウイルスのゲノム中に存在する核酸を指す。このような二本鎖核酸のサイズは、塩基対（ｂｐ）単位で提供される。

【0013】

「逆方向末端反復（ＩＴＲ）」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ複製の開始点として、及びウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしてシスに機能する、ＡＡＶゲノムの５’末端及び３’末端に見出される、当該技術分野において認知されている領域を指す。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒になって、宿主細胞ゲノムからの除去及びレスキュー、ならびに宿主細胞ゲノムへの２つの隣接するＩＴＲ間に挿入されたヌクレオチド配列の組込みを効率的に提供する。ある特定のＡＡＶ関連ＩＴＲの配列は、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１）：３６４－３７９（２００５）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）により開示されている。本明細書での使用を見出すＩＴＲ配列は、完全長野生型ＡＡＶ ＩＴＲまたはその断片であり得るか、または複製起点としてシスに機能することができる完全長野生型ＡＡＶ ＩＴＲの配列変化であり得る。本発明の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターにおいて有用なＡＡＶ ＩＴＲは、任意の既知のＡＡＶ血清型に由来し得、ある特定の好ましい実施形態において、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５血清型に由来し得る。

【0014】

「転写調節エレメント」は、遺伝子転写の調節に関与する遺伝子のヌクレオチド配列を指し、転写因子が結合することで、ＲＮＡポリメラーゼの結合を助け、発現を促進する、プロモーター、ならびに応答エレメント、アクチベーター、及びエンハンサー配列、ならびに抑制タンパク質が結合することで、ＲＮＡポリメラーゼの結合を阻止し、発現を妨げる、オペレーターまたはサイレンサー配列が含まれる。「肝臓特異的転写調節エレメント」という用語は、肝組織中に特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを指す。肝臓特異的調節エレメントの例としては、マウスサイレチン（ｔｈｙｒｅｔｉｎ）プロモーター（ｍＴＴＲ）、内在性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、及びその活性断片、ヒトアルブミン最小プロモーター、ならびにマウスアルブミンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｅｎｈ１と共に、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６等の、肝臓特異的転写因子結合部位に由来するエンハンサーも考慮される。

【0015】

一実施形態において、本発明のＡＡＶベクターは、１４アミノ酸ＳＱ配列によって置換されたＢドメインを有する機能的に活性なＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸を含む。ＳＱ配列は、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１７：７９８－８０７，２０１１、ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－３３４４，２０１３、ＷＯ２０１３／１８６５６３、及びＷＯ２０１５／０３８６２５において開示されている。ＦＶＩＩＩコード領域配列は、コドンを最適化したＦＶＩＩＩコード配列であり得る（例えば、２０１１年１月１３日に公開されたＷＯ２０１１／００５９６８、２０１５年３月１９日に公開されたＷＯ２０１５／０３８６２５、及びＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－３３４４，２０１３を参照されたく、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。好ましい一実施形態において、ＡＡＶベクターまたは組換えＡＡＶウイルス粒子の機能的に活性なヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸は、配列番号１のヌクレオチド４０３～４７７６からなる。この配列は、本明細書において「ＦＶＩＩＩ－ＳＱ」と称される。

【0016】

第１の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、図２Ａに概略的に示されるＰｒｏｔｏ１を含み、配列番号１に記載される核酸配列を含む。

【0017】

第２の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、図２Ｂに概略的に示されるＰｒｏｔｏ１Ｓを含み、配列番号２に記載される核酸配列を含む。

【0018】

第３の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、図２Ｃに概略的に示されるＰｒｏｔｏ２Ｓを含み、配列番号３に記載される核酸配列を含む。

【0019】

第４の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、図２Ｄに概略的に示されるＰｒｏｔｏ３Ｓを含み、配列番号４に記載される核酸配列を含む。

【0020】

別の実施形態において、本発明の組換えＡＡＶベクターは、ＳＱ配列を含むＢドメイン全体、及び軽鎖またはＣドメインのすぐＮ末端側に位置するａ３ドメインを欠失している機能性ＦＶＩＩＩをコードする核酸を含む。ＦＶＩＩＩコード領域配列は、コドンを最適化した配列であり得る（例えば、２０１１年１月１３日に公開されたＷＯ２０１１／００５９６８、２０１５年３月１９日に公開されたＷＯ２０１５／０３８６２５、及びＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－３３４４，２０１３を参照のこと）。

【0021】

第１の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、図３Ａに概略的に示されるＰｒｏｔｏ４を含み、配列番号５に記載される核酸配列を含む。

【0022】

第２の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、図３Ｂに概略的に示されるＰｒｏｔｏ５を含み、配列番号６に記載される核酸配列を含む。

【0023】

第３の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、図３Ｃに概略的に示されるＰｒｏｔｏ６を含み、配列番号７に記載される核酸配列を含む。

【0024】

第４の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、図３Ｄに概略的に示されるＰｒｏｔｏ７を含み、配列番号８に記載される核酸配列を含む。

【0025】

他の実施形態において、本発明の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）（当該技術分野において公知であるように改変されてもされなくてもよい）、肝臓特異的転写調節領域、コドンを最適化した機能的に活性なＦＶＩＩＩコード領域、任意に１つ以上のイントロン、ポリアデニル化配列、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ（当該技術分野において公知であるように改変されてもされなくてもよい）を含む核酸を含む。好ましい一実施形態において、肝臓特異的転写調節領域は、短縮型ＡｐｏＥエンハンサー配列、１８６塩基ヒトアルファ抗トリプシン（ｈＡＡＴ）近位プロモーター（５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の４２塩基を含む）、ならびに（ｉ）３４塩基ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサー、（ｉｉ）３２塩基ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域、及び（ｉｉｉ）ヒトＡＡＴ近位プロモーターの遠位エレメントの８０の追加塩基からなる群から選択される１つ以上のエンハンサーを含み、コドンを最適化した機能的に活性なＦＶＩＩＩコード領域はＦＶＩＩＩ ＳＱ変異体をコードする。別の好ましい実施形態において、肝臓特異的転写調節領域は、α１－ミクログロブリンエンハンサー配列及び１８６塩基ヒトアルファ抗トリプシン（ＡＡＴ）近位プロモーターを含む。

【0026】

第１の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号９に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００ＡＴＧを含む。

【0027】

第２の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１０に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００ＡＴＧｂＧＨポリＡを含む。

【0028】

第３の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１１に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ配列を含む。

【0029】

第４の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１２に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０３ＡＴＧを含む。

【0030】

第５の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１３に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０３ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡを含む。

【0031】

第６の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１４に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０５ＡＴＧｂＧＨポリＡを含む。

【0032】

第７の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１５に記載される核酸配列を含むコンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩを含む。

【0033】

第８の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１６に記載される核酸配列を含むコンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴを含む。

【0034】

第９の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１７に記載される核酸配列を含むコンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩを含む。

【0035】

第１０の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１８に記載される核酸配列を含むコンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩｈＡＡＴを含む。

【0036】

第１１の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号１９に記載される核酸配列を含むコンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴＡＴＧ ＦＶＩＩＩを含む。

【0037】

第１２の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２０に記載される核酸配列を含むコンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ２×μ－グロブリンエンハンサーを含む。

【0038】

第１３の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２１に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００ＡＴＧ短ポリＡ２×μ－グロブリンエンハンサーを含む。

【0039】

第１４の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２２に記載される核酸配列を含むコンストラクト第ＶＩＩＩ因子－ＢＭＮ００１を含む。

【0040】

第１５の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２３に記載される核酸配列を含むコンストラクト第ＶＩＩＩ因子－ＢＭＮ００２配列を含む。

【0041】

第１６の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２４に記載される核酸配列を含むコンストラクト９９を含む。

【0042】

第１７の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２５に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００を含む。

【0043】

第１８の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２６に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００の逆配向を含む。

【0044】

第１９の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２７に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００ＡＴを含む。

【0045】

第２０の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２８に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧを含む。

【0046】

第２１の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２９に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ ｂＧＨポリＡを含む。

【0047】

第２２の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３０に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ（逆）ｂＧＨポリＡを含む。

【0048】

第２３の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３１に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００ｂＧＨポリＡを含む。

【0049】

第２４の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３２に記載される核酸配列を含むコンストラクト１００～４００を含む。

【0050】

第２５の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３３に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０１を含む。

【0051】

第２６の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３４に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０２配列を含む。

【0052】

第２７の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３５に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０３を含む。

【0053】

第２９の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３６に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０３逆配向を含む。

【0054】

第３０の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３７に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０３ＡＴを含む。

【0055】

第３１の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３８に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０３ＡＴ ２ｘＭＧを含む。

【0056】

第３２の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３９に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０３ＡＴ ２ｘＭＧｂＧＨポリＡを含む。

【0057】

第３３の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号４０に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０３ｂＧＨポリＡを含む。

【0058】

第３４の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号４１に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０４を含む。

【0059】

第３５の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号４２に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０５を含む。

【0060】

第３６の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号４３に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０６を含む。

【0061】

第３７の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号４４に記載される核酸配列を含むコンストラクト１０６ＡＴを含む。

【0062】

第３８の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列番号４５に記載される核酸配列を含むｐ－１００ ＡＴＧＢを含む。

【0063】

さらに他の実施形態において、本発明は、機能性第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするベクターコンストラクトを対象とし、当該コンストラクトは、１つ以上の異なる配向（複数可）の、上述のコンストラクト及びこれらの組み合わせの個々の成分のうちの１つ以上を含む。本発明はまた、逆配向の上述のコンストラクトを対象とする。本発明はまた、本明細書に記載されるＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子、及び血友病Ａの治療のためのそれらの使用を対象とする。

【0064】

一本鎖形態での本発明のＡＡＶベクターは、約７．０ｋｂ長未満、または６．５ｋｂ長未満、または６．４ｋｂ長未満、または６．３ｋｂ長未満、または６．２ｋｂ長未満、または６．０ｋｂ長未満、または５．８ｋｂ長未満、または５．６ｋｂ長未満、または５．５ｋｂ長未満、または５．４ｋｂ長未満、または５．４ｋｂ長未満、または５．２ｋｂ長未満、または５．０ｋｂ長未満である。一本鎖形態での本発明のＡＡＶベクターは、約５．０ｋｂ～約６．５ｋｂ長、または約４．８ｋｂ～約５．２ｋ長、または４．８ｋｂ～５．３ｋｂ長、または約４．９ｋｂ～約５．５ｋｂ長、または約４．８ｋｂ～約６．０ｋｂ長、または約５．０ｋｂ～６．２ｋｂ長、または約５．１ｋｂ～約６．３ｋｂ長、または約５．２ｋｂ～約６．４ｋｂ長、または約５．５ｋｂ～約６．５ｋｂ長の範囲である。

【0065】

別の実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶベクターのうちのいずれかを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を生成する方法を提供する。本方法は、本発明のＡＡＶベクター（様々なＡＡＶ ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子と関連する）のうちのいずれかで形質移入された細胞を培養するステップと、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルス粒子を形質移入された細胞の上清から回収するステップと、を含む。

【0066】

組換えＡＡＶ産生に有用な本発明の細胞は、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＡｏ３８等の昆虫細胞を含む、バキュロウイルスに感染しやすいあらゆる細胞型である。使用される好ましい哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ １０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９、及びＭＲＣ－５であり得る。

【0067】

本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターのうちのいずれかを含む組換えウイルス粒子、または本発明の上述の方法によって生成される任意のウイルス粒子を提供する。

【0068】

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶウイルス」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及び本明細書に記載されるカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。粒子は、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達されるトランス遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、典型的に、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、このようなベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含有されることから、ＡＡＶベクター粒子の生成には、必然的にＡＡＶベクターの生成が含まれる。

【0069】

本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターのうちのいずれかを含む細胞、及び本発明のこれらの細胞によって生成されるウイルス粒子を提供する。

【0070】

別の実施形態において、本発明は、血友病Ａに罹患している患者を治療する方法を提供し、本方法は、この患者に、治療上有効量の本発明のＡＡＶベクターのうちのいずれか、または本発明のウイルス粒子、または本発明の方法によって生成されるウイルス粒子を投与することを含む。

【0071】

別の実施形態において、本発明は、循環ＦＶＩＩＩタンパク質レベルの増加を必要とする対象における循環ＦＶＩＩＩタンパク質レベルを増加させる方法を提供し、本方法は、当該患者に、本発明のＡＡＶベクター、または本発明のウイルス粒子、または本発明の方法によって生成されるウイルス粒子のうちのいずれかを投与することを含む。

【0072】

別の実施形態において、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現の誘導を必要とする対象におけるＦＶＩＩＩタンパク質の発現を誘導するための方法を提供し、本方法は、当該患者に、本発明のＡＡＶベクター、または本発明のウイルス粒子、または本発明の方法によって生成されるウイルス粒子のうちのいずれかを投与することを含む。

【0073】

別の実施形態において、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現の増加を必要とする対象におけるＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加させるための方法を提供し、本方法は、当該患者に、本発明のＡＡＶベクター、または本発明のウイルス粒子、または本発明の方法によって生成されるウイルス粒子のうちのいずれかを投与することを含む。

【0074】

本発明はまた、当該治療上有効量の当該組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与後に、当該対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在または存在を決定するステップをさらに含む、本発明の方法のうちのいずれかも提供する。さらに、本発明は、当該対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の存在の決定後に、当該対象に、有効量のコルチコステロイドを投与するステップをさらに含む、本発明の方法のうちのいずれかも提供する。

【0075】

さらなる一実施形態において、本発明は、血友病Ａの治療用薬剤の調製のために、本発明のＡＡＶベクターまたは本発明の組換えＡＡＶウイルス粒子のうちのいずれかの使用を提供する。一態様では、この薬剤は、血友病Ａを治療するのに有効な量でヒトＦＶＩＩＩを発現する、ある量のＡＡＶベクターまたは組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルス粒子を含む。本発明はまた、薬剤の投与後に、対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在または存在が決定される、本発明の使用のうちのいずれかも提供する。対象が血清中に抗ＡＡＶカプシド抗体を有することが決定された場合、血清中に抗ＡＡＶカプシド抗体を有する対象への投与のための薬剤の調製における有効量のコルチコステロイドの使用。

【0076】

別の実施形態において、本発明は、血友病Ａの治療用のＡＡＶベクターまたは本発明の組換えＡＡＶウイルス粒子のうちのいずれかを含む組成物を提供する。一態様では、本組成物は、血友病Ａを治療するのに有効な量でヒトＦＶＩＩＩを発現する、ある量のＡＡＶベクターまたは組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルス粒子を含む。加えて、本発明の組成物のうちのいずれかは、組成物の投与後に、血清中に抗ＡＡＶカプシド抗体を有することが決定された対象に、有効量のコルチコステロイドと共に投与される。

【0077】

別の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターは、血友病Ａに罹患している患者を治療するために有用なＡＡＶウイルス粒子を生成するために使用される。

【0078】

別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される組換えＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶウイルス粒子を含む薬学的製剤を提供する。より具体的には、ある特定の態様では、本発明は、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩをコードするウイルス、緩衝剤、等張剤、増量剤、及び界面活性剤を含む薬学的製剤を対象とする。特に好ましい実施形態において、本発明の薬学的製剤は、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ、ｐ－１００ ＡＴＧＢ、もしくは他の本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかを含み、及び／または６５℃以下で保存中、少なくとも２週間安定している。本発明のさらに他の実施形態において、薬学的製剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約５ｍｇ／ｍｌ～約４０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約０．１ｍｇ／ｍｌ～約４ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む。特に好ましい実施形態において、本発明の薬学的製剤は、約１．４２ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約１．３８ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約８．１８ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約２ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む。本発明の薬学的製剤は、液体形態であり得、かつ約１Ｅ１２ｖｇ／ｍｌ～約２Ｅ１４ｖｇ／ｍｌの濃度の、より好ましくは約２Ｅ１３ｖｇ／ｍｌの濃度のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルス粒子を含み得る。一実施形態において、本発明の薬学的製剤は、血友病Ａに罹患しているヒトに静脈内投与に有用である。

【0079】

本発明はまた、血友病Ａに罹患している対象を治療するための方法も対象とし、本方法は、対象に、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与するステップを含み、このウイルスは、任意に、上述のように製剤化され得る。好ましい一実施形態において、血友病Ａに罹患している対象は、ヒトである。一実施形態において、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである。一実施形態において、投与ステップは、静脈内（ＩＶ）投与によって達成される。本発明のある特定の態様では、投与ステップは、対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、好ましくは対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、投与ステップは、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはそれ以上後に対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、対象に投与される治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスは、最小の２Ｅ１３ｖｇ／体重ｋｇ、時には、少なくとも６Ｅ１３ｖｇ／体重ｋｇである。ある特定の実施形態において、治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与に加えて、対象は、ＡＡＶ
ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防及び／または治療するために、コルチコステロイドで予防的に、治療的に、またはその両方で治療される。一実施形態において、関連した肝毒性は、ベースライン（すなわち、ＦＶＩＩＩ ＡＡＶを事前に投与する）アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルを治療後のＡＬＴレベルと比較することによって測定され、治療後のＡＬＴレベルの増加は、関連した肝毒性の証拠となる。予防的コルチコステロイド治療は、対象における肝毒性を予防する及び／または測定したＡＬＴレベルの増加を防ぐためのコルチコステロイドの投与を指す。治療的コルチコステロイド治療は、ＡＶＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与によって引き起こされる肝毒性を軽減する及び／またはＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与によって引き起こされる対象の血流中の上昇したＡＬＴ濃度を減少させるためのコルチコステロイドの投与を指す。ある特定の実施形態において、予防的または治療的コルチコステロイド治療は、対象への少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍｇ／日、またはそれ以上のコルチコステロイドの投与を含み得る。ある特定の実施形態において、対象の予防的または治療的コルチコステロイド治療は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０週間、またはそれ以上の連続期間にわたってなされ得る。

【0080】

本発明はまた、血友病Ａに罹患している対象を治療するのに用いるための治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含む組成物も対象とする。一実施形態において、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである。別の実施形態において、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスは、ｐ－１００ ＡＴＧＢベクターを含む。本組成物は、任意に、上述のように製剤化され得る。ある特定の実施形態において、治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含む組成物は、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防する及び／または治療するのに用いるための予防的及び／または治療的コルチコステロイドを含む組成物と共に投与される。予防的または治療的コルチコステロイド治療剤を含む組成物は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍｇ／日、またはそれ以上のコルチコステロイドを含み得る。ある特定の実施形態において、予防的または治療的コルチコステロイドを含む組成物は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０週間、またはそれ以上の連続期間にわたって投与され得る。

【0081】

本発明はまた、血友病Ａに罹患している対象の治療のための薬剤の調製における治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの使用も対象とする。ある特定の実施形態において、ＡＡＶＦＶＩＩＩウイルスは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ、またはｐ－１００
ＡＴＧＢベクターを含むウイルスである。この薬剤は、任意に、上述のように製剤化され得る。好ましい一実施形態において、血友病Ａに罹患している対象は、ヒトである。一実施形態において、薬剤は、静脈内（ＩＶ）投与によって投与される。本発明の一態様では、薬剤の投与は、対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質、好ましくは、投与の１６週間以上後に対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、薬剤はまた、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与に関連したあらゆる肝毒性の予防及び／または治療のための予防的及び／または治療的コルチコステロイドも含む。予防的または治療的コルチコステロイド治療剤からなる薬剤は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍｇ／日、またはそれ以上のコルチコステロイドを含み得る。ある特定の実施形態において、予防的または治療的コルチコステロイドを含む薬剤は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０週間、またはそれ以上の連続期間にわたって投与され得る。

【0082】

本発明はまた、血友病Ａに罹患している対象における出血症状発現中の出血時間を減少させるための方法も対象とし、本方法は、対象に、本明細書に記載される治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与するステップを含み、このウイルスは、任意に、上述のように製剤化され得る。好ましい一実施形態において、血友病Ａに罹患している対象は、ヒトである。一実施形態において、投与ステップは、静脈内（ＩＶ）投与によって達成される。ある特定の実施形態において、投与ステップは、出血症状発現の少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０週間、またはそれ以上前に行われる。本発明の一態様では、投与ステップは、対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、好ましくは対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、投与ステップは、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはそれ以上後に対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与に加えて、対象は、上述のように、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防及び／または治療するために、コルチコステロイドで予防的に、治療的に、またはその両方で治療される。

【0083】

本発明はまた、血友病Ａに罹患している対象における出血症状発現の出血時間を減少させるため、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含む組成物も対象とする。一実施形態において、ＡＡＶＦＶＩＩＩウイルスは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである。本組成物は、任意に、上述のように製剤化され得る。好ましい一実施形態において、血友病Ａに罹患している対象は、ヒトである。組成物は、出血症状発現前に投与され得る。一実施形態において、組成物は、出血症状発現前に静脈内（ＩＶ）投与によって投与される。本発明の一態様では、投与ステップは、対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、好ましくは対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、投与ステップは、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはそれ以上後に対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、出血時間を減少するのに用いるための治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含む組成物は、上述のように、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防及び／または治療するのに用いるための予防的及び／または治療的コルチコステロイドを含む組成物と共に投与される。

【0084】

本発明はまた、出血時間を減少させる方法のうちのいずれかも提供し、本方法は、当該治療上有効量の当該組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与後に、当該対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在または存在を決定するステップをさらに含む。さらに、本発明は、出血時間を減少させる方法のうちのいずれかを提供し、本方法は、当該対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の存在の決定後に、当該対象に、有効量のコルチコステロイドを投与するステップをさらに含む。

【0085】

本発明はまたは、血友病Ａに罹患している対象における出血症状発現の出血時間を減少させるための薬剤の調製における治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの使用も対象とする。一実施形態において、ＡＡＶＦＶＩＩＩウイルスは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである。この薬剤は、任意に、上述のように製剤化され得る。好ましい一実施形態において、血友病Ａに罹患している対象は、ヒトである。薬剤は、出血症状発現前に投与され得る。一実施形態において、薬剤は、出血症状発現前に静脈内（ＩＶ）投与によって投与される。本発明の一態様では、薬剤の投与は、対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、好ましくは、対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、薬剤の投与は、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはそれ以上後に対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、出血時間を減少するために治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含む薬剤はまた、上述のように、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防及び／または治療するための予防的及び／または治療的コルチコステロイドも含む。さらに、出血時間を減少するのに用いるために本発明の組成物のうちのいずれかが、組成物の投与後に、血清中に抗ＡＡＶカプシド抗体を有することが決定された対象に、有効量のコルチコステロイドと共に投与される。

【0086】

本発明はまた、治療を必要とする対象における機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を誘導するための方法も対象とし、本方法は、対象に、本明細書に記載される組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与するステップを含み、このウイルスは、任意に、上述のように製剤化され得、かかる投与は、対象の血流中での、機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の発現の増加または機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の濃度の増加をもたらす。好ましい一実施形態において、必要とする対象は、ヒトである。一実施形態において、投与ステップは、静脈内（ＩＶ）投与によって達成される。本発明の一態様では、投与ステップは、対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、好ましくは対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、投与ステップは、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはそれ以上後に対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与に加えて、対象は、上述のように、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防及び／または治療するために、コルチコステロイドで予防的に、治療的に、またはその両方で治療される。さらに、出血時間を減少させるための薬剤の投与後に本発明の使用のうちのいずれかにおいて、対象の血清中での抗ＡＡＶカプシド抗体の不在または存在が決定される。対象が血清中に抗ＡＡＶカプシド抗体を有することが決定された場合、血清中に抗ＡＡＶカプシド抗体を有する対象への投与のための薬剤の調製における有効量のコルチコステロイドの使用が企図される。

【0087】

本発明はまた、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現の増加を必要とする対象におけるＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加させるための方法も対象とし、本方法は、対象に、本明細書に記載される組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与するステップを含み、このウイルスは、任意に、上述のように製剤化され得、かかる投与は、対象の血流中での、機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の発現の増加または機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の濃度の増加をもたらす。好ましい一実施形態において、必要とする対象は、ヒトである。一実施形態において、投与ステップは、静脈内（ＩＶ）投与によって達成される。本発明の一態様では、投与ステップは、対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、好ましくは対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、投与ステップは、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはそれ以上後に対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与に加えて、対象は、上述のように、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防及び／または治療するために、コルチコステロイドで予防的に、治療的に、またはその両方で治療される。

【0088】

本発明はまた、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現の増加または誘発を必要とする対象におけるＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加または誘発させるのに用いるための治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含む組成物も対象とする。一実施形態において、ＡＡＶＦＶＩＩＩウイルスは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである。本組成物は、任意に、上述のように製剤化され得る。好ましい一実施形態において、必要とする対象は、血友病Ａに罹患しているヒトである。組成物は、出血症状発現前に投与され得る。一実施形態において、組成物は、出血症状発現前に静脈内（ＩＶ）投与によって投与される。本発明の一態様では、投与ステップは、対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、好ましくは対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、投与ステップは、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはそれ以上後に対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加または誘導させるのに用いるための治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含む組成物は、上述のように、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防及び／または治療するのに用いるための予防的及び／または治療的コルチコステロイドを含む組成物と共に投与される。

【0089】

本発明はまた、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現の増加または誘発を必要とする対象におけるＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加または誘発させるのに用いるための薬剤の調製における治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの使用も対象とする。一実施形態において、必要とする対象は、血友病Ａに罹患しているヒトである。一実施形態において、ＡＡＶＦＶＩＩＩウイルスは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである。この薬剤は、任意に、上述のように製剤化され得る。薬剤は、出血症状発現前に投与され得る。一実施形態において、薬剤は、出血症状発現前に静脈内（ＩＶ）投与によって投与される。本発明の一態様では、薬剤の投与は、対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、好ましくは、対象の血流中に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、薬剤の投与は、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはそれ以上後に対象の血流中に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加または誘導させるための治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含む薬剤はまた、上述のように、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防及び／または治療するための予防的及び／または治療的コルチコステロイドも含む。

【0090】

本発明はまた、血友病Ａに罹患している対象を治療する方法も対象とし、本方法は、（ｉ）当該対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在を決定するステップと、（ｉｉ）当該対象に、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与するステップと、を含む。

【0091】

本発明はまた、血友病Ａに罹患している対象の治療のための薬剤の調製における治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの使用も対象とし、抗ＡＡＶカプシド抗体は、対象の血清に不在である。

【0092】

本発明はまた、血友病Ａに罹患している対象を治療するのに用いるための治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含む組成物も対象とし、抗ＡＡＶカプシド抗体は、対象の血清に不在である。

【0093】

本発明はまた、血友病Ａに罹患している対象を治療する方法も対象とし、本方法は、（ｉ）当該対象に、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与するステップと、（ｉｉ）当該治療上有効量の当該組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与後に、当該対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在または存在を決定するステップと、を含む。一実施形態において、本方法は、当該対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の存在の決定後に、当該対象に、有効量のコルチコステロイドを投与するステップをさらに含む。

【0094】

本発明は、血友病Ａの治療のための薬剤の調製における治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの使用を対象とし、薬剤の投与後に、対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在または存在が決定される。対象が血清中に抗ＡＡＶカプシド抗体を有することが決定された場合、血清中に抗ＡＡＶカプシド抗体を有する対象への投与のための薬剤の調製における有効量のコルチコステロイドの使用。本発明はまた、血友病Ａの治療のために有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩを含む組成物も対象とし、この組成物は、組成物の投与後に、血清中に抗ＡＡＶカプシド抗体を有することが決定された対象に、有効量のコルチコステロイドと共に投与される。

【0095】

本発明の他の実施形態は、本特許明細書を読む際に当業者には明らかであろう。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルス、緩衝剤、等張剤、増量剤、及び界面活性剤を含む、薬学的製剤。
（項目２）
前記組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスが、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである、項目１に記載の薬学的製剤。
（項目３）
６５℃以下で保存中、少なくとも２週間安定している、項目１または２に記載の薬学的製剤。
（項目４）
約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約５ｍｇ／ｍｌ～約４０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約０．１ｍｇ／ｍｌ～約４ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む、項目１～３のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
（項目５）
約１．４２ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約１．３８ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約８．１８ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約２ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
（項目６）
液体である、項目１～５のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
（項目７）
前記ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを約１Ｅ１２ｖｇ／ｍｌ～約２Ｅ１４ｖｇ／ｍｌの濃度で含む、項目１～６のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
（項目８）
前記ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを約２Ｅ１３ｖｇ／ｍｌの濃度で含む、項目７に記載の薬学的製剤。
（項目９）
血友病Ａに罹患している患者へのＩＶ投与に有用である、項目１～８のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
（項目１０）
血友病Ａに罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与することを含む、方法。
（項目１１）
前記組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスが、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記投与ステップが、静脈内投与によるものである、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１３）
前記投与ステップが、前記対象に、約１Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～約１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与することを含む、項目１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記投与ステップが、前記対象に、約６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～約６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与することを含む、項目１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記対象における少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす、項目１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記対象が、前記投与の３週間以上後に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現する、項目１０～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記対象における少なくとも約１ＩＵ／ｄｌの機能性ＦＶＩＩＩ活性の増加をもたらす、項目１０～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記投与ステップが、項目１～９のいずれか一項に記載の薬学的製剤を投与することを含む、項目１０～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記薬学的製剤が、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約５ｍｇ／ｍｌ～約４０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約０．１ｍｇ／ｍｌ～約４ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記薬学的製剤が、約１．４２ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約１．３８ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約８．１８ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約２ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記対象が、５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで予防的に治療される、項目１０～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記対象が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間、またはそれ以上の連続期間にわたって５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで予防的に治療される、項目１０～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記対象が、５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで治療的に治療される、項目１０～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記対象が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間、またはそれ以上の連続期間にわたって５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで治療的に治療される、項目１０～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記治療上有効量の前記組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与後に、前記対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在または存在を決定するステップをさらに含む、項目１０～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の存在の決定後に、前記対象に、有効量のコルチコステロイドを投与するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
血友病Ａに罹患している対象における出血症状発現の出血時間を短縮する方法であって、前記対象に、前記出血症状発現前に、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与することを含む、方法。
（項目２８）
前記投与ステップが、前記出血症状発現の少なくとも３週間前に起こる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスが、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである、項目２７または２８に記載の方法。
（項目３０）
前記投与ステップが、静脈内投与によるものである、項目２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記投与ステップが、前記対象に、約１Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～約１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与することを含む、項目２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記投与ステップが、前記対象に、約６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～約６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与することを含む、項目２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記対象における少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす、項目２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記対象が、前記投与の３週間以上後に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現する、項目２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記対象における少なくとも約１ＩＵ／ｄｌの機能性ＦＶＩＩＩ活性の増加をもたらす、項目２７～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記投与ステップが、項目１～９のいずれか一項に記載の薬学的製剤を投与することを含む、項目２７～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記薬学的製剤が、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約５ｍｇ／ｍｌ～約４０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約０．１ｍｇ／ｍｌ～約４ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記薬学的製剤が、約１．４２ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約１．３８ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約８．１８ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約２ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記対象が、５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで予防的に治療される、項目２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記対象が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間、またはそれ以上の連続期間にわたって５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで予防的に治療される、項目２７～３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記対象が、５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで治療的に治療される、項目２７～４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記対象が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間、またはそれ以上の連続期間にわたって５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで治療的に治療される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
第ＶＩＩＩ因子タンパク質発現の増加を必要とする対象における第ＶＩＩＩ因子タンパク質発現を増加させる方法であって、前記対象に、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与することを含む、方法。
（項目４４）
前記組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスが、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記投与ステップが、静脈内投与によるものである、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記投与ステップが、前記対象に、約１Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～約１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与することを含む、項目４３～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記投与ステップが、前記対象に、約６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～約６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与することを含む、項目４３～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記対象における少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす、項目４３～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記対象が、前記投与の３週間以上後に少なくとも約５ＩＵ／ｄｌの機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現する、項目４３～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記対象における少なくとも約１ＩＵ／ｄｌの機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす、項目４３～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記対象が、前記投与の３週間以上後に少なくとも約１ＩＵ／ｄｌの機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現する、項目４３～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記対象における少なくとも約１ＩＵ／ｄｌの機能性ＦＶＩＩＩ活性の増加をもたらす、項目４３～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記投与ステップが、項目１～９のいずれか一項に記載の薬学的製剤を投与することを含む、項目４３～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記薬学的製剤が、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約５ｍｇ／ｍｌ～約４０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約０．１ｍｇ／ｍｌ～約４ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記薬学的製剤が、約１．４２ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウム、約１．３８ｍｇ／ｍｌの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約８．１８ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウム、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトール、及び約２ｍｇ／ｍｌの濃度のポロキサマー１８８を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記対象が、５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで治療される、項目４３～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記コルチコステロイド治療が、予防的に行われる、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記コルチコステロイド治療が、治療的に行われる、項目５６または５７に記載の方法。
（項目５９）
前記対象が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間、またはそれ以上の連続期間にわたって５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで治療される、項目４３～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記治療上有効量の前記組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与後に、前記対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在または存在を決定するステップをさらに含む、項目４３～５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の存在の決定後に、前記対象に、有効量のコルチコステロイドを投与するステップをさらに含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
血友病Ａに罹患している対象を治療する方法であって、（ｉ）前記対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在を決定するステップと、（ｉｉ）前記対象に、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与するステップと、を含む、方法。
（項目６３）
血友病Ａに罹患している対象を治療する方法であって、（ｉ）前記対象に、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを投与するステップと、（ｉｉ）前記治療上有効量の前記組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与後に、前記対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の不在または存在を決定するステップと、を含む、方法。
（項目６４）
前記対象の血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の存在の決定後に、前記対象に、有効量のコルチコステロイドを投与するステップをさらに含む、項目６３に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0096】

【図1】例示的なＦＶＩＩＩをコードする組換えＡＡＶベクターの概略図を提供する。左から右に、ベクターは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ配列、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列、３４塩基ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサー配列、３２塩基ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域配列、４２塩基の５’ＵＴＲ配列を含む１８６塩基ヒトＡＡＴプロモーター配列、コドンを最適化したヒトＦＶＩＩＩ ＳＱ配列、４９塩基合成Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔポリアデニル化配列、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ配列（２０１１年１月１３日に公開されたＷＯ２０１１／００５９６８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－３３４４，２０１３を参照のこと）を含む。このベクターは、５０８１塩基長である。

【図2A】本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの概略図を提供する。（Ａ）Ｐｒｏｔｏ１、（Ｂ）Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、（Ｃ）Ｐｒｏｔｏ２Ｓ、及び（Ｄ）Ｐｒｏｔｏ３Ｓ。

【図2B】本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの概略図を提供する。（Ａ）Ｐｒｏｔｏ１、（Ｂ）Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、（Ｃ）Ｐｒｏｔｏ２Ｓ、及び（Ｄ）Ｐｒｏｔｏ３Ｓ。

【図2C】本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの概略図を提供する。（Ａ）Ｐｒｏｔｏ１、（Ｂ）Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、（Ｃ）Ｐｒｏｔｏ２Ｓ、及び（Ｄ）Ｐｒｏｔｏ３Ｓ。

【図2D】本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの概略図を提供する。（Ａ）Ｐｒｏｔｏ１、（Ｂ）Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、（Ｃ）Ｐｒｏｔｏ２Ｓ、及び（Ｄ）Ｐｒｏｔｏ３Ｓ。

【図3A】本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの概略図を提供する。（Ａ）Ｐｒｏｔｏ４、（Ｂ）Ｐｒｏｔｏ５、（Ｃ）Ｐｒｏｔｏ６、及び（Ｄ）Ｐｒｏｔｏ７。

【図3B】本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの概略図を提供する。（Ａ）Ｐｒｏｔｏ４、（Ｂ）Ｐｒｏｔｏ５、（Ｃ）Ｐｒｏｔｏ６、及び（Ｄ）Ｐｒｏｔｏ７。

【図3C】本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの概略図を提供する。（Ａ）Ｐｒｏｔｏ４、（Ｂ）Ｐｒｏｔｏ５、（Ｃ）Ｐｒｏｔｏ６、及び（Ｄ）Ｐｒｏｔｏ７。

【図3D】本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの概略図を提供する。（Ａ）Ｐｒｏｔｏ４、（Ｂ）Ｐｒｏｔｏ５、（Ｃ）Ｐｒｏｔｏ６、及び（Ｄ）Ｐｒｏｔｏ７。

【図4A】本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの概略図を提供する。（Ａ）コンストラクト１００ＡＴＧ、（Ｂ）コンストラクト１００ＡＴＧｂＧＨポリＡ、（Ｃ）コンストラクト１００ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ、（Ｄ）コンストラクト１０３ＡＴＧ、（Ｅ）コンストラクト１０３ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ、（Ｆ）コンストラクト１０５ＡＴＧ ｂＧＨポリＡ、（Ｇ）コンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ、（Ｈ）コンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴ、（Ｉ）コンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ、（Ｊ）コンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩｈＡＡＴ、（Ｋ）コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴＡＴＧ ＦＶＩＩＩ、（Ｌ）コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ２×μ－グロブリンエンハンサー、（Ｍ）コンストラクト１００ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ ２×μ－グロブリンエンハンサー、（Ｎ）コンストラクト第ＶＩＩＩ因子ＢＭＮ００１、（Ｏ）コンストラクト第ＶＩＩＩ因子ＢＭＮ００２、（Ｐ）コンストラクト９９、（Ｑ）コンストラクト１００、（Ｒ）コンストラクト１００の逆配向、（Ｓ）コンストラクト１００ＡＴ，（Ｔ）コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ，（Ｕ）コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ ｂＧＨポリＡ、（Ｖ）コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ（逆）ｂＧＨポリＡ、（Ｗ）コンストラクト１００ｂＧＨポリＡ、（Ｘ）コンストラクト１００－４００、（Ｙ）コンストラクト１０１、（Ｚ）コンストラクト１０２、（ＡＡ）コンストラクト１０３、（ＢＢ）コンストラクト１０３逆配向、（ＣＣ）コンストラクト１０３ＡＴ、（ＤＤ）コンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧ、（ＥＥ）コンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧｂＧＨポリＡ、（ＦＦ）コンストラクト１０３ｂＧＨポリＡ、（ＧＧ）コンストラクト１０４、（ＨＨ）コンストラクト１０５、（ＩＩ）コンストラクト１０６、及び（ＪＪ）コンストラクト１０６ＡＴ。

【図4B】同上。

【図4C】同上。

【図4D】同上。

【図4E】同上。

【図4F】同上。

【図4G】同上。

【図4H】同上。

【図4I】同上。

【図4J】同上。

【図4K】同上。

【図4L】同上。

【図4M】同上。

【図4N】同上。

【図4O】同上。

【図4P】同上。

【図4Q】同上。

【図4R】同上。

【図4S】同上。

【図4T】同上。

【図4U】同上。

【図4V】同上。

【図4W】同上。

【図4X】同上。

【図4Y】同上。

【図4Z】同上。

【図4AA】同上。

【図4BB】同上。

【図4CC】同上。

【図4DD】同上。

【図4EE】同上。

【図4FF】同上。

【図4GG】同上。

【図4HH】同上。

【図4II】同上。

【図4JJ】同上。

【図5】Ｒａｇ２マウスにおける組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩ Ｐｒｏｔｏコンストラクトの評価の結果を提供し、Ｐｒｏｔｏウイルスコンストラクトが、図１に示されるベクターと同様に、ＦＶＩＩＩを形質導入することを示し、ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ分析によって決定されるＦＶＩＩＩタンパク質（ｎｇ／ｍｌ）を表す。

【図6】本発明の様々な組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩコンストラクトが、マウス尾静脈流体力学的注入アッセイにおいて測定されるように、ＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ発現を誘導することを示す。

【図7】本発明の様々な組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩコンストラクトが、マウス尾静脈流体力学的注入アッセイにおいて測定されるように、ＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ発現を誘導することを示す。

【図8】本発明の様々な組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩコンストラクトが、マウス尾静脈流体力学的注入アッセイにおいて測定されるように、ＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ発現を誘導することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0097】

本発明は、機能的に活性なＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクター、例えば、完全にパッケージングされたＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター、または高い発現活性を有するＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを提供する。本発明の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、改善された導入遺伝子の発現、ならびに改善されたＡＡＶウイルス産生収率及び簡易化した精製を有する。ＦＶＩＩＩタンパク質コード領域への１つ以上のイントロンの導入が、発現を増強する。エンハンサーの数及び位置の再構成は、発現を増強する。

【0098】

例示的なＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター
２０１１年１月１３日に公開されたＷＯ２０１１／００５９６８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－３３４４，２０１３に記載される、図１に示される例示的な組換えＡＡＶ
ＦＶＩＩＩベクターは、大容量、すなわち、５．０ｋｂ超のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターである。図１に示されるように、このＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、左から右に、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）５’ＩＴＲ、野生型ＡＡＶ２由来ウイルス配列、３４塩基ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）／Ｃ１エンハンサー要素、３２塩基ヒトアルファ抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター遠位Ｘ領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列の４２塩基を含む１８６塩基ヒトＡＡＴ（ｈＡＡＴ）プロモーター、ＦＶＩＩＩ Ｂドメインが１４アミノ酸のＳＱ配列で置換されているコドンを最適化したヒトＦＶＩＩＩ配列、４９塩基合成Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔポリアデニル化配列、野生型ＡＡＶ２由来ウイルス配列、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを含む。このベクターは、５０８１塩基長であり、ＷＯ２０１１／００５９６８に記載されるように、インビトロ及びインビボの両方で機能的に活性なＦＶＩＩＩを発現する。

【0099】

Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、Ｐｒｏｔｏ２Ｓ、及びＰｒｏｔｏ３Ｓベクター
大容量ＡＡＶベクターと関連する問題を回避するため、及び／またはＡＡＶベクターからＦＶＩＩＩトランス遺伝子の発現を増加させるために、本発明は、機能性ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、完全にパッケージングされた、より小型の、すなわち５．０ｋｂ未満のＡＡＶベクターを提供する。組換えＡＡＶ Ｐｒｏｔｏ１コンストラクトの４９７０ｂｐヌクレオチド配列は、配列番号１に提供される。

【0100】

組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターＰｒｏｔｏ１を作製するために、機能的に活性なＦＶＩＩＩの産生には不必要であると決定された配列を、図１に示されるベクターから除去した。実施例１に示されるように、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列３’～ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの５３塩基、ＡＡＶ２ウイルス配列５’～ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの４６塩基、及びコドンを最適化したＦＶＩＩＩタンパク質コード領域に隣接する１２塩基を含む、１１１塩基の外来性ＤＮＡを除去した。図１に示されるベクターのコドンを最適化したＦＶＩＩＩ
ＳＱ配列はまた、「ＦＶＩＩＩ－ＳＱ」と称される、新規のコドンを最適化したＦＶＩＩＩ ＳＱ配列によって置換された。次いで、ＦＶＩＩＩ－ＳＱコード配列（配列番号１の塩基４０３～４７７６）を、Ｐｒｏｔｏ１ベクターに導入した。得られたＰｒｏｔｏ１ベクターは、４９７０塩基長であり、左から右に、改変ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）５’ＩＴＲ、３４塩基ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）／Ｃ１エンハンサー要素、３２塩基ヒトアルファ抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター遠位Ｘ領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列の４２塩基を含む１８６塩基ｈＡＡＴプロモーター、ＦＶＩＩＩ Ｂドメインが１４アミノ酸のＳＱ配列で置換されている新規のコドンを最適化したヒトＦＶＩＩＩ配列、４９塩基合成Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔポリアデニル化配列、及び改変ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを含む。設計されるとき、Ｐｒｏｔｏ１ベクターが、インビトロまたはインビボのいずれかで機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを発現することが可能であり得るかどうかは不明であった。

【0101】

ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ１Ｓを作製するために、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの３’末端の１０塩基、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの５’末端の１０塩基を、Ｐｒｏｔｏ１ベクターから除去した。得られたＰｒｏｔｏ１Ｓベクターは、４９５０塩基長である。Ｐｒｏｔｏ１Ｓの配列のヌクレオチド配列は、配列番号２に記載されている。

【0102】

ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ２Ｓを作製するために、合成１００塩基イントロンは、Ｐｒｏｔｏ１Ｓベクター中のＦＶＩＩＩ－ＳＱ配列のエクソン１と２の間に挿入した。３４塩基ＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサー及び３２塩基ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域を、ヒトＡＡＴプロモーターの上流から除去し、合成イントロン内に逆配向（これらの要素がヒトＡＡＴプロモーターの上流に位置するときの配向と比較して）に挿入した。得られるＰｒｏｔｏ２Ｓベクターは、４９８３塩基長である。Ｐｒｏｔｏ２Ｓの配列のヌクレオチド配列は、配列番号３に記載されている。

【0103】

ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ３Ｓを作製するために、ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域を、Ｐｒｏｔｏ２Ｓベクターから除去し、逆配向の３４塩基ＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コピーで置換した。得られるＰｒｏｔｏ３Ｓベクターは、４９８４塩基長である。Ｐｒｏｔｏ３Ｓの配列のヌクレオチド配列は、配列番号４に記載されている。

【0104】

Ｐｒｏｔｏ４、ＰｒｏｔｏＳ、Ｐｒｏｔｏ６、及びＰｒｏｔｏ７ベクター
ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターのサイズをさらに減少させるため、及び／またはＡＡＶベクターからのＦＶＩＩＩトランス遺伝子の発現を増加させるために、本発明はまた、完全にパッケージングされた、より小型の、すなわち５．０ｋｂ未満のＢドメイン及びａ３ドメイン欠失ＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクターを提供する。

【0105】

ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ４を作製するために、１４アミノ酸のＳＱ配列及びＣドメインに隣接して位置するａ３ドメインを、Ｐｒｏｔｏ１ベクターから除去した。欠失したＦＶＩＩＩ配列の合計量は、５５アミノ酸または１６５塩基である。得られるＰｒｏｔｏ４ベクターは、４８０５塩基長である。Ｐｒｏｔｏ４の配列のヌクレオチド配列は、配列番号５に記載されている。

【0106】

ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ５を作製するために、１２９塩基の切断型ＦＶＩＩＩイントロンを、Ｐｒｏｔｏ４ベクター中のコドンを最適化したＦＶＩＩＩ配列のエクソン１と２の間に挿入した。得られるＰｒｏｔｏ５ベクターは、４９３４塩基長である。Ｐｒｏｔｏ５の配列のヌクレオチド配列は、配列番号６に記載されている。

【0107】

ＡＡＶ Ｐｒｏｔｏ６ベクターを作製するために、３４塩基のＦＶＩＩＩイントロンを、Ｐｒｏｔｏ５ベクター中の順配向の３４塩基ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コピーで置換した。得られるＰｒｏｔｏ６ベクターは、４９３４塩基長である。Ｐｒｏｔｏ６の配列のヌクレオチド配列は、配列番号７に記載されている。

【0108】

ＡＡＶ Ｐｒｏｔｏ７ベクターを作製するために、３４塩基のＦＶＩＩＩイントロンを、Ｐｒｏｔｏ５ベクター中の順配向の３４塩基ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コピーで置換した。得られるＰｒｏｔｏ７ベクターは、４９３４塩基長である。Ｐｒｏｔｏ７の配列のヌクレオチド配列は、配列番号８に記載されている。

【0109】

改善されたプロモーター／エンハンサー配列を有するさらなる組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター
Ｂドメイン及びａ３ドメイン欠失ＦＶＩＩＩの発現を増加させるために、強力なプロモーターを有する大容量ＡＡＶベクターを作製し、これらのコンストラクトを、改変されたエンハンサー配列及び／またはプロモーター配列を伴って作製した。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、切断型の機能性ＦＶＩＩＩを発現する。これらのコンストラクトは、ＡｐｏＥＨＣＲもしくはその断片、μ－グロブリンエンハンサーもしくはその断片、ヒトアルファ１抗トリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）もしくはその断片、セルピンＡエンハンサーもしくはその断片、ＬＰ１プロモーターエンハンサーもしくはその断片、またはマクログロブリンエンハンサーもしくその断片等の１つ以上のプロモーター及びエンハンサー配列を含んだ。これらのコンストラクトは、ｂＧＨポリＡ配列または合成ウサギβ－グロビンポリＡ配列等のポリアデニル化配列を含む。いくつかの実施形態において、コンストラクトは、ｈＡＡＴイントロンまたはヒトβ－グロビンイントロン等のイントロンまたはイントロンの断片を含む。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、新規のコドンを最適化したＦＶＩＩＩ－ＳＱコード配列を含む。

【0110】

コンストラクト１００ＡＴＧ（図４Ａ）は、５５１１塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～５０２は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０９～７２６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７２７～９１０は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基９２３～５２９６は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５３０５～５３５２は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５３６７～５５１１は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0111】

コンストラクト１００ＡＴＧｂＧＨポリＡ（図４Ｂ）は、５６８８塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号１０に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～５０２は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０９～７２６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７２７～９１０は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基９２３～５２９６は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５３０５～５５２９は、ｂＧＨポリＡであり、塩基５５４４～５６８８は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0112】

コンストラクト１００ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ（図４Ｃ）は、５６１３塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～５０２は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０９～７２６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７２７～９１０は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基９２３～５２９６は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５３０５～５４５４は、短ｂＧＨポリＡであり、塩基５４６９～５６１３は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0113】

コンストラクト１０３ＡＴＧ（図４Ｄ）は、５３６２塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～３４４は、４コピー（４×）の４４ｂｐ ＡｐｏＥ反復であり、塩基３６０～５７７は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５７８～７６１は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基７７４～５１４７は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１５６～５２０３は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５２１８～５３６２は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0114】

コンストラクト１０３ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ（図４Ｅ）は、５４６４塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号１３に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～３４４は、４コピー（４×）の４４ｂｐＡｐｏＥ反復であり、塩基３６０～５７７は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５７８～７６１は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基７７４～５１４７は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１５６～５３０５は、ｂＧＨ短ポリＡであり、塩基５３２０～５４６４は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0115】

コンストラクト１０５ＡＴＧｂＧＨポリＡ（図４Ｆ）は、６３５４塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号１４に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１７３～５１２は、２コピー（２ｘ）の１７０ｂｐ ミクログロブリンエンハンサーであり、塩基５１９～７３６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７３７～９２０は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基９３３～５３０６は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５３１５～５５３９は、ｂＧＨポリＡであり、塩基５５４６～６１９５は、２コピー（２ｘ）の３２５ｂｐ ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基６２１０～６３５４は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0116】

コンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ（図４Ｇ）は、６３０８塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号１５に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～４４９は、２コピー（２ｘ）の１４５ｂｐマクログロブリンエンハンサーであり、塩基４５０～１３４７は、８９８ｂｐ ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基１３４８～１５３１は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基１５４４～５９１７は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５９２６～６１４９は、ｂＧＨポリＡであり、塩基６１６４～６３０８は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0117】

コンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴ（図４Ｈ）は、５６３５塩基長である。このコンストラクトは、配列番号１６に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～４４９は、２コピー（２ｘ）の１４５ｂｐマクログロブリンエンハンサーであり、塩基４５７～６７４は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基６７５～８５８は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基８７１～５２４４は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５２５３～５４７６は、ｂＧＨポリＡであり、塩基５４９０～５６３５は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0118】

コンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ（図４Ｉ）は、６９６２塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号１７に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～８０７は、２コピー（２×）の３２１ｂｐ ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基８１４～１１０３は、２コピー（２×）の１４５ｂｐマクログロブリンエンハンサーであり、塩基１１０４～２００１は、８９８ｂｐ ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基２００２～２１８５は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基２１９８～６５７１は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基６５８０～６８０３は、ｂＧＨポリＡであり、塩基６８１８～６９６２は、３’ＡＡＶ２
ＩＴＲである。

【0119】

コンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴ（図４Ｊ）は、６２８９塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号１８に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～８０７は、２コピー（２×）の３２１ｂｐ ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基８１４～１１０３は、２コピー（２×）の１４５ｂｐマクログロブリンエンハンサーであり、塩基１１１１～１３２８は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基１３２９～１５１２は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基１５２５～５８９８は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５９０７～６１３０は、ｂＧＨポリＡであり、塩基６２４５～６２８９は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0120】

コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴＡＴＧ ＦＶＩＩＩ（図４Ｋ）は、５４３０塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号１９に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６８～３０９は、２コピー（２×）の７１ｂｐ セルピンＡエンハンサーであり、塩基３２６～５４３は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５４４～７２７は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基７４０～５１１３は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１２２～５２７１は、短ｂＧＨポリＡであり、塩基５２８６～５４３０は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0121】

コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ２×μ－グロブリンエンハンサー（図４Ｌ）は、５７７９塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２０に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６８～３０９は、２コピー（２×）の７１ｂｐ セルピンＡエンハンサーであり、塩基３２６～５４３は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５４４～７２７は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基７４０～５１１３は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１２２～５２７１は、短ｂＧＨポリＡであり、塩基５２７９～５６１８は、２コピー（２×）の１７０ｂｐμ－グロブリンエンハンサーであり、塩基５６３５～５７７９は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0122】

コンストラクト１００ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ ２×μ－グロブリンエンハンサー（図４Ｍ）は、５９６２塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２１に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～５０２は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０９～７２６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７２７～９１０は、改変ヒトβ－グロビン第２イントロンであり、塩基９２３～５２９６は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５３０５～５４５４は、短ｂＧＨポリＡであり、塩基５４６２～５８０１は、２コピー（２×）の１７０ｂｐ ミクログロブリンエンハンサーであり、塩基５８１８～５９６２は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0123】

コンストラクト第ＶＩＩＩ因子ＢＭＮ００１（図４Ｎ）は、５９１９塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２２に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～４８０は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基４８７～８８４は、３９８ｂｐ ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基８８５～１１４５は、切断型のｈＡＡＴイントロンであり、塩基１１５５～５５２８は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５５３７～５７６０は、ｂＧＨポリＡであり、塩基５７７５～５９１９は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0124】

コンストラクト第ＶＩＩＩ因子ＢＭＮ００２（図４Ｏ）は、５３０６塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２３に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１７５～７０５は、ＬＰ１プロモーター／エンハンサーであり、塩基７１８～５０９１は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１００～５１４７は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５１６２～５３０６は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0125】

コンストラクト９９（図４Ｐ）は、５４６１塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２４に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～６２７は、ＡｐｏＥＨＣＲ／ＭＡＲであり、塩基６３４～８６６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基８７３～５２４６は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５２５５～５３０２は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５３１７～５４６１は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0126】

コンストラクト１００（図４Ｑ）は、５３２７塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２５に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～４９３は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０９～７２６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７３９～５１１２は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１２１～５１６８は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５１８３～５３２７は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0127】

コンストラクト１００の逆配向（図４Ｒ）は、５３０９塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２６に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０－４８４は、逆配向のＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基４９１～７０８は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７２１～５０９４は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１０３～５１５０は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５１６５～５３０９は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0128】

コンストラクト１００ＡＴ（図４Ｓ）は、５５３２塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２７に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～４９３は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０９～７２６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７２７～９３１は、ｈＡＡＴイントロンであり、塩基９４４～５３１７は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５３２６～５３７３は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５３８８～５５３２は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0129】

コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ（図４Ｔ）は、５８７７塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２８に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～４９３は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０８～８４７は、２コピー（２×）の１７０ｂｐ μ－グロブリンエンハンサーであり、塩基８５４～１０７１は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基１０７２～１２７６は、ｈＡＡＴイントロンであり、塩基１２８９～５６６２は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５６７１～５７１８は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５７３３～５８７７は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0130】

コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧｂＧＨポリＡ（図４Ｕ）は、６０５４塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号２９に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～４９３は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０８～８４７は、２コピー（２×）の１７０ｂｐ μ－グロブリンエンハンサーであり、塩基８５４～１０７１は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基１０７２～１２７６は、ｈＡＡＴイントロンであり、塩基１２８９～５６６２は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５６７１～５８９５は、ｂＧＨポリＡであり、塩基５９１０～６０５４は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0131】

コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ（逆）ｂＧＨポリＡ（図４Ｖ）は、６０５４塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３０に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～４９３は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０８～８４７は、２コピー（２×）の１７０ｂｐ逆配向のμ－グロブリンエンハンサーであり、塩基８５４～１０７１は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基１０７２～１２７６は、ｈＡＡＴイントロンであり、塩基１２８９～５６６２は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５６７１～５８９５は、ｂＧＨポリＡであり、塩基５９１０～６０５４は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0132】

コンストラクト１００ｂＧＨポリＡ（図４Ｗ）は、５５０４塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３１に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～４９３は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５０９～７２６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７３９～５１１２は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基対５１２１～５３４５は、ｂＧＨポリＡであり、塩基５３６０～５５０４は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0133】

コンストラクト１００～４００（図４Ｘ）は、５５０７塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３２に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～４９３は、ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５１２～９０６は、３９８ｂｐ ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基９１９～５２９２は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５３０１～５３４８は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５３６３～５５０７は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0134】

コンストラクト１０１（図４Ｙ）は、５３１１塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３３に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１７０～４７７は、２コピー（２×）の１５４ｂｐ ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基４９３～７１０は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７２３～５０９６は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１０５～５１５２は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５１６７～５３１１は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0135】

コンストラクト１０２（図４Ｚ）は、５１５６塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３４に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～３２２は、１５４ｂｐＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基３３８～５５５は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５６８～４９４１は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基４９５０－４９９７は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５０１２～５１５６は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0136】

コンストラクト１０３（図４ＡＡ）は、５１７８塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３５に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２
ＩＴＲであり、塩基１６９－３４４は、４コピー（４×）の４４ｂｐ ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基３６０～５７７は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５９０～４９６３は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基４９７２～５０１９は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５０３４～５１７８は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0137】

コンストラクト１０３の逆配向（図４ＢＢ）は、５１６０塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０～３３５は、４コピー（４×）の４４ｂｐ逆配向のＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基３４２～５５９は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５７２～４９４５は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基４９５４～５００１は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５０１６～５１６０は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0138】

コンストラクト１０３ＡＴ（図４ＣＣ）は、５３８３塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３７に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～３４４は、４コピー（４×）の４４ｂｐ ＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基３６０～５７７は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５７８～７８２は、ｈＡＡＴイントロンであり、塩基７９５～４３７４は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１７７～５２２４は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５２３９～５３８３は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0139】

コンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧ（図４ＤＤ）は、５７２８塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３８に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～３４４は、４コピー（４×）の４４ｂｐのＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基３５９～６９８は、２コピー（２×）の１７０ｂｐのμ－グロブリンエンハンサーであり、塩基７０５～９２２は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基９２３～１１２７は、ｈＡＡＴイントロンであり、塩基１１４０～５５１３は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５５２２～５５６９は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５５８４～５７２８は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0140】

コンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧ ｂＧＨポリＡ（図４ＥＥ）は、５９０５塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号３９に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～３４４は、４コピー（４×）の４４ｂｐのＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基３５９～６９８は、２コピー（２×）の１７０ｂｐのμ－グロブリンエンハンサーであり、塩基７０５～９２２は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基９２３～１１２７は、ｈＡＡＴイントロンであり、塩基１１４０～５５１３は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５５２２～５７４６は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５７６１～５９０５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0141】

コンストラクト１０３ｂＧＨポリＡ（図４ＦＦ）は、５３５５塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号４０に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９～３４４は、４コピー（４×）の４４ｂｐのＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基３６０～５７７は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５９０～４９６３は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基４９７２～５１９６は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５２１１～５３５５は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0142】

コンストラクト１０４（図４ＧＧ）は、５６１８塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号４１に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２
ＩＴＲであり、塩基１６９～７８４は、４コピー（４×）の１５４ｂｐのＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基８００～１０１７は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基１０３０～５４０３は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５４１２～５４５９は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５４７４～５６１８は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0143】

コンストラクト１０５（図４ＨＨ）は、５９９３塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号４２に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２
ＩＴＲであり、塩基１７３～５１２は、２コピー（２×）の１７０ｂｐのμ－グロブリンエンハンサーであり、塩基５１９～７３６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７４９～５１２２は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１３１～５１７８は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５１８５～５８３４は、２コピー（２×）のＡｐｏＥＨＣＲであり、塩基５８４９～５９９３は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0144】

コンストラクト１０６（図４ＩＩ）は、５３３７塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号４３に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２
ＩＴＲであり、塩基１７３～５１２は、２コピー（２×）の１７０ｂｐのμ－グロブリンエンハンサーであり、塩基５１９～７３６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７４９～５１２２は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５１３１～５１７８は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５１９３～５３３７は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0145】

コンストラクト１０６ＡＴ（図４ＪＪ）は、５５４２塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号４４に記載されており、塩基１～１４５は、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１７３～５１２は、２コピー（２×）の１７０ｂｐのμ－グロブリンエンハンサーであり、塩基５１９～７３６は、ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７３７～９４１は、ｈＡＡＴイントロンであり、塩基９５４～５３２７は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱであり、塩基５３３６～５３８３は、合成ウサギβ－グロビンポリＡであり、塩基５３９８～５５４２は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0146】

コンストラクトｐ－１００ ＡＴＧＢは、５６４０塩基長である。このコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号４５に記載されており、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡｐｏＥＨＣＲ、ｈＡＡＴプロモーター、改変ヒトβ－グロビン第２イントロン、ＦＶＩＩＩ－ＳＱをコードする配列、ｂＧＨポリＡ配列、及び３’ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

【0147】

ＡＡＶベクター
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染しているヘルパーウイルスによって与えられる、細胞内でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、以下の表１に示されるとおり、特徴付けられているＡＡＶの血清型は１３種存在する。ＡＡＶの概説及び総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出され得る。しかしながら、様々な血清型は、遺伝子レベルにおいてでさえ、構造的にかつ機能的に、極めて密接に関連していることが周知であるため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であろうことが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照のこと）。例えば、すべてのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子によってもたらされるとてもよく似た複製特性を明らかに示し、すべて、３つの関連するカプシドタンパク質を保有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端での類似する自己アニーリングセグメントの存在を示すヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンはまた、それぞれの血清型における複製機能が同様の調節管理下にあることも示唆する。

【0148】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）によって挟まれ、１つ以上の発現制御エレメントに動作可能に連結された対象となる１つ以上のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子生成物をコード及び発現するベクターが形質移入された宿主細胞中に存在するときに、感染ウイルス粒子内への複製及びパッケージングされ得る。

【0149】

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。粒子は、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達されるトランス遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、典型的に、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、このようなベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含有されることから、ＡＡＶベクター粒子の生成には、必然的にＡＡＶベクターの生成が含まれる。

【0150】

ＡＡＶの「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、それぞれ、複製タンパク質及びカプシド形成されたタンパク質をコードする遺伝子である。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、今までに、調べられたすべてのＡＡＶ血清型において見出されており、本明細書及び引用された参考文献に記載されている。野生型ＡＡＶでは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は通常、ウイルスゲノム内で互いに隣接して見出され（すなわち、これらは隣接または重複する転写単位として共に「連結」している）、これらは通常、ＡＡＶ血清型の間で保存されている。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子はまた、個々に、及び集合的に、「ＡＡＶパッケージング遺伝子」とも称される。本明細書に従ってＡＡＶのｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐ及びアデノのヘルパー機能の存在下でＡＡＶベクターをパッケージングすることが可能であり、標的細胞受容体と結合することが可能な、Ｃａｐタンパク質をコードしている。いくつかの実施形態において、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子は、特定のＡＡＶ血清型、例えば、以下に表１に示される血清型に由来するアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質をコードしている。

【表1】

【0151】

ＡＡＶの生成に使用されるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来され得る。通常、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで有意に相同的なゲノム配列を有し、同様の一連の遺伝的機能を与え、本質的に物理的かつ機能的に等価なビリオンを生成し、ほぼ同一の機構により複製及び構築する。ＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の考察については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９７９０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３３０３、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３－３３（１９９７）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５－６４（１９８３）、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９－１３１９（１９９９）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９－３１９（１９９８）、及びＷｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５－４７（２０００）を参照のこと。

【0152】

すべての知られているＡＡＶ血清型のゲノム機構は非常に似ている。ＡＡＶのゲノムは、約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長未満の直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質の独自のコードクレオチド配列に隣接している。ＶＰタンパク質は、カプシドを形成する。末端１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖が形成され得るように組織化されている。これらのヘアピン構造体は、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ錯体のためのプライマーとしての役割を果たす。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードする。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモーターから転写される。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから転写される。本発明のベクターに使用されるＩＴＲは、関連するｃａｐ遺伝子と同じ血清型に対応し得るか、または異なり得る。特に好ましい実施形態において、本発明のベクターに使用されるＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型に対応し、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ５血清型に対応する。

【0153】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、Ｓｆ９またはＨＥＫ細胞等の特定の細胞型における発現のための発現制御配列に動作的に連結している。昆虫宿主細胞または哺乳類宿主細胞において外来遺伝子を発現するための、当業者に公知の手法が、本発明を実施するために使用され得る。昆虫細胞においてのポリペプチドの分子工学及び発現のための方法論は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ．１９８６．Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘ．、Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｉｎ Ｐｒｏｋｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ
Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ’ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９７－１５２、Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２，Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ，１９９２，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，１９９５，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３９、米国特許第４，７４５，０５１号、ＵＳ２００３１４８５０６、及びＷＯ０３／０７４７１４に記載されている。ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写に特に適しているプロモーターは、例えば、多角体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーターである。しかしながら、昆虫細胞において活性な他のプロモーターが、当該技術分野において既知であり、例えば、ｐ１０、ｐ３５、またはＩＥ－１プロモーター、及び上記の参考文献に記載されるさらなるプロモーターも企図される。

【0154】

異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、文書により十分に裏付けられており、核酸、例えばベクター、例えば昆虫細胞適合ベクターをそのような細胞に導入する方法、及びそのような細胞を培養液中で維持する方法等である。例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ
ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２－８（１９８９）、Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６４６－５０（１９９１）、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２－３０（１９９２）、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．２１９：３７－４４（１９９６）、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．２７２：３８２－９３（２０００）、及びＳａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第６，２０４，０５９号を参照のこと。いくつかの実施形態において、昆虫細胞におけるＡＡＶをコードする核酸コンストラクトは、昆虫細胞適合ベクターである。「昆虫細胞適合ベクター」または「ベクター」は、本明細書で使用される場合、昆虫または昆虫細胞の増殖性形質転換またはトランスフェクションが可能である核酸分子を指す。昆虫または昆虫細胞の増殖性形質転換またはトランスフェクションが可能である核酸分子を指す。昆虫細胞適合であればいかなるベクターも使用することができる。このベクターは、昆虫細胞ゲノムに組み込まれ得るが、昆虫細胞においてベクターの存在は永続的である必要はなく、一過性のエピソーム性ベクターも含まれる。ベクターは、任意の既知の手段によって、例えば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、または感染によって導入され得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター、またはプラスミドである。より好ましい実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスであり、すなわち、コンストラクトが、バキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びそれらの使用法は、昆虫細胞の分子工学に関する上記の参考文献に記載されている。

【0155】

バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープを有するＤＮＡウイルスであり、そのうちの２つのメンバーは、細胞培養液中で組換えタンパク質を生成するための周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、巨大なゲノム内容物の特定の細胞への送達を可能にするように操作可能である、環状の二本鎖ゲノム（８０～２００ｋｂｐ）を有する。ベクターとして使用されるウイルスは、通常、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多カプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｂｍ）ＮＰＶ）（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）である。

【0156】

バキュロウイルスは、一般に、組換えタンパク質の発現のための昆虫細胞の感染に使用される。具体的には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８６）、ＥＰ １２７，８３９、ＥＰ １５５，４７６、Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５）、Ｌｅｂａｃｑ－Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）、Ｍｉｙａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ（１９８７）、及びＭａｒｔｉｎ
ｅｔ ａｌ（１９８８）に記載されているように達成することができる。タンパク質産生のために使用することができる、多数のバキュロウイルス株及び変異体及び対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８６）、Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５）、及びＭｃＫｅｎｎａ（１９８９）において記載されている。

【0157】

組換えＡＡＶを生成するための方法
本開示は、昆虫または哺乳動物細胞において組換えＡＡＶを生成するための材料及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、ウイルスコンストラクトは、対象となる１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするために、プロモーター及びプロモーターの制限酵素認識部位下流をさらに含み、プロモーター及び制限酵素認識部位は、５’ＡＡＶ ＩＴＲの下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流に位置している。いくつかの実施形態において、ウイルスコンストラクトは、制限酵素認識部位の転写後の調節エレメント下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流をさらに含む。いくつかの実施形態において、ウイルスコンストラクトは、制限酵素認識部位で挿入され、プロモーターで動作に連結されたポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドは、対象となるタンパク質のコード領域を含む。当業者が認識するように、本出願に開示されているＡＡＶベクターのうちの任意の１つは、組換えＡＡＶを生成するためのウイルスコンストラクトとして、本方法において使用することができる。

【0158】

いくつかの実施形態において、ヘルパー機能は、アデノウイルスまたはバキュロウイルスのヘルパー遺伝子を含む１つ以上のヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスによって提供される。アデノウイルスまたはバキュロウイルスのヘルパー遺伝子の非限定的な例としては、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡが挙げられるが、これらに限定されず、これらは、ＡＡＶパッケージングにヘルパー機能を提供し得る。

【0159】

ＡＡＶのヘルパーウイルスは、当該技術分野において公知であり、例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅファミリー及びＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅファミリーからのウイルスが含まれる。ＡＡＶのヘルパーウイルスの例としては、米国特許出願公開第２０１１／０２０１０８８号（この米国特許出願公開の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＳＡｄＶ－１３ヘルパーウイルス及びＳＡｄＶ－１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。適切なヘルパー機能をＡＡＶに提供し得るＡＡＶのいかなるヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドも本明細書で使用することができることは、当業者に理解されよう。

【0160】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、プラスミド中に存在する。プラスミドは、ｃａｐ遺伝子と同じ血清型に対応してもしなくてもよい、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をさらに含むことができる。任意のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、及びこれらの任意の変異体が挙げられるが、これらに限定されない）からのｃａｐ遺伝子及び／またはｒｅｐ遺伝子は、組換えＡＡＶを生成するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、血清型１３、またはこれらの変異体からのカプシドをコードする。

【0161】

いくつかの実施形態において、昆虫細胞または哺乳類細胞が、ヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルス、ＡＡＶｃａｐ遺伝子をコードするウイルスコンストラクト及びプラスミドを形質移入され得；同時形質移入後に組換えＡＡＶウイルスが種々の時点において収集され得る。例えば、組換えＡＡＶウイルスは、同時形質移入の約１２時間後、約２４時間後、約３６時間後、約４８時間後、約７２時間後、約９６時間後、約１２０時間後、またはこれらいずれか２つの時点の間の時間後に、収集され得る。

【0162】

組換えＡＡＶはまた、感染性組換えＡＡＶを生成するのに適している当該技術分野において公知の任意の従来の方法を用いて生成され得る。いくつかの例では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子生成に必要な成分のいくつかを安定的に発現する昆虫細胞または哺乳類細胞を用いることによって生成され得る。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノム内に組み込まれ得る。次いで、昆虫または哺乳類細胞は、ヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を与えるアデノウイルスまたはバキュロウイルス）、ならびに５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ（及び、必要に応じて、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターに同時感染され得る。この方法の利点は、細胞が選択可能であること、及び組換えＡＡＶの大量生産に適していることである。別の非限定例として、プラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために使用することができる。さらに別の非限定的な例として、５’及び３’ＡＡＶ ＬＴＲならびにｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を含有するウイルスベクターの両方が産生細胞のＤＮＡに安定的に組み込まれ得、ヘルパー機能は、組換えＡＡＶを生成するために野生型アデノウイルスによって提供され得る。

【0163】

ＡＡＶ生成で使用される細胞型
本発明のＡＡＶベクターを含むウイルス粒子は、ＡＡＶまたは生物学的生成物の生成を可能にし、かつ培養液中で維持することができる、あらゆる無脊椎動物細胞型を用いて生成してもよい。例えば、使用される昆虫細胞株は、ＳＦ９、ＳＦ２１、ＳＦ９００＋等のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ショウジョウバエ細胞株、蚊細胞株、例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株、家蚕細胞株、例えば、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ細胞株、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞株、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ細胞株、例えば、Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ細胞株からのものであり得る。好ましい昆虫細胞は、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＡｏ３８を含む、バキュロウイルスに感染しやすい昆虫種からの細胞である。

【0164】

バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープを有するＤＮＡウイルスであり、そのうちの２つのメンバーは、細胞培養液中で組換えタンパク質を生成するための周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、巨大なゲノム内容物の特定の細胞への送達を可能にするように操作可能である、環状の二本鎖ゲノム（８０～２００ｋｂｐ）を有する。ベクターとして使用されるウイルスは、通常、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多カプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｂｍ－ＮＰＶ）（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）である。

【0165】

バキュロウイルスは、一般に、組換えタンパク質の発現のための昆虫細胞の感染に使用される。具体的には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８６）、ＥＰ １２７，８３９、ＥＰ １５５，４７６、Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５）、Ｌｅｂａｃｑ－Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）、Ｍｉｙａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ（１９８７）、及びＭａｒｔｉｎ
ｅｔ ａｌ（１９８８）に記載されているように達成することができる。タンパク質産生のために使用することができる、多数のバキュロウイルス株及び変異体及び対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８６）、Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５）、及びＭｃＫｅｎｎａ（１９８９）において記載されている。

【0166】

本発明の別の態様では、本発明の方法はまた、ＡＡＶの複製または生物学的産物の生成を可能にし、かつ培養液中で維持することができる、あらゆる哺乳動物細胞型を用いて実行される。使用される好ましい哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ １０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９、及びＭＲＣ－５細胞であり得る。

【0167】

ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの試験
本発明の完全にパッケージングされたＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを試験するためのアッセイは、例えば、（１）肝臓特異的なｍＲＮＡ発現及びスプライシング、ならびにインビトロでのＦＶＩＩＩタンパク質の生成及び分泌を試験するためのヒト肝臓由来の細胞株、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＡＶベクター核酸を含む二本鎖ＤＮＡプラスミドの一過性トランスフェクション、（２）ＨＥＫ２９３細胞及びバキュロウイルスに感染した昆虫細胞におけるＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを含むＡＡＶビリオンの生成、（３）アルカリ性ゲル分析及び複製アッセイにおけるＡＡＶベクター核酸の評価、ならびに（４）Ｒａｇ２マウスにおけるＦＶＩＩＩ発現、ＦＶＩＩＩ活性、及びＦＶＩＩＩ比活性の評価、を含む。これらのアッセイは、実施例により詳細に記載されている。

【0168】

本発明の完全にパッケージングされたＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、図１に示される代表的なベクターと少なくとも同じ発現及び／または活性、好ましくは、図１に示されるベクターと比較して１．５倍、２倍、３倍、４倍、もしくは５倍、またはそれ以上の発現及び／または活性を示す。

【0169】

本発明の完全にパッケージングされたＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、断片ゲノムの混入がほとんどまたは全くない高いベクター収率、好ましくは、図１に示されるベクターと比較して１．５倍、２倍、３倍、４倍、もしくは５倍、またはそれ以上高いベクター収率を有する。

【0170】

薬学的製剤
他の実施形態において、本発明は、血友病Ａに罹患している対象への投与に有用なＦＶＩＩＩ ＡＡＶベクター／ビリオンの薬学的製剤を対象とする。ある特定の態様では、本発明の薬学的製剤は、本明細書で開示されているベクターから生成される組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩビリオンを含む液体製剤であり、製剤中の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩビリオンの濃度は、大きく異なり得る。ある特定の実施形態において、製剤中の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩビリオンの濃度は、１Ｅ１２ｖｇ／ｍｌ～２Ｅ１４ｖｇ／ｍｌの範囲であり得る。特に好ましい実施形態において、製剤中の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩビリオンの濃度は、約２Ｅ１３ｖｇ／ｍｌである。別の好ましい実施形態において、製剤中に存在する組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩビリオンは、ＡＡＶ５カプシド中の図２Ａに概略的に示されるＰｒｏｔｏ１ベクターのカプシド形成に由来するＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである。

【0171】

他の態様では、本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩ薬学的製剤は、保存及び／または血友病Ａの治療のために対象への投与のために有利な特性を有する製剤を提供するために、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。ある特定の実施形態において、本発明の薬学的製剤は、安定性の検出可能な変化を伴わずに、少なくとも２週間、好ましくは少なくとも４週間、より好ましくは少なくとも６週間、さらにより好ましくは、少なくとも約８週間の期間中、６５℃以下で保存することができる。この件について、「安定した」という用語は、製剤中に存在する組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスが、保存中、その物理的安定性、化学的安定性、及び／または生物学的活性を本質的に保持することを意味する。本発明のある特定の実施形態において、薬学的製剤中に存在する組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスは、－６５℃で決定期間の保存中、ヒト患者におけるその生物学的活性の少なくとも約８０％、より好ましくは、ヒト患者におけるその生物学的活性の少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％保持する。

【0172】

ある特定の態様では、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩビリオンを含む製剤は、１つ以上の緩衝剤をさらに含む。例えば、様々な態様では、本発明の製剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌ、または約１．４ｍｇ／ｍｌ～約１．６ｍｇ／ｍｌの濃度の二塩基性リン酸ナトリウムを含む。特に好ましい実施形態において、本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩ製剤は、約１．４２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム（乾燥した）を含む。本発明の組換えＡＡＶ
ＦＶＩＩＩ製剤での用途を見出し得る別の緩衝剤は、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物であり、いくつかの実施形態において、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌ、または約１．３ｍｇ／ｍｌ～約１．５ｍｇ／ｍｌの濃度での用途を見出す。特に好ましい実施形態において、本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩ製剤は、約１．３８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含む。本発明のなおさらに特定の好ましい実施形態において、本発明の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩ製剤は、約１．４２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム及び約１．３８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含む。

【0173】

別の態様では、本発明の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩ製剤は、好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ～約１５ｍｇ／ｍｌ、または約８ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、塩化ナトリウム等の１つ以上の等張剤を含み得る。特に好ましい実施形態において、本発明の製剤は、約８．１８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。当該技術分野において公知の他の緩衝剤及び等張剤は、好適であり、本開示の製剤で用いるために日常的に使用され得る。

【0174】

別の態様では、本発明の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩ製剤は、１つ以上の増量剤を含み得る。例示的な増量剤としては、マンニトール、スクロース、デキストラン、ラクトース、トレハロース、及びポビドン（ＰＶＰ Ｋ２４）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の好ましい実施形態において、本発明の製剤は、約５ｍｇ／ｍｌ～約４０ｍｇ／ｍｌ、または約１０ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍｌ、または約１５ｍｇ／ｍｌ～約２５ｍｇ／ｍｌの量で存在し得る、マンニトールを含む。特に好ましい実施形態において、マンニトールは、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0175】

さらに別の態様では、本発明の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩ製剤は、非イオン性界面活性剤であり得る、１つ以上の界面活性剤を含み得る。例示的な界面活性剤には、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート８０、またはその化学名ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても知られている）、ナトリウムドデシルスルフェート、ステアリン酸ナトリウム、アンモニウムラウリルスフフェート、ＴＲＩＴＯＮ ＡＧ ９８（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ）、ポロキサマー４０７、ポロキサマー１８８等、及びこれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態において、本発明の製剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約４ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、または約１．８ｍｇ／ｍｌ～約２．２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る、ポロキサマー１８８を含む。特に好ましい実施形態において、ポロキサマー１８８は、約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0176】

本発明の特に好ましい実施形態において、本発明の薬学的製剤は、約１．４２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、約１．３８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、約８．１８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、約２０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び約２ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８を含む液体溶液中で製剤化されたＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを含む。

【0177】

本開示の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスを含有する製剤は、安定しており、品質、効能、または純度の許容できない変化を生じることなく、長期間の間保存され得る。一態様では、製剤は、少なくとも１ヶ月間、例えば、少なくとも１ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、またはそれ以上の間、約５℃（例えば、２℃～８℃）の温度で安定している。別の態様では、製剤は、少なくとも６ヶ月間、例えば、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、またはそれ以上の間、約－２０℃以下の温度で安定している。別の態様では、製剤は、少なくとも６ヶ月間、例えば、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、またはそれ以上の間、約－４０℃以下の温度で安定している。別の態様では、製剤は、少なくとも６ヶ月間、例えば、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、またはそれ以上の間、約－６０℃以下の温度で安定している。

【0178】

治療方法
ある特定の実施形態において、本発明は、血友病Ａに罹患している対象を治療するための方法を対象とし、本方法は、その対象に、治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルス、またはそれを含む薬学的組成物を投与することを含む。さらに他の実施形態において、本発明は、血友病Ａに罹患している対象における出血症状発現中に出血時間を減少させるための方法を対象とし、本方法は、対象に、治療上有効量の、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルス、またはそれを含む薬学的組成物を投与することを含む。この点については、血友病Ａに罹患している対象における血友病Ａの治療に関してまたは出血症状発現中の出血時間を減少させるための方法で用いるための「治療上有効量」は、（１）例えば、打撲、関節痛、または腫れ、長期間頭痛、嘔吐、または疲労を含む、血友病Ａの生理学的症状のうちの１つ以上を、ある程度、軽減、阻害、または予防、（２）血液を凝血する能力の改善、（３）出血症状発現中の出血時間全体の減少、（４）対象の血漿中の機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の濃度または活性の測定可能な増加をもたらす投与、及び／または（５）障害と関連する１つ以上の症状のある程度の緩和、の効果のうちの１つ以上を引き起こすことができる量を指す。「治療上有効量」のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターもしくはウイルス、または本明細書に記載される治療のために、それを含む薬学的組成物は、実験的に及び日常的な様式で決定され得る。しかしながら、ある特定の実施形態において、「治療上有効量」の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスは、約１Ｅ１２ｖｇ／体重ｋｇ～約１Ｅ１４ｖｇ／体重ｋｇ、好ましくは、約６Ｅ１２ｖｇ／体重ｋｇ～約６Ｅ１３ｖｇ／体重ｋｇの範囲に及ぶ。特に好ましい実施形態において、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスは、約２Ｅ１３ｖｇ／体重ｋｇである。別の特に好ましい実施形態において、治療上有効量の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスは、約６Ｅ１３ｖｇ／体重ｋｇである。

【0179】

本発明の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター／ウイルスは、様々な既知の投与技術を通して、対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象に投与され得る。好ましい一実施形態において、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩ遺伝子療法ウイルスは、単回ボーラスとしてまたは長期間にわたって静脈内注射によって投与され、少なくとも約１、５、１０、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、もしくは２４０分、またはそれ以上であり得る。本発明の特に好ましい実施形態において、投与された組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱである。

【0180】

本発明の、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター／ウイルス、またはそれを含む薬学的製剤の投与は、好ましくは、投与前の対象の血漿中に存在する機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の活性量と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の対象の血漿中の機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の活性量の増加をもたらす。ある特定の実施形態において、本発明の、組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター／ウイルス、またはそれを含む薬学的製剤の投与は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ＩＵ／ｄｌ、またはそれ以上の対象の血漿中の機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の活性の発現をもたらす。この点においては、ＦＶＩＩＩ活性に関して、「ＩＵ」または「国際単位」という用語は、十分理解され、かつ許容された用語であり、１ＩＵのＦＶＩＩＩ活性が、１ｍｌの正常ヒト血漿中のＦＶＩＩＩの量に相当する。血漿中のＦＶＩＩＩ活性は、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＰＴ）方法を含む、多くの公知及び許容されるアッセイによって定量的に決定され得る（例えば、Ｍｉｌｅｔｉｃｈ ＪＰ：Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ．Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅ Ｂｅｕｔｌｅｒ，ＭＡ Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＢＡ Ｃｏｌｌｅｒ，ＴＪ Ｋｉｐｐｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，１９９５，ｐｐＬ８５－８６，Ｇｒｅａｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｉｎ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＲＷ Ｃｏｌｍａｎ，Ｊ Ｈｉｒｓｈ，ＶＪ Ｍａｒｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＪＢ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ，２００１，ｐｐ１１９７－１２３４、及びＯｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１２２：７８２－７９８（１９９８）を参照のこと）または発色性ＦＸａアッセイ（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２８（６）：１２５－１２９（２０１１））。

【0181】

本発明の他の実施形態において、対象における出血時間は、例えば、Ｉｖｙ方法（例えば、Ｉｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃ．Ｏｂｓｔｅｔ．６０：７８１（１９３５）及びＩｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．２６：１８１２（１９４１）を参照のこと）またはＤｕｋｅ方法（例えば、Ｄｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ５５：１１８５（１９１０）を参照のこと）を含む、公知の及び許容される技術によって測定され得る。対象における「出血症状発現」は、外面的にまたは内面的に、対象における出血をもたらす損傷を指し、通常、損傷から凝血の形成の時間期間を含む。

【0182】

本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与は、場合によっては、観察可能な肝毒性度をもたらし得る。肝毒性は、例えば、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩ投与前（すなわち、ベースライン）及びＡＡＶ ＦＶＩＩＩ投与後の両方で、対象の血流中のある特定の肝臓関連酵素（複数可）（例えばアラニントランスアミナーゼ、ＡＬＴ）の濃度を測定する、様々な公知の日常的に使用される技術によって測定され得る。（投与前と比較して）ＡＡＶ ＦＶＩＩＩ投与後のＡＬＴ濃度の観察可能な増加は、薬剤誘発性の肝毒性を示す。本発明のある特定の実施形態において、治療上有効量のＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与に加えて、対象は、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与と関連するあらゆる肝毒性を予防及び／または治療するために、コルチコステロイドで予防的に、治療的に、またはその両方で治療され得る。「予防的」コルチコステロイド治療は、対象における肝毒性を予防する及び／または測定したＡＬＴレベルの増加を防ぐためのコルチコステロイドの投与を指す。「治療的」コルチコステロイド治療は、ＡＶＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与によって引き起こされる肝毒性を軽減する及び／またはＡＡＶ ＦＶＩＩＩウイルスの投与によって引き起こされる対象の血流中の上昇したＡＬＴ濃度を減少させるためのコルチコステロイドの投与を指す。ある特定の実施形態において、予防的または治療的コルチコステロイド治療は、対象への少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍｇ／日、またはそれ以上のコルチコステロイドの投与を含み得る。ある特定の実施形態において、対象の予防的または治療的コルチコステロイド治療は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０週間、またはそれ以上の連続期間にわたってなされ得る。本明細書に記載される方法での用途を見出すコルチコステロイドは、例えば、デキサメタゾン、プレドニゾン、フルドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン等を含む、任意の周知のまたは日常的に使用されるコルチコステロイドを含む。

【0183】

抗ＡＡＶ抗体の検出
全身性ＡＡＶ媒介性の第ＶＩＩＩ因子遺伝子導入による肝臓への成功した形質導入の可能性を最大限に生かすために、上述のヒト患者への治療的レジメンにおけるＡＡＶベクターの投与前に、見込み患者は、細胞の形質導入をブロッキングすることが可能であるか、またはそうでなければ治療的レジメンの全体的効率を減少させる抗ＡＡＶカプシド抗体の存在について評価され得る。かかる抗体は、見込み患者の血清中に存在し得、任意の血清型のＡＡＶカプシドに対して作られ得る。一実施形態において、事前の抗体に対して作られた血清型は、ＡＡＶ５である。

【0184】

事前のＡＡＶ免疫を検出するための方法は、当該技術分野において公知であり、日常的に使用されており、細胞に基づいたインビトロ形質導入阻害（ＴＩ）アッセイ、インビボ（例えば、マウスにおける）ＴＩアッセイ、及び全抗カプシド抗体（ＴＡｂ）のＥＬＩＳＡに基づいた検出を含む（例えば、Ｍａｓａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．１５：３７９－３８９（２０１３）及びＢｏｕｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２１：７０４－７１２（２０１０）を参照のこと）。ＴＩアッセイは、ＡＡＶ誘導性レポーターベクターが予め導入されている宿主細胞を使用し得る。レポーターベクターは、発現がＡＡＶウイルスによって宿主細胞の形質導入時に誘導される、ＧＦＰ等の誘導性レポーターベクターを含み得る。宿主細胞の形質導入を阻止／減少させることができるヒト血清中に存在する抗ＡＡＶカプシド抗体は、それによって、系のレポーター遺伝子の全体の発現を減少させ得る。したがって、かかるアッセイは、治療的ＦＶＩＩＩ ＡＡＶウイルスによって細胞の形質導入を阻止／減少させることができるヒト血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体の存在を検出するために使用され得る。

【0185】

抗ＡＡＶカプシド抗体を検出するためのＴＡｂアッセイは、ヒト血清を通過する、「捕捉剤」として固相結合ＡＡＶカプシドを使用し得、それによって、血清中に存在する抗カプシド抗体が固相結合「捕捉剤」に結合することができる。一旦非特異的結合を除去するために洗浄されると、「検出剤」は、捕捉剤と結合する抗カプシド抗体の存在を検出するために使用され得る。検出剤は、抗体、ＡＡＶカプシド等であり得、結合抗カプシド抗体の検出及び定量化に役立つように検出可能に標識され得る。一実施形態において、検出剤は、電気化学発光技術及び装置を用いて検出され得るルテニウムまたはルテニウム錯体で標識される。

【0186】

同じ上述の方法論は、対象となる治療的ＡＡＶウイルスで以前に治療された患者における抗ＡＡＶカプシド免疫応答の作製を評価及び検出するために使用され得る。したがって、これらの技術が、治療的ＦＶＩＩＩ ＡＡＶウイルスによる治療前に抗ＡＡＶカプシド抗体の存在を評価するために使用され得るだけでなく、それらはまた、投与後に投与された治療的ＦＶＩＩＩ ＡＡＶウイルスに対して免疫応答の誘導を評価及び測定するために使用され得る。したがって、本発明は、ヒト血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体を検出するための技術及び血友病Ａの治療のための治療的ＦＶＩＩＩ ＡＡＶウイルスの投与のための技術を組み合わせる方法を企図し、ヒト血清中の抗ＡＡＶカプシド抗体を検出するための技術は、治療的ＦＶＩＩＩ ＡＡＶウイルスの投与前または投与後のいずれかで行われ得る。

【0187】

本発明の他の態様及び利点は、以下の実例を考慮することにより理解されよう。

【実施例0188】

実施例１
Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、Ｐｒｏｔｏ２Ｓ、及びＰｒｏｔｏ３Ｓベクターの作製
２０１１年１月１３日に公開されたＷＯ２０１１／００５９６８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－３３４４，２０１３に詳述される、図１に概略的に示される組換えＡＡＶ
ＦＶＩＩＩベクターは、大容量、すなわち、５．０ｋｂ超のＡＡＶベクターである。図１に示されるように、このベクターは、左から右に、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）５’ＩＴＲ、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列、３４塩基ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）／Ｃ１エンハンサー、３２塩基ヒトアルファ抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター遠位Ｘ領域、４２塩基の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列を含む１８６塩基ヒトＡＡＴプロモーター、Ｂドメインが１４アミノ酸のＳＱ配列で置換されているコドンを最適化したヒトＦＶＩＩＩ配列、４９塩基合成ポリアデニル化配列、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを含む。このベクターは、５０８１塩基長である。

【0189】

図１に示されるＦＶＩＩＩベクターよりも小さいベクターを得るために、ＦＶＩＩＩの発現及び／もしくは活性、またはＡＡＶビリオン生成に不必要であると本明細書において本発明者らによって考えられているＤＮＡ配列を、元のベクター配列から除去した。ＡＡＶ２ウイルス配列３’～ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの５３塩基、ＡＡＶ２ウイルス配列５’～ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの４６塩基、及びコドンを最適化したＦＶＩＩＩ ＳＱコード領域に隣接した１１塩基を含む、外来性ＤＮＡ配列を除去した。ＳＱリンカーを保有する新規のコドンを最適化したＢ－ドメイン欠失ＦＶＩＩＩコード配列はまた、新規の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターに生成され、導入された。ある特定の配列の変化が、ＡＡＶ２ ５’及び３’ＩＴＲになされた。４９７０塩基長である、結果として得られるＰｒｏｔｏ１ベクターは、図２Ａにおいて図式形態で示され、完全ヌクレオチド配列は、配列番号１に記載される。本明細書において本発明者らは、Ｐｒｏｔｏ１が感染性組換えＡＡＶウイルスを生成し、機能性第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードすることを実証した。

【0190】

ＡＡＶ２ ＩＴＲ内のヘアピンループに隣接する配列はまた、組換えＡＡＶベクターにおいて不要であり得る（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５２１，２２５号、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１６６８－１６７７，１９９６、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０７７－３０８２，１９９７を参照のこと）。Ｐｒｏｔｏ１ベクターのサイズをさらに減少させるために、ＡＡＶ２
５’ＩＴＲ内のヘアピンループの３’側に隣接したＡＡＶ２配列の１０塩基を除去し、ＡＡＶ２配列の１０塩基を、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ内のヘアピンループの５’側に隣接したＡＡＶ２配列の１０塩基を除去した。４９５０塩基長である結果として得られるＰｒｏｔｏ１Ｓベクターは、図２Ｂにおいて図式形態で示され、配列は、配列番号２に記載される。

【0191】

Ｐｒｏｔｏ１Ｓベクター中のＦＶＩＩＩ ＳＱ変異体の発現を増加させる試みにおいて、１００塩基の合成イントロンを、コドンを最適化したＦＶＩＩＩ配列中のエクソン１とエクソン２の間に挿入した。イントロンの挿入は、例えば、インターフェロン遺伝子等のイントロンを含まない遺伝子における、ｍＲＮＡ発現のレベルを増加させ得ることが知られている。

【0192】

エンハンサーは、距離及び配向に非依存的に働くと定義される。３４塩基ＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーは、米国特許第８，０３０，０６５号（ＦＩＸ発現）及びＷＯ２０１１／００５９６８（ＦＶＩＩＩ発現）（これらの両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）における、その推定的なエンハンサー活性によって例証されるように、ＦＶＩＩＩ発現に関して距離及び配向に非依存的に働く。Ｄｉ Ｓｉｍｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６：２７５９－２７６６，１９８７に記載される、３２塩基ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域は、異種プロモーターの発現を増強する調節ドメイン内に位置する。

【0193】

Ｐｒｏｔｏ１Ｓベクター中のＦＶＩＩＩ ＳＱ変異体の発現をさらに増加させるための別の試みにおいて、合成イントロン配列は、３４塩基ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサー及び３２塩基ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域を組み入れ、ヒトＡＡＴプロモーターの上流のその位置から移動された。これら２つの調節エレメントを、Ｐｒｏｔｏ１Ｓにおけるそれらの配向に対して逆配向に挿入した。４９８３塩基長である結果として得られるＰｒｏｔｏ２Ｓベクターは、図２Ｃにおいて図式形態で示され、配列は、配列番号３に記載される。

【0194】

ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域は、イントロン内の転写開始点から下流で機能することが以前に示されていなかったため、Ｐｒｏｔｏ２Ｓベクター中のこの調節エレメントを、イントロン内のエンハンサーの第１コピーと同じ配向の、３４塩基ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コピーと置換した。４９８５塩基長である結果として得られるＰｒｏｔｏ３Ｓベクターは、図２Ｄにおいて図式形態で示され、配列は、配列番号４に記載される。

【0195】

Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、Ｐｒｏｔｏ２Ｓ、及びＰｒｏｔｏ３Ｓベクター核酸を、ｐＵＣ１９細菌発現プラスミド内にクローン化し、それによって、二本鎖形態のＡＡＶ
ＦＶＩＩＩベクターを作製した。

【0196】

実施例２
Ｐｒｏｔｏ４、Ｐｒｏｔｏ５、Ｐｒｏｔｏ６、及びＰｒｏｔｏ７ベクターの作製
Ｐｒｏｔｏ１ベクターのサイズをさらに減少させるため、及び／またはＰｒｏｔｏ１ベクターと比較して、ＦＶＩＩＩの発現を増加させるために、軽鎖またはＣドメインに隣接して位置するａ３ドメインを除去した。ａ３ドメインは、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ因子への結合に関与するが、インビボで機能的に活性なＦＶＩＩＩには不要であり得る。

【0197】

Ｐｒｏｔｏ１ベクターから開始して、１４アミノ酸のＳＱ配列及び４１アミノ酸のａ３ドメイン（野生型ＦＶＩＩＩのアミノ酸１６４９～１６８９に対応する）を除去した。４８０５塩基長である結果として得られるＰｒｏｔｏ４ベクターは、図３Ａにおいて図式形態で示され、配列は、配列番号５に記載される。

【0198】

Ｂドメイン及びａ３ドメイン欠失ＦＶＩＩＩの発現を増加させる試みにおいて、１２９塩基の切断型のＦＶＩＩＩイントロンを、Ｐｒｏｔｏ４ベクター中のコドンを最適化したＦＶＩＩＩ配列中のエクソン１とエクソン２の間に挿入した。４９３４塩基長である結果として得られるＰｒｏｔｏ５ベクターは、図３Ｂにおいて図式形態で示され、配列は、配列番号６に記載される。

【0199】

Ｂドメイン及びａ３ドメイン欠失ＦＶＩＩＩの発現をさらに増加させる試みにおいて、３４塩基ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コピーを、Ｐｒｏｔｏ５ベクター中の順配向または逆配向のいずれかに挿入した。４９３４塩基長であり、イントロンの順配向ＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーを有する結果として得られるＰｒｏｔｏ６ベクターは、図３Ｃにおいて図式形態で示され、配列は、配列番号７に記載される。

【0200】

４９３４塩基長であり、イントロンの逆配向ＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーを有する結果として得られるＰｒｏｔｏ７ベクターは、図３Ｄにおいて図式形態で示され、配列は、配列番号８に記載される。

【0201】

Ｐｒｏｔｏ４、Ｐｒｏｔｏ５、Ｐｒｏｔｏ６、及びＰｒｏｔｏ７ベクター核酸を、ｐＵＣ１９細菌発現プラスミド内にクローン化し、それによって、二本鎖形態のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを作製した。

【0202】

実施例３
ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの発現及び活性を試験するためのアッセイ
本発明の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを試験するためのアッセイは、例えば、（１）肝臓特異的なｍＲＮＡ発現及びスプライシング、ならびにインビトロでのＦＶＩＩＩタンパク質の生成及び分泌を試験するためのヒト肝臓由来の細胞株、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＡＶベクター核酸を含む二本鎖ＤＮＡプラスミドの一過性トランスフェクション、（２）２９３細胞及びバキュロウイルスに感染した昆虫細胞におけるＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを含むＡＡＶビリオンの生成、（３）アルカリ性ゲル分析及び複製アッセイにおけるＡＡＶベクター核酸の評価、ならびに（４）Ｒａｇ２マウスにおけるＦＶＩＩＩ発現、ＦＶＩＩＩ活性、及びＦＶＩＩＩ比活性の評価、を含む。

【0203】

一過性トランスフェクションアッセイ
予備的なインビトロアッセイは、本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターからのＦＶＩＩＩの発現及び活性が、図１に示されるＦＶＩＩＩ発現ベクターからのものと比較するために行われる。本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの二本鎖形態が、ヒト肝細胞株である、ＨｅｐＧ２に一過性に形質移入される。トランスフェクションの後、例えば、２４または４８時間後、培養上清中のＦＶＩＩＩ抗原及び活性が測定される。

【0204】

このアッセイを用いて、Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、及びＰｒｏｔｏ２Ｓベクターを一過性に形質移入されたＨｅｐＧ２細胞におけるＦＶＩＩＩ活性は、図１のＦＶＩＩＩベクターを用いて得られたＦＶＩＩＩ活性と同様であり、Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、及びＰｒｏｔｏ２Ｓベクターが、機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現可能であったことを示した。

【0205】

２９３細胞及びバキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＡＡＶ ＦＶＩＩＩビリオンの産生
本発明の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターがＦＶＩＩＩをコードする核酸を実際にパッケージングしていることを実証するために、実施例１及び２に記載されるように作製された二本鎖形態のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを、ＡＡＶビリオンを産生可能な細胞内に導入する。第一のＡＡＶウイルス産生系では、二本鎖形態のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター核酸を含むプラスミドは、ＡＡＶ Ｃａｐ及びＲｅｐタンパク質を発現するプラスミド、ならびにＡＡＶビリオン産生に必要とされるアデノウイルスヘルパー機能を発現するプラスミドと共に、２９３細胞に同時トランスフェクトされる。第二のＡＡＶウイルス産生系では、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター核酸、ならびにＡＡＶ Ｃａｐ及びＲｅｐタンパク質を発現する、バキュロウイルスコンストラクトを作製し、次いで、昆虫Ｓｆ９細胞に同時感染させる。一過性に形質移入された２９３細胞またはバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞内で産生される、結果として得られるＡＡＶビリオンを、当該技術分野において公知の標準方法によって精製及び分析する。

【0206】

アルカリ性ゲルアッセイ及び複製アッセイによる評価
アルカリ性ゲル電気泳動アッセイを用いて、パッケージングされた核酸のサイズを決定する。複製中心アッセイを用いて、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターが両方のパッケージング法によって無傷な形態でパッケージングされているかどうかを決定する。

【0207】

プライマー伸長アッセイを用いて、完全な末端を有する、すなわち、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ（センス鎖）または３’ＩＴＲ（アンチセンス鎖）内のヘアピンループの５’末端において終結している、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター核酸の量を定量化する。

【0208】

あるいは、ＰＣＲアッセイを用いて、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター核酸が完全な末端を有しているかどうか、すなわち、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ（センス鎖）または３’ＩＴＲ（アンチセンス鎖）内のヘアピンループの５‘末端において終結しているかどうかを決定する。

【0209】

Ｒａｇ２マウスにおける評価
一過性に形質移入された２９３細胞またはバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞パッケージングベクターにおいて産生されるＡＡＶビリオンを、静脈内投与される、２ｅ１１、２ｅ１２、及び２ｅ１３ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｋｇで、Ｒａｇ２マウスにおいて、ＦＶＩＩＩの発現及び活性について試験する。ＦＶＩＩＩの発現及び／または活性は、ＡＡＶウイルスまたはヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対する宿主免疫応答の存在によって複雑化されないため、Ｒａｇ２マウスをこのアッセイで使用する。

【0210】

ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて、ＦＶＩＩＩ抗原を決定する。ＦＸａ活性化アッセイ及び／または凝固アッセイを用いて、ＦＶＩＩＩ活性を決定する。ＦＶＩＩＩ抗原及び活性アッセイを用いて、ＦＶＩＩＩ比活性を決定する。

【0211】

現在好ましいその実施形態を考慮することによって、本発明の実施における多数の変更形態及び変形形態の発生が当業者に予期される。したがって、本発明の範囲に置かれるべき唯一の限定は、添付の特許請求の範囲に現れるもののみである。

【0212】

実施例４
改善されたプロモーター／エンハンサー配列を有するコンストラクトの作製
機能性ＦＶＩＩＩの発現を増加させる強力なプロモーターを有するさらなる組換えＡＡＶベクターを作製するために、改変されたエンハンサー及び／またはプロモーター配列を有するコンストラクトを作製した。いくつかの実施形態において、コンストラクトは、短縮型のＡｐｏＥまたはμ－グロブリンエンハンサーを含んだ。これらのコンストラクトを標準的なＤＮＡクローニング技術を用いて作製し、その配列を、配列番号９～４５に示す。

【0213】

実施例５
ＡＡＶウイルス粒子の作製
組換えバクミドの作製
ＤＨ１０ Ｂａｃコンピテント細胞を、氷上で解凍した。組換えシャトルプラスミド（例えば、ｐＦＢ－ＧＦＰ）を添加し、コンピテント細胞と穏やかに混合し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、コンピテント細胞を、約４２℃の温度で３０秒間加熱し、次いで、２分間冷却した。コンピテント細胞を、４２℃で３０秒間熱ショックし、氷上で２分間冷却した。ＳＯＣを細胞に添加し、撹拌しながら３７℃で４時間インキュベートして、組換えを起こさせた。インキュベーション期間中、２枚のＬＢプレート（形質転換のための種々の抗生物質（例えば、カナマイシン、ゲンタマイシン、及びテトラサイクリン）を追加で含有する上にＸ－ｇａｌを塗布し、続いてＩＰＴＧを塗布した。

【0214】

ある量のインキュベーション混合物が得られ、これを希釈し、次いで、２枚のＬＢプレート上に塗布し、３７℃で約３０～４８時間インキュベートした。いくつかの白色コロニーを、各プレートから選択し、ＬＢプレート中に与えられた同じ抗生物質の組み合わせを含有するＬＢ培地中で一晩培養した。次に、バクミドＤＮＡ及びグリセロールストックを調製し、－８０℃で保存した。

【0215】

組換えバクミドＤＮＡの精製
ある量のバクミドグリセロールストックを取り出し、上述のＬＢプレート中に与えられた同じ抗生物質の組み合わせを含有するＬＢ培地中で培養する。培養物を３７℃で一晩、振盪させながら増殖させる。次に、ある量のこの培養物を、微量遠心管内で、最高速度で約３０秒間スピンさせる。

【0216】

ピペットを用いて、ペレットを再懸濁緩衝液中で再懸濁し、次に溶解緩衝液中で再懸濁し、管を数回反転させて緩衝液を混合し、次いで、室温で約５分間インキュベートした。例示的な再懸濁緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＣＬ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１００ｕｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａを含む。例示的な溶解緩衝液は、２００ｍＭのＮａＯＨ及び１％ ＳＤＳを含む。ある量の沈殿緩衝液（例えば、３．０Ｍの酢酸カリウムを含む緩衝液、ｐＨ５．５）をゆっくりと加え、管を数回反転させて緩衝液を混合し、次いで、氷上で約１０分間インキュベートした。管を最大速度で約１０分間遠心し、上清を、イソプロパノールを含有する管内に注ぎ入れる。管を数回反転させて、溶液を混合した。

【0217】

次に、この溶液を、室温で約１５分間、最大速度で遠心し、ピペットを用いて、遠心分離した直後に上清を取り除いた。

【0218】

ある量の７０％エタノールを添加して、ペレットをすすぎ、最大速度で１分間再度スピンした。次いで、エタノールを除去し、溶液を再度スピンして、微量のエタノールを取り除く。ある量のＴＥ／ＥＢ緩衝液を各管に添加し、ペレットをピペットで注意深く溶解させる。すぐに使用しない場合は、この溶液を－２０℃で保存した。

【0219】

組換えバキュロウイルスのＰ０ストックの生成
Ｓｆ９細胞を、６ウェルプレート中の約１×１０^６細胞／ウェル（または１０ｃｍウェルプレート中の６×１０^６細胞または１５ｃｍ皿中の１．７×１０^７細胞）で播種し、細胞をトランスフェクション前に少なくとも１時間付着させた。

【0220】

トランスフェクション溶液Ａ及びＢを以下のとおりに調製する：溶液Ａ：ある量のバクミドを、１５ｍＬ管内の抗生物質を含有しないある量の無血清培地中に希釈した。溶液Ｂ：ある量のＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎを、１５ｍＬ管内の抗生物質を含有しないある量の無血清培地中に希釈した。溶液Ｂを、溶液Ａに添加し、ピペットで約３回、ピペットで穏やかに混合し、室温で３０～４５分間インキュベートした。次に、プレートからの培地を吸引し、抗生物質を含有しないある量の無血清培地を添加し、細胞を洗浄した。抗生物質を含有しないある量のＳＦ９００ＩＩを、脂質－ＤＮＡ混合物を含有する各管に添加した。

【0221】

細胞からの培地を吸引し、トランスフェクション溶液を細胞に添加し、細胞を２８℃で約５時間インキュベートした。トランスフェクション溶液を除去し、ある量の無血清培地及び抗生物質を添加し、２８℃で約４日間インキュベートした。組換えバキュロウイルスを含有する培地を収集し、１０００ｒｐｍで約５分間回転させて、細胞残屑を除去した。バキュロウイルスを、４℃暗下で保存した。

【0222】

バキュロウイルス（Ｐ１）の増幅
Ｓｆ９細胞を、約４×１０^６細胞／ｍＬに増幅させ、振盪フラスコ内で新鮮な培地で約２×１０^６細胞／ｍＬに希釈した。ある量のＳｆ９細胞に、ある量のＰ０ストックバキュロウイルスを感染させた。感染多重度（ＭＯＩ）は、約０．１である。

【0223】

Ｓｆ９細胞を、約３日間インキュベートし、バキュロウイルスを回収した。細胞を２，０００ｒｐｍで５分間スピンして、細胞をペレット状にし、上清を収集し、４℃暗下で保存した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＲａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒキットプロトコルに従って、バキュロウイルスの力価を決定した。

【0224】

Ｐ１組換えバキュロウイルスを用いたＡＡＶの生成
Ｓｆ９細胞を、約１×１０^７細胞／ｍＬに増殖させ、約５×１０^６細胞／ｍＬに希釈した。ある量の希釈したＳｆ９細胞に、Ｂａｃ－ベクター（５Ｍｏｉ）及びＢａｃ－ヘルパー（１５Ｍｏｉ）を３日間感染させた。３日目に細胞生存を評価した（約５０％～７０％の死細胞が観察される）。

【0225】

細胞ペレットを、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により回収した。培地を除去し、細胞を溶解させた（または、すぐに使用しない場合は、細胞ペレットを、－２０℃で保存した）。

【0226】

溶解及びバンド形成／精製プロトコル
ある量のＳｆ９溶解緩衝液及びベンゾナーゼを各細胞ペレットに添加し、十分にボルテックスして、細胞を再懸濁させる。再懸濁させたＳｆ９細胞を、氷上で約１０分間インキュベートして、溶解物を冷却した。溶解物を約２０秒間超音波処理して、細胞を十分に溶解させ、次いで、３７℃で約３０分間インキュベートした。

【0227】

ある量の５Ｍ ＮａＣｌを添加し、混合物をボルテックスし、次いで、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ある量のＮａＣｌを添加して、塩濃度を約５００ｍＭにし、ボルテックスし、８，０００ｒｐｍ、１５℃で２０分間遠心分離して、清澄な溶解物を生成した。

【0228】

清澄な溶解物を、超遠心分離工程に進ませる。ＣｓＣｌ勾配は、長い針を有する注射器を通じて、初めに清澄な溶解物を添加し、次いで、ある量の１．３２ｇ／ｃｃ及びある量の１．５５ｇ／ｃｃ ＣｓＣｌ溶液を添加することにより調製した。ＣｓＣｌ溶液間の接触面に印を付けた。ＰＢＳを、遠心管の頂部まで添加し、管を注意深く平衡させ、密封した。

【0229】

管を５５，０００ｒｐｍ、１５℃で約２０時間遠心した。各管の頂部に穴をあけ、２つのＣｓＣｌ溶液の接触面マークの少し上に位置するＡＡＶバンドに印を付ける。

【0230】

ＡＡＶ溶液を７０．１Ｔｉローター用遠心管に移すことによって、第２のＣｓＣｌ遠心分離を行い、管の頂部近くまである量のＣｓＣｌ溶液を添加した。管を平衡させ、密封した。管を６５，０００ｒｐｍで約２０時間遠心分離し、ＡＡＶバンド（より低いバンド、より高いバンドは空のカプシドである）を収集した。

【0231】

実施例５
Ｒａｇ２マウスにおけるコンストラクトの評価
コドンを最適化したＳＱ ＦＶＩＩＩをコードする遺伝子配列を含むＡＡＶビリオンを、図１のＦＶＩＩＩベクター、Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、Ｐｒｏｔｏ２Ｓ、及びＰｒｏｔｏ３Ｓコンストラクトを用いた、バキュロウイルス及び２９３細胞を用いて作製した。パッケージングの限界は、バキュロウイルスの場合は約４８００ｂｐ、２９３細胞の場合は約４９５０ｂｐである。

【0232】

図５に示すように、切断型（Ｔ）または非切断型（ＮＴ）のゲノムで試験したすべてのコンストラクトは、ＦＶＩＩＩ配列を形質導入することができる。Ｐｒｏｔｏ１からのＦＶＩＩＩの発現は、これらのＡＡＶがバキュロウイルス系によって作製された場合に、図１のＦＶＩＩＩコンストラクトと同様であった。２Ｓ及びＰｒｏｔｏ３Ｓにおけるイントロンの包含は、Ｐｒｏｔｏ１と比較して、改善したＦＶＩＩＩの発現をもたらさなかった。２９３細胞内で作製されたＡＡＶフランキング配列を含有する図１のＦＶＩＩＩベクターは、バキュロウイルス内で作製されたＡＡＶ配列を欠く同じベクターよりもさらに強力であった。結果として、有効性及び関連ＦＶＩＩＩ発現を増加させる試みにおいて、さらなるエンハンサーを、Ｐｒｏｔｏ１、例えば、コンストラクト１０１、１０２、１０２及び１０４に添加した。

【0233】

実施例６
改善されたプロモーター／エンハンサー配列を有するＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの発現及び活性
さらなる組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの発現及び活性を、流体力学的注射プロトコルを用いて試験した。流体力学的送達は、インビボで様々な組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの効率をスクリーニングするための迅速な方法である。具体的には、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩプラスミドＤＮＡは、上述のように作製し、次いで、ＴｒａｎｓＩＴ－ＱＲ流体力学的送達溶液中で希釈した。プラスミドＤＮＡを、（マウス重量（ｇ）／１０）＝０．１ｍｌの送達溶液）によって決定される体積で、５～６週齢Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１８～２５ｇ）の尾静脈に注射した。注射時間は、５秒間未満であった。次いで、各マウスからの血漿を、注射から４８時間後に収集し、発現されたＦＶＩＩＩタンパク質の量を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。注射したマウスの血漿中のＦＶＩＩＩの量を、ＥＬＩＳＡ試験を用いて測定し、組換えＦＶＩＩＩ（Ｘｙｎｔｈａ ＳＱ等価）を、比較のための標準物質として用いた。

【0234】

ＦＶＩＩＩ発現を調査するために、本発明のある特定の組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩコンストラクトは、インビボで機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の発現をもたらすそれらの能力を測定するために、流体力学的注射プロトコルにおいて試験した。図６に示されるように、５μｇのプラスミド投与で試験したすべてのコンストラクトは、様々な効率レベルで機能性ＦＶＩＩＩを生成した。

【0235】

図７及び８は、本発明の様々な組換えＡＡＶ ＦＶＩＩＩコンストラクトの１μｇのプラスミド投与のための流体力学的注射についてのデータを提供する。図７及び８に示されるように、試験された様々なコンストラクトの注射はすべて、様々な効率レベルでＦＶＩＩＩタンパク質のインビボでの発現をもたらした。

【0236】

実施例７
ｐ－１００ ＡＴＧＢベクターを含むＡＡＶウイルスの分析
配列番号４５として本明細書に示されるＦＶＩＩＩ－ＳＱをコードするベクターｐ－１００ ＡＴＧＢを含むＡＡＶウイルス（「ＡＡＶ５－ｐ１００ＡＴＧＢ－ＦＶＩＩＩ」）を、生成し、上の実施例５に記載される、Ｒａｇ２マウスにおける機能性ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質を発現する能力について評価した。より具体的には、Ｒａｇ２マウスを、６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、２Ｅ１３ｖｇ．ｋｇ、または６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのいずれかの投与でＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱウイルスまたはＡＡＶ５－ｐ１００ＡＴＧＢ－ＦＶＩＩＩウイルスの単回投与で投与し、その後に、ＦＶＩＩＩタンパク質濃度を、マウスの血流中で決定した。これらの分析の結果は、ＡＡＶ５－ｐ１００ＡＴＧＢ－ＦＶＩＩＩウイルスの投与が、試験した２つのより低量のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱウイルスを投与したよりも、循環機能性ＦＶＩＩＩタンパク質レベルが約３倍高かったことを示した。試験した最高用量でさえ、ＡＡＶ５－ｐ１００ＡＴＧＢ－ＦＶＩＩＩウイルスが、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱウイルスを投与したよりも、循環機能性ＦＶＩＩＩタンパク質レベルが高かったが、観察された発現の差は、試験した最高用量で若干弱毒化した。これらの結果は、ＡＡＶ５－ｐ１００ＡＴＧＢ－ＦＶＩＩＩウイルスがインビボで肝細胞を有効に形質導入し、機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の高いレベルの発現を提供することを示す。

【0237】

実施例８
血友病Ａのための特定の組換えＦＶＩＩＩ ＡＡＶベクター／ウイルスの研究
血友病Ａ（ＨＡ）は、５，０００人の男性に１人の男性が冒されるＸ連鎖劣性出血性障害である。内因性凝固カスケードにおける必須の補助因子、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性の不足により生じる。この障害は、新規の変異体または後天性免疫プロセスのいずれかにより遺伝し得、ＦＶＩＩＩの不十分な量または機能不全性ＦＶＩＩＩをもたらすが、すべては、凝血障害プロセスを特徴とする。ＨＡ患者の臨床表現型は、大部分は、残留発現のレベルによって制御される。重度のＨＡは、１％未満の野生型のＦＶＩＩＩ活性（１ＩＵ／ｄＬ未満）に分類され、中程度の疾患は、１～５％の野生型の活性（１ＩＵ／ｄｌ～５ＩＵ／ｄｌ）を含み、軽症型は、５～４０％の活性（５ＩＵ／ｄｌ～４０ＩＵ／ｄｌ）である。重度のＨＡの臨床症状は、しばしば、主に、関節及び軟組織において、依然として自然出血症状発現の状態であり、脳が関与する場合には、出血からの死亡のリスクを大幅に増加させる。

【0238】

重度のＨＡの治療は、現在、出血症状発現を予防または制御するために、それぞれ、予防として１週間につき２～３回及び出血時の両方で、血漿由来または組換えＦＶＩＩＩタンパク質（ｒｈＦＶＩＩＩ）の濃縮物の静脈内注射からなる。ｒｈＦＶＩＩＩの半減期（最も承認された生成物において２４時間下で）は、頻繁な注入を必要とし、ＨＡの治療における大きな進歩であるが、重度のＨＡ患者においては、治療中に複数の出血事象を継続して有することはよく見られる（オンデマンド治療において最大３０～５０の予防法を有する、平均１～７の症状の発現／年）。複数の出血事象の結果は、衰弱させる多関節の関節症の一因となり、その後、死亡のリスクを大幅に増加させる、基礎病理の発生である。化学的修飾（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの直接複合）及びＦＶＩＩＩ（例えば、ＦＶＩＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質）の生体工学は、半減期を約５０％向上させ、それ故に、期待できる投与の減少、及び活性レベルのトラフを１％超に維持することを示す。しかしながら、これらの長時間作用するＦＶＩＩＩは、重度のＨＡ患者において、ＦＶＩＩＩ活性の臨界値を維持するために頻回注入に依存したままである。したがって、患者に、正常かつ出血のない生活に適合するＦＶＩＩＩレベルを与えるためのＨＡの完全な予防的治療への強い満たされない要求がある。

【0239】

遺伝子治療は、活性なＦＶＩＩＩの連続的な内因性生成し、適切な遺伝子配列を有するベクターの単回静脈内投与による疾患修飾性療法の可能性を提供する。血友病Ａは、臨床症状が血漿中で微量（２００ｎｇ／ｍｌ）に循環する単一遺伝子生成物（ＦＶＩＩＩ）の欠如に起因するため、遺伝子置換アプローチによく適している。遺伝子発現の厳重に調節される制御は、必須ではなく、ＦＶＩＩＩのレベルの軽度増加（血漿中濃度のいかなる増加（２ｎｇ／ｍｌ）により、１％の活性の増加を促す）は、重症型の疾患を改善し得る。それ故に、内因性ＦＶＩＩＩ活性の比較的小さい変化は、疾患表現型の臨床的に関連する改善をもたらす。最後に、遺伝子の導入への反応は、構築された実験技術を用いて容易にアッセイされる定性的エンドポイントよりも有効な定量的エンドポイントを用いて評価され得る。

【0240】

ＦＶＩＩＩ置換においていくつかの異なる遺伝子導入戦略が評価されているが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、最も有望であることを示す。それらは、卓越した明確な安全性プロファイルを有し、肝臓等の特定組織に対して（とりわけ、血清型２、５、及び８に対して）、長期間の導入遺伝子の発現を向性に向かわせ得る。実際に、関連疾患である血友病Ｂに対して継続的な遺伝子治療臨床試験は、重度から中等度または軽度の出血表現型の変換には十分であるレベルでヒト第ＩＸ因子の安定した（３６ヶ月超の）発現が組換えＦＩＸ ＡＡＶ－８ベクターの単回末梢静脈投与後に達成可能であることを確立している。この試験の数人の参加者は、これまでは出血をもたらした行動を行った時でさえ、自然発症型出血に苦しむことなく、予防因子を中断することができた。それ故に、遺伝子療法治療は、彼らの生活の質において大幅な改善をもたらした。

【0241】

さらなる前臨床研究
組換えＦＶＩＩＩ－ＳＱをコードするベクターＰｒｏｔｏ１（本明細書において、図２Ａ及び配列番号１に示される）は、上述のように、バキュロウイルス／Ｓｆ９に基づいた発現系を用いて組換えＡＡＶ５ ＦＶＩＩＩ－ＳＱコードウイルスを生成するために使用された。作製されたウイルス（本明細書では、「ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ」と称される）は、精製され、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含有する０．００１％ポロキサマー１８８において、前臨床動物試験のために製剤化された。

【0242】

ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ非臨床的プログラムは、ヒト患者における組換えウイルスの単回ＩＶ投与を支持するために、形質導入、ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質の相対発現及び活性、ならびにＡＡＶ５カプシドの全安全性プロファイル及びＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱのＦＶＩＩＩ－ＳＱ導入遺伝子の生成物成分を明らかにするために設計された。ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの非臨床的プロファイルは、インビトロ研究の１つ、マウスにおける１０の単回投与研究、正常な野生型（ＷＴ）、Ｒａｇ２－／－（Ｂ６．１２９Ｓ６－Ｒａｇ２ｔｍ１Ｆｗａ Ｎ１２）、及び第ＶＩＩＩ因子－／－（Ｂ６；１２９Ｓ－Ｆ８ｔｍ１Ｋａｚ／Ｊ）（Ｒａｇ２－／－マウス（Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－）、ならびにカニクイザル及びアカゲザルと交配させた）を通して評価された。

【0243】

薬力学的（ＰＤ）評価は、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ遺伝子療法が、（ｉ）マウスにおける、ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）（ｒｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ；欧州では、ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）として、米国では、Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）として市販）と比較して、正しくサイズ指定されたＦＶＩＩＩ－ＳＱ（軽鎖及び重鎖）の血漿発現をもたらす、（ｉｉ）ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの投与が、体外から投与されたＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）と同様に、用量依存的な様式において、血友病Ａのマウスモデルにおいて凝血障害を治療した、ならびに（ｉｉｉ）ＩＶ注入を介した提案された臨床投与経路は、血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性、または対応する肝臓ＲＮＡ及びＤＮＡレベルをマウスにおいて比較する時に、ボーラス投与と同様またはそれよりも良好である可能性があることを実証した。

【0244】

非ヒト霊長類における一時的ＦＶＩＩＩ－ＳＱ発現は、種特異であると思われ、ヒト患者において安定した導入遺伝子の発現を達成した他の臨床研究において見られたような、診療所において生じることは予期されない。免疫原性は、診療所において厳重にモニタリングされ、タンパク質発現との関係が評価されよう。

【0245】

全非臨床的プログラムは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ及びその主な成分、ＡＡＶ５カプシド及び導入遺伝子生成物ＦＶＩＩＩ－ＳＱによる毒性の可能性を考慮した。ＦＶＩＩＩ－ＳＱは、市販の組換え因子置換治療、ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）と同じアミノ酸配列を有する。毒物学的プログラムの設計は、標的臓器の特定、相対的血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び相対的活性、免疫原性及び肝臓ＤＮＡゲノム及びＲＮＡを含む、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの毒性学的プロファイルを特徴付けることを目的とした。４週及び１３週の追跡期間を有する正常なＣＤ－１マウスにおける、あるＧＬＰ単回投与研究を、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを用いて行った。Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウス及び正常なサルにおけるＰＤ研究は、組織学及び臨床病理学のさらなる毒性パラメータを含んだ。

【0246】

ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの非臨床的安全性プロファイルは、以下の免疫原性の予測された観察を含んだ：（ｉ）すべてのＡＡＶ５ベクターで処置された免疫応答性動物（ＣＤ１マウス及びサル）の血漿中の抗ＡＡＶ５抗体の検出、ならびに（ｉｉ）免疫応答性動物における抗ＦＶＩＩＩ－ＳＱ抗体の検出が、ＦＶＩＩＩ発現または活性と相関しなかったが、６Ｅ１２または６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを施された４匹のサルにおいて僅かにＡＰＴＴの延長におけるコントリビュータであり得ることが１匹のマウス及び数匹のサルにおいて観察された。抗体レベルは、成熟Ｂ及びＴリンパ球を欠き、抗体応答を引き起こすことができないため、Ｒａｇ２－／－由来マウスにおいて決定されなかった。しかしながら、サルＦＶＩＩＩを用いた抗ＦＶＩＩＩ－ＳＱ抗体の種間交差反応は、評価されず、凝血中の抗体の影響に関する確固たる結論を不可能にした。非用量依存的な最小から軽度の腎炎が、８週間後のＲａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスにおいて観察され、腎臓機能障害を示す腎臓臨床化学パラメータの対応する変化はなかった。腎臓所見は、１３週間後にＣＤ－１マウスにおいて観察されず、このことは、異種タンパク質への株特異的な反応を示唆した。肝臓臨床化学においてＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱに関連した変化は、肝機能性障害または細胞毒性を示し得るサルにおいて観察されなかった。順応及び研究期間を通して体重減少により、１４日目に、６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇを施されたアカゲザルの予定該の殺処分が行われ、死亡率は、持続する体重減少及び進行中の大腸所見により、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱと関連しないと見なされた。肝臓臨床化学パラメータの変化を含む、他のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱに関連した所見は、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを施された、カニクイザルまたはアカゲザルにおいて顕著であった。

【0247】

特異的な所見は、予測された免疫原性以外にはＦＶＩＩＩ－ＳＱ導入遺伝子生成物とは関連性がなかった。ＦＶＩＩＩ－ＳＱ導入遺伝子生成物が市販の酵素処理、ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）と同じである最終配列を有するため、固有のＦＶＩＩＩ特異的標的臓器毒性は、特定されなかった。

【0248】

予測された免疫原性に加えて、固有のＡＡＶ５カプシド関連の毒性は、非臨床的プログラムにおいて観察されなかった。ＡＡＶカプシドの免疫原性は、非臨床的及び臨床プログラムにおいてモニタリングされよう。

【0249】

正常及び疾患モデルマウスの両方ならびに限定された数のサルは、概念実証を確立し、６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＦＩＨ投与量を選択するために、潜在的な種のスケーリング及び用量反応を評価するために使用された。開始用量は、マウス（正常及び疾患モデル、Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－）及びサルにおいて行われた前臨床研究からの全データを考慮した。活性に基づいて検出可能な薬理学的反応は、マウス及び２種のサルにおいて、６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇで観察された。さらに正確な用量推奨を確定し得るような、マウスとカニクイザルとアカゲザルの間で一貫した種間スケーリングは、見られなかった。１０倍の安全マージンは、投与した最高用量で正常マウスにおけるＧＬＰの１３週間研究において、６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱのＮＯＡＥＬに基づいた。臨床観察または化学のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱに関連した変化は、８週間後の１０倍の安全マージンである、最大６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量でマウスにおいて観察されなかった。全体としては、すべての動物における抗ＡＡＶ５抗体の予測された形成及び免疫コンピテント動物における抗ＦＶＩＩＩ－ＳＱ抗体の低力価の限定された形成を除いた、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱに関連した所見は、正常マス及びサルにおいて、それぞれ、最大投与用量の６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇでは観察されなかった。

【0250】

インビトロで１つ、及びインビボで９つの研究が、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ（６つの非ＧＬＰマウス研究及び３つの非ＧＬＰサル研究）の主要薬力学的（ＰＤ）を評価するために行われた。すべての研修は、単回投与であり、静脈内（ＩＶ）投与経路を使用した。提案された臨床投与経路は、最長６０分間のＩＶ注入である。このプログラムにおける動物の大部分は、ＩＶボーラス注射を介してＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱが投与され、そのため、ＦＶＩＩＩ－ＳＱ発現における投与期間の評価（３０分間のＩＶボーラス対注入）は、１つのマウス研究を評価した。２Ｅ１０～２Ｅ１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを施されたマウスにおける２つの用量反応研究は、８週間後の肝臓におけるＤＮＡ及びＲＮＡの発現を含む、ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性の血漿濃度のＰＤ関係を確立した。１つのマウス研究は、製造のために、バキュロウイルス感染細胞株の選択を支持した。１つのマウス研究は、４週間及び１３週間にわたって、肝臓ＤＮＡ及びＲＮＡと共に、血漿ＦＶＩＩＩタンパク質及び活性を評価した。１つのマウス研究は、凝血の機能的評価として出血時間を評価した。２つのサル研究は、製造のために、ベクターＡＡＶ５及びバキュロウイルス感染細胞株の選択を支持した。第３のサル研究は、カニクイザル及びアカゲザルにおけるＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱのＰＤ効果を比較した。

【0251】

ＰＤエンドポイント（血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性、肝臓ＤＮＡベクターゲノム及びＲＮＡ転写コピー）は、マウス及びサル研究において評価した。肝臓ＤＮＡベクターゲノム及びＲＮＡ転写コピーは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱによる肝臓の形質導入を確認するために評価された。血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱ導入遺伝子の肝臓発現のバイオマーカーとして使用された。いくつかの毒性エンドポイントは、２種にわたる用量関係を評価するために、１つのマウス研究（組織学）及び３つのサル研究（臨床病理学）に組み合わせられた。

【0252】

Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスにおけるＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの薬力学的評価
この研究の目的は、６Ｅ１２または６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与された雄Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスにおける単回ＩＶ投与から４週間及び１３週間にわたるＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの一次ＰＤを評価することであった。ＰＤエンドポイントは、血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性レベル、ならびに肝臓ＦＶＩＩＩ－ＳＱ ＲＮＡ及びＤＮＡの存在を含んだ。６匹の雄Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスは、研究開始時に８週齢であった。動物は、６つの群（１０／群）に無作為に割り当てられ、尾静脈を介して、ビヒクル、６Ｅ１２または６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱのいずれかの単回ＩＶ注射が与えられた。

【0253】

適切なモノクローナル抗体は、ＦＶＩＩＩ重鎖についてはＧＭＡ８０２３、ＦＶＩＩＩ軽鎖についてはＧＭＡ８００１を、２μｇ／ｍｌの最終濃度で一晩プレート上にコーティングされた。翌日、ウェルを、緑色希釈剤でブロックし、群４及び群６からのマウス血漿サンプル（５０ｕｌ）、またはＸｙｎｔｈａ（登録商標）（５００ｎｇ／ｍｌ）を添加された正常マウスサンプルを、等体積の緑色希釈剤で希釈し、１００μｌの混合物を、ＦＶＩＩＩ重鎖または軽鎖の濃縮のために個々のウェルに添加した。濃縮された血漿サンプルを、還元ポリアクリルアミドゲルを変性することによって分解し、ウエスタン分析のためのニトロセルロース膜に移した。ＦＶＩＩＩ重鎖を、ビオチン共役抗ＦＶＩＩＩポリクローナル（ＳＡＦＣ－ＡＰＢＩＯ、０．５μｇ／ｍｌ）及びストレプトアビジン共役アルカリホスファターゼ（０．２５μｇ／ｍｌ）で連続インキュベーションによって検出した。ＦＶＩＩＩ－ＳＱ軽鎖を、抗ＦＶＩＩＩモノクローナル（ＧＭＡ８０２５、１．０μｇ／ｍｌ）及びロバ抗マウス共役アルカリホスファターゼ（０．２５μｇ／ｍｌ）で連続インキュベーションによって検出した。膜を、アルカリホスファターゼ基質（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｕｅ）を沈殿する比色分析を用いて現像し、画像化した。

【0254】

ウエスタンブロットによって６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物からの血清のＡＡＶ導入遺伝子由来のＦＶＩＩＩ－ＳＱ重鎖及び軽鎖の分子量の評価は、発現した血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱ重鎖及び軽鎖が、ｒｈＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質と同様の分子のサイズであったことを確立した。これは、潜在的に切断型のゲノムの代わりに、ＦＶＩＩＩ－ＳＱの重鎖及び軽鎖の両方の発現が、正しいサイズであったことを示す。かかる切断型のゲノムでベクターからのジスフェルリン及び血友病Ａ第ＶＩＩＩ因子の有効かつ機能的発現は、これまでに実証された。血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質の両鎖の分子量は、正しいサイズであり、対応するマウスは、ＦＶＩＩＩ－ＳＱ活性を有した。

【0255】

Ｒａｇ２－／－マウスにおけるＩＶボーラス及び注入研究
この研究の目的は、投与の５週間後にＲａｇ２－／－マウスにおける肝臓組織中での６．０Ｅ１２及び２．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＦＶＩＩＩ－ＳＱ ＤＮＡ及びＲＮＡの単回ＩＶボーラスまたは３０分間のＩＶ注入の効果、ならびに血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性レベルを比較することであった。６０匹の雄Ｒａｇ２－／－マウスは、研究開始時に約８週齢であった。動物は、６つの群（１０動物／群）に無作為に分配された。群１～３及び４～６に、それぞれ、尾静脈を介して、単回ＩＶボーラスまたは３０分間のＩＶ注入（ビヒクル、６．０Ｅ１２、または２．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ）を投与した。

【0256】

６．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において、ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱベクターゲノム／肝臓細胞は、それぞれ、ＩＶ注入及び低速ボーラス群において、５．０６Ｅ－２及び３．５０Ｅ－２であった。肝臓中のＦＶＩＩＩ－ＳＱ発現コピー／μｇ ＲＮＡは、それぞれ、ＩＶ注入及びボーラス群において、３．７６Ｅ４及び１．８７Ｅ４であった。２．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において、ＤＮＡ値は、注入群の場合は０．３４２ベクターゲノム／細胞であり、ボーラス群の場合は０．３１６ベクターゲノム／細胞であった。肝臓中のＦＶＩＩＩ－ＳＱ発現コピー／μｇ ＲＮＡは、注入群の場合は２．３５Ｅ５であり、ボーラス群の場合は１．５３Ｅ５であった。

【0257】

６．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ（低用量）を投与した動物において、ボーラスまたは３０分間の注入によってＩＶ投与した時の肝臓ＲＮＡ及びＤＮＡレベルまたは血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性の差がほとんどなかった。２．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において、ＩＶ注入による３０分間にわたる投与は、血清中のＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性をほぼ２倍にしたが、肝臓ＲＮＡ及びＤＮＡレベルは、同様のままであった。これらのデータに基づいて、ＩＶ注入を介した提案されたＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの臨床投与は、ボーラス投与と同様であるかまたはそれより良好である可能性が高い。

【0258】

Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスにおける出血時間の評価
この研究の目的は、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比較して、雄Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスにおけるＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの単回投与の８週間後の出血時間の機能性凝血エンドポイントを評価することであった。さらに、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ治療の８週間後の出血時間の変化は、ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）で処置したＲａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスにおいて達成された結果と比較された。１００匹の雄Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウス及び２０匹の雄の週齢を適合させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、研究開始時に約８週齢であった。動物を、４つの群（２０動物／用量）に無作為に分配し、尾静脈を介して、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの単回ＩＶ注射を投与した（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：ビヒクル、Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－：ビヒクル、２．０Ｅ１３または１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ）。

【0259】

ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）を投与したＲａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－動物は、出血時間及び体積の用量依存的な減少を有した。５０Ｕ／ｋｇのＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）を投与したＲａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－動物において、０．４９±０．３０ｇの平均血液損失及び１８．１±９．３９分の平均出血時間が観察された。２００Ｕ／ｋｇのＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）を投与したＲａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスにおいて、０．１３４±０．１９ｇの平均血液損失及び４．２９±６．１６分の平均出血時間があった。

【0260】

ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）及びＦＶＩＩＩ－ＳＱの血漿中濃度は、それぞれ、５０Ｕ／ｋｇのＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）及び２Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与したマウスにおいて同様であった。

【0261】

ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱのＲａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスへの投与は、投与から８週間後に血液損失体積及び出血時間の用量依存的な減少をもたらした。血液損失体積及び出血時間の用量依存的な減少は、投与から８週間後に観察された。１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において、血液損失及び出血時間は、ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）処置で達成された補正値と比較して、野生型レベルに対して補正された。ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの投与は、体外から投与されたＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）と同様に、用量依存的様式において、血友病Ａのマウスモデルにおける凝血障害を治すことができる。

【0262】

Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスにおける用量反応
２Ｅ１１～２Ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与したＲａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスにおいて、血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質または活性レベルは検出されなかった。

【0263】

本研究において、６０匹の雄Ｒａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウスは、研究開始時に約８週齢であった。動物を、６つの群（１０動物／用量）に無作為に分配し、尾静脈を介して、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの単回ＩＶ注射を投与した（ビヒクル、２Ｅ１２、６Ｅ１２、２Ｅ１３、６Ｅ１３、及び２Ｅ１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ）。

【0264】

ＦＶＩＩＩ－ＳＱ血漿タンパク質レベルは、概ね、１．５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ以上のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において用量依存的であった。ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質レベルは、１．７Ｅ１１ｖｇ／ｋｇ以下のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において定量レベルを下回った。ＰＤ活性は、概ね、用量と共に増加し、活性と相関性があった。１．８Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ以下のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において、動物間変動性が観察され、サブセットの動物のみが、血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱ及び活性の検出可能なレベルを有した。

【0265】

ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性レベルと一致して、ベクターゲノムコピー及び発現コピー（ＲＮＡ）が、１．５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ以上のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において観察された。ベクターゲノムＤＮＡコピー及び発現コピーＲＮＡ／μｇ ＲＮＡは、概ね、用量と共に増加した。

【0266】

ＦＶＩＩＩ－ＳＱ血漿タンパク質レベル、活性レベル、ならびにベクターゲノム及びＲＮＡレベルは、概ね、１．５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ以上のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与したＲａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－動物において用量依存的であった。１．５Ｅ１２（２匹の動物）または１．８Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ（１０匹のうち８匹の動物）を投与したサブセットの動物において、用量は、６．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの提案されたＦＩＨ臨床用量の階層内であり、活性は、正常の２．８～６６．４％の範囲であった。これは、結果として得られる血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性レベルが動物においてより一貫性のある反応を与える可能性があるため、臨床におけるＰＤ活性が、６．０Ｅ１２の用量レベルで達成され得ることを示す。

【0267】

カニクイザルにおけるカプシド選択
この研究の目的は、カニクイザルへの単回ＩＶボーラスとして投与した時の８週間にわたるＦＶＩＩＩ－ＳＱ導入遺伝子を用いた２つのカプシド（ＡＡＶ５．２ ＦＶＩＩＩ－ＳＱ及びＡＡＶ８．２ ＦＶＩＩＩ－ＳＱ、すなわち、それぞれ、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８カプシドタンパク質、及びＡＡＶ２ ＩＴＲ）の相対的活性を評価することであった。８匹の雄カニクイザルは、研究開始時に２．８～４．１歳であり、体重は、２．６～３．６ｋｇであった。すべての動物は、免疫枯渇させたカニクイザルの血清と比較して、抗ＡＡＶ５または抗ＡＡＶ８形質導入の阻害活性について予めスクリーニングした。動物は、４つの群に割り当てられ、単回低速ボーラス静脈内投与として、２．０Ｅ１２または２．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５．２－ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱまたはＡＡＶ８．２－ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱのいずれか（それぞれ、０．５及び５．０ｍＬ／ｋｇ）を投与した。

【0268】

ＡＡＶ５．２ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ及びＡＡＶ８．２ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱの単回注射の投与は、検出可能なレベルの血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質レベルをもたらし、これは、２．０Ｅ１３のベクター／ｋｇを投与したカニクイザルにおいて良好な耐容性を示した。肝臓臨床化学においてＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱに関連した変化は、観察されず、これは、肝機能性障害が観察されなかったことを示した。ＡＡＶ５カプシドが、継続した開発のために選択された。

【0269】

カニクイザルにおける単回投与ＩＶ研究
この研究の目的は、カニクイザルへの単回ＩＶボーラスとして投与した時の８週間にわたる２つの細胞株（バキュロウイルスに感染したｓｆ９昆虫及びヒト２９３細胞）で生成された２つの生産ロットのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの相対的活性を評価することであった。８匹のナイーブ雄サルは、処置開始時に３．９～４．３歳であり、体重は、２．８～４．３ｋｇであった。すべての動物は、研究への割り当て前に、抗ＡＡＶ５抗体及びＡＡＶ５形質導入の阻害活性について予めスクリーニングした。各サル（２／用量群）は、単回低速ボーラスＩＶ注射（２Ｅ１３及び６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ）を受け、８週間観察された。

【0270】

相対的血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質レベルは、８週間にわたって評価された。可能なＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱに関連したＡＰＴＴの延長は、抗ＦＶＩＩＩ抗体形成を有する動物において観察された。これは、外因性因子置換においては既知の潜在的な免疫原性の結果である。肝臓臨床化学においてＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱに関連した変化は、観察されず、これは、肝機能性障害が観察されなかったことを示した。血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱレベルは、３～６週間にわたって増加したが、その後減少した。

【0271】

ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与したすべての動物は、投与の２週間後に、血漿中にＦＶＩＩＩ－ＳＱのレベルを発現した。全般に、ＦＶＩＩＩ－ＳＱレベルは、経時的に増加し、その後、８週目までに減少した。血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱのピークレベルは、４．８ｎｇ～６７．４ｎｇのＦＶＩＩＩ－ＳＱ／ｍｌの範囲であった。

【0272】

カニクイザル及びアカゲザルにおける単回投与ＩＶ研究
６Ｅ１２及び２Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与したカニクイザル及びアカゲザルにおいて、ＦＶＩＩＩ－ＳＱの相対的発現が６週間にわたって評価された。肝臓臨床化学においてＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱに関連した変化は、観察されず、これは、肝機能性障害がないことを示した。血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質レベルは、アカゲザルと比較して、カニクイザルにおいて高かった。血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱレベルは、４～５週間にわたって増加したが、その後減少した。肝臓ベクターゲノムＤＮＡは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与しすべての動物において検出され、これは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ形質導入レベルが、すべての動物において生じたことを暗示した。肝臓ＦＶＩＩＩ－ＳＱ ＲＮＡコピーが、血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質を発現した動物において観察された。肝臓臨床化学においてＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱに関連した変化は、生存サルにおいて観察されず、これは、肝機能性障害が観察されなかったことを示した。

【0273】

結論
全体的に見て、複数のＲａｇ２－／－×ＦＶＩＩＩ－／－マウス研究において、血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び正常ヒト活性の割合（％）は、一般に、用量に比例していると思われ、肝臓におけるＤＮＡ及びＲＮＡについても同様であった。ＦＶＩＩＩ－ＳＱ活性及びタンパク質レベルは、一般に、マウスにおいてＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの単回投与後に時間と共に増加したが、ＲＮＡは、時間と共に肝臓において増加した。血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質の発現及び活性は、これらの研究において相互関係を示す傾向があった。血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱレベル及び活性によって証明されるように、６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ以下のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において、動物間及び研究間で高い変動性があった。血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質レベルの一貫性がある発現は、６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ以上のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した動物において観察された。

【0274】

２Ｅ１２～６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを投与した限られた数のサルにおいて、血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱレベルは、６Ｅ１２ｖｇ／ｍＬ以上投与した動物において検出されたが、検出可能な血漿レベルは、２Ｅ１２ｖｇ／ｋｇを投与した動物においては観察されなかった。

【0275】

カニクイザルにおいて行われた研究において、ＦＶＩＩＩ－ＳＱの発現は、投与の３～５週間後にピークであり、場合によっては、検出の限界を下回るレベルまで研究終了にかけて減少した。場合によっては、抗ＦＶＩＩＩ抗体は、血漿中のＦＶＩＩＩ－ＳＱレベルがピークになる前、またはピークになった後の動物において検出された。しかしながら、抗体は、ＦＶＩＩＩ－ＳＱの減少した発現を有するすべての動物において検出されたわけではなく、このことは、他の潜在的な機構が、細胞毒性Ｔ－リンパ球（ＣＴＬ）媒介性の形質導入細胞のクリアランス等の発現を阻害すること、またはあるいは、発現の他の非特異的な阻害剤を示唆した。非ヒト霊長類における一時的ＦＶＩＩＩ－ＳＱ発現は、種特異であると思われ、診療所において生じることは予期されない。

【0276】

サルにおけるＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの単回ＩＶボーラスは、提案された臨床開始用量６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇから６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱで血漿中に測定可能なＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質レベルをもたらし、マウスにおけるＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの投与は、比較可能な用量範囲にわたって研究において一貫して観察される血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性レベルをもたらした。第１／２相ヒト臨床試験の提案された開始用量、６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱは、サル及びマウスの両方において検出可能な血漿ＦＶＩＩＩ－ＳＱタンパク質及び活性レベルも有した１０倍の安全因子に基づいて選択され、治療量以下の結果の可能性を低下させた。

【0277】

重度の血友病Ａに罹患しているヒト患者におけるＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの用量漸増安全性、耐容性、及び有効性研究
本研究において、図２ＡのＰｒｏｔｏ１ ＦＶＩＩＩ－ＳＱベクターを含む組換えＦＶＩＩＩ ＡＡＶビリオン（配列番号１）は、単回静脈投与によってヒト患者に送達されよう。この研究は、ベクターを形質導入した肝臓組織から合成される、血漿中に安定した潜在的に生涯にわたる活性ｈＦＶＩＩＩの発現を達成するために設計される。この臨床研究は、ベクター用量と残留ＦＶＩＩＩ活性の増加との関係、及びこれらのレベルが、臨床表現型を変えるのに十分であるかどうかを評価するために設計された初のヒト研究である。用量と安全性の関係は、重度のＨＡに罹患している患者におけるｈＦＶＩＩＩの活性と相関関係を示すであろう。

【0278】

この研究の第一の目的は、（ｉ）ヒトＦＶＩＩＩ－ＳＱをコードする組換えＡＡＶの単回静脈投与の安全性を評価することと、（ｉｉ）注入の１６週間後に、正常活性の５％以上（５ＩＵ／ｄＬ未満）でＦＶＩＩＩの発現を達成するのに必要とされるＦＶＩＩＩ－ＳＱをコードする組換えＡＡＶの用量を決定することである。血友病Ａに罹患している個体におけるＡＡＶ媒介性のＦＶＩＩＩ活性の動力学、持続時間、及び大きさが、決定され、適切な用量に対して相関関係を示すであろう。

【0279】

この研究の第二の目的は、（ｉ）組換えＦＶＩＩＩ ＡＡＶウイルスの全身投与後のＦＶＩＩＩ導入遺伝子及び／またはＡＡＶカプシドタンパク質に対する免疫応答を説明することと、（ｉｉ）研究期間中のＦＶＩＩＩ置換療法の頻度におけるＦＶＩＩＩ ＡＡＶ投与の影響を評価することと、（ｉｉｉ）研究期間中の治療を必要とする出血症状発現の数における投与の影響を評価することである。

【0280】

組換えＦＶＩＩＩ－ＳＱをコードするベクターＰｒｏｔｏ１（本明細書において、図２Ａ及び配列番号１に示される）は、バキュロウイルス／Ｓｆ９に基づいた発現系を用いて組換えＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱウイルスを生成するために使用された。ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱプロセスは、バッチ細胞培養、回収、精製、及び製剤化からなり、製剤化したバルク製剤原料（ＦＢＤＳ）をもたらす。ＦＢＤＳは、タンデム０．２μｍの滅菌フィルタを通して濾過し、充填前に滅菌バイオプロセス収集袋に収集される。次いで、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱは、１．１ｍｌの滅菌ＦＢＤＳを、２ｍｌのクライオバイアルに充填することによって無菌で調製され、滅菌キャップで密封する。次いで、充填したバイアルを、ラベル付け、包装、及び－６５℃以下で冷凍する前に、視覚的に検査する。

【0281】

臨床ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ液体製剤
上述の、非／前臨床研究のために使用されるＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ液体製剤がガラス及びプラスチック表面に対して組換えＡＡＶの有意な吸着を示したため、ヒト臨床研究で用いるために有利な特性を有する新規のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱ製剤を開発するために、本明細書において作業が行われた。精製されたＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱは、以下のとおりにヒト臨床研究のために製剤化された。

【0282】

精製された組換えＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱウイルスは、１．３８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、１．４２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム（乾燥）、８．１８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、２０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び２．０ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８）、ｐＨ７．４を含む、ヒト患者へのＩＶ投与に有用な液体製剤において様々な濃度で製剤化された。一実施形態において、上述の製剤中の組換えＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱウイルスの濃度は、２Ｅ１３ｖｇ／ｍｌであった。結果として得られる液体製剤は、ＩＶ注入に有用な滅菌の透明／無色から淡黄色溶液であり、上述の非／前臨床研究のために使用された製剤と比較して、ガラス及びプラスチックへの結合に対するウイルス吸着損失を許容されるレベルまで低下させる。この液体製剤は、－６５℃以下で保存中、延長期間中に安定していることが証明され、下述のヒト臨床研究において使用される。

【0283】

ヒト臨床研究の設計
重度の血友病Ａに罹患しているこの初のヒト用量漸増研究への参加者は、（ｉ）単回静脈投与（ｉｖ）として投与される、体重１キログラム当たり６Ｅ１２ベクターゲノム、（ｉｉ）２Ｅ１３ｖｇ／キログラム、静脈投与、または（ｉｉｉ）６Ｅ１３ｖｇ／キログラム、静脈投与の、用量レベルに従って、最大３つのコホートのうちの１つに連続して登録され、注入の１６週間後の追跡期間が続き、安全性及び有効性評価が得られるであろう。一次エンドポイント分析の１６週間後に、安全性及び有効性は、約５年間評価されよう。

【0284】

患者は、コホート間で３週間毎またはそれ以上連続して登録されよう。３週間目に得られるＦＶＩＩＩ活性が５ＩＵ／ｄＬ未満である場合、単一の患者が安全に投与された後に、用量漸増が生じ得る。３週間は、発現がほぼ最大である時間であると予測される。この漸増パラダイムは、治療量以下の用量に供される患者数を最小限に抑えることを目的とする。

【0285】

開始用量は、マウス及びサルの非臨床研究において観察されたＦＶＩＩＩの発現及び安全性に基づいた。開始用量は、非ヒト霊長類における無毒性量（ＮＯＡＥＬ）から有意な安全マージン（１０倍）を有する。

【0286】

注射から約３週間後に、次の用量レベルを増減させる決定は、安全性パラメータ及びＦＶＩＩＩ活性の検討に基づいてなされるであろう。ＦＶＩＩＩ活性が５ＩＵ／ｄＬ以上である場合、用量群の他の患者は、患者間で３週間待つことなく登録されよう。

【0287】

患者１は、体重１キログラム当たり６Ｅ１２ベクターゲノム［ｖｇ］で静脈内流入によって投与されよう。活性レベルが２１日で５ＩＵ／ｄＬ以上に達しない場合、より高い用量（２Ｅ１３ｖｇ／キログラム）が、次の患者のために使用されよう。

【0288】

活性レベルが、患者２の後で、５ＩＵ／ｄＬ以上に達しない場合、より高い用量（６Ｅ１３ｖｇ／キログラム）が、次の患者のために使用されよう。

【0289】

各用量に対して、活性レベルが５ＩＵ／ｄＬに達し、かつ安全性の問題が見出されない場合、最大４人の患者がこの投与を受けるであろう。いかなる時点でも、活性レベルが１０ＩＵ／ｄＬ以上に達した場合、さらなる用量漸増は行われないが、追加の患者は、１用量当たり合計６人の患者に対してこの用量レベルで投与されよう。

【0290】

肝臓酵素の頻繁なモニタリングが、この試験中のすべての患者に行われよう。ベースライン（すなわち、ＦＶＩＩＩベクター投与前）のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）濃度が決定され、投与後の１．５倍以上のＡＬＴの上昇は、治療的コルチコステロイドの使用をもたらすであろう。患者はまた、肝毒性を予防するために、コルチコステロイドを用いて、予防的（すなわち、ＦＶＩＩＩベクター投与前）に治療され得る。

【0291】

結果－患者１
患者１は、上述のように、体重１キログラム当たり６Ｅ１２ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱで単回静脈内注入によって投与された。投与時に、患者１は、０．５ＩＵ／ｄｌ以下の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルを有した。投与の７日後、患者１の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、５．４ＩＵ／ｄｌまで上昇し、投与の１４日後には、１９．２ＩＵ／ｄｌまでさらに増加した。しかしながら、投与の２１日後に、患者１の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、０．５ＩＵ／ｄｌ以下まで減少し、その後、そのレベルを常に保った。

【0292】

結果－患者２
患者１の第ＶＩＩＩ因子活性レベルが投与の２１日間後に少なくとも５ＩＵ／ｄｌではなかったため、患者２は、上述のように、単回静脈内注入によって、体重１キログラム当たり２Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの用量まで増量した。投与時に、患者２は、０．１ＩＵ／ｄｌ以下の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルを有した。投与の２１日間後に、患者２の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、０．７ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１０週間後に２．１ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１２週間後に２．４ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１６週間後に１．９ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の２８週間後に２．４ＩＵ／ｄｌまで増加し、後者は、投与前のレベルと比較して、少なくとも２４倍の増加を表した。患者２で測定されたＡＬＴレベルは、２８週間の観察期間中のいかなる時点でもベースラインを超えて１．５倍以上増加せず、したがって、コルチコステロイドでの治療は開始されなかった。

【0293】

結果－患者３
患者３は、上述のように、単回静脈内注入によって、体重１キログラム当たり６Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱの用量まで増量した。投与時に、患者３は、１．０ＵＬ／ｄｌ未満の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルを有した。投与の２１日間後に、患者３の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、３．１ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１０週間後に２０．８ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１２週間後に３４．７ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１６週間後に５６．６ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の２８週間後に８９．３ＩＵ／ｄｌまで増加し、ヒトにおける十分な血液凝固に必要とされる第ＶＩＩＩ因子の濃度を優に上回り、患者における出血事象中の出血時間を減少させた。

【0294】

患者３のＡＬＴレベルが、ＦＶＩＩＩベクター投与後にベースラインを超えて１．５倍増加することが観察されたため、対象は、継続観察期間にわたって、５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで治療的に治療された。治療的コルチコステロイド治療は、第ＶＩＩＩ因子レベルの同時減少またはいかなる関連する重篤な有害事象も伴わずに、許容されるレベルまで肝毒性関連のＡＬＴ濃度を低下させた。

【0295】

結果－患者４
患者４に、上述のように、体重１キログラム当たり６Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを単回静脈内注入によって投与した。投与時に、患者４は、１．０ＵＬ／ｄｌ未満の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルを有した。投与の２１日間後に、患者４の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、５．６ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１０週間後に６７．８ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１２週間後に８９ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１６週間後に１７０ＩＵ／ｄｌ超まで増加し、投与の２０週間後に２１９．２ＩＵ／ｄｌまで増加し、ヒトにおける十分な血液凝固に必要とされる第ＶＩＩＩ因子の濃度を優に上回り、患者における出血事象中の出血時間を減少させた。

【0296】

患者４は、継続観察期間にわたって、５ｍｇ／日～４０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで予防的に治療された。予防的コルチコステロイド治療は、第ＶＩＩＩ因子レベルの同時減少またはいかなる関連する重篤な有害事象も伴わずに、許容されるレベルまで肝毒性関連のＡＬＴ濃度を維持した。

【0297】

結果－患者５
患者５に、上述のように、体重１キログラム当たり６Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを単回静脈内注入によって投与した。投与時に、患者５は、１．０ＵＬ／ｄｌ未満の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルを有した。投与の２１日間後に、患者５の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、２．２ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１０週間後に２４．４ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１２週間後に５９．４ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１６週間後に１２６．５ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１９週間後に２７１．２ＩＵ／ｄｌまで増加し、ヒトにおける十分な血液凝固に必要とされる第ＶＩＩＩ因子の濃度を優に上回り、患者における出血事象中の出血時間を減少させた。

【0298】

患者５は、継続観察期間にわたって、５ｍｇ／日～４０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで予防的及び治療的の両方で治療された。予防的及び治療的コルチコステロイド治療は、第ＶＩＩＩ因子レベルの同時減少またはいかなる関連する重篤な有害事象も伴わずに、許容されるレベルまで肝毒性関連のＡＬＴ濃度を維持した。

【0299】

結果－患者６
患者６に、上述のように、体重１キログラム当たり６Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを単回静脈内注入によって投与した。投与時に、患者６は、１．０ＵＬ／ｄｌ未満の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルを有した。投与の２１日間後に、患者６の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、１．０ＩＵ／ｄｌ未満であり、投与の１０週間後に６．２ＩＵ／ｄｌであり、投与の１２週間後に１９．６ＩＵ／ｄｌであり、投与の１６週間後に１３ＩＵ／ｄｌであり、投与の１９週間後に１３ＩＵ／ｄｌであり、ヒトにおける十分な血液凝固に必要とされる第ＶＩＩＩ因子の濃度を優に上回り、患者における出血事象中の出血時間を減少させた。

【0300】

患者６は、継続観察期間にわたって、５ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで治療的に治療された。治療的コルチコステロイド治療は、第ＶＩＩＩ因子レベルの同時減少またはいかなる関連する重篤な有害事象も伴わずに、許容されるレベルまで肝毒性関連のＡＬＴ濃度を維持した。

【0301】

結果－患者７
患者７に、上述のように、体重１キログラム当たり６Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを単回静脈内注入によって投与した。投与時に、患者７は、１．０ＵＬ／ｄｌ未満の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルを有した。投与の２１日間後に、患者７の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、１０．４ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１０週間後に５６．４ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１２週間後に５８ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１６週間後に９３．１ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１８週間後に１３５．８ＩＵ／ｄｌまで増加し、ヒトにおける十分な血液凝固に必要とされる第ＶＩＩＩ因子の濃度を優に上回り、患者における出血事象中の出血時間を減少させた。

【0302】

患者７は、継続観察期間にわたって、５ｍｇ／日～４０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで予防的に治療された。予防的コルチコステロイド治療は、第ＶＩＩＩ因子レベルの同時減少またはいかなる関連する重篤な有害事象も伴わずに、許容されるレベルまで肝毒性関連のＡＬＴ濃度を維持した。

【0303】

結果－患者８
患者８に、上述のように、体重１キログラム当たり６Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを単回静脈内注入によって投与した。投与時に、患者８は、１．０ＵＬ／ｄｌ未満の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルを有した。投与の２１日間後に、患者８の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、５．１ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１０週間後に３５．２ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１２週間後に４２．７ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１６週間後に４９．７ＩＵ／ｄｌまで増加し、投与の１７週間後に６８．８ＩＵ／ｄｌまで増加し、ヒトにおける十分な血液凝固に必要とされる第ＶＩＩＩ因子の濃度を優に上回り、患者における出血事象中の出血時間を減少させた。

【0304】

患者８は、継続観察期間にわたって、１０ｍｇ／日～４０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで予防的に治療された。予防的コルチコステロイド治療は、第ＶＩＩＩ因子レベルの同時減少またはいかなる関連する重篤な有害事象も伴わずに、許容されるレベルまで肝毒性関連のＡＬＴ濃度を維持した。

【0305】

結果－患者９
患者９に、上述のように、体重１キログラム当たり６Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱを単回静脈内注入によって投与した。投与時に、患者９は、１．０ＵＬ／ｄｌ未満の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルを有した。投与の１２週間後に、患者９の循環血液第ＶＩＩＩ因子レベルは、７８．７ＩＵ／ｄｌまで増加し、ヒトにおける十分な血液凝固に必要とされる第ＶＩＩＩ因子の濃度を優に上回り、患者における出血事象中の出血時間を減少させた。

【0306】

患者９は、継続観察期間にわたって、１０ｍｇ／日～４０ｍｇ／日の範囲の濃度のコルチコステロイドで治療的に治療された。治療的コルチコステロイド治療は、第ＶＩＩＩ因子レベルの同時減少またはいかなる関連する重篤な有害事象も伴わずに、許容されるレベルまで肝毒性関連のＡＬＴ濃度を維持した。

【0307】

要約
この実施例８に表される結果は、ヒト患者における血友病Ａの成功した療法は、本発明の組成物及び方法を用いて達成され得ることを実証する。より具体的には、体重１キログラム当たり少なくとも２Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱによる血友病Ａに罹患しているヒトの治療が、治療後の少なくとも２６週間にわたって２ＩＵ／ｄｌ以上の安定したＦＶＩＩＩ活性をもたらし、体重１キログラム当たり少なくとも６Ｅ１３ベクターゲノム［ｖｇ］のＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱによる血友病Ａに罹患しているヒトの治療が、治療したすべての患者において１０ＩＵ／ｄｌ超の高く持続したＦＶＩＩＩ活性をもたらしたことを本明細書において実証する。さらに、本明細書において提供されるデータは、ＡＡＶ５－ＦＶＩＩＩ－ＳＱによる治療が、良好な耐容性を示し、ＡＬＴレベルまたは肝毒性の他のマーカーの臨床的に関連する持続的上昇をもたらさないことを実証する。患者の予防的及び／または治療的コルチコステロイド治療は、第ＶＩＩＩ因子レベルの同時減少またはいかなる関連する重篤な有害事象も伴わずに、許容されるレベルまで肝毒性関連のＡＬＴ濃度を維持することができる。最後に、初期データは、コルチコステロイドで予防的または治療的のいずれかによって治療された患者が、ＦＶＩＩＩ発現またはＡＬＴ濃度レベルに悪影響を及ぼすことなく、ステイロイド治療を順調に徐々に減らすことができることを実証する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図4M】

【図4N】

【図4O】

【図4P】

【図4Q】

【図4R】

【図4S】

【図4T】

【図4U】

【図4V】

【図4W】

【図4X】

【図4Y】

【図4Z】

【図4AA】

【図4BB】

【図4CC】

【図4DD】

【図4EE】

【図4FF】

【図4GG】

【図4HH】

【図4II】

【図4JJ】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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