特開2022-101545IP Force 特許公報全文掲載

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本発明の原理および一般に、組換えタンパク質、特に高含有量のマンノース－６－リン酸を有するリソソーム酵素の製造

要約特許出願時に添付された[要約書]

【課題】組換えヒトリソソームタンパク質の生成、捕捉および精製のための方法を提供する。
【解決手段】組換えヒトリソソームタンパク質の生成方法であって、組換えヒトリソソームタンパク質を分泌するバイオリアクター内で宿主細胞を培養すること；前記バイオリアクターから培地を除去すること；前記培地をろ過して濾液を提供すること；前記濾液をアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムに充填して前記リソソームタンパク質を捕捉すること；および前記ＡＥＸカラムから第１のタンパク質生成物を溶出すること、を含む方法である。
【選択図】図６

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明の１つの態様は、組換えヒトリソソームタンパク質の生成方法に関する。この態様の様々な実施形態において、本方法は、組換えヒトリソソームタンパク質を分泌するバイオリアクター内で宿主細胞を培養すること、前記バイオリアクターから培地を除去すること、前記培地をろ過して濾液を提供すること、前記濾液をアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムに充填して前記リソソームタンパク質を捕捉すること、および・・・　続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る

この発明についての権利主張の範囲[特許請求の範囲]

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1A】 非リン酸化高マンノースグリカン、モノ－Ｍ６Ｐグリカン、およびビス－Ｍ６Ｐグリカンを示す。
【図1B】 Ｍ６Ｐ基の化学構造を示す。
【図2A】 標的組織（例えば、ポンペ病を有する対象の筋肉組織）に対するＭ６Ｐを有するグリカンを介したｒｈＧＡＡの生産的標的化を記載する。
【図2B】 非標的組織（例えば、肝臓および脾臓）への非生産的薬物クリアランス、または非標的組織への非Ｍ６Ｐグリカンの結合によって説明される。
【図3A】 ＣＩＭＰＲ受容体（ＩＧＦ２受容体としても知られる）およびこの受容体のドメインをグラフで示す。
【図3B】 ＣＩＭＰＲに対するビス－およびモノ－Ｍ６Ｐを有するグリカンの結合親和性（ナノモル）、高マンノース型グリカンのマンノース受容体への結合親和性、およびアシアロ糖タンパク質受容体に対する脱シアル化複合グリカンの結合親和性を示す表である。Ｍ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐを有するグリカンを有するＲｈＧＡＡは、筋肉上のＣＩＭＰＲに生産的に結合し得る。
【図4A】 それぞれルミザイム（登録商標）およびミオザイム（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を示す。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介して結合したＧＡＡ分子がＣＩＭＰＲに置換された。図４Ａに示すように、ルミザイム（登録商標）におけるＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図４Ｂは、ＧＡＡミオザイム（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。ルミザイム（登録商標）またはミオザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの２２％または２７％のみがＭ６Ｐで溶出された。これらの図は、これら２つの従来のｒｈＧＡＡ製品における大部分のｒｈＧＡＡが、標的筋肉組織のＣＩＭＰＲを標的化するのに必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠いていることを示す。
【図4B】 それぞれルミザイム（登録商標）およびミオザイム（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を示す。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介して結合したＧＡＡ分子がＣＩＭＰＲに置換された。図４Ａに示すように、ルミザイム（登録商標）におけるＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図４Ｂは、ＧＡＡミオザイム（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。ルミザイム（登録商標）またはミオザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの２２％または２７％のみがＭ６Ｐで溶出された。これらの図は、これら２つの従来のｒｈＧＡＡ製品における大部分のｒｈＧＡＡが、標的筋肉組織のＣＩＭＰＲを標的化するのに必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠いていることを示す。
【図5】 ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物で形質転換した。
【図6】 組換えリソソームタンパク質の製造、捕捉および精製のための例示的方法の概略図である。
【図7A】 それぞれミオザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図７Ｂから明らかなように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％はＭ６Ｐを含んでいた。
【図7B】 それぞれミオザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図７Ｂから明らかなように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％はＭ６Ｐを含んでいた。
【図8】 陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムでの捕捉を伴うおよび伴わないＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図9】 ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＰｏｌｙｗａｘ溶出プロファイルを示すグラフである。
【図10】 ＢＰ－ｒｈＧＡＡ、ＡＴＢ２００－１およびＡＴＢ２００－２として同定されたＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの３つの異なる調製物と比較した、ルミザイム（登録商標）のＮ－グリカン構造の概要を示す表である。
【図11A】 ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11B】 ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11C】 ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11D】 ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11E】 ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11F】 ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11G】 ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11H】 ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図12A】 図１２Ａは、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ（左のトレース）とルミザイム（右のトレース）のＣＩＭＰＲ結合親和性を比較するグラフである。
【図12B】 図１２Ｂは、ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのビス－Ｍ６Ｐ含有量を比較する表である。
【図13A】 図１３Ａは、様々なＧＡＡ濃度で正常線維芽細胞内のＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ活性（左のトレース）とルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右のトレース）とを比較するグラフである。
【図13B】 図１３Ｂは、様々なＧＡＡ濃度でポンペ病を有する対象由来の線維芽細胞内のＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ活性（左のトレース）とルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右のトレース）とを比較する表である。
【図13C】 図１３Ｃは、健常対象およびポンペ病に罹患した対象由来の線維芽細胞のＫ取り込みを比較する表である。
【図14A】 図１４Ａは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス心筋における組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図14B】 図１４Ｂは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス四頭筋における組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図14C】 図１４Ｃは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス三頭筋における組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図15】 ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡとシャペロンミグルスタットとの組み合わせが、ミグルスタットシャペロンを含まないルミザイム（登録商標）またはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡによる処置よりも、ＧＡＡノックアウトマウスにおいて著しく良好なグリコーゲンクリアランスを提供したことを示す表である。
【図16】 ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の心臓、隔膜およびヒラメ筋の一連の電子顕微鏡写真であり、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ－１）のレベルを示す。
【図17】 ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の心臓およびヒラメ筋の一連の電子顕微鏡写真であり、過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することによりグリコーゲンレベルを示す。
【図18】 ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の四頭筋の一連の電子顕微鏡写真（１０００ｘ）であり、メチレンブルーで染色して空胞を示した（矢印で示す）。
【図19】 ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の四頭筋の一連の電子顕微鏡写真（４０ｘ）であり、これは、オートファジーマーカー微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ型軽鎖３ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲート（ＬＣ３Ａ ＩＩ）およびｐ６２、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルを示す。
【図20】 陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムでの捕捉および精製前後の組換えα－ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα－Ｇａｌ Ａ）酵素のＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図21A】 ミグルスタットの存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスのワイヤハンドおよび握力筋肉データを示すグラフである。
【図21B】 ミグルスタットの存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスのワイヤハンドおよび握力筋肉データを示すグラフである。
【図22A】 ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22B】 ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22C】 ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22D】 ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22E】 ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22F】 ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22G】 ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図23】 ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の外側広筋（ＶＬ）の筋線維の一連の顕微鏡写真（１００ｘおよび２００ｘ）であり、ジストロフィンシグナルを示す。
【図24】 ポンペ病を有する成人における経口ミグルスタットと共投与したＡＴＢ２００の静脈内注入の安全性、忍容性、ＰＫ、ＰＤ、および有効性を評価するための、オープンラベル、一定連続、用量漸増、ヒト初回、第１／２相実験の実験デザインを示す。
【図25A】 ５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図25B】 ５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図25C】 ２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質のＡＵＣを示すグラフである。
【図25D】 ２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、２人の別個のヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図26】 １３０ｍｇまたは２６０ｍｇのミグルスタットを投与した後のヒト対象における血漿中のミグルスタットの濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図27A】 ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【図27B】 ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【図27C】 ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【図27D】 ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。

選択図 図6出願人が指定した本件の代表的な図

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