(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022101557
(43)【公開日】2022-07-06
(54)【発明の名称】イオン交換膜クロマトグラフィー
(51)【国際特許分類】
C07K 1/18 20060101AFI20220629BHJP
【ＦＩ】
C07K1/18
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022050501
(22)【出願日】2022-03-25
(62)【分割の表示】P 2019193276の分割
【原出願日】2012-12-18
(31)【優先権主張番号】61/579,285
(32)【優先日】2011-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ビル， ジェローム ジョセフ， ジュニア
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン， アリック マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ダウド， クリストファー ジョン
(72)【発明者】
【氏名】セアー， ブルック エレン
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA20
4H045AA40
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA23
(57)【要約】 （修正有）
【課題】タンパク質精製のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法を提供する。
【解決手段】（ａ）関心ポリペプチド及び混入物を含む組成物を、イオン交換膜に通すことであって、ポリペプチド及び膜は、ポリペプチド及び混入物を膜に結合させる操作条件において、反対の電荷を有し、ポリペプチドのｐｉとは明らかに異なるｐＨと、バッファイオンによる電荷の遮蔽を防止するのに有効な低イオン強度とを有するバッファを含む、通すこと、（ｂ）混入物が膜に結合したままで、関心ポリペプチドが主に溶出液中にあるようにイオン交換膜をオーバーロードさせること、（ｃ）関心ポリペプチドを含む、イオン交換膜からの溶出液を採取すること、（ｄ）関心ポリペプチドを含む、膜の溶出液に対して、膜と類似の電荷の精製工程を行うこと、（ｅ）精製されたポリペプチドを、帯電させたイオン交換クロマトグラフィー精製工程の溶出液から回収することを含む方法、の提供。
【選択図】図１
【解決手段】（ａ）関心ポリペプチド及び混入物を含む組成物を、イオン交換膜に通すことであって、ポリペプチド及び膜は、ポリペプチド及び混入物を膜に結合させる操作条件において、反対の電荷を有し、ポリペプチドのｐｉとは明らかに異なるｐＨと、バッファイオンによる電荷の遮蔽を防止するのに有効な低イオン強度とを有するバッファを含む、通すこと、（ｂ）混入物が膜に結合したままで、関心ポリペプチドが主に溶出液中にあるようにイオン交換膜をオーバーロードさせること、（ｃ）関心ポリペプチドを含む、イオン交換膜からの溶出液を採取すること、（ｄ）関心ポリペプチドを含む、膜の溶出液に対して、膜と類似の電荷の精製工程を行うこと、（ｅ）精製されたポリペプチドを、帯電させたイオン交換クロマトグラフィー精製工程の溶出液から回収することを含む方法、の提供。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法であって、
ａ．関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、イオン交換膜に通すことであって、前記ポリペプチドおよび前記膜が、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させる操作条件において、反対の電荷を有し、前記操作条件は、前記ポリペプチドの電荷を促進するように前記ポリペプチドのｐＩとは明らかに異なるｐＨと、バッファイオンによる電荷の遮蔽を防止するのに有効な低イオン強度とを有するバッファを含む、通すこと、
ｂ．少なくとも１つの前記混入物が前記膜に結合したままで、前記関心ポリペプチドが主に溶出液中にあるように、前記イオン交換膜をオーバーロードさせること、
ｃ．前記関心ポリペプチドを含む、前記イオン交換膜からの前記溶出液を採取すること、
ｄ．前記関心ポリペプチドを含む、前記膜の溶出液に対して、前記膜と類似の電荷のイオン交換クロマトグラフィー工程を行うこと、
ｅ．精製された前記ポリペプチドを、帯電させた前記イオン交換クロマトグラフィー工程の前記溶出液から回収することを含む、方法。
ａ．関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、イオン交換膜に通すことであって、前記ポリペプチドおよび前記膜が、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させる操作条件において、反対の電荷を有し、前記操作条件は、前記ポリペプチドの電荷を促進するように前記ポリペプチドのｐＩとは明らかに異なるｐＨと、バッファイオンによる電荷の遮蔽を防止するのに有効な低イオン強度とを有するバッファを含む、通すこと、
ｂ．少なくとも１つの前記混入物が前記膜に結合したままで、前記関心ポリペプチドが主に溶出液中にあるように、前記イオン交換膜をオーバーロードさせること、
ｃ．前記関心ポリペプチドを含む、前記イオン交換膜からの前記溶出液を採取すること、
ｄ．前記関心ポリペプチドを含む、前記膜の溶出液に対して、前記膜と類似の電荷のイオン交換クロマトグラフィー工程を行うこと、
ｅ．精製された前記ポリペプチドを、帯電させた前記イオン交換クロマトグラフィー工程の前記溶出液から回収することを含む、方法。
【請求項2】
前記イオン交換膜は、０．１から１００μｍのポアサイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記イオン交換膜はモノリスまたはデプスフィルターにより置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
タンパク質の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法であって、
ａ．関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、陽イオン交換膜に通すことであって、前記ポリペプチドおよび前記膜が、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させる操作条件において、反対の電荷を有し、前記操作条件は、前記ポリペプチドのｐＩを約１から約５ｐＨ単位下回るｐＨと、約４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率とを有するバッファを含む、通すこと、
ｂ．少なくとも１つの前記混入物が前記膜に結合したままで、前記関心ポリペプチドが主に溶出液中にあるように、前記陽イオン交換膜をオーバーロードさせること、
ｃ．前記関心ポリペプチドを含む、前記陽イオン交換膜からの前記溶出液を採取すること、
ｄ．前記関心ポリペプチドを含む、前記膜の溶出液に対して、陽イオン交換クロマトグラフィー精製工程を行うこと、
ｅ．精製された前記ポリペプチドを、前記陽イオン交換クロマトグラフィー精製工程の前記溶出液から回収することを含む、方法。
ａ．関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、陽イオン交換膜に通すことであって、前記ポリペプチドおよび前記膜が、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させる操作条件において、反対の電荷を有し、前記操作条件は、前記ポリペプチドのｐＩを約１から約５ｐＨ単位下回るｐＨと、約４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率とを有するバッファを含む、通すこと、
ｂ．少なくとも１つの前記混入物が前記膜に結合したままで、前記関心ポリペプチドが主に溶出液中にあるように、前記陽イオン交換膜をオーバーロードさせること、
ｃ．前記関心ポリペプチドを含む、前記陽イオン交換膜からの前記溶出液を採取すること、
ｄ．前記関心ポリペプチドを含む、前記膜の溶出液に対して、陽イオン交換クロマトグラフィー精製工程を行うこと、
ｅ．精製された前記ポリペプチドを、前記陽イオン交換クロマトグラフィー精製工程の前記溶出液から回収することを含む、方法。
【請求項5】
前記ｐＨは、前記ポリペプチドの前記ｐＩを約１から約４ｐＨ単位下回る、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ｐＨは、前記ポリペプチドの前記ｐＩを約１から約３ｐＨ単位下回る、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記ｐＨは、前記ポリペプチドの前記ｐＩを約１から約２ｐＨ単位下回る、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
前記ｐＨは、前記ポリペプチドの前記ｐＩを約１ｐＨ単位下回る、請求項４に記載の方法。
【請求項9】
前記伝導率は約２０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項４に記載の方法。
【請求項10】
前記伝導率は約１０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項４に記載の方法。
【請求項11】
前記陽イオン交換膜は、陽イオン交換モノリスまたはデプスフィルターである、請求項４に記載の方法。
【請求項12】
タンパク質の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法であって、
ａ．関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、陰イオン交換膜に通すことであって、前記ポリペプチドおよび前記膜が、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させる操作条件において、反対の電荷を有し、前記操作条件は、前記ポリペプチドのｐＩを約１から約５ｐＨ単位上回るｐＨと、約４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率とを有するバッファを含む、通すこと、
ｂ．少なくとも１つの前記混入物が前記膜に結合したままで、前記関心ポリペプチドが主に溶出液中にあるように、前記陰イオン交換膜をオーバーロードさせること、
ｃ．前記関心ポリペプチドを含む、前記陰イオン交換膜からの前記溶出液を採取すること、
ｄ．前記関心ポリペプチドを含む、前記膜の溶出液に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程を行うこと、
ｅ．精製された前記ポリペプチドを、前記陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程の前記溶出液から回収することを含む、方法。
ａ．関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、陰イオン交換膜に通すことであって、前記ポリペプチドおよび前記膜が、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させる操作条件において、反対の電荷を有し、前記操作条件は、前記ポリペプチドのｐＩを約１から約５ｐＨ単位上回るｐＨと、約４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率とを有するバッファを含む、通すこと、
ｂ．少なくとも１つの前記混入物が前記膜に結合したままで、前記関心ポリペプチドが主に溶出液中にあるように、前記陰イオン交換膜をオーバーロードさせること、
ｃ．前記関心ポリペプチドを含む、前記陰イオン交換膜からの前記溶出液を採取すること、
ｄ．前記関心ポリペプチドを含む、前記膜の溶出液に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程を行うこと、
ｅ．精製された前記ポリペプチドを、前記陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程の前記溶出液から回収することを含む、方法。
【請求項13】
前記ｐＨは、前記ポリペプチドの前記ｐＩを約１から約４ｐＨ単位上回る、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ｐＨは、前記ポリペプチドの前記ｐＩを約１から約３ｐＨ単位上回る、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記ｐＨは、前記ポリペプチドの前記ｐＩを約１から約２ｐＨ単位上回る、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記ｐＨは、前記ポリペプチドの前記ｐＩを約１ｐＨ単位上回る、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記伝導率は約２０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
前記伝導率は約１０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項19】
前記陰イオン交換膜は、陰イオン交換モノリスまたはデプスフィルターに置き換えられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項20】
前記膜は混合モードの吸着材である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記混入物は宿主細胞のタンパク質である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記宿主細胞のタンパク質はチャイニーズハムスター卵巣タンパク質（ＣＨＯＰ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記宿主細胞のタンパク質は大腸菌タンパク質（ＥＣＰ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記混入物はアミノグリコシド系抗生物質である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記アミノグリコシド系抗生物質はゲンタマイシンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記混入物はイオンポリマーである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記イオンポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ポリペプチドはＣＨ２／ＣＨ３領域を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ポリペプチドは抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
さらなる前記精製工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記ａからｅの工程の間に、さらなる前記精製工程が継続的に行われ、前記精製工程はイオン交換クロマトグラフィーである、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記イオン交換クロマトグラフィーは陽イオン交換カラムを含む、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記イオン交換クロマトグラフィーは陰イオン交換カラムを含む、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
精製した前記ポリペプチドを薬学的に許容可能な担体と組み合わせることにより、薬学的組成物を調製することをさらに含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、広くタンパク質の精製に関する。特に、本発明は、上流のイオン交換膜クロマトグラフィーの使用による不純物を取り除くための、下流の精製工程の性能を向上させるための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ラージスケールの、経済的なタンパク質の精製は、バイオテクノロジー産業にとってますます重要な課題である。一般的に、タンパク質は、そのタンパク質の遺伝子を含む組換えプラスミドを挿入することにより、関心タンパク質を産生するために操作された真核生物細胞株または原核生物細胞株のいずれかを用いて細胞培養により産生される。これらの細胞には、通常、動物血清の調製物から供給される、糖、アミノ酸、および成長因子を含む、複合増殖培地を与えなければならない。ヒトへの治療として使用するために十分な純度に、細胞自身の副産物由来および細胞に対して与えられる化合物の混合物由来の所望のタンパク質を分離することは、手強い課題を提起する。
【0003】
細胞片からのタンパク質の精製の手順は、最初のうちは、所与のタンパク質の発現のメカニズムに依存する。いくつかのタンパク質は、細胞から周りの増殖培地への直接の分泌が生じ得、他は細胞内でなされる。後者のタンパク質に関しては、精製プロセスの最初の工程は細胞の溶解を含み、それは機械的せん断、浸透圧ショック、または酵素処理を含む種々の方法により行われ得る。そのような破壊は、ホモジネート内に細胞の全内容物を放出させ、さらに、小さなサイズであるために取り除くのが難しい細胞下の断片を産出する。それらは、一般的に、分画遠心法または濾過により取り除かれる。細胞の自然死による直接的に分泌されたタンパク質、および、タンパク質産生実行の過程での細胞内の宿主細胞のタンパク質の放出により、より小さな規模であるが、同様の問題が生じる。
【0004】
大きな細胞破片成分のない、関心タンパク質を含む清澄液がいったん得られると、細胞により産生された残りの他のタンパクからのその分離は、通常、異なるクロマトグラフィー技術の組み合わせを用いて試みられる。これらの技術は、電荷、疎水性の程度、またはサイズに基づいて、タンパク質と他の不純物の混合物を分離する。いくつかの異なるクロマトグラフィー樹脂は、これらの技術のそれぞれに関して使用可能であり、関与する特定のタンパク質に対する精製スキームの的確な仕立てを可能にする。これらの分離方法のそれぞれのエッセンスは、タンパク質が長いカラムの下へ異なる速度で移動し、それらがより遠くのカラムの下側へ通過するようにして増加させる物理的分離を達成するか、あるいは、分離媒体に選択的に接着し、その後、異なる溶剤または置換剤により差次的に溶出または置換することである。いくつかの場合には、不純物が特異的にカラムに接着し、関心タンパク質は接着しない場合に、所望のタンパク質は不純物から分離され、つまり、関心タンパク質は「フロースルー」内に存在する。タンパク質精製に関する文献は、非特許文献１を含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｆａｈｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ Ｒｅｖ．２００１；１８：３０１－２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従来のラージスケールの抗体精製プロセスは、他のカラム操作と組み合わせて、一次捕獲および精製工程として、固定化したプロテインＡが使用されている周りに構築されることが多い。プロテインＡは、ＩｇＧのＦｃ領域に親和性のある、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ）由来の細胞壁タンパク質である。この理由から、ＩｇＧ精製のために広く用いられている。プロテインＡカラム操作は、概して、フロースルー分画でほとんどの処理不純物を洗い流し、９８％を超える製品関連純度を実現する。しかしながら、プロテインＡクロマトグラフィーの使用に対しては、多くの欠点がある。まず、結合は、通常、中性からやや塩基性のｐＨで行われ、溶出は、通常、酸性のｐＨでなされる。潜在的な課題の１つは、低いｐＨが、ＩｇＧを変性させ得、または、部分的に変性させ得るということである。このため、および、臨床応用のために要求される高い製品純度のため、追加的な濃縮および精製工程が、製品関連異性体の分離、並びに、宿主細胞のタンパク質／ＤＮＡ、細胞培養不純物、浸出したプロテインＡ、およびウイルスの残量の除去のために必要である。複合的な課題は、これらの多くの不純物が、精製された抗体を分離するための下流のプロセスの操作ユニットの効率に干渉し得る、ということである。他の主な課題は価格であり、プロテインＡカラムは、従来のイオン交換カラムよりも、さらにより高額である。最後に、例えば、ポリペプチド、抗体様分子、抗体フラグメント、および／または所定の細胞系から精製された完全抗体の精製で、プロテインＡクロマトグラフィーが適切でない、または、コスト的に禁止されている、とする多くのシナリオがある。
【0007】
本発明の本質は、上記の課題を解決することであって、抗体、抗体フラグメント、およびポリペプチド精製におけるプロテインＡ工程を用いる、現在当該技術分野で可能なものに対する代替的な精製方法を、その実施形態において示す。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本明細書では、本発明は、（ａ）関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、イオン交換膜に通すことであって、前記ポリペプチドおよび前記膜は、前記ポリペプチドの前記電荷を促進するように前記ポリペプチドのｐＩとは明らかに異なるｐＨとバッファイオンによる電荷の遮蔽を防止するのに有効な低イオン強度とを有するバッファを含む、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させる操作条件で、反対電荷を有する、通すこと、（ｂ）前記関心ポリペプチドを含む、前記イオン交換膜からの分画を採取すること、（ｃ）前記ポリペプチドを含む前記組成物について１つまたはそれ以上のさらなる精製工程を行うこと、（ｄ）前記精製ポリペプチドを前記溶出液から回収することを含む、タンパク質の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法に関する。
【0009】
代替的には、本発明は、（ａ）関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、陽イオン交換膜に通すこと、前記ポリペプチドのｐＩを約１から約５ｐＨ単位下回るｐＨ、および約４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率とを有するバッファを含む、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させる操作条件で、前記ポリペプチドおよび前記膜は反対電荷を有する、通すこと、（ｂ）前記関心ポリペプチドを含む、前記イオン交換膜からの分画を採取すること、（ｃ）前記ポリペプチドを含む前記組成物について１つまたはそれ以上のさらなる精製工程を行うこと、（ｄ）前記精製ポリペプチドを前記溶出液から回収することを含む、タンパク質の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法に関する。
【0010】
さらに代替的には、本発明は、（ａ）関心ポリペプチドおよび種々の混入物を含む組成物を、陰イオン交換膜に通すこと、前記ポリペプチドのｐＩを約１から約５ｐＨ単位上回るｐＨ、および約４０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率とを有するバッファを含む、前記ポリペプチドおよび少なくとも１つの前記混入物を前記膜に結合させる操作条件で、前記ポリペプチドおよび前記膜は反対電荷を有する、通すこと、（ｂ）前記関心ポリペプチドを含む、前記イオン交換膜からの分画を採取すること、（ｃ）前記ポリペプチドを含む前記組成物について１つまたはそれ以上のさらなる精製工程を行うこと、（ｄ）前記精製ポリペプチドを前記溶出液から回収することを含む、タンパク質の精製のための下流のクロマトグラフィー工程の効率を高める方法に関する。
【0011】
一態様では、前記混入物は、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質（ＣＨＯＰ）である。一態様では、前記混入物は、大腸菌タンパク質（ＥＣＰ）である。一態様では、前記混入物は、ゲンタマイシンである。さらに他の態様では、前記混入物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。
【0012】
別の態様では、前記ポリペプチドは、ＣＨ２／ＣＨ３領域を含む。他の態様では、前記ポリペプチドは、抗体である。さらに他の態様では、前記抗体は、モノクローナル抗体である。
【0013】
他の態様では、本方法はさらに、前記ポリペプチドを含む組成物に対して、上記工程ａからｂの前、上記工程ａからｂの間、または上記工程ａからｂのあとのうちいずれかに、１つまたはそれ以上のさらなる精製工程を行うことを含み、上記精製工程は、代替的にはＦｃ結合親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー）、さらに代替的には、結合／溶出、フロースルー、または置換モードで操作されるカラムまたは膜を用いるイオン交換クロマトグラフィーである。さらに他の態様では、前記イオン交換膜は、モノリスまたはデプスフィルターにより置き換えられる。
【0014】
さらに、本発明は、前記精製ポリペプチドを薬学的に許容可能な担体と組み合わせることにより、薬学的組成物の調製物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図3】図３は、ｐＨ５．５で６．４ｍＳ／ｃｍ、およびｐＨ８．０で５．０ｍＳ／ｃｍ、ムスタング（Ｍｕｓｔａｎｇ）（商標）Ｓ（スモールスケール、０．１８ｍＬ ＭＶ、６６７ＭＶ／時）での、ｍＡｂ１陰イオン交換プールの収率を示す。
【図9】図９は、タンパク質をロードし、ＵＶ吸光度がベースラインに届くまで２０ｍＭアセテートバッファで洗浄したムスタングＳ膜を、その後、ゲンタマイシンにより抗体置換を行うために、２０ｍＭアセテート／ゲンタマイシンバッファで溶出したものを示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
定義
本明細書では、用語「約」により前置きされた数値範囲および量は、明白に、ちょうどの範囲またはちょうどの数量を含む。
本明細書では、用語「約」により前置きされた数値範囲および量は、明白に、ちょうどの範囲またはちょうどの数量を含む。
【0017】
本明細書で精製される「組成物」は、関心ポリペプチドおよび１つまたはそれ以上の混入物を含む。組成物は、「部分的に精製されている」（つまり、プロテインＡクロマトグラフィーのように、１つまたはそれ以上の精製工程が行われる）こととしてもよく、または、宿主細胞もしくはポリペプチドを産生する生物（例えば、組成物が収集された細胞培養液を含むこととしてもよい。）から直接得られることとしてもよい。
【0018】
本明細書で用いられる場合には、「ポリペプチド」は、一般的には、約１０のアミノ酸よりも多くを有するペプチドおよびタンパク質を指す。好ましくは、ポリペプチドは、哺乳類のタンパク質であって、その例は、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポプロテイン；アルファ１アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子－アルファおよび－ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常なＴ細胞の活性で調節され、発現され、かつ分泌される（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ））；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；微生物タンパク、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮＡ分解酵素；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子のレセプター；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、－４、－５、または－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、またはＮＴ－６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ－β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－アルファおよびＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を含む、ＴＧＦ－ベータ；インスリン様増殖因子－Ｉおよび－ＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、およびＣＤ２０；エリスロポエチン；骨形成誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、－ベータ、および－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＧ－ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１からＩＬ－１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４およびＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４レセプター；およびフラグメントおよび／またはあらゆる上記ポリペプチドの変異体、並びに、あらゆる上記ポリペプチドに結合する抗体フラグメントを含む抗体を含む。
【0019】
「混入物」は、所望のポリペプチド産生物とは異なる物質である。混入物は、宿主細胞物質、例えば、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質（ＣＨＯＰ）または大腸菌タンパク質（ＥＣＰ）；浸出したプロテインＡ；核酸；所望のポリペプチドの変異体、フラグメント、凝集物、異性体、もしくは誘導体；他のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス混入物；アミノグリコシド系抗生物質成分（例えば、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン）；または精製プロセスに添加されるイオンポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリビニルアミン、ポリアルギニン、ポリビニルスルホン酸、ポリアクリル酸）、等を含むが、これらに限定されない。
【0020】
本明細書で用いられる場合、用語「ＣＨ２／ＣＨ３領域」は、免疫グロブリン分子のＦｃ領域におけるこれらのアミノ酸残基を指す。好ましい実施形態では、ＣＨ２／ＣＨ３領域は、インタクトなＣＨ２領域、その後に続くインタクトなＣＨ３領域を含み、最も好ましくは免疫グロブリンのＦｃ領域である。ＣＨ２／ＣＨ３領域含有ポリペプチドの例は、抗体、イムノアドヘシン、およびＣＨ２／ＣＨ３領域と融合するまたは結合する関心ポリペプチドを含む融合タンパク質を含む。
【0021】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書で精製される抗体は、組換抗体である。「組換抗体」は、抗体をコードする核酸により形質転換された、または、遺伝子導入された、宿主細胞で産生されたもの、または相同的組換えの結果として抗体を産生するものである。「形質転換」および「遺伝子導入」は、細胞内で核酸を導入するプロセスを指すために互換的に使用される。以下の形質転換または遺伝子導入で、核酸は、宿主細胞ゲノム内で統合することとしてもよく、または、染色体外因子として存在してもよい。「宿主細胞」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養での細胞並びに宿主動物内の細胞を含む。ポリペプチドの組換え型の産生方法は、例えば、参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５，５３４，６１５号に記載されている。
【0022】
用語「抗体」は、広義に用いられ、具体的には、本明細書で定義されるように、ＣＨ２／ＣＨ３領域を含むために維持され、または、変更される限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを包含する。
【0023】
本明細書で抗体は、関心「抗原」に対して方向づけられる。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾病または疾患に苦しむ哺乳類に対する抗体の投与は、その哺乳類に治療効果をもたらし得る。しかしながら、非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原、米国特許第５，０９１，１７８号参照）に対する抗体も考えられる。抗原がポリペプチドである場合、それは、増殖因子としての膜貫通分子（例えば、レセプター）またはリガンドであることとしてもよい。例示的な抗原は、上記これらのポリペプチドを含む。本発明により包含される、抗体の好ましい分子標的は、ＣＤポリペプチド、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ３４；ＨＥＲレセプターファミリーの膜、例えば、ＥＧＦレセプター（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４レセプター；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、およびそのサブユニットａまたはｂのいずれかを含むａｖ／ｂ３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ｂ抗体）；増殖因子、例えば、ＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ－４；ポリペプチドＣ等を含む。可溶性の抗原またはそのフラグメントは、任意に他の分子と結合し、抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。レセプターとしての膜貫通分子に関し、これらのフラグメント（例えば、レセプターの細胞外ドメイン）は、免疫原として用いられ得る。代替的には、膜貫通分子を発現する細胞は、免疫原として用いられ得る。そのような細胞は、天然源（例えば、癌細胞株）由来であり得、または膜貫通分子を発現するように組換え技術により形質転換された細胞であることとしてもよい。
【0024】
本明細書で精製される抗体の例は、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））を含むＨＥＲ２抗体（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５－４２８９ （１９９２）、米国特許第５，７２５，８５６号）およびペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標））（国際公開第０１／００２４５号）；ＣＤ２０抗体（以下参照）；ＩＬ－８抗体（Ｓｔ Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｓｔ， １０３：９３２ （１９９３）、および国際公開第９５／２３８６５号）；ヒト化ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））およびラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））のような、ヒト化および／または親和性成熟ＶＥＧＦ抗体を含む、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプター抗体（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ７：５３－６４ （１９９２）、国際公開第９６／３００４６号、および１９９８年１０月１５日公開の国際公開第９８／４５３３１号）；ＰＳＣＡ抗体（国際公開第０１／４０３０９号）；エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標））を含むＣＤ１１ａ抗体（米国特許第５，６２２，７００号、国際公開第９８／２３７６１号、Ｓｔｅｐｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｔｌ． ４：３－７ （１９９１）、およびＨｏｕｒｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５８：３７７－３８０ （１９９４））；オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））を含むＩｇＥに結合する抗体（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２６２３－２６３２ （１９９３）、および国際公開第９５／１９１８１号；１９９８年２月３日発行の米国特許第５，７１４，３３８号、または１９９２年２月２５日発行の米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日公開の国際公開第９３／０４１７３号、または１９９８年６月３０日出願の国際出願ＵＳ９８／１３４１０号、米国特許第５，７１４，３３８号）；ＣＤ１８抗体（１９９７年４月２２日に発行の米国特許第５，６２２，７００号、または１９９７年７月３１日公開の国際公開第９７／２６９１２号）；Ａｐｏ－２レセプター抗体（１９９８年１１月１９日公開の国際公開第９８／５１７９３号）；組織因子（ＴＦ）抗体（１９９４年１１月９日に付与の欧州特許第０４２０９３７Ｂ１号）；α４～α７インテグリン抗体（１９９８年２月１９日公開の国際公開第９８／０６２４８号）；ＥＧＦＲ抗体（例えば、キメラ化またはヒト化２２５抗体、セツキシマブ、１９９６年１２月１９日公開の国際公開第９６／４０２１０号のＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標））；ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ３（１９８５年５月７日発行の米国特許第４，５１５，８９３号）；ＣＤ２５またはＴａｃ抗体、例えば、ＣＨＩ－６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））およびＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（１９９７年１２月２日発行の米国特許第５，６９３，７６２号）；ＣＤ４抗体、例えば、ｃＭ－７４１２抗体（Ｃｈｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３９（１）：５２－５６ （１９９６））；ＣＤ５２抗体、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ－１Ｈ（ＩＬＥＸ／Ｂｅｒｌｅｘ）（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３３７ （１９８８））；Ｆｃレセプター抗体、例えば、Ｆｃに対するＭ２２抗体（ＲＩ Ｇｒａｚｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５（１０）：４９９６－５００２ （１９９５）に記載）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、例えば、ｈＭＮ－１４（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（２３Ｓｕｐｐｌ）： ５９３５ｓ－５９４５ｓ （１９９５））；ｈｕＢｒＥ－３、ｈｕ－Ｍｃ３およびＣＨＬ６を含む胸部上皮細胞に対する抗体（Ｃｅｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（２３）： ５８５２ｓ－５８５６ｓ （１９９５）；およびＲｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（２３ Ｓｕｐｐ）： ５９１６ｓ－５９２０ｓ （１９９５））；Ｃ２４２のような結腸癌細胞に結合する抗体（Ｌｉｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６（１）：１－９ （１９９６））；ＣＤ３８抗体、例えば、ＡＴ１３／５（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５（２）：９２５－９３７ （１９９５））；ＣＤ３３抗体、例えば、ＨｕＭ１９５（Ｊｕｒｃｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ－５９１０ｓ （１９９５））およびＣＭＡ－６７６またはＣＤＰ７７１；ＥｐＣＡＭ抗体、例えば、１７－１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））；ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えば、アブシキシマブまたはｃ７Ｅ３ Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））；ＲＳＶ抗体、例えば、ＭＥＤＩ－４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））；ＣＭＶ抗体、例えば、ＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標）；ＨＩＶ抗体、例えば、ＰＲＯ５４２；肝炎抗体、例えば、Ｈｅｐ Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標）；ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；イディオタイプのＧＤ３ エピトープ抗体ＢＥＣ２；αｖβ３抗体（例えば、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；ヒト腎細胞癌抗体、例えば、ｃｈ－Ｇ２５０；ＩＮＧ－１；抗ヒト１７－１Ａｎ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体（Ａ３３）；直接ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌（ＳＦ－２５）；ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えば、Ｓｍａｒｔ ＩＤ１０および抗－ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ－１）；ＣＤ３７抗体、例えば、ＴＲＵ０１６（Ｔｒｕｂｉｏｎ）；ＩＬ－２１抗体（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）；抗Ｂ細胞抗体（Ｉｍｐｈｅｒｏｎ）；ＭＡｂを標的とするＢ細胞（免疫原／Ａｖｅｎｔｉｓ）；１Ｄ０９Ｃ３（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ／ＧＰＣ）；ＬｙｍｐｈｏＲａｄ １３１（ＨＧＳ）；Ｌｙｍ－１抗体、例えば、Ｌｙｍ－１Ｙ－９０（ＵＳＣ）または抗Ｌｙｍ－１ Ｏｎｃｏｌｙｍ（ＵＳＣ／Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）；ＬＩＦ ２２６（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌｉｆｅｓｃｉ．）；ＢＡＦＦ抗体（例えば、国際公開第０３／３３６５８号）；ＢＡＦＦレセプター抗体（例えば、国際公開第０２／２４９０９号参照）；ＢＲ３抗体；Ｂｌｙｓ抗体、例えば、ベリムマブ；ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ－Ｂ（商標）；ＩＳＦ １５４（ＵＣＳＤ／Ｒｏｃｈｅ／Ｔｒａｇｅｎ）；ゴミリキシマ（ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａ）（Ｉｄｅｃ １５２；Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）；ＩＬ－６レセプター抗体、例えば、アトリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ）（ＡＣＴＥＭＲＡ（商標）；Ｃｈｕｇａｉ／Ｒｏｃｈｅ）；ＩＬ－１５抗体、例えば、ＨｕＭａｘ－Ｉｌ－１５（Ｇｅｎｍａｂ／Ａｍｇｅｎ）；ケモカインレセプター抗体、例えば、ＣＣＲ２抗体（例えば、ＭＬＮ１２０２；Ｍｉｌｌｉｅｎｅｕｍ）；抗補体抗体、例えば、Ｃ５抗体（例えば、エクリズマブ，５Ｇ１．１；Ａｌｅｘｉｏｎ）；ヒト免疫グロブリンの経口製剤（例えば、ＩｇＰＯ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；ＩＬ－１２抗体、例えば、ＡＢＴ－８７４（ＣＡＴ／Ａｂｂｏｔｔ）；テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）（ＢＭＳ－２２４８１８；ＢＭＳ）；Ｓ２Ｃ６およびそのヒト化変異体を含むＣＤ４０抗体（国際公開第００／７５３４８号）およびＴＮＸ１００（Ｃｈｉｒｏｎ／Ｔａｎｏｘ）；ｃＡ２またはインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ＣＤＰ５７１、ＭＡＫ－１９５、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））、ペグ化ＴＮＦ－α抗体フラグメントを含むＴＮＦ－α抗体、例えば、ＣＤＰ－８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、Ｄ２Ｅ７（Ｋｎｏｌｌ）、抗ＴＮＦ－αポリクローナル抗体（例えば、ＰａｓｓＴＮＦ；Ｖｅｒｉｇｅｎ）；エプラツズマブＹ－９０およびエプラツズマブ（ｅｐｒａｔｚｕｍａｂ）Ｉ－１３１、アビオゲン（Ａｂｉｏｇｅｎ）のＣＤ２２抗体（Ａｂｉｏｇｅｎ，Ｉｔａｌｙ）、ＣＭＣ５４４（Ｗｙｅｔｈ／Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、コンボトックス（ｃｏｍｂｏｔｏｘ）（ＵＴ Ｓｏｕｔｗｅｓｔｅｒｎ）、ＢＬ２２（ＮＩＨ）、およびＬｙｍｐｏＳｃａｎ Ｔｃ９９（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）を含む、例えば、ＬＬ２またはエプラツズマブ（ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（登録商標）；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）のようなＣＤ２２抗体、を含むが、これらに限定されない。
【0025】
ＣＤ２０抗体の例は、今は「リツキシマブ」（「ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）」）と呼ばれる「Ｃ２Ｂ８」（米国特許第５，７３６，１３７号）；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．より市販される「イブリツモマブ・チウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ Ｔｉｕｘｅｔａｎ）」（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））または「Ｙ２Ｂ８」により設計されたイットリウム［９０］標識２Ｂ８マウス抗体（米国特許第５，７３６，１３７号；受け入れ番号ＨＢ１１３８８で１９９３年６月２２日にＡＴＣＣにより寄託された２Ｂ８）；マウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」、「トシツモマブ」とも呼ばれ、任意に１３１Ｉで標識され、Ｃｏｒｉｘａより市販される「ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ」抗体（ＢＥＸＸＡＲ（商標））または「１３１Ｉ－Ｂ１」を生成する（米国特許第５，５９５，７２１号も参照）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ６９（２）：５８４－５９１ （１９８７））および「フレームワークパッチ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｐａｔｃｈｅｄ）」またはヒト化１Ｆ５を含むその変異体（国際公開第２００３／００２６０７号、Ｌｅｕｎｇ， Ｓ．；ＡＴＣＣ寄託ＨＢ－９６４５０）；マウス２Ｈ７およびキメラ２Ｈ７抗体（米国特許第５，６７７，１８０号）；ヒト化２Ｈ７（国際公開第２００４／０５６３１２号、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．）；２Ｆ２（ＨｕＭａｘ－ＣＤ２０）、Ｂ細胞の細胞膜のＣＤ２０分子を標的とする全長ヒト、高親和性抗体（Ｇｅｎｍａｂ，Ｄｅｎｍａｒｋ；例えば、Ｇｌｅｎｎｉｅ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ８： ５０３－５１０ （２００３）およびＣｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １０１： １０４５－１０５２ （２００３）；国際公開第２００４／０３５６０７号；米国特許出願公開第２００４／０１６７３１９号参照）；国際公開第２００４／０３５６０７号および米国特許出願公開第２００４／０１６７３１９号（Ｔｅｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）に記載のヒトモノクローナル抗体；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｓｈｉｔａｒａ ｅｔ ａｌ．）に記載のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合コンプレックス型糖鎖を有する抗体；モノクローナル抗体、および、ＨＢ２０－３、ＨＢ２０－４、ＨＢ２０－２５、およびＭＢ２０－１１のようなＣＤ２０に結合する抗原結合フラグメント（国際公開第２００５／０００９０１号、Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）；ＡＭＥシリーズの抗体のような分子に結合するＣＤ２０、例えば、国際公開第２００４／１０３４０４号および米国特許出願公開第２００５／００２５７６４号（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ＡＭＥ）に記載されているＡＭＥ３３抗体；米国特許出願公開第２００５／００２５７６４号（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）に記載されているような分子に結合するＣＤ２０；Ａ２０抗体またはその変異体、例えば、キメラまたはヒト化Ａ２０抗体（それぞれ、ｃＡ２０、ｈＡ２０）またはＩＭＭＵ－１０６（米国特許出願公開第２００３／０２１９４３３号、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；米国特許出願公開第２００５／００６９５４５Ａ１号、および国際公開第２００５／１６９６９号（Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．）に記載の、エピトープ枯渇Ｌｅｕ－１６、１Ｈ４、または２Ｂ８を含み、任意にＩＬ－２と結合するＣＤ２０結合抗体；ＣＤ２２およびＣＤ２０と結合する二重特異性抗体、例えば、ｈＬＬ２ｘｈＡ２０（国際公開第２００５／１４６１８号、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｗｏｒｋｓｈｏｐから入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８－２、９３－１Ｂ３、Ｂ－Ｃ１、またはＮＵ－Ｂ２（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．のＬｅｕkｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ， Ｅｄ．， ｐ． ４４０， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８７））；１Ｈ４（Ｈａｉｓｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９２：１８４ （１９９８））；抗ＣＤ２０オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）Ｅ結合（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；抗ＣＤ２０－ＩＬ２（ＥＭＤ／Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ／Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）；抗ＣＤ２０ ＭＡｂセラピー（ＥｐｉＣｙｔｅ）；抗ＣＤ２０抗体ＴＲＵ０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ）を含む。
【0026】
本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、つまり、集団を構成する個々の抗体が、少量存在する、自然に発生し得る突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、種々の決定因子（エピトープ）に対して通常、種々の抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対するものである。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるとされる、抗体の性質を示し、いずれかの特定の方法によって抗体の産生を必要とするとは解釈されない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法により作製されることとしてもよく、または、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）により作製されることとしてもよい。さらなる実施形態では、「モノクローナル抗体」は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２－５５４ （１９９０）に記載される技術を用いて生成される抗体ファージライブラリーから分離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４－６２８ （１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１－５９７ （１９９１）は、ファージライブラリーを用いる、マウスおよびヒト抗体の分離についてそれぞれ記載する。後の文献は、鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９－７８３ （１９９２））による、高い親和性（ｎＭレンジ）のヒト抗体の産生について記載し、並びに、非常に大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして、組み合わせ感染およびｉｎ ｖｉｖｏでの組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， ２１：２２６５－２２６６ （１９９３））について記載している。よって、これらの技術は、モノクローナル抗体を分離するための、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する代替として実行可能である。代替的には、内因性の免疫グロブリン産生なしに、ヒト抗体の全てのレパートリーの産生を免疫化時に可能とする、形質転換動物（例えば、マウス）をすぐに産み出すことができる。例えば、キメラおよび生殖細胞系遺伝子変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性の抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載される。そのような生殖細胞系遺伝子変異マウスにおける、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移行は、抗原へのチャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：２５５１ （１９９３）； Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：２５５－２５８ （１９９３）； Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．， ７：３３ （１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８ （１９９２）参照。
【0027】
本明細書で、モノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来、または、特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する、抗体における対応する配列に対して同一または相同の「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含むが、鎖（複数を含む）の残りは、他の種由来の、または、他の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、並びに、所望の生物活性を示す限りそのような抗体のフラグメントに対応する配列に対して同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５ （１９８４））。
【0028】
本明細書で用いられる場合、用語「高頻度可変領域」とは、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」、または「ＣＤＲ」（つまり、軽鎖可変ドメインにおける残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）、並びに、重鎖可変ドメインにおける３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ． （１９９１））由来のアミノ酸残基、および／または「高頻度可変性ループ（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐ）」由来のそれらの残基（つまり、軽鎖可変ドメインにおける残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）および９１～９６（Ｌ３）、並びに、重鎖可変ドメインにおける２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７ （１９８７））を含む。「フレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される高頻度可変領域残基以外のこれらの可変ドメイン残基である。
【0029】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形成は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（受容体抗体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ））であり、受容体の高頻度可変領域由来の残基は、所望の特異性、親和性、および性能を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような、非ヒト種（ドナー抗体（ｄｏｎｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ））の高頻度可変領域由来の残基により置換される。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体において、または、ドナー抗体においてみられない残基を含むこととしてもよい。これらの変更は、さらに抗体性能を精製するためになされる。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含み、全てのまたは実質的に全ての高頻度可変性ループは非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、全てのまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列のそれらである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を含むであろう。
【0030】
ヒト化抗体の作製に使用される、ヒト可変ドメイン、軽鎖および重鎖の両方の選択は、抗原性の低減に非常に重要である。いわゆる「最良適合（ｂｅｓｔ－ｆｉｔ）」方法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒトの配列は、その後、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられている（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２２９６ （１９９３）； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１ （１９８７））。
【0031】
他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために用いることとしてもよい（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５ （１９９２）； Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ．， １５１：２６２３ （１９９３））。
【0032】
抗体は、抗原に対する高い親和性の維持、および、他の好ましい生物学的特性を有してヒト化されることがさらに重要である。この課題を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列、並びに、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いる種々の概念的ヒト化産生物の分析のプロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは普及しており、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の、可能性のある三次元立体構造を示して表示する、コンピュータプログラムが使用可能である。これらの表示の調査は、候補免疫グロブリン配列の機能における、残基について見込まれる役割の分析、つまり、その抗原に結合する、候補免疫グロブリンの性能に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。このように、所望の抗体特性、例えば、標的抗原（複数を含む）に関する親和性の増加を達成するように、ＦＲ残基は、受容体から選択されて、組み合わされ、そして配列を移入し得る。一般的には、ＣＤＲ残基は、直接的にかつほぼ実質的に、抗原結合への影響に関与している。
【0033】
「抗体フラグメント」は、抗体の全長の一部、一般的には、抗原結合領域またはその可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）；一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体、を含む。種々の技術は、抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。慣例上、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７ （１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１ （１９８５）参照）。しかしながら、現在、これらのフラグメントを組換え型の宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体フラグメントを、上述した抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替的には、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収され、化学的に結合されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７ （１９９２））。他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の集合を促進するために、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。他のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え型の宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体フラグメント産生のための他の技術は、当業者にとって明白であろう。
【0034】
他の実施形態では、選択する抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号参照。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単鎖ポリペプチドに存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概要に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９－３１５ （１９９４）参照。
【0035】
用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する、小さな抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）にて、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上で２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは、他の鎖の相補的ドメインと対になり、２つの抗原結合部位を形成することを強いられる。二重特異性抗体については、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８ （１９９３）により十分に記載されている。
【0036】
本出願で用いられる場合、表現「線状抗体」は、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．， ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７－１０６２ （１９９５）に記載されている抗体を指す。簡潔には、これらの抗体は、抗原結合領域のペアを形成するタンデム（ｔａｎｄｅｍ）Ｆｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）のペアを含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【0037】
「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なるエピトープに関する結合特異性を有し、それらエピトープは、通常、異なる抗原由来である。このような分子は、通常、２つの抗原のみに結合するが（つまり、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体のように追加の特異性を有する抗体は、本明細書で用いられる場合、この表現により包含される。ＢｓＡｂの例は、腫瘍細胞抗原に対する１つのアーム（ａｒｍ）および細胞傷害性トリガー分子（ｔｒｉｇｇｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に対する他のアームを有するもの、例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性腫瘍Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ－３、抗ＣＤ３／Ｌ－Ｄ１（抗結腸癌）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞粘着分子（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎腫瘍性（ｐａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）関連抗原（ＡＭＯＣ－３１）／抗ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合する１つのアームおよび毒素に結合する１つのアームを有するＢｓＡｂ、例えば、抗サポリン／抗Ｉｄ－１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド；酵素活性プロドラッグを変換するためのＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（マイトマイシンリン酸塩（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）プロドラッグのマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する）；血栓溶解薬として用いられ得るＢｓＡｂ、例えば、抗フィブリン／抗組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）；細胞表面レセプターに対する免疫複合体を標的にするためのＢｓＡｂ、例えば、抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）；感染疾病の治療に用いるためのＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ；ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍検出のためのＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂ；および診断ツールとしてのＢｓＡｂ、例えば、抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗βガラクトシダーゼ、を含む。三重特異性抗体の例は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７、および抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７を含む。二重特異性抗体は、全長の抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。
【0038】
２よりも多い原子価を有する抗体が考えられる。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７： ６０ （１９９１）。
【0039】
本明細書における目的に関する「裸の抗体（ｎａｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、細胞傷害性部分または放射標識に結合していない抗体である。
【0040】
本明細書における「インタクトな抗体」とは、２つの抗原結合領域およびＦｃ領域を有する。好ましくは、インタクトな抗体は、機能的なＦｃ領域を有する。
【0041】
「治療」は、治療処置および予防または防止手段の両方を指す。治療を必要とするのは、すでに疾患を有する者、並びに、疾患が防止されるべき者を含む。
【0042】
「疾患」は、本明細書に記載されるように精製された抗体による治療から利益を得るであろう、あらゆる状態である。これは、慢性および急性疾患、並びに、これらの疾患へと哺乳類を病気に罹らせるそれらの病的状態の両方を含む。
【0043】
語句「イオン交換クロマトグラフィー」は、化合物がそれらの正味の電荷に基づいて分離される、分離技術を指す。分子は、陰イオン（負の電荷を有する）または陽イオン（正の電荷を有する）のいずれかとして分類される。いくつかの分子（例えば、ポリペプチド）は、陰イオンおよび陽イオングループの両方を有することとしてもよい。
【0044】
陰イオン交換樹脂またはイオン交換ポリマーは、有機ポリマー基材から製造された、通常、小さな（直径１～２ｍｍ）ビーズの形態の、不溶性マトリックス（または支持構造）である。Ｈｏｒｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ． （２００４） Ｖｏｌ． ７６， Ｎｏ． ４， ｐｐ． ８８９－９０６。材料は、容易にイオンを捕捉して放出する部位である表面上に、高度に発達したポア構造を有する。イオンの捕捉は、他のイオンの放出と同時にのみ行われ、よって、そのプロセスはイオン交換とも呼ばれる。１つまたはいくつかの異なるタイプのイオンを選択的に選ぶように製造される、複合的な異なるタイプのイオン交換樹脂がある。
【0045】
最も典型的なイオン交換樹脂は、架橋したポリスチレンに基づく。必要とされる活性基は、重合後に導入され得、置換された単量体が用いられ得る。例えば、架橋結合は、重合プロセス時に、スチレンに対して０．５～２５％のジビニルベンゼンを加えることにより達成されることが多い。非架橋ポリマーは、安定性が低いので、まれにしか用いられない。架橋結合は、樹脂のイオン交換能を減少させ、イオン交換プロセスを達成するために必要とされる時間が延長される。粒子のサイズもまた、樹脂のパラメーターに影響を及ぼし、より小さな粒子はより大きな外表面を有するが、カラムプロセスにおけるより大きなヘッドロスを引き起こす。
【0046】
官能基が異なる、４つの主なタイプのイオン交換樹脂：強酸性（典型的には、スルホン酸基、例えば、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、または、ポリＡＭＰＳ）；強塩基性、（四級アミノ基（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）、例えば、ポリＡＰＴＡＣのようなトリメチルアンモニウム基）；弱酸性（主に、カルボン酸基））；弱塩基性（一級、二級、および／または三級アミノ基、例えば、ポリエチレンアミン）がある。特殊なタイプ：キレート樹脂（イミノ二酢酸、チオ尿素、および他多数）もある。
【0047】
イオン交換クロマトグラフィー膜は、全部の正または負の電荷により化合物と結合するであろう。結合部位は、吸着材のポアに沿って位置する。化合物は、対流により結合部位へ輸送される。正に帯電した膜（陰イオン交換）は、全部の負の電荷により化合物と結合するであろう。逆に、負に帯電した膜（陽イオン交換）は、全部の正の電荷により化合物と結合するであろう。
【0048】
イオン交換膜を強または弱のいずれかとしてさらに特徴づけることができる。強イオン交換膜は、ｐＨレベルの広い範囲にわたって帯電（イオン化）されている。弱イオン交換膜は、狭いｐＨ範囲内でイオン化されている。４つの最も一般的なイオン交換の化学的性質は以下である。
【0049】
【0050】
一般的には、イオン交換膜は０．１から１００μｍのポアサイズを有する。参照としては、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡＧ）は、３～５μｍの公称のポアサイズを有し、単層または多層フォーマットで市販される、強陰イオン交換膜であり、ムスタングＱ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、０．８μｍの公称のポアサイズを有し、同様に単層または多層フォーマットで市販される、強陰イオン交換膜である。他の参照としては、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡＧ）は、３～５μｍの公称のポアサイズを有し、単層または多層フォーマットで市販される、強陽イオン交換膜であり、ムスタングＳ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、０．８μｍの公称のポアサイズを有し、同様に単層または多層フォーマットで市販される、強陽イオン交換膜である。他の参照としては、ナトリックスＳ（Ｎａｔｒｉｘ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）は、高表面積マクロ多孔性ハイドロゲル内に包まれる不織性の高度な繊維耐久性ポリマー基質で構成される強陽イオン交換膜である。
【0051】
「公称の」ポアサイズの定格は、６０から９８％の大部分の微粒子が定格のポアサイズを維持するための膜の性能を表す。
【0052】
溶液の「ｐＨ」は、水試料のイオン化に対する酸性度またはアルカリ性度を計測する。水のｐＨは中性、つまり、７である。ほとんどのｐＨの読み取り値は０から１４の範囲である。水より高い［Ｈ＋］（７より低いｐＨ）を有する溶液は酸性であり、水より低い［Ｈ＋］（７より高いｐＨ）を有する溶液はアルカリ性である。ｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定され得る。バッファのｐＨは、ＨＣｌまたはＮａＯＨのような酸または塩基を用いて調節されることとしてもよい。
【0053】
ポリペプチドのような分子の「ｐＩ」または「等電点」は、ポリペプチドが同じ数の正および負の電荷を含むｐＨを指す。ｐＩは、ポリペプチドのアミノ酸残基の正味の電荷から算出され得、または、等電点分離法により測定され得る。陰イオンと陽イオングループの両方を有するポリペプチドの両性の性質は、操作されることとしてもよい。ポリペプチドのｐＨは、所望のポリペプチドが陽イオンとして作用する（正の電荷を有する）点にまで下げられることとしてもよい。代替的に、ポリペプチドのｐＨは、所望のポリペプチドが陰イオンとして作用する（負の電荷を有する）点にまで上げられることとしてもよい。
【0054】
用語「伝導率」は、２つの電極間の電流を伝導する溶液の性能を指す。伝導率の基本単位は、ジーメンス（ｓｉｅｍｅｎｓ）（Ｓ）であり、以前は、モー（ｍｈｏ）と呼ばれていた。伝導率は、通常、ｍＳ／ｃｍの単位で表される。溶液中のイオンの電荷は、電流の伝導度を促進させるので、溶液の伝導率は、そのイオン濃度に比例する。これらの測定はともに、イオン強度と十分に関連付けることができる。イオン強度は、電解質の濃度と密接に関連し、特定のイオンの電荷が、どの程度効果的に、電解質における他のイオンによりシールドされ、または、安定化されるのかを示す。イオン強度と電解質濃度との主な違いは、いくつかのイオンがより高く帯電した場合に、前者のほうがより高くなることである。両者の他の違いは、イオン強度がフリーイオンの濃度を反映し、単にどのくらいの塩を溶液に添加したのかではないことである。伝導率は、オリオン（Ｏｒｉｏｎ）伝導率メーターの種々のモデルのような伝導率メーターを用いて測定され得る。溶液の伝導率は、その中のイオンの濃度を変化させることにより変更されることとしてもよい。例えば、溶液中の緩衝剤の濃度および／または塩の濃度（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、または塩化カリウム）は、所望の伝導率を達成するために変更されることとしてもよい。好ましくは、種々のバッファの塩の濃度は、所望の導電率を達成するために変更される。
【0055】
膜クロマトグラフィーに関し、「流量」は、通常、１時間あたりの膜容量（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｏｌｕｍｅ）（ＭＶ／時）として記載される。
【0056】
膜クロマトグラフィーに関し、「負荷密度（ｌｏａｄ ｄｅｎｓｉｔｙ）」は、膜で１リットルあたりに処理される組成物のグラム数として表現されることが多い。
【0057】
「バッファ」は、酸－塩基結合成分の作用による、ｐＨの変化に抵抗する溶液である。例えば、バッファの所望のｐＨに応じて準備され得る種々のバッファは、Ｂｕｆｆｅｒｓ． Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇｕｅｆｆｒｏｙ， Ｄ．， Ｅｄ． Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （１９７５）に記載されている。
【0058】
ポリペプチドおよび１またはそれ以上の混入物を含む組成物からポリペプチドを「精製する」ことは、組成物から少なくとも１つの混入物を（完全にまたは部分的に）取り除くことにより、組成物におけるポリペプチドの純度を増加させることを意味する。「精製工程」とは、「均質」な組成物をもたらす全ての精製プロセスの一部であることとしてもよい。本明細書において「均質」は、組成物の総重量に基づき、少なくとも約７０重量％、好ましくは少なくとも約８０重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも約９５重量％の関心抗体を含む組成物を指すために用いられる。
【0059】
イオン交換膜への分子の「結合」とは、分子がイオン交換膜内またはイオン交換膜上で可逆的に固定化されるように、適切な条件下（ｐＨおよび／または伝導率）で、分子とイオン交換膜の帯電した基（複数を含む）との間の静電的相互作用によりイオン交換膜に分子を曝すことを意味する。
【0060】
イオン交換膜の「洗浄」とは、イオン交換膜中またはイオン交換膜上に適切なバッファを通すことを意味する。
【0061】
イオン交換膜からの分子（例えば、抗体または混入物）の「溶出」は、それらから分子を取り除くことを意味する。
【0062】
膜クロマトグラフィーに関し、「フロースルー」は、化合物が保持されていない場合の膜への不純物の結合を指す。
【0063】
膜クロマトグラフィーに関し、「競合吸着」は、所与の条件における、１より多い成分の膜への結合を指す。
【0064】
膜クロマトグラフィーに関し、「オーバーロードクロマトグラフィー」は、関心化合物および不純物の両方の膜への競合吸着の促進を指す。膜は、化合物の結合容量を超えてロードされる。不純物がより強く結合するという、化合物と不純物との異なる結合力を利用することにより、化合物は、不純物により置換され、膜から脱離し、膜溶出液中に流れ出る。
【0065】
「置換クロマトグラフィー」は、サンプルがカラムまたは膜上に配置され、その後、もとの混合物の成分よりもより強く吸収される溶質により置換される、クロマトグラフィー技術に関する。溶剤分離「ピーク」よりも、連続する「矩形」ゾーンの高度に濃縮された純物質に、成分が分離されることが結果となる。Ｔｕｇｃｕ （１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｖｏｌ ４２１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｐｐ ７１－８９。より高い産生濃度、より高い純度、より増加したスループットが、クロマトグラフィーの他のモードと比較して得られるかもしれない。置換クロマトグラフィーは、種々のアプリケーションにおける高いカラム負荷での複合混合物からのタンパク質の精製に関して効率的な技術である。置換クロマトグラフィーは、ベンチスケールでの標準的な分析的クロマトグラフィーカラムを用いて、複合混合物から精製タンパク質のｍｇ量を得ることに関し、十分に適している。また、特に、フィードにおける微量成分の濃縮に関し、十分に適している。置換クロマトグラフィーは、イオン交換、ＨＩＣ、およびＲＰＬＣを含む種々の樹脂システムを用いて容易に行うことができる。 Ｆｒｅｉｔａｇ ａｎｄ Ｂｒｅｉｅｒ． （１９９５） Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ ６９１， １０１－１１２。
【0066】
語句「混合モード」は、例えば、正味の電荷に基づく分離の上に積層されるポリペプチド間の親水性／疎水性の差に基づく分離のような、２つの異なるメカニズムに基づいて化合物を分離する性能を有する吸着剤を指す。これは、イオン性相互作用および水素結合または疎水性相互作用を含むいくつかの異なる方法で標的分子と相互に作用し得る多様式のリガンドの使用により達成されることが多い。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅのような吸着剤は、「混合モード」クロマトグラフィー樹脂の例である。
【0067】
「デプスフィルター」は、媒体により、むしろ単に媒体の表面上で、粒子を保持するために多孔質濾過媒体を用いる種々のフィルターである。これらのフィルターは、他のタイプのフィルターに対して相対的に、目詰まりする前に大量の粒子を保持できるので、濾過される液体が高負荷の粒子を含む場合に通常用いられる。
【0068】
「モノリス」は、特定のアプリケーションに関して、化学的に変更されている多孔性基材で構成されるクロマトグラフィー媒体を指す。イオン交換モノリスは、クロマトグラフィー樹脂に対する代替として開発され、典型的には、より多量の輸送とより低い圧力をもたらす高い浸透性および短い拡散距離を示し、より高い流速および／またはより短い滞留時間での使用を可能にする。
【0069】
本発明の実施に関する形態
本明細書において、本発明は、ポリペプチドおよび１つまたはそれ以上の混入物を含む組成物（例えば、水溶液）からポリペプチドを精製する方法を提供する。組成物は、一般的には、ポリペプチドの組換え型の産生物から得られるものであるが、ペプチド合成（または他の合成手段）によるポリペプチドの産生から得られることとしてもよく、または、ポリペプチドの天然源（ｎａｔｉｖｅ ｓｏｕｒｃｅ）からポリペプチドを精製することとしてもよい。好ましくは、ポリペプチドはＣＨ２／ＣＨ３領域を含むポリペプチドである。好ましい実施形態では、ＣＨ２／ＣＨ３領域を含むポリペプチドは抗体である。
本明細書において、本発明は、ポリペプチドおよび１つまたはそれ以上の混入物を含む組成物（例えば、水溶液）からポリペプチドを精製する方法を提供する。組成物は、一般的には、ポリペプチドの組換え型の産生物から得られるものであるが、ペプチド合成（または他の合成手段）によるポリペプチドの産生から得られることとしてもよく、または、ポリペプチドの天然源（ｎａｔｉｖｅ ｓｏｕｒｃｅ）からポリペプチドを精製することとしてもよい。好ましくは、ポリペプチドはＣＨ２／ＣＨ３領域を含むポリペプチドである。好ましい実施形態では、ＣＨ２／ＣＨ３領域を含むポリペプチドは抗体である。
【0070】
抗体の組換え型の産生
ポリペプチドの組換え型の産生に関し、ポリペプチド配列をコードする核酸は、単離されて、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または、発現のために、複製可能なベクターに挿入される。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子への特異的な結合を可能とするオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）を用いて、容易に単離されて、配列決定される。多くのベクターが使用可能である。ベクター成分は、一般的に、１つまたはそれ以上の、下記シグナル配列、複製開始点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３４，６１５号に具体的に記載されているように）を含むが、これらに限定されない。
ポリペプチドの組換え型の産生に関し、ポリペプチド配列をコードする核酸は、単離されて、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または、発現のために、複製可能なベクターに挿入される。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子への特異的な結合を可能とするオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）を用いて、容易に単離されて、配列決定される。多くのベクターが使用可能である。ベクター成分は、一般的に、１つまたはそれ以上の、下記シグナル配列、複製開始点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３４，６１５号に具体的に記載されているように）を含むが、これらに限定されない。
【0071】
本明細書において、ベクターにおけるＤＮＡをクローニングまたは発現するための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、または高度な真核生物細胞である。本目的に関して適する原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物のような真正細菌を含み、例えば、大腸菌のようなエシェリシア属、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ・チフィリウムのようなサルモネラ、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）のようなセラチア、および赤痢菌、のような腸内細菌、並びに、枯草菌およびリケニホルミス菌（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０に記載されているバチルス・リケニフォルミス４１Ｐ）のような桿菌、緑膿菌のようなシュードモナス、およびストレプトマイセスである。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）のような他の菌株も適する。これらの例は、限定するというよりもむしろ例示である。
【0072】
原核生物に加えて、糸状菌類または酵母のような真核生物の微生物は、ベクターをコードする抗体に関するクローニングおよび発現宿主に適する。出芽酵母または一般のパン酵母は、下等な真核生物の宿主微生物の間で最も一般的に用いられる。しかしながら、シゾサッカロミセス・ポンベ；クリベロマイセス属宿主、例えば、クリベロマイセス・ラクチス、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、クリベロマイセス・ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、クリベロマイセス・ウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、クリベロマイセス・ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、クリベロマイセス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、クリベロマイセス・テモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびクリベロマイセス・マルキシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ；シュワニオマイセスオクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）のようなシュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；並びに、例えば、ニューロスポーラ、ペニシリウム、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）のような糸状菌類、および、アスペルギルス・ニデュランスやアスペルギルス・ニガーのようなアスペルギルス属宿主のような他の属、種、および菌株は、一般的に入手可能であり、本明細書において有用である。
【0073】
グリコシル化ポリペプチドの発現に関して適する宿主細胞は、多細胞性生物由来である。脊椎動物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。数多くのバキュロウイルス菌株および変異体、並びに、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、およびカイコのような宿主由来の、対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。遺伝子導入のための種々のウイルス株、例えば、キンウワバ科ＮＰＶのＬ－１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ－５株が一般的に利用可能であり、本明細書においては、そのようなウイルスは、特に、スポドプテラ・フルギペルダの細胞の遺伝子導入に関し、本発明に係るウイルスとして用いられることとしてもよい。また、コットン、コーン、ポテト、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養は、宿主として利用され得る。
【0074】
しかしながら、関心はこの上ない脊椎動物細胞にあり、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の普及によりルーチン手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ－７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓細胞（懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９ （１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６ （１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３－２５１ （１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４－６８ （１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝腫瘍細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）を含むが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞が抗体の発現に関して好ましいことが多く、本発明により精製される抗体を産生するのに有利に使用されるかもしれない。
【0075】
宿主細胞は、ポリペプチド産生のために、上記発現またはクローニングベクターにより形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために適切であるとして改変された、慣用されている栄養培地で培養される。
【0076】
本発明のポリペプチドを産生するために用いられる宿主細胞は、種々の培地で培養されることとしてもよい。Ｈａｍ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４ （１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５ （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；米国特許第４，５６０，６５５号；もしくは米国特許第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載されるあらゆる培地が、宿主細胞用の培地として使用されることとしてもよい。これらのあらゆる培地は、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、バッファ（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、アミノグリコシド系抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、微量元素（通常、マイクロモルレンジの最終濃度で存在する、無機化合物として定義される）、並びにグルコースまたは同等のエネルギー源を補うこととしてもよい。あらゆる他の必要な補足は、当業者によって知られる適切な濃度で含まれることとしてもよい。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で前に使用されたものであり、それらは当業者にとって明らかであろう。
【0077】
組換技術を用いる場合、ポリペプチドは、細胞内で細胞周辺腔にて産生され得、または、培地中に直接分泌される。ポリペプチドが細胞内に産生される場合には、最初のステップとして、微粒子状の破片、宿主細胞または溶解した細胞（例えば、ホモジナイゼーションからの結果として生じる）のいずれかが、例えば、遠心分離または限外濾過により取り除かれる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮されることとしてもよい。
【0078】
本発明の一態様は、ＣＥＸカラムへのゲンタマイシンの影響が考えられる。ゲンタマイシン、および他のアミノグリコシド系抗生物質は、無抵抗コンタミネーションを防止するために、細胞培養アプリケーションにおける殺菌性の添加物として用いられ得る。細胞培養に添加される場合に、それはプロセス関連性不純物として取り除かれなければならない。典型的な除去は、アフィニティクロマトグラフィー工程を用いて達成されるが、いくつかのプロセスでは、親和工程が最初の精製工程ではないかもしれない。
【0079】
陽イオン性アミノグリコシド系抗生物質として、ゲンタマイシンは、中性のｐＨで、または、中性より低いｐＨで正に帯電されている。中性のｐＨで、または、中性より低いｐＨで、関心ポリペプチドを結合させる意図により、ＣＥＸカラムが最初のクロマトグラフィー工程である場合、ゲンタマイシンはカラム上の結合部位に関して競合するであろう。以前の研究は、ゲンタマイシンが、ＣＥＸ膜または樹脂に対して、抗体よりも強く結合し得るということを示している。ＣＥＸカラムにおける効果は、抗体結合能において減少することは明らかである。
【0080】
本発明の他の態様は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、または他の陽イオンポリマーのＣＥＸカラムへの影響が考えられる。ＰＥＩは、大腸菌ポリペプチド精製プロセスにおける、前収集凝集剤として用いられ得る。ＰＥＩが、細胞ホモジナイゼーション工程後に添加される場合、それは不純物結合剤として作用し、遠心分離および濾過の両方をより強いプロセスにする。この工程を組み込むことによる懸念は、不純物を凝集するのに用いられないあらゆる余分なＰＥＩの影響であり、その理由は、その後、最終的にＣＥＸカラムに接触する精製プールにそれが残るからである。
【0081】
直線または分岐ポリマーにわたり、ＰＥＩの多くの異なる形態があり、それらは、一級、二級、または三級アミンを含み得る。ＰＥＩの形状は、それが大多数のプロセス条件で正に荷電するという事実ほどの懸念ではない。よって、それは非常に強くＣＥＸカラムに結合する。さらに、ほとんどの大腸菌タンパク質に関する最初のクロマトグラフィー工程は、相対的に高い結合容量を有することから、ＣＥＸカラムであることとしてもよい。さらに、ＰＥＩに対するＣＥＸカラムの強い結合のため、ＰＥＩが各ランのあとにカラムから溶出され得るように、より弱いＣＥＸカラムの使用を必要とする場合もある。
【0082】
以前の研究は、異なるレベルのＰＥＩが凝集に使用される場合、より低いＰＥＩレベルが用いられると、ＣＥＸカラムの結合容量は増加することを示している。また、ＣＥＸクロマトグラフィー工程の収率が、ロード時におけるより低いレベルのＰＥＩにより増加することが観察されている。
【0083】
不純物を減少させるために、イオン交換カラムの前に、同様に帯電させたイオン交換膜を用いることは、結合容量、収率、不純物クリアランスの増加をもたらし得、それらの全てがより効果的なプロセスと操作コストの低減を可能にし得る。
【0084】
本発明の膜イオン交換クロマトグラフィー方法
本発明の好ましい実施形態では、本明細書における精製方法が行われる組成物は、組換え型の産生ポリペプチド、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）または大腸菌の組換え型の宿主細胞培養により発現される、インタクトな抗体である。任意に、組成物は、膜イオン交換クロマトグラフィー前に、少なくとも１つの精製工程が行われる。組成物は、関心ポリペプチドおよび１つまたはそれ以上の混入物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質（ＣＨＯＰ）；大腸菌タンパク質（ＥＣＰ）；浸出プロテインＡ；核酸；所望の抗体の変異体、フラグメント、凝集物、または誘導体；他のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス混入物；アミノグリコシド系抗生物質成分（例えば、ゲンタマイシン）；または精製プロセスに添加されるイオンポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリビニルアミン、ポリアルギニン、ポリビニルスルホン酸、ポリアクリル酸）等を含む。
本発明の好ましい実施形態では、本明細書における精製方法が行われる組成物は、組換え型の産生ポリペプチド、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）または大腸菌の組換え型の宿主細胞培養により発現される、インタクトな抗体である。任意に、組成物は、膜イオン交換クロマトグラフィー前に、少なくとも１つの精製工程が行われる。組成物は、関心ポリペプチドおよび１つまたはそれ以上の混入物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質（ＣＨＯＰ）；大腸菌タンパク質（ＥＣＰ）；浸出プロテインＡ；核酸；所望の抗体の変異体、フラグメント、凝集物、または誘導体；他のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス混入物；アミノグリコシド系抗生物質成分（例えば、ゲンタマイシン）；または精製プロセスに添加されるイオンポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリビニルアミン、ポリアルギニン、ポリビニルスルホン酸、ポリアクリル酸）等を含む。
【0085】
膜イオン交換クロマトグラフィー方法の前、最中、またはあとに行われる追加の精製手順の例は、疎水性相互作用クロマトグラフィー上の分取（例えば、ＰＨＥＮＹＬ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上）、エタノール沈殿、熱沈着、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、アイソエレクトリックフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ＨＥＰＡＲＩＮ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿法、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親水性電荷誘導クロマトグラフィー、高性能接線流濾過（ＨＰＴＦＦ）、およびアフィニティクロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、または特異性基質、リガンド、もしくは抗原を捕獲剤として用いる）を含む。
【0086】
組換技術を用いる場合、ポリペプチドは、細胞内で細胞周辺腔にて産生され得、または、培地中に直接分泌される。ポリペプチドが細胞内に産生される場合には、最初のステップとして、微粒子状の破片、宿主細胞または溶解した細胞のいずれかが、例えば、遠心分離または限外濾過により取り除かれる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、組換え型の宿主細胞は、例えば、遠心分離または濾過により、細胞培養培地から分離されることとしてもよい。
【0087】
抗体を分離する場合には、ほとんどの精製は、最初の工程として用いる場合、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーの最中に生じる。プロテインＡは、抗体のＦｃ領域と特異的に結合する、バクテリアの細胞壁タンパク質である。クロマトグラフィー媒体上に固定化された場合、プロテインＡは、精製組換え型抗体に関する技術を提供し、その理由は、それが選択的に複合溶液中の抗体を結合でき、不純物をフロースルーさせることを可能にするからである。
【0088】
プロテインＡアフィニティカラムの基本的な手順は直接的であり、ほぼ中性のｐＨで結合し、酸性のｐＨで溶出する。固相上へ固定化されたプロテインＡは、ＣＨ２／ＣＨ３領域含有ポリペプチドを精製するために用いられる。固相は、好ましくは、プロテインＡを固定化するためのガラス、シリカ、アガロース、またはポリスチレンジビニルベンゼン表面を含むカラムである。好ましくは、固相は、コントロールされた細孔ガラスカラム、ケイ酸カラム、高度に架橋されたアガロースカラムである。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されるＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムは、抗体の精製に有効な高度に架橋されたアガロースプロテインＡカラムの例である。場合によっては、カラムへの非特異的な付着を防ぐために、カラムはグリセロールのような試薬でコートされている。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されるＰＲＯＳＥＰ Ａ（商標）カラムは、グリセロールでコートされているプロテインＡコントロール細孔ガラスカラムの一例である。プロテインＡクロマトグラフィーの固相は、適切なバッファにより平衡化されている。
【0089】
組換え型の宿主細胞由来の混入調製物は、平衡化バッファと同じであることとしてもよいローディングバッファを用いて、平衡化された固相上にロードされる。混入調製物は固相を通り、ポリペプチドが固定化したプロテインＡに吸着され、他の混入物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質、ポリペプチドがＣＨＯ細胞で産生されるＣＨＯＰ、ゲンタマイシン、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ））は、固相に非特異的に結合する。
【0090】
続いて行われる次の工程は、中間洗浄工程における、塩、アミノ酸、および／または疎水性電解質溶剤を含む溶液での固相の洗浄により、固相に結合した混入物の除去を必要とする。好ましい実施形態では、この洗浄における塩はリン酸カリウムであり、アミノ酸はアルギニンであり、疎水性電解質はＴＥＭＡＣおよび／またはＴＥＡＣである。洗浄時には単一の溶質が存在するが、特定の実施形態では、２つまたはそれ以上のこのような溶質が用いられることとしてもよい。溶質は、好ましくは、ほぼ中性のｐＨを有するｐＨバッファ溶液に添加される。
【0091】
前項の中間洗浄工程に続いて、関心ポリペプチドをカラムから回収する。これは、通常、適切な溶出バッファを用いて達成される。ポリペプチドは、例えば、約２から約５の範囲、好ましくは約２．５から約３．５の範囲の低ｐＨを有する溶出バッファを用いてカラムから溶出することとしてもよい。本目的に関する溶出バッファの例はクエン酸またはアセテートバッファを含む。
【0092】
膜イオン交換クロマトグラフィーは、本明細書で主張されるように行われる。陰イオンまたは陽イオン交換膜のいずれで準備されるのかが、最初に決定される。いくつかの抗体の等電点（ｐＩ）は約６．７から９．４の範囲であるが、多くの抗体のｐＩは高い（＞８が多く、時々＞９）。一般的には、陽イオン交換膜は約８より大きいｐＩを有する抗体に使用され、陰イオン交換膜は約８より小さいｐＩを有する抗体に使用され得る。
【0093】
オーバーロードモードにおける膜陽イオン交換クロマトグラフィーのランに関し、ロードする物質のｐＨは、抗体のｐＩを約１から約５ｐＨ単位下回って調製され、ロードする物質の伝導率は、ｐＨに応じて約４０ｍＳ／ｃｍ以下に調節され、抗体は、その後、膜を通って放出される。いくつかの実施形態では、ロードする物質のｐＨは、抗体のｐＩを約１から約４ｐＨ単位、約１から約３ｐＨ単位、約１から約２ｐＨ単位、または約１ｐＨ単位、下回って調製される。他の実施形態では、ロードする物質の伝導率は、ｐＨに応じて、約２０ｍＳ／ｃｍ以下または約１０ｍＳ／ｃｍ以下に調節される。ロードのｐＨは抗体のｐＩよりも低いので、抗体は（正に帯電しており）最初には通過しないであろう。さらに、抗体は、陽イオン交換の負の官能基に静電気的に結合しているであろう。これは、抗体（正）および膜（負）が反対電荷を有しているからである。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー中に抗体とともに溶出する、多くの混入物、例えば、ＣＨＯＰまたはＥＣＰのような宿主細胞のタンパク質、ゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のようなイオンポリマー添加物、のｐＩは、抗体のｐＩとは少しだけ異なっている、つまり、それらのｐＩは約０．０５から約０．２ｐＩ単位だけ異なり得るので、「塩基性」の抗体のようなこれらの混入物もまた、膜に結合するであろう。プロテインＡクロマトグラフィーを使用しない精製スキームでは、ゲンタマイシンもしくはＰＥＩまたは他の不純物は、膜が使用されない限り、ＩＥＸカラムの性能を妨害するのに十分に高い濃度で留まるであろう。理論に拘束されることなく、最小限のイオン遮蔽により電荷を誘発するｐＨおよび伝導率条件での、オーバーロードモードの膜陽イオン交換クロマトグラフィーのランに関し、競合吸着が発生し、混入物は優先的に膜に結合し、または、さもなければ、効果的に抗体を膜から「移動」させ（ＲＲ Ｄｒａｇｅｒ ， ＦＥ Ｒｅｇｎｉｅｒ， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３５９：１４７－５５ （１９８６））、結合後に、抗体をマトリックスまたはフロースルーから「溶出」させて、溶出液に回収することを可能にするようである。
【0094】
オーバーロードモードにおける膜陰イオン交換クロマトグラフィーのランに関し、ロードする物質のｐＨは、抗体のｐＩを約１から約５ｐＨ単位上回って調製され、ロードする物質の伝導率は、ｐＨに応じて約４０ｍＳ／ｃｍ以下に調節され、抗体は、その後、膜を通って放出される。いくつかの実施形態では、ロードする物質のｐＨは、抗体のｐＩを約１から約４ｐＨ単位、約１から約３ｐＨ単位、約１から約２ｐＨ単位、または約１ｐＨ単位、上回って調製される。他の実施形態では、ロードする物質の伝導率は、ｐＨに応じて、約２０ｍＳ／ｃｍ以下または約１０ｍＳ／ｃｍ以下に調節される。ロードのｐＨは抗体のｐＩよりも高いので、抗体は（負に帯電しており）最初には通過しないであろう。さらに、抗体は、陰イオン交換の正の官能基に静電気的に結合しているであろう。これは、抗体（負）および膜（正）が反対電荷を有しているからである。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー中に抗体とともに溶出する、多くの混入物、例えば、ＣＨＯＰのような宿主細胞のタンパク質のｐＩは、抗体のｐＩとは少しだけ異なっている、つまり、それらのｐＩは約０．０５から約０．２ｐＩ単位だけ異なり得るので、「酸性」の抗体のようなこれらの混入物もまた、膜に結合するであろう。理論に拘束されることなく、最小限のイオン遮蔽により電荷を誘発するｐＨおよび伝導率条件での、オーバーロードモードの膜陰イオン交換クロマトグラフィーのランに関し、競合吸着が発生し、混入物は優先的に膜に結合し、または、さもなければ、効果的に抗体を膜から「移動」させ（ＲＲ Ｄｒａｇｅｒ ， ＦＥ Ｒｅｇｎｉｅｒ， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３５９：１４７－５５ （１９８６））、結合後に、抗体をマトリックスまたはフロースルーから「溶出」させて、溶出液に回収することを可能にするようである。
【0095】
一例では、膜クロマトグラフィーは、圧力計、センサ、およびポンププラスポンプコントローラ（ｐｕｍｐ ｐｌｕｓ ｐｕｍｐ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）を備えるＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような、カスタムクロマトグラフィーシステムまたはスタンダードクロマトグラフィーシステムのいずれかの上でのランである。この例では、膜デバイスは圧力計の下流に設置される。上記の例では、ｐＨおよび伝導率検出器は、膜デバイスの下流に設置される。この例を続けると、システムは、十分に水で流し、その後、膜を設置する前に平衡化バッファを流す。この例をさらに続けると、溶液のｐＨおよび伝導率出力が平衡化バッファの仕様と一致（約５膜容量）し、かつ安定したベースラインが確認されるまで、膜を取り付けたシステムに平衡化バッファを流す。この例をよりさらに続けると、フィード物質を、３３３～２６６７ＭＶ／時、ｐＨ５．５（仮定上の「塩基性」抗体の精製用）またはｐＨ８．０（仮定上の「酸性」抗体の精製用）、および約４ｍＳ／ｃｍの伝導率でポンプによりロードする。この例をよりさらに続けると、作動背圧（ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｂａｃｋｐｒｅｓｓｕｒｅ）、並びに、作動中のｐＨおよび伝導率が記録される。最後に、この例では、２８０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）吸光度トレースがベースラインを超える０．２吸光度ユニットである場合に、膜溶出液中のポリペプチドが直ちに収集される。フィード物質をロードしたあと、膜は適切な洗浄バッファで洗浄され、プール採取は、２８０ｎｍでのＵＶトレースが０．２吸光度をいったん下回ると停止され、膜溶出液分画におけるプールからのサンプルは、ポリペプチド濃度、二量体／凝集レベル、宿主細胞のタンパク質、ＤＮＡ、および浸出プロテインＡに関して分析される。工程収率は、典型的には、ロードされたポリペプチドおよび膜溶出液中のポリペプチドを用いて算出される。膜は、慣例上、１回のみの使用である。分析的アッセイに関し、ポリペプチド含有量（ポリペプチド濃度）は、Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて２８０ｎｍでの吸光度により測定されることとしてもよい。ポリペプチド凝集は、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定されることとしてもよい。宿主細胞のタンパク質、例えば、ＣＨＯＰまたはＥＣＰのレベルは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により分析されることとしてもよい。宿主細胞ＤＮＡは、ＴａｑＭＡＮ ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の使用により定量化されることとしてもよい。浸出プロテインＡは、プロテインＡ樹脂のベンダーにより推奨される、免疫化学的なＥＬＩＳＡをベースとする方法を用いて行われることとしてもよい。ゲンタマイシンは、ＥＬＩＳＡおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）により分析されることとしてもよく、レベルは、ＱセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィーまたは核磁気共鳴（ＮＭＲ）により定量化されることとしてもよい。
【0096】
以下のバッファは、仮定上で設計され、Ｓ膜で使用するために試験される：（１）８９ｍＭ酢酸、１２７ｍＭ トリスベース、２１ｍＭクエン酸、ｐＨ５．５、６．０ｍＳ／ｃｍ、（２）２８ｍＭ ＭＥＳ、９５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、１１ｍＳ／ｃｍ、（３）２００ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、１２ｍＳ／ｃｍ、（４）１００ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、６．４ｍＳ／ｃｍ、（５）９６ｍＭ酢酸、６５ｍＭ トリス、ｐＨ５．０、３．６ｍＳ／ｃｍ、（６）２５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．１、０．８ｍＳ／ｃｍ、（７）５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、９０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＳ／ｃｍ、（８）０．５ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、４．５ｍＭ 酢酸、ｐＨ５．０、８．０ｍＳ／ｃｍ、２５ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０、６．０ｍＳ／ｃｍ。
【0097】
以下のバッファは、仮定上で設計され、Ｑ膜で使用するために試験される：（１）５０ｍＭ トリス、１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、４．３ｍＳ／ｃｍ、（２）２５ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、１．３ｍＳ／ｃｍ、（３）６０ｍＭ トリス、１１８ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、１５．７ｍＳ／ｃｍ、（４）５０ｍＭ トリス、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ８．０、７．０ｍＳ／ｃｍ、（５）２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８５ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０、６．５ｍＳ／ｃｍ、および（６）９１ｍＭ酢酸、１３０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、５．０ｍＳ／ｃｍ、（７）７５ｍＭ グリシン、９ｍＭ リン酸、１１５ｍＭ トリス、ｐＨ８．９、０．８ｍＳ／ｃｍ（８）２５ｍＭ トリス、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９、１．０ｍＳ／ｃｍ、（９）２５ｍＭ トリス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０、１．５ｍＳ／ｃｍ、（１０）１ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．３、１５．２ｍＳ／ｃｍ。
【0098】
さらに、あらゆるバッファシステムは、適切なｐＨに到達させるために、酢酸、クエン酸、ＨＥＰＥＳ、塩酸、リン酸、水酸化ナトリウム、トリス、または他のこのような酸性および塩基性のバッファの添加によりｐＨを上または下に調製し得る。また、あらゆるバッファシステムは、適切な伝導率に到達させるために、精製水、注射用水（ＷＦＩ）、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸カリウム、または他のこのような低度および高度の塩含有バッファの使用により伝導率を上または下に調節し得る。
【0099】
競合吸着膜クロマトグラフィー工程の開発は、種々のレベルのｐＨおよび伝導率で膜を通過するロード物質のロードに関与する。関心ポリペプチドまたは混入物のいずれかのポリペプチドの保持は、分子が大きな静電的相互作用を有する場合に、高められ得る。静電的相互作用は、ポリペプチドが高度に帯電された条件下で操作される場合に、つまり、ポリペプチドの電荷を高める、ポリペプチドのｐＩとは十分に異なるｐＨ、およびバッファイオンによる電荷の遮蔽を防止するための低イオン強度を有するバッファを用いる場合に、高められ得る。対照的に、静電的相互作用は、ポリペプチドが不十分に帯電された条件下で操作される場合に、つまり、ポリペプチドの電荷を低減させる、ポリペプチドのｐＩとは十分に近いｐＨ、およびバッファイオンによる電荷の遮蔽を許容するための高イオン強度を有するバッファを用いる場合に、低減され得る。結果として、異なる物理化学特性を有するポリペプチドは、バッファ溶液を最適化することによる膜吸着により分離され得る。いくつかの分子は所与の膜上に保持され得、一方、他のものがバッファのｐＨおよびイオン強度の適切な選択に基づいて流出する。
【0100】
本明細書の膜イオン交換クロマトグラフィー方法により得られるポリペプチド調製物は、必要に応じて追加の精製工程が行われることとしてもよい。さらなる精製工程の例は上記のとおりである。
【0101】
図１を参照すると、抗体に関する成功的な精製スキームの一例は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、その後の結合および溶出モードでのランにおける陽イオン交換カラム、その後の最後の研磨工程（複数を含む）による、最初の捕獲工程を伴う回収プロセスである。
【0102】
図１を参照すると、向上された精製スキームの一例は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、その後の結合および溶出モードでの陽イオン交換カラムのランを保護するオーバーロードモードでの陽イオン交換膜のラン、その後の最後の研磨工程（複数を含む）による、最初の捕獲工程を伴う回収プロセスである。
【0103】
図１を参照すると、向上された精製スキームの他の例は、結合および溶出モードでの陽イオン交換カラムのランを保護するオーバーロードモードでの最初の陽イオン交換膜のラン、その後の研磨工程（複数を含む）を伴う回収プロセスである。
【0104】
図２を参照すると、非抗体に関する成功的な精製スキームの一例は、陽イオン交換クロマトグラフィー、その後の最後の研磨工程（複数を含む）による、最初の捕獲工程を伴う回収プロセスである。
【0105】
図２を参照すると、向上された精製スキームの一例は、結合および溶出モードでの陽イオン交換カラムのランを保護するオーバーロードモードでの最初の陽イオン交換膜のラン、その後の研磨工程（複数を含む）を伴う回収プロセスである。
【0106】
単一の精製工程または最後の研磨工程として主にＩＥＸ膜を用いるアプリケーションとは異なり、本精製方法における膜は、同様に帯電させたイオン交換膜（例えば、陽イオン交換樹脂の前に直接配置される陽イオン交換膜）を保護するために用いられる。膜は、カラムに向かう不純物を低減しまたは排除するように、ポリペプチド／抗体よりも不純物に関してより選択的であるため、このことは有益である。不純物はまた、ポリペプチド／抗体を移動させ得、結果的にそれがカラム上へ移動する。膜は、上記カラムで連続的にまたは非連続的に使用され得る。
【0107】
この精製方法において同様に帯電させたイオン交換カラムの前に膜を使用することは、ロードにおける不純物が陽イオン交換カラムの性能を低下させるときにはいつでも有効であるかもしれない。膜でこれらの不純物を除去することにより、陽イオン交換カラムについて、高い結合容量でロードすることが可能となり得、削減されたカラムのサイズまたは１回のランあたりのサイクル数の低減をもたらす。代替的には、膜でこれらの不純物を除去することにより、陽イオン交換カラムについて、高い工程収率を有すること、または廃棄までのより長い樹脂寿命を有すること、または陽イオン交換プールにおける低減された不純物レベルをもたらすこと、または、下流の研磨工程の回数を低減されることを可能とするかもしれない。また、プロテインＡアフィニティ樹脂に代わるより安価なものが必要とされていた場合、または関心ポリペプチドがプロテインＡアフィニティ樹脂に結合しない場合に有用であるとして、陽イオン交換カラムについて、プロテインＡアフィニティカラムと置き換えることを可能とするかもしれない。連続操作で陽イオン交換膜および陽イオン交換カラムを用いることは、トータルの処理時間、バッファ、またはタンクもしくはクロマトグラフィースキッド（ｓｋｉｄ）のような装置を低減することにより有利となるかもしれない。
【0108】
任意に、ポリペプチドは、必要に応じて、１つまたはそれ以上の異種性の分子と結合する。異種性の分子は、例えば、ポリペプチド（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）の血清半減期を増加させるものであることとしてもよく、または、それは、標識（例えば、酵素、蛍光標識および／または放射性核種）、もしくは細胞傷害性分子（例えば、毒素、化学療法剤、または放射性同位体等）であることとしてもよい。
【0109】
ポリペプチドを含み、任意に異種性の分子と結合する治療製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態での所望の純度の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０））を任意に有するポリペプチドの混合により調製されることとしてもよい。「薬学的に許容可能な」担体、賦形剤、または安定剤は、準備される容量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファ、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；プロテイン、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、またはグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；および／または非イオン界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【0110】
また、有効成分は、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メタクリル酸メチル（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルのそれぞれのような界面の重合により、または、例えばコアセルベーション技術により調製されたマイクロカプセル内に、コロイド薬物送達システム内に（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン内に、封入されることとしてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）に開示されている。
【0111】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与で使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
【0112】
徐放性調製物が準備されることとしてもよい。適切な徐放性調製物の例は、ポリペプチドを含む、固体疎水性ポリマーの半透性のマトリックスを含み、そのマトリックスは、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形状をした物である。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌグルタミン酸およびγエチルＬグルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドからなる注射用マイクロスフェア）並びにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。
【0113】
本明細書に開示される精製されたポリペプチドまたはポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、その後、種々の診断、治療、または、このようなポリペプチドおよび組成物に関して知られる他の用途に用いられる。例えば、治療に有効な量のポリペプチドを哺乳類に投与することにより、ポリペプチドを哺乳類における疾患を治療するために使用することとしてもよい。
【0114】
以下の実施例は、例示として提案され、限定するものではない。明細書中における全ての引用の開示は、参照により本明細書中に明確に組み込まれる。
【実施例0115】
実施例１
導入
本研究は、下流のカラムの効率を高めるために、競合吸着モードでイオン交換膜を用いるモノクローナル抗体の精製に焦点を合わせる。競合吸着モードでの膜操作は、モノクローナル抗体または他の関心ポリペプチドよりも強く多くの不純物と結合するので、膜は、同様に帯電させた下流のカラムで、効果的に有害な影響を有し得る不純物を除去する。
導入
本研究は、下流のカラムの効率を高めるために、競合吸着モードでイオン交換膜を用いるモノクローナル抗体の精製に焦点を合わせる。競合吸着モードでの膜操作は、モノクローナル抗体または他の関心ポリペプチドよりも強く多くの不純物と結合するので、膜は、同様に帯電させた下流のカラムで、効果的に有害な影響を有し得る不純物を除去する。
【0116】
このアプローチは、重複した陽イオン交換または陰イオン交換精製工程を省こうと試みる多くの精製プロセスに対して反直感的である。本出願では、下流のカラムより前の重複した膜が、カラムの性能を高めて、全体的なプロセスがより効率的になり得る。
【0117】
ｍＡｂ由来の１つの組換え型ＤＮＡ、１つのアームの抗体由来の１つの組換え型ＤＮＡ、およびポリペプチド由来の１つの組換え型ＤＮＡは、それらの分子の種類に基づく分析のために選択された。ｍＡｂはＣＨＯ細胞培養で産生され、非クロマトグラフィー精製から３つのカラムクロマトグラフィー工程（プロテインＡ、陰イオン交換、および陽イオン交換）の範囲の精製の程度に変化させた。１つのアームの抗体は、大腸菌細胞培養で産生され、プロテインＡクロマトグラフィー工程により精製された。ポリペプチドは、大腸菌細胞培養で産生され、事前のクロマトグラフィー精製は行わなかった。フィードストリーム（ｆｅｅｄｓｔｒｅａｍ）は、クロマトグラフィーカラムに否定的な影響を及ぼし得る不純物の残量のレベルに基づいて選択された。
【0118】
この研究は、イオン交換カラムに否定的な影響を及ぼすゲンタマイシンおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような不純物の性能、および、これらの不純物を取り除き、向上したカラム性能をもたらす、ムスタング（商標）ＳおよびナトリックスＳのようなイオン交換膜の性能を調査する。
【0119】
材料と方法
フィードストリーム
フィードストリームは、市販または調査目的のために最初に産生される工業的、試験的、またはスモールスケールの培養バッチ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。フィードストリームは、異なる精製度を有し、細胞が分離され、清澄液が少なくとも１つのカラムクロマトグラフィー工程により精製されたこと、または、精製されなかったことを意味する。各フィードストリームは、標的治療ポリペプチドおよび定量化が可能なレベルの不純物を含んでいた。各フィードストリームの組成物は、個々のポリペプチドプロセスおよび精製レベルに基づいて変化した。一覧表１は、本研究で用いられた各抗体、ポリペプチド、または一価抗体に関するフィードストリーム性能を示す。
フィードストリーム
フィードストリームは、市販または調査目的のために最初に産生される工業的、試験的、またはスモールスケールの培養バッチ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。フィードストリームは、異なる精製度を有し、細胞が分離され、清澄液が少なくとも１つのカラムクロマトグラフィー工程により精製されたこと、または、精製されなかったことを意味する。各フィードストリームは、標的治療ポリペプチドおよび定量化が可能なレベルの不純物を含んでいた。各フィードストリームの組成物は、個々のポリペプチドプロセスおよび精製レベルに基づいて変化した。一覧表１は、本研究で用いられた各抗体、ポリペプチド、または一価抗体に関するフィードストリーム性能を示す。
【0120】
【0121】
ａ全ての製品のフィードストックサンプルは、工業的、試験的、またはスモールスケールのプロセスから採取された。
ｂプールｐＨおよび伝導率は、十分な製品安定性を確保するためにあらかじめ調製されている。
ｃ等電点（ｐＩ）は、各ｍＡｂのアミノ酸配列に基づいて算出された。
ｂプールｐＨおよび伝導率は、十分な製品安定性を確保するためにあらかじめ調製されている。
ｃ等電点（ｐＩ）は、各ｍＡｂのアミノ酸配列に基づいて算出された。
【0122】
ポリペプチドの定量化
ポリペプチドの濃度は、３つの方法を用いて測定された。不純物レベルが、ＵＶ吸光度への明らかな影響を有するには低すぎた場合、２８０および３２０ｎｍでＵＶ分光光度スキャンが用いられた。不純物レベルまたは色がＵＶ吸光度、分析的アフィニティカラム、またはイオン交換カラムへの明らかな影響を有しているかもしれない場合、抗体またはポリペプチド濃度をそれぞれ定量化するために使用された。
ポリペプチドの濃度は、３つの方法を用いて測定された。不純物レベルが、ＵＶ吸光度への明らかな影響を有するには低すぎた場合、２８０および３２０ｎｍでＵＶ分光光度スキャンが用いられた。不純物レベルまたは色がＵＶ吸光度、分析的アフィニティカラム、またはイオン交換カラムへの明らかな影響を有しているかもしれない場合、抗体またはポリペプチド濃度をそれぞれ定量化するために使用された。
【0123】
ＵＶ分光光度スキャンにより試験されたサンプルに関し、ポリペプチドを含むサンプルは、適切な非干渉希釈剤により、０．１から１．０ＡＵの範囲に希釈された。サンプルの調製およびスペクトルスキャンリーディング（ｓｐｅｃ ｓｃａｎ ｒｅａｄｉｎｇ）が二重に行われ、平均値が記録された。試験されたポリペプチドの吸収係数は、１．４５から１．７０（ｍｇ／ｍＬ）－１ｃｍ－１であった。２８０および３２０ｎｍでの吸光度、希釈係数、経路長（１ｃｍ）、および吸収消衰係数（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）は、ランベルト・ベールの法則（Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔ Ｌａｗ）として知られる数式を用いて、ｍＡｂ濃度を算出するために使用された。
【0124】
【0125】
分析的アフィニティカラムにより試験されるサンプルに関し、抗体を含むサンプルは、必要に応じて、０．０２５～４．０ｍｇ／ｍＬの範囲で、適切な非干渉希釈剤により希釈された。代替的には、注入量は、それぞれ、より低いまたはより高い濃度のサンプルの２倍または半分とすることができた。サンプル調製およびＨＰＬＣ試験は二重に行われ、平均値が記録された。一般的な抗体のＨＰＬＣ分析として、サンプル濃度の結果は、標準物質の抗体の吸収消衰係数に対して対応する吸収消衰係数を用いることにより、特異的抗体に関して補正される。
【0126】
分析的イオン交換カラムにより試験されるサンプルに関し、ポリペプチドを含むサンプルは、必要に応じて、０．１～０．８ｍｇ／ｍＬの範囲で、適切な非干渉希釈剤により希釈された。サンプル調製およびＨＰＬＣ試験は二重に行われ、平均値が記録された。サンプル濃度の結果は、注入ピーク下の面積を総和することにより測定され、標準物質を用いるスタンダードカーブに対応付けた。
【0127】
ＣＨＯ宿主細胞のタンパク質（ＣＨＯＰ）の定量化
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が、ＣＨＯＰのレベルを定量化するために用いられた。親和－精製ヤギ抗ＣＨＯＰ抗体は、マイクロタイタープレートのウェル上で固定化された。ＣＨＯＰを含むサンプルの希釈、スタンダード、およびコントロールをウェル中でインキュベートし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合するヤギ抗ＣＨＯＰ抗体を用いてインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼの酵素活性は、ｏ－フェニレンジアミンジヒドロクロリドにより検出された。ＣＨＯＰは、マイクロタイタープレートリーダーにて、４９２ｎｍでの吸光度を読み取ることにより定量化された。コンピュータのカーブフィッティングプログラムが、スタンダードカーブを作成するために使用され、サンプル濃度が自動的に算出された。ＥＬＩＳＡに関する分析範囲は、典型的には、５ｎｇ／ｍｌから３２０ｎｇ／ｍｌであった。各サンプルに関し、２～４倍の希釈液が分析され、値が平均化された。ＣＨＯＰ値は、タンパク質濃度により除算され、結果はｐｐｍの単位で報告された（ｎｇＣＨＯＰ／ｍｇタンパク質）。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が、ＣＨＯＰのレベルを定量化するために用いられた。親和－精製ヤギ抗ＣＨＯＰ抗体は、マイクロタイタープレートのウェル上で固定化された。ＣＨＯＰを含むサンプルの希釈、スタンダード、およびコントロールをウェル中でインキュベートし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合するヤギ抗ＣＨＯＰ抗体を用いてインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼの酵素活性は、ｏ－フェニレンジアミンジヒドロクロリドにより検出された。ＣＨＯＰは、マイクロタイタープレートリーダーにて、４９２ｎｍでの吸光度を読み取ることにより定量化された。コンピュータのカーブフィッティングプログラムが、スタンダードカーブを作成するために使用され、サンプル濃度が自動的に算出された。ＥＬＩＳＡに関する分析範囲は、典型的には、５ｎｇ／ｍｌから３２０ｎｇ／ｍｌであった。各サンプルに関し、２～４倍の希釈液が分析され、値が平均化された。ＣＨＯＰ値は、タンパク質濃度により除算され、結果はｐｐｍの単位で報告された（ｎｇＣＨＯＰ／ｍｇタンパク質）。
【0128】
大腸菌タンパク質（ＥＣＰ）の定量化
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が、ＣＨＯＰの定量化と同様に、ＥＣＰのレベルを定量化するために用いられた。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が、ＣＨＯＰの定量化と同様に、ＥＣＰのレベルを定量化するために用いられた。
【0129】
ゲンタマイシンの定量化
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が、ゲンタマイシンのレベルを定量化するために用いられた。ゲンタマイシン－ＢＳＡに対するヤギポリクローナル抗体が、マイクロタイタープレートのウェル上に固定化される。抗体への結合に関し、ゲンタマイシンは、ビオチン－ゲンタマイシンと競合する。結合したビオチン－ゲンタマイシンの量は、酵素活性がテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）により検出される、西洋ワサビペルオキシダーゼ－ストレプトアビジンにより測定される。サンプルの認定中に確立される許容可能な希釈に従って、ＥＬＩＳＡ分析希釈剤によりサンプルが希釈される。マイクロタイタープレートリーダーにて、４５０ｎｍで吸光度を読み取ることにより、ゲンタマイシンは定量化される。最小４つのパラメーターのコンピュータのカーブフィッティングプログラムが、スタンダードカーブを作成するために使用され、サンプル濃度が自動的に算出される。典型的には、ゲンタマイシン分析におけるスタンダードカーブの報告範囲は、０．５８ｎｇ／ｍＬから９０ｎｇ／ｍＬである。各サンプルに関し、２～４倍希で分析され、値が平均化された。ゲンタマイシンの値は、タンパク質濃度により除算され、結果はｐｐｍの単位で報告された（ｎｇゲンタマイシン／ｍｇタンパク質）。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が、ゲンタマイシンのレベルを定量化するために用いられた。ゲンタマイシン－ＢＳＡに対するヤギポリクローナル抗体が、マイクロタイタープレートのウェル上に固定化される。抗体への結合に関し、ゲンタマイシンは、ビオチン－ゲンタマイシンと競合する。結合したビオチン－ゲンタマイシンの量は、酵素活性がテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）により検出される、西洋ワサビペルオキシダーゼ－ストレプトアビジンにより測定される。サンプルの認定中に確立される許容可能な希釈に従って、ＥＬＩＳＡ分析希釈剤によりサンプルが希釈される。マイクロタイタープレートリーダーにて、４５０ｎｍで吸光度を読み取ることにより、ゲンタマイシンは定量化される。最小４つのパラメーターのコンピュータのカーブフィッティングプログラムが、スタンダードカーブを作成するために使用され、サンプル濃度が自動的に算出される。典型的には、ゲンタマイシン分析におけるスタンダードカーブの報告範囲は、０．５８ｎｇ／ｍＬから９０ｎｇ／ｍＬである。各サンプルに関し、２～４倍希で分析され、値が平均化された。ゲンタマイシンの値は、タンパク質濃度により除算され、結果はｐｐｍの単位で報告された（ｎｇゲンタマイシン／ｍｇタンパク質）。
【0130】
ポリエチレンイミンの定量化
全てのデータは、５ｍｍ勾配のＴＣＩクライオプローブおよびオートサンプラーを備えるＢｒｕｋｅｒ６００ＭＨｚ分光計に記録された。データは、溶液中のタンパク質からの共鳴信号を最小化するために設計された、スピン－エコーパルスシーケンスを用いて取得された。励起彫刻（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ）パルスシーケンスは、プレサチュレーション（ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）パルスシーケンスと相まって、溶液中の水からの共鳴信号を最小化するように設計された。ＮＭＲ計測の前に、Ｄ２Ｏは、１０％最終濃度（６３０ｍＬのサンプル＋７０ｍＬのＤ２Ｏ）となるように、全てのサンプルに添加された。
全てのデータは、５ｍｍ勾配のＴＣＩクライオプローブおよびオートサンプラーを備えるＢｒｕｋｅｒ６００ＭＨｚ分光計に記録された。データは、溶液中のタンパク質からの共鳴信号を最小化するために設計された、スピン－エコーパルスシーケンスを用いて取得された。励起彫刻（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ）パルスシーケンスは、プレサチュレーション（ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）パルスシーケンスと相まって、溶液中の水からの共鳴信号を最小化するように設計された。ＮＭＲ計測の前に、Ｄ２Ｏは、１０％最終濃度（６３０ｍＬのサンプル＋７０ｍＬのＤ２Ｏ）となるように、全てのサンプルに添加された。
【0131】
定量ＮＭＲ分析は一般的な分析方法であり、非常に大量の有機分子に適用することができる。一般的に、全ての分子は、特徴的な共振周波数、相対的なピーク強度、線幅、および結合パターンによる、特有のＮＭＲシグナルのセットを有している。少ない（ｓｍａｌｌ）、陽子を含有する分子の濃度を測定するために適切であるとされる、ＮＭＲ分析に関する唯一の判断基準は、ＮＭＲシグナルの分析物およびバッファ成分が重複しないことである。ＮＭＲ分析は、広い範囲の分析物濃度にわたって正確かつ精密である（例えば、プロピレングリコールに関し、１ｕｇ／ｍＬから１５４，５００ｕｇ／ｍＬ）。
【0132】
クロマトグラフィー膜
試験される膜は、ムスタング（商標）Ｓ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびナトリックスＳ（Ｎａｔｒｉｘ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）であった。ムスタング（商標）ＳおよびナトリックスＳは、正に帯電したタンパク質およびウイルス性の粒子と効果的に結合する、強陽イオン交換膜である。ムスタング（商標）Ｓは、０．８μｍのポアを有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）から作られ、スルホン酸の形態により変更される。ナトリックスＳ膜は、フレキシブル多孔性支持マトリックス内に形成される高分子ハイドロゲルからなる。支持マトリックスは機械的強度を提供し、一方ハイドロゲルの性質は製品の分離化学作用を決定する。結合容量を高めるために、製造業者は、各デバイス内に多層の膜を組み合わせることができる。層および厚さの合計数は、製造される各デバイスのサイズおよび製造業者により異なる。膜容量（ＭＶ）は、膜の物理的な量であり（固形（ｓｏｌｉｄ）およびボイド）、ｍＬの単位で測定される。多重スケールを表す種々の膜デバイスがこの研究に用いられた。一覧表２は、試験された各膜の適切な仕様を表にしたものである。
試験される膜は、ムスタング（商標）Ｓ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびナトリックスＳ（Ｎａｔｒｉｘ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）であった。ムスタング（商標）ＳおよびナトリックスＳは、正に帯電したタンパク質およびウイルス性の粒子と効果的に結合する、強陽イオン交換膜である。ムスタング（商標）Ｓは、０．８μｍのポアを有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）から作られ、スルホン酸の形態により変更される。ナトリックスＳ膜は、フレキシブル多孔性支持マトリックス内に形成される高分子ハイドロゲルからなる。支持マトリックスは機械的強度を提供し、一方ハイドロゲルの性質は製品の分離化学作用を決定する。結合容量を高めるために、製造業者は、各デバイス内に多層の膜を組み合わせることができる。層および厚さの合計数は、製造される各デバイスのサイズおよび製造業者により異なる。膜容量（ＭＶ）は、膜の物理的な量であり（固形（ｓｏｌｉｄ）およびボイド）、ｍＬの単位で測定される。多重スケールを表す種々の膜デバイスがこの研究に用いられた。一覧表２は、試験された各膜の適切な仕様を表にしたものである。
【0133】
【0134】
クロマトグラフィー樹脂
試験される樹脂は、フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）およびＳＰセファロースファストフロー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）であった。フラクトゲルＳＥ ＨｉｃａｐおよびＳＰセファロースファストフロー樹脂は、強陽イオン交換樹脂である。フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐ樹脂は、約８００Åのポアサイズを有する、直径４０から９０μｍの架橋されたポリメタクリレート粒子からなる。機能的なリガンドは、長い、直鎖ポリマーで粒子と共有結合している。ＳＰセファロースファストフロー樹脂は、約４，０００，０００Ｄａの排除限界を有する、直径４５から１６５μｍの高度に架橋されたアガロース粒子からなる。セファロースファストフローは、官能基としてのスルホプロピルリガンドを有する、セファロースの架橋された誘導体である。架橋結合方法は、製造業者が所有する。
試験される樹脂は、フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）およびＳＰセファロースファストフロー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）であった。フラクトゲルＳＥ ＨｉｃａｐおよびＳＰセファロースファストフロー樹脂は、強陽イオン交換樹脂である。フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐ樹脂は、約８００Åのポアサイズを有する、直径４０から９０μｍの架橋されたポリメタクリレート粒子からなる。機能的なリガンドは、長い、直鎖ポリマーで粒子と共有結合している。ＳＰセファロースファストフロー樹脂は、約４，０００，０００Ｄａの排除限界を有する、直径４５から１６５μｍの高度に架橋されたアガロース粒子からなる。セファロースファストフローは、官能基としてのスルホプロピルリガンドを有する、セファロースの架橋された誘導体である。架橋結合方法は、製造業者が所有する。
【0135】
膜および樹脂精製システム
スモールスケールの試験は、統合型の定量ポンプ、圧力センサ、並びにインラインｐＨ、伝導率、ＵＶセンサを備える、プログラム可能な処理精製システムである、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）により行われた。探査システムは、コンピュータで起動するＵＮＩＣＯＲＮ（商標）ｖ５．１０ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を通じてプログラムされ、制御された。また、スモールスケールの試験は、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ（登録商標）Ｌ／Ｓ（登録商標）デジタルエコノミードライブペリスタルティックポンプ（ｄｉｇｉｔａｌ ｅｃｏｎｏｍｙ ｄｒｉｖｅ ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ，Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、インラインＤＴＸ（商標）Ｐｌｕｓ ＴＮＦ－Ｒ圧力センサ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、およびＡＮＤ ＥＫ－１２００ｉ天秤（Ａ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）からなるマニュアルのシステムを用いて行われた。天秤は、沈積流量を測定することにより、ポンプの流量を物理的にモニターするために用いられた。量は、１．０ｇ／ｍＬのフィードストリーム密度が想定される量に変換された。インライントランスデューサからの圧力および天秤からの量は、圧力および量のそれぞれの採取のために、コンピュータで起動するＴｒｅｎｄｌｉｎｋ（商標）バージョン３．１．１（Ｃａｎａｒｙ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｍａｒｔｉｎｓｂｕｒｇ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）およびＲｓＣｏｍバージョン２．４０（Ａ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）ソフトウェアにリンクされたＮｅｔＤＡＱ（商標）２６４０Ａ／４１Ａネットワークデータ取得システム（Ｆｌｕｋｅ，Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて連続的にモニタリングされた。
スモールスケールの試験は、統合型の定量ポンプ、圧力センサ、並びにインラインｐＨ、伝導率、ＵＶセンサを備える、プログラム可能な処理精製システムである、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）により行われた。探査システムは、コンピュータで起動するＵＮＩＣＯＲＮ（商標）ｖ５．１０ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を通じてプログラムされ、制御された。また、スモールスケールの試験は、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ（登録商標）Ｌ／Ｓ（登録商標）デジタルエコノミードライブペリスタルティックポンプ（ｄｉｇｉｔａｌ ｅｃｏｎｏｍｙ ｄｒｉｖｅ ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ，Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、インラインＤＴＸ（商標）Ｐｌｕｓ ＴＮＦ－Ｒ圧力センサ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、およびＡＮＤ ＥＫ－１２００ｉ天秤（Ａ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）からなるマニュアルのシステムを用いて行われた。天秤は、沈積流量を測定することにより、ポンプの流量を物理的にモニターするために用いられた。量は、１．０ｇ／ｍＬのフィードストリーム密度が想定される量に変換された。インライントランスデューサからの圧力および天秤からの量は、圧力および量のそれぞれの採取のために、コンピュータで起動するＴｒｅｎｄｌｉｎｋ（商標）バージョン３．１．１（Ｃａｎａｒｙ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｍａｒｔｉｎｓｂｕｒｇ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）およびＲｓＣｏｍバージョン２．４０（Ａ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）ソフトウェアにリンクされたＮｅｔＤＡＱ（商標）２６４０Ａ／４１Ａネットワークデータ取得システム（Ｆｌｕｋｅ，Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて連続的にモニタリングされた。
【0136】
膜フロースルーサンプルの採取技術
フロースルーサンプルは、３つの異なる方法で採取された。グラブサンプル（ｇｒａｂ ｓａｍｐｌｅ）および分画が最も一般的であった。グラブサンプルは、特定のスループットで得られる、フロースルーの瞬間的な少量の分取である。分画は、フロースルーサンプルよりも大きく、スループット範囲により定義される。また、フロースルーは、単一のラージプールとして採取された。プールの分析は効率的であるが、グラブサンプルおよび分画は、連続するサンプルを組み合わせて傾向を示すことができるので、一般的に、ｍＡｂおよび不純物レベルをモニタリングするにはより有用である。
フロースルーサンプルは、３つの異なる方法で採取された。グラブサンプル（ｇｒａｂ ｓａｍｐｌｅ）および分画が最も一般的であった。グラブサンプルは、特定のスループットで得られる、フロースルーの瞬間的な少量の分取である。分画は、フロースルーサンプルよりも大きく、スループット範囲により定義される。また、フロースルーは、単一のラージプールとして採取された。プールの分析は効率的であるが、グラブサンプルおよび分画は、連続するサンプルを組み合わせて傾向を示すことができるので、一般的に、ｍＡｂおよび不純物レベルをモニタリングするにはより有用である。
【0137】
動的結合容量（ＤＢＣ）技術
膜の動的結合容量（ＤＢＣ）および樹脂は、典型的なプロセス流量での媒体にフィードストリームをロードすることにより測定された。これは、静的結合容量を測定するために典型的になされていた、ロードしたフィードストリームに媒体を浸すことよりもむしろ好ましい。このアプリケーションに関し、ＤＢＣは、媒体性能のより適切な基準となった。ＤＢＣは、ロード段階中のフロースルーグラブサンプルまたは分画を採取することにより測定された。グラブサンプルまたは全ての分画の量に関する特定のスループット、および、全てのグラブサンプルまたは分画に関するポリペプチドまたは不純物の濃度を用いることは、ＤＢＣグラフを生成することを可能にした。さらに、ロード材料におけるポリペプチドまたは不純物の濃度が既知である場合、グラフは、ロードした濃度（Ｃ０）を濾過した濃度（Ｃ）と比較して生成できた。この場合、０のＣ／Ｃ０値は、濾過濃度がロードした濃度よりも非常に低いことを示し、一方、１のＣ／Ｃ０値は、濾過濃度がロードした濃度と同様であることを示す。
膜の動的結合容量（ＤＢＣ）および樹脂は、典型的なプロセス流量での媒体にフィードストリームをロードすることにより測定された。これは、静的結合容量を測定するために典型的になされていた、ロードしたフィードストリームに媒体を浸すことよりもむしろ好ましい。このアプリケーションに関し、ＤＢＣは、媒体性能のより適切な基準となった。ＤＢＣは、ロード段階中のフロースルーグラブサンプルまたは分画を採取することにより測定された。グラブサンプルまたは全ての分画の量に関する特定のスループット、および、全てのグラブサンプルまたは分画に関するポリペプチドまたは不純物の濃度を用いることは、ＤＢＣグラフを生成することを可能にした。さらに、ロード材料におけるポリペプチドまたは不純物の濃度が既知である場合、グラフは、ロードした濃度（Ｃ０）を濾過した濃度（Ｃ）と比較して生成できた。この場合、０のＣ／Ｃ０値は、濾過濃度がロードした濃度よりも非常に低いことを示し、一方、１のＣ／Ｃ０値は、濾過濃度がロードした濃度と同様であることを示す。
【0138】
実験
フィードストック（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）低温貯蔵から取り出され（２～８℃または≦－７０℃）、室温へと平衡化した。その後、適切な滴定剤（つまり、１．５Ｍトリス塩基または１Ｍクエン酸）または希釈剤（精製水または５Ｍ塩化ナトリウム）を用いて、任意に、一覧表１に示される条件から、ｐＨおよび／または伝導率を調節した。その後、低温貯蔵または調整中に形成されたかもしれないあらゆる沈殿物を取り除くために、ＡｃｒｏＰａｋ（商標）２０（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ＡｃｒｏＰａｋ（商標）１０００（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、または１０００ｍＬ真空フィルター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いてオフライン（ｏｆｆｌｉｎｅ）で濾過した。
フィードストック（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）低温貯蔵から取り出され（２～８℃または≦－７０℃）、室温へと平衡化した。その後、適切な滴定剤（つまり、１．５Ｍトリス塩基または１Ｍクエン酸）または希釈剤（精製水または５Ｍ塩化ナトリウム）を用いて、任意に、一覧表１に示される条件から、ｐＨおよび／または伝導率を調節した。その後、低温貯蔵または調整中に形成されたかもしれないあらゆる沈殿物を取り除くために、ＡｃｒｏＰａｋ（商標）２０（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ＡｃｒｏＰａｋ（商標）１０００（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、または１０００ｍＬ真空フィルター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いてオフライン（ｏｆｆｌｉｎｅ）で濾過した。
【0139】
精製システムは、精製水または適切なバッファを用いてロードおよびフロースルーラインを洗浄することにより準備された。膜は、フィードポンプまたは圧力センサの下流のインラインに配置され、その後、５０～５００ＭＶの精製水または平衡化バッファで洗浄した。洗浄後、フィードストリームが膜上にロードされ、種々の量が３３３～２６６７ＭＶ／時の一定流速でロードされた。ロード段階中に、必要に応じてフロースルーが採取された。その後、あらゆる残余生産物を収集するために、任意に、膜をバッファで追跡（ｃｈａｓｅ）した。膜上の不純物の保持を維持するために、追跡（ａ．ｋ．ａ洗浄バッファ）バッファは、一般的に、フィードに対して類似のｐＨおよび同等またはそれより低い伝導率であった。
【0140】
得られた膜グラブサンプル、分画、またはプールは、その後、ポリペプチドおよび／または不純物濃度を測定するために分析された。
【0141】
いくつかの場合には、得られた膜プールは、その後、樹脂上にロードされた。ＵＶ、ｐＨ、および伝導率がリアルタイムで傾向づけられ得るように、かつ、プーリングがインラインＵＶセンサにより容易になされ得るように、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒを用いる樹脂クロマトグラフィーのみが行われた。ロード段階中に、必要に応じてフロースルーが採取された。
【0142】
いくつかの場合には、膜が溶出された。膜溶出は、プーリングがインラインＵＶセンサにより容易になされ得るように、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒを用いてのみ行われた。膜は、高塩バッファ（２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび３５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５）を用いて溶出された。さらに、いくつかの場合には、２０ｍＬ以上の、２つのバッファ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５および２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５）の０から１００％の勾配により、膜は溶出された。
【0143】
いくつかの場合には、樹脂が溶出された。樹脂溶出は、プーリングがインラインＵＶセンサにより容易になされ得るように、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒを用いてのみ行われた。２００ｃｍ／時の一定流速で、高塩バッファ勾配（５０から５００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）または高塩工程（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）を用いて、樹脂は溶出され、フラクトゲルＳＥ ＨｉｃａｐおよびＳＰセファロースファストフローに関し、それぞれ０．５～１．０ＯＤまたは１．２５～１．２５ＯＤからプールされた。
【0144】
結果
スモールスケール陽イオン交換膜収率
ｐＨ８．０かつ５．０ｍＳ／ｃｍでのＭＡｂ１陰イオン交換プール、および、１Ｍクエン酸を用いてｐＨ５．５かつ６．４ｍＳ／ｃｍに調製されたｍＡｂ１陰イオン交換プールは、６６７ＭＶ／時でムスタング（商標）Ｓ膜により処理された。ムスタング（商標）Ｓ膜が使用されたのは、０．１８ｍＬ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）デバイスであった。ｐＨ５．５およびｐＨ８．０でのｍＡｂ１フィードストリームはともに抗体のｐＩを下回り、よって、正に帯電した。フィードおよびフロースルーグラブサンプルは、抗体濃度に関して分析された。最初のサンプルは、膜に対するいくつかの抗体結合を示したが、図３は、収率が両方のｐＨ条件で類似し、１０００ｇ／Ｌ負荷密度下で急速に増加し、約５０００ｇ／Ｌの負荷密度のあとに９６％以上が達成可能であることを示す。
スモールスケール陽イオン交換膜収率
ｐＨ８．０かつ５．０ｍＳ／ｃｍでのＭＡｂ１陰イオン交換プール、および、１Ｍクエン酸を用いてｐＨ５．５かつ６．４ｍＳ／ｃｍに調製されたｍＡｂ１陰イオン交換プールは、６６７ＭＶ／時でムスタング（商標）Ｓ膜により処理された。ムスタング（商標）Ｓ膜が使用されたのは、０．１８ｍＬ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）デバイスであった。ｐＨ５．５およびｐＨ８．０でのｍＡｂ１フィードストリームはともに抗体のｐＩを下回り、よって、正に帯電した。フィードおよびフロースルーグラブサンプルは、抗体濃度に関して分析された。最初のサンプルは、膜に対するいくつかの抗体結合を示したが、図３は、収率が両方のｐＨ条件で類似し、１０００ｇ／Ｌ負荷密度下で急速に増加し、約５０００ｇ／Ｌの負荷密度のあとに９６％以上が達成可能であることを示す。
【0145】
スモールスケール陰イオン交換膜収率
比較対象に関し、ｍＡｂ２は、７．７の等電点を超えて陰イオン交換膜を使用する試験のために選択された。タンパク質は高いｐＨでは脱アミドおよび凝集する傾向があるので、類似の試験はｍＡｂ１では行わなかった。ｐＨ５．５および９ｍＳ／ｃｍでの陽イオン交換プールは、１．５Ｍトリス塩基を用いて、ｐＨを８．０に調節した。フィードストックは、その後、３つの分離プールに分けられ、精製水を用いて伝導率が調節された。最初のプールは１０ｍＳ／ｃｍであり、２番目および３番目のプールは７ｍＳ／ｃｍおよび４ｍＳ／ｃｍにそれぞれ調節された。全ての３つのプールは、ｐＨ８．０に維持された。各フィードストリームは、その後、スモールスケールの０．３５ｍＬムスタング（商標）Ｑで６００ＭＶ／時の一定流速にて処理された。ｍＡｂ３はｐＨ８．０で、ｐＩを０．３ｐＨ単位上回り、よって、抗体は負に帯電した。ロードおよびフロースループールは、抗体濃度に関して分析された。図４は、収率が全ての３つのｐＨ濃度に類似し、最初に２００ｇ／Ｌの負荷密度下で急激に増加し、約１０００ｇ／Ｌの負荷密度のあとに９６％以上であることを示す。
比較対象に関し、ｍＡｂ２は、７．７の等電点を超えて陰イオン交換膜を使用する試験のために選択された。タンパク質は高いｐＨでは脱アミドおよび凝集する傾向があるので、類似の試験はｍＡｂ１では行わなかった。ｐＨ５．５および９ｍＳ／ｃｍでの陽イオン交換プールは、１．５Ｍトリス塩基を用いて、ｐＨを８．０に調節した。フィードストックは、その後、３つの分離プールに分けられ、精製水を用いて伝導率が調節された。最初のプールは１０ｍＳ／ｃｍであり、２番目および３番目のプールは７ｍＳ／ｃｍおよび４ｍＳ／ｃｍにそれぞれ調節された。全ての３つのプールは、ｐＨ８．０に維持された。各フィードストリームは、その後、スモールスケールの０．３５ｍＬムスタング（商標）Ｑで６００ＭＶ／時の一定流速にて処理された。ｍＡｂ３はｐＨ８．０で、ｐＩを０．３ｐＨ単位上回り、よって、抗体は負に帯電した。ロードおよびフロースループールは、抗体濃度に関して分析された。図４は、収率が全ての３つのｐＨ濃度に類似し、最初に２００ｇ／Ｌの負荷密度下で急激に増加し、約１０００ｇ／Ｌの負荷密度のあとに９６％以上であることを示す。
【0146】
スモールスケール陽イオン交換膜の不純物クリアランス
陽イオン交換膜の不純物クリアランスを評価するために、ｐＨ５．５かつ３．２ｍＳ／ｃｍでのｍＡｂ３プロテインＡプールは、スモールスケールの０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜で１３３３ＭＶ／時の一定流速にて処理された。ｍＡｂ３のロードは、算出されたｐＩを３．４単位下回り、よって、抗体は正に帯電した。ロード、フロースルー分画、および溶出サンプルが分析され、ＣＨＯＰに関する結果は図５に示される。データは、ムスタング（商標）Ｓが、最初に４３８から１０９ｐｐｍまでＣＨＯＰを低減することを示す。負荷密度が５５，３００ｇ／Ｌに達した時、ＣＨＯＰは３１８ｐｐｍに増加した。高い塩を含む溶液を用いて膜を溶出した。塩のイオンは、電荷を遮蔽するために使用され、よって、静電的相互作用を妨害し、タンパク質を膜表面から離脱させて、移動相中に自由に移動させる。溶出プールの分析は、静電力による膜へのＣＨＯＰ結合を裏付ける、不純物の濃縮を示す。
陽イオン交換膜の不純物クリアランスを評価するために、ｐＨ５．５かつ３．２ｍＳ／ｃｍでのｍＡｂ３プロテインＡプールは、スモールスケールの０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜で１３３３ＭＶ／時の一定流速にて処理された。ｍＡｂ３のロードは、算出されたｐＩを３．４単位下回り、よって、抗体は正に帯電した。ロード、フロースルー分画、および溶出サンプルが分析され、ＣＨＯＰに関する結果は図５に示される。データは、ムスタング（商標）Ｓが、最初に４３８から１０９ｐｐｍまでＣＨＯＰを低減することを示す。負荷密度が５５，３００ｇ／Ｌに達した時、ＣＨＯＰは３１８ｐｐｍに増加した。高い塩を含む溶液を用いて膜を溶出した。塩のイオンは、電荷を遮蔽するために使用され、よって、静電的相互作用を妨害し、タンパク質を膜表面から離脱させて、移動相中に自由に移動させる。溶出プールの分析は、静電力による膜へのＣＨＯＰ結合を裏付ける、不純物の濃縮を示す。
【0147】
吸着材性能をさらに評価するために、ｐＨ５．５かつ６．０ｍＳ／ｃｍでのｍＡｂ３陰イオン交換プールは、スモールスケールの０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜で６６７ＭＶ／時の一定流速にて処理された。ｍＡｂ３のｐＨは、ｐＩを３．４ｐＨ単位下回り、よって抗体は正に帯電した。フィードおよびフロースルーグラブサンプルは、ｍＡｂ、ＣＨＯＰ、およびゲンタマイシン濃度について分析された。フィードおよびグラブサンプル濃度を比較するために、膜負荷密度の関数としての、Ｃ／Ｃ０のグラフ（グラブサンプル／ロード）が生成された。図６に示されるように、ｍＡｂのＣ／Ｃ０値は、２～１６ｋｇ／Ｌの負荷密度で１．０に近く、グラブサンプル濃度がロードした濃度とほぼ同一であり、改めて収率が高くなるであろうことが示唆される。逆に、ＣＨＯＰおよびゲンタマイシンのＣ／Ｃ０値は低く、０．２以下で２～１６ｋｇ／Ｌの負荷密度であることから、グラブサンプル濃度がロードした濃度よりもかなり低く、ｍＡｂによるオーバーロードにも関わらず、ムスタング（商標）Ｓがこれらの不純物の大部分を取り除いていることが示唆される。
【0148】
スモールスケール陽イオン交換膜結合選択性
陽イオン交換膜が、ｍＡｂに対比して特定の不純物の結合に関して選択的かどうかを評価するために、ｍＡｂ３プロテインＡプールを用いる一連の実験が設計され実施された。このプールは、より高いレベルの不純物を理由に選択され、高分子量種（ＨＭＷＳ）、二量体、低分子量種（ＬＭＷＳ）、ゲンタマイシン、およびＣＨＯＰを含んでいた。プロテインＡプールは、ｐＨ５．５かつ４．４ｍＳ／ｃｍに調節された。ロード前に、各ムスタング（商標）Ｓ膜は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５かつ１．３ｍＳ／ｃｍバッファで平衡化された。４つの実験が行われ、各ローディングは、１０００、５０００、１００００、または１５０００ｇ／Ｌの負荷密度に対する０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜での１３３３ＭＶ／時であった。ローディング後に、膜は２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５かつ１．３ｍＳ／ｃｍバッファで洗浄された。洗浄後、洗浄バッファおよび２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウムをｐＨ５．１かつ約５００ｍＳ／ｃｍで用いる勾配溶出が膜を溶出するために使用された。勾配は、２０ｍＬ以上で形成され、溶出分画は２ｍＬごとに採取されて分析された。４つの実験に関し、溶出分画は、全ての不純物およびｍＡｂ濃度に関して分析された。あらゆる所与の負荷密度実験において、分画は、不純物またはｍＡｂが膜からいつ溶出したのかを測定するために、先に溶出した種よりもより強固に結合する、後に溶出した種と比較され得る。図７は、５０００ｇ／Ｌでの負荷密度実験に関する、１０分画溶出にわたって分析された種々の種の正規化濃度％を示す。各ピークの位置は、ｍＡｂ単量体は、最も早く溶出するので、最も弱く膜に結合していることを示唆する。結合力の低い順に、単量体、その後にＨＭＷＳ、二量体、ＣＨＯＰ、ＬＭＷＳ、およびゲンタマイシンが続く。多くの種が、勾配における類似の位置で溶出するが、このグラフは、ゲンタマイシンが、比較している種よりも、より強く結合することを明らかに示す。
陽イオン交換膜が、ｍＡｂに対比して特定の不純物の結合に関して選択的かどうかを評価するために、ｍＡｂ３プロテインＡプールを用いる一連の実験が設計され実施された。このプールは、より高いレベルの不純物を理由に選択され、高分子量種（ＨＭＷＳ）、二量体、低分子量種（ＬＭＷＳ）、ゲンタマイシン、およびＣＨＯＰを含んでいた。プロテインＡプールは、ｐＨ５．５かつ４．４ｍＳ／ｃｍに調節された。ロード前に、各ムスタング（商標）Ｓ膜は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５かつ１．３ｍＳ／ｃｍバッファで平衡化された。４つの実験が行われ、各ローディングは、１０００、５０００、１００００、または１５０００ｇ／Ｌの負荷密度に対する０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜での１３３３ＭＶ／時であった。ローディング後に、膜は２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５かつ１．３ｍＳ／ｃｍバッファで洗浄された。洗浄後、洗浄バッファおよび２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウムをｐＨ５．１かつ約５００ｍＳ／ｃｍで用いる勾配溶出が膜を溶出するために使用された。勾配は、２０ｍＬ以上で形成され、溶出分画は２ｍＬごとに採取されて分析された。４つの実験に関し、溶出分画は、全ての不純物およびｍＡｂ濃度に関して分析された。あらゆる所与の負荷密度実験において、分画は、不純物またはｍＡｂが膜からいつ溶出したのかを測定するために、先に溶出した種よりもより強固に結合する、後に溶出した種と比較され得る。図７は、５０００ｇ／Ｌでの負荷密度実験に関する、１０分画溶出にわたって分析された種々の種の正規化濃度％を示す。各ピークの位置は、ｍＡｂ単量体は、最も早く溶出するので、最も弱く膜に結合していることを示唆する。結合力の低い順に、単量体、その後にＨＭＷＳ、二量体、ＣＨＯＰ、ＬＭＷＳ、およびゲンタマイシンが続く。多くの種が、勾配における類似の位置で溶出するが、このグラフは、ゲンタマイシンが、比較している種よりも、より強く結合することを明らかに示す。
【0149】
さらに、各負荷密度に関し、カラムに結合する各不純物またはｍＡｂの総量を算出し、種々の負荷密度実験にわたって比較することができた。図８は、増加する膜負荷密度の関数として、各種の正規化質量％を示す。線の方向は、種の量が増加または減少しているかどうかを示す。以前に最も弱く結合することを示したｍＡｂ単量体は、負荷密度増加としての減少レベル量を有する。逆に、二量体、ＨＭＷＳ、ＣＨＯＰ、ゲンタマイシン、およびＬＭＷＳは全て、負荷密度増加として量が増加する。このことは、以前の結合力の結果を裏付け、絶えず膜に結合する他の種が原因で、ｍＡｂ単量体が減少することを示唆する。
【0150】
スモールスケール陽イオン交換膜置換
結合選択性を説明するための仮説として、ゲンタマイシンのような強く結合する種がｍＡｂ単量体を溶出できるかどうかを測定するために、ｍＡｂ３プロテインＡプールを用いて実験が行われた。プロテインＡプールは、ｐＨ５．５かつ４．２ｍＳ／ｃｍに調節された。実験は、ｐＨ５．４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムにより０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜を平衡化することにより行われた。ｍＡｂ１プロテインＡプールは、ＵＶの傾向（ｔｒｅｎｄ）がｍＡｂ漏出を明確に示すまでロードされた。その後、平衡化バッファにより膜を洗浄したあとに、平衡化バッファおよび２ｇ／Ｌゲンタマイシンを含有する溶出バッファを用いて膜を溶出した。なお、平衡化バッファおよび溶出バッファは、膜に結合するｍＡｂへのあらゆる影響を防止するために同一のｐＨおよび伝導率であった。図９は、ロード、洗浄、および溶出段階中のＵＶ、ｐＨ、および伝導率の傾向を含むクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、洗浄段階は、溶出段階が開始される前に、ベースラインにＵＶの傾向を戻すのに十分であったことを示す。また、溶出段階中に、あらゆるｐＨまたは伝導率の傾向の有意な変化がなく、大きなＵＶのピークが観察されることを示す。このことは、ゲンタマイシンが、陽イオン交換膜から、結合したｍＡｂ単量体を効果的に置換し得ることを明示する。
結合選択性を説明するための仮説として、ゲンタマイシンのような強く結合する種がｍＡｂ単量体を溶出できるかどうかを測定するために、ｍＡｂ３プロテインＡプールを用いて実験が行われた。プロテインＡプールは、ｐＨ５．５かつ４．２ｍＳ／ｃｍに調節された。実験は、ｐＨ５．４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムにより０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜を平衡化することにより行われた。ｍＡｂ１プロテインＡプールは、ＵＶの傾向（ｔｒｅｎｄ）がｍＡｂ漏出を明確に示すまでロードされた。その後、平衡化バッファにより膜を洗浄したあとに、平衡化バッファおよび２ｇ／Ｌゲンタマイシンを含有する溶出バッファを用いて膜を溶出した。なお、平衡化バッファおよび溶出バッファは、膜に結合するｍＡｂへのあらゆる影響を防止するために同一のｐＨおよび伝導率であった。図９は、ロード、洗浄、および溶出段階中のＵＶ、ｐＨ、および伝導率の傾向を含むクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、洗浄段階は、溶出段階が開始される前に、ベースラインにＵＶの傾向を戻すのに十分であったことを示す。また、溶出段階中に、あらゆるｐＨまたは伝導率の傾向の有意な変化がなく、大きなＵＶのピークが観察されることを示す。このことは、ゲンタマイシンが、陽イオン交換膜から、結合したｍＡｂ単量体を効果的に置換し得ることを明示する。
【0151】
ＣＥＸ膜のゲンタマイシン結合の比較
ゲンタマイシンのＣＥＸ膜への結合容量を測定するために、０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜および０．２３ｍＬナトリックスＳを試験する実験が行われた。ｐＨ７．２のＰＢＳバッファは、２．０Ｍ酢酸およびＰＷにより、最終的にｐＨ５．００かつ伝導率８．１０ｍＳ／ｃｍに調節された。その後、調節されたバッファは、最終濃度が約１．０ｍｇ／ｍＬかつ４０，０００ｎｇ／ｍＬとなるようにｍＡｂ３ＵＦ／ＤＦプールおよびゲンタマイシンが添加された。得られた添加液はロード用フィードストリームとして使用された。
ゲンタマイシンのＣＥＸ膜への結合容量を測定するために、０．１８ｍＬムスタング（商標）Ｓ膜および０．２３ｍＬナトリックスＳを試験する実験が行われた。ｐＨ７．２のＰＢＳバッファは、２．０Ｍ酢酸およびＰＷにより、最終的にｐＨ５．００かつ伝導率８．１０ｍＳ／ｃｍに調節された。その後、調節されたバッファは、最終濃度が約１．０ｍｇ／ｍＬかつ４０，０００ｎｇ／ｍＬとなるようにｍＡｂ３ＵＦ／ＤＦプールおよびゲンタマイシンが添加された。得られた添加液はロード用フィードストリームとして使用された。
【0152】
実験を行うために、両方の膜がＰＷで洗浄され、調節されたバッファで平衡化され、添加溶液でロードされ、調節されたバッファで洗浄された。ロード段階中に、４ｍＬフロースルーグラブサンプルが、２０、４０、６０、および８０ｍＬのムスタング（商標）Ｓに関して収集された。ナトリックスＳに関し、４ｍＬフロースルーグラブサンプルが、１０ｍＬで、その後６０ｍＬごとに合計１９サンプル収集された。全てのサンプルが、その後、ｍＡｂおよびゲンタマイシン濃度に関して分析し、ロード濃度を比較して、図１０に示されるように、膜負荷密度に対するＣ／Ｃ０のグラフを作成した。
【0153】
プロットされてはいないが、ｍＡｂ濃度は、１．０のＣ／Ｃ０値に達し、その工程がフロースルーにおける抗体に関して高い収率であることを示唆する。逆に、ゲンタマイシンのＣ／Ｃ０値は、かなりあとになって１．０に達し、両方の膜が有意なレベルで結合していることを示唆する。ムスタング（商標）Ｓは、４．４から８．９ｇ／Ｌｍの間のゲンタマイシンの結合容量を有するが、ナトリックスＳは、より高いゲンタマイシンの結合容量を有し、より遅い漏出を示した。５０ｇ／Ｌでは、Ｃ／Ｃ０値は０．３であり、漏出曲線は約１２５ｇ／Ｌｍまでやや線形であり、Ｃ／Ｃ０値は約０．８であった。１２５ｇ／Ｌｍよりあとの漏出曲線は平らになり、おそらく小レベルのｍＡｂは移動しているが、膜はまだゲンタマイシンと結合していることを示唆する。
【0154】
これらの結果は、異なるＣＥＸ膜が異なるゲンタマイシン結合容量および漏出曲線を有することを示す。より高い結合容量および段階的な漏出を有するナトリックスＳは、ゲンタマイシンを取り除くためのより効果的な膜となるであろう。さらに、より高レベルのゲンタマイシン結合により、より多くのｍＡｂが置換され、より高い操作収率をもたらすことが期待されるであろう。
【0155】
ＣＥＸ樹脂および強く結合するアミノグリコシド系抗生物質の影響
ゲンタマイシンがＣＥＸ樹脂の充填カラム上に有し得るように、強く結合する不純物に、何が影響を与えるのかについて測定するために、カラムを保護するＣＥＸ膜ありまたはなしで、モデルフィードストリームおよび実際のフィードストリームの両方で試験を行うための、一連の実験が設計された。図１１は、種々の実験、抗体および不純物の濃度、並びに、これらの実験を行うために必要とされる工程を示す。
ゲンタマイシンがＣＥＸ樹脂の充填カラム上に有し得るように、強く結合する不純物に、何が影響を与えるのかについて測定するために、カラムを保護するＣＥＸ膜ありまたはなしで、モデルフィードストリームおよび実際のフィードストリームの両方で試験を行うための、一連の実験が設計された。図１１は、種々の実験、抗体および不純物の濃度、並びに、これらの実験を行うために必要とされる工程を示す。
【0156】
最初に、ｍＡｂ３ＵＦ／ＤＦプールを添加したＰＢＳのモデルフィードストリームを用いて、漏出曲線を生成することにより、抗体結合容量に関し、異なるレベルのゲンタマイシン、フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐ樹脂が試験された。ＰＢＳは、まず１．０Ｍ酢酸でｐＨ５．０に調節され、その後、ＰＷにより伝導率８．０ｍＳ／ｃｍに調節された。ｍＡｂ濃度が約１．６ｍｇ／ｍＬとなるように、ＵＦ／ＤＦプールが調節されたバッファ内に添加された。
【0157】
実施された各クロマトグラフィー実験に関し、所望のフィードストリームでロードする前に、フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐは、まずｐＨ５の２５ｍＭ酢酸ナトリウムにより平衡化された。ロード後、カラムをｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムにより洗浄し、ｐＨ７．７の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳにより洗浄し、ｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムにより洗浄し、ｐＨ５．５の３５０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて溶出し、１Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて再生し、その後、カラムの次の使用まで０．１Ｎ ＮａＯＨで保存した。
【0158】
ゲンタマイシンを添加することなく、最初の実験を行い、１０８ｇ／Ｌの抗体ＤＢＣを示した。次に、上記調節および添加を、２４，１００ｍｇ／ｍＬの最終濃度となるようにゲンタマイシンの添加ありで行った。この実験は、減少した８９ｇ／Ｌの抗体ＤＢＣを示した。その条件が３０，５００のゲンタマイシン濃度で繰り返され、８８ｇ／Ｌの抗体ＤＢＣが算出された。このデータは、モデルシステムのＰＢＳ、精製された抗体、および異なるレベルのゲンタマイシンを使用する場合、ゲンタマイシンの存在が、フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐ樹脂上の抗体ＤＢＣを、１０８ｍｇ／ｍＬから約８８ｇ／Ｌに減少させることを示す。
【0159】
次に、約０．９ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ３、２４，１００～３０，０００ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および４０８，０００ｎｇ／ｍＬのＣＨＯＰを含む、収集された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を用いて、２つの実験が行われた。用いるＨＣＣＦは、ゲンタマイシンレベルで、モデルフィードストリームの６８および７１ｇ／Ｌの抗体ＤＢＣと一致する。８８および８９ｇ／ＬモデルフィードストリームＤＢＣと、ＨＣＣＦを用いる６８および７１ｇ／ＬのＤＢＣとの間の差に関する可能な説明は、フィードストリームにおける高いレベルのＣＨＯＰの存在である。
【0160】
図１２は、上記実験からの全ての抗体の漏出曲線、並びに、フィードストリームの不純物レベルおよび近似のＤＢＣを示す。また、ランからランにかけて、起こり得るカラムの劣化またはゲンタマイシンのキャリーオーバーを防ぐために、ランはランダム化した順序で行われた。実験の順序は図１２に付随する表に列挙される。実験順序および抗体ＤＢＣの間に相関関係はなかったので、カラムが劣化していたということ、または、ゲンタマイシンのキャリーオーバーが後のランに影響を及ぼしていたということはありそうにない。
【0161】
最後に、フィードストリーム中のゲンタマイシンの存在がカラムＤＢＣにおける有意な減少を示すこと、および、ＣＥＸ膜が有意なレベルの抗体と結合することなくゲンタマイシンと結合できることが分かり、ＣＥＸ膜がＣＥＸ樹脂の性能を保護および向上できるのかどうかを試験するために、２つの実験が行われた。ナトリックスＳは、ムスタング（商標）Ｓを上回って向上したゲンタマイシン結合容量を示したので、フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐを保護するために使用された。２ＬのＨＣＣＦが解凍され、２Ｍ酢酸でｐＨ５に調節され、ＰＷで８ｍＳ／ｃｍに調節され、フィードストリームの凍結および解凍からのあらゆる影響を取り除くためにオフラインで無菌濾過された。こうして調節および濾過されたフィードストリームから、ロードは、カラム上にロードされる一部分に分けられ、一方、残りの他の部分は０．７５ｍＬナトリックスＳで処理され、その後フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐ上にロードされた。両方のカラムのロード段階中に関し、１５ｍＬの分画が約６０サンプルずつ採取された。調節されたＨＣＣＦ、ナトリックスフロースルー、およびフラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐ分画は、抗体およびゲンタマイシン濃度に関して分析された。得られたＨＣＣＦおよびナトリックスのフロースルーフィードストリーム抗体および不純物濃度、並びに、得られたフラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐ漏出曲線は、図１３に示す。得られたデータは、ナトリックスが、調節されたＨＣＣＦで、ゲンタマイシンレベルを２４，１００ｎｇ／ｍＬから８７０ｎｇ／ｍＬへと十分に減少させたことを示す。ＣＨＯＰレベルは、４０８，０００ｎｇ／ｍＬから３２８，０００ｎｇ／ｍＬへと緩やかに減少した。抗体濃度は、調節されたＨＣＣＦの濃度の０．８８ｍｇ／ｍＬと比較して、わずかに低い０．８３ｍｇ／ｍＬであり、約９４％の収率を示した。最後に、得られたＣＥＸカラム漏出曲線は、調節されたＨＣＣＦおよびナトリックスフロースルーを用いる９４ｇ／Ｌの抗体ＤＢＣを使用した場合、カラムが７２ｇ／Ｌの抗体ＤＢＣを有したことを示す。このことは、ＣＥＸカラムにロードする前に、ＣＥＸ膜によりゲンタマイシン含有フィードストリームを通過することによる、約３０％のＤＢＣの増加を示す。
【0162】
ＣＥＸ膜のＥＣＰおよびＰＥＩ漏出
他の不純物、例えば、ＥＣＰまたはＰＥＩによりＣＥＸ膜を使用する場合に、同様の性能が観察できるかどうかを試験するために、一価抗体１のプロテインＡプールおよび０．２３ｍＬナトリックスＳ膜を使用する実験が行われた。使用されたプロテインＡプールは、１．５Ｍトリス塩基を用いて、前もってｐＨ６．７に調節され、ＰＷを用いて２．５ｍＳ／ｃｍの伝導率となるように希釈した。４．７ｇ／Ｌｈの抗体濃度、１３０ｕｇ／ｍＬのＰＥＩ、および８，８７０ｎｇ／ｍＬのＥＣＰを有するロードが、平衡化したナトリックスＳ上にロードされ、２ｍＬのフロースルー分画が１０サンプル、その後、５ｍＬ分画が１２サンプル採取された。フロースルー分画は、その後、抗体、ＰＥＩ、およびＥＣＰ濃度について分析され、その後、膜の抗体負荷密度に対するＣ／Ｃ０値を作成するために用いられた。図１４は、抗体およびＥＣＰの両方が、約１２３ｍｇ／ｍＬでＣＥＸ膜を漏出することを示す。定量化のＰＥＩレベルは３０ｕｇ／ｍＬであるため、最初のいくつかのサンプルは、そのレベルであるか、または、そのレベルを下回っており、図１４は、これらのサンプル中にいかなる濃度のＰＥＩが存在するのかが不明であったため、０．２３のＣ／Ｃ０値を示す。０．２３のＰＥＩレベルを検出する場合、ＰＥＩは、３３０ｍｇ／ｍＬで漏出するようであり、抗体およびＥＣＰよりも有意に遅い。これらの結果は、抗体収率に否定的な影響を与えることなく、ＣＥＸ膜がイオンポリマーを取り除くのにも有効であることを示唆する。
他の不純物、例えば、ＥＣＰまたはＰＥＩによりＣＥＸ膜を使用する場合に、同様の性能が観察できるかどうかを試験するために、一価抗体１のプロテインＡプールおよび０．２３ｍＬナトリックスＳ膜を使用する実験が行われた。使用されたプロテインＡプールは、１．５Ｍトリス塩基を用いて、前もってｐＨ６．７に調節され、ＰＷを用いて２．５ｍＳ／ｃｍの伝導率となるように希釈した。４．７ｇ／Ｌｈの抗体濃度、１３０ｕｇ／ｍＬのＰＥＩ、および８，８７０ｎｇ／ｍＬのＥＣＰを有するロードが、平衡化したナトリックスＳ上にロードされ、２ｍＬのフロースルー分画が１０サンプル、その後、５ｍＬ分画が１２サンプル採取された。フロースルー分画は、その後、抗体、ＰＥＩ、およびＥＣＰ濃度について分析され、その後、膜の抗体負荷密度に対するＣ／Ｃ０値を作成するために用いられた。図１４は、抗体およびＥＣＰの両方が、約１２３ｍｇ／ｍＬでＣＥＸ膜を漏出することを示す。定量化のＰＥＩレベルは３０ｕｇ／ｍＬであるため、最初のいくつかのサンプルは、そのレベルであるか、または、そのレベルを下回っており、図１４は、これらのサンプル中にいかなる濃度のＰＥＩが存在するのかが不明であったため、０．２３のＣ／Ｃ０値を示す。０．２３のＰＥＩレベルを検出する場合、ＰＥＩは、３３０ｍｇ／ｍＬで漏出するようであり、抗体およびＥＣＰよりも有意に遅い。これらの結果は、抗体収率に否定的な影響を与えることなく、ＣＥＸ膜がイオンポリマーを取り除くのにも有効であることを示唆する。
【0163】
ＣＥＸ樹脂および強結合イオンポリマーの影響
ＣＥＸ樹脂の充填カラム上にて、ＰＥＩのような強く結合する不純物に、何が影響を与えるのかについて測定するために、ポリペプチド１の抽出段階およびＳＰセファロースファストフローカラム上へのそれらの影響を用いて、ＰＥＩのレベルを評価する、一連の実験が行われた。フィードストリームは、この産生物に関してより純粋ではなく、カラム上に進むＰＥＩレベルを定量化することができなかったため、代わりに、抽出中に使用されるＰＥＩレベルに留意した。
ＣＥＸ樹脂の充填カラム上にて、ＰＥＩのような強く結合する不純物に、何が影響を与えるのかについて測定するために、ポリペプチド１の抽出段階およびＳＰセファロースファストフローカラム上へのそれらの影響を用いて、ＰＥＩのレベルを評価する、一連の実験が行われた。フィードストリームは、この産生物に関してより純粋ではなく、カラム上に進むＰＥＩレベルを定量化することができなかったため、代わりに、抽出中に使用されるＰＥＩレベルに留意した。
【0164】
これらの実験に関し、抽出された産生物は、０．７５から１．０５％の範囲の異なるレベルのＰＥＩで調製され、ＰＷにより希釈され、４つの遠心分離液サンプルを産生するために遠心分離された。各遠心分離液サンプルは、約ｐＨ７．０かつ８．０ｍＳ／ｃｍで、その後ＳＰセファロースファストフローカラムにロードされるとともに、フロースルーサンプルが採取され、ポリペプチド濃度が分析された。得られたデータは、樹脂ポリペプチドの負荷密度の関数としての、Ｃ／Ｃ０グラフを作成するために使用された。図１５は、漏出曲線、および、試験された各遠心分離液に関するカラムの対応するＤＢＣを示す。表に示されているように、ＰＥＩ％は抽出プロセス中に増加し、カラムのＤＢＣは減少する。
【0165】
さらに、ポリペプチド１を用いる実験の第２のセット上で、異なるＰＥＩ％の遠心分離液をＳＰセファロースファストフローカラムにロードし、その後にカラムを洗浄し、各実験用に溶出した。各実験から得られたプールは、その後、ポリペプチド濃度、ＥＣＰ、およびサイズ排除クロマトグラフによる産生物のサイズに関して分析された。図１６は、工程収率の減少をもたらす、抽出中に増加したレベルのＰＥＩ％、および、ＥＣＰ、産生凝集物、または二量体のような不純物のレベルが増加したプールを用いて生成されたことを示す。
【0166】
このＣＥＸカラムの前に、ＣＥＸ膜を用いる実験は行わなかったが、以前の研究からナトリックスＳによりＰＥＩが結合され得ることが分かり、ＰＥＩ％の関数としての減少したＣＥＸカラムの性能が分かったので、このフィードストリーム上でＣＥＸ膜を使用することが、カラムの結合容量だけでなく、得られるプールをも向上させることを仮定し得た。
【0167】
結論
イオン交換膜は、タンパク質結合を生じるｐＨおよび伝導率条件で、不純物の除去に効果的であることが示された。オーバーロードしたクロマトグラフィーを介する操作、および、不純物と関心タンパク質と間の競合吸着により、１０００～５０００ｇ／Ｌｍの負荷密度が達成されたあとに、９６％以上の収率が示された。陽イオン交換膜は、１６，０００ｇ／Ｌｍの負荷密度に対する０．２未満のＣ／Ｃ０値で、結合し、膜フロースルー分画におけるＣＨＯＰおよびゲンタマイシンのような不純物を有意に減少させることが示された。陽イオン交換膜はまた、高分子量種、二量体、低分子量種、ゲンタマイシン、およびＣＨＯＰを含む、より未精製のフィードストリームを用いる場合、抗体と比較して、特定の不純物の結合に関する選択性を呈することが示された。これらの研究では、これらの不純物が異なる強度で結合し、増加した膜負荷密度は継続した不純物の結合を示す一方、膜への抗体結合は減少し、小さな分子量の、高く帯電した種、例えばゲンタマイシンが、競合する種よりもかなり強く結合することが示された。さらに、競合吸着および置換クロマトグラフィーは、ゲンタマイシンを含有するバッファを用いる、陽イオン交換膜からの抗体の溶出により生じることが確認された。２つの陽イオン交換膜、ムスタング（商標）Ｓ、およびナトリックスＳは、それぞれ４．４～８．９ｇ／Ｌｍおよび５０ｇ／Ｌｍのゲンタマイシンに関し、動的結合容量を有することが示された。また、ナトリックスＳに関する漏出曲線は、ムスタング（商標）Ｓよりも緩やかであることが示された。ナトリックスＳは、従来の膜よりも高い結合容量を有するように設計されており、段階的な漏出とともに、この性能は、不純物を取り除くのに十分適している。
イオン交換膜は、タンパク質結合を生じるｐＨおよび伝導率条件で、不純物の除去に効果的であることが示された。オーバーロードしたクロマトグラフィーを介する操作、および、不純物と関心タンパク質と間の競合吸着により、１０００～５０００ｇ／Ｌｍの負荷密度が達成されたあとに、９６％以上の収率が示された。陽イオン交換膜は、１６，０００ｇ／Ｌｍの負荷密度に対する０．２未満のＣ／Ｃ０値で、結合し、膜フロースルー分画におけるＣＨＯＰおよびゲンタマイシンのような不純物を有意に減少させることが示された。陽イオン交換膜はまた、高分子量種、二量体、低分子量種、ゲンタマイシン、およびＣＨＯＰを含む、より未精製のフィードストリームを用いる場合、抗体と比較して、特定の不純物の結合に関する選択性を呈することが示された。これらの研究では、これらの不純物が異なる強度で結合し、増加した膜負荷密度は継続した不純物の結合を示す一方、膜への抗体結合は減少し、小さな分子量の、高く帯電した種、例えばゲンタマイシンが、競合する種よりもかなり強く結合することが示された。さらに、競合吸着および置換クロマトグラフィーは、ゲンタマイシンを含有するバッファを用いる、陽イオン交換膜からの抗体の溶出により生じることが確認された。２つの陽イオン交換膜、ムスタング（商標）Ｓ、およびナトリックスＳは、それぞれ４．４～８．９ｇ／Ｌｍおよび５０ｇ／Ｌｍのゲンタマイシンに関し、動的結合容量を有することが示された。また、ナトリックスＳに関する漏出曲線は、ムスタング（商標）Ｓよりも緩やかであることが示された。ナトリックスＳは、従来の膜よりも高い結合容量を有するように設計されており、段階的な漏出とともに、この性能は、不純物を取り除くのに十分適している。
【0168】
フィードストリームの増加におけるゲンタマイシン濃度としてのＤＢＣの減少とともに、ゲンタマイシンの存在下で、陽イオン交換樹脂が動的結合容量の変動を呈することが示された。フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐカラムは、０～３０，５００ｎｇ／ｍｇゲンタマイシンを含むモデルフィードストリームを用いて、１０８ｇ／Ｌから８８ｇ／ＬへとＤＢＣを減少させた。代表的なフィードストリームを用いたとき、フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐは、６８～７１ｇ／ＬのＤＢＣを示した。陽イオン交換膜有用性は、そのフィードストリームにおけるゲンタマイシン濃度を、収率９４％で、２４，１００ｎｇ／ｍｇから８７０ｎｇ／ｍｇのゲンタマイシンに減少させることができた場合に実証された。減少したゲンタマイシン濃度のフィードストリームは、フラクトゲルＳＥ Ｈｉｃａｐが、直接比較した場合の７２ｇ／Ｌと比較して、９４ｇ／ＬのＤＢＣを有することを可能にした。ゲンタマイシンに非常に似ており、陽イオン交換膜は、一価抗体およびＥＣＰの存在下で、高く帯電させた、ＰＥＩのようなイオンポリマーに結合することが示された。最終的に、陽イオン交換樹脂は、フィードストリームにおけるＰＥＩ濃度を変化させることにより、否定的な影響を受けることが示され、ＰＥＩ濃度の増加としてのプール不純物の増加および動的結合容量の減少をもたらした。ＰＥＩが上流で０．７５％から１．０５％に増加したとき、ＳＰセファロースファストフローカラムは、５１ｇ／Ｌから３６ｇ／Ｌに減少することが示された。別の研究では、上流で使用されたＰＥＩ濃度が０．６％から１．１％に増加したとき、工程収率は９６％から７０％に減少し、ＥＣＰは１５５ｎｇ／ｍｇから９０４ｎｇ／ｍｇに増加し、凝集物は２．５％から１７．３％に増加し、二量体は３．７％から５．９％に増加した。ＳＰセファロースファストフローカラムの前の陽イオン交換膜の使用は試験されなかったが、ＰＥＩによりカラムが否定的な影響を受けること、膜がＰＥＩとの結合に有効であること、適切なサイズの膜はカラムへ向かうＰＥＩ％を減少させてより高い結合容量およびへ収率と導く一方、プールの不純物濃度をも減少させることが分かった。
【0169】
より良い精製技術は、絶えず出現する。より高い結合容量のイオン交換樹脂が開発され、プロテインＡアフィニティ樹脂の代替としてのそれらの使用は、操作コストが減少する理由となりそうである。しかしながら、増加した不純物レベルのフィードストリーム、または、下流のアプリケーションでは概して観察されないゲンタマイシンまたはＰＥＩのような不純物に対して行われる場合、それらの真の有効性が減少されるかもしれない。このようなイオン交換樹脂前のイオン交換膜の使用は、カラム上にロードされる不純物を減少させることにより、カラムを保護することができる。このことは、より高い動的結合容量、工程収率の増加、またはプール不純物濃度の減少のような、カラムに関するいくつかの向上を導き得る。十分な不純物結合容量、量、および浸透性を有する適切な膜を選択することにより、２つの工程が連続的に操作され、さらなる操作時間および最終的な精製プロセスコストを低減するかもしれない。
【0170】
上記明細書は、本発明を実施する当業者が十分に実施できると考えられる。堆積された実施形態は本発明の特定の態様を１つの具体例として表されたものであるため、本発明は堆積された構成の範囲に限定されず、機能的に同等のあらゆる構成は本発明の範囲内である。本明細書における材料の堆積は、本明細書おいて含まれる記載が、そのベストモードを含む、本発明のあらゆる態様の実施を可能とするには不十分であることの承認を構成するものではなく、それが代表する特定の実施例に特許請求の範囲を限定することを構成するものでもない。実際に、本明細書において示され、かつ説明されたこれらに加えて、本発明の種々の変更は、上記の記載から当業者にとって明らかであり、添付の特許請求の範囲内のものであるといえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】