(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022103479
(43)【公開日】2022-07-08
(54)【発明の名称】ロイコ型色原体の安定化方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/531 20060101AFI20220701BHJP
C09B 15/00 20060101ALI20220701BHJP
C09B 67/44 20060101ALI20220701BHJP
C12Q 1/28 20060101ALI20220701BHJP
【ＦＩ】
G01N33/531 B
C09B15/00
C09B67/44 C
C12Q1/28
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020218125
(22)【出願日】2020-12-28
(71)【出願人】
【識別番号】000006770
【氏名又は名称】ヤマサ醤油株式会社
(72)【発明者】
【氏名】川嵜 淳史
(72)【発明者】
【氏名】荒井 智
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QR02
4B063QR57
4B063QR58
4B063QR64
4B063QR66
4B063QS02
4B063QX01
(57)【要約】 （修正有）
【課題】水溶液中でのロイコ型色原体の安定化方法、及び、ロイコ型色原体を安定に保持する液状試薬を提供する。
【解決手段】一液中にロイコ型色原体、βシクロデキストリン類及びキレート剤を含む溶液を、キットの構成要素として含むことを特徴とする、酸化発色系を用いた測定キット。βシクロデキストリン類がβシクロデキストリン、マルトシルβシクロデキストリン、グルコシルβシクロデキストリン、カルボキシメチルβシクロデキストリン、ジメチルβシクロデキストリン、モノアミノβシクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、メチルβシクロデキストリン、グルクロニルグルコシルβシクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル）βシクロデキストリン、トリ－Ｏ－メチルβシクロデキストリン、サクシニルβシクロデキストリン、スルホプロピルβシクロデキストリン等である。
【選択図】図１
【解決手段】一液中にロイコ型色原体、βシクロデキストリン類及びキレート剤を含む溶液を、キットの構成要素として含むことを特徴とする、酸化発色系を用いた測定キット。βシクロデキストリン類がβシクロデキストリン、マルトシルβシクロデキストリン、グルコシルβシクロデキストリン、カルボキシメチルβシクロデキストリン、ジメチルβシクロデキストリン、モノアミノβシクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、メチルβシクロデキストリン、グルクロニルグルコシルβシクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル）βシクロデキストリン、トリ－Ｏ－メチルβシクロデキストリン、サクシニルβシクロデキストリン、スルホプロピルβシクロデキストリン等である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一液中にロイコ型色原体、βシクロデキストリン類及びキレート剤を含む溶液を、キットの構成要素として含むことを特徴とする、酸化発色系を用いた測定キット。
【請求項2】
βシクロデキストリン類がβシクロデキストリン、マルトシルβシクロデキストリン、グルコシルβシクロデキストリン、カルボキシメチルβシクロデキストリン、ジメチルβシクロデキストリン、モノアミノβシクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、メチルβシクロデキストリン、グルクロニルグルコシルβシクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル）βシクロデキストリン、トリ－Ｏ－メチルβシクロデキストリン、サクシニルβシクロデキストリン、スルホプロピルβシクロデキストリン、サクシニルヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、及びトリアセチルβシクロデキストリンであることを特徴とする、請求項１に記載の測定キット。
【請求項3】
キレート剤がジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ビス（２－アミノエチル）エチレングリコール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の測定キット。
【請求項4】
さらに還元剤を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の測定キット。
【請求項5】
還元剤として還元性硫酸塩類を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の測定キット。
【請求項6】
酸化発色系として、過酸化水素とペルオキシダーゼを含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の測定キット。
【請求項7】
さらにＬ－グルタミン酸オキシダーゼを含み、試料中のＬ－グルタミン酸濃度を測定することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の測定キット。
【請求項8】
ロイコ型色原体水溶液中にβシクロデキストリン類及びキレート剤を共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
【請求項9】
さらに還元剤を含むことを特徴とする、請求項８に記載のロイコ型色原体の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ロイコ型色原体の安定化方法に関する。
【背景技術】
【0002】
臨床検査分野において、酵素法による種々の測定法が確立されている。この方法は、例えば、測定する目的成分から酸化物質を生成させ、この酸化物質と、酸化により発色化合物を生成する発色剤とを、酸化酵素によって反応させ、生じた発色の吸光度を測定する方法である。
【0003】
発色剤の例としては、４－アミノアンチピリンに代表されるカップラーと各種トリンダー試薬との組み合わせが多用されている。一方、より少量の過酸化水素を高感度に検出する方法として、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７）などのロイコ型色原体を用いた方法も知られている。
【0004】
一般に、ロイコ型色原体は高感度色原体であることが知られており、試料中に微量しか存在しない成分の定量に好適に用いられている。
【0005】
しかし、ロイコ型色原体は高感度型色原体である一方で、その保存安定性が悪く、特に、溶液中では室内照明などの光照射により自然発色してしまうという欠点を有している。このロイコ型色原体の安定性不良という課題に対して、これまで種々のロイコ型色原体の溶液中での安定化方法が報告されている。その一部を以下に記載する。保存用液のｐＨを１～５に調整する方法（特許文献１）、酸性糖またはその塩を共存させる方法（特許文献２）、プロピレンングリコールモノメチルエーテルやその類縁体を共存させる方法（特許文献３）、還元型βニコチンアミドアデニンジヌクレオチドあるいは還元型βニコチンアミドアデニンジヌクレオチド－リン酸を共存させる方法（特許文献４）、界面活性剤及び色素物質を共存させる方法（特許文献５）、界面活性剤及びキレート剤を共存させる方法（特許文献６）、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた１種以上の還元剤を共存させる方法（特許文献７）、過酸化水素とは反応しないロイコ型色原体とは別の色素及びシクロデキストリン類を共存させる方法（特許文献８）、ロイコ型色原体とは別の色素、パーオキシダーゼ、シクロデキストリン類、還元剤を共存させる方法（特許文献９）、アスコルビン酸を添加する方法（特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２００５／０８８３０５号
【特許文献2】特開平６－２８９０１５号公報
【特許文献3】特開平７－２３４２２１号公報
【特許文献4】特開平９－１９２９６号公報
【特許文献5】国際公開第２００９／１１６５７５号
【特許文献6】特開２０１１－２６３５９号公報
【特許文献7】特開２００８－２０１９６８号公報
【特許文献8】特開２００８－２０１９６８号公報
【特許文献9】特開２０１１－１２０５９９号公報
【特許文献10】国際公開第２０１４／０８８０５６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記に記載した通り、ロイコ型色原体の安定化方法は数多く検討されているものの、その安定化効果、特に常温やそれ以上の高温条件下、１５日以上の長期間における安定化効果は不十分であり、更なる安定化方法が求められていた。
【0008】
すなわち、本発明の目的は、水溶液中でのロイコ型色原体の安定化方法、及び、ロイコ型色原体を安定に保持する液状試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ロイコ型色原体含有水溶液に、βシクロデキストリン類、キレート剤の組み合わせを添加することにより、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保持されることを見出し、本発明を完成させた。
【0010】
すなわち、本発明は、以下のものである。
［１］一液中にロイコ型色原体、βシクロデキストリン類及びキレート剤を含む溶液を、キットの構成要素として含むことを特徴とする、酸化発色系を用いた測定キット。
［２］βシクロデキストリン類がβシクロデキストリン、マルトシルβシクロデキストリン、グルコシルβシクロデキストリン、カルボキシメチルβシクロデキストリン、ジメチルβシクロデキストリン、モノアミノβシクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、メチルβシクロデキストリン、グルクロニルグルコシルβシクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル）βシクロデキストリン、トリ－Ｏ－メチルβシクロデキストリン、サクシニルβシクロデキストリン、スルホプロピルβシクロデキストリン、サクシニルヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、及びトリアセチルβシクロデキストリンから選ばれる１種であることを特徴とする、［１］に記載の測定キット。
［３］キレート剤がジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ビス（２－アミノエチル）エチレングリコール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の測定キット。
［４］さらに還元剤を含むことを特徴とする、［１］から［３］のいずれか一項に記載の測定キット。
［５］還元剤として還元性硫酸塩類を含むことを特徴とする、［１］から［４］のいずれか一項に記載の測定キット。
［６］酸化発色系として、過酸化水素とペルオキシダーゼを含むことを特徴とする、［１］から［５］のいずれか一項に記載の測定キット。
［７］さらにＬ－グルタミン酸オキシダーゼを含み、試料中のＬ－グルタミン酸濃度を測定することを特徴とする、［１］から［６］のいずれか一項に記載の測定キット。
［８］ロイコ型色原体水溶液中にβシクロデキストリン類及びキレート剤を共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
［９］さらに還元剤を含むことを特徴とする、［８］に記載のロイコ型色原体の安定化方法。
［１］一液中にロイコ型色原体、βシクロデキストリン類及びキレート剤を含む溶液を、キットの構成要素として含むことを特徴とする、酸化発色系を用いた測定キット。
［２］βシクロデキストリン類がβシクロデキストリン、マルトシルβシクロデキストリン、グルコシルβシクロデキストリン、カルボキシメチルβシクロデキストリン、ジメチルβシクロデキストリン、モノアミノβシクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、メチルβシクロデキストリン、グルクロニルグルコシルβシクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル）βシクロデキストリン、トリ－Ｏ－メチルβシクロデキストリン、サクシニルβシクロデキストリン、スルホプロピルβシクロデキストリン、サクシニルヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、及びトリアセチルβシクロデキストリンから選ばれる１種であることを特徴とする、［１］に記載の測定キット。
［３］キレート剤がジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ビス（２－アミノエチル）エチレングリコール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の測定キット。
［４］さらに還元剤を含むことを特徴とする、［１］から［３］のいずれか一項に記載の測定キット。
［５］還元剤として還元性硫酸塩類を含むことを特徴とする、［１］から［４］のいずれか一項に記載の測定キット。
［６］酸化発色系として、過酸化水素とペルオキシダーゼを含むことを特徴とする、［１］から［５］のいずれか一項に記載の測定キット。
［７］さらにＬ－グルタミン酸オキシダーゼを含み、試料中のＬ－グルタミン酸濃度を測定することを特徴とする、［１］から［６］のいずれか一項に記載の測定キット。
［８］ロイコ型色原体水溶液中にβシクロデキストリン類及びキレート剤を共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
［９］さらに還元剤を含むことを特徴とする、［８］に記載のロイコ型色原体の安定化方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明により、水溶液中でのロイコ型色原体の安定化方法、及び、ロイコ型色原体を安定に保持する液状試薬が提供される。本発明を利用することで、酸化発色系を用いた測定キットに含まれるロイコ型色原体水溶液を、常温やそれ以上の高温条件下で、１５日以上の長期間にわたり安定に保管することができる。
【0012】
さらに、本発明の一態様によれば、長期間にわたりキャリブレーションを実施しない場合であっても、正確な測定値を得られる測定キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、各安定化剤を使用した場合の各試料のバックグラウンドの吸光度の経時変化を示している。図１において、横軸は各Ｒ２試薬試料の３７℃での保管日数を示している。縦軸は、各試料の主波長６６０ｎｍ副波長８００ｎｍにおけるバックグラウンドの吸光度（Ａｂｓ）を示している。図中、１～１５で示されているのは測定に用いたＲ２試薬試料の番号であり、試料の番号と添加された安定化剤の種類及び組み合わせについては、表１に記載されている。
【図2】図２は、Ｒ２試薬のＤＡ－６７濃度を変更した場合の、各ＤＡ－６７濃度におけるブランク吸光度の測定結果を示している。横軸には、各Ｒ２試薬におけるＤＡ－６７濃度が記載されている。図中、１５μＭと記載されている試料が本願明細書実施例中の試薬Ｎｏ．２１に、３０μＭと記載されている試料が試薬Ｎｏ．２０に、６０μＭと記載されている試料が試薬Ｎｏ．２２に、３０μＭ着色抑制剤無しと記載されている試料が試薬Ｎｏ．１６に対応している。縦軸は、各試料の主波長６６０ｎｍ副波長８００ｎｍにおけるバックグラウンドの吸光度（Ａｂｓ）を示している。冷蔵保管前の試料の測定結果をＤａｙ０、６週間冷蔵保管後の試料の測定結果をＤａｙ４２として示している。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、ロイコ型色原体の安定化方法に関する。
【0015】
本明細書において、「ロイコ型色原体」とは、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質をいう。過酸化活性物質としては、例えばペルオキシダーゼ等が挙げられる。
【0016】
本明細書において、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるとは、水溶液中で、ロイコ型色原体が熱に対して安定であることをいう。
【0017】
本明細書において、ロイコ型色原体の安定性は、以下の方法によって測定されるものと定義する。
［測定方法］
下記方法によって調製されるロイコ型色原体水溶液の吸光度を測定することにより、試料溶液中のロイコ型色原体の分解を検出する。ロイコ型色原体の分解に伴い特定波長における吸光度が増大するため、以下の測定方法によって測定される吸光度が高いことは、ロイコ型色原体の分解が促進されていることを示す。
［ロイコ型色原体試料溶液の調製方法］
Ｒ１試薬（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．１、４０Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ、１０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ、０．１％ プロクリン９５０）、
Ｒ２試薬（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．１、０．４Ｕ／ｍＬ Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、０．１（ｗ／ｖ）％ プロクリン９５０、３０μＭ ＤＡ－６７）を調製する。上記操作によって調製される水溶液を、ロイコ型色原体モデル水溶液とする。安定化剤を添加したロイコ型色原体試料溶液を調製する場合には、上記Ｒ２試薬に安定化剤を所定量溶解させ、上記モデル溶液と同様に水溶液を調製する。
［保管条件］
ロイコ型色原体モデル水溶液もしくは安定化剤を添加したロイコ型色原体試料水溶液を、設定温度を３７℃、暗条件としたヤマト科学株式会社製インキュベータ内で保管する。
［測定条件］
ＭｉｌｌｉＱ水 ５μＬをＩＷＡＫＩ社製９６穴アッセイプレートに分注する。そこにＲ１試薬を９０μＬ加え、室温で１０分間静置する。その後、Ｒ２試薬を９０μＬ加え、室温で１０分間静置する。その後ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーで主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍの吸光度を測定する。
［検量線設定条件］
本発明においては、上記方法に加え、ＭｉｌｌｉＱ水に代えて標準溶液として濃度既知のＬ－グルタミン酸溶液（例えば、３００μＭのＬ－グルタミン酸溶液）を用いて同様の方法をさらに行ってもよい。得られた測定値から回帰直線を導くことで、検量線を設定することができる。サンプルのＬ－グルタミン酸量を測定する場合には、サンプルの吸光度を測定し、下記式１を用いることにより、サンプル中のＬ－グルタミン酸量を算出することができる。
Ｌ－グルタミン酸濃度（μＭ）＝サンプルの吸光度÷標準液の吸光度×標準液濃度（μＭ）
［測定方法］
下記方法によって調製されるロイコ型色原体水溶液の吸光度を測定することにより、試料溶液中のロイコ型色原体の分解を検出する。ロイコ型色原体の分解に伴い特定波長における吸光度が増大するため、以下の測定方法によって測定される吸光度が高いことは、ロイコ型色原体の分解が促進されていることを示す。
［ロイコ型色原体試料溶液の調製方法］
Ｒ１試薬（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．１、４０Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ、１０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ、０．１％ プロクリン９５０）、
Ｒ２試薬（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．１、０．４Ｕ／ｍＬ Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、０．１（ｗ／ｖ）％ プロクリン９５０、３０μＭ ＤＡ－６７）を調製する。上記操作によって調製される水溶液を、ロイコ型色原体モデル水溶液とする。安定化剤を添加したロイコ型色原体試料溶液を調製する場合には、上記Ｒ２試薬に安定化剤を所定量溶解させ、上記モデル溶液と同様に水溶液を調製する。
［保管条件］
ロイコ型色原体モデル水溶液もしくは安定化剤を添加したロイコ型色原体試料水溶液を、設定温度を３７℃、暗条件としたヤマト科学株式会社製インキュベータ内で保管する。
［測定条件］
ＭｉｌｌｉＱ水 ５μＬをＩＷＡＫＩ社製９６穴アッセイプレートに分注する。そこにＲ１試薬を９０μＬ加え、室温で１０分間静置する。その後、Ｒ２試薬を９０μＬ加え、室温で１０分間静置する。その後ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーで主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍの吸光度を測定する。
［検量線設定条件］
本発明においては、上記方法に加え、ＭｉｌｌｉＱ水に代えて標準溶液として濃度既知のＬ－グルタミン酸溶液（例えば、３００μＭのＬ－グルタミン酸溶液）を用いて同様の方法をさらに行ってもよい。得られた測定値から回帰直線を導くことで、検量線を設定することができる。サンプルのＬ－グルタミン酸量を測定する場合には、サンプルの吸光度を測定し、下記式１を用いることにより、サンプル中のＬ－グルタミン酸量を算出することができる。
Ｌ－グルタミン酸濃度（μＭ）＝サンプルの吸光度÷標準液の吸光度×標準液濃度（μＭ）
【0018】
なお、本明細書におけるロイコ型色原体の安定性の試験法は、上記方法と同等性が担保される範囲内で、適宜改変することもできる。
【0019】
本発明において、「βシクロデキストリン類」とは、βシクロデキストリン及びその誘導体を包含する。
【0020】
本発明の一態様は、一液中にロイコ型色原体、βシクロデキストリン類及びキレート剤を含む溶液をキットの構成要素として含むことを特徴とする、酸化発色系を用いた測定キットである。
【0021】
本発明に用いられるロイコ型色原体は、前述の通り過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質であればよい。ＤＡ－６７等のフェノチアジン系色原体、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４’’ －トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳ）等のトリフェニルメタン系色原体、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’ －ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ－６４）等のジフェニルアミン系色原体、ｏ－フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、中でも、ＤＡ－６７、１０－（メチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０－（Ｎ－メチルカルバモイル）－３－ジメチルアミノ－７－ヒドロキシ－１０Ｈ－フェノチアジン、ＴＰＭ－ＰＳが好ましく、中でもＤＡ－６７がより好ましい。
【0022】
本発明に用いられるロイコ型色原体水溶液は、通常発色試薬として用いる濃度であれば、ロイコ型色原体の濃度に制限はないが、通常０．００５～１０ｍＭである。中でも、高値域での検量線の直線性が改善するという観点から、好ましくは０．０２～３ｍＭ、さらに好ましくは０．０５～１ｍＭである。
【0023】
本発明に用いられるβシクロデキストリン類は、βシクロデキストリン、マルトシルβシクロデキストリン、グルコシルβシクロデキストリン、カルボキシメチルβシクロデキストリン、ジメチルβシクロデキストリン、モノアミノβシクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、メチルβシクロデキストリン、グルクロニルグルコシルβシクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル）βシクロデキストリン、トリ－Ｏ－メチルβシクロデキストリン、サクシニルβシクロデキストリン、スルホプロピルβシクロデキストリン、サクシニルヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、及びトリアセチルβシクロデキストリンが例示されるが、中でもメチルβシクロデキストリンがより好ましい。本発明において、上記βシクロデキストリン類は１種類でもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【0024】
本発明に用いられるβシクロデキストリン類の濃度は、ロイコ型色原体の安定化効果が奏される限りにおいて適宜設定することができるが、０．１～１０Ｖｏｌ％であることが好ましく、０．３～１Ｖｏｌ％であることがより好ましい。
【0025】
本発明に使用されるキレート剤の具体例としては、ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ビス（２－アミノエチル）エチレングリコール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’ －テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）及びそれらの塩から選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、及びそれらの塩から選ばれる１種以上が、ロイコ型色原体の安定効果の点で特に好ましい。
【0026】
本発明に用いられるキレート剤の濃度は、ロイコ型色原体の安定化効果が奏される限りにおいて適宜設定することができる。例えばＣｙＤＴＡを用いる場合には、０．００１～１ｍＭであることが好ましく、０．００３～０．０２ｍＭであることがより好ましい。
【0027】
本発明は、ロイコ型色原体水溶液に、シクロデキストリン類、キレート剤を添加することにより、ロイコ型色原体を安定に保管することができる。具体的には、前述のロイコ型色原体の安定性試験方法において、添加物を加えていない対照試料の吸光度（自然発色）に比べ、吸光度（自然発色）を５０％以下に抑えることができる。
【0028】
本発明は、さらに還元剤を含むことが好ましい。本発明に用いることのできる還元剤は、チオグリセロールなどの還元性チオアルコール類、及びチオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムなどの還元性硫酸塩類を例示することができる。中でも、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類が好ましく、システイン、システアミン、Ｎ－アセチルシステイン、チオグリセロール、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムが好ましく、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムがより好ましい。
【0029】
本発明に用いられる還元剤の濃度は、ロイコ型色原体の安定化効果が奏される限りにおいて適宜設定することができるが、例えば還元性硫酸塩類を用いた場合には、０．００５～１０ｍＭであることが好ましく、０．０２～３ｍＭであることがより好ましい。
【0030】
本発明は、βシクロデキストリン類、キレート剤を添加したロイコ型色原体水溶液に、さらに還元剤を添加することにより、ロイコ型色原体をより安定に保管することができる。具体的には、前述のロイコ型色原体の安定性試験方法において、添加物を加えていない対照試料の吸光度（分解度）に比べ、吸光度（分解度）を２５％以下に抑えることができる。
【0031】
本発明は、ｐＨを調整するため緩衝剤を配合していてもよい。このような緩衝剤としては、ｐＨを５～８に維持することができるリン酸、グリシン、トリス、グッド等の緩衝剤を挙げることができる。より好ましくは、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳが挙げられる。これらの緩衝剤の濃度は１０～５００ｍＭ、さらに５０～２００ｍＭが好ましい。
【0032】
本発明には、さらに目的に応じて、酵素、酵素活性化剤、抗体、防腐剤等を配合することができる。
【0033】
本発明には、ロイコ型色原体が安定であるため、あらゆる種類の酸化発色系の比色定量試薬として使用できる。好ましくは、酵素反応を利用して、標的成分から直接又は２次的に過酸化水素を生成させ、ペルオキシダーゼによりロイコ型色原体を発色させる反応系に広く利用することができる。
【0034】
本発明に用いる酸化発色系としては、過酸化水素及びペルオキシダーゼを用いる反応系が好ましい。
【0035】
本発明の測定対象は、ロイコ型色原体を利用する測定系により測定可能であれば特に制限はない。好適に測定できる一例としては、Ｌ－グルタミン酸濃度が例示される。
【0036】
本発明の測定試薬は、目的に応じて緩衝剤、酵素、酵素活性化剤、抗体、防腐剤等を配合することができる。
【0037】
本発明の測定キットは、発色系試薬溶液を一液とすることもでき、二液以上とすることもできるが、ユーザーが利用する際の簡便性とロイコ型色原体の安定性とを両立させるため、二液であることが好ましい。
【0038】
本発明の測定キットは、上述した発色系試薬溶液の他に、常用されている試薬等を適宜用いることができる。例えば、反応プレート、標準液、希釈液、などを含有していてもよい。本発明の測定キットの具体的な態様としては、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、プロクリン９５０からなる第一反応溶液、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、プロクリン９５０、メチルβシクロデキストリン、ＣｙＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウムからなる第二反応溶液、反応プレート、標準液、希釈液からなる測定キットが例示される。
【0039】
本発明の測定キットは、反応液の発色を吸光光度計等の手段により検出することで、検体に含まれる標的成分量等を定量することができる。本発明の測定キットは、ロイコ型色原体が安定であることに起因して、バックグラウンドの測定値が低減され、結果として精度よく測定することが可能となる。
【0040】
本発明の一態様は、ロイコ型色原体水溶液中にβシクロデキストリン類及びキレート剤を共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法である。
【0041】
また、本発明の一態様は、ロイコ型色原体水溶液中にβシクロデキストリン類、キレート剤及び還元剤を共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法である。
【0042】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例0043】
実施例１．ロイコ型色原体の安定化方法検討
ロイコ型色原体を安定化させる方法を検討すべく、ロイコ型色原体とは別の色素、シクロデキストリン類、還元剤、キレート剤の添加検討を実施した。
ロイコ型色原体を安定化させる方法を検討すべく、ロイコ型色原体とは別の色素、シクロデキストリン類、還元剤、キレート剤の添加検討を実施した。
【0044】
ロイコ型色原体の安定性の試験方法は以下の通りである。
［試料の調製方法］
下記［表１］に従い、Ｒ２試薬（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．１、０．４Ｕ／ｍＬ Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、０．１（ｗ／ｖ）％ プロクリン９５０、３０μＭ ＤＡ－６７）に各種安定化剤の組み合わせを添加した。
［試料の調製方法］
下記［表１］に従い、Ｒ２試薬（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．１、０．４Ｕ／ｍＬ Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、０．１（ｗ／ｖ）％ プロクリン９５０、３０μＭ ＤＡ－６７）に各種安定化剤の組み合わせを添加した。
【0045】
【表1】
【0046】
表中、各種安定化剤の列に○が付いている場合、その安定化剤を添加したことを意味する。各種安定化剤は、以下の原料を用い、以下の終濃度となるように添加した。
オレンジＧ…アクリジンオレンジ（ナカライテスク社製） 終濃度１００μＭ
Ｍ－βシクロデキストリン…メチルβシクロデキストリン（富士フィルム和光純薬社製） 終濃度０．５（ｗ／ｖ）％
チオ硫酸ナトリウム…チオ硫酸ナトリウム五水和物（ナカライテスク社製） 終濃度３．３ｍＭ
ＣｙＤＴＡ…ＣｙＤＴＡ（同仁化学研究所社製） 終濃度１０μＭ
オレンジＧ…アクリジンオレンジ（ナカライテスク社製） 終濃度１００μＭ
Ｍ－βシクロデキストリン…メチルβシクロデキストリン（富士フィルム和光純薬社製） 終濃度０．５（ｗ／ｖ）％
チオ硫酸ナトリウム…チオ硫酸ナトリウム五水和物（ナカライテスク社製） 終濃度３．３ｍＭ
ＣｙＤＴＡ…ＣｙＤＴＡ（同仁化学研究所社製） 終濃度１０μＭ
【0047】
Ｒ１試薬（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．１、４０Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ、１０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ、０．１％ プロクリン９５０）は表１のＮｏ．１～１５に対して共通の試薬を使用した。
【0048】
［安定性の測定方法］
前述のロイコ型色原体の安定性試験方法に従い、安定性試験を実施した。すなわち、各Ｒ２試料水溶液を、設定温度を３７℃、暗条件としたヤマト科学社製インキュベータ内で保管し、実験開始時（０日）、３日経過時、８日経過時、１５日経過時に蒸留水５μＬをＩＷＡＫＩ社製９６穴アッセイプレートに分注した。そこにＲ１試薬を９０μＬ加え、室温で１０分間静置した。その後、上述のＲ２試薬を９０μＬ加え、室温で１０分間静置した。Ｔｅｃａｎ社製プレートリーダーで主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍの２波長の吸光度を測定した。
前述のロイコ型色原体の安定性試験方法に従い、安定性試験を実施した。すなわち、各Ｒ２試料水溶液を、設定温度を３７℃、暗条件としたヤマト科学社製インキュベータ内で保管し、実験開始時（０日）、３日経過時、８日経過時、１５日経過時に蒸留水５μＬをＩＷＡＫＩ社製９６穴アッセイプレートに分注した。そこにＲ１試薬を９０μＬ加え、室温で１０分間静置した。その後、上述のＲ２試薬を９０μＬ加え、室温で１０分間静置した。Ｔｅｃａｎ社製プレートリーダーで主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍの２波長の吸光度を測定した。
【0049】
各試料の０日、３日、８日、１５日時点の吸光度測定結果を図１に、対照試料（試料１）の１５日間保管後の吸光度に対する各試料の１５日間保管後の相対吸光度（％）を表２に示す。
【0050】
【表2】
【0051】
上記の結果から、βシクロデキストリン類及びキレート剤を添加した試料（Ｎｏ．１０、１３、１４、１５）は１５日目の相対吸光度が５０％以下、すなわちロイコ型色原体の分解が抑制されたことが読み取れる。さらに、シクロデキストリン類及びキレート剤に加えて還元剤も添加した試料（Ｎｏ．１４、１５）においては、よりロイコ型色原体の安定性が向上し、１５日目の相対吸光度が２５％以下となったことが読み取れる。
【0052】
実施例２．冷蔵安定性の検討
実施例１にて見出されたβシクロデキストリン類及びキレート剤の組み合わせが、冷蔵安定性にも寄与するか検証した。
実施例１にて見出されたβシクロデキストリン類及びキレート剤の組み合わせが、冷蔵安定性にも寄与するか検証した。
【0053】
下記［表３］に従い、Ｒ２試薬に各種安定化剤の組み合わせを添加した。調製したＲ２試薬は、ＰＰ製５ｍＬチューブに分注し、アルミホイルで遮光して、４℃条件下で８週間保存した。
Ｒ２試薬は各条件共通の成分として、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１、０．４Ｕ／ｍＬ Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、０．１（ｗ／ｖ）％ アジ化ナトリウム、３０μＭ ＤＡ－６７）を含む。
なお、表中各種安定化剤の列に○が付いている場合、その安定化剤を添加したことを意味する。各種安定化剤は、以下の原料を用い、以下の終濃度となるように添加した。
Ｍ－βシクロデキストリン…メチルβシクロデキストリン（富士フィルム和光純薬社製） 終濃度０．５（ｗ／ｖ）％
チオ硫酸ナトリウム…チオ硫酸ナトリウム五水和物（ナカライテスク社製） 終濃度３．３ｍＭ
ＣｙＤＴＡ…ＣｙＤＴＡ（同仁化学研究所社製） 終濃度１０μＭ
Ｒ２試薬は各条件共通の成分として、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１、０．４Ｕ／ｍＬ Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、０．１（ｗ／ｖ）％ アジ化ナトリウム、３０μＭ ＤＡ－６７）を含む。
なお、表中各種安定化剤の列に○が付いている場合、その安定化剤を添加したことを意味する。各種安定化剤は、以下の原料を用い、以下の終濃度となるように添加した。
Ｍ－βシクロデキストリン…メチルβシクロデキストリン（富士フィルム和光純薬社製） 終濃度０．５（ｗ／ｖ）％
チオ硫酸ナトリウム…チオ硫酸ナトリウム五水和物（ナカライテスク社製） 終濃度３．３ｍＭ
ＣｙＤＴＡ…ＣｙＤＴＡ（同仁化学研究所社製） 終濃度１０μＭ
【0054】
【表3】
【0055】
Ｒ２試薬Ｎｏ．１６～２０を用いて、冷蔵保管前と冷蔵８週間後にブランクの吸光度を測定した。Ｒ１試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１、４０Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ、１０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ、０．１％ プロクリン９５０）はＮｏ．１６～２０で共通の試薬液を使用した。
【0056】
冷蔵保管前（Ｄａｙ０）のブランク吸光度、冷蔵８週間後（８Ｗ）のブランク吸光度、及び対照試料（試料１６）の８週間保管後のブランク吸光度に対する各試料の８週間保管後の相対吸光度（％）を、表４に示す。
【0057】
【表4】
【0058】
上記の結果から、βシクロデキストリン類及びキレート剤を添加した試料（Ｎｏ．１９、２０）に冷蔵保管８週間後の相対吸光度が２５％以下、すなわちロイコ型色原体の分解が抑制されたことが読み取れる。さらに、βシクロデキストリン類及びキレート剤に加えて還元剤も添加した試料（Ｎｏ．２０）においては、よりロイコ型色原体の安定性が向上し、冷蔵保管８週間後の相対吸光度が１０％以下となったことが読み取れる。
【0059】
本実施例の結果より、βシクロデキストリン類及びキレート剤の組み合わせは、実施例１にて検証した高温条件下での安定性と同様に、冷蔵安定性にも寄与することが確認された。βシクロデキストリン類及びキレート剤に加えて還元剤も添加した場合には、実施例１と同様、より安定化効果が高まることが確認された。
【0060】
実施例３．ノンキャリブレーション測定の検討
冷蔵保管前（Ｄａｙ０）測定時にＬ－グルタミン酸標準品を測定してキャリブレーション（検量線の取得）を行い、一定期間保管後にノンキャリブレーション測定、すなわちＤａｙ０で取得した検量線を用いて測定値を算出する測定の検討を行った。
冷蔵保管前（Ｄａｙ０）測定時にＬ－グルタミン酸標準品を測定してキャリブレーション（検量線の取得）を行い、一定期間保管後にノンキャリブレーション測定、すなわちＤａｙ０で取得した検量線を用いて測定値を算出する測定の検討を行った。
【0061】
実施例２の表３に従い、Ｎｏ．１６～２０のＲ２試薬を調製した。調製したＲ２試薬を用いて、３００μＭのＬ－グルタミン酸標準液および水（ブランク用）の吸光度を測定し、吸光度からの一次式の検量線を取得した。
【0062】
調製したＲ２試薬は、ＰＰ製５ｍＬチューブに分注し、アルミホイルで遮光して、４℃条件下で８週間保存した。冷蔵保管したＲ２試薬Ｎｏ．１６～２０を用いて、管理検体Ｌ（Ｌ－Ｇｌｕ水溶液 １０．６μＭ）、管理検体Ｍ（Ｌ－Ｇｌｕ 水溶液２６５．０μＭ＋１０００ｍｇ／Ｌ アスコルビン酸）、ヒト血漿（Ａｃｃｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、ＥＤＴＡ ２Ｎａ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ Ｂ）を測定した。測定試料は全て－８０℃保存、Ｒ１試薬はＮｏ．１６～２０で共通の試薬液を使用した。
【0063】
ノンキャリブレーション測定による測定値を表５に、各検体の表示値に対するノンキャリブレーション測定による測定値の比を表６に記載する。
【0064】
【表5】
【0065】
【表6】
【0066】
βシクロデキストリン類及びキレート剤に加えて還元剤も添加したＮｏ．２０のみ、いずれの検体においても表示値±２０％以内の測定値を示した。
【0067】
本実施例の結果から、βシクロデキストリン類、キレート剤及び還元剤を含む試薬を用いることにより、８週間という長期間にわたりキャリブレーションを実施しない場合であっても、正確な測定値を得られることが示唆された。当該特性は、本発明の利用者の機器校正の手間を削減することにつながるため、産業上有用である。
【0068】
実施例４．ロイコ型色原体溶液の濃度による影響の検討
本願発明のロイコ型色原体安定化効果が、ロイコ型色原体濃度の影響を受けるか、検討を行った。
本願発明のロイコ型色原体安定化効果が、ロイコ型色原体濃度の影響を受けるか、検討を行った。
【0069】
実施例２のＮｏ．２０のＲ２試薬組成（３０μＭ ＤＡ－６７）を、ＤＡ－６７濃度を１５μＭへと変更した試薬Ｎｏ．２１、６０μＭへと変更した試薬Ｎｏ．２２を調製した。Ｎｏ．２０～２２のＲ２試薬を６週間冷蔵保管した後、実施例２と同様の方法でブランクの吸光度を測定した。対照として、安定化剤を添加していない実施例２Ｎｏ．１６のＲ２試薬でも、同様の保管条件及び測定方法にて、ブランクの吸光度を測定した。Ｒ１試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１、４０Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ、１０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ、０．１％ プロクリン９５０）はＮｏ．２０～２２で共通の試薬液を使用した。
【0070】
ブランク吸光度の測定結果を図２に示す。冷蔵保管後のブランク吸光度は、ロイコ型色原体（ＤＡ－６７）濃度に比例して直線的に増加しており、本発明のロイコ型色原体安定化効果は、ロイコ型色原体の濃度に影響を受けず、ロイコ型色原体が低濃度の場合であっても、高濃度の場合であっても、同等の安定化効果が発揮されていることが確認された。
【図1】
【図2】
