特開 2022-103708 抗原結合分子、核酸組成物、ベクター組成物、細胞およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉの精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022103708

(43)【公開日】2022-07-08

(54)【発明の名称】抗原結合分子、核酸組成物、ベクター組成物、細胞およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉの精製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220701BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220701BHJP

   C07K 16/12 20060101ALI20220701BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220701BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220701BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220701BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220701BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20220701BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C07K16/12

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N1/20 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020218501

(22)【出願日】2020-12-28

(71)【出願人】

【識別番号】317006683

【氏名又は名称】地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所

(71)【出願人】

【識別番号】899000079

【氏名又は名称】慶應義塾

(74)【代理人】

【識別番号】110002790

【氏名又は名称】Ｏｎｅ ｉｐ特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】中藤 学

(72)【発明者】

【氏名】井上 浄

(72)【発明者】

【氏名】井上 ひかる

(72)【発明者】

【氏名】福田 真嗣

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BA30

4B065CA25

4B065CA46

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA50

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA15

(57)【要約】

【課題】Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉを分離可能とすること。
【解決手段】本発明は、抗原結合分子であって、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉに結合する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉに結合することを特徴とする、抗原結合分子。

【請求項2】

他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌に結合しないこと、
を特徴とする、請求項１に記載の抗原結合分子。

【請求項3】

前記他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓであること、
を特徴とする、請求項２に記載の抗原結合分子。

【請求項4】

前記抗原結合分子は、抗体、抗体断片またはペプチドであり、
アミノ酸配列として、配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗原結合分子。

【請求項5】

前記抗原結合分子は、抗体または抗体断片であり、
重鎖のアミノ酸配列として配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸、または配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
軽鎖のアミノ酸配列として配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
を含むことを特徴とする、請求項４に記載の抗原結合分子。

【請求項6】

配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域と、
配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域と、
配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域と、
配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域と、
配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域と、
配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域と、
を含むことを特徴とする、請求項５に記載の抗原結合分子。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか一項に記載の抗原結合分子をコードする核酸配列、または複数の核酸配列を含むことを特徴とする、核酸組成物。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸配列、または複数の核酸配列を含むベクター組成物、または複数のベクターを含むことを特徴とする、ベクター組成物。

【請求項9】

請求項８に記載のベクター組成物を含むことを特徴とする、細胞。

【請求項10】

請求項１から６のいずれか一項に記載の抗原結合分子を用いて、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉを含む試料からＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉを単離する、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉの精製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗原結合分子、核酸組成物、ベクター組成物、細胞およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉの精製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトの腸管、主に大腸には約１０００種類、４０兆個にも及ぶ腸内細菌（腸内細菌叢（そう）や腸内フローラとよばれる）が生息しているといわれている。ヒトの腸内細菌は、互いに密接な関係を持ちながら複雑にバランスをとっており、個人によって極めて多様で異なり、更に食事・在住国などの要因によっても異なることが知られている。

【0003】

ヒトの下部消化管に存在する腸内細菌として、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属が知られている。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に対する抗原結合分子として、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対する抗体（例えば、非特許文献１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓの構成成分に対する抗体作製報告例がある（例えば、非特許文献２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎａｋｏｓｈｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／１３２３５８＞

【非特許文献2】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９８４ Ｓｅｐ； ２０（３）： ５１９－５２４． ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１７； １２（３）： ｅ０１７３１２８．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属を含む細菌集団から、標的とする所定のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種を分離することが望まれている。

【0006】

本発明の目的は、Ｂ．ｄｏｒｅｉを分離可能とすることである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決するための本発明の主たる発明は、抗原結合分子であって、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉに結合する。

【0008】

その他本願が開示する課題やその解決方法については、発明の実施形態の欄および図面により明らかにされる。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、Ｂ．ｄｏｒｅｉのみが分離可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本抗原結合分子の交差性の有無を検討した、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の、他の種類の細菌を示す図である。

【図2】本抗原結合分子の、他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属との交差性の有無を検討した結果を示す図である。

【図3】本抗原結合分子の交差性の有無を検討した、グラム陰性菌、グラム陽性菌を示す図である。

【図4】本抗原結合分子の、他のグラム陰性菌、グラム陽性菌との交差性の有無を検討した結果を示す図である。

【図5】本抗原結合分子を用いて、Ｂ．ｄｏｒｅｉの単離を行う検討をする際に用いた、腸内細菌基準株を示す図である。

【図6】本抗原結合分子を用いて、ＭＡＣＳ（登録商標）によりＢ．ｄｏｒｅｉの単離を行った結果を示す図である。

【図7】ＭＡＣＳ（登録商標）によりＢ．ｄｏｒｅｉが単離できているかを調べるためのＲＴ－ＰＣＲに用いた、核酸増幅用のプライマーの塩基配列を示す図である。

【図8】ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。

【図9】ＭＡＣＳにより単離したＢ．ｄｏｒｅｉを培養した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明の実施形態の内容を列記して説明する。本発明は、以下のような構成を備える。
［項目１］
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉに結合することを特徴とする、抗原結合分子。
［項目２］
他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌に結合しないこと、
を特徴とする、項目１に記載の抗原結合分子。
［項目３］
前記他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓであること、
を特徴とする、項目２に記載の抗原結合分子。
［項目４］
前記抗原結合分子は、抗体、抗体断片またはペプチドであり、
アミノ酸配列として、配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
を含むことを特徴とする、項目１から３のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
［項目５］
前記抗原結合分子は、抗体または抗体断片であり、
重鎖のアミノ酸配列として配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸、または配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
軽鎖のアミノ酸配列として配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
を含むことを特徴とする、項目４に記載の抗原結合分子。
［項目６］
配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域と、
配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域と、
配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域と、
配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域と、
配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域と、
配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域と、
を含むことを特徴とする、項目５に記載の抗原結合分子。
［項目７］
項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合分子をコードする核酸配列、または複数の核酸配列を含むことを特徴とする核酸組成物。
［項目８］
項目７に記載の核酸配列、または複数の核酸配列を含むベクター組成物、または複数のベクターを含むことを特徴とするベクター組成物。
［項目９］
項目８に記載のベクター組成物を含むことを特徴とする細胞。
［項目１０］
項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合分子を用いて、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉを含む試料からＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉを単離する、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉの精製方法。

【0012】

＜実施の形態の詳細＞
本実施形態に係る抗原結合分子は、例えば、特定の抗原と強く特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成される多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科抗体、キメラ抗体、短鎖Ｆｖ、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ‘）２断片、抗体断片ジスルフィド結合Ｆｖ、および抗イディオタイプ抗体、細胞内抗体、抗体断片、並びに、上記のいずれかのエピトープ結合断片を包含し、また、ポリペプチド、ペプチド、核酸、合成低分子、合成高分子などが挙げられる。

【0013】

本実施形態では、抗原結合分子の一例として、モノクローナル抗体について図面を参照しながら説明する。

【0014】

本実施形態に係る抗原結合分子としてのモノクローナル抗体（以下、本抗体と記す）は、Ｂ．ｄｏｒｅｉに対して特異性の高いものである。このため、本実施形態に係る抗原結合分子を用いることで、Ｂ．ｄｏｒｅｉを含む試料から、Ｂ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。

【0015】

本実施形態において、本抗体は、他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に結合しないことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、Ｂ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。

【0016】

本実施形態において、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属としては、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓであること、が挙げられる。

【0017】

本実施形態において、本抗体は、グラム陽性菌、グラム陰性菌に対して交差性がないことが好ましい。これにより、本抗体を用いることで、他の細菌が多く含まれる糞便などから、Ｂ．ｄｏｒｅｉを単離、濃縮することが可能である。

【0018】

また、本実施形態において、本抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹ）、またはこれらのサブアイソタイプ、またはアロタイプのものでもあってもよい。

【0019】

更に、本実施形態において、本抗体は、任意の哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、ウマ、ラット、イヌ、ネコ、マウス、ヒツジ、ラクダなど、または他の動物、例えば鳥類（例えばニワトリ）に由来するものであってもよい。

【0020】

本実施形態では、本抗体のアミノ酸配列の一部を以下に開示する。本実施形態において、以下に開示するアミノ酸配列と、７０％の相同性を有することが好ましく、７５％の相同性を有することがより好ましく、更に８０％の相同性を有することが好ましく、更に８５％の相同性を有することが好ましく、更に９０％の相同性を有することが好ましく、更に９５％の相同性を有することが好ましく、１００％同一である方が好ましい機能を発揮する。

【0021】

以下に本抗体のアミノ酸配列の一部を示す。式１は配列番号１であり、式２は配列番号２であり、式３は配列番号３であり、式４は配列番号４であり、式５は配列番号５であり、式６は配列番号６であり、式７は配列番号７であり、式８は配列番号８である。なお、別途配列表に記載した、配列番号１に示すのは本抗体の重鎖アミノ酸配列であり、配列番号２に示すのは本抗体の軽鎖アミノ酸配列である。
［式１］
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
［式２］
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
［式３］
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ
［式４］
Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
［式５］
Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ
［式６］
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
［式７］
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
［式８］
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｔｈｒ

【0022】

すなわち、本実施形態において、本抗体はアミノ酸配列として、配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。なお、本抗体は、好ましくはアミノ酸配列として、配列番号１、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。

【0023】

本実施形態において、本抗体は、重鎖のアミノ酸配列として配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸、または配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列とを含むことが好ましい。なお、本抗体は、好ましくはアミノ酸配列として、配列番号１、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。

【0024】

本実施形態において、本抗体は、
配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域と、
配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域と、
配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域と、
配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域と、
配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域と、
配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域と、を含むことが好ましい。なお、本抗体は、好ましくはアミノ酸配列として、配列番号１、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。

【0025】

本抗体は、Ｂ．ｄｏｒｅｉの表面抗原に結合し得るが、他のポリペプチドに特異的に結合しないことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。

【0026】

本実施形態では、本抗体のアミノ酸配列の一部をコードする塩基配列を以下に開示する。本実施形態において、以下に開示する塩基配列と、７０％の相同性を有することが好ましく、７５％の相同性を有することがより好ましく、更に８０％の相同性を有することが好ましく、更に８５％の相同性を有することが好ましく、更に９０％の相同性を有することが好ましく、更に９５％の相同性を有することが好ましく、１００％同一である方が好ましい機能を発揮する。

【0027】

以下に本抗体の塩基配列の一部を示す。式９は配列番号９であり、式１０は配列番号１０であり、式１１は配列番号１１であり、式１２は配列番号１２であり、式１３は配列番号１３であり、式１４は配列番号１４であり、式１５は配列番号１５であり、式１６は配列番号１６である。なお、配列表に記載した、配列番号９に示すのは本抗体の重鎖アミノ酸配列の全長をコードする塩基配列であり、配列番号１０に示すのは軽鎖アミノ酸配列の全長をコードする塩基配列である。
［式９］
ＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
［式１０］
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
［式１１］
ＧＧＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣ
［式１２］
ＴＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡ
［式１３］
ＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣ
［式１４］
ＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＡＧ
［式１５］
ＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴ
［式１６］
ＴＣＴＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧ

【0028】

すなわち、本実施形態において、本抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列として、配列番号１１から１６のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号１１から１６のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。

【0029】

本実施形態において、核酸組成物とは、本実施形態に係る抗原結合分子をコードする核酸配列、または複数の核酸配列を含む核酸組成物も含む。また、本実施形態では、前記核酸配列、または複数の核酸配列を含むベクター組成物、または複数のベクター組成物も含む。更に、本実施形態では、前記ベクターをも含む。本実施形態において、ベクターとは、連結している別の核酸を運搬する核酸分子を意味する。ベクターの１例としてプラスミドがある。前記プラスミドは、その中に別のＤＮＡ断片をライゲーションすることでできる、環状の二本鎖ＤＮＡである。また、ベクターの１例として、ウイルスベクターがある。前記ウイルスベクターは、別のＤＮＡ断片をウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。ある種のベクターは、導入される宿主細胞の中で、自律的に複製することができる。なお、一例として、宿主細胞のゲノム中に組み込むことができるベクターもある。当該ゲノム中に組み込むことができるベクターは、宿主のゲノムと一緒に複製される。

【0030】

本実施形態において、細胞とは、その中に発現ベクターが導入されている細胞を意味する。宿主細胞としては、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞、または動物細胞があげられる。

【0031】

本実施形態において、抗体は以下の手法を用いて取得した。野生型マウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ）に免疫増強剤と抗原を混合したもので免疫し、そのマウスの脾臓を免疫不全マウス（Ｃ．Ｂ－１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｊｃｌ）に移植する。移植した免疫不全マウスに追加免疫を行った後、血清内における標的抗体の抗体価の上昇が観察されたマウスの脾臓を摘出しミエローマ細胞と融合することで樹立したハイブリドーマ由来の抗体である。

【0032】

－８０℃で保存していた、健常者から単離したＢ．ｄｏｒｅｉ（以下、Ｂ．ｄｏｒｅｉ単離株）のグリセロールストックから、２０μＬを５ｍＬのＧＡＭ液体培地に添加し、アネロパック（登録商標）ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて３７℃で２４時間培養する。次に、嫌気性チャンバーＢＡＣＴＲＯＮ ３００（ＳＨＥＬ ＬＡＢ社製）内にて２００ｍＬのＧＡＭ液体培地２本に対し、培養液をそれぞれ２ｍＬ添加し、更に２４時間培養する。合計４００ｍＬの培養液を、７５００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心分離し、上清を除く。ペレットに滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと記する）を加え洗浄を行う。菌体の洗浄は合計３回行う。回収した菌体の一部を、ＶＤ－８００Ｒ凍結乾燥機（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて２４時間乾燥し、乾燥重量と菌体重量の比率を求める。菌体／ＰＢＳが１００μｇ／１００μＬになるように滅菌済みＰＢＳで希釈し、以下、抗原として使用する。

【0033】

次に、調整した前記抗原を用いて免疫を行う。前記抗原に、免疫増強剤であるＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を等量加えた（以下、腹腔内投与用抗原と記す）のちに、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与をする。尾微静脈投与（ｉ．ｖ．）の際には、前記抗原のみを、マウスに追加投与する。ＢＡＬＢ／ｃＡマウスに、当該腹腔内投与用抗原を、隔週２回のｉ．ｐ．投与をする。免疫したＢＡＬＢ／ｃＡマウスから脾臓を摘出し、免疫不全マウス（Ｃ．Ｂ－１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｊｃｌ）へと移植を行う。

【0034】

脾臓を移植した免疫不全マウスに追加免疫および最終免疫をｉ．ｖ．経路にて実施した後、脾臓を摘出し、ミエローマ細胞と融合することにより、ハイブリドーマの作製を行う。得られたハイブリドーマの中から、抗原に対し特異的反応を示し、かつ他の細菌への交差性の低い抗体を産生する能力を持つものを、フローサイトメトリーにより選抜する。

【実施例0035】

以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。

【0036】

本実施形態の一例であるモノクローナル抗体の作製にあたり、まず抗原であるＢ．ｄｏｒｅｉの調整を行った。

【0037】

－８０℃で保存していた、健常者から単離したＢ．ｄｏｒｅｉ単離株のグリセロールストックから、２０μＬを５ｍＬのＧＡＭ液体培地（日水製薬株式会社製）に添加し、アネロパック（登録商標）ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて３７℃で２４時間培養した。次に、嫌気性チャンバーＢＡＣＴＲＯＮ ３００（ＳＨＥＬ ＬＡＢ社製）内にて２００ｍＬのＧＡＭ液体培地２本に対し、培養液をそれぞれ２ｍＬ添加し、更に２４時間培養した。合計４００ｍＬの培養液を、７５００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心分離し、上清を除いた。残ったペレットに滅菌ＰＢＳを加え洗浄を行った。菌体の洗浄は合計３回行った。回収した菌体の一部を、ＶＤ－８００Ｒ凍結乾燥機（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて２４時間乾燥し、乾燥重量と菌体重量の比率を求めた。菌体／ＰＢＳが１００μｇ／１００μＬになるように滅菌済みＰＢＳで希釈し、以下、抗原として使用した。

【0038】

次に、調整した前記抗原を用いて免疫を行った。前記抗原に、免疫増強剤であるＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を等量加えた（以下、調整済抗原と記す）のちに、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を行った。尾微静脈（ｉ．ｖ．）投与の際には、前記抗原のみを、マウスに追加投与した。ＢＡＬＢマウス５匹に、当該調整済抗原を、隔週２回のｉ．ｐ．投与をした。抗原を免疫したＢＡＬＢ／ｃＡマウス２匹より脾臓を摘出し、免疫不全マウス（Ｃ．Ｂ－１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｊｃｌ）４匹に移植を行った。

【0039】

移植した免疫不全マウスに、６回の追加免疫・最終免疫をｉ．ｖ．経路にて実施したあと、脾臓を摘出し、ミエローマ細胞と融合することにより、ハイブリドーマの作製を行った。

【0040】

次に、作製したハイブリドーマの中から、抗原に対し特異的反応を示す抗体を産生する能力を持つものをフローサイトメトリーにより選抜した。

【0041】

前記選抜した、いくつかのハイブリドーマが産生する抗体に関して、Ｂ．ｄｏｒｅｉへの特異性と、他の細菌への交差性を検討した。前記抗原として使用した、健常者から単離したＢ．ｄｏｒｅｉ単離株に加え、他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属細菌として、理化学研究所バイオリソースセンターの微生物材料開発室（ＪＣＭ）より購入した細菌種（図１）を、第１試験細菌群として検討対象とした。

【0042】

第１試験細菌群の培養条件（以下、試験用培養条件１と記す）は以下の通りである。ＧＡＭ液体培地（日水製薬株式会社製）５ｍＬに対して、各細菌のグリセロールストックより２０μＬを添加し、嫌気性チャンバーＢＡＣＴＲＯＮ ３００（ＳＨＥＬ ＬＡＢ社製）内にて２４時間培養した。

【0043】

第１試験細菌群は、以下に示すグラム染色法を用いて、培養後に単一細菌であることを確認した。５μＬの前記菌培養液をスライドガラスに塗布し、火炎固定した。クリスタル紫を各スポットあたり１００μＬずつ作用させ、１分間染色したのち水洗した。次に、ヨウ素を１００μＬ作用させ、３０秒染色したのち水洗した。ヨウ素液染色をもう一度繰り返した。エタノール／アセトン混合脱色液を各スポットあたり１００μＬずつ作用させ、水洗し乾燥した。最後に、パイフェル溶液を１００μＬ作用させ、１分間染色したのち水洗した。乾燥後、光学顕微鏡下で観察しＴｏｕｐＶｉｅｗ（ＴｏｕｐＴｅｋ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社製）を用いて画像を取得した。

【0044】

特異性と交差性の検討のため、以下の方法により、抗体を含むハイブリドーマ細胞培養上清（以下、ＧＳ１培養上清）を調整した。５０ｍＬの細胞培養培地が含まれたフラスコに２×１０^６Ｃｅｌｌｓの前記ハイブリドーマ細胞を添加し、３７℃ ５％ ＣＯ_２ 環境下で一週間培養した。フラスコ内の溶液を５０ｍＬチューブに移し、１０００ ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離して上清を取得した。更に夾雑物を除くために上清を、０．２２μｍフィルターに通し、５０ｍＬチューブに回収した。最終濃度０．０５％になるようにＮａＮ_３を加え、使用まで４℃で保管した。

【0045】

ＧＳ１培養上清に含まれる抗体の特異性と交差性の測定にはフローサイトメーターＡｃｃｕｒｉ Ｃ６ ｐｌｕｓ（ＢＤ社製）を用いた。前記試験用培養条件１に従い、対象の細菌種を培養し、当該培養液を８０００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、培養上清を除いた。その後、ＰＢＳにて二回洗浄した後、菌体ペレットをＰＢＳで再懸濁した。分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標） ２０００ Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でＯＤ値（光学濃度）を測定し、大腸菌における菌体数変換式である１ＯＤ_６６０＝８×１０^８ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに基づき、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１×１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅまたは１×１０^８ ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅに希釈した。希釈後、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離して上清を除き、残ったペレットにＧＳ１培養上清を１００μＬ加えて懸濁し、３０ｍｉｎ、４℃で静置しＧＳ１培養上清に含まれる抗体と反応させた。また、第１試験細菌群と反応性をもたないＩｇＧ１ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）をネガティブコントロールとし、同様に第１試験細菌群と反応させた。その後、滅菌済みＰＢＳを１ｍＬ加え洗浄し、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、ＧＳ１培養上清又はＩｇＧ１ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌを除去した。この過程を二回繰り返した後、二次抗体を１００μＬずつ添加し、３０ｍｉｎ、４℃で静置し、検討に使用した。なお、二次抗体はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで５００倍希釈したものを用いた。更に、ＦＡＣＳ測定の直前に、死細菌と区別するため、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ： Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μＬずつ添加した。ＦＡＣＳ測定により取得されたＦＣＳファイルは、ＦｌｏｗＪｏ ｖｅｒｓｉｏｎ １０．５．３（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）にて解析した。なお、本段落に記載した方法を、以下ＦＡＣＳ測定法という。

【0046】

図２に、ＧＳ１培養上清を用いた、前記ＦＡＣＳ測定の結果を示す。当該結果は、ＧＳ１培養上清に含まれる抗体（以下、ＧＳ１抗体と記す）は、Ｂ．ｄｏｒｅｉには結合するが、図１に示した他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属には結合しないことを示した。

【0047】

次に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属以外のグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する交差反応性を検討するため、ＪＣＭより購入した細菌種（図３に示す。以下、第２試験細菌群と記す）とＧＳ１培養上清の反応性を調べた。各細菌の培養条件は前記試験用培養条件１と同様であり、培養上清は前記ＧＳ１培養上清と同様であり、ＦＡＣＳの手法は前記ＦＡＣＳ測定法を用いた。

【0048】

図４に、第２試験細菌群に対し、ＧＳ１培養上清を反応させたＦＡＣＳの結果を示す。当該結果は、ＧＳ１培養上清は第２試験細菌群には反応しないことを示した。これにより、ＧＳ１抗体はＢ．ｄｏｒｅｉに対して特異性が高く、他の細菌に対して交差性が低い抗体であることが証明された。

【0049】

次に、ＧＳ１抗体の有用性を示すため、Ｂ．ｄｏｒｅｉおよび図５に記載した計５種類の腸内細菌基準株を混合した腸内細菌基準株混合溶液から、Ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ、登録商標）を用いて、Ｂ．ｄｏｒｅｉを単離、濃縮できるかどうかの検討を行った。

【0050】

前記試験用培養条件１に従い培養した、Ｂ．ｄｏｒｅｉおよび図５に記載した計５種類の腸内細菌基準株を８０００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、培養上清を除いた。その後、ＰＢＳにて二回洗浄した後、菌体ペレットをＰＢＳで再懸濁した。分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標） ２０００ Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でＯＤ値（光学濃度）を測定し、大腸菌における菌体数変換式である１ＯＤ_６６０＝８×１０^８ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに基づき、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１×１０^８ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈した。それぞれの培養溶液を１００ｕｌずつ混合した腸内細菌基準株混合溶液を作成した後、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離して上清を除き、残ったペレットにＧＳ１培養上清を１００μＬ加えて懸濁し、３０ｍｉｎ、４℃で静置しＧＳ１培養上清に含まれる抗体と反応させた。また、比較対象としてＩｇＧ１ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）をネガティブコントロールとし、同様に腸内細菌基準株混合溶液と反応させた。これらのサンプルを２本ずつ（ＧＳ１抗体反応サンプル２本、ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体反応サンプル２本、合計４本）用意した。その後、滅菌済みＰＢＳを１ｍＬ加え洗浄し、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、ＧＳ１培養上清又はＩｇＧ１ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌを除去した。この過程を二回繰り返した後、二次抗体を１００μＬずつ添加し、３０ｍｉｎ、４℃で静置し、検討に使用した。なお、二次抗体はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を２％ＢＳＡを含むＰＢＳで５００倍希釈したものを用いた。その後、滅菌済みＰＢＳを１ｍＬ加え洗浄し、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、未反応の二次抗体を除去した。この過程を二回繰り返した後、ＧＳ抗体反応サンプル１本とＩｇＧ１ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ反応サンプルの１本は５００ｕｌの２％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁し、分離前サンプルとして測定まで遮光しながら４℃で保管した。残り２本のサンプルに関しては１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０倍希釈したＡｎｔｉ－ＦＩＴＣ標識 ＭＡＣＳ（登録商標） ｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を、２００μＬずつ添加し、１５ｍｉｎ、４℃で反応させた。反応後、滅菌済みＰＢＳを１ｍＬ加え懸濁し、１４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し上清を除去した。この洗浄工程を合計３回行った後、ＭＡＣＳ バッファー（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ含有））５００μＬで懸濁した。この懸濁液をＭＡＣＳ（登録商標） ｍｉｄｉ ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて分離した。ＭＡＣＳ用マグネットにカラムをセットし、カラム内を５００ｕＬのＭＡＣＳバッファーにて洗浄した。次にその他の分画（Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収するためのチューブをカラムの下にセットし、サンプル５００ｕｌを添加した。カラムから出てきた溶液を回収した。カラムに１ｍｌのＭＡＣＳバッファーを加え、出てきた溶液はＦｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈチューブに回収（Ｆｌｏｗ ＴｈｒｏｕｇｈサンプルＡとする）した。この工程をさらに二回繰り返した。洗浄工程を終えたカラムはマグネットから外し、標的分画（Ｅｌｕｔｉｏｎ）回収用チューブ上に設置し、５００ｕｌのＭＡＣＳバッファーを添加し、プランジャーにて押し出すことにより回収（ＥｌｕｔｉｏｎサンプルＢとする）した。これらの分離した溶液を８，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ４００μＬに懸濁した。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ ｐｌｕｓ（ＢＤ社製）を用いてＭＡＣＳ（登録商標）による分離前と分離後における各種細菌懸濁液、Ｆｌｏｗ ＴｈｒｏｕｇｈとＥｌｕｔｉｏｎと、ＧＳ１抗体およびＩｇＧ１ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏとの反応性を解析した。ＦＡＣＳ測定により取得されたＦＣＳファイルは、解析ソフトＦｌｏｗＪｏ ｖｅｒｓｉｏｎ １０．５．３（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）で解析した。またＦｌｏｗ ＴｈｒｏｕｇｈとＥｌｕｔｉｏｎの一部は１４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で菌体ペレットを回収し、使用まで－８０℃にて保管した。

【0051】

図６に、ＭＡＣＳ（登録商標）の検討結果を示す。ＧＳ１抗体に反応せず流れ出たＦｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈと、ＧＳ１抗体に反応した後、抗体からはがしたＥｌｕｔｉｏｎには、流れ出たものに差があることが判明した。

【0052】

次に、Ｆｌｏｗ ＴｈｒｏｕｇｈとＥｌｕｔｉｏｎに含まれる菌体の種類について、ＲＴ（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）－ＰＣＲを用いて確認をした。

【0053】

－８０℃で保存したＦｌｏｗ ＴｈｒｏｕｇｈサンプルＡとＥｌｕｔｉｏｎサンプルＢの菌体に対して、４００μＬのＴＥ１０バッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え溶解し、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（３００ ｍｇ／ｍＬ）（ＷＡＫＯ社製）を２０μＬ加え、ローテーションしながら３７℃、８時間反応させた。その後、精製されたＡｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（登録商標）（２００００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）（ＷＡＫＯ社製）を１２μＬ加えて混合し、更にローテーションしながら３７℃、８時間反応させた。その後、５０μＬの１０％ＳＤＳ（ｐＨ７．２）を加えて混合し、更にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２５ ｍｇ／ｍＬ）（ＭＥＲＣＫ社製）を１２μＬ加え、５５℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、５００μＬのＰｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ（２５：２４：１）を加え、Ｍｉｃｒｏ Ｍｉｘｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて最大速度で３ｍｉｎ撹拌したのち、１７，８００×ｇ、１０ｍｉｎ、２０℃で遠心分離し、上清を採取した。上清に、再度５００μＬのＰｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌを加え、同様に撹拌し遠心分離した後に上清を採取した。回収した上清に４０μＬの３Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅを加え混合し、１ｍＬの冷やした１００％Ｅｔｈａｎｏｌを加え、ボルテックスで撹拌した後に－８０℃で１時間静置した。その後、１７，８００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心分離し上清を捨て、７０％Ｅｔｈａｎｏｌを５００μＬ加え、転倒混和した。１７，８００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心分離し上清を捨て、遠心エバポレーターでチューブ内の水分を蒸発させた。残った沈殿は精製された核酸であり、当該沈殿に、ＴＥ１０を１００μＬ加え、Ｍｉｃｒｏ Ｍｉｘｅｒを用いて最大速度で１ｍｉｎ撹拌後、８０μＬを別チューブに移し、ＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）を１μＬ加え、３７℃、一晩インキュベートした。

【0054】

前記取得した核酸を用いて、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標） ２０００ Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によりＤＮＡ濃度を測定し、Ｐｕｒｅ Ｗａｔｅｒ（Ｗａｋｏ社製）を用いて１０ｎｇ／ｕｌになるように調整した。希釈したＤＮＡ１ｕＬを鋳型とし、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ２（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は初期変性９５℃、３０ｓｅｃ→（９６℃、３０ｓｅｃ、５５℃、４５ｓｅｃ、７２℃、１ｍｉｎ）×４０サイクル、で実施した。使用したプライマーを図７に示す。解析方法は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍを標的とし１６Ｓ ｒＲＮＡ配列特異的プライマーにより増幅された遺伝子発現量を基準に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌特異的プライマーもしくはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）特異的プライマーにより増幅された遺伝子発現量を比較Ｃｔ法により解析した。

【0055】

図８にＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌特異的プライマーを用いた結果は、ＭＡＣＳ（登録商標）を行う前のサンプルに比べ、標的分画中にＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌の割合が増加していることが判明した。なお、もともとのサンプルにＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌としてはＢ．ｄｏｒｅｉのみが含まれていることから、Ｅｌｕｔｉｏｎ中にＢ．ｄｏｒｅｉが含まれていることとなる。一方でＧＳ１抗体が結合しないと考えられるＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ量は、ＭＡＣＳ（登録証商標）前に比べ、標的分画で減少していた。これにより、ＧＳ１抗体を用いて、Ｂ．ｄｏｒｅｉを特異的に単離、濃縮できることが判明した。

【0056】

更に、単離、濃縮したＢ．ｄｏｒｅｉが、培養可能かどうかを検討した。

【0057】

段落００５１に記載の手法でＭＡＣＳ分離前の培養液、ＭＡＣＳ分離後の標的分画の各溶液を１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで４００μＬに懸濁した。当該懸濁した溶液を５０μＬ、滅菌済みコンラージ棒を用いて菌液をＧＡＭ寒天培地に撒き、Ｂａｃｔｒｏｎ３００（ＳＨＥＬ ＬＡＢ）内において３７℃嫌気環境下（ Ｎ_２ガスをベースに５．０２％ＣＯ_２、 ４．９５％ Ｈ_２を添加した混合ガス）で培養した。２４時間培養した後、プレート上に形成されたコロニーを撮影した。

【0058】

図９に単離、濃縮したＢ．ｄｏｒｅｉの培養試験の結果を示す。ＭＡＣＳ分離前の培養液ではコロニーが形成された。また、前記ＲＴ－ＰＣＲの結果からＢ．ｄｏｒｅｉが単離されている標的分画でもコロニーの形成が見られた。この結果はＧＳ１抗体が結合した菌も増殖可能であることを示すものであった。

【0059】

ＧＳ１抗体を産生するハイブリドーマの維持は以下のように行った。ハイブリドーマが保存された凍結バイアルチューブを３７℃で急速解凍した。１ｍＬのハイブリドーマ細胞溶液に１０ｍＬの細胞培養培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／１％ピルビン酸ナトリウム溶液／１Ｘ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ－グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製））を添加し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離した。上清を除去し、１ｍＬの培地で再懸濁したのちに、１４ｍＬの培地が入った培養フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。飽和状態に達する直前に培養細胞液１ｍＬを１３ｍＬの培地を含んだ培養フラスコに移し、培養することで維持した。

【0060】

更に、シークエンス解析のために、以下のようにＧＳ１抗体産生ハイブリドーマ細胞の調整を行った。培養したハイブリドーマを回収し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離した。上清を除き、１０ｍＬの滅菌ＰＢＳに細胞を再懸濁した。１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、滅菌ＰＢＳを加え、血球計算版を用いて細胞数を数えた。細胞を２×１０^７Ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整し、１００μＬの細胞溶液を新しいチューブ分取し、そこにＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を９００μＬ加え懸濁し、４℃で一晩インキュベートし、当該サンプルをＤＮＡシークエンス解析に用いた。

【0061】

以上示したように、得られた抗体は、Ｂ．ｄｏｒｅｉに対して高い特異性を有し、Ｂ．ｄｏｒｅｉを特異的に精製することができる。このため、本抗体は、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、更には濃縮することができるため、医薬、ヘルスケア等の分野において貢献することができる。また、本実施形態により、腸内細菌叢を構成する腸内細菌の中の一つであるＢ．ｄｏｒｅｉに対し高い特異性を持つ抗原結合分子と、当該抗原結合分子を用いてＢ．ｄｏｒｅｉを含む細菌集団から、標的とするＢ．ｄｏｒｅｉのみを効率よく単離、濃縮することができる。

【0062】

特定の腸内細菌を標的とする特異的性の高い抗体は作製例も少なく、便検体など多種の腸内細菌が存在する中から標的細菌を分離・濃縮するためには選択培地を使用し、形成されたコロニーを単離、核酸を抽出したのちにシークエンスにより配列を確認する必要があった。本実施形態による抗体はＢ．ｄｏｒｅｉに対する特異性が高く、他の細菌種への交差反応がほとんどないため、抗体が結合した菌はほぼ標的細菌となる。そのため従来の手法よりも簡便に効率よく標的の菌を単離・濃縮することが可能となる。便試料などＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属を多く含むような検体からも本抗体を用いることでＢ． ｄｏｒｅｉを効率よく単離できることが期待される。また本抗体を用いて、腸内細菌叢の中におけるＢ． ｄｏｒｅｉの割合を評価する方法を構築することで小児一型糖尿病などの非侵襲診断に応用できる可能性がある。

【0063】

これまで腸内細菌のゲノム配列は個人ごとに異なることが知られており、同じ腸内細菌でも発現する因子や機能が異なることが知られている。そのため、他者の腸内細菌を摂取しても殆ど定着しないことがある。Ｂ． ｄｏｒｅｉは有用菌の一つであり、腸内細菌由来のリポ多糖を減少させることでアテローム性動脈硬化症の抑制に寄与することが報告されている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２０１８ Ｎｏｖ ２７；１３８（２２）：２４８６－２４９８．）。そのため、適正数のＢ． ｄｏｒｅｉを保持し続けることは健康維持に重要である。本申請で作製したＢ． ｄｏｒｅｉ特異的抗体を用いることで、個人固有のＢ． ｄｏｒｅｉを効率よく単離、再培養する手法を確立し、宿主に戻すことによりＢ． ｄｏｒｅｉの存在割合を意のままに調整し、かつ長期的な定着させることできる可能性がある。一方で、Ｂ． ｄｏｒｅｉは疾患とも関連しており、小児一型糖尿病の発症前に増加することが報告されている（Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１４； ５： ６７８）。本抗体を利用し、便中Ｂ． ｄｏｒｅｉの割合を適切に評価することで、これらの疾患の診断薬として応用できる可能性もある。

【0064】

上述した実施形態は、本発明の理解を容易にするための例示に過ぎず、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良することができると共に、本発明にはその均等物が含まれることは言うまでもない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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