知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 独立行政法人国立がん研究センターの特許一覧 ▶ 国立感染症研究所長の特許一覧 ▶ 独立行政法人理化学研究所の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022104747
(43)【公開日】2022-07-11
(54)【発明の名称】抗ウイルス剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/47 20060101AFI20220704BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220704BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220704BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20220704BHJP
【ＦＩ】
A61K31/47
A61P31/12
A61P31/14
A61P31/16
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020219885
(22)【出願日】2020-12-29
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業「ＲｄＲＰ阻害剤による抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２戦略」産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】510097747
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立がん研究センター
(71)【出願人】
【識別番号】591222245
【氏名又は名称】国立感染症研究所長
(71)【出願人】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100109542
【弁理士】
【氏名又は名称】田伏 英治
(72)【発明者】
【氏名】増富 健吉
(72)【発明者】
【氏名】安川 麻美
(72)【発明者】
【氏名】渡士 幸一
(72)【発明者】
【氏名】本間 光貴
(72)【発明者】
【氏名】関根 俊一
(72)【発明者】
【氏名】小山 裕雄
(72)【発明者】
【氏名】深見 竹広
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC28
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB33
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、ウイルスに起因する疾患の予防または治療剤を提供することにある。
【解決手段】式（Ｉ）：
（式中、各記号は明細書に記載の通りである。）
で表される化合物またはその塩を有効成分として含有する、ウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【選択図】なし
【解決手段】式（Ｉ）：
（式中、各記号は明細書に記載の通りである。）
で表される化合物またはその塩を有効成分として含有する、ウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）：
（式中、ｍ個のＲ１およびｎ個のＲ２は、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩を有効成分として含有する、ウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【化1】
（式中、ｍ個のＲ１およびｎ個のＲ２は、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩を有効成分として含有する、ウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【請求項2】
式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が、式（Ｉａ）：
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、およびＲ２ａは、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
Ｒ２ｂは、水素原子またはハロゲン原子を示す。）
で表される化合物またはその塩である、請求項１に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【化2】
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、およびＲ２ａは、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
Ｒ２ｂは、水素原子またはハロゲン原子を示す。）
で表される化合物またはその塩である、請求項１に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【請求項3】
式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が、以下の式：（ＲＫ－Ｘ）、（ＲＫ－Ｙ）または（ＲＫ－Ｚ）：
で表される化合物から選択される化合物またはその塩である、請求項１に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【化3】
【請求項4】
ウイルスが、ＲＮＡウイルスである、請求項１～３に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【請求項5】
ウイルスが、一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項４に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【請求項6】
ウイルスが、コロナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、デングウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、および／または西ナイル熱ウイルスである、請求項５に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【請求項7】
ウイルスが、コロナウイルスである、請求項６に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【請求項8】
ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項７に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【請求項9】
ヒトに投与するための、請求項１～８に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（以下、ＲｄＲＰと表記する場合がある）の阻害作用を有するスルホンアミド誘導体を有効成分として含有するウイルスに起因する疾患の予防または治療剤に関するものであり、医薬の分野において有用である。
【背景技術】
【0002】
感染の拡大が問題となっている新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）に対する有効な治療法としては、未だ完全に確立されたものはなく、有効性の高い新たな治療薬またはワクチンの開発が期待されている。
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を含むコロナウイルスは、１本鎖のプラス鎖ＲＮＡをゲノムとして持つＲＮＡウイルスである。プラス鎖あるいはマイナス鎖の違いはあるが、１本鎖ＲＮＡをゲノムとしてもつＲＮＡウイルスには、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、デングウイルス、西ナイル熱ウイルス等が挙げられる。これらの「ＲＮＡウイルス」に共通する生物学的特徴として、ゲノム複製（すなわちＲＮＡ複製）にＲｄＲＰを用いるという特徴があり、いいかえれば、「ＲｄＲＰは、ＲＮＡウイルスの種を超えてｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅに必須の酵素」であると考えられるため、ＲｄＲＰを阻害することにより治療効果を示す抗ウイルス剤の開発が進められて来た。
このような薬剤としてレムデシビルの検討が進められ（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）、既に承認されている。しかし、レムデシビルは点滴静注薬であるため、臨床上の利便性が必ずしも高いとは言えなかった。従って、医療現場では経口投与可能な、有効性の高い抗ウイルス剤が待たれていた。
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を含むコロナウイルスは、１本鎖のプラス鎖ＲＮＡをゲノムとして持つＲＮＡウイルスである。プラス鎖あるいはマイナス鎖の違いはあるが、１本鎖ＲＮＡをゲノムとしてもつＲＮＡウイルスには、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、デングウイルス、西ナイル熱ウイルス等が挙げられる。これらの「ＲＮＡウイルス」に共通する生物学的特徴として、ゲノム複製（すなわちＲＮＡ複製）にＲｄＲＰを用いるという特徴があり、いいかえれば、「ＲｄＲＰは、ＲＮＡウイルスの種を超えてｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅに必須の酵素」であると考えられるため、ＲｄＲＰを阻害することにより治療効果を示す抗ウイルス剤の開発が進められて来た。
このような薬剤としてレムデシビルの検討が進められ（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）、既に承認されている。しかし、レムデシビルは点滴静注薬であるため、臨床上の利便性が必ずしも高いとは言えなかった。従って、医療現場では経口投与可能な、有効性の高い抗ウイルス剤が待たれていた。
【0003】
特許文献１には、糖尿病等の治療に用い得るＰＰＡＲ－γ活性調節用化合物としてのスルホンアミド誘導体が記載されているが、ＲｄＲＰ阻害作用を有することについては記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第２００１／００５７９号
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，２６９－２７１（２０２０）
【非特許文献2】Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０２０ Ｍａｙ １５；３６８（６４９２）：７７９－７８２．
【非特許文献3】Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０２０； ３８３：１８１３－１８２６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、優れた抗ウイルス作用を有し、経口投与可能な、新たなＲｄＲＰ阻害剤を提供することにより、上記の課題の解決を図るものである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、かかる状況下、鋭意検討を重ねた結果、特定構造のスルホンアミド誘導体が、ＲｄＲＰ阻害作用を有し、コロナウイルス等のウイルスに起因する疾患の予防または治療に有効であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【0008】
［１］式（Ｉ）：
【0009】
【化1】
【0010】
（式中、ｍ個のＲ１およびｎ個のＲ２は、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩を有効成分として含有する、ウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［２］式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が、式（Ｉａ）：
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩を有効成分として含有する、ウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［２］式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が、式（Ｉａ）：
【0011】
【化2】
【0012】
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、およびＲ２ａは、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
Ｒ２ｂは、水素原子またはハロゲン原子を示す。）
で表される化合物またはその塩である、上記［１］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［３］式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が、以下の式：（ＲＫ－Ｘ）、（ＲＫ－Ｙ）または（ＲＫ－Ｚ）：
Ｒ２ｂは、水素原子またはハロゲン原子を示す。）
で表される化合物またはその塩である、上記［１］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［３］式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が、以下の式：（ＲＫ－Ｘ）、（ＲＫ－Ｙ）または（ＲＫ－Ｚ）：
【0013】
【化3】
【0014】
で表される化合物から選択される化合物またはその塩である、上記［１］または［２］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［４］ウイルスが、ＲＮＡウイルスである、上記［１］～［３］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［５］ウイルスが、一本鎖ＲＮＡウイルスである、上記［１］～［４］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［６］ウイルスが、コロナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、デングウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、および／または西ナイル熱ウイルスである、上記［１］～［５］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［７］ウイルスが、コロナウイルスである、上記［１］～［６］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［８］ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、上記［１］～［７］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［９］ヒトに投与するための、上記［１］～［８］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［１０］式（Ｉ）：
［４］ウイルスが、ＲＮＡウイルスである、上記［１］～［３］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［５］ウイルスが、一本鎖ＲＮＡウイルスである、上記［１］～［４］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［６］ウイルスが、コロナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、デングウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、および／または西ナイル熱ウイルスである、上記［１］～［５］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［７］ウイルスが、コロナウイルスである、上記［１］～［６］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［８］ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、上記［１］～［７］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［９］ヒトに投与するための、上記［１］～［８］に記載のウイルスに起因する疾患の予防または治療剤。
［１０］式（Ｉ）：
【0015】
【化4】
【0016】
（式中、ｍ個のＲ１およびｎ個のＲ２は、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩の有効量を、その投与を必要とする哺乳動物に投与することを含む、ウイルスに起因する疾患の予防または治療方法。
（＊）好適な化合物（Ｉ）、好適な対象ウイルス、および好適な対象者については、上記［２］～［９］を参照することができる。
［１１］ウイルスに起因する疾患の予防または治療における使用のための、式（Ｉ）：
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩の有効量を、その投与を必要とする哺乳動物に投与することを含む、ウイルスに起因する疾患の予防または治療方法。
（＊）好適な化合物（Ｉ）、好適な対象ウイルス、および好適な対象者については、上記［２］～［９］を参照することができる。
［１１］ウイルスに起因する疾患の予防または治療における使用のための、式（Ｉ）：
【0017】
【化5】
【0018】
（式中、ｍ個のＲ１およびｎ個のＲ２は、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩。
（＊）好適な化合物（Ｉ）、好適な対象ウイルス、および好適な対象者については、上記［２］～［９］を参照することができる。
［１２］ウイルスに起因する疾患の予防または治療のための医薬を製造するための、式（Ｉ）：
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩。
（＊）好適な化合物（Ｉ）、好適な対象ウイルス、および好適な対象者については、上記［２］～［９］を参照することができる。
［１２］ウイルスに起因する疾患の予防または治療のための医薬を製造するための、式（Ｉ）：
【0019】
【化6】
【0020】
（式中、ｍ個のＲ１およびｎ個のＲ２は、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩の使用。
（＊）好適な化合物（Ｉ）、好適な対象ウイルス、および好適な対象者については、上記［２］～［９］を参照することができる。
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩の使用。
（＊）好適な化合物（Ｉ）、好適な対象ウイルス、および好適な対象者については、上記［２］～［９］を参照することができる。
【発明の効果】
【0021】
本発明により、ウイルスに起因する疾患の予防または治療に有効かつ安全に使用可能な薬剤が、提供される。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1A】後記実施例１における、試験方法の概要を示す。
【図1B】後記実施例１における、被験化合物ＲＫ－Ｘ、ＲＫ－Ｙ、およびＲＫ－Ｚ投与時の、相対的ウイルス量の定量結果を示す。
【図2】後記の実施例２における、被験化合物ＲＫ－Ｘの投与による蛍光強度の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明は、ＲｄＲＰ阻害作用を有する前記式（Ｉ）で表される特定構造のスルホンアミド誘導体またはその塩（以下、両者を総称して「化合物（Ｉ）」と表記する場合がある）を有効成分として含有する、ウイルスに起因する疾患の予防または治療剤；有効量の化合物（Ｉ）をその投与を必要とする哺乳動物に投与することを含む、ウイルスに起因する疾患の予防または治療方法；ウイルスに起因する疾患の予防または治療における使用のための、化合物（Ｉ）；ウイルスに起因する疾患の予防または治療のための医薬を製造するための、化合物（Ｉ）の使用；に関する。
【0024】
以下、上記した本発明について詳述するが、特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味をもつ。
【0025】
（本発明の化合物（Ｉ）について）
本発明の化合物（Ｉ）は、以下の式：
本発明の化合物（Ｉ）は、以下の式：
【0026】
【化7】
【0027】
（式中、ｍ個のＲ１およびｎ個のＲ２は、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩である。
ｍおよびｎは、互いに独立して、０～３の整数を示す。）
で表される化合物またはその塩である。
【0028】
上記化合物（Ｉ）において、好ましいものは、以下の式（Ｉａ）：
【0029】
【化8】
【0030】
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、およびＲ２ａは、互いに独立して、ハロゲン原子を示し、および
Ｒ２ｂは、水素原子またはハロゲン原子を示す。）
で表される化合物またはその塩である。
Ｒ２ｂは、水素原子またはハロゲン原子を示す。）
で表される化合物またはその塩である。
【0031】
上記各式中、「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
【0032】
ここで、より好ましい化合物（Ｉ）は、以下の式（ＲＫ－Ｘ）、（ＲＫ－Ｙ）または（ＲＫ－Ｚ）で表される化合物またはその塩である。
【0033】
【化9】
【0034】
本発明の化合物（Ｉ）またはその塩は、当業者であれば、例えば、国際公開第２００１／００５７９号に記載された方法（例えば、実施例１７８、１８０等）や当技術分野で公知の方法を適宜活用して製造し、本発明の実施のために使用することができる。また、化合物（Ｉ）またはその塩が市販されている場合は、購入して使用することもできる。
【0035】
本発明の実施に当たっては、化合物（Ｉ）は、遊離の形態、またはその塩（好ましくは、その医薬として許容される塩）の形態のいずれにおいても使用することができる。使用される個々の化合物（Ｉ）の特性を踏まえて当業者であれば両形態から適宜選択して本発明を実施することができる。
医薬として許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸との塩、酢酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トシル酸塩、マレイン酸塩等の有機酸との塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等のアミノ酸との塩等が挙げられる。
医薬として許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸との塩、酢酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トシル酸塩、マレイン酸塩等の有機酸との塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等のアミノ酸との塩等が挙げられる。
【0036】
本発明を実施するに当たっては、化合物（Ｉ）はそのプロドラッグ（以下、両者を総称して、「本発明化合物」と表記する場合がある）の形態で使用することもできる。当業者であれば、適宜当該プロドラッグを設計することができ、また当該プロドラッグは自体公知の方法によって製造することができる。当該プロドラッグは、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような、生理的条件で目的とするＳＳＴＲ５拮抗剤に変化するものであってもよい。
【0037】
（本発明のウイルスに起因する疾患について）
本発明のウイルスに起因する疾患としては、各種のウイルスの感染により惹起される疾患が挙げられるが、本発明化合物がより有効なものとしては、ＲＮＡウイルスに起因する疾患が挙げられる。本発明化合物がさらに有効なものとしては、一本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、コロナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、デングウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、西ナイル熱ウイルス等）に起因する疾患が挙げられ、特に有効なものとしては、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等）に起因する疾患が挙げられる。
係る疾患としては、例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、エボラ出血熱、ポリオ、デング熱、手足口病、麻疹、西ナイル熱等が挙げられる。
本発明のウイルスに起因する疾患としては、各種のウイルスの感染により惹起される疾患が挙げられるが、本発明化合物がより有効なものとしては、ＲＮＡウイルスに起因する疾患が挙げられる。本発明化合物がさらに有効なものとしては、一本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、コロナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、デングウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、西ナイル熱ウイルス等）に起因する疾患が挙げられ、特に有効なものとしては、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等）に起因する疾患が挙げられる。
係る疾患としては、例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、エボラ出血熱、ポリオ、デング熱、手足口病、麻疹、西ナイル熱等が挙げられる。
【0038】
本明細書中、「予防」には、疾患（病態の全体、もしくは１つまたは複数の病態）の発症の防止、および当該疾患の発症の遅延が含まれる。「予防有効量」とは、かかる目的を達成するに足る本発明化合物の用量をいう。
【0039】
本明細書において、「治療」には、疾患（病態の全体、もしくは１つまたは複数の病態）の治癒、当該疾患の改善、および当該疾患の重篤度の進展の抑制が含まれる。「治療有効量」とは、かかる目的を達成するに足る本発明化合物の用量をいう。
【0040】
（投与形態について）
本発明を実施するにあたっては、本発明化合物は、単独の形態で、または本発明化合物を有効成分として、医薬として許容される担体とともに含む医薬組成物の形態でのいずれの形態でも使用することができる。
本発明を実施するにあたっては、本発明化合物は、単独の形態で、または本発明化合物を有効成分として、医薬として許容される担体とともに含む医薬組成物の形態でのいずれの形態でも使用することができる。
【0041】
かかる医薬組成物としては、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠、バッカル錠等を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む）、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、放出制御製剤（例、速放性製剤、徐放性製剤、徐放性マイクロカプセル剤）、エアゾール剤、フィルム剤（例、口腔内崩壊フィルム、口腔粘膜貼付フィルム）、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤（例、ボーラス）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、経皮吸収型製剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤（例、肛門坐剤、膣坐剤）、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等が挙げられる。中でも、経口投与に適した医薬組成物の形態が好ましい。
【0042】
本明細書において、「医薬として許容される担体」としては、製剤技術の分野で慣用されている各種の担体を用いることができる。
【0043】
「医薬として許容される担体」の具体例としては、例えば、固形製剤においては、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカ等）、結合剤（例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ－マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等）および崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ－ヒドロキシプロピルセルロース等）、等を用いることができる。
【0044】
液状製剤においては、溶剤（例えば、注射用水、等張食塩水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、等）、溶解補助剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等）、懸濁化剤（例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等）、等張化剤（例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール等）、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等）、および無痛化剤（例えば、ベンジルアルコール等）、等を用いることができる。
【0045】
必要により、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、ソルビン酸等）、抗酸化剤（例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α－トコフェロール等）、着色剤、甘味剤等の製剤添加物をさらに添加してもよい。
【0046】
本発明の医薬組成物は、剤型、投与方法、担体などにより異なるが、本発明化合物を製剤全量に対して通常０．０１～９９％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．１～８５％（ｗ／ｗ）の割合で添加することにより、製造し得る。当該医薬組成物は、その形態に応じて、製剤技術の分野で慣用の方法により製造できる。本発明の医薬組成物は、有効成分を含む速放性製剤または徐放性製剤等の放出制御製剤に成形してもよい。
【0047】
（投与対象について）
本発明化合物は、毒性が低く、かつ副作用も少ないことが期待でき、医薬品として優れた性質も有している。従って、本発明化合物は、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ウマ等）に対して、安全に投与し得る。
本発明化合物は、毒性が低く、かつ副作用も少ないことが期待でき、医薬品として優れた性質も有している。従って、本発明化合物は、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ウマ等）に対して、安全に投与し得る。
【0048】
（投与経路について）
本発明を実施するに当たっては、本発明化合物は、単独で、または医薬組成物として、経口的又は非経口的（例、静脈内、筋肉内、皮下、臓器内、鼻腔内、皮内、点眼、脳内、直腸内、膣内、腹腔内投与、および病巣への投与）に投与し得る。中でも、経口投与が好ましい。
本発明を実施するに当たっては、本発明化合物は、単独で、または医薬組成物として、経口的又は非経口的（例、静脈内、筋肉内、皮下、臓器内、鼻腔内、皮内、点眼、脳内、直腸内、膣内、腹腔内投与、および病巣への投与）に投与し得る。中でも、経口投与が好ましい。
【0049】
（投与量について）
本発明化合物の投与量は、投与対象、投与経路および投与対象の年齢や症状によって異なるが、特に限定されない。例えば、その投与量は有効成分である本発明化合物として１回当たり、経口投与する場合、０．１～６０００ｍｇ、非経口投与する場合、その投与量は０．０１～６００ｍｇである。当該投与量を１日当たり１～３回に分けて投与することができる。また、徐放性製剤の形態で投与する場合には、当該投与量に相当するように隔日投与あるいはそれ以上の間隔を空けて投与することも可能である。
本発明化合物の投与量は、投与対象、投与経路および投与対象の年齢や症状によって異なるが、特に限定されない。例えば、その投与量は有効成分である本発明化合物として１回当たり、経口投与する場合、０．１～６０００ｍｇ、非経口投与する場合、その投与量は０．０１～６００ｍｇである。当該投与量を１日当たり１～３回に分けて投与することができる。また、徐放性製剤の形態で投与する場合には、当該投与量に相当するように隔日投与あるいはそれ以上の間隔を空けて投与することも可能である。
【0050】
（他剤との併用について）
本発明の実施に当たっては、本発明化合物は、他の薬剤と組み合わせて、対象疾患の予防または治療に用いることができ、他の薬剤との併用による優れた予防および／または治療効果が期待できる。また、かかる併用療法により他の薬剤の用量を下げて、これらが有する副作用を低減することも期待できる。
このような本発明の実施に当たって本発明化合物と組み合わせて用いられ得る薬剤（以下、併用薬剤と表記する場合がある）は、患者の疾患の種類、その症状の重篤度等に鑑みて、適宜選択することができる。
例えば、併用薬剤としては、抗ウイルス活性を有するレムデシビル、ネルフィナビル、ファビビラビル、ロピナビル、クロロキン等の抗ウイルス薬、デキサメタゾン、シクレソニド等のステロイド薬、ヒドロキシクロロキン等の抗炎症薬、ナファモスタット、カモスタット等のタンパク分解酵素阻害薬、あるいはトシリズマブ、サリルマブ等の抗ＩＬ－６Ｒ抗体、バリシチニブ、ルキソリチニブ等のＪＡＫ阻害薬、アカラブルチニブ等のＢＴＫ阻害薬、ラブリズマブ等の抗補体抗体等の重症化したサイトカインストーム症候群や急性呼吸窮迫症候群治療用の薬剤、又はインターフェロン製剤等が挙げられる。
併用薬剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明化合物と併用薬剤とが組み合わされ得る。例えば、（１）本発明化合物と併用薬剤とを組み合わせて含有する製剤の投与、（２）本発明化合物と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時または別々の投与、（３）本発明化合物と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時または別々の投与、等の形態で用いることができる。好ましい形態は、医療現場の実態に応じて、適宜選択することができる。
上記の本発明化合物と併用薬剤とを組み合わせて含有する製剤は、先に説明された本発明化合物を含有する医薬組成物に準じて、当業者であれば適宜製造することができる。
併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択し得る。また、本発明化合物と併用薬剤との配合比は、投与対象の疾患や症状、投与経路、用いる併用薬剤の種類、等により適宜選択し得る。通常は、用いる併用薬剤の一般的な臨床用量を基準にして医療現場の実態に応じて適宜決定し得る。
本発明の実施に当たっては、本発明化合物は、他の薬剤と組み合わせて、対象疾患の予防または治療に用いることができ、他の薬剤との併用による優れた予防および／または治療効果が期待できる。また、かかる併用療法により他の薬剤の用量を下げて、これらが有する副作用を低減することも期待できる。
このような本発明の実施に当たって本発明化合物と組み合わせて用いられ得る薬剤（以下、併用薬剤と表記する場合がある）は、患者の疾患の種類、その症状の重篤度等に鑑みて、適宜選択することができる。
例えば、併用薬剤としては、抗ウイルス活性を有するレムデシビル、ネルフィナビル、ファビビラビル、ロピナビル、クロロキン等の抗ウイルス薬、デキサメタゾン、シクレソニド等のステロイド薬、ヒドロキシクロロキン等の抗炎症薬、ナファモスタット、カモスタット等のタンパク分解酵素阻害薬、あるいはトシリズマブ、サリルマブ等の抗ＩＬ－６Ｒ抗体、バリシチニブ、ルキソリチニブ等のＪＡＫ阻害薬、アカラブルチニブ等のＢＴＫ阻害薬、ラブリズマブ等の抗補体抗体等の重症化したサイトカインストーム症候群や急性呼吸窮迫症候群治療用の薬剤、又はインターフェロン製剤等が挙げられる。
併用薬剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明化合物と併用薬剤とが組み合わされ得る。例えば、（１）本発明化合物と併用薬剤とを組み合わせて含有する製剤の投与、（２）本発明化合物と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時または別々の投与、（３）本発明化合物と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時または別々の投与、等の形態で用いることができる。好ましい形態は、医療現場の実態に応じて、適宜選択することができる。
上記の本発明化合物と併用薬剤とを組み合わせて含有する製剤は、先に説明された本発明化合物を含有する医薬組成物に準じて、当業者であれば適宜製造することができる。
併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択し得る。また、本発明化合物と併用薬剤との配合比は、投与対象の疾患や症状、投与経路、用いる併用薬剤の種類、等により適宜選択し得る。通常は、用いる併用薬剤の一般的な臨床用量を基準にして医療現場の実態に応じて適宜決定し得る。
【実施例0051】
以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能であるか、当業者であれば適宜調製することが可能である。
【0052】
実施例１
Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，１１７，７００１（２０２０）“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ＴＭＰＲＳＳ２”に従い、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するＲｄＲＰ阻害剤による阻害効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を確認した。ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞は（ＪＣＲＢｎｏ．ＪＣＲＢ１８１９）に保存されている。
（１）ＴＭＰＲＳＳ２過剰発現ＶｅｒｏＥ６細胞株をＩＷＡＫＩ社製の９６穴の細胞培養プレートの各ウェルに培養した。次いで、被験薬物として、
・本発明のＲｄＲＰ阻害剤の各濃度１６μＭ、２４μＭ、３６μＭ
・ポジティブ薬物対照群として、レムデシビル１０μＭ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製）、あるいは
・対照群として、ジメチルスルホキシド０．５％（Ｓｉｇｍａ社製）
を添加し、５％ＣＯ２条件下、３７℃で１時間培養した。培養には、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＤＭＥＭ培地およびウシ胎仔血清を用いた。
以上の試験群に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２無添加で同様に処理したものを正常細胞対照群とした。
（２）上記培養後の各ウェル中の細胞に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（国立感染症研究所ウイルス第３部より入手）を処理した。１時間後に洗浄し過剰のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を除去した後、上記薬物等の共存下、３７℃で２４時間培養した（図１Ａに実験方法の概要を図示する）。
（３）各ウェルの培養液上清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡをリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量し、ｒｅｌａｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ（相対的ウイルスＲＮＡ 黒抜き）とｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（細胞生存率 白抜き）を求めた。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２無添加で同様に処理したものを正常細胞対照群とし、同様に計算した。
（４）結果を図１Ｂに示す。
図１Ｂから、ＲＫ－Ｘ ２４μＭでウイルスＲＮＡが０．２７％、ＲＫ－Ｙ ３６μＭで０．００８７％、ＲＫ－Ｚ ２４μＭで０．２６％と、明らかな細胞毒性なく、ポジティブ薬物対照群を上回るウイルスＲＮＡ減少効果を認めた（ここでの数値は、「ＤＭＳＯ投与の対照群でのウイルス量に対する％」である）。
これらの濃度は、ヒトにＲＫ－Ｘ（１０ｍｇ）を投与したときに到達する濃度（４７７μｇ／Ｌ；Ｆｌｏｒｅｎ，Ｌ．Ｃ．；Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎ，Ｂ．；Ｋｗｅｉ，Ｌ．；ｅｔ ａｌ．６４ｔｈ Ａｎｎｕ Ｍｅｅｔ Ｓｃｉ Ｓｅｓｓ Ａｍ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃ （ＡＤＡ）・２００４－０６－０４／２００４－０６－０８・ Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ・ Ａｂｓｔ ６５１－Ｐ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００４，５３（Ｓｕｐｐｌ．２））から示唆されるとおり、ＲｄＲＰ阻害剤の経口投与で十分に達成できる濃度である。したがって、本発明の組成物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する十分な効果が得られることが明らかとなった。
Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，１１７，７００１（２０２０）“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ＴＭＰＲＳＳ２”に従い、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するＲｄＲＰ阻害剤による阻害効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を確認した。ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞は（ＪＣＲＢｎｏ．ＪＣＲＢ１８１９）に保存されている。
（１）ＴＭＰＲＳＳ２過剰発現ＶｅｒｏＥ６細胞株をＩＷＡＫＩ社製の９６穴の細胞培養プレートの各ウェルに培養した。次いで、被験薬物として、
・本発明のＲｄＲＰ阻害剤の各濃度１６μＭ、２４μＭ、３６μＭ
・ポジティブ薬物対照群として、レムデシビル１０μＭ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製）、あるいは
・対照群として、ジメチルスルホキシド０．５％（Ｓｉｇｍａ社製）
を添加し、５％ＣＯ２条件下、３７℃で１時間培養した。培養には、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＤＭＥＭ培地およびウシ胎仔血清を用いた。
以上の試験群に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２無添加で同様に処理したものを正常細胞対照群とした。
（２）上記培養後の各ウェル中の細胞に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（国立感染症研究所ウイルス第３部より入手）を処理した。１時間後に洗浄し過剰のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を除去した後、上記薬物等の共存下、３７℃で２４時間培養した（図１Ａに実験方法の概要を図示する）。
（３）各ウェルの培養液上清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡをリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量し、ｒｅｌａｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ（相対的ウイルスＲＮＡ 黒抜き）とｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（細胞生存率 白抜き）を求めた。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２無添加で同様に処理したものを正常細胞対照群とし、同様に計算した。
（４）結果を図１Ｂに示す。
図１Ｂから、ＲＫ－Ｘ ２４μＭでウイルスＲＮＡが０．２７％、ＲＫ－Ｙ ３６μＭで０．００８７％、ＲＫ－Ｚ ２４μＭで０．２６％と、明らかな細胞毒性なく、ポジティブ薬物対照群を上回るウイルスＲＮＡ減少効果を認めた（ここでの数値は、「ＤＭＳＯ投与の対照群でのウイルス量に対する％」である）。
これらの濃度は、ヒトにＲＫ－Ｘ（１０ｍｇ）を投与したときに到達する濃度（４７７μｇ／Ｌ；Ｆｌｏｒｅｎ，Ｌ．Ｃ．；Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎ，Ｂ．；Ｋｗｅｉ，Ｌ．；ｅｔ ａｌ．６４ｔｈ Ａｎｎｕ Ｍｅｅｔ Ｓｃｉ Ｓｅｓｓ Ａｍ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃ （ＡＤＡ）・２００４－０６－０４／２００４－０６－０８・ Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ・ Ａｂｓｔ ６５１－Ｐ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００４，５３（Ｓｕｐｐｌ．２））から示唆されるとおり、ＲｄＲＰ阻害剤の経口投与で十分に達成できる濃度である。したがって、本発明の組成物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する十分な効果が得られることが明らかとなった。
【0053】
実施例２
ＲＫ－ＸのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体に対するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）活性阻害効果を、二本鎖核酸に結合して蛍光を発するＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の蛍光強度を指標として評価した。当該評価系は「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ＮＳ５ ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ．Ｔｒｏｐ．Ｄｉｓ．，２０１９）で用いられた方法に基づいている。
（１）ｎｓｐ１２は大腸菌由来セルフリータンパク質合成系を用いて試験管内で作製し、各種クロマトグラフィーによって精製した。ｎｓｐ７およびｎｓｐ８はそれぞれ大腸菌内において発現させ、細胞破砕段階から共精製することによってｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体として調製した。
精製したｎｓｐ１２とｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体を混合し、室温で３０分間静置した。次いで、ゲル濾過バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００（Ｃｙｔｉｖａ社）に混合物を通すことで、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体を分離した。
（２）ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体溶液とＰｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ溶液を等量混合し、室温で３０分間静置した。混合液に１００％ ＤＭＳＯに溶解したＲＫ－Ｘ、アッセイバッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４，２３．８ｍＭ ＮａＣｌ，１５％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１％（ｖ／ｖ） ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液を順次添加した後、室温に１時間静置した。添加量に関しては、ＲＫ－Ｘ溶液は反応系の約１／６０量、それ以外はｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体溶液と等量である。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体、Ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ、ＧＴＰの反応液における終濃度はそれぞれ２．６μＭ、０．３ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭである。
反応液全量とＴＥバッファーに溶解したＰｉｃｏＧｒｅｅｎを９６ウェルプレート上で混合し、室温で２０分間静置した。次いで、マルチモードプレートリーダーＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて蛍光強度（励起波長／蛍光波長＝４８５／５３５ｎｍ）の測定を行った。
（３）図２に蛍光強度の測定結果を示す。ＲＫ－ＸのＲｄＲｐ活性阻害効果は３種類の濃度（４．２μＭ，８．３μＭ，８３μＭ）で評価した。図２におけるｗ／ｏＲＫ－Ｘは、ＲＫ－Ｘを含まない１００％ ＤＭＳＯ添加時の蛍光強度である。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体存在下における著しい蛍光強度の増大は、ＲｄＲｐ反応が進行し二本鎖ＲＮＡが生成されていることを示している。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体とＲＫ－Ｘの共存在下において、ＲＫ－Ｘ濃度依存的な蛍光強度の減少が確認された。このことは、ＲＫ－Ｘがｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体に対する直接的なＲｄＲｐ活性阻害効果を有することを示唆している。
ＲＫ－ＸのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体に対するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）活性阻害効果を、二本鎖核酸に結合して蛍光を発するＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の蛍光強度を指標として評価した。当該評価系は「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ＮＳ５ ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ．Ｔｒｏｐ．Ｄｉｓ．，２０１９）で用いられた方法に基づいている。
（１）ｎｓｐ１２は大腸菌由来セルフリータンパク質合成系を用いて試験管内で作製し、各種クロマトグラフィーによって精製した。ｎｓｐ７およびｎｓｐ８はそれぞれ大腸菌内において発現させ、細胞破砕段階から共精製することによってｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体として調製した。
精製したｎｓｐ１２とｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体を混合し、室温で３０分間静置した。次いで、ゲル濾過バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００（Ｃｙｔｉｖａ社）に混合物を通すことで、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体を分離した。
（２）ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体溶液とＰｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ溶液を等量混合し、室温で３０分間静置した。混合液に１００％ ＤＭＳＯに溶解したＲＫ－Ｘ、アッセイバッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４，２３．８ｍＭ ＮａＣｌ，１５％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１％（ｖ／ｖ） ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液を順次添加した後、室温に１時間静置した。添加量に関しては、ＲＫ－Ｘ溶液は反応系の約１／６０量、それ以外はｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体溶液と等量である。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体、Ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ、ＧＴＰの反応液における終濃度はそれぞれ２．６μＭ、０．３ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭである。
反応液全量とＴＥバッファーに溶解したＰｉｃｏＧｒｅｅｎを９６ウェルプレート上で混合し、室温で２０分間静置した。次いで、マルチモードプレートリーダーＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて蛍光強度（励起波長／蛍光波長＝４８５／５３５ｎｍ）の測定を行った。
（３）図２に蛍光強度の測定結果を示す。ＲＫ－ＸのＲｄＲｐ活性阻害効果は３種類の濃度（４．２μＭ，８．３μＭ，８３μＭ）で評価した。図２におけるｗ／ｏＲＫ－Ｘは、ＲＫ－Ｘを含まない１００％ ＤＭＳＯ添加時の蛍光強度である。ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体存在下における著しい蛍光強度の増大は、ＲｄＲｐ反応が進行し二本鎖ＲＮＡが生成されていることを示している。また、ｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体とＲＫ－Ｘの共存在下において、ＲＫ－Ｘ濃度依存的な蛍光強度の減少が確認された。このことは、ＲＫ－Ｘがｎｓｐ７－ｎｓｐ８－ｎｓｐ１２複合体に対する直接的なＲｄＲｐ活性阻害効果を有することを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【0054】
本発明は、ウイルスに起因する疾患の予防または治療剤を提供するものであり、医薬の分野において有用である。
【図1A】
【図1B】
【図2】
