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特開2022-104889免疫刺激性リポプレックス、免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物、およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022104889
(43)【公開日】2022-07-12
(54)【発明の名称】免疫刺激性リポプレックス、免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物、およびその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/711 20060101AFI20220705BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20220705BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220705BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220705BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220705BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220705BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220705BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220705BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220705BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20220705BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20220705BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220705BHJP
C12N 15/117 20100101ALI20220705BHJP
【ＦＩ】
A61K31/711
A61K31/713 ZNA
A61K31/7105
A61K48/00
A61K39/395 T
A61P35/00
A61P37/04
A61P43/00 121
A61K9/127
A61K47/18
A61K47/28
A61K47/34
C12N15/117 Z
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021209444
(22)【出願日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】63/131,134
(32)【優先日】2020-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】390023582
【氏名又は名称】財團法人工業技術研究院
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１９５，Ｓｅｃ．４，ＣｈｕｎｇＨｓｉｎｇＲｄ．，Ｃｈｕｔｕｎｇ，Ｈｓｉｎｃｈｕ，Ｔａｉｗａｎ ３１０４０
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】ネン－チャン ユ
(72)【発明者】
【氏名】フェリス チェン
(72)【発明者】
【氏名】チー－ペン リウ
(72)【発明者】
【氏名】ミン－シ ウ
(72)【発明者】
【氏名】シー－タ チェン
(72)【発明者】
【氏名】チア－ム トゥ
(72)【発明者】
【氏名】リ－ウェン チャン
(72)【発明者】
【氏名】ジェン－シアン リ
(72)【発明者】
【氏名】メン－ピン シ
(72)【発明者】
【氏名】シャン－チン ワン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】免疫チェックポイント阻害剤の治療効果の改善（例えば、治療奏効率、組織の薬剤暴露量等の向上等）またはその使用できる適応症の増加を可能とする送達ビヒクルを提供する。
【解決手段】リポソームおよび少なくとも１つの免疫刺激核酸医薬を含む免疫刺激性リポプレックスであって、免疫刺激核酸医薬とリポソームとが複合化しており、リポソームが、４０から８５モル％のカチオン性脂質、１０から５０モル％のコレステロール、および０．００１から２０モル％の修飾ポリエチレングリコール脂質を含む、免疫刺激性リポプレックスを提供する。本開示はまた、前記免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物も提供する。
【選択図】図５
【解決手段】リポソームおよび少なくとも１つの免疫刺激核酸医薬を含む免疫刺激性リポプレックスであって、免疫刺激核酸医薬とリポソームとが複合化しており、リポソームが、４０から８５モル％のカチオン性脂質、１０から５０モル％のコレステロール、および０．００１から２０モル％の修飾ポリエチレングリコール脂質を含む、免疫刺激性リポプレックスを提供する。本開示はまた、前記免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物も提供する。
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫刺激性リポプレックスであって：
リポソーム；および
前記リポソームと複合化する少なくとも１つの免疫刺激核酸医薬、
を含み；
前記リポソームが、４０から８５モル％のカチオン性脂質、１０から５０モル％のコレステロール、および０．００１から２０モル％の修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含む、免疫刺激性リポプレックス。
リポソーム；および
前記リポソームと複合化する少なくとも１つの免疫刺激核酸医薬、
を含み；
前記リポソームが、４０から８５モル％のカチオン性脂質、１０から５０モル％のコレステロール、および０．００１から２０モル％の修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含む、免疫刺激性リポプレックス。
【請求項2】
前記免疫刺激核酸医薬には、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）、低分子干渉リボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）、マイクロリボヌクレオチド（ｍｉＲＮＡ）または前述の組み合わせが含まれる、請求項１に記載の免疫刺激性リポプレックス。
【請求項3】
前記カチオン性脂質には、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、脂質ＧＬ６７（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｐｉｄ ６７）、エチルホスホコリン（ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、３－β－［Ν－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）］カルバモイル（ＤＣ－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、前記各カチオン性脂質の誘導体または前記カチオン性脂質およびその誘導体の組み合わせが含まれる、請求項１または２に記載の免疫刺激性リポプレックス。
【請求項4】
前記修飾ＰＥＧ脂質には、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ脂質、ＤＭＧ－ＰＥＧ脂質または前述の組み合わせが含まれる、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫刺激性リポプレックス。
【請求項5】
前記ＤＳＰＥ－ＰＥＧ脂質および前記ＤＭＧ－ＰＥＧ脂質のＰＥＧ平均分子量が５００から１５０００Ｄａである、請求項４に記載の免疫刺激性リポプレックス。
【請求項6】
前記ＤＳＰＥ－ＰＥＧ脂質および前記ＤＭＧ－ＰＥＧ脂質のＰＥＧ末端官能基にはアミン基（ＮＨ２）またはマレイミド基（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）が含まれる、請求項４に記載の免疫刺激性リポプレックス。
【請求項7】
その粒径範囲が５０ナノメートルから３５０ナノメートルであり、かつその重合体分散度（ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ，ＰＤＩ）が０．４未満である、請求項１から６のいずれか１項に記載の免疫刺激性リポプレックス。
【請求項8】
がんを治療する薬剤を作製するのに用いる、請求項１から７のいずれか１項に記載の免疫刺激性リポプレックスの用途。
【請求項9】
前記がんには、結腸がん、乳がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、食道がん、頭頚部扁平上皮がん、前立腺がん、膀胱がん、リンパ腫、胆嚢がん、腎臓がん、血液がん、大腸がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がんまたはグリオーマが含まれる、請求項８に記載の免疫刺激性リポプレックスの用途。
【請求項10】
前記薬剤を個体に投与する方式には、静脈（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）注射、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射、筋肉（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）注射または吸入剤が含まれる、請求項８に記載の免疫刺激性リポプレックスの用途。
【請求項11】
前記免疫刺激性リポプレックスが免疫チェックポイント阻害剤と併用され、かつ前記免疫チェックポイント阻害剤には抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体または前述の組み合わせが含まれる、請求項８から１０のいずれか１項に記載の免疫刺激性リポプレックスの用途。
【請求項12】
請求項１から７のいずれか１項に記載の免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物。
【請求項13】
前記免疫刺激性リポプレックスと併用される免疫チェックポイント阻害剤をさらに含み、前記免疫チェックポイント阻害剤には抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体または前述の組み合わせが含まれる、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
がんを治療する薬剤を作製するのに用いる請求項１２または１３に記載の医薬組成物の用途。
【請求項15】
請求項１２または１３に記載の医薬組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／１３１，１３４号の利益を主張するもので、その全体が参照することにより本明細書に援用される。
本出願は、２０２０年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／１３１，１３４号の利益を主張するもので、その全体が参照することにより本明細書に援用される。
【技術分野】
【0002】
本開示は、免疫刺激性リポプレックスおよび免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物に関し、特にがん治療に有効に応用できる免疫刺激性リポプレックスおよびその医薬組成物に関する。
【0003】
免疫療法は、人体に元より備わる免疫システムの強化または免疫能力を外から与えることにより、疾病を治療または予防するものであり、近年、免疫療法はがんの治療に広く応用されるようになってきている。免疫療法には多種の方式があり、免疫チェックポイントブロッケード（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ，ＩＣＢ）は、臨床がん治療を有効に改善する効果がある方式であると認められており、例えば、免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＩＣＩ）を用いて治療を行うことができる。しかし、免疫チェックポイント阻害剤の単剤療法によるいくつかのがん（例えば、結腸直腸がん、トリプルネガティブ乳がん、肺がん、肝臓がん、腎癌等）への治療効果は理想的とは言えない。
【0004】
さらに、既知となっている多くの免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＴＬＲ９活性剤）の安全な投薬方式は腫瘍内投与（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射であるが、こうした状況は免疫チェックポイント阻害剤が使用できる適用症を制限してしまっており、例えば表在性腫瘍の治療にしか使用できないものとなっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
よって、免疫チェックポイント阻害剤の治療効果の改善（例えば、治療奏効率、組織の薬剤暴露量等の向上等）またはその使用できる適応症の増加を可能とする送達ビヒクルの開発は、医薬分野で取り組まれている研究課題の１つである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示のいくつかの実施形態により、リポソームおよび少なくとも１つの免疫刺激核酸医薬を含む免疫刺激性リポプレックスであって、免疫刺激核酸医薬とリポソームとが複合化しており、リポソームが４０から８５モル％のカチオン性脂質、１０から５０モル％のコレステロール、および０．００１から２０モル％の修飾ポリエチレングリコール脂質を含む、免疫刺激性リポプレックスを提供する。本開示はまた、前記免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物も提供する。
【0007】
本開示のいくつかの実施形態により、がんを治療する薬剤を作製するのに用いる前記免疫刺激性リポプレックスの用途を提供する。
【0008】
本開示のいくつかの実施形態により、前記免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物を提供する。
【0009】
本開示のいくつかの実施形態により、がんを治療する薬剤を作製するのに用いる前記医薬組成物の用途を提供する。
【0010】
本開示の特徴または利点を明らかかつ理解し易くするため、以下に好ましい実施形態を挙げ、添付の図面と対応させながら、詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図１は、本開示の一実施例において、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫刺激性リポプレックスを注射した後のマウス組織内のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの濃度測定結果を示している。ＣｐＧ－ＯＤＮ群：５０μｇ／マウス、１００μＬ／マウスの単回容量でＣｐＧ－７９０９オリゴデオキシヌクレオチドをマウスに静脈注射；リポプレックス群：５０μｇ／マウス、１００μＬ／マウスの単回用量で放射標識ＣｐＧ－７９０９と複合化した配合組成Ｆ１２のリポプレックスをマウスに静脈注射。
【図2】図２は、本開示の一実施例において、ヒトＴＬＲ９を発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ｈＴＬＲ９細胞株を濃度の異なるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫刺激性リポプレックスで処理した後に生じたＳＥＡＰの相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ，ＲＬＵ）の結果を示している。ＣｐＧ－ＯＤＮ群：ＣｐＧ－７９０９オリゴデオキシヌクレオチドで処理した細胞群であり、ＥＣ５０は約４８５ｎＭ；リポプレックス群：配合組成Ｃ１のリポプレックスで処理した細胞群であり、ＥＣ５０は約４６ｎＭ。
【図3】図３は、本開示の一実施例において、ヒトＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３－ｈＴＬＲ９／ＮＦ－κＢ－ｌｕｃ細胞株を濃度の異なるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫刺激性リポプレックスで処理した後に生じたＦＬｕｃの相対発光量（ＲＬＵ）の結果を示している。ＣｐＧ－ＯＤＮ群：ＣｐＧ－７９０９オリゴデオキシヌクレオチドで処理した細胞群であり、ＥＣ５０は約２４２ｎＭ；リポプレックス群－１：配合組成Ｃ１のリポプレックスで処理した細胞群であり、ＥＣ５０は約１８ｎＭ；リポプレックス群－２：配合組成Ｃ３のリポプレックスで処理した細胞群であり、ＥＣ５０は約２０ｎＭ；リポプレックス群－３：配合組成Ｃ２のリポプレックスで処理した細胞群であり、ＥＣ５０は約９ｎＭ；リポプレックス群－４：配合組成Ｃ６のリポプレックスで処理した細胞群であり、ＥＣ５０は約１２ｎＭ。
【図4】図４Ａ～４Ｃは、本開示の一実施例において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を濃度の異なるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫刺激性リポプレックスで処理した後に生じたＩＦＮ－α、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γの濃度変化をそれぞれ示している。コントロール群：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．５。ＣｐＧ－ＯＤＮ群：ＣｐＧ－７９０９オリゴデオキシヌクレオチドで処理したＰＢＭＣ群；リポプレックス群：配合組成Ｃ１のリポプレックスで処理したＰＢＭＣ群。
【図5】図５は、本開示の一実施例において、ＣＴ２６腫瘍細胞株を接種したマウスの投薬後の腫瘍体積の変化を示している。コントロール群：生理食塩水を週に２回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体群：抗マウスＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射；ＣｐＧ－ＯＤＮ群：ＣｐＧ－７９０９（５０μｇ／マウス）を週に２回静脈注射；リポプレックス群（ＢＩＷ）：配合組成Ｃ１のリポプレックス（５０μｇ／マウス）を週に２回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体＋ＣｐＧ－ＯＤＮ群：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、およびＣｐＧ－７９０９（５０μｇ／マウス）を週に２回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群（ＱＷ）：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ１のリポプレックス（５０μｇ／マウス）を週に１回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群（ＢＩＷ）：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ１のリポプレックス（５０μｇ／マウス）を週に２回静脈注射。
【図6】図６は、本開示の一実施例において、ＣＴ２６腫瘍細胞株を接種したマウスの投薬後の腫瘍体積の変化を示している。コントロール群：生理食塩水を週に２回静脈注射。抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ１０のリポプレックス（１５μｇ／マウス）を週に２回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ９のリポプレックス（１５μｇ／マウス）週に２回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－３：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ８のリポプレックス（１５μｇ／マウス）週に２回静脈注射。
【図7】図７は、本開示の比較例において、ＣＴ２６腫瘍細胞株を接種したマウスの投薬後の腫瘍体積の変化を示している。コントロール群：生理食塩水を週に２回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体群：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｅ２のリポプレックス（１５μｇ／マウス）を週に１回静脈注射。
【図8】図８は、本開示の一実施例において、ＣＴ２６腫瘍細胞株を接種したマウスの投薬後の腫瘍体積の変化を示している。コントロール群：生理食塩水を週に２回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ８のリポプレックス（１５μｇ／マウス）を週に１回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ１４のリポプレックス（１５μｇ／マウス）を週に１回静脈注射。
【図9】図９は、本開示の一実施例において、ＣＴ２６腫瘍細胞株を接種したマウスの投薬後の腫瘍体積の変化を示している。コントロール群：生理食塩水を週に２回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ１１のリポプレックス（１５μｇ／マウス）を週に１回静脈注射；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２：抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ１３のリポプレックス（１５μｇ／マウス）を週に１回静脈注射。
【図10】図１０は、本開示の一実施例において、ＣＴ２６腫瘍細胞株を接種したマウスの投薬後の腫瘍体積の変化を示している。抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス－１および抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス－２：２匹のマウスに対し、抗ＰＤ－１抗体（２５０μｇ／マウス）を週に２回腹腔注射、および配合組成Ｃ１のリポプレックス（５０μｇ／マウス）を週に２回静脈注射し、投薬期間は１４日（１１～２５日目）とし；コントロール群：８１日目にＣＴ２６細胞株を正常マウスに再接種。
【図11】図１１は、本開示の一実施例において、マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ｍＴＬＲ９細胞株を濃度の異なるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫刺激性リポプレックスで処理した後に生じたＳＥＡＰの相対発光量（ＲＬＵ）の結果を示している。ＣｐＧ－ＯＤＮ群：ＣｐＧ－３０－ＰＳオリゴデオキシヌクレオチドで処理した細胞群であり、ＥＣ５０は約４１９Ｍ；リポプレックス群－１：配合組成Ｃ２０のリポプレックスで処理した細胞群であり、ＥＣ５０は約９ｎＭ。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本開示の実施形態による核酸医薬複合体について詳細に説明する。以下の記載では、本開示のいくつかの実施形態の異なる態様を実施するために用いられる多くの異なる実施形態または例を提示しているという点が理解されなければならない。下記の特定の要素および構成は、単に本開示のいくつかの実施形態を簡潔に表すものにすぎない。当然に、これらは単なる例示に過ぎず、本開示を限定するものではない。
【0013】
本明細書において、「約」、「およそ」、「実質的に」なる用語は、通常の場合、所定の値または範囲の５％以内、または３％以内、または２％以内、または１％以内、または０．５％以内にあるということを表す。本明細書における所定の数はおおよその数である。つまり「約」、「およそ」、「実質的に」ということが特に説明されていない場合にも、「約」、「およそ」、「実質的に」という意味であり得るということである。さらに、数値の範囲を表す用語「第１の数値と第２の数値の間の」および「第１の数値から第２の数値までの」は、前記範囲が第１の数値、第２の数値、およびこれらの間のその他の数値を含むことを示す。
【0014】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用する全ての用語（技術および科学用語を含む）は、本開示の属する技術分野における技術者が通常理解するものと同じ意味を有する。例えば、通常使用される辞書で定義されるこれら用語は、関連技術および本開示の背景または前後の文脈と一致する意味に解されるべきであって、理想化された、または過度に正式な仕方で解釈されてはならないということが、理解できる。本開示の内容がより容易に理解されるよう、以下に術語および用語の定義を提供する。
【0015】
術語「カチオン性脂質」とは、多種の脂質種中のいずれかのことであって、生理的ｐＨにおいて正味の正電荷を有するか、またはプロトン化可能基を有し、かつｐＫａより低いｐＨで正に帯電するものである。
【0016】
術語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いることができ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が含まれ得る任意の長さのヌクレオチドの重合体のことをいう。ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドは、プリン（アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）もしくはそれらの誘導体）またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）もしくはウラシル（Ｕ）もしくはそれらの誘導体）塩基および糖の結合からなる。ＤＮＡ中の４つのヌクレオチドのユニット（または塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと称される。ＲＮＡ中の４つのヌクレオチドのユニット（または塩基）は、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンと称される。ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリン酸エステルである。核酸の非限定的な例には、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー等が含まれる。核酸には、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログが含まれ得る。
【0017】
術語「ＣｐＧ」および「ＣＧ」は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いることができ、ホスホジエステル結合により分離されているシトシンおよびグアニンのことを指す。本開示の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドには、１つまたは複数の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが含まれ得る。本開示のいくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＯＤＮ）である。
【0018】
術語「プログラムされたデスリガンド－１」は、「ＰＤ－Ｌ１」、「表面抗原分類２７４（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７４，ＣＤ２７４）」または「Ｂ７ホモログ－１（Ｂ７ ｈｏｍｏｌｏｇ－１，Ｂ７－Ｈ１）」とも称され、ヒトにおいてＣＤ２７４遺伝子にコードされるタンパク質のことを指す。ヒトＰＤ－Ｌ１は４０ｋＤａ １型膜貫通タンパク質であり、その主な機能は免疫システムを抑制することにある。ＰＤ－Ｌ１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞における受容体ＰＤ－１に結合して、活性化または抑制を制御する。ＰＤ－Ｌ１はまた、共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７－１）に対して顕著な親和性を有するものでもある。ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞における受容体ＰＤ－１との結合により、Ｔ細胞受容体に制御されるＩＬ－２の産生、およびＴ細胞増殖の活性化を抑制することのできるシグナルが伝達され得る。ＰＤ－Ｌ１は、チェックポイント（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）と見なすことができ、かつその腫瘍における増加は、Ｔ細胞に制御される抗腫瘍応答の抑制を助ける。本開示の実施形態によれば、ＰＤ－Ｌ１は哺乳動物由来のＰＤ－Ｌ１であってよく、例えば、ヒト由来のＰＤ－Ｌ１であってよい。
【0019】
術語「がん」は、哺乳動物における細胞集団の制御されない細胞成長に特徴付けられる生理学的な病状のことをいう。術語「腫瘍」は、過度な細胞成長または増殖により生じた何らかの組織腫瘤のことを指し、前がん病変を含む良性（非がん性）または悪性（がん性）腫瘍を含む。
【0020】
術語「免疫反応」には、自然免疫系および獲得免疫系からの応答が含まれ、それには細胞制御の免疫応答または体液性免疫応答が含まれる。免疫応答には、Ｔ細胞およびＢ細胞応答、ならびに免疫系の他の細胞、例えばナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ，ＮＫ）細胞、単核細胞、マクロファージ等からの応答が含まれる。
【0021】
さらに、術語「治療」は、診断された病理学的な症状あるいは病気を治癒し、緩和し、症状を軽減し、および／もしくは進行を止める治療手段、ならびに／または目的とする病理学的な症状あるいは病気の進行を予防および／もしくは緩和する予防手段のことを指す。よって、治療を必要とする個体には、すでに疾病にかかっている者、疾病にかかり易い者、および疾病を予防すべき者が含まれ得る。本開示の実施形態によれば、がんまたは腫瘍を有する患者が以下の状態のうちの１つまたは複数を示した場合は、個体の治療が成功したことを表す：免疫応答の増加、抗腫瘍応答の増加、免疫細胞の細胞溶解活性の増加、免疫細胞の腫瘍細胞殺傷の増加、がん細胞数の減少もしくは完全な不存在；腫瘍サイズの縮小；周辺器官へのがん細胞浸潤の抑制もしくは不存在；腫瘍もしくはがん細胞の転移の抑制もしくは不存在；がん細胞成長の抑制もしくは不存在；具体的ながんに関連する１つまたは複数の症状の寛解；罹患率および死亡率の低下；生活の質の改善；腫瘍形成性の低減；またはがん幹細胞の数もしくは出現頻度等の減少等。
【0022】
本開示のいくつかの実施形態により、特定の組成を有するリポソーム、およびリポソームと複合化した免疫刺激核酸医薬を含む免疫刺激性リポプレックスを提供し、それは、全身性投与の方式（例えば静脈注射）により投与されてよい。本開示の実施形態により提供されるリポプレックスは、免疫刺激核酸医薬（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）の低い安定性、および不十分な組織暴露量の問題を改善することができ、薬剤の特異的免疫賦活作用を高め、単回用量の薬剤の作用時間を延長することもでき、薬剤により引き起こされる全身性免疫副作用を低減させ得る。さらに、本開示のいくつかの実施形態により、免疫刺激性リポプレックスを現行の免疫チェックポイント阻害剤と併用すれば、相乗効果を発揮して、がん免疫療法の治療効果をより一層高めることができる。
【0023】
本開示の実施形態により提供される免疫刺激性リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）は、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、および少なくとも１つの免疫刺激核酸医薬を含み、免疫刺激核酸医薬とリポソームとは複合化され、かつリポソームは約４０から約８５モル％（ｍｏｌ％）のカチオン性脂質、約１０から約５０モル％のコレステロール、および約０．００１から約２０モル％の修飾ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）脂質を含む。
【0024】
いくつかの実施形態によれば、リポソームは、約５０から約８０モル％のカチオン性脂質、約１５から約３５モル％のコレステロール、および約０．０１から約１５モル％の修飾ＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態によれば、リポソームは約６０から約８０モル％のカチオン性脂質、約１５から約３０モル％のコレステロール、および約０．１から約１５モル％の修飾ＰＥＧ脂質を含む。
【0025】
いくつかの実施形態によれば、リポソームは、カチオン性脂質、コレステロールおよび修飾ＰＥＧ脂質を含む組成から形成されるナノ粒子集合体である。本明細書において、術語「ナノ粒子」とは、サイズがナノメートルスケールで測定される粒子のことをいい、例えば、ナノ粒子は、粒径が約１００００ナノメートル（ｎｍ）未満の構造を有する粒子のことをいう。いくつかの実施形態によれば、リポソームの粒径範囲は、約５０ナノメートルから約２００ナノメートル、または約６０ナノメートルから約１７０ナノメートル、または約７０ナノメートルから約１６５ナノメートルであり、例えば約８０ナノメートル、約９０ナノメートル、約１００ナノメートル、約１１０ナノメートル、約１２０ナノメートル、約１３０ナノメートル、約１４０ナノメートル、約１５０ナノメートル、約１６０ナノメートル、または約１７０ナノメートルである。
【0026】
リポソームのカチオン性脂質、コレステロールおよび修飾ＰＥＧ脂質の比率を特定の範囲内として調製し（例えば、約４０～８５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約１０～５０ｍｏｌ％のコレステロール、および約０．００１～２０ｍｏｌ％の修飾ＰＥＧ脂質を含む）、ナノ粒子構造を有するリポソームを形成する必要があるという点に留意すべきである。
【0027】
いくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質には、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ，ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉ－Ｏ－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ，ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ ｐｒｏｐａｎｅ，ＤＯＤＭＡ）、脂質ＧＬ６７（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｐｉｄ ６７）、エチルホスホコリン（ｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、３－β－［Ν－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）］カルバモイル（３s－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）－ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＤＣ－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、前述した各カチオン性脂質の誘導体または前述したカチオン性脂質およびその誘導体の組み合わせが含まれるが、これに限定はされない。
【0028】
いくつかの実施形態によれば、修飾ＰＥＧ脂質には、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ脂質（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール、１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｃａｒｂｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］）、ＤＭＧ－ＰＥＧ脂質（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール、１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｒａｃ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）または前述の組み合わせが含まれるが、これに限定はされない。
【0029】
いくつかの実施形態によれば、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ脂質およびＤＭＧ－ＰＥＧ脂質のＰＥＧ平均分子量は約５００から約１５０００Ｄａ、または約８００から約１２０００Ｄａ、例えば約９００Ｄａ、約１０００Ｄａ、約２０００Ｄａ、約３０００Ｄａ、約４０００Ｄａ、約５０００Ｄａ、約６０００Ｄａ、約７０００Ｄａ、約８０００Ｄａ、約９０００Ｄａ、約１００００Ｄａ、または約１１０００Ｄａ等であるが、本開示はこれに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ脂質およびＤＭＧ－ＰＥＧ脂質のＰＥＧ末端官能基にはアミン基（ＮＨ２）またはマレイミド基（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）が含まれるが、これに限定はされない。
【0030】
いくつかの実施形態によれば、リポソームの重合体分散度（ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ，ＰＤＩ）は約０．４未満、例えば約０．３未満、約０．２未満、または約０．１未満である。ＰＤＩは粒子の粒径分布の広がりを評価するのに用いることができ、ＰＤＩが大きいほど、形成されるリポソーム中により多種の粒径サイズの粒子が存在するということであって、リポソームの均一性が低いということを表す。なお、いくつかの実施形態によれば、ＰＤＩが０．４より大きいと、リポソームの配合組成の均質性は低く、形成されるリポソーム粒子の均一性が低いということである、という点に注目すべきである。
【0031】
いくつかの実施形態によれば、リポソームのゼータ電位（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は約０から約１５０ｍＶ、または約５から約１００ｍＶであってよいが、これに限定はされない。ゼータ電位は、粒子表面の帯電状況の指標を提供することができる。一般に、ゼータ電位の数値が＋１０ｍＶから－１０ｍＶの間にあると、粒子表面が電気的に中性になることを表し；＋３０ｍＶより大きい、または－３０ｍＶより小さいと、それぞれ粒子表面が明らかに正帯電または負帯電していることを表す。
【0032】
また、リポソームを形成するカチオン性脂質および修飾ＰＥＧ脂質のタイプは、前述した実施形態で挙げたものに限られず、本開示のいくつかの実施形態によれば、その他の適したタイプのカチオン性脂質および修飾ＰＥＧ脂質を選択することができ、形成されたリポソームが好ましいナノ粒子構造、例えば好ましい粒径範囲、ＰＤＩ等を有するものであればよい、ということが理解されなければならない。
【0033】
また、いくつかの実施形態によれば、免疫刺激性リポプレックス中の免疫刺激核酸医薬は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＯＤＮ）、低分子干渉リボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）、マイクロリボヌクレオチド（ｍｉＲＮＡ）または前述の組み合わせを含み得る。
【0034】
ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはＴＬＲ９受容体（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９）に結合することができ、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはＴＬＲ９を強力に活性化して、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）の産生を促し、抗腫瘍または抗ウイルス等の免疫応答を誘発することができる。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、既知の免疫刺激性を有する任意のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列であってよい。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列長は約１５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドであってよいが、これに限定はされない。例えば、いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列と、配列番号：１または２で示される核酸配列とは、少なくとも８５％の相同性を有していてよく、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有していてよいが、これに限定はされない。
【0035】
いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列は、１つまたは複数の非メチル化ＣｐＧモチーフ（ｍｏｔｉｆ）を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列中のＣｐＧモチーフは、８５％から１００％が非メチル化のものであってよく、例えば約８８％、９０％、９２％、９５％、９８％等が非メチル化のものであってよいが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列中のＣｐＧモチーフは全部が非メチル化のものであり得る。また、いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列は、修飾ホスホジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）、例えばホスホロチオエート結合（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｂｏｎｄ）を含み、これにより免疫刺激核酸医薬が生体内の酵素に分解されるリスクを低減し、リポプレックスの安定性を高めることができる。いくつかの実施形態によれば、ホスホロチオエート結合の数は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列のホスホジエステル結合の数の約７０％から１００％、または約８０％から１００％を占めていてよく、例えば８５％、９０％または９５％であってよいが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列中の全てのホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合に修飾されていてよい。
【0036】
さらに、前述したｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、既知の免疫刺激性を有する任意のｓｉＲＮＡ配列およびｍｉＲＮＡ配列であり得る。
【0037】
いくつかの実施形態によれば、リポソームと免疫刺激核酸医薬とが複合化して形成されるリポプレックスの粒径の範囲は、約５０ナノメートルから３５０ナノメートル、または約６０ナノメートルから約３００ナノメートル、または約７０ナノメートルから約２５０ナノメートル、例えば約８０ナノメートル、約９０ナノメートル、約１００ナノメートル、約１１０ナノメートル、約１２０ナノメートル、約１３０ナノメートル、約１４０ナノメートル、約１５０ナノメートル、約１６０ナノメートル、約１７０ナノメートル、約１８０ナノメートル、約１９０ナノメートル、約２００ナノメートル、約２１０ナノメートル、約２２０ナノメートル、約２３０ナノメートル、または約２４０ナノメートル等であってよいが、本開示はこれに限定されない。
【0038】
いくつかの実施形態によれば、リポソームと免疫刺激核酸医薬とが複合化して形成されたリポプレックスの重合体分散度（ＰＤＩ）は約０．４未満、例えば約０．３未満、約０．２未満、または約０．１未満である。なお、いくつかの実施形態によれば、ＰＤＩが０．４より大きいと、リポプレックスの配合組成の均質性が低く、形成されるリポプレックス粒子の均一性が低いということである、という点に注目すべきである。
【0039】
いくつかの実施形態によれば、リポプレックスのゼータ電位（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は約－７０から約１５０ｍＶ、または約－６０から約１００ｍＶであってよいが、これに限定はされない。
【0040】
本開示の実施形態によれば、特定の組成を有する免疫刺激性リポプレックスは、免疫刺激核酸医薬の低い安定性、および不十分な組織暴露量の問題を改善することができ、薬剤の特異的免疫賦活作用を高め得るという点に注目されたい。
【0041】
さらに、いくつかの実施形態によれば、前述した免疫刺激性リポプレックスは、がん治療の薬剤を作製するのに用いることができる。いくつかの実施形態によれば、免疫刺激性リポプレックスは、医薬的に許容され得る担体をさらに含んでいてよい。例えば、いくつかの実施形態によれば、有効量の前記免疫刺激性リポプレックスを必要な個体に投与することができる。いくつかの実施形態によれば、個体には哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、オランウータンまたはヒト等が含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、前記個体はヒトであり得る。いくつかの実施形態によれば、免疫刺激性リポプレックスを含む薬剤を個体に投与する方式には、静脈（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）注射、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射、筋肉（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）注射または吸入剤が含まれ得るが、これに限定はされない。
【0042】
いくつかの実施形態によれば、前述したがんには、結腸がん、乳がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、食道がん、頭頚部扁平上皮がん、前立腺がん、膀胱がん、リンパ腫、胆嚢がん、腎臓がん、血液がん、大腸がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がんまたはグリオーマが含まれ得るが、これに限定はされない。
【0043】
本開示の実施形態によれば、免疫刺激性リポプレックスは、全身性投与の方式で投与されてよく、一般的な腫瘍内投与の投薬による限界の問題、例えば深部の腫瘍の不十分な治療効果といった問題を改善できるという点に注目されたい。
【0044】
また、いくつかの実施形態によれば、免疫刺激性リポプレックスは免疫チェックポイント阻害剤と併用することができる。免疫チェックポイント阻害剤には、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体または前述の組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。免疫刺激性リポプレックスを現行の免疫チェックポイント阻害剤と併用することで、相乗効果が奏され、ひいてはがん免疫療法の効果をより一層高めることができる。
【0045】
いくつかの実施形態によれば、前述した免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物を提供し、この医薬組成物はがんの治療に用いることができる。医薬組成物は医薬的に許容され得る担体をさらに含んでいてよい。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害剤をさらに含んでいてよく、それは免疫刺激性リポプレックスと併用される。免疫チェックポイント阻害剤には抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体または前述の組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物を個体に投与する方式には、静脈注射、皮下注射、筋肉注射または吸入剤が含まれ得るが、これに限定はされない。
【0046】
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、溶液または懸濁液の形式とされていてよい。あるいは、医薬組成物は、脱水固形物（例えば冷凍乾燥または噴霧乾燥した固形物）であり得る。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は無菌かつ個体に対して無毒性のものであり得る。さらに、いくつかの実施形態によれば、前述した医薬的に許容され得る担体には、賦形剤、溶解剤、緩衝剤、安定剤または防腐剤が含まれ得るが、これに限定はされない。
【0047】
例えば、賦形剤には溶媒が含まれていてよく、いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は溶媒として水性媒体を含み得る。水性媒体には、例えば無菌水、食塩水、リン酸緩衝食塩水またはリンゲル液（Ｒｉｎｇｅｒ'ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、溶解剤は、冷凍もしくは噴霧乾燥時および／または保存時に免疫刺激性リポプレックスを安定させる助けとなり、かつその分解を防止する保護剤である。溶解剤には例えば、糖（単糖、二糖および多糖）、例として蔗糖、乳糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトールまたはぶどう糖が含まれ得るが、これに限定はされない。さらに、いくつかの実施形態によれば、緩衝剤は、加工、保存時等において免疫刺激性リポプレックスに分解が発生しないようにｐＨ値を調整することができる。緩衝液には例えば塩、例として酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩または硫酸塩が含まれ得るが、これに限定はされない。緩衝液には例えばアミノ酸、例としてアルギニン、グリシン、ヒスチジン、またはリジンが含まれていてもよいが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、安定剤には例えば右旋糖、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロールまたはマンニトールが含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、防腐剤には例えば、抗酸化剤または抗微生物劑が含まれ得るが、これに限定はされない。
【0048】
また、本開示の実施形態により、前述した医薬組成物および使用方法が記載された説明書を含むキットを提供する。医薬組成物を含むキットは適切に包装されている。いくつかの実施形態によれば、キットは、医薬組成物を投与するのに用いる装置（例えば、注射器および針、噴霧器、または乾燥粉末吸入装置等）をさらに含んでいてよい。
【0049】
本開示の上述およびその他の目的、特徴、ならびに利点をより明らかに分かり易くするため、以下に複数の作製例、実施例および比較例を挙げて詳細に説明するが、これらは本開示の内容を限定するものではない。
【0050】
作製例１：リポソームの作製
【0051】
下表１に示される配合組成番号Ｆ１～Ｆ２５およびＮ１～Ｎ１１のとおりに、カチオン性脂質、コレステロールおよび修飾ＰＥＧ脂質を量り取り、丸底フラスコ中に入れ、メタノール（Ｍｅｒｃｋより購入）で脂質を溶解した。ここで使用したカチオン性脂質ＤＯＴＡＰはＡｖａｎｔｉより購入し（ＣＡＳ番号１３２１７２－６１－３）、コレステロールはＮｉｐｐｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌより購入し（ＣＡＳ番号５７－８８－５）、修飾ＰＥＧ脂質ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２Ｋ）はＮｉｐｐｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌより購入し（ＣＡＳ番号２４７９２５－２８－６）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－１Ｋ、５Ｋ、１０ＫはＮａｎｏｃｓより購入し；ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２Ｋ－ＮＨ２はＡｖａｎｔｉより購入し（ＣＡＳ番号４７４９２２－２６－４）；ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２Ｋ－ＭａｌｅｉｍｉｄｅはＡｖａｎｔｉより購入した（ＣＡＳ番号４７４９２２－２２－０）。
【0052】
脂質が全て溶解したのを確認した後、丸底フラスコをバッファーボトルおよび減圧濃縮装置に接続し、６０℃の水浴中にて回転速度１５０ｒｐｍで温度を平衡化した。次いで、真空度を１５０ｍＰａに設定し、真空ポンプを起動して約５分動作させた。その後、真空度を２０ｍＰａに設定し、溶媒を完全に除去したところ、配合組成の混合物は薄膜を形成した。次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５、ＶＷＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅより購入）を丸底フラスコ中に加えて水和（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）反応を進行させ、低出力超音波振動により薄膜を完全に溶解させた。その後、水和した溶液に対し、高出力超音波振動（Ｐｕｌｓｅ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）または高圧ホモジナイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）で粒度の分級（ｓｉｚｉｎｇ）を行った。サンプルが透明で清澄であった場合、０．２２μｍのフィルターでろ過してから分けた；サンプルが沈殿していた場合は、サンプルを直接遠心管に移し、サンプルを４℃で保存した。
【0053】
次いで、サンプルを２０μＬ取り、ＰＢＳ９８０μＬ中に加え、振とうして均一にした後、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ （Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で各配合組成で形成されたリポソームの粒径を測定した。また、サンプルを２０μＬ取り、１０ｍＭ ＮａＣｌ溶液９８０μＬ中に加え、振とうして均一にした後、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ （Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌで各配合組成で形成されたリポソームのゼータ電位を測定した。
【0054】
【表1】
【0055】
表１に示されるように、配合組成番号Ｆ１～Ｆ２５で形成されたリポソームの粒径範囲は５０ｎｍから２００ｎｍ、リポソームのＰＤＩ値はいずれも０．４未満、その大部分が０．３未満であり、リポソーム粒子が均質性および均一性に優れるということが示されている。さらに、配合組成番号Ｆ１～Ｆ２５で形成されたリポソームの粒子表面はほとんどが正に帯電していた。これに対し、配合組成番号Ｎ１およびＮ３～Ｎ１０は沈殿が生じ、粒子構造のリポソームが形成されず、配合組成Ｎ２およびＮ１１で形成されたリポソームにあっては粒径範囲が小さく（５０ｎｍ未満）、かつリポソーム粒子表面は負に帯電していた。
【0056】
作製例２：リポプレックスの作製
【0057】
先ず、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５、ＶＷＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅより購入）でＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）の凍結結晶粉末ＣｐＧ－７９０９（配列番号：１で示される核酸配列、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにカスタム合成を委託）またはＣｐＧ－３０－ＰＳ（配列番号：２で示される核酸配列、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにカスタム合成を委託）を溶解し、軽く振とうし、ＣｐＧ－ＯＤＮ凍結結晶粉末が完全に溶解したのを確認した。さらに、０．２２μｍフィルターでＣｐＧ－ＯＤＮ溶液をろ過した。
【0058】
その後、先ず１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）をサンプルびんまたは遠心管に入れ、次いで、下表２に示される配合組成番号Ｃ１～Ｃ２０およびＥ１～Ｅ２にしたがって、先ずリポソーム（リポソームの作製方式は作製例１の部分に記載されている）を加えてから、ＣｐＧ－ＯＤＮ溶液を加えた。サンプルを混ぜ合わせた後、３０～４０分撹拌を続け、リポソームとオリゴデオキシヌクレオチドとの複合化を完了させてリポプレックスを形成した。
【0059】
次いで、サンプルを２０μＬ取ってＰＢＳ９８０μＬ中に加え、振とうして均一にした後、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ （Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で各配合組成により形成したリポプレックスの粒径を測定した。また、サンプルを２０μＬ取って１０ｍＭ ＮａＣｌ溶液９８０μＬ中に加え、振とうして均一にした後、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ （Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で各配合組成により形成したリポプレックスのゼータ電位を測定した。
【0060】
【表2】
【0061】
表２に示されるように、配合組成番号Ｃ１～Ｃ２０で形成されたリポプレックスの粒径範囲は５０ｎｍから３００ｎｍ、リポソームのＰＤＩ値はいずれも０．３５未満、その大部分は０．２未満であり、リポソーム粒子が均質性および均一性に優れるということが示されている。さらに、リポプレックスの粒子表面は、正に帯電、または負に帯電し得る。
【0062】
実施例１：リポプレックスの薬物動態的評価
【0063】
マウスの薬物動態的評価を通して、リポプレックス（ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドと複合化したリポソーム）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）単独の動物体内における薬剤暴露量の差を分析し、不十分な標的組織（例えば腫瘍）薬剤暴露量が薬効に影響を与える主因を確かめた。
【0064】
先ず、配合組成Ｆ１２のリポソームをサンプルびんまたは遠心管に入れてから、１２５Ｉ（Ｎ－スクシンイミジル４－メチル－３－トリメチルスタニルベンゾエート，Ｎ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－ｍｅｔｈｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｔａｎｎｙｌ ｂｅｎｚｏａｔｅ，ＣＥＮＴＲＩＰｕｒｅ ＭＩＮＩ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ）で標識されたＣｐＧ－７９０９（５ｍｇ／ｍＬ、ｄｄＨ２Ｏ中、ＰＨ値７．５）を加えて複合反応を進行させた。複合反応は２ステップに分けて行い、各ステップの溶液の混合は、１５～２０分続けて撹拌するものとした。２ステップの複合体積は下表３に示すとおりであり、生体内薬物動態試験に必要な薬物濃度０．５ｍｇ／ｍＬで調製した（用量５０μｇ／マウス、投与体積１００μＬ／マウス）。複合反応が完了した後、形成されたリポプレックスの粒径、ＰＤＩおよびゼータ電位を測定したところ、粒径８９．８１ｎｍ、ＰＤＩ０．２０５、ゼータ電位２４．３ｍＶであった。
【0065】
【表3】
【0066】
次いで、用量５０μｇ／マウス、注射体積１００μＬ／マウスで、配合組成Ｆ１２のリポプレックスまたは単独の１２５Ｉ標識ＣｐＧ－７９０９（ＣｐＧ－ＯＤＮ）をマウス（メスＢａｌｂ／ｃマウス、体重約２５ｇ、楽斯科生物科技社より購入）に単回用量静脈注射した。薬剤群をリポプレックス群およびＣｐＧ－ＯＤＮ群に分け、かつ各薬剤群を採血（ＰＫ）群および組織分布（ｂｉｏ－ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）群に分けた。採血群（マウス３匹）では、投薬の１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、３日および７日後にそれぞれ血液を採取した。組織分布群（マウス３匹）では、投薬の４時間、２４時間、３日および７日後にそれぞれ肝臓、腎臓、脾臓、リンパ節を採取した。そして、γカウンター（ｇａｍｍａ ｃｏｕｎｔｅｒ）で標的物質の活性度の分析を行った。採血群の実験結果は表４に示すとおりであり、組織分布群の実験結果は図１および表５（定量化の結果）に示すとおりである。
【0067】
【表4】
【0068】
【表5】
【0069】
表４に示されるように、リポプレックス群は、血液中のＣｐＧ－ＯＤＮ薬剤暴露量を約２倍高めることができる。さらに、図１および表５の結果に示されるように、リポプレックス群は、組織中のＣｐＧ－ＯＤＮ薬剤暴露量を約１．７～１６６倍高めることができる。これからわかるように、単独使用するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドと比較して、リポプレックスは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの生体内における薬物動態特性を改善することができる。
【0070】
実施例２：リポプレックスのＴＬＲ９活性化能力の評価
【0071】
ヒトＴＬＲ９を発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ｈＴＬＲ９細胞株（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎより購入、製品番号ｈｋｂ－ｈｔｌｒ９）を用いて、配合組成Ｃ１のリポプレックス（リポプレックス群）および単独ＣｐＧ－７９０９（ＣｐＧ－ＯＤＮ群）のＴＬＲ９活性化能力を評価した。詳細には、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ｈＴＬＲ９細胞株は、活性化が誘導された後に、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＳＥＡＰ）を生じるが、これによりリポプレックス群およびＣｐＧ－ＯＤＮ群のＴＬＲ９を誘導する活性を評価することができる。ＳＥＡＰ発光レポーター遺伝子システムＰｈｏｓｐｈａ－Ｌｉｇｈｔ（登録商標）ＳＥＡＰ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入、製品番号Ｔ１０１７）を用いて、リポプレックス群およびＣｐＧ－ＯＤＮ群で処理した細胞培養上清中のＳＥＡＰを検出した。誘導の２日前に９６ウェルプレートに接種しておいたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ｈＴＬＲ９細胞の細胞培養上清を除去し、異なる誘導剤を含有する完全細胞培養液を加え、細胞培養器でさらに７時間培養してから、細胞培養上清のサンプルを収集して－８０℃で保存した。－８０℃で保存したサンプルを解凍した後、上述したＳＥＡＰレポーター遺伝子分析試薬キットを用いて細胞培養上清中のＳＥＡＰレポーター遺伝子活性を分析した。次いで、関連分析データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ生物統計学ソフトウェアによりデータ処理した。結果は図２に示されるとおりである。
【0072】
図２に示されるように、実験結果より、ＣｐＧ－ＯＤＮ群のＥＣ５０値がおよそ４８５ｎＭ、リポプレックス群のＥＣ５０値がおよそ４６ｎＭであることが示された。単独使用のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドに比して、リポプレックス配合組成はＴＬＲ９活性能力を大幅に高めることができた（ＥＣ５０が約１０倍向上）。
【0073】
実施例３：リポプレックスのＴＬＲ９活性化能力の評価
【0074】
ヒトＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３－ｈＴＬＲ９／ＮＦ－κＢ－ｌｕｃ細胞株（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入、製品番号６０６８５）を用い、配合組成Ｃ１、Ｃ３、Ｃ２、Ｃ６のリポプレックス（それぞれリポプレックス群－１、リポプレックス群－２、リポプレックス群－３、リポプレックス群－４に対応）および単独ＣｐＧ－７９０９（ＣｐＧ－ＯＤＮ群）のＴＬＲ９活性化能力を評価した。詳細には、ＨＥＫ２９３－ｈＴＬＲ９／ＮＦ－κＢ－ｌｕｃ細胞株は、活性化が誘導された後に、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ，ＦＬｕｃ）を生じるが、これによりリポプレックス群－１～４およびＣｐＧ－ＯＤＮ群のＴＬＲ９を誘導する活性を評価することができる。Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｐｒｏｍｅｇａより購入、製品番号Ｅ４５５０）を、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡより購入、製品番号Ｃ２９７８）と組み合わせて用い、リポプレックス群－１～４およびＣｐＧ－ＯＤＮ群で処理した細胞内のレポーター遺伝子活性分析を行った。誘導の２日前に９６ウェルプレートに接種しておいたＨＥＫ２９３－ｈＴＬＲ９／ＮＦ－κＢ－ｌｕｃ細胞の細胞培養上清を除去し、異なる誘導剤を含有する完全細胞培養液を加え、細胞培養器でさらに６時間培養した後、上述したＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ溶解バッファを加え、かつ上述したＲａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ発光レポーター遺伝子試薬キットを用い、細胞溶解液中におけるレポーター遺伝子の活性を分析した。次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ生物統計学ソフトウェアにより関連データの処理および分析を行った。結果は図３に示されるとおりである。
【0075】
図３に示されるように、実験結果より、ＣｐＧ－ＯＤＮ群のＥＣ５０値がおよそ２４２ｎＭ、リポプレックス群－１のＥＣ５０値がおよそ１８ｎＭ、リポプレックス群－２のＥＣ５０値がおよそ２０ｎＭ、リポプレックス群－３のＥＣ５０値がおよそ９ｎＭ、リポプレックス群－４のＥＣ５０値がおよそ１２ｎＭであることが示された。単独使用のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドに比して、配合組成の異なるリポプレックス－１～４はいずれもＴＬＲ９活性能力を大幅に高めることができていた（ＥＣ５０が約１０倍向上）。
【0076】
実施例４：リポプレックスのサイトカイン活性化能力の評価
【0077】
先ず、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ １．０７７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより購入）を用いてヒト血液を分離し、４００×ｇで４０分遠心分離した後、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）を分離し、ＰＢＭＣ細胞を収集した後、ＤＰＢＳ緩衝液で洗浄・遠心分離し、さらに１００×ｇで１０分遠心分離して血小板を分離した後、細胞数１．５×１０６で４８ウェルプレートに接種した。次いで、培養プレート中に、系列希釈した濃度の異なるＣｐＧ－７９０９（ＣｐＧ－ＯＤＮ群）または配合組成Ｃ１のリポプレックス（リポプレックス群）を加え、２４時間培養した後、上清を収集して、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２７－ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－ｒａｄより購入）でＩＦＮ－γ、ＩＬ－６の濃度変化を測定した。また、ＰＢＬ ＶｅｒｉＫｉｎｅ－ＨＳ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－α Ａｌｌ Ｓｕｂｔｙｐｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ Ｐｒｏｄｕｃｔ（ＰＢＬ ａｓｓａｙ ｓｃｉｅｎｃｅ，＃４２１１５より購入）でＩＦＮ－α濃度を測定した。
【0078】
図４Ａ～４Ｃに示されるように、実験結果から、リポプレックス群は、低濃度（例えば，約１０ｎＭ）のときに、ヒトＰＢＭＣ細胞のＩＬ－６、ＩＦＮ－γ産生を促進することができ、活性化能力がＣｐＧ－ＯＤＮ群よりも強いことが示されている。また、ＣｐＧ－ＯＤＮ群がほぼ活性化することのできなかったＩＦＮ－αも、リポプレックス群では分泌の促進が見られた。このことからわかるように、リポプレックス群は、免疫抗がんに関連するサイトカインの分泌を有効に促進することができる。
【0079】
実施例５：リポプレックスの生体内における免疫抗がん効果の評価
【0080】
マウス大腸がん細胞株ＣＴ２６（ＡＴＣＣより購入）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入）中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２の培養器に入れた。細胞数２×１０５のＣＴ２６細胞株を、５～８週齢のマウス（メスＢＡＬＢ／ｃマウス、楽斯科生物科技社より購入）の右背部皮下に接種し、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３となったときに、下記のようにグループ分けして投薬を行った：コントロール群、抗ＰＤ－１抗体群、ＣｐＧ－ＯＤＮ群、リポプレックス群（ＢＩＷ）、抗ＰＤ－１抗体＋ＣｐＧ－ＯＤＮ群、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群（ＱＷ）、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群（ＢＩＷ）。
【0081】
コントロール群は、週に２回生理食塩水を静脈注射し、注射体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体群は、抗マウスＰＤ－１抗体（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌより購入、型番ＢＥ０１４６）を用い、週に２回腹腔注射し、注射用量は２５０μｇ、注射体積は１００μＬとし；ＣｐＧ－ＯＤＮ群は、ＣｐＧ－７９０９を用い、週に２回静脈注射し、注射用量は５０μｇ、注射体積は１００μＬとし；リポプレックス群（ＢＩＷ）は、配合組成Ｃ１のリポプレックスを用い、週に２回静脈注射し、注射用量は５０μｇ、注射体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋ＣｐＧ－ＯＤＮ群は、抗マウスＰＤ－１抗体およびＣｐＧ－７９０９を併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射し、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、ＣｐＧ－７９０９は週に２回静脈注射し、注射用量は５０μｇ、体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群（ＱＷ）は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ１のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射し、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは週に１回静脈注射し、注射用量は５０μｇ、体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群（ＢＩＷ）は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ１のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射し、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは週に２回静脈注射し、注射用量は５０μｇ、体積は１００μＬとした。薬剤投与の期間は１４日とし、各群につきそれぞれ６匹のマウスを使用して実験を行い（ｎ＝６）、腫瘍体積を週に２回測定した。結果は図５に示されるとおりである。また、下式（Ａ）により腫瘍増殖抑制率（ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ，ＴＧＩ）を算出することができる。
（１－［（Ｔｎ）／（Ｃｎ）］）×１００％…式（Ａ）
式中、Ｔｎはｎ日目の処理群の腫瘍体積であり、Ｃｎはｎ日目のコントロール群の腫瘍体積である。
（１－［（Ｔｎ）／（Ｃｎ）］）×１００％…式（Ａ）
式中、Ｔｎはｎ日目の処理群の腫瘍体積であり、Ｃｎはｎ日目のコントロール群の腫瘍体積である。
【0082】
【表6】
【0083】
図５および表６に示されるように、実験結果より、抗ＰＤ－１抗体およびリポプレックスを併用した抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群（ＱＷ）ならびに抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群（ＢＩＷ）は、同用量のときに相乗効果を発揮することができ、より優れた腫瘍増殖抑制効果（ＴＧＩ）を奏し、かつ投薬の頻度が週に１回（ＱＷ）と週に２回（ＢＩＷ）とで薬効に有意な差はなかった。
【0084】
実施例６：リポプレックスの生体内における免疫抗がん効果の評価
【0085】
実施例６では、異なる配合組成のリポプレックス（異なる組成比）および投薬用量減少の免疫抗がん効果に対する影響を評価した。実施例５と同じ方法を用い、細胞数２×１０５のＣＴ２６細胞株を、５～８週齢のマウス（メスＢＡＬＢ／ｃマウス、楽斯科生物科技社より購入）の右背部皮下に接種し、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３となったときに、下記のようにグループ分けして投薬を行った：コントロール群、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－３。
【0086】
コントロール群は、週に２回生理食塩水を静脈注射し、注射体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ１０のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射し、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは、週に１回静脈注射し、注射用量は１５μｇ、体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ９のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射し、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは週に１回静脈注射し、注射用量は１５μｇ、体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－３は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ８のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射し、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは週に１回静脈注射し、注射用量は１５μｇ、体積は１００μＬとした。薬剤投与の期間は１４日とし、各群につきそれぞれ８匹のマウスを使用して実験を行い（ｎ＝８）、腫瘍体積を週に２回測定した。結果は図６に示されるとおりである。また、各群の腫瘍増殖抑制率を算出した。結果は表７に示されるとおりである。
【0087】
【表7】
【0088】
図６および表７に示されるように、実験結果より、抗ＰＤ－１抗体および異なる配合組成を併用するリポプレックスの抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１～３は、いずれも優れた腫瘍増殖抑制効果（ＴＧＩ）を有しており、３つの群の配合組成の異なるリポプレックスの薬効に有意な差は無いことが分かった。さらに、抗ＰＤ－１抗体との併用時に、全投薬用量を減らしても腫瘍増殖抑制効果には影響しないが、投薬用量の低下によって、元の活性成分により生じる副作用の懸念が低減され得るという点に注目されたい。
【0089】
比較例１：リポプレックスの生体内における免疫抗がん効果の評価
【0090】
比較例１では、異なる配合組成のリポプレックス（異なる組成比）および投薬用量減少の免疫抗がん効果に対する影響を評価した。実施例５と同じ方法を用い、細胞数２×１０５のＣＴ２６細胞株を、５～８週齢のマウス（メスＢＡＬＢ／ｃマウス、楽斯科生物科技社より購入）の右背部皮下に接種し、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３となったときに、下記のようにグループ分けして投薬を行った：コントロール群、抗ＰＤ－１抗体群、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群。
【0091】
コントロール群は週に２回生理食塩水を静脈注射し、注射体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体群は、抗マウスＰＤ－１抗体（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌより購入、型番ＢＥ０１４６）を用い、週に２回腹腔注射し、注射用量は２５０μｇ、注射体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｅ２のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射し、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは週に１回静脈注射し、注射用量は１５μｇとした。薬剤投与の期間は２４日とし、各群につきそれぞれ８匹のマウスを使用して実験を行い（ｎ＝８）、腫瘍体積を週に２回測定した。結果は図７に示されるとおりである。また、各群の腫瘍増殖抑制率を算出した。結果は表８に示されるとおりである。
【0092】
【表8】
【0093】
図７および表８に示されるように、実験結果より、抗ＰＤ－１抗体を単独使用した抗ＰＤ－１抗体群と比べて、抗ＰＤ－１抗体およびリポプレックスを併用した抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群は、統計データ的に有意な差がないことが分かった。このことから分かるように、特定範囲内の組成比を有するリポプレックスでなければ、免疫抗がんの効果を有効に発揮することはできない。
【0094】
実施例７：リポプレックスの生体内における免疫抗がん効果の評価
【0095】
実施例７では、異なる配合組成のリポプレックス（異なるタイプのＰＥＧ脂質）の免疫抗がん効果に対する影響を評価した。実施例５と同じ方法を用い、細胞数２×１０５のＣＴ２６細胞株を、５～８週齢のマウス（メスＢＡＬＢ／ｃマウス、楽斯科生物科技社より購入）の右背部皮下に接種し、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３となったときに、下記のようにグループ分けして投薬を行った：コントロール群、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２。
【0096】
コントロール群は週に２回生理食塩水を静脈注射し、注射体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ８のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは週に１回静脈注射、注射用量は１５μｇ、体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ１４のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは週に１回静脈注射、注射用量は１５μｇ、体積は１００μＬとした。薬剤投与の期間は１４日とし、各群につきそれぞれ８匹のマウスを使用して実験を行い（ｎ＝８）、腫瘍体積を週に２回測定した。結果は図８に示されるとおりである。また、各群の腫瘍増殖抑制率を算出した。結果は表９に示されるとおりである。
【0097】
【表9】
【0098】
図８および表９に示されるように、実験結果より、ＣＴ２６細胞株の同種組織腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－１抗体および異なる配合組成のリポプレックス（異なるタイプのＰＥＧ脂質）を併用した抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１～２はいずれも優れた腫瘍増殖抑制効果（ＴＧＩ）を有することが示され、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２ＫおよびＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋの異なる配合組成を用いたリポプレックスの薬効に有意な差は無かった。
【0099】
実施例８：リポプレックスの生体内における免疫抗がん効果の評価
【0100】
実施例８では、異なる配合組成のリポプレックス（分子量が異なるＰＥＧ）の免疫抗がん効果に対する影響を評価した。実施例５と同じ方法を用い、細胞数２×１０５のＣＴ２６細胞株を、５～８週齢のマウス（メスＢＡＬＢ／ｃマウス、楽斯科生物科技社より購入）の右背部皮下に接種し、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３となったときに、下記のとおりにグループ分けして投薬を行った：コントロール群、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２。
【0101】
コントロール群は週に２回生理食塩水を静脈注射し、注射体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ１１のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは週に１回静脈注射、注射用量は１５μｇ、体積は１００μＬとし；抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２は、抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ１３のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは週に１回静脈注射、注射用量は１５μｇ、体積は１００μＬとした。薬剤投与の期間は１４日とし、各群につきそれぞれ８匹のマウスを使用して実験を行い（ｎ＝８）、腫瘍体積を週に２回測定した。結果は図９に示されるとおりである。また、各群の腫瘍増殖抑制率を算出した。結果は表１０に示されるとおりである。
【0102】
【表10】
【0103】
図９および表１０に示されるように、実験結果より、ＣＴ２６細胞株の同種組織腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－１抗体および異なる配合組成のリポプレックス（分子量の異なるＰＥＧ、つまり長さの異なるＰＥＧ分子）を併用した抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１～２はいずれも優れた腫瘍増殖抑制効果（ＴＧＩ）を有することが示され、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－１ＫおよびＤＳＰＥ－ＰＥＧ－１０Ｋの異なる配合組成を用いたリポプレックスの薬効に有意な差は無かった。
【0104】
実施例９：リポプレックスの生体内における免疫抗がん効果の評価
【0105】
実施例９では、リポプレックスの腫瘍に対する特異性および記憶性を評価した。マウス大腸がん細胞株ＣＴ２６（ＡＴＣＣより購入）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入）中で培養し、また、マウス乳がん由来細胞株４Ｔ１（ＡＴＣＣより購入）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養し、それらを３７℃、５％ＣＯ２の培養器に入れた。次いで、細胞数２×１０５のＣＴ２６細胞株を、５～８週齢のマウス（メスＢＡＬＢ／ｃマウス、楽斯科生物科技社より購入）の右背部皮下に接種し、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３となったときに、下記のとおりにグループ分けして投薬を行った：抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－１、抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス群－２。
【0106】
抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス－１～２は、２匹のマウスにそれぞれ抗マウスＰＤ－１抗体および配合組成Ｃ１のリポプレックスを併用し、抗ＰＤ－１抗体は週に２回腹腔注射、注射用量は２５０μｇ、体積は１００μＬとし、リポプレックスは、週に２回静脈注射、注射用量は５０μｇ、体積は１００μＬとした。薬剤投与の期間は１４日（１１～２５日目）とし、各群につきそれぞれ２匹のマウスを使用して実験を行い（ｎ＝２）、腫瘍体積を週に１～２回測定した。また、８１日目にＣＴ２６細胞株を完全寛解したマウスおよび正常マウス（コントロール群とした。ｎ＝５）に再接種し、かつ１１７日目に４Ｔ１細胞を完全寛解マウスに接種した（ｎ＝２）。
【0107】
図１０に示されるように、実験結果から、抗ＰＤ－１抗体およびリポプレックスを併用した抗ＰＤ－１抗体＋リポプレックス－１～２の投薬後、腫瘍が完全寛解され、かつ腫瘍完全寛解（ｔｕｍｏｒ－ｆｒｅｅ）となったマウスにマウス大腸がん細胞株ＣＴ２６を再接種した後も、腫瘍が成長することは無かった（ｎ＝２）。これに対し、正常マウス（コントロール群）では、ＣＴ２６細胞株接種後に腫瘍が形成された（ｎ＝５）。また、前述した完全寛解マウスに、異なる腫瘍細胞株（マウス乳がん細胞株４Ｔ１）をさらに接種したところ、腫瘍は成長し得た（ｎ＝２）。このことからわかるように、抗ＰＤ－１抗体およびリポプレックスの併用は、同種の腫瘍に対して特異的な免疫記憶を有し、臨床応用において腫瘍再発の確率を有効に低減させることができる。
【0108】
実施例１０：リポプレックスのＴＬＲ９活性化能力の評価
【0109】
実施例１０では、異なるタイプのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）を担持したリポプレックスのＴＬＲ９活性化能力に対する影響を評価した。実施例１０の実験方法は実施例２とほぼと同じようであるが、実施例１０ではマウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ｍＴＬＲ９細胞株（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎより購入、製品番号ｈｋｂ－ｍｔｌｒ９）を用いて配合組成Ｃ２０のリポプレックス（リポプレックス群）およびＣｐＧ－３０－ＰＳ単独（ＣｐＧ－ＯＤＮ群）のＴＬＲ９活性化能力を評価した。
【0110】
図１１に示されるように、実験結果より、ＣｐＧ－ＯＤＮ群のＥＣ５０値はおよそ４１９ｎＭであり、リポプレックス群のＥＣ５０値はおよそ９ｎＭであることが示された。単独使用のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドに比べ、異なるタイプのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを担持したリポプレックスは、ＴＬＲ９活性化能力を大幅に高めることもできた（ＥＣ５０が約４５倍向上）。
【0111】
実施例１１：リポプレックスのサイトカイン活性化能力の評価
【0112】
実施例１１では、異なるタイプのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）を担持したリポプレックスのＴＬＲ９活性化能力に対する影響を評価した。実施例１１の実験方法は実施例４とほぼと同じようであるが、実施例１１で用いたサンプルはＣｐＧ－３０－ＰＳ（ＣｐＧ－ＯＤＮ群）および配合組成Ｃ２０のリポプレックス（リポプレックス群）とした。
【0113】
図１２Ａ～１２Ｂに示されるように、実験結果より、リポプレックス群は低濃度（例えば約１０ｎＭ）のときでもヒトＰＢＭＣ細胞のＩＬ－６、ＩＦＮ－γ産生を促進することができており、活性化能力がＣｐＧ－３０－ＰＳ単独（ＣｐＧ－ＯＤＮ群）よりも強いことが示された。よって、異なるタイプのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを担持したリポプレックスは、免疫抗がんに関連するサイトカイン分泌を有効に促進することもできる。
【0114】
実施例１２：リポプレックスの安全性評価
【0115】
実施例１２により、リポプレックスのＰＥＧ脂質の含量および免疫刺激核酸医薬の含量の、配合組成の安全性に対する影響を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（楽斯科生物科技社より購入）を用いて反復投与毒性試験を行った。週に１回静脈投与し、投薬期間は１４日間とした。試験の過程でマウスの体重を量り、臨床観察を行った。実験は下記のとおりにグループ分けして投薬を行った：ブランクコントロール群、リポプレックス群－１、リポプレックス群－２、リポプレックス群－３、リポプレックス群－４。
【0116】
コントロール群は週に１回生理食塩水を静脈注射し、注射体積は１００μＬとし；リポプレックス群－１は配合組成Ｃ１５を用い、注射用量は５０μｇ、注射体積は１００μＬとし；リポプレックス群－２は配合組成Ｃ２を用い、注射用量は５０μｇ、注射体積は１００μＬとし；リポプレックス群－３は、配合組成Ｃ９を用い、注射用量は１５μｇ、注射体積は１００μＬとし；リポプレックス群－４は、配合組成Ｃ９を用い、注射用量は５μｇ、注射体積は１００μＬとした。投薬期間は１１日間とし、各群につきそれぞれ５匹のマウスを用いて実験を行った（ｎ＝５）。結果は１３Ａ～１３Ｂに示されるとおりである。
【0117】
図１３Ａ～１３Ｂに示されるように、リポプレックス群－１では、投薬２日目に体重が約１４％減り、かつ２匹のマウスが死亡した。残りのマウスを犠牲死させ、剖検・採取したところ、肺実質、胸水、肝小葉隔壁が明らかであることがわかり、一部のマウスは摂餌しない等の有害反応が見られた。このことからわかるように、リポプレックス配合組成中のＰＥＧ脂質の含量は、安全性において非常に大きく影響するため、リポプレックスの組成にはＰＥＧ脂質が含まれている必要がある。
【0118】
上に述べたように、本開示の実施形態が提供する新規核酸医薬複合体は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーとを結合させたものであり、腫瘍標的指向性および免疫チェックポイント阻害活性を備え、核酸医薬複合体の腫瘍への集積、および腫瘍微小環境の免疫細胞障害効果を増加させることができ、かつ多種の免疫細胞を刺激して活性化させる能力を備えており、腫瘍微小環境の免疫細胞活性化および凝集を増加させることができる。また、本開示の実施形態が提供する核酸医薬複合体は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドと抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーとを単純に組み合わせて用いるよりも、抗腫瘍の薬効に優れる。
【0119】
上に述べたように、本開示の実施形態が提供する免疫刺激性リポプレックスは、特定の組成を有するリポソーム、およびリポソームと複合化された免疫刺激核酸医薬を含み、全身性投与の方式により投与されてよい。リポプレックスは、免疫刺激核酸医薬の低い安定性、および不十分な組織暴露量の問題を改善することができ、薬剤の特異的免疫賦活作用を高め、単回用量の薬剤の作用時間を延長させることもでき、薬剤により引き起こされる全身性免疫副作用を低減させ得る。さらに、本開示のいくつかの実施形態によれば、免疫刺激性リポプレックスを現行の免疫チェックポイント阻害剤と併用すれば、相乗効果を発揮して、がん免疫療法の治療効果をより一層高めることができる。
【0120】
本開示の実施形態およびその利点を上のように開示したが、当該技術分野において通常の知識を有する者は、本開示の精神および範囲を逸脱しない限りにおいて、当然に変更、置換および修飾することができるという点が理解されなければならない。さらに、各請求項は個別の実施形態をそれぞれ構成し、かつ本開示の保護範囲には各請求項および実施形態の組み合わせも含まれる。本開示の保護範囲は、添付の特許請求の範囲で定義されたものが基準となる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【外国語明細書】