特開 2022-104986 細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022104986

(43)【公開日】2022-07-12

(54)【発明の名称】細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20220705BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/16 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/32 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/34 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/50 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/51 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20220705BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20220705BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20220705BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220705BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20220705BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20220705BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20220705BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20220705BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220705BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20220705BHJP

   C12N 9/24 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/56 20060101ALN20220705BHJP

   C07K 14/115 20060101ALN20220705BHJP

   C07K 14/11 20060101ALN20220705BHJP

   C07K 14/145 20060101ALN20220705BHJP

   C07K 14/08 20060101ALN20220705BHJP

   C07K 14/155 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/40 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/44 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/45 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/49 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/47 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/869 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 15/861 20060101ALN20220705BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20220705BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00 ZNA

A61K35/12

A61K35/15 A

A61K35/15 Z

A61K35/16 Z

A61K35/28

A61K35/30

A61K35/32

A61K35/34

A61K35/36

A61K35/50

A61K35/51

A61K35/545

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

A61K38/16

A61K38/47

A61P25/00

A61P25/08

A61P25/14

A61P25/16

A61P25/24

A61P25/28

A61P27/06

C12N9/24

C12N15/56

C07K14/115

C07K14/11

C07K14/145

C07K14/08

C07K14/155

C12N15/40

C12N15/44

C12N15/45

C12N15/49

C12N15/47

C12N15/86 Z

C12N15/867 Z

C12N15/869 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/861 Z

C12N5/10

【審査請求】有

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022062691

(22)【出願日】2022-04-04

(62)【分割の表示】P 2021521927の分割

【原出願日】2019-07-02

(31)【優先権主張番号】10-2018-0076719

(32)【優先日】2018-07-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2018-0089538

(32)【優先日】2018-07-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0079666

(32)【優先日】2019-07-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(71)【出願人】

【識別番号】521001526

【氏名又は名称】キュラミス カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣＵＲＡＭＹＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】４１２－ｈｏ，１０３，Ｄａｅｈａｋ－ｒｏ，Ｊｏｎｇｎｏ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，０３０８０ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ソン、ジョンジュン

(72)【発明者】

【氏名】キム、キユン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ギェソン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】脳、脊椎、末梢神経の損傷をはじめとする神経変性疾患に対して、より広範囲の機序に作用し、強力な効果を有する治療剤を提供すること。
【解決手段】ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷もしくは死滅中の細胞または遺伝子異常のある細胞との細胞融合により正常細胞に回復する。従って、前記ＨＮ／Ｆタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞を、細胞損傷に関連する疾患、例えば神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物の有効成分として有効に用いることができる。
【選択図】図２１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項2】

前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質は、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ １）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ；ＨＲＳＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）または水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項3】

前記ベクターは、直鎖状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換え非ウイルス性ベクター、組換えウイルス性ベクター及び遺伝子発現誘導ベクターシステム（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項4】

前記組換えウイルス性ベクターは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ヘルパー依存性アデノウイルス（ｈｅｌｐｅｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）及びワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）ベクターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項5】

前記神経変性疾患または神経疾患は、運動ニューロン損傷もしくは死滅、脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発するものであることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項6】

前記運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）及び進行性球麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｂｕｌｂａｒ ｐａｌｓｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項7】

前記脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発梗塞性認知症（ｍｕｌｔｉ－ｉｎｆａｃｔ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｍｉｄ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）、軽度認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、代謝性脳疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ ａｔｒｏｐｈｙ；ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、脳虚血（ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳炎後パーキンソニズム（ｐｏｓｔ－ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、トゥレット障害（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、むずむず脚症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ ｌｅｇｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項8】

ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項9】

前記細胞は、幹細胞、前駆細胞及び動物細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項10】

前記細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）細胞、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）細胞及び異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項11】

前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項12】

前記成体幹細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）及び間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項13】

前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格、筋肉、神経、骨膜、羊膜及び胎盤からなる群から選択される少なくとも１種の組織由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の神経変性疾患または神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途に関し、具体的にはヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）遺伝子を細胞に形質導入して過剰発現させることにより他の細胞との細胞融合能力を高め、損傷もしくは死滅中の細胞または遺伝子異常のある細胞との細胞融合により細胞損傷を回復させて正常遺伝子を伝達することができる、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びに細胞損傷に関連する疾患における用途に関する。

【背景技術】

【0002】

一般に、疾患及び老化は、細胞損傷及び細胞死により進行する。細胞損傷及び死滅が誘発される代表的な疾患としては、神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などが挙げられる。

【0003】

急速な老齢人口の増加に伴い、脳、脊椎、末梢神経の損傷をはじめとする神経変性疾患が増加する傾向にある。神経変性疾患の原因は、いまだ明らかにされていない。また、各神経変性疾患の病理機序として、少しずつ異なる機序が作用することが知られている。

【0004】

例えば、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）などは、運動ニューロンのみ選択的に死滅して運動機能のみ退行するものである。その結果、四肢麻痺の症状が現れるので、運動ニューロン疾患ともいう。

【0005】

一方、前記運動ニューロン疾患とは異なり、アルツハイマー病、パーキンソン病などは、脳のニューロンが消失する代表的な神経変性疾患として知られている。アルツハイマー病においては、ニューロンの消失により全般的な脳萎縮所見が現れる。このような脳病理所見は、疾患初期には主に記憶力を担う主な脳部位である海馬及び嗅内皮質部位に限定されて現れるが、次第に頭頂葉、前頭葉などを経て脳全体に広がる。このような脳病理所見の進行により、初期には記憶力の低下が主に現れるが、進行に伴う漸進的な経過を経て、様々な臨床症状が現れるようになり、徐々に悪化する。パーキンソン病は、中脳に位置する黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ；ＳＮ）におけるドーパミン作動性ニューロン（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の消失により誘発される。ドーパミン作動性ニューロンの消失は、線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）内の深刻なドーパミン減少を誘発し、大脳基底核（ｂａｓａｌ ｇａｎｇｌｉａ）、視床（ｔｈａｌａｍｕｓ）及び運動皮質（ｍｏｔｏｒ ｃｏｒｔｅｘ）を含む錐体外路系（ｅｘｔｒａｐｙｒａｍｉｄａｌ ｓｙｓｔｅｍ）による運動調節機能に障害を生じさせる。

【0006】

このように様々な病理機序が作用するので、いずれか１つの機序に作用する治療剤では疾患の治療が困難であり、それ故に現在までほとんど全ての臨床試験が失敗しており、根本的な治療剤が全くない状態である。具体的には、ＡＬＳの治療剤で米国ＦＤＡに承認されたものとしては、運動ニューロンを破壊する過度なグルタミン酸を抑制するリルゾール（ｒｉｒｕｚｏｌｅ）、フリーラジカルによる酸化ストレス損傷を抑制するエダラボン（ｅｄａｒａｖｏｎｅ）以外にはほとんどない実情であり、これらも約３カ月間の生存延長効果や、身体機能の悪化を僅かに鈍化させる効果しかない。アルツハイマー病においては、米国ＦＤＡに承認された治療剤として、脳のニューロンの活動を助ける神経伝達物質であるアセチルコリンを活性化するアリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ）、エクセロン（Ｅｘｅｌｏｎ）、ナメンダ（Ｎａｍｅｎｄａ）、ラザダイン（Ｒａｚａｄｙｎｅ）などがあるが、これらも脳細胞の損傷を最小限に抑えて症状を緩和したり、進行速度を遅らせるだけであり、治療剤としては力不足である。パーキンソン病においても、ドーパミン作用剤であるレボドパ（ｌｅｖｏｄｏｐａ）が治療の根幹として用いられているが、長期的な効果は限定的である。他の神経変性疾患においても、完治をもたらす治療剤がない現状である。よって、より広範囲の機序に作用し、強力な効果を有する治療剤が至急必要とされ、幹細胞治療を含む新たな治療方法が切実に求められている疾患であるといえる。

【0007】

現在、神経変性疾患を治療するために、細胞移植、症状を改善する薬物の投与など、様々な治療法が提示されており、特に最近は細胞治療に関心が置かれている。しかしながら、従来の細胞治療技術は、健康な細胞（または幹細胞）を疾患部位に挿入することにより死滅した細胞を代替したり、死滅中の細胞の周辺環境を改善して再生させることを目標とするが、そのような試みは、多くの前臨床または臨床試験において効果がないか、効果が僅かであった。また、ニューロンの場合は、他の器官とは異なり、神経回路を形成することが機能において非常に重要であるので、外部から供給された細胞がニューロンに分化し、既存の神経回路をそのまま復元することは期待しがたい。よって、従来の方法以外に、新たなニューロン損傷緩和または保護のための治療方法の開発が切実に求められる。

【0008】

一方、筋肉は、人体を支えて生命現象を維持する必須組織である。筋肉においては、筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）が分化して多核筋管（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｍｙｏｔｕｂｅ）細胞を形成して筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）を作るが、筋芽細胞と筋細胞の死滅は、様々な疾患の原因となっている。また、遺伝子突然変異や様々な原因で筋細胞が消失する疾患が報告されているが、根本的な治療剤がいまだない状況である。このような筋肉疾患は、種類によって症状や疾患の程度が様々であり、ニューロンや脊髄などの神経系統の問題により発生する複合的な形態をとることもある。

【0009】

例えば、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、筋細胞が破壊される疾患であり、遺伝子異常により発生し、症状は力が弱くなり、立つことが困難になることから始まって次第に酷くなり、呼吸筋肉が麻痺して死亡することもある。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ Ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などの多くの種類があり、種類によって異なる症状が現れる。前記ＤＭＤ及びＢＭＤは、Ｘ染色体に存在するジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝子の異常により発生し、約１／３は自然突然変異、残りは伴性遺伝に起因する。ＤＭＤとＢＭＤは、どちらも同じ遺伝子の異常が原因であるが、フレームシフト突然変異（ｆｒａｍｅ－ｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）などにより強力な表現型を示すものをＤＭＤという。ＤＭＤにおいては、疾患の予後が不良であり、９～１３才でほとんどの患者が歩行不能になり、筋力弱化だけでなく、認知低下を同伴することもあり、心筋症、呼吸筋障害を伴って死亡に至ることもある。ＤＭＤにおいては、近年、エキソンスキッピング（ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ）による治療を試みる方法が多く用いられている。エキソンスキッピングは、ジストロフィン遺伝子のｅｘｏｎ５１のスプライシング促進配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒ）を標的とするものであるが、ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅのみ回復させ、軽症型の遺伝子変異に置換する原理であるので、根本的な治療法ではなく、全てのＤＭＤを対象とする治療法でもない。

【0010】

このように、筋肉疾患患者は疾患が進行すると一人では日常生活が行えず、根本的な治療剤も全くない状況であるので、筋細胞損傷または死滅による筋肉疾患を効果的に治療できる新たな治療法が強く求められている。

【0011】

よって、本発明者らは、神経変性疾患、筋肉変性疾患などの細胞損傷に対する疾患治療剤を開発すべく努力した結果、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷もしくは死滅中の細胞または遺伝子異常のある細胞の細胞損傷を回復させて正常遺伝子を伝達する能力が高まることを確認した。よって、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合技術は、細胞損傷を誘発する神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の治療に有用であることを確認し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】韓国公開特許第１０－２００８－００２６７８６号公報

【特許文献2】韓国公開特許第１０－２００６－０１１９０６４号公報

【特許文献3】米国特許第５４８６３５９号明細書

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Annemieke Aartsma-Rus et al" Development of Exon Skipping Therapies for Duchenne Muscular Dystrophy: A Critical Review and a Perspective on the Outstanding Issues, Nucleic Acid Ther. 2017 Oct 1;27(5): 251-259

【非特許文献2】Eckert DM, Kim PS. Annu Rev Biochem. 2001;70:777-810.

【非特許文献3】Sapir A, Avinoam O, Podbilewicz B, Chernomordik LV. Dev Cell. 2008 Jan;14(1):11-21.

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【非特許文献22】Remington's Pharmaceutical Sciences, 最新版

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその細胞損傷に関連する疾患、より具体的には神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患における用途を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

前記目的を達成するために、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0016】

また、本発明は、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0017】

さらに、本発明は、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。

【0018】

さらに、本発明は、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。

【0019】

さらに、本発明は、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いるための、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの用途を提供する。

【0020】

さらに、本発明は、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いるための、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞の用途を提供する。

【発明の効果】

【0021】

本発明によれば、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合によりＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞内の正常遺伝子及び転写調節因子を損傷した細胞の核内に伝達し、損傷した細胞内の細胞修復に関与する遺伝子の発現を調節したり、正常遺伝子を伝達して正常タンパク質を回復させることにより、損傷した細胞が回復することが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合すると正常細胞に回復することが確認された。

【0022】

よって、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合技術により、細胞損傷を回復させて正常遺伝子を導入することができるので、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞は、細胞損傷に関連する疾患、具体的には神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患を治療するのに有用である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】本発明の一実施例によるｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合により死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞死抑制効果を示す図である。

【図2】本発明の一実施例によるｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４ ｃｅｌｌ ｇｒｏｕｐにおけるＢａｘ及びＢｃｌ－ｘＬの発現分析を示す図である。

【図3】本発明の一実施例によりＨＮ及びＦをそれぞれ挿入したＰｃＤＮＡ３．１発現ベクターを作製するための模式図である。

【図4】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおいてＨＮ及びＦ ｍＲＮＡ発現を分析した図である。

【図5】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおいてＨＮ及びＦタンパク質発現を画像解析した図である。

【図6】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの免疫表現型（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を分析した図である。

【図7】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおいてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株との細胞融合能力を分析した図である。

【図8】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞においてＣｈＡＴ及びＣＤ１０５発現を分析した図である。

【図9】本発明の一実施例によるＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、及びＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓのプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）分析結果を示す図である。

【図10】本発明の一実施例によるＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、及びＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓのヒートマップ（ｈｅａｔｍａｐ）分析結果を示す図である。

【図11】本発明の一実施例によるＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、及びＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおいて細胞修復に関連する遺伝子ＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２ ｍＲＮＡ発現を分析した図である。

【図12】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ＮＳＣｓとの細胞融合により死滅中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞株の細胞死抑制効果を示す図である。

【図13】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａにおいてＨＮ及びＦ ｍＲＮＡ発現を分析した図である。

【図14】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａにおいてＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株との細胞融合能力を分析した図である。

【図15】本発明の一実施例によりＨＮ及びＦを挿入したｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ２Ａ発現ベクターを作製するための模式図である。

【図16】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａまたはＦ－Ｐ２Ａ－ＨＮ－ＨｅＬａにおいてＣ２Ｃ１２筋芽細胞株との細胞融合能力を分析した図である。

【図17】本発明の一実施例により選択した細胞修復に関連する遺伝子ＤＤＢ１のプロモーター部位（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）において転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ；ＴＦ）であるＴＤＰ－４３結合モチーフ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）を確認した図である。

【図18】本発明の一実施例によりマウスＤＢＢｌ（ｍＤＤＢｌ）に特異的に結合するプロモーターを作製するための模式図である。

【図19】本発明の一実施例によるＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ－ＴＤＰ－４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株が融合した細胞においてＴＤＰ－４３によるｍＤＤＢｌ発現を分析した図である。

【図20】本発明の一実施例によるＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ－ＴＤＰ－４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株が融合した細胞においてＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株の核内へのＴＤＰ－４３の転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を画像解析した図である。

【図21】損傷した細胞におけるＨＮ／Ｆタンパク質過剰発現細胞による細胞損傷回復機序を模式化した図である。

【図22】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合により死滅中のアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）細胞モデルの細胞死抑制効果を示す図である。

【図23】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合により死滅中のハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＨＤ）疾患細胞モデルの細胞死抑制効果を示す図である。

【図24】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合により死滅中の心不全疾患細胞モデルの細胞死抑制効果を示す図である。

【図25】本発明の一実施例により筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）またはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＤＭＤ）疾患マウスモデルにＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを注入するための脊髄内注入（ｉｎｔｒａ－ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）方法を示す図である。

【図26】本発明の一実施例によりＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを注入したＧ９３Ａ ＳＯＤ Ｔｇマウスにおいて運動性能を分析した図である。

【図27】本発明の実施例により作製したＤＭＤ疾患細胞モデルのジストロフィン及びＣＴＧＦ発現を分析した図である。

【図28】本発明の実施例によりＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓ処理したＤＭＤ疾患細胞モデルのジストロフィン及びＣＴＧＦ発現を分析した図である。

【図29】ＤＭＤ疾患動物モデルであるｍｄｘマウスの骨格筋においてジストロフィン発現を分析した図である。

【図30】本発明の一実施例によりＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを注入したｍｄｘマウスの骨格筋組織においてＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの生着能を分析した図である。

【図31】本発明の一実施例によりＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを注入したｍｄｘマウスの骨格筋組織において注入３週間後及び注入１５週間後にジストロフィン発現を分析した図である。

【図32】本発明の一実施例によりＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを注入したｍｄｘマウスの骨格筋組織においてＣＴＧＦ発現を分析した図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

【0025】

本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。

【0026】

本発明における前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質は、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ １）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ；ＨＲＳＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）または水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）由来のものであるが、これらに限定されるものではなく、これらのタンパク質と同一または類似の機序により細胞の融合を促進し、死滅を抑制し、損傷した細胞の損傷を回復させるものであれば、様々な由来のもの並びに／または全長及び／もしくは断片のいかなる形態のヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質が用いられてもよい（非特許文献２，３，４）。

【0027】

本発明によるヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）は、ウイルスで発現する糖タンパク質であり、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼの両方の活性を有する単一のウイルスタンパク質であるか、またはそれぞれが別個のタンパク質として存在するものであるが、これらに限定されるものではなく、本発明による効果を発揮するものであれば、いかなるものでも本発明に含まれる。前者の例としては、ムンプスウイルス（ｍｕｍｐ ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ－１）、２型（ＨＰＩＶ－２）または３型（ＨＰＩＶ－３）、鳥類ニューカッスル病ウイルス（ａｖｉａｎ ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）などのパラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）由来のものが挙げられ、後者の例としては、インフルエンザウイルス由来のものが挙げられる。これらのタンパク質及び核酸配列は公知であり、例えばヘマグルチニン・ノイラミニダーゼは、Ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｔｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｚｙｍｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）ＥＣ：３．２．１．１８に開示されており、タンパク質配列は、例えばセンダイウイルス由来のものがＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＢ０６２８８．１に公開されている。本発明の一実施例においては、本発明の実施例２と同様に製造されるセンダイウイルス由来のＨＮ単一タンパク質が用いられる。

【0028】

また、融合タンパク質（Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｆ ｐｒｏｔｅｉｎ）とは、細胞間の融合またはウイルスの細胞への融合／エントリー、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、膜トラフィッキング（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に用いられる糖タンパク質を意味する。本発明の一実施例においては、ウイルス由来のＦタンパク質が用いられるが、それは構造的特徴によりクラスＩ、ＩＩ及びＩＩＩに分けられる。クラスＩの例としては、エボラウイルスのＧＰ２、ＭｏＭｕＬｖ（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）のＭｏ－５５、免疫不全ウイルスＨＩＶのｇｐ４１、Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ（ＳＩＶ）ｇｐ４１などが挙げられる。クラスＩＩの例としては、ＳＦＶ Ｅ１、ＴＢＥＶ Ｅなどが挙げられる。クラスＩＩＩの例としては、ＨＳＶ（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）のｇＢ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ）、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）のｇＢ、ＶＳＶ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）のＧタンパク質、バキュロウイルスの糖タンパク質であるｇｐ６４などが挙げられる。これらの融合糖タンパク質及び核酸配列は公開されており、例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＣ８２３００．１に公開されている。

【0029】

本発明における前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子は、全長及び／または断片の形態で用いられる。具体的には、本発明に開示されているタンパク質をコードする野生型遺伝子配列及びその断片はもとより、細胞内での発現、タンパク質の安定性などの特徴が有利に働くように塩基配列の一部が人為的に改変された遺伝子、及び自然界に見られる塩基配列の一部が改変された遺伝子、またはそれらの全ての断片が含まれるものである。

【0030】

本発明における前記ベクターとは、宿主細胞において標的遺伝子を発現させるための手段を意味する。前記ベクターは、標的遺伝子の発現のための要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含むものであり、複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）、プロモーター、オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、転写終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）などを含んでもよく、宿主細胞のゲノムへの導入のための好ましい酵素部位（例えば、制限酵素部位）、宿主細胞への導入を確認するための選択マーカー、タンパク質への翻訳のためのリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ；ＲＢＳ）、ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）などをさらに含んでもよい。前記ベクターは、前記プロモーター以外の転写調節配列（例えば、インハンサーなど）をさらに含んでもよい。

【0031】

さらに、前記ベクターは、当該技術分野で公知のプラスミドＤＮＡ、組換えベクターまたはその他の媒体であり、具体的には直鎖状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換え非ウイルス性ベクター、組換えウイルス性ベクターまたは遺伝子発現誘導ベクターシステム（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）であり、前記組換えウイルス性ベクターは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ヘルパー依存性アデノウイルス（ｈｅｌｐｅｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）またはワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）ベクターであるが、これらに限定されるものではない。

【0032】

さらに、前記ベクターとは、遺伝子治療用発現ベクターを意味する。前記「遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、遺伝子異常により誘発される各種遺伝病を治療するために、遺伝子異常のある細胞に正常遺伝子を挿入したり、新たな機能を提供することにより、その機能を正常化させる方法を意味する。よって、本発明における遺伝子治療用発現ベクターとは、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質遺伝子を体内の正常細胞に伝達して発現させることにより、遺伝子異常のある細胞と正常細胞との細胞融合を用いて新たな機能を提供し、その機能を正常化することのできる発現ベクターを意味する。

【0033】

本発明の一実施例におけるヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質遺伝子は、前述したように公知の配列からそれを特異的に認識することのできるプライマーを作製し、それを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により前記遺伝子を増幅し、それを前述した発現ベクターに導入すると、それを後述する本発明による細胞に導入することができる。導入方法は公知であり、例えばリポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ファージによる形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、ウイルスによる感染法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0034】

また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を提供する。

【0035】

本発明における「形質転換」とは、外部から与えられたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることであり、すなわち生物のある系統の細胞から抽出された核酸の一種であるＤＮＡを他の系統の生きている細胞に導入したときにＤＮＡがその細胞に取り込まれて遺伝子形質が変化する現象を意味する。

【0036】

本発明における前記形質転換された細胞は、幹細胞、前駆細胞または動物細胞であるが、これらに限定されるものではない。また、前記幹細胞は、具体的には胚性幹細胞、成体幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳ）であるが、これらに限定されるものではなく、前記幹細胞から分化した幹細胞、例えば胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞などが全て含まれる。さらに、前記細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、非自己、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）または異種（Ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞である。自己由来のものが最も好ましく、レシピエントに由来するものであるので、薬学的組成物の投与の際に免疫反応の問題がなく、安全であるという利点がある。

【0037】

前記胚性幹細胞は、胚発生初期である胞胚期（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅ）の内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）から形成され、あらゆる細胞に分化可能な潜在力（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有するものであり、いかなる組織細胞にも分化可能であるという利点があり、細胞治療研究に用いられている。

【0038】

前記成体幹細胞とは、胚芽発達段階以降も成体全般に見られる未分化の幹細胞を意味する。このような成体幹細胞は、周辺組織の特性に細胞自身を合わせて分化する組織特異的分化能力（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を有する。成体幹細胞は、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格筋、臍帯、臍帯血などの様々な成体細胞に由来するものである。具体例として、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）、骨格筋幹細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＮＳＣ）、脂肪由来の幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、脂肪由来の前駆細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、血管内皮前駆細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0039】

また、前記間葉系幹細胞は、既に成人になったヒトの各部位から得られる成体組織由来の幹細胞であり、臍帯、臍帯血、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格、筋肉、神経、骨膜、羊膜または胎盤から分離することができ、様々な細胞、例えば脂肪細胞、運動ニューロンなどに分化することができる多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を意味する。さらに、間葉系幹細胞は、免疫抑制剤を用いなくても、同種または異種の受益者において効果的に生着するという特徴がある。前記間葉系幹細胞は、動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトの間葉系幹細胞である。

【0040】

本発明の一実施例における間葉系幹細胞は、脂肪組織由来の間葉系幹細胞である。脂肪組織由来の間葉系幹細胞は、骨髄、羊水、臍帯血幹細胞とは異なり、多量の提供が受けられるという実用的な利点を有し、脂肪細胞の約１％が幹細胞であるものと推定されており、近年、先進国において広範囲に行われている成形手術が脂肪吸引術（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）であることを考慮すると、脂肪由来の幹細胞は無限の供給性を有し、有用性が特に高いといえる。

【0041】

前記間葉系幹細胞を得る過程は次の通りである。ヒトまたはマウスを含む哺乳動物、好ましくはヒトの間葉系幹細胞源、例えば脂肪組織、血液または骨髄から間葉系幹細胞を分離する。次に、前記細胞を好適な培地で培養する。培養過程で浮遊細胞を除去し、培養プレートに付着した細胞を継代培養し、最終的に確立された（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）間葉系幹細胞を得る。

【0042】

また、骨髄などに非常に少量で存在する間葉系幹細胞を分離及び培養する過程は、当該技術分野において周知であり、例えば特許文献３に開示されている。

【0043】

前記過程で用いられる培地としては、幹細胞の培養に用いられる一般的ないかなる培地を用いてもよい。より具体的には、血清（例えば、ウシ胎児血清、ウマ血清及びヒト血清）または血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む培地を用いる。本発明に用いられる培地としては、例えばＲＰＭＩシリーズ、Ｅａｇｌｅｓ'ｓ ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ、非特許文献５）、α－ＭＥＭ（非特許文献６）、Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ ＭＥＭ（非特許文献７）、１９９培地（非特許文献８）、ＣＭＲＬ １０６６、ＲＰＭＩ １６４０（非特許文献９）、Ｆ１２（非特許文献１０）、Ｆ１０（非特許文献１１）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ、非特許文献１２）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物（非特許文献１３）、Ｗａｙ－ｍｏ、ｈ'ｓ ＭＢ７５２／１（非特許文献１４）、ＭｃＣｏｙ'ｓ ５Ａ（非特許文献１５）及びＭＣＤＢシリーズ（非特許文献１６）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記培地は、他の成分、例えば抗生剤または抗真菌剤（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）、グルタミンなどを含んでもよい。培地及び培養についての一般的な説明は非特許文献１７に記載されており、この文献は参照として本明細書に組み込まれる。

【0044】

間葉系幹細胞の確認は、例えばフローサイトメトリーにより行うことができる。このフローサイトメトリーは、間葉系幹細胞の特異な表面マーカーを用いて行われる。本発明の一実施例による間葉系幹細胞は、マーカーとしてＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０と、陰性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲの表現型を有する。

【0045】

また、前記人工多能性幹細胞に関しては、多能性のない成人の皮膚細胞などの体細胞に逆分化を起こす４種類の特定遺伝子を導入して発現させるか、逆分化を起こす４種類の遺伝子を導入した細胞で形成された逆分化誘導タンパク質を抽出し、それを再び体細胞に注入することにより、胚性幹細胞などの多能性を有する幹細胞を作製することができるが、これを人工多能性幹細胞または逆分化幹細胞という。人工多能性幹細胞による幹細胞治療や、患者から体細胞を得て人工多能性幹細胞を作製し、生体外で分化させることにより様々な疾患の経過を研究し、疾患モデルや新薬開発における細胞基盤研究などに用いられる。前記人工多能性幹細胞は、公知の方法、例えば非特許文献１８、１９などに開示されている方法により得られる。また、人工多能性幹細胞由来の幹細胞、例えば人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｍｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ－ＭＳＣｓ）、人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ－ＮＳＣｓ）などが全て含まれる。本発明の一実施例における前記人工多能性幹細胞由来の幹細胞は、人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞である。

【0046】

前記人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞は、公知の方法、例えば非特許文献２０、２１などに開示されている方法により得られる。

【0047】

また、前記前駆細胞とは、特定細胞の形態及び機能を備える前段階の細胞であり、特定細胞系統の細胞に分化するか、特定タイプの組織を形成することができ、自己再生産（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）能は有するが、分化能は極めて制限される細胞を意味する。内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞及び外胚葉前駆細胞が全てこれに含まれる。

【0048】

また、前記動物細胞は、ヒトを含む動物起源の機能的及び構造的基本単位であり、ヒトを含む動物（例えば、サル、イヌ、ヤギ、ブタ、ラットなどの哺乳動物）起源の細胞であればいかなるものでもよい。よって、本発明の動物細胞は、これらに限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、生殖細胞、皮膚細胞（例えば、線維芽細胞、角質細胞）、免疫細胞、癌細胞などが含まれる。具体例として、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、ＮＳ０（ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ）細胞、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、Ｓｐ２／０（ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ）細胞、ヒト網膜細胞（ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｃｅｌｌ）、ＨＵＶＥＣ細胞、ＨＭＶＥＣ細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＨｅｐＧ－２細胞、ＨＬ－６０細胞、ＩＭ－９細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｔ９８Ｇ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0049】

また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0050】

本発明における前記ベクターについては、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略し、以下では筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物の特有な構成についてのみ説明する。

【0051】

なお、本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターは、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物の有効成分として有用である。

【0052】

本発明における前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、細胞損傷に関連する疾患である。

【0053】

前記神経変性疾患または神経疾患は、ニューロン損傷、脊髄神経損傷、末梢神経損傷またはニューロン死滅を誘発する。

【0054】

また、前記神経変性疾患または神経疾患は、運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患と、脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患に分けられる。

【0055】

前記運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患の改善または治療のためには、運動ニューロンの保存及び回復が必須である。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または進行性球麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｂｕｌｂａｒ ｐａｌｓｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0056】

前記脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、損傷した脳または脊髄のニューロン、末梢神経の回復により疾患を予防または治療することができる。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発梗塞性認知症（ｍｕｌｔｉ－ｉｎｆａｃｔ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｍｉｄ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）、軽度認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、代謝性脳疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ ａｔｒｏｐｈｙ；ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、脳虚血（ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳炎後パーキンソニズム（ｐｏｓｔ－ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、トゥレット障害（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、むずむず脚症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ ｌｅｇｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）または注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0057】

前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する。このような筋肉変性疾患または筋肉疾患の例としては、ミオパチー（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性ミオパチー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ Ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、バース症候群（Ｂａｒｔｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）またはＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0058】

本発明による薬学的組成物は、一般に用いられる薬学的に許容される担体と共に好適な形態に剤形化することができる。薬学的に許容される担体としては、例えば水、好適なオイル、食塩水、水性グルコース、グリコールなどの非経口投与用担体などが挙げられ、安定化剤や保存剤をさらに含んでもよい。好適な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸などの抗酸化剤が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルまたはプロピルパラベン及びクロロブタノールが挙げられる。また、本発明による細胞治療用組成物は、その投与方法や剤形に応じて、必要であれば懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、鎮痛剤、緩衝剤、酸化防止剤などを適宜含んでもよい。前述したものをはじめとして、本発明に適する薬学的に許容される担体及び製剤は、非特許文献２２に詳細に記載されている。

【0059】

本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施することのできる方法で薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量の形態または多用量容器に入れた形態に製造することができる。

【0060】

また、前記薬学的組成物は、有効成分を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与される。本発明の薬学的組成物は、疾患の治療のために、治療学的に有効な量で含まれる。本発明における「治療」とは、特に断らない限り、その「治療」が行われる疾患または疾病の少なくとも１つの症状を逆転または緩和するか、その進行を抑制または予防することを意味する。また、前記「治療学的に有効な量」とは、研究者、獣医師、医師またはその他の臨床医により求められる、組織、系、動物またはヒトにおいて生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味し、それには治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量が含まれる。本発明の薬学的組成物に含まれる有効成分が効果に応じて変化することは、当業者にとって明らかである。

【0061】

よって、最適な薬学的組成物含有量は、当業者が容易に決定することができ、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれる他の成分の含有量、剤形の種類、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、同時に用いられる薬物をはじめとする様々な因子に応じて調節される。

【0062】

本発明の一実施例における薬学的組成物は、静脈投与または脊髄内投与される。

【0063】

前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要である。例えば、本発明の組成物の投与量は、有効成分であるヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞０．１×１０^５～１．０×１０^８細胞数／ｋｇ（体重）、より好ましくは０．５×１０^６～１．０×１０^７細胞数／ｋｇ（体重）である。ただし、投与量は、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、感受性などの要因に応じて様々に処方することができ、当業者であればこのような要因を考慮して投与量を好適に調節することができる。投与回数は１回、または臨床的に許容される副作用の範囲内で２回以上であってもよく、投与部位も１つの部位または２つ以上の部位であってもよい。ヒト以外の動物に対しても、ｋｇ当たりのヒトと同じ投与量で投与してもよく、例えば目的の動物とヒトの虚血器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）などで前記投与量を換算した量を投与してもよい。本発明による治療の対象動物の例としては、ヒト及びその他の目的とする哺乳動物を挙げることができ、具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ヤギ、ウマ、ブタなどが含まれる。

【0064】

また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0065】

本発明における前記細胞については、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞についての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。また、前記疾患、細胞の投与方法、投与量などについては、前記ベクターを含む薬学的組成物の投与方法、投与量などについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。

【0066】

なお、本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞は、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物の有効成分として有用である。

【0067】

また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。

【0068】

さらに、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。

【0069】

本発明における前記ベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、その投与方法、投与量などについては、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、それを含む薬学的組成物の投与方法、投与量などについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。

【0070】

本発明における前記個体は、筋肉変性疾患または筋肉疾患により苦痛を感じる個体であり、より具体的には前述したヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたは前記ベクターで形質転換された細胞を投与することにより前記疾患による細胞損傷、例えば筋細胞損傷が緩和及び／または回復する哺乳動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ヤギ、ウマ、ブタなどである。

【0071】

前記神経変性疾患または神経疾患は、ニューロン損傷、脊髄損傷、末梢神経損傷またはニューロン死滅を誘発する。

【0072】

また、前記神経変性疾患または神経疾患は、運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患と、脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患に分けられる。

【0073】

前記運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患の改善または治療のためには、運動ニューロンの保存及び回復が必須である。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または進行性球麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｂｕｌｂａｒ ｐａｌｓｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0074】

前記脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、損傷した脳または脊髄のニューロン、末梢神経の回復により疾患を予防または治療することができる。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発梗塞性認知症（ｍｕｌｔｉ－ｉｎｆａｃｔ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｍｉｄ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）、軽度認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、代謝性脳疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ ａｔｒｏｐｈｙ；ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、脳虚血（ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳炎後パーキンソニズム（ｐｏｓｔ－ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、トゥレット障害（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、むずむず脚症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ ｌｅｇｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）または注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0075】

前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する。このような筋肉変性疾患または筋肉疾患の例としては、ミオパチー（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性ミオパチー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ Ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、バース症候群（Ｂａｒｔｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）またはＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0076】

本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞は、筋肉変性疾患または筋肉疾患を予防または治療するのに有用である。

【0077】

また、本発明は、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物として用いるための、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの用途を提供する。

【0078】

さらに、本発明は、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物として用いるための、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞の用途を提供する。

【0079】

本発明における前記ベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、その投与方法、投与量などについては、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、それを含む薬学的組成物の投与方法、投与量などについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。また、前記疾患については、前記筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物についての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。

【0080】

本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞は、筋肉変性疾患または筋肉疾患を予防または治療するのに有用である。

【0081】

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例0082】

細胞培養
Ｋ－ＳＴＭＥＣＥＬＬ ＩＲＢ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ）の同意及び了解の下に得たヒト脂肪由来の間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｈＡＴＭＳＣｓ）は、抗生剤を添加したＲＫＣＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加、Ｋ－ＳＴＥＭＣＥＬＬにより提供）で培養した。マウス運動ニューロン細胞株（ＮＳＣ３４ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ、ＵＳＡ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。マウス神経芽細胞腫細胞株（Ｎ２Ａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。ヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。マウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２ ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。ラット心筋芽細胞株（Ｈ９ｃ２ ｈｅａｒｔ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。

【0083】

また、正常なヒトから同意の下に血液の提供を受けて作製したヒト人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ）は、ｂＦＧＦを含まないｈＥＳ ｃｅｌｌ培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の入った培養プレートに浮遊状態で４日間培養した。次に、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＲＡ、５×１０^－７Ｍ）の入ったｈＥＳ ｃｅｌｌ培養培地で４日間培養し、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ［ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（２％）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｈｅｐａｒｉｎ ｓｏｄｉｕｍ（２μｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培養培地］で７日間培養した。凝集状態のｃｏｌｏｎｉｅｓから離れた浮遊状態の細胞をｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍの入ったポリ－l－オルニチン（ｐｏｌｙ－l－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（１０ｍｇ／ｍｌ）／ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）（５μｇ／ｍｌ）コーティング培養プレートで７日間培養し、５～７日ごとにアキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）で処理して細胞を継代培養することにより、人人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ－ＮＳＣｓ）を得た。

【0084】

前記細胞は、全て５％ＣＯ_２を供給して３７℃の条件下で培養した。

【実施例0085】

死滅中の運動ニューロン細胞株と脂肪由来の間葉系幹細胞の細胞融合による運動ニューロン細胞株の細胞死抑制効果の分析
細胞トラッカー（ｔｒａｃｋｅｒ）ＣＭ－ＤｉＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で標識した運動ニューロン細胞株ＮＳＣ３４細胞を細胞死誘導因子であるタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）２．５μＭで処理して２４時間培養した。アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ染色後に、アネキシンＶ抗体を用いたフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によりアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４細胞を分離した。緑色染料（ｃｅｌｌ－ｓｔａｌｋｅｒ^ＴＭ、Ｂｉｔｅｒｉａｌｓ）で標識したｈＡＴＭＳＣｓとアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４細胞をセンダイウイルス（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧｅｎｏｍＯＮＥＴＭ－ＣＦ ＥＸ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ、ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ、Ｊａｐａｎ）でメーカーの示す方法に従って細胞融合し、その後フローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。図１に示すように、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こっていないＮＳＣ３４細胞群において、９９．５％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群において、３２．９％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。これらの結果は、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合によりＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の死滅を抑制できることを示すものである。

【0086】

また、死滅抑制効果を分子レベルで確認した。要約すると、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群をフローサイトメトリーにより分離し、その後逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ－ＰＣＲ）及び定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）によりｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢａｘとａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢｃｌ－ｘＬの発現を分析した。図２に示すように、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こっていないＮＳＣ３４細胞群に比べて、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群において、Ｂａｘ ｍＲＮＡの発現は大幅に減少し、Ｂｃｌ－ｘＬ ｍＲＮＡの発現は大幅に増加した。

【0087】

これらの結果は、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株がｈＡＴＭＳＣｓと細胞融合を起こすと、ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢａｘの発現減少及びａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢｃｌ－ｘＬの発現増加により、細胞死が抑制されることを意味するものである。