ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人静岡大学
特開2022-106420表面増強ラマン散乱による高感度の標的物質の検出のためのナノゲル若しくはキット及び検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022106420
(43)【公開日】2022-07-20
(54)【発明の名称】表面増強ラマン散乱による高感度の標的物質の検出のためのナノゲル若しくはキット及び検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 21/65 20060101AFI20220712BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20220712BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20220712BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20220712BHJP
【ＦＩ】
G01N21/65
G01N33/543 595
G01N33/543 541A
C12Q1/68
C12Q1/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021001391
(22)【出願日】2021-01-07
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
(71)【出願人】
【識別番号】304023318
【氏名又は名称】国立大学法人静岡大学
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100124800
【弁理士】
【氏名又は名称】諏澤 勇司
(74)【代理人】
【識別番号】100140888
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 欣乃
(72)【発明者】
【氏名】朴 龍洙
(72)【発明者】
【氏名】オジョドモ ジョン アチャデュ
【テーマコード（参考）】
2G043
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G043AA04
2G043BA16
2G043BA17
2G043CA04
2G043DA02
2G043EA03
2G043KA01
4B063QA01
4B063QQ06
4B063QQ10
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR48
4B063QS39
(57)【要約】
【課題】本発明は、表面増強ラマン散乱による高感度の標的物質の検出のためのナノゲル、該ナノゲルを含むキット、並びにこれらを用いた表面増強ラマン散乱に基づく検出方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明のナノゲルは、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのナノゲルであって、ＳＥＲＳナノタグを内部に含み、ナノゲルの表面に標的物質に対する特異的プローブが結合されており、物理的又は化学的刺激に応じてナノタグをナノゲルの外に放出できる。
【選択図】図２
【解決手段】本発明のナノゲルは、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのナノゲルであって、ＳＥＲＳナノタグを内部に含み、ナノゲルの表面に標的物質に対する特異的プローブが結合されており、物理的又は化学的刺激に応じてナノタグをナノゲルの外に放出できる。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのナノゲルであって、ＳＥＲＳナノタグを内部に含み、前記ナノゲルの表面に標的物質に対する特異的プローブが結合されており、物理的又は化学的刺激に応じて前記ナノタグを前記ナノゲルの外に放出できる、ナノゲル。
【請求項2】
前記物理的又は化学的刺激が、ｐＨ、温度及び光から選択される、請求項１に記載のナノゲル。
【請求項3】
前記標的物質が、タンパク質、核酸、糖、バクテリア及びウイルスから選択される、請求項１又は２に記載のナノゲル。
【請求項4】
前記標的物質がウイルス又はバクテリアである、請求項１～３のいずれか一項に記載のナノゲル。
【請求項5】
前記プローブが、抗体、核酸プローブ、レクチン及びアプタマーから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のナノゲル。
【請求項6】
尿、便、血液、唾液、その他の体液、粘膜、毛髪、細胞、及び組織から選択される被検試料中の標的物質を検出するための、請求項１～５のいずれか一項に記載のナノゲル。
【請求項7】
前記ＳＥＲＳナノタグが、表面に４－メルカプト安息香酸が結合した三酸化モリブデン量子ドットである、請求項１～６のいずれか一項に記載のナノゲル。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のナノゲルと、
表面修飾及び前記標的物質に対する特異的プローブが結合した磁性ナノ粒子と
を含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのキット。
表面修飾及び前記標的物質に対する特異的プローブが結合した磁性ナノ粒子と
を含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのキット。
【請求項9】
さらに、表面に六方晶窒化ホウ素でコーティングした２次元基板を含む、請求項８に記載のキット。
【請求項10】
請求項１～７のいずれか一項に記載のナノゲル、又は、請求項８又は９に記載のキットを用いた、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出方法。
【請求項11】
（１）請求項１～７のいずれか一項に記載のナノゲル、及び、表面修飾及び前記標的物質に対する特異的プローブが結合した磁性ナノ粒子を用意する工程と、
（２）前記標的物質を含み得る試料に、前記ナノゲル及び前記磁性ナノ粒子を接触させ、前記標的物質、前記ナノゲル及び前記磁性ナノ粒子を含む反応複合体を形成させる工程と、
（３）磁石を用いて、前記反応複合体を回収する工程と、
（４）前記反応複合体に物理的又は化学的刺激を加え、前記ナノゲルから前記ＳＥＲＳナノタグを放出させ、ＳＥＲＳホットスポットを形成させる工程と、
（５）前記ＳＥＲＳホットスポットが形成された反応複合体をＳＥＲＳ基板においてラマン散乱分析を行い、標的物質の存在を検出する工程と
を含む、請求項１０に記載の検出方法。
（２）前記標的物質を含み得る試料に、前記ナノゲル及び前記磁性ナノ粒子を接触させ、前記標的物質、前記ナノゲル及び前記磁性ナノ粒子を含む反応複合体を形成させる工程と、
（３）磁石を用いて、前記反応複合体を回収する工程と、
（４）前記反応複合体に物理的又は化学的刺激を加え、前記ナノゲルから前記ＳＥＲＳナノタグを放出させ、ＳＥＲＳホットスポットを形成させる工程と、
（５）前記ＳＥＲＳホットスポットが形成された反応複合体をＳＥＲＳ基板においてラマン散乱分析を行い、標的物質の存在を検出する工程と
を含む、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項12】
前記反応複合体に物理的又は化学的刺激が、ｐＨ、温度及び光から選択される、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項13】
前記ＳＥＲＳ基板が表面に六方晶窒化ホウ素でコーティングした２次元基板である、請求項１１又は１２に記載の検出方法。
【請求項14】
（６）前記標的物質の標準物を用いて予め作成した検量線を参照に標的物質を定量する工程をさらに含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、表面増強ラマン散乱による高感度の標的物質の検出のためのナノゲル若しくはキット及び検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
物質に光を照射すると、光と物質の相互作用により反射、屈折、吸収などのほかに散乱が起こる。散乱光のなかには入射した光と同じ波長の光が散乱されるレイリー散乱と、分子振動によって入射光とは異なる波長に散乱されるラマン散乱がある。ラマン散乱光における入射光との波長差は、物質が持つ分子振動のエネルギー分に相当するため、ラマン散乱光を分光して得られるラマンスペクトルにより、分子レベルの構造や濃度等を解析できる。すなわち、ラマン分光法による解析である。
【0003】
しかし、ラマン散乱光は不安定であり、レイリー散乱よりも１０－６倍ほど微弱な光であるため、それを増強する技術として表面増強ラマン散乱（ｓｕｒｆａｃｅ－ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＥＲＳ）が開発された（非特許文献１、２）。ＳＥＲＳとは、貴金属ナノ構造体に結合した分子からのラマン散乱光が何億倍にも増強される現象をいう。入射光であるラマンレーザーが貴金属ナノ構造体の表面で表面プラズモンを発生させ、表面プラズモンが結合分子と相互作用することによって、結合分子のラマン信号を大きく増幅させる現象、すなわち、表面プラズモン共鳴を用いる。
【0004】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）分光法は、２／３次元（２Ｄ／３Ｄ）ナノ構造を含む「ホットスポット」より、病原体の次世代診断の有効なプラットフォームとして知られている（非特許文献１）。ＳＥＲＳに基づく病原体の検出は、標的抗原とＳＥＲＳナノタグ及び「ホットスポット」領域を作り出すＳＥＲＳ基板の複合系で構成されている（非特許文献１、３）。したがって、ＳＥＲＳに基づくイムノアッセイの感度や再現性は、ＳＥＲＳナノタグ及びＳＥＲＳ基板の安定性に依存する。
【0005】
イムノアッセイでは、試料マトリクスから標的抗原を前処理又は単離することが必須である。臨床試料は、しばしば、ＳＥＲＳナノタグとの非特異的相互作用を引き起こし得る複雑なマトリックスを含む（非特許文献４、５）。ナノタグはまた、高イオン強度溶液中で不安定で再現不可能なシグナルを示す（非特許文献６）。その結果、特に不純物を多く含む臨床サンプルの場合、ナノタグの不安定さ、構造的な凝集及び化学的歪みは、ＳＥＲＳによる検出における重大な欠点として指摘されている。
【0006】
これに対処するために、ＳＥＲＳナノタグは、保護シェル／層として硬質シリカコーティング及びポリマーで覆われていることが提案された（非特許文献７）。その目的は、ＳＥＲＳナノタグが機械的及び化学的な変形を起こさないようにすること、並びに凝集を減少させ、複雑な環境での安定性を保証することによってその完全性を維持することである（非特許文献８～１０）。また、ＳＥＲＳナノタグの生体適合性及び非毒性も、この戦略によって改善されている（非特許文献１１）。
【0007】
この戦略は、ＳＥＲＳに基づくイムノアッセイ及びイメージングにおいて非常に有用であるものの、保護シェル／層の厚み及び剛性に起因する大きな寸法及び磁気の非透過性は、複雑なカプセル化プロセスと相まって、この戦略の便利な使用を制限している（非特許文献７、１２）。さらに、ＳＥＲＳナノタグが厚くて硬い保護層中に固定されるため、ラマン活性に必要な光と物質の相互作用を妨げる傾向があり、その結果、ＳＥＲＳナノタグの性能の効率を制限し得る。
【0008】
一方、３次元ナノゲルは、調整可能なフレームワークと内部空洞を有する軟質ポリマーナノマテリアルである（非特許文献１３）。ナノゲルは、典型的には、生物医学的用途におけるインビボ輸送のためのペイロード／保護シェルとして使用される（非特許文献１４）。ナノゲルはその柔軟な化学構造のために、特定の刺激（ｐＨ、温度又は光）に応答するように調整することができ、それによって、カプセル化（封入）された物質の刺激誘発性放出を可能にする（非特許文献１５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Lee, H.K., Lee, Y.H., Koh,C.S.L., Phan-Quang, G.C., Han, X., Lay, C.L., Sim, H.Y.F., Kao, Y.C., An, Q.,Ling, X.Y., 2019. Chem. Soc. Rev. 48, 731-756.
【非特許文献2】Porter, M.D., Lipert, R.J.,Siperko, L.M., Wang, G., Narayanan, R., 2008. Chem. Soc. Rev. 37, 1001-1011.
【非特許文献3】Kaminska, A., Witkowska, E.,Winkler, K., Dziecielewski, I., Weyher, J.L., Waluk, J., 2015. Biosens.Bioelectron. 66, 461-467.
【非特許文献4】Neng, J., Harpster, M.H., Wilson,W.C., Johnson, P.A., 2013. Biosens. Bioelectron. 41, 316-321.
【非特許文献5】Sun, Y., Xu, L., Zhang, F., Song,Z., Hu, Y., Ji, Y., Shen, J., Li, B., Lu, H., Yang, H., 2017. Biosens.Bioelectron. 89, 906-912.
【非特許文献6】Tang, H., Zhu, C., Meng, G., Wu,N., 2018. J. Electrochem. Soc. 165, B3098-B3118.
【非特許文献7】Wang, Y., Schlucker, S., 2013.Analyst. 138, 2224-2238.
【非特許文献8】Liang, Y., Gong, J.L., Huang, Y.,Zheng, Y., Jiang, J.H., Shen, G.L., Yu, R.Q., 2007. Talanta. 72(2) 443-449.
【非特許文献9】Ouyang, L., Ren, W., Zhu, L.,Irudayaraj, J., 2017. Rev. Anal. Chem. 36, 20160027.
【非特許文献10】Tang, H., Zhu, C., Meng, G., Wu,N., 2018. J. Electrochem. Soc. 165, B3098-B3118.
【非特許文献11】Chen, M., Luo, W., Zhang, Z.,Wang, R., Zhu, Y., Yang, H., Chen, X., 2017. ACS Appl. Mater. Interfaces. 9 (48)42156-42166.
【非特許文献12】Grubisha, D.S., Lipert, R.J.,Park, H.Y., Driskell, J., Porter, M.D., 2003. Anal. Chem. 75(21) 5936-5943.
【非特許文献13】Wang, H., Chen, Q., Zhou, S.,2018. Chem. Soc. Rev. 47, 4198-4232.
【非特許文献14】Liu, J., Detrembleur, C.,Mornet, S., Jerome, C., Duguet, E., 2015. J. Mater. Chem. B. 3, 6117-6147.
【非特許文献15】Guarrotxena, N.,Quijada-Garrido, I., 2016. Chem. Mater. 28(5) 1402-1412.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、従来のＳＥＲＳナノタグの厚くて硬い保護層による問題点を鑑み、表面増強ラマン散乱による高感度の標的物質の検出のためのナノゲル、該ナノゲルを含むキット、並びにこれらを用いた表面増強ラマン散乱に基づく検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ｐＨ応答性ナノゲルを用いて、ＳＥＲＳナノタグを当該ｐＨ応答性ナノゲルに封入／放出させることで、ＳＥＲＳナノタグの化学的変形から保護し、さらに、ｐＨ応答性ナノゲルの表面に標的物質の特異的抗体を結合されることによって、ＳＥＲＳのための「ホットスポット」を効率よく作り出すことに成功し、それによって標的物質を高感度に検出する方法を見出し、本発明を完成させた。
【0012】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのナノゲルであって、ＳＥＲＳナノタグを内部に含み、上記ナノゲルの表面に標的物質に対する特異的プローブが結合されており、物理的又は化学的刺激に応じて上記ナノタグを上記ナノゲルの外に放出できる、ナノゲル。
［２］
上記物理的又は化学的刺激が、ｐＨ、温度及び光から選択される、［１］に記載のナノゲル。
［３］
上記標的物質が、タンパク質、核酸、糖、バクテリア及びウイルスから選択される、［１］又は［２］に記載のナノゲル。
［４］
上記標的物質がウイルス又はバクテリアである、［１］～［３］のいずれかに記載のナノゲル。
［５］
上記プローブが、抗体、核酸プローブ、レクチン及びアプタマーから選択される、［１］～［４］のいずれかに記載のナノゲル。
［５］
尿、便、血液、唾液、その他の体液、粘膜、毛髪、細胞、及び組織から選択される被検試料中の標的物質を検出するための、［１］～［６］のいずれかに記載のナノゲル。
［７］
上記ＳＥＲＳナノタグが、表面に４－メルカプト安息香酸が結合した三酸化モリブデン量子ドットである、［１］～［６］のいずれかに記載のナノゲル。
［８］
［１］～［７］のいずれかに記載のナノゲルと、
表面修飾及び上記標的物質に対する特異的プローブが結合した磁性ナノ粒子と
を含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのキット。
［９］
さらに、表面に六方晶窒化ホウ素でコーティングした２次元基板を含む、［８］に記載のキット。
［１０］
［１］～［７］のいずれかに記載のナノゲル、又は、［８］又は［９］に記載のキットを用いた、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出方法。
［１１］
（１）［１］～［７］のいずれかに記載のナノゲル、及び、表面修飾及び上記標的物質に対する特異的プローブが結合した磁性ナノ粒子を用意する工程と、
（２）上記標的物質を含み得る試料に、上記ナノゲル及び上記磁性ナノ粒子を接触させ、上記標的物質、上記ナノゲル及び上記磁性ナノ粒子を含む反応複合体を形成させる工程と、
（３）磁石を用いて、上記反応複合体を回収する工程と、
（４）上記反応複合体に物理的又は化学的刺激を加え、上記ナノゲルから上記ＳＥＲＳナノタグを放出させ、ＳＥＲＳホットスポットを形成させる工程と、
（５）上記ＳＥＲＳホットスポットが形成された反応複合体をＳＥＲＳ基板においてラマン散乱分析を行い、標的物質の存在を検出する工程と
を含む、［１０］に記載の検出方法。
［１２］
上記反応複合体に物理的又は化学的刺激が、ｐＨ、温度及び光から選択される、［１１］に記載の検出方法。
［１３］
上記ＳＥＲＳ基板が表面に六方晶窒化ホウ素でコーティングした２次元基板である、［１１］又は［１２］に記載の検出方法。
［１４］
（６）上記標的物質の標準物を用いて予め作成した検量線を参照に標的物質を定量する工程をさらに含む、［１１］～［１３］のいずれかに記載の検出方法。
［１］
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのナノゲルであって、ＳＥＲＳナノタグを内部に含み、上記ナノゲルの表面に標的物質に対する特異的プローブが結合されており、物理的又は化学的刺激に応じて上記ナノタグを上記ナノゲルの外に放出できる、ナノゲル。
［２］
上記物理的又は化学的刺激が、ｐＨ、温度及び光から選択される、［１］に記載のナノゲル。
［３］
上記標的物質が、タンパク質、核酸、糖、バクテリア及びウイルスから選択される、［１］又は［２］に記載のナノゲル。
［４］
上記標的物質がウイルス又はバクテリアである、［１］～［３］のいずれかに記載のナノゲル。
［５］
上記プローブが、抗体、核酸プローブ、レクチン及びアプタマーから選択される、［１］～［４］のいずれかに記載のナノゲル。
［５］
尿、便、血液、唾液、その他の体液、粘膜、毛髪、細胞、及び組織から選択される被検試料中の標的物質を検出するための、［１］～［６］のいずれかに記載のナノゲル。
［７］
上記ＳＥＲＳナノタグが、表面に４－メルカプト安息香酸が結合した三酸化モリブデン量子ドットである、［１］～［６］のいずれかに記載のナノゲル。
［８］
［１］～［７］のいずれかに記載のナノゲルと、
表面修飾及び上記標的物質に対する特異的プローブが結合した磁性ナノ粒子と
を含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのキット。
［９］
さらに、表面に六方晶窒化ホウ素でコーティングした２次元基板を含む、［８］に記載のキット。
［１０］
［１］～［７］のいずれかに記載のナノゲル、又は、［８］又は［９］に記載のキットを用いた、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出方法。
［１１］
（１）［１］～［７］のいずれかに記載のナノゲル、及び、表面修飾及び上記標的物質に対する特異的プローブが結合した磁性ナノ粒子を用意する工程と、
（２）上記標的物質を含み得る試料に、上記ナノゲル及び上記磁性ナノ粒子を接触させ、上記標的物質、上記ナノゲル及び上記磁性ナノ粒子を含む反応複合体を形成させる工程と、
（３）磁石を用いて、上記反応複合体を回収する工程と、
（４）上記反応複合体に物理的又は化学的刺激を加え、上記ナノゲルから上記ＳＥＲＳナノタグを放出させ、ＳＥＲＳホットスポットを形成させる工程と、
（５）上記ＳＥＲＳホットスポットが形成された反応複合体をＳＥＲＳ基板においてラマン散乱分析を行い、標的物質の存在を検出する工程と
を含む、［１０］に記載の検出方法。
［１２］
上記反応複合体に物理的又は化学的刺激が、ｐＨ、温度及び光から選択される、［１１］に記載の検出方法。
［１３］
上記ＳＥＲＳ基板が表面に六方晶窒化ホウ素でコーティングした２次元基板である、［１１］又は［１２］に記載の検出方法。
［１４］
（６）上記標的物質の標準物を用いて予め作成した検量線を参照に標的物質を定量する工程をさらに含む、［１１］～［１３］のいずれかに記載の検出方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明の柔軟性及び刺激応答性を有するナノゲルによれば、ＳＥＲＳナノタグを内部に捕捉することによって化学的変形から保護でき、そして、標的抗原の分離・濃縮・精製の後に、刺激によってナノゲルからＳＥＲＳナノタグを放出させ、非常に効果的に「ホットスポット」を生成させることができる。
【0014】
本発明はまた、標的物質－プローブの特異的反応（例えば、抗原抗体反応）を利用したＳＥＲＳに基づく高感度検出方法を提供することができる。本発明の検出方法において、本発明のナノゲルに加えて、所定の官能基化された磁性ナノ粒子を使うことで、標的物質－プローブの特異的反応の後に、反応複合体を効率よく分離・濃縮でき、さらに、磁性ナノ粒子の官能基とＳＥＲＳタグと結合することで、「ホットスポット」を生成させることができる。本発明の検出方法が特異性・選択性が高く、また、安定性も高いため、複雑な成分を含む様々な標的物質を高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】（Ａ）は、ＭｏＯ３－ＱＤ及び４－ＭＢＡを用いたＳＥＲＳナノタグの調製スキームを示し、（Ｂ）はチオール－マレイミド親和性を介したナノタグの局在によるＩｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰの調製スキーム、及びＳＥＲＳ「ホットスポット」形成スキームの模式図を示す。
【図2】ＳＥＲＳナノタグ封入／保護のためのナノゲルベースの化学ペイロードシステム（ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧ）の模式図、並びに、ＳＥＲＳ「ホットスポット」形成及び標的ウイルスの高感度免疫アッセイ、ＳＥＲＳナノタグのｐＨ誘発性放出、ＳＥＲＳ検出のスキームの模式図を示す。
【図3】（ａ）はＭｏＯ３－ＱＤのＸＰＳワイドスキャンスペクトルを示し、（ｂ）はＭｏ ３ｄの高分解能ＸＰＳスペクトルを示す。
【図4】（ａ）はＭｏＯ３－ＱＤのＴＥＭ画像であり、（ｂ）はＭｏＯ３－ＱＤのサイズ（粒子径）分布グラフである。
【図5】ＭｏＯ３－ＱＤのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルを示す。
【図6】（ａ）はｐＨ応答性ナノゲル（ＮＧ）を示す模式図であり、（ｂ）はｐＨ７．０での未処理ＮＧのＴＥＭ画像であり、（ｃ）はｐＨ７．４でのＳＥＲＳナノタグを担持したＮＧ（ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧ）のＴＥＭ画像であり、（ｄ）はｐＨ４．５におけるＳＥＲＳナノタグ（４－ＭＢＡ－ＭｏＯ３－ＱＤ）の放出を示すＴＥＭ画像である。
【図7】（ａ）はｐＨ４～９におけるＮＧの遷移流体力学直径（Ｄｈ）の測定結果を示し、（ｂ）はｐＨ４～９におけるＮＧの流体力学容積（Ｖｈ）の測定結果を示す。
【図8】（ａ）はＳＥＲＳナノタグを担持したＮＧ及び未処理のＮＧ（空のＮＧ）のＤＬＳプロットを示し、（ｂ）はＳＥＲＳナノタグ単独、及びｐＨ７．４でＳＥＲＳナノタグをＮＧに封入した場合のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを示す。
【図9】マレイミド官能化ＣｍａｇＮＰ（ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰ）又はマレイミド部分を含まないＣｍａｇＮＰの存在で形成されたナノタグのＳＥＲＳスペクトルを示す。
【図10】（ａ）は、異なる濃度のＥ型肝炎ウイルス様粒子（ＨＥＶ－ＬＰ）を添加した場合の、ＳＥＲＳナノタグを担持したＮＧを用いたＨＥＶ－ＬＰ検出の結果（ラマン散乱強度）を示し、（ｂ）は検出プラットフォームとして２Ｄ 六方晶窒化ホウ素（ｈ－ＢＮ）基板を使用した場合、ＰＢＳ又はヒト血清中のＨＥＶ－ＬＰでの検出の結果（ラマン散乱強度に基づく検量線）を示す（図中のスケールバーはラマン散乱強度１００００を示す）。
【図11】（ａ）は、ベアガラス基板上のＰＢＳ中のＨＥＶ－ＬＰの検出結果（ラマン散乱強度に基づく検量線）を示し、（ｂ）は２Ｄ ｈ－ＢＮ基板又はベアガラス基板を検出プラットフォームとして使用した、臨床試料中のＨＥＶ（Ｇ７ＨＥＶ）の検出結果（ラマン散乱強度に基づく検量線）を示す。
【図12】（ａ）は感染した患者の糞便サンプル中のノロウイルス（ＮｏＶ）の、本発明のＳＥＲＳに基づくイムノアッセイによる検出結果（ラマン散乱強度に基づく検量線）、及び、市販ＥＬＩＳＡを用いた検出結果（吸収強度に基づく検量線）を示し、（ｂ）は潜在的干渉生体分子としての他のウイルス及びウイルス様粒子の存在下でのＨＥＶ－ＬＰの特異的及び選択的な検出結果を示す。
【図13】（ａ）はＳＥＲＳ検出基板（ｈ－ＢＮ）の光学画像、及び１００個のランダムスポットのマッピングを示し、（ｂ）は２Ｄ ｈ－ＢＮ及びＳｉ基板の写真を示し、（ｃ）はマッピングされた異なる１００個のスポットのＳＥＲＳシグナル、並びに１０９８ｃｍ－１でのイムノアッセイのスポット－スポット変動及び再現性を示す相対標準偏差を示すグラフであり、（ｄ）はランダムに分布した１００個のスポットにおけるＳＥＲＳナノタグをオーバーラップしたＳＥＲＳスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の検出方法は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質－プローブの特異的反応による検出方法である。なお、標的物質－プローブの特異的反応の代表的な例として、抗原抗体反応（免疫反応）が挙げられるが、他の標的物質－プローブの特異的反応も同様に機能するため、以下抗原抗体反応を例に標的物質－プローブの特異的反応を説明する場合がある。ＳＥＲＳ検出は、検出感度を高めるために、プラズモン電場強度が高い「ホットスポット」を生じさせることが重要である。本発明の革新的な検出方法は、物理的又は化学的刺激に対する応答性のあるナノゲルを用い、ＳＥＲＳナノタグを封入（保護）及び放出することによって、制御された放出を実現でき、ホットスポットを作り出すことを可能とする。
【0017】
本発明の検出方法は、さらにナノゲルの表面に標的物質の特異的プローブ（例えば、特異的抗体）を結合させ、また、同じ標的物質に対する特異的プローブ（例えば、特異的抗体）を結合した磁性ナノ粒子を用いることを特徴とし、これによって、磁性ナノ粒子とナノゲルの両方が標的物質と結合し、サンドイッチ構造の反応複合体（例えば、免疫複合体）を形成させることができる。反応複合体は、磁気によって簡単に分離し、濃縮できるため、複雑な成分を含む臨床サンプルからでも高感度に検出することを可能とする。
【0018】
本発明の検出方法はさらに、上記磁性ナノ粒子がＳＥＲＳナノタグに結合できるように官能化されていることを特徴とする。分離・濃縮した反応複合体に物理的又は化学的刺激を与え、ナノゲルからＳＥＲＳナノタグを放出させ、さらに磁気ナノ粒子と結合させ、ナノゲルの周囲にＳＥＲＳのホットスポットを形成させ、標的物質を高感度に検出することを可能とする。
【0019】
さらに、本発明はまたＳＥＲＳ検出に適したＳＥＲＳ基板をも提供し、それによって、標的物質の検出感度をさらに向上させることができる。
【0020】
以下、本発明におけるＳＥＲＳナノタグ、ナノゲル、ＳＥＲＳ基板、キット及び検出方法について詳細に説明する。
【0021】
〔ＳＥＲＳナノタグ〕
本実施形態のＳＥＲＳナノタグが、ＳＥＲＳ活性を有するナノタグであればよい。ＳＥＲＳナノタグとしては、表面プラズモン効果のあるものであればよく、例えば金、銀、銅、モリブデン等の金属を含むプラズモン金属量子ドットが挙げられ、好ましくは三酸化モリブデン量子ドット（ＭｏＯ３－ＱＤ）であり、さらに表面に４－メルカプト安息香酸（４－ＭＢＡ）が結合した三酸化モリブデン量子ドット（ＭｏＯ３－ＱＤ）である。ここで、結合とは架橋などの化学反応によって、４－ＭＢＡ官能基がＭｏＯ３－ＱＤと結合していることを意味する。
本実施形態のＳＥＲＳナノタグが、ＳＥＲＳ活性を有するナノタグであればよい。ＳＥＲＳナノタグとしては、表面プラズモン効果のあるものであればよく、例えば金、銀、銅、モリブデン等の金属を含むプラズモン金属量子ドットが挙げられ、好ましくは三酸化モリブデン量子ドット（ＭｏＯ３－ＱＤ）であり、さらに表面に４－メルカプト安息香酸（４－ＭＢＡ）が結合した三酸化モリブデン量子ドット（ＭｏＯ３－ＱＤ）である。ここで、結合とは架橋などの化学反応によって、４－ＭＢＡ官能基がＭｏＯ３－ＱＤと結合していることを意味する。
【0022】
ＳＥＲＳは、分子について一般的な蛍光よりはるかに狭い特徴を有する指紋様の振動スペクトルを発生するレーザーに基づく光学的分光法である。ラマン散乱は幅広い範囲の波長を使って励起可能で、この波長範囲には単色性遠赤色光または近赤外光が含まれ、その光子エネルギーは非常に小さいため、生体試料の中の固有の背景蛍光を励起しない。ラマンスペクトルは一般に、３００～３５００ｃｍ-1の振動エネルギーをカバーすることが可能である。
【0023】
本発明のＳＥＲＳナノタグは、３００～３５００ｃｍ-1の振動エネルギー範囲において特徴的な振動スペクトルを示すものであればよく、好ましくは、１０００～１７００ｃｍ－１の振動エネルギー範囲において特徴的な振動スペクトルを示す分子が結合されたプラズモン金属量子ドットである。そのような分子としては、４－ＭＢＡを挙げることができる。４－ＭＢＡが結合したＭｏＯ３－ＱＤは、１０９８ｃｍ－１において４－ＭＢＡの特徴的なラマンバンドを有する。このほかに、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ又は４－ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌも使用可能である。
【0024】
ＳＥＲＳナノタグの粒子径は、一般的な量子ドットの粒子径を有していればよく、例えば、１ｎｍ～１００ｎｍであればよく、また、１ｎｍ～５０ｎｍ又は１ｎｍ～２０ｎｍであってよい。また、粒子径が均一であるものが好ましい。
【0025】
プラズモン金属量子ドットは、既知の方法によって作製することができる。例えば、ＭｏＯ３－ＱＤの場合、Ｚｕらの方法（Zu, H., et al., 2018. New J. Chem. 42, 18533-18540）に従って合成してもよく、実施例に記載されたように、Ｚｕらの方法の改良として、水熱プロセスを用いて合成してもよい。また、ＭｏＯ３－ＱＤの表面に４－ＭＢＡを結合させる方法は、既知の方法によって作製することができる。例えば、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）及びカルボジイミド化学（ＥＤＣ／ＮＨＳ）によるシラン処理を含む２段階手順にしたがって、作製することができる。
【0026】
〔ナノゲル〕
本実施形態のナノゲルは、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのナノゲルであって、ＳＥＲＳナノタグを内部に含み、ナノゲルの表面に標的物質に対する特異的抗体が結合されており、かつ、物理的又は化学的刺激に応じてナノタグをナノゲルの外に放出できるナノゲルである。ここで、「ＳＥＲＳナノタグを内部に含（む）」ことを本明細書でしばしば「封入される」と表現する。また、ここのＳＥＲＳナノタグとしては、上述の本発明のＳＥＲＳナノタグを用いることができる。
本実施形態のナノゲルは、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのナノゲルであって、ＳＥＲＳナノタグを内部に含み、ナノゲルの表面に標的物質に対する特異的抗体が結合されており、かつ、物理的又は化学的刺激に応じてナノタグをナノゲルの外に放出できるナノゲルである。ここで、「ＳＥＲＳナノタグを内部に含（む）」ことを本明細書でしばしば「封入される」と表現する。また、ここのＳＥＲＳナノタグとしては、上述の本発明のＳＥＲＳナノタグを用いることができる。
【0027】
本実施形態のナノゲルとしては、刺激応答性を有するナノゲルであれば特に限定されない。ここで、刺激応答性とは、物理的又は化学的刺激を受けると、ナノゲルの透過性が変化し得ることを意味する。ナノゲルの透過性が変化することによって、ナノゲルの周囲に存在する物質（ＳＥＲＳナノタグ）をナノゲルの中に封入したり、ナノゲルの中に封入した物質を周囲に放出したりすることができるようになる。そのため、物理的又は化学的刺激を制御することで、ＳＥＲＳナノタグを保護したり、放出させ反応させるタイミングを制御したりすることができる。
【0028】
物理的又は化学的刺激として、制御しやすい観点から、ｐＨ、温度及び光から選択されることが好ましい。当業者が、測定対象である標的物質及びその抗体に応じて、適切な刺激応答性ナノゲルを選択することができる。制御しやすい観点から、ｐＨ応答性ナノゲルが好ましく用いられる。ｐＨ応答性ナノゲルとしては、例えば、ｐＨ４～９の範囲における応答性を有するナノゲルが挙げられる。その中に、実施例に記載されているグルタルアルデヒド（ＧＡ）マイクロエマルションを架橋して得られたｐＨ応答性ナノゲルが好ましく用いられる。
【0029】
上記ｐＨ応答性ナノゲルは、中性（ｐＨ７．０～８．０）の範囲において安定であり、このｐＨ範囲であれば、特に生理的なｐＨ（７．４）において、ナノゲルの中の空洞に封入されたＳＥＲＳナノタグを放出しない。一方で、弱酸性（ｐＨ４～５．特にｐＨ４．５）においては、ナノゲルの構造が変化し、ナノゲル中に封入されたナノタグを放出したり、周囲に存在するナノタグを取り込んだりすることができ、ナノゲルを取り込ませた後に、ｐＨを中性に戻すと、ナノタグをナノゲルの中に封入・保護することができる。ナノタグがナノゲルの中に封入されていることを、例えばＴＥＭで確認することができ、また、その放出も同様にＴＥＭで観察することができる。さらに、ＳＥＲＳナノタグがナノゲルに封入されると、その特徴的なラマン散乱がナノゲルによって遮蔽されてしまうため、ラマン散乱解析によってもＳＥＲＳナノタグが封入されているかどうかを確認することができる。
【0030】
本実施形態のナノゲルの表面に標的物質に対する特異的プローブ（例えば、特異的抗体）が結合されている。これは、ナノゲルと標的物質との特異的反応（例えば、抗原抗体反応）に基づく検出のためである。標的物質に対する特異的プローブは後述のとおりである。ナノゲルに抗体等の特異的プローブを結合させる方法は、既知の方法にしたがって行うことができる。例えば、実施例に記載の方法を挙げることができる。
【0031】
〔磁性ナノ粒子〕
本実施形態の磁性ナノ粒子は、表面修飾及び標的物質に対する特異的抗体が結合した磁性ナノ粒子である。磁性ナノ粒子の表面修飾は、ＳＥＲＳナノタグに結合した分子（例えば、４－ＭＢＡ）と反応し、結合できる修飾基であることが好ましい。表面修飾した磁性ナノ粒子としては、例えば、マレイミド官能化した磁性ナノ粒子が挙げられる。ここの抗体は、標的物質に対する特異的な抗体であり、ナノゲルに結合した抗体と同じであってもよく、別のものであってもよい。
本実施形態の磁性ナノ粒子は、表面修飾及び標的物質に対する特異的抗体が結合した磁性ナノ粒子である。磁性ナノ粒子の表面修飾は、ＳＥＲＳナノタグに結合した分子（例えば、４－ＭＢＡ）と反応し、結合できる修飾基であることが好ましい。表面修飾した磁性ナノ粒子としては、例えば、マレイミド官能化した磁性ナノ粒子が挙げられる。ここの抗体は、標的物質に対する特異的な抗体であり、ナノゲルに結合した抗体と同じであってもよく、別のものであってもよい。
【0032】
磁性ナノ粒子としては、通常の磁石によって吸着分離できるほどの磁性を有しているものであればよく、例えばＦｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＣｏＦｅ３Ｏ４等の磁性材料からなるナノスケールの粒子であってもよい。また、抗体等のプローブを結合させるために、磁性ナノ粒子が官能化したものであることが好ましく、例えばプローブが抗体である場合、カルボキシル化磁性ナノ粒子であることが好ましい。
【0033】
磁性ナノ粒子の粒子径は、３ｎｍ～５０ｎｍであればよく、例えば、３ｎｍ～２０ｎｍ、又は３ｎｍ～１０ｎｍであってもよい。
【0034】
磁性ナノ粒子の作製は、既知の方法に従って行うことができる。また、磁性ナノ粒子のカルボキシル化、及びカルボキシル化磁性ナノ粒子への抗体の結合も既知の方法にしたがって行うことができる。具体的には、実施例に記載の方法が挙げられる。
〔ＳＥＲＳ基板〕
本実施形態のＳＥＲＳ基板は、表面に六方晶窒化ホウ素（ｈ－ＢＮ）でコーティングした２次元基板（以下、「六方晶窒化ホウ素基板」又は「ｈ－ＢＮ基板」と呼ぶ）であることが好ましい。ｈ－ＢＮ基板が２次元（２Ｄ）基板であることが好ましく、以下「２Ｄ ｈ－ＢＮ基板」と呼ぶ場合がある。
〔ＳＥＲＳ基板〕
本実施形態のＳＥＲＳ基板は、表面に六方晶窒化ホウ素（ｈ－ＢＮ）でコーティングした２次元基板（以下、「六方晶窒化ホウ素基板」又は「ｈ－ＢＮ基板」と呼ぶ）であることが好ましい。ｈ－ＢＮ基板が２次元（２Ｄ）基板であることが好ましく、以下「２Ｄ ｈ－ＢＮ基板」と呼ぶ場合がある。
【0035】
ＳＥＲＳ測定は、２Ｄ ｈ－ＢＮ基板上で行われると、ｈ－ＢＮ ＳＥＲＳ活性によって、ｈ－ＢＮコーティング無しの基板に比べて、約１０３オーダーの大きさまで信号を増強されることができる。したがって、標的物質の量がわずかであっても、高感度に検出することができる。
【0036】
２Ｄ ｈ－ＢＮ基板の調製は、例えばベアグラスにｈ－ＢＮ分散液の滴下及び固定化によって行うことができる。具体的には、実施例に記載の方法が挙げられる。
〔キット〕
本実施形態のキットは、上述の本発明のナノゲルと、上述の本発明の磁性ナノ粒子とを含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのキットである。さらに、本実施形態のキットは、上述の本発明のＳＥＲＳ基板を含むことが好ましい。
〔キット〕
本実施形態のキットは、上述の本発明のナノゲルと、上述の本発明の磁性ナノ粒子とを含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出のためのキットである。さらに、本実施形態のキットは、上述の本発明のＳＥＲＳ基板を含むことが好ましい。
【0037】
本実施形態のキットを用いて、後述の検出方法を行うことで、標的物質を高感度に検出することができる。
【0038】
〔検出方法〕
本発明の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出方法は、本発明のナノゲル、又は、本発明のキットを用いた検出方法である。
本発明の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく標的物質の検出方法は、本発明のナノゲル、又は、本発明のキットを用いた検出方法である。
【0039】
本実施形態の検出方法は、下記の工程を含んでもよい。なお、検出方法の一例の模式図は図２に示す。
（１）上述の本発明のナノゲル、及び、表面修飾及び標的物質に対する特異的プローブが結合した磁性ナノ粒子を用意する工程、
（２）標的物質を含み得る試料に、ナノゲル及び磁性ナノ粒子を接触させ、標的物質、ナノゲル及び磁性ナノ粒子を含む反応複合体を形成させる工程、
（３）磁石を用いて、反応複合体を回収する工程、
（４）反応複合体に物理的又は化学的刺激を加え、ナノゲルからＳＥＲＳナノタグを放出させ、ＳＥＲＳホットスポットを形成させる工程、及び
（５）ＳＥＲＳホットスポットが形成された反応複合体をＳＥＲＳ基板においてラマン散乱分析を行い、標的物質の存在を検出する工程。
（１）上述の本発明のナノゲル、及び、表面修飾及び標的物質に対する特異的プローブが結合した磁性ナノ粒子を用意する工程、
（２）標的物質を含み得る試料に、ナノゲル及び磁性ナノ粒子を接触させ、標的物質、ナノゲル及び磁性ナノ粒子を含む反応複合体を形成させる工程、
（３）磁石を用いて、反応複合体を回収する工程、
（４）反応複合体に物理的又は化学的刺激を加え、ナノゲルからＳＥＲＳナノタグを放出させ、ＳＥＲＳホットスポットを形成させる工程、及び
（５）ＳＥＲＳホットスポットが形成された反応複合体をＳＥＲＳ基板においてラマン散乱分析を行い、標的物質の存在を検出する工程。
【0040】
工程（１）におけるナノゲル及び磁性ナノ粒子は、上述のとおりである。
【0041】
標的物質に対するプローブとしては、特に限定されず、プローブと特異的に結合する物質であればよい。例えば、抗原－抗体、糖－レクチン、リガンド－レセプター、アプタマーの標的物質－アプタマー、核酸－核酸等の、互いに特異的に結合する物質の組の一方を標的物質とし、他方をプローブとして用いることができる。例えば、ウイルス、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、化学物質、ホルモン等を標的物質又はプローブに用いることができる。
【0042】
標的物質としては、タンパク質、核酸（ＲＮＡ若しくはＤＮＡ）、糖、バクテリア及びウイルスから選択されることが好ましく、特にウイルス又はバクテリアであることが好ましい。ウイルスとしては、例えば、特異的な抗体を用いて診断される代表的なヒト又はヒト以外の動物に感染する、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、ＴＴ型）、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＳＶ）、ロタウイルス、コロナウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、日本脳炎ウイルス等が挙げられる。また、プローブとしては、抗体、核酸プローブ、レクチン及びアプタマーから選択されることが好ましい。
【0043】
ウイルスが標的物質である場合、ウイルスに対する抗体としては、ウイルスの表面抗原に対する抗体を挙げられる。既知のウイルスの表面抗原としては、例えば、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のＧｅｎｏｇｒｏｕｐ １～７（Ｇ１～Ｇ７）、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ノロウイルスのＧｅｎｏｇｒｏｕｐ ＩおよびＧｅｎｏｇｒｏｕｐ ＩＩ等が挙げられる。
【0044】
特異的抗体は、公知の方法により作製することができ、例えば、標的物質に特異的な領域の部分配列ペプチドをマウス、ウサギ、ヤギ等の動物に免疫して抗血清を採取したり、抗体を産生するハイブリドーマを作製したりすることによって、取得できる。また、市販品の抗体を利用してもよい。抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体又はそれらの機能的断片でもよい。また、標的物質に対する抗体は、一種又は二種以上を用いることができる。
【0045】
標的物質は、液体中に存在していてもよく、固体、粉末、流動体、気体等の中に存在していてもよい。標的物質を含む被験試料としては、例えば、ヒト又はヒト以外の動物から採取される、尿、便、血液、唾液、その他の体液、粘膜、毛髪、細胞、組織等を挙げることができる。血液は全血、血漿又は血清を含む。その他の体液は、粘液、胃液、腸液等を含む。被験試料が液体であることが好ましいため、標的物質が液体以外の試料材料中に存在する場合には、適切なバッファー等に該試料材料を溶解又は懸濁し、試料を液体にすることが好ましい。また、検出感度を挙げるために、試料を事前に精製し、不純物や夾雑物を除くことが好ましい。一方で、本発明の検出方法は実施例にも証明されたように、検出特性及び選択性が高く、複雑な成分を含む被検試料（生体試料）における標的物質の検出であっても高感度かつ特異的に検出することができる。
【0046】
工程（２）において、標的物質を含み得る試料に、ナノゲル及び磁性ナノ粒子を接触させ、標的物質、ナノゲル及び磁性ナノ粒子を含む反応複合体を形成させる。例えば、標記物質に対する特異的プローブが抗体である場合、標的物質に、ナノゲル及び磁性ナノ粒子を接触させる際に、抗原抗体反応を起こさせるため、免疫反応が適切に行える条件（温度、ｐＨ、接触時間）で行うことが好ましい。接触は好ましくは液体中に行う。ナノゲル及び磁性ナノ粒子は好ましく過剰量で添加されることが好ましい。得られる免疫複合体は、ナノゲル－標的物質－磁性ナノ粒子のサンドイッチ構造を有する。
【0047】
工程（３）において、磁石を用いて、反応複合体（例えば、免疫複合体）を回収する。磁石によって回収された磁性ナノ粒子には、標的物質及びナノゲルが結合されているものを含む。一方、標的物質に結合しなかった過剰量のナノゲルは回収されない。回収された反応複合体について、工程（４）を行う前に、好ましく洗浄して、非特異的に結合した成分を除去することが好ましい。
【0048】
工程（４）において、反応複合体（例えば、免疫複合体）に物理的又は化学的刺激を加え、ナノゲルからＳＥＲＳナノタグを放出させ、ＳＥＲＳホットスポットを形成させる。ナノゲルからＳＥＲＳナノタグの放出は上述のとおりである。ナノゲルから放出されたＳＥＲＳナノタグは、磁性ナノ粒子の表面修飾と結合し、それによってＳＥＲＳホットスポットを形成する（図１、図２）。
【0049】
工程（５）において、ＳＥＲＳホットスポットが形成された反応複合体（例えば、免疫複合体）をＳＥＲＳ基板においてラマン散乱分析を行い、標的物質の存在を検出する。この際に、使用するＳＥＲＳ基板として、上述の六方晶窒化ホウ素基板であることが好ましい。この際に、磁石をＳＥＲＳ基板の下に配置し、反応複合体をＳＥＲＳ基板上の任意の位置に誘導することもできる。
【0050】
さらに、本実施形態の検出方法は、（６）標的物質の標準物を用いて予め作成した検量線を参照に標的物質を定量する工程をさらに含んでもよい。
【0051】
本発明の検出方法は、高感度な検出を提供できるだけでなく、使用する抗体を変えることで、様々な標的物質に対応でき、非常に汎用性の高い検出方法である。
【0052】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例0053】
＜測定機器＞
共焦点ラマン分光法及びＳＥＲＳ分析は、７８５ｎｍレーザーを使用して、ＮＲＳ－７１００搭載顕微鏡レーザーラマン分光光度計（ＪＡＳＣＯ、東京、日本）で行った。測定は、１％のレーザパワー及び２秒の積分時間で１００×対物レンズを用いて行った。マルチポイントＳＥＲＳ分析は、２μｍのステップサイズ及び２秒の曝露時間を有する、５０μｍ×５０μｍの領域における高速マッピング機能によって行われた。レーザパワーは１％であり、取得時間は各画素で１秒に設定した。
共焦点ラマン分光法及びＳＥＲＳ分析は、７８５ｎｍレーザーを使用して、ＮＲＳ－７１００搭載顕微鏡レーザーラマン分光光度計（ＪＡＳＣＯ、東京、日本）で行った。測定は、１％のレーザパワー及び２秒の積分時間で１００×対物レンズを用いて行った。マルチポイントＳＥＲＳ分析は、２μｍのステップサイズ及び２秒の曝露時間を有する、５０μｍ×５０μｍの領域における高速マッピング機能によって行われた。レーザパワーは１％であり、取得時間は各画素で１秒に設定した。
【0054】
Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）分析は、ＥＳＣＡ１６００システム（ＵＬＶＡＣ－ＰＨＩ Ｉｎｃ．，東京，日本）で、Ａｌ Ｋα Ｘ線源（１４８６．６ｅＶ）及び半球型アナライザーを用いて行った。
【0055】
基底状態電子吸収（ＵＶ／Ｖｉｓ）スペクトルは、フィルターベースのマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００Ｍ；ＴＥＣＡＮ，Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ）で記録した。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は、１００ｋＶで動作するＪＥＭ－２１００Ｆシステム（ＪＥＯＬ，Ｌｔｄ．，東京，日本）を用いて得た。動的光散乱（ＤＬＳ）及びゼータ電位分析は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒナノシリーズ Ｎａｎｏ－ＺＳ９０システム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔ． Ｌｔｄ．， Ｍａｌｖｅｒｎ， ＵＫ）を用いて行った。粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）分析は、Ｎｉフィルター及びＣｕ－Ｋα源を有するＲＩＮＴ ＵＬＴＩＭＡ ＸＲＤシステム（Ｒｉｇａｋｕ Ｃｏ．，東京，日本）を用いて行った。０．０１°／ステップ及び１０ｓ／ポイントの走査速度で２θ＝１０～９０°にわたってデータを収集した。
【0056】
フーリエ変換赤外分光法は、ＡＴＲ ＰＲＯ６１０Ｐ－Ｓ（ＪＡＳＣＯ）を備えたＦＴ／ＩＲ－６３００分光計によって行った。
【0057】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）実験は、マイクロプレートリーダー（モデル６８０；Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【0058】
＜試薬・材料＞
モリブデン酸アンモニウム四水和物、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及び過酸化水素（３０％）は、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（大阪）により供給された。グルタルアルデヒド、塩化鉄（ＩＩＩ）、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、無水コハク酸、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分岐平均Ｍｗ ２５，０００）、タンニン酸、トリトンＸ－１００、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ´－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。４－メルカプト安息香酸（４－ＭＢＡ）及びＮ－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩は、東京化成工業（株）から供給された。六方晶窒化ホウ素（ｈ－ＢＮ）粉末は、ＡＣＳ Ｍａｔｅｒｉａｌ，ＬＬＣ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から入手した。すべての実験及び溶液調製は、特に明記しない限り、超純二重蒸留脱イオン（ＤＩ）水（＞１８ＭΩ・ｃｍ）を用いて行った。
モリブデン酸アンモニウム四水和物、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及び過酸化水素（３０％）は、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（大阪）により供給された。グルタルアルデヒド、塩化鉄（ＩＩＩ）、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、無水コハク酸、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分岐平均Ｍｗ ２５，０００）、タンニン酸、トリトンＸ－１００、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ´－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。４－メルカプト安息香酸（４－ＭＢＡ）及びＮ－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩は、東京化成工業（株）から供給された。六方晶窒化ホウ素（ｈ－ＢＮ）粉末は、ＡＣＳ Ｍａｔｅｒｉａｌ，ＬＬＣ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から入手した。すべての実験及び溶液調製は、特に明記しない限り、超純二重蒸留脱イオン（ＤＩ）水（＞１８ＭΩ・ｃｍ）を用いて行った。
【0059】
ヒト血清（ヒト男性ＡＢ血漿由来、米国起源、滅菌濾過）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。ジカウィルスは長崎大学熱帯医学研究所森田教授のご好意により提供された。ＮｏＶ－ＬＰは、発明者らの従来のプロトコルに従って調製した。インフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１）（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）は、Ｐｒｏｓｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．（Ｒｅｈｏｖｏｔ， Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。臨床的に分離されたインフルエンザウイルスＡ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／１１０／２００９（Ｈ３Ｎ２）は、横浜市衛生研究所（日本）のＣ．Ｋａｗａｋａｍｉ博士のご好意により提供された。ヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）から購入した。デングウイルスｃＤＮＡは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ）によって合成された。ＨＥＶ－ＬＰ及びウサギ抗Ｇ３ＨＥＶ ＩｇＧ抗体は、国立感染症研究所の李 天成博士から提供された。Ｇ７ＨＥＶのＲＮＡコピー数は５．０×１０８コピー／ｍＬであった。ＮｏｖのゲノグループＩＩに特異的で広範に反応するモノクローナル抗体（ＮＳ１４，経口免疫マウスの脾臓細胞から得たイソタイプ－ＩｇＧ）をサンドイッチ型免疫アッセイに用いた。ウイルス様粒子調製のための標準プロトコルに従って、ＧＩＩ．４ノロウイルス様粒子（ＮｏＶ－ＬＰｓ）を発現させ精製した。胃腸炎に感染した患者の臨床糞便サンプルは、静岡県環境衛生研究所の阿部冬樹様より提供された。検体を前処理し、ＲＴ－ｑＰＣＲ法を用いて定量した。
【0060】
ＮｏＶ検出用の市販のＥＬＩＳＡキット－ＮＶ ＥＩＡ「生研」は、日本の東京のＤｅｎｋａ Ｃｏ．Ｌｔｄによって供給された。迅速試験のための紙ベースの側方流動ＮｏＶ抗原キットが、Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｍｅｄ．Ｃｏ．Ｌｔｄ．（日本）によって提供された。
【0061】
〔実施例１ ＳＥＲＳナノタグ、磁性ナノ粒子、ナノゲル及びｈ－ＢＮ基板の作製〕
＜ＭｏＯ３－ＱＤの合成＞
プラズモン三酸化モリブデン量子ドット（ＭｏＯ３－ＱＤ）は、水熱プロセスを用いた改良を除いて、Ｚｕらの方法（Zu, H., et al., 2018. New J. Chem. 42, 18533-18540）に従って合成した。
＜ＭｏＯ３－ＱＤの合成＞
プラズモン三酸化モリブデン量子ドット（ＭｏＯ３－ＱＤ）は、水熱プロセスを用いた改良を除いて、Ｚｕらの方法（Zu, H., et al., 2018. New J. Chem. 42, 18533-18540）に従って合成した。
【0062】
具体的には、０．１ｇ（０．０８ｍｍｏｌ）のモリブデン酸アンモニウム四水和物を、２０ｍＬの脱イオン（ＤＩ）水及びＨ２Ｏ２（５：３）混合物に溶解した。次いで、ＰＶＰ（０．５ｇ）を添加し、１時間撹拌した。混合物を、テフロン加工のステンレス鋼オートクレーブに移し、１８０℃で４時間加熱した。室温まで冷却した後、得られたＭｏＯ３－ＱＤをエタノールで４回、次いでアセトンで２回洗浄し、６００℃で１２時間乾燥した。
【0063】
＜ＳＥＲＳナノタグの作製＞
図１のＡに示すように、４－メルカプト安息香酸（４－ＭＢＡ）と、上記合成したＭｏＯ３－ＱＤを用いて、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）及びカルボジイミド化学（ＥＤＣ／ＮＨＳ）によるシラン処理を含む２段階手順によって、ＳＥＲＳナノタグを作製した。
図１のＡに示すように、４－メルカプト安息香酸（４－ＭＢＡ）と、上記合成したＭｏＯ３－ＱＤを用いて、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）及びカルボジイミド化学（ＥＤＣ／ＮＨＳ）によるシラン処理を含む２段階手順によって、ＳＥＲＳナノタグを作製した。
【0064】
具体的には、２ｍｇのＭｏＯ３－ＱＤをエタノールとトルエン（１：１）の混合物中５ｍＬで１２時間連続的に撹拌し、次いで２ｍｇ／ｍＬのＡＰＴＥＳを混合物に添加し、９０℃で１２時間還流した。この後、得られたＮＨ２－官能化ＭｏＯ３－ＱＤを、トルエン、次いでエタノールを使用して繰り返し洗浄し、６０℃で真空乾燥した。４－ＭＢＡをＮＨ２官能化ＭｏＯ３－ＱＤに結合させるために、５ｍｇ過剰の４－ＭＢＡをＰＢＳ（ｐＨ ７．６）５ｍＬ中のＥＤＣ（２００μＬ、０．１Ｍ）及びＮＨＳ（１００μＬ、０．１Ｍ）の混合物と共に１時間撹拌して、４－ＭＢＡのカルボキシル基を活性化した。次いで、３ｍｇの調製したＮＨ２－官能化ＭｏＯ３－ＱＤを、得られた混合物に添加し、さらに６時間撹拌して、ＭｏＯ３－ＱＤの末端ＮＨ２を４－ＭＢＡのカルボン酸基にカルボジイミド結合させた。最後に、得られた生成物を遠心分離し、エタノールとアセトンの混合物（１：１）で３回洗浄し、６０℃で減圧乾燥して、新規なＳＥＲＳナノタグ（４－ＭＢＡ－ＭｏＯ３－ＱＤ）を得た。
【0065】
＜カルボキシル化磁性ナノ粒子（ＣｍａｇＮＰ）の合成＞
磁性ナノ粒子（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ；ｍａｇＮＰ）は、Ｚｈａｎｇらの方法（Zhang, Z.J., et al., 2014. J. Huazhong Univ. Sci. Technol. - Med.Sci. 34, 270-275）にしたがって調製した。得られたｍａｇＮＰを、Ｓａｆａｅｉ－Ｇｈｏｍｉらの方法（Safaei-Ghomi, J., et al., 2017. Ultrason Sonochem. 38, 488-495）にしたがって、無水コハク酸を用いてカルボキシル化し、カルボキシル化磁性ナノ粒子（ＣｍａｇＮＰ）を得た。
磁性ナノ粒子（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ；ｍａｇＮＰ）は、Ｚｈａｎｇらの方法（Zhang, Z.J., et al., 2014. J. Huazhong Univ. Sci. Technol. - Med.Sci. 34, 270-275）にしたがって調製した。得られたｍａｇＮＰを、Ｓａｆａｅｉ－Ｇｈｏｍｉらの方法（Safaei-Ghomi, J., et al., 2017. Ultrason Sonochem. 38, 488-495）にしたがって、無水コハク酸を用いてカルボキシル化し、カルボキシル化磁性ナノ粒子（ＣｍａｇＮＰ）を得た。
【0066】
具体的には、調製したｍａｇＮＰ ３ｍｇを反応媒体としての脱水トルエン１０ｍＬに溶解し、さらに０．２ｍｇの無水コハク酸を添加し、１２０℃で６時間還流した。その後、得られたカルボン酸末端を有するｍａｇＮＰ（ＣｍａｇＮＰ）をトルエン及びジエチルエーテルで３回繰り返し洗浄した。得られたＣｍａｇＮＰを外部磁石によって収集し、６０℃で真空乾燥した。
【0067】
＜Ｉｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰの作製＞
図１のＢに示すスキームのように、調製したＣｍａｇＮＰに、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド(ＥＤＣ／ＮＨＳ)カルボジイミド化学を用いて、抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体及びマレイミド含有化合物を同時に結合させた。
図１のＢに示すスキームのように、調製したＣｍａｇＮＰに、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド(ＥＤＣ／ＮＨＳ)カルボジイミド化学を用いて、抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体及びマレイミド含有化合物を同時に結合させた。
【0068】
具体的には、ＰＢＳ（ｐＨ ７．６）１ｍＬ中のＣｍａｇＮＰ ２ｍｇに０．１Ｍ（５ｍＬ）ＥＤＣを混合し、約１時間撹拌して、ＣｍａｇＮＰのカルボキシル基を有する活性エステル中間体を生成させた。次いで、２ｍＬの０．１Ｍ ＮＨＳ、５．２μｇの抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体、及びＮ－（２－アミノエチル）マレイミド（２ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を同時に活性化ＣｍａｇＮＰに添加して、ＣｍａｇＮＰのカルボン酸と、抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体及びＮ－（２－アミノエチル）マレイミドのアミノ基とのカルボジイミド化学反応を同時に促進した。混合物を４℃で８時間撹拌した後、得られた抗ＨＥＶ ＩｇＧ－マレイミド修飾ＣｍａｇＮＰ（Ｉｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰ）生成物を遠心分離により精製し、非結合抗体を除去するために磁気的に分離し、次いで非特異的相互作用を最小限にするために５％ＢＳＡと共にインキュベートした。さらに磁気分離を行って、過剰なＢＳＡを除去した。Ｉｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰを、使用されるまでに超純ＤＩ水中に再溶解するか、または４℃で冷蔵庫に保存した。
【0069】
ＥＬＩＳＡを用いてＩｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰの抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体の抗原結合能を確認し、タンパク質アッセイを用いて定量した。
抗ＨＥＶ ＩｇＧの代わり、ＮｏＶ－ＬＰｓ／ＮｏＶを検出するための抗ＮｏＶ抗体とマレイミド官能基を有するＩｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰも同様な手順に従って調製した。
抗ＨＥＶ ＩｇＧの代わり、ＮｏＶ－ＬＰｓ／ＮｏＶを検出するための抗ＮｏＶ抗体とマレイミド官能基を有するＩｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰも同様な手順に従って調製した。
【0070】
＜ｐＨ応答性ナノゲルの調製＞
ｐＨ応答性ナノゲル（ＮＧ）は、油中水型エマルションプロセスとグルタルアルデヒド（ＧＡ）を用いて、架橋剤としてのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とタンニン酸（ＴＡ）との間の静電相互作用により調製した（Zou, Y., et al., 2019. Macromol. Biosci. 19, 1-11）。
ｐＨ応答性ナノゲル（ＮＧ）は、油中水型エマルションプロセスとグルタルアルデヒド（ＧＡ）を用いて、架橋剤としてのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とタンニン酸（ＴＡ）との間の静電相互作用により調製した（Zou, Y., et al., 2019. Macromol. Biosci. 19, 1-11）。
【0071】
具体的には、ＰＥＩ １ｍＬ及びＴＡ ０．５ｍｇをトリトンＸ－１００（２ｍＬ）及びトルエン（５ｍＬ）の混合物に溶解した。得られた混合物を３０分間攪拌した後、生成したマイクロエマルションにＧＡ ０．５ｍＬを加え、さらに１２時間穏やかに攪拌した。この後、得られたＮＧを、アセトンを用いて沈殿させ、次いでエタノールで洗浄した。ＮＧをＤＩ水中に再分散させ、使用されるまで４℃にて保存した（図６の（ａ））。
【0072】
＜ＳＥＲＳナノタグ－ナノゲルの作製＞
Ｄｅｋａら（Deka, S.R., et al., 2010. Langmuir.26 (12) 10315-10324.）及びＬｉら（Li, Y., et al., 2018.Biomacromolecules. 19(6) 2062-2070.）の手順に従って、ＳＥＲＳナノタグをｐＨ応答性ナノゲル（ＮＧ）内に封入した。
Ｄｅｋａら（Deka, S.R., et al., 2010. Langmuir.26 (12) 10315-10324.）及びＬｉら（Li, Y., et al., 2018.Biomacromolecules. 19(6) 2062-2070.）の手順に従って、ＳＥＲＳナノタグをｐＨ応答性ナノゲル（ＮＧ）内に封入した。
【0073】
ＰＢＳ（ｐＨ ７．０）１ｍＬ中の５０μｇ／ｍＬのＮＧ及び０．５ｍｇ／ｍＬの４－ＭＢＡ－ＭｏＯ３－ＱＤを混合し、数滴の０．０１Ｍ ＨＣｌでｐＨを４．５に調節してＮＧの膨潤を誘導し、ＮＧの透過性を変化させ、ＳＥＲＳナノタグの封入を可能にした。０．０１Ｍ ＮａＯＨを滴下で添加し、４℃で穏やかに撹拌しながら、１時間インキュベートし、反応媒体のｐＨを再び７．４までゆっくりと増加させた。ｐＨ７．４で、反応液を約１時間放置して、ＳＥＲＳナノタグが封入されたＮＧ（本明細書において、場合によって「ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧ」又は単に「担持ＮＧ」と呼ぶ）を安定化した。
【0074】
＜Ｉｍｍｕｎｏ－ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧの作製＞
調製したＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧに抗ＨＥＶ ＩｇＧを下記の方法に従って結合させた。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）１ｍＬ中の１０．１μｇの抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体溶液に、２ｍＬのＥＤＣ（０．１Ｍ）を混合して、周囲温度で約１時間撹拌して、抗体のカルボキシル基を有する活性エステル中間体を生成させた。次いで、活性化された抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体に、ＮＨＳ（０．１Ｍ）２ｍＬ及び担持ＮＧ（２ｍｇ／ｍＬ）３ｍＬを添加し、混合物を４℃で８時間撹拌した。非特異的結合を排除するために、１０％ＢＳＡ溶液を添加して、抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体結合ＮＧ（本明細書において場合によって、「Ｉｍｍｕｎｏ－ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧ」、又は「担持イムノＮＧ」と呼ぶ）の表面を飽和させ、使用されるまでストック溶液を４℃で保存した。抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体結合体をＥＬＩＳＡにより確認し、ニンヒドリンタンパク質アッセイを用いて、ＮＧの表面に結合した抗ＨＥＶ ＩｇＧの量を決定した。ＳＥＲＳナノタグなしで同様の条件下で処理した抗体結合ＮＧ（本明細書において場合によって、「Ｉｍｍｕｎｏ－ＮＧ」と呼ぶ）を、免疫アッセイにおける陰性対照として使用した。
調製したＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧに抗ＨＥＶ ＩｇＧを下記の方法に従って結合させた。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）１ｍＬ中の１０．１μｇの抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体溶液に、２ｍＬのＥＤＣ（０．１Ｍ）を混合して、周囲温度で約１時間撹拌して、抗体のカルボキシル基を有する活性エステル中間体を生成させた。次いで、活性化された抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体に、ＮＨＳ（０．１Ｍ）２ｍＬ及び担持ＮＧ（２ｍｇ／ｍＬ）３ｍＬを添加し、混合物を４℃で８時間撹拌した。非特異的結合を排除するために、１０％ＢＳＡ溶液を添加して、抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体結合ＮＧ（本明細書において場合によって、「Ｉｍｍｕｎｏ－ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧ」、又は「担持イムノＮＧ」と呼ぶ）の表面を飽和させ、使用されるまでストック溶液を４℃で保存した。抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体結合体をＥＬＩＳＡにより確認し、ニンヒドリンタンパク質アッセイを用いて、ＮＧの表面に結合した抗ＨＥＶ ＩｇＧの量を決定した。ＳＥＲＳナノタグなしで同様の条件下で処理した抗体結合ＮＧ（本明細書において場合によって、「Ｉｍｍｕｎｏ－ＮＧ」と呼ぶ）を、免疫アッセイにおける陰性対照として使用した。
【0075】
ＨＥＶの代わりに、２０．５μｇの抗ＮｏＶ抗体を用いて、ＮｏＶを検出するためのＩｍｍｕｎｏ－ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧも同様な手順で作製した。
【0076】
＜２Ｄ六方晶窒化ホウ素ＳＥＲＳ基板の作製＞
２Ｄ六方晶窒化ホウ素（ｈ－ＢＮ）の固体基板を、調製したガラススライド上に、ｈ－ＢＮ分散液の滴下及び固定化によって調製した。
２Ｄ六方晶窒化ホウ素（ｈ－ＢＮ）の固体基板を、調製したガラススライド上に、ｈ－ＢＮ分散液の滴下及び固定化によって調製した。
【0077】
具体的には、μ－石英ガラススライドを１０ｍＬの酸性ピラニア溶液（Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２［３０％］の比率３：１）に浸漬し、続いて脱イオン水、次いでエタノールですすいだ。Ｎ２ガス流を用いてガラススライドを乾固し、次いで各スライドを７０℃で４時間真空オーブンに入れた。その後、ｈ－ＢＮ分散物を、オーブンで乾燥した石英スライド上に堆積させ、それをさらに７０℃の真空オーブン中に８時間置いて、ｈ－ＢＮコーティングを得た。
【0078】
〔実施例２ アッセイ及び結果〕
＜ＭｏＯ３－ＱＤの表面化学特性＞
合成したＭｏＯ３－ＱＤの表面化学特性は、Ｘ線電子分光法（ＸＰＳ）により評価した。ＸＰＳの結果を図３に示す。図３の（ａ）はワイドスキャンＸＰＳスペクトルを示し、（ａ）からは、２３６．６ｅＶ（Ｍｏ ３ｄ）、２８５．２５ｅＶ（Ｃ １ｓ）、４１２．５ｅＶ（Ｍｏ ３ｐ）及び５３２．４ｅＶ（Ｏ １ｓ）の結合エネルギーを有するピークが確認された。また、図３の（ｂ）からは、デコンボリューションされたＭｏ ３ｄピークは、ＭｏのＭｏ５＋酸化状態に帰属される２３６．４２ｅＶに典型的な強いピークを示すことが確認された。一方、ＭｏＯ３－ＱＤのＭｏ６＋状態は２３８．０５ｅＶで観測された。
＜ＭｏＯ３－ＱＤの表面化学特性＞
合成したＭｏＯ３－ＱＤの表面化学特性は、Ｘ線電子分光法（ＸＰＳ）により評価した。ＸＰＳの結果を図３に示す。図３の（ａ）はワイドスキャンＸＰＳスペクトルを示し、（ａ）からは、２３６．６ｅＶ（Ｍｏ ３ｄ）、２８５．２５ｅＶ（Ｃ １ｓ）、４１２．５ｅＶ（Ｍｏ ３ｐ）及び５３２．４ｅＶ（Ｏ １ｓ）の結合エネルギーを有するピークが確認された。また、図３の（ｂ）からは、デコンボリューションされたＭｏ ３ｄピークは、ＭｏのＭｏ５＋酸化状態に帰属される２３６．４２ｅＶに典型的な強いピークを示すことが確認された。一方、ＭｏＯ３－ＱＤのＭｏ６＋状態は２３８．０５ｅＶで観測された。
【0079】
ＭｏＯ３－ＱＤのサイズはＴＥＭで観察し、ＴＥＭ画像を図４の（ａ）に、サイズ（粒子径）分布を図４の（ｂ）に示す。図４から、ＭｏＯ３－ＱＤは凡そ３～９ｎｍの範囲内の粒子径（直径）を有するナノスケールドットであること、及び、その平均粒子径が６．０５±１．２ｎｍであることが確認された。さらに、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて記録された流体力学径（Ｄｈ）は５．７±３．３ｎｍであり、これはＴＥＭの結果に近い。
【0080】
【0081】
＜ｐＨ応答性ＮＧの特性＞
ナノゲル（ＮＧ）は、多量の内部空洞を有する３Ｄフレームワークを有することが知られている。作製したＮＧの形態をＴＥＭで評価したところ、平均粒子径が約２００±３５ｎｍであり、ＮＧが球状形態で均一に分散していることがわかった（図６の（ｂ））。また、水性媒体中のＮＧの流体力学径（Ｄｈ）は、ＮＧが水性媒体中に均一に分散していることを示す０．１８の多分散指数値で約２５７ｎｍのＤｈを示した。
ナノゲル（ＮＧ）は、多量の内部空洞を有する３Ｄフレームワークを有することが知られている。作製したＮＧの形態をＴＥＭで評価したところ、平均粒子径が約２００±３５ｎｍであり、ＮＧが球状形態で均一に分散していることがわかった（図６の（ｂ））。また、水性媒体中のＮＧの流体力学径（Ｄｈ）は、ＮＧが水性媒体中に均一に分散していることを示す０．１８の多分散指数値で約２５７ｎｍのＤｈを示した。
【0082】
＜ｐＨによって制御されるＳＥＲＳ Ｎａｎｏｔａｇｓの封入／放出＞
ＳＥＲＳナノタグの最適な担持（封入）及び放出条件は、ＴＥＭによってモニタリングし、決定した。
ＳＥＲＳナノタグの最適な担持（封入）及び放出条件は、ＴＥＭによってモニタリングし、決定した。
【0083】
ｐＨ７．４でＳＥＲＳナノタグをＮＧと混合した後、ｐＨ４．５に切り替え、１時間後、再びｐＨ７．４に戻した後、ＴＥＭ画像を記録した。図６の（ｂ）はｐＨ７．０での未処理ＮＧ（空のＮＧ）、（ｃ）はｐＨ７．４でのＳＥＲＳナノタグを担持したＮＧ（ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧ）、（ｄ）はｐＨ４．５における、ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧから、ＳＥＲＳナノタグ（４－ＭＢＡ－ＭｏＯ３－ＱＤ）の放出を示すＴＥＭ画像である。
【0084】
ｐＨ７．４での未処理のＮＧが約２３０ｎｍの粒子径を有する（ｂ）のに対して、ＳＥＲＳナノタグを担持したＮＧの粒子径は約２８６ｎｍ径まで増大した（ｃ）。また、ナノタグがＮＧの層内に完全に封入されていることは、（ｃ）の画像からはっきり確認できた。ｐＨを４．５に戻した際のナノタグ担持ＮＧのＴＥＭ画像（ｄ）において、ＮＧの粒子径が約３６０ｎｍまで増大し、ナノタグが外層の周囲に放出及び／又は分散しているのが確認でき、ＮＧのｐＨ応答性挙動を確認することができた。
【0085】
さらに、化学ペイロードシステムとしてのＮＧを評価するために、ｐＨ誘発膨潤及び脱膨潤実験を決定した。そのために、ＮＧ溶液のｐＨを０．０１ＭのＨＣｌ又はＮａＯＨを用いて変化させた。得られたＮＧの懸濁液を種々のｐＨ値で動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて追跡した。各ｐＨにおけるＮＧの遷移流体力学直径（Ｄｈ）の測定結果を図７（ａ）に示す。図７（ａ）により、ＮＧのＤｈがその環境ｐＨに厳密に反比例することが確認された。
【0086】
さらに、各ｐＨにおけるＮＧの流体力学容積（Ｖｈ）の測定結果を図７（ｂ）に示す。図７（ｂ）によれば、ｐＨ８から酸性レベルｐＨ４へのｐＨ媒体の遷移は、ＮＧの内部キャビティの流体力学容積（Ｖｈ）におけるラジカルシフトを、約６．０×１０２ｎｍ３から１．２×１０６ｎｍ３への比例した増加で誘導し、流体力学容積（Ｖｈ）の約２０００倍の増加を示した。４．０～９．０のｐＨ値では、ＮＧの臨界膨潤遷移が観察された。これは、合成に使用されるＰＥＩ及びＴＡ前駆体の比によって決定されるＮＧの表面電荷に依存した。
【0087】
ｐＨ応答性のナノタグの封入／放出は、さらにＤＬＳ及びゼータ電位分析を用いて観察した。ＤＬＳの結果を図８に示す。ｐＨ４．５におけるナノタグ担持ＮＧのＤｈは３５０ｎｍであるのに対して、未処理ＮＧが２３８ｎｍであり、両者の粒子径の差があることが確認された（図８の（ａ））。一方、最適な担持ｐＨ（７．４）では粒子径が３８０ｎｍであった。また、ＮＧの表面電荷の動力学を溶液媒体の異なるｐＨでのゼータ電位解析により調べた結果、ＮＧの表面電荷は環境ｐＨに厳密に依存することが分かった（データを示さず）。
【0088】
ナノタグのｐＨ制御された封入及び放出の決定的な評価は、ＵＶ－ｖｉｓ測定を用いて確認された。図８の（ｂ）に示すように、ＳＥＲＳナノタグ単独で確認された、ナノタグのＭｏＯ３－ＱＤの特徴的なプラズモン吸収は、ｐＨ７．４（最適なナノタグ担持ｐＨ）でＳＥＲＳナノタグを担持したＮＧにおいて殆ど確認できなかった。これは、図６（ｃ）のＴＥＭ画像によって示されるように、ナノタグがＮＧの空洞内に完全に捕捉・封入されたため、ナノタグが遮蔽されることに起因する。一方、ｐＨを４．５に戻すと、ＭｏＯ３－ＱＤの強いプラズモン吸収が観察され、これは、ＮＧのカプセル化層からのＳＥＲＳナノタグの放出を示す。
【0089】
＜標的ウイルスのＳＥＲＳイムノアッセイ＞
（サンドイッチプロトコル）
検出プロトコル、図２に示される。ＰＢＳ（ｐＨ７．６）又はヒト血清培地中のＨＥＶ－ＬＰ検出を試みた。免疫磁気的ウイルスの捕捉／単離工程、及び、サンドイッチプロトコルを介して行った。この方法は、特にヒト血清及び細胞培養上清中のＨＥＶ検出に非常に有益であった。磁気的に濃縮されたＨＥＶ－ＬＰ捕捉サンドイッチ免疫複合体を、最適化されたｐＨ制御プロトコルに従うｐＨ誘導ＳＥＲＳイムノアッセイに使用した。ＳＥＲＳナノタグ負荷イムノＮＧはｐＨ７．０～８．０で安定であり、したがって、生理的ｐＨ７．４でサンドイッチ複合体を形成する免疫反応は、封入されたナノタグを放出されなかった。ｐＨを４．５に変化した後、ＮＧはその空洞からナノタグを放出し、その後の２Ｄ ｈ－ＢＮ基板においてＳＥＲＳ検出を行った。ここで、サンドイッチ構造とは、標的物質であるウイルスを、Ｉｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰにおける抗体と、ＳＥＲＳナノタグ担持ＮＧにおける抗体の両方結合によって形成する複合体をいう。
（サンドイッチプロトコル）
検出プロトコル、図２に示される。ＰＢＳ（ｐＨ７．６）又はヒト血清培地中のＨＥＶ－ＬＰ検出を試みた。免疫磁気的ウイルスの捕捉／単離工程、及び、サンドイッチプロトコルを介して行った。この方法は、特にヒト血清及び細胞培養上清中のＨＥＶ検出に非常に有益であった。磁気的に濃縮されたＨＥＶ－ＬＰ捕捉サンドイッチ免疫複合体を、最適化されたｐＨ制御プロトコルに従うｐＨ誘導ＳＥＲＳイムノアッセイに使用した。ＳＥＲＳナノタグ負荷イムノＮＧはｐＨ７．０～８．０で安定であり、したがって、生理的ｐＨ７．４でサンドイッチ複合体を形成する免疫反応は、封入されたナノタグを放出されなかった。ｐＨを４．５に変化した後、ＮＧはその空洞からナノタグを放出し、その後の２Ｄ ｈ－ＢＮ基板においてＳＥＲＳ検出を行った。ここで、サンドイッチ構造とは、標的物質であるウイルスを、Ｉｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰにおける抗体と、ＳＥＲＳナノタグ担持ＮＧにおける抗体の両方結合によって形成する複合体をいう。
【0090】
マレイミド官能化ＣｍａｇＮＰ（Ｉｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰ）と、マレイミド部分を含まないＩｍｍｕｎｏ－ＣｍａｇＮＰ（コントロール）を比較した。ＰＢＳ（ｐＨ７．０）又は５０％ヒト血清中において、２ｍＬのＳＥＲＳナノタグを担持したＩｍｍｕｎｏ－ＮＧ（Ｉｍｍｕｎｏ－ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧ）を１．５ｍＬのＩｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰと混合し、これにＨＥＶ－ＬＰ（具体的な濃度はその都度決めれば良いので、ここのでは明記しなくても良いと思います。実際使用の際００９３のように１０～１０６ｆｇ／ｍLの範囲で行っています。）を添加した。コントロールとして、Ｉｍｍｕｎｏ－ＣｍａｇＮＰを用いた。混合液を３０分間インキュベートしたのち、外部磁石を用いて、形成されたサンドイッチ免疫複合体を回収した。ＰＢＳで３回洗浄した後、得られた免疫複合体を１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）の溶液中に再懸濁し、０．１ＭのＨＣｌを添加することによってｐＨを４．５に変更して、封入されたＳＥＲＳナノタグを放出させた。次いで、５０μＬのナノタグ担持Ｉｍｍｕｎｏ－ＮＧ／ＨＥＶ－ＬＰ／Ｉｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰ複合体を含む溶液を、ＳＥＲＳ測定のために外部磁場に置かれた２Ｄ ｈ－ＢＮコーティングガラス基板に移した。
【0091】
Ｉｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰ又はＩｍｍｕｎｏ－ＣｍａｇＮＰの存在で、形成されたサンドイッチ免疫複合体の４－ＭＢＡのＳＥＲＳスペクトルを図９に示す。マレイミド官能化ＣｍａｇＮＰにＳＥＲＳナノタグの４－ＭＢＡのＳＥＲＳシグナルが観察されたのに対して、マレイミド部分を含まないＣｍａｇＮＰは、４－ＭＢＡのＳＥＲＳシグナルが観察されなかった。マレイミド部分はＳＥＲＳナノタグの結合を媒介することが証明された。
【0092】
（Ｅ型肝炎ウイルス様粒子（ＨＥＶ－ＬＰ）のＳＥＲＳ検出）
ＨＥＶ－ＬＰを用いて、ＳＥＲＳに基づくＨＥＶ免疫アッセイのための最適なプロトコルを開発した。手順は、上記サンドイッチプロトコルと同じであった。
ＨＥＶ－ＬＰを用いて、ＳＥＲＳに基づくＨＥＶ免疫アッセイのための最適なプロトコルを開発した。手順は、上記サンドイッチプロトコルと同じであった。
【0093】
具体的には、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）又は５０％ヒト血清中において、２ｍＬのＳＥＲＳナノタグを担持したＩｍｍｕｎｏ－ＮＧ（Ｉｍｍｕｎｏ－ＳＥＲＳ ｎａｎｏｔａｇ＠ＮＧ）を１．５ｍＬのＩｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰと混合し、この混合液に種々の力価（０（添加なし）、１０ｆｇ／ｍＬ、１００ｆｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１．０ｎｇ／ｍＬ）のＨＥＶ－ＬＰを添加した。混合液を３０分間インキュベートしたのち、外部磁石を用いて、形成されたサンドイッチ免疫複合体を回収した。ＰＢＳで３回洗浄した後、得られた免疫複合体を１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）の溶液中に再懸濁し、０．１ＭのＨＣｌを添加することによってｐＨを４．５に変更して、封入されたＳＥＲＳナノタグを放出させた。次いで、５０μＬのナノタグ担持Ｉｍｍｕｎｏ－ＮＧ／ＨＥＶ－ＬＰ／Ｉｍｍｕｎｏ－ｍａｌ－ＣｍａｇＮＰ複合体を含む溶液を、ＳＥＲＳ測定のために外部磁場に置かれた２Ｄ ｈ－ＢＮコーティングガラス基板に移した。ＳＥＲＳ測定の結果を図１０に示す。
【0094】
図１０の（ａ）から、ＳＥＲＳナノタグ（４－ＭＢＡのラマンバンド）のシグナル応答が、ＨＥＶ－ＬＰ濃度依存的にラマンシグナルが増加したことが確認された。より多くのＳＥＲＳナノタグが放出され、ターゲットＨＥＶ－ＬＰの濃度が高くなると「ホットスポット」クラスターを形成したことを示唆した。
【0095】
図１０の（ａ）の結果を基に、１０９８ｃｍ－１における４－ＭＢＡの特徴的なラマンバンドを用いて、ＳＥＲＳ強度とＨＥＶ－ＬＰの濃度の検量線（ＳＥＲＳ強度対ＨＥＶ－ＬＰ濃度のｌｏｇ変換の較正プロット）を作成した（図１０（ｂ））。ＨＥＶ－ＬＰの検出限界（ＬＯＤ）は、ＰＢＳ中で約６．５ｆｇ／ｍＬであり、ヒト血清中で約８９ｆｇ／ｍＬであると計算された。
【0096】
さらに、コーティングなしのベアグラス基板を用いたＳＥＲＳ免疫アッセイ（ＰＢＳ中）を行った。その結果を図１１（ａ）に示す。ベアグラス上のＨＥＶ－ＬＰの検出限界（ＬＯＤ）は２．８ｐｇ／ｍＬであると計算された。これは、化学的にＳＥＲＳ活性な２Ｄ ｈ－ＢＮ基板の分析感度と比較して、１０３のオーダーではるかに低かった。すなわち、６．５ｆｇ／ｍＬ（２Ｄ ｈ－ＢＮ基板）及び２．８ｐｇ／ｍＬ（ベアガラス）のＬＯＤは、それぞれ１０２粒子／ｍＬ及び１０５粒子／ｍＬのＨＥＶ－ＬＰ検出能力に対応する。この感度の大きな差異は、プラズモンＭｏＯ３－ＱＤ及び２Ｄ ｈ－ＢＮ基板の相乗的なＳＥＲＳ活性（電磁及び化学メカニズム）に特に起因すると考えられる。この結果は、ＳＥＲＳに基づく検出における化学機構の寄与を介したＳＥＲＳ増強における２Ｄ基板材料の重要性を実証した。
【0097】
（臨床試料中の標的ウイルスＧ７ＨＥＶのＳＥＲＳ検出）
開発されたＳＥＲＳに基づく免疫アッセイ技術の汎用性を実証するために、臨床試料中の標的ウイルスＧ７ＨＥＶの検出を行った。したがって、細胞培養上清から抽出されたＧ７ＨＥＶは、ＨＥＶ－ＬＰについての最適化された検出プロトコルに従って検出された。
開発されたＳＥＲＳに基づく免疫アッセイ技術の汎用性を実証するために、臨床試料中の標的ウイルスＧ７ＨＥＶの検出を行った。したがって、細胞培養上清から抽出されたＧ７ＨＥＶは、ＨＥＶ－ＬＰについての最適化された検出プロトコルに従って検出された。
【0098】
ＳＥＲＳ分析の前にＨＥＶを濃縮するために、さらなる洗浄工程及び前混合培地における免疫磁気分離／単離が必要であった。細胞培養上清からのＧ７ＨＥＶの検出は、１０２～１０６ＲＮＡコピー／ｍＬの濃度範囲内で可能であり、８７．３ＲＮＡコピー／ｍＬのＬＯＤが達成された。異なる濃度のＨＥＶを用いた直線検量線（図１１の（ｂ））のＲ２値は０．９９２９であり、これは２Ｄ ｈ－ＢＮ基板上での検出のために良好なＲ２値である。したがって、臨床試料分析結果は、複雑なマトリックスを有する試料におけるＨＥＶ検出の高感度及び選択性をもたらす、開発されたＳＥＲＳに基づくイムノアッセイの確実性及び干渉のないことが実証された。
【0099】
（ノロウイルス（ＮｏＶ）のＳＥＲＳ検出）
感染した患者の糞便から抽出された臨床ＮｏＶ（ＧＩＩ．３）を同様な方法で検出した。１０～１０５ ＲＮＡコピー／ｍＬの範囲で、１０ＲＮＡコピー／ｍＬレベルまでＮｏＶを検出できた（図１２の（ａ））。用いた検体をＥＬＩＳＡ及びラテラルフローイムノアッセイに基づくＮｏＶアッセイ用の市販キットの感度と比較したところ、それぞれ約１０３ＲＮＡコピー／ｍＬ、及び約１０５ＲＮＡコピー／ｍＬ検出した。この結果は、本発明のアッセイが、臨床サンプル中のＮｏＶの検出における大きな進歩であることを示唆した。
感染した患者の糞便から抽出された臨床ＮｏＶ（ＧＩＩ．３）を同様な方法で検出した。１０～１０５ ＲＮＡコピー／ｍＬの範囲で、１０ＲＮＡコピー／ｍＬレベルまでＮｏＶを検出できた（図１２の（ａ））。用いた検体をＥＬＩＳＡ及びラテラルフローイムノアッセイに基づくＮｏＶアッセイ用の市販キットの感度と比較したところ、それぞれ約１０３ＲＮＡコピー／ｍＬ、及び約１０５ＲＮＡコピー／ｍＬ検出した。この結果は、本発明のアッセイが、臨床サンプル中のＮｏＶの検出における大きな進歩であることを示唆した。
【0100】
（標的ウイルスの特異的及び選択的検出）
開発されたＳＥＲＳに基づくイムノアッセイを用いて、標的ウイルスＨＥＶ－ＬＰの検出特異性を調べた。干渉ウイルスとして、インフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）、Ｚｉｋａ、ＮｏＶ－ＬＰ及びデングＤＮＡを別々に免疫アッセイで干渉試験した。その結果、夾雑物の有無に影響されることなく、安定してＳＥＲＳ応答を得ることができた（図１２の（ｂ））。
開発されたＳＥＲＳに基づくイムノアッセイを用いて、標的ウイルスＨＥＶ－ＬＰの検出特異性を調べた。干渉ウイルスとして、インフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）、Ｚｉｋａ、ＮｏＶ－ＬＰ及びデングＤＮＡを別々に免疫アッセイで干渉試験した。その結果、夾雑物の有無に影響されることなく、安定してＳＥＲＳ応答を得ることができた（図１２の（ｂ））。
【0101】
図１２の（ｂ）に示された結果は、標的ＨＥＶ検出は、試験された生体分子又はウイルスＲＮＡの５×１０３コピー／ｍＬまでであっても、干渉なしに行うことができることを示した。
【0102】
（検出の再現性及び安定性の実証）
開発されたＳＥＲＳに基づくイムノアッセイの再現性のあるＳＥＲＳシグナルの生成能力をさらに試験し、実証した。
開発されたＳＥＲＳに基づくイムノアッセイの再現性のあるＳＥＲＳシグナルの生成能力をさらに試験し、実証した。
【0103】
２Ｄ ｈ－ＢＮ基板上のランダムにサンプリングした１００以上のスポットから発生したＳＥＲＳ信号の平均強度を収集した（図１３の（ａ）、（ｂ））。１０９８ｃｍ－１におけるＳＥＲＳナノタグの４－ＭＢＡのラマンバンドの強度値／増強因子（ＥＦｓ）を用いて、平均計算強度からのシグナルの相対標準偏差（ＲＳＤ）を計算した。これをさらに用いて、ＳＥＲＳナノタグシグナルの均一性及び再現性を評価した。
【0104】
その結果は、各スポットが、いくらかのシグナル強度変動を伴うが、強いＳＥＲＳシグナルを生成できることを実証した（図１３の（ｃ）、（ｄ）。また、計算したＲＳＤは５．９５％であり、８％以下の偏差を示し、２Ｄ ｈ－ＢＮ基板上のＳＥＲＳナノタグ及び免疫アッセイプロセスの優れたスポット間再現性を示した。さらに、開発されたＳＥＲＳに基づくイムノアッセイの安定性の試験を１ヶ月間にわたって実施した結果、信頼できるＳＥＲＳシグナルが、イムノアッセイの３週間以内にその初期出力を損なうことなく依然として得られることが実証された（データ示さず）。
【0105】
上記のように、本発明者らは、インビボ薬物ペイロード／送達システムに類似したナノゲルの技術を、ウイルスなどの標的物質のＳＥＲＳによる検出に応用した。そのため、新規ＳＥＲＳナノタグとしてプラズモンＭｏＯ３－ＱＤを用い、また、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）又はノロウイルス（ＮｏＶ）の検出においてナノゲル（ＮＧ）のｐＨ応答性挙動を利用した。ナノゲルに封入されたＳＥＲＳナノタグのｐＨ誘導性の放出は、ナノタグ－マレイミド結合親和性によって駆動される、操作された局所的なＳＥＲＳ「ホットスポット」領域をもたらした。ウイルスなどの標的物質濃縮のためにｍａｌ－ＣｍａｇＮＰの磁気特性を利用することにより、２Ｄ六方晶窒化ホウ素基板上の磁気プルダウン／作動プロセスが達成され、検出のためのナノタグのＳＥＲＳ活性が増強された。
【0106】
この戦略により、開発された開発されたＳＥＲＳに基づくイムノアッセイの感度は、使用されたナノタグ／２Ｄ基板システムの相乗的な寄与のために、プラズモンＭｏＯ３－ＱＤ単独（ベアガラス基板上）では到達できない閾値まで大幅に増加した。さらに、この開発されたＳＥＲＳに基づくイムノアッセイは、臨床試料中のウイルス検出のための再現可能なＳＥＲＳシグナルを生成できるだけでなく、ＮＧ又はｍａｌ－ＣｍａｇＮＰ上の抗体を変えるだけで、様々なウイルスを検出することができる。特に、ＳＥＲＳナノタグに対するナノゲルによる保護戦略は、複雑な環境におけるＳＥＲＳナノタグの安定性及び安全性を向上させ、また、将来のさらなる安定性及び安全性の向上が期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
