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特開2022-107646アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022107646
(43)【公開日】2022-07-22
(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/35 20060101AFI20220714BHJP
C07K 14/015 20060101ALI20220714BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220714BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220714BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220714BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220714BHJP
【ＦＩ】
C12N15/35
C07K14/015 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
C12N7/01
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022080954
(22)【出願日】2022-05-17
(62)【分割の表示】P 2018564682の分割
【原出願日】2018-01-29
(31)【優先権主張番号】P 2017014377
(32)【優先日】2017-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 医療分野研究成果展開事業 研究成果最適展開支援プログラム 「ＡＡＶ中空粒子を用いる臓器特異的ＤＤＳの臨床応用に向けた開発」 委託事業 産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】500557048
【氏名又は名称】学校法人日本医科大学
(71)【出願人】
【識別番号】510147776
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター
(71)【出願人】
【識別番号】302019245
【氏名又は名称】タカラバイオ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】岡田 尚巳
(72)【発明者】
【氏名】岡田 浩典
(72)【発明者】
【氏名】喜納 裕美
(72)【発明者】
【氏名】榎 竜嗣
(72)【発明者】
【氏名】西江 敏和
(72)【発明者】
【氏名】峰野 純一
(57)【要約】
【課題】組換えＡＡＶによる標的細胞への遺伝子導入効率の向上及び／又は遺伝子発現効率の向上のために、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を提供すること。
【解決手段】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体であって、該変異体は、野生型のＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比べてＰＬＡ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、該変異体は、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ（但し、マーモセット由来のＡＡＶを除く）の変異体であり、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号２で示される野生型のＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における（１）３位、（２）６位、および（３）６８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がそれぞれ、（１）セリンまたはトレオニンへの置換、（２）リシン、アルギニンまたはヒスチジンへの置換、および（３）バリン、ロイシンまたはイソロイシンへの置換である、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体であって、該変異体は、野生型のＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比べてＰＬＡ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、該変異体は、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ（但し、マーモセット由来のＡＡＶを除く）の変異体であり、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号２で示される野生型のＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における（１）３位、（２）６位、および（３）６８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がそれぞれ、（１）セリンまたはトレオニンへの置換、（２）リシン、アルギニンまたはヒスチジンへの置換、および（３）バリン、ロイシンまたはイソロイシンへの置換である、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体であって、該変異体は、野生型のＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比べてＰＬＡ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
該変異体は、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ（但し、マーモセット由来のＡＡＶを除く）の変異体であり、
該少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号２で示される野生型のＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における（１）３位、（２）６位、および（３）６８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がそれぞれ、（１）セリンまたはトレオニンへの置換、（２）リシン、アルギニンまたはヒスチジンへの置換、および（３）バリン、ロイシンまたはイソロイシンへの置換である、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体。
該変異体は、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ（但し、マーモセット由来のＡＡＶを除く）の変異体であり、
該少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号２で示される野生型のＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における（１）３位、（２）６位、および（３）６８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がそれぞれ、（１）セリンまたはトレオニンへの置換、（２）リシン、アルギニンまたはヒスチジンへの置換、および（３）バリン、ロイシンまたはイソロイシンへの置換である、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体。
【請求項2】
配列番号２で示される野生型のＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における（１）３位、（２）６位、および（３）６８位に対応する位置のアミノ酸置換がそれぞれ、（１）トレオニンへの置換、（２）ヒスチジンへの置換、および（３）バリン、ロイシンまたはイソロイシンへの置換である、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体。
【請求項3】
請求項１または２に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸。
【請求項4】
請求項３に記載の核酸を含む細胞。
【請求項5】
請求項４に記載の細胞を培養して組換えＡＡＶ粒子を産生させる工程を包含する、組換えＡＡＶ粒子の製造方法。
【請求項6】
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸、ＡＡＶ粒子形成に必要なアデノウイルス由来要素をコードする核酸およびＡＡＶゲノムＤＮＡの塩基配列を有する核酸をさらに含む請求項４に記載の細胞を培養する工程を包含する、請求項５に記載の組換えＡＡＶ粒子の製造方法。
【請求項7】
請求項１または２に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を含む組換えＡＡＶ粒子。
【請求項8】
請求項７に記載の組換えＡＡＶ粒子を含む組成物。
【請求項9】
請求項７に記載の組換えＡＡＶ粒子を標的細胞に接触させる工程を含む、標的細胞へのイン・ビトロ遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体に関する。本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体は、特に標的細胞への遺伝子の導入及び／又は標的細胞での導入遺伝子の発現に有用である。
【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）は、ヒトや霊長目などの哺乳動物に感染する直径約２０ｎｍの非エンベロープウイルスで、パルボウイルス科、ディペンドウイルス属に分類される。現在までに、多数のＡＡＶの血清型が同定されており（例えば、非特許文献１）、血清型によって感染する動物種や細胞種が異なることが知られている。
【0003】
ＡＡＶゲノムはおよそ４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ）で、両端にはそれぞれ約１４５塩基の逆方向末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ：ＩＴＲ）配列がある。ＩＴＲ配列はそれ自身がワトソン－クリック塩基対を形成し、ＡＡＶゲノムの複製やパッケージングに必要なシスエレメントを含むＴ型のヘアピン構造を形成する。ＡＡＶゲノムのＩＴＲ配列に挟まれた領域には、２つのオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）が存在する。片方のＯＲＦ（ｒｅｐ遺伝子とも呼ばれる）は４種のＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）をコードし、もう片方のＯＲＦ（ｃａｐ遺伝子とも呼ばれる）は３種のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）及び集合活性化タンパク質（ａｓｓｅｍｂｌｙ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＡＰ）をコードする。Ｒｅｐタンパク質はヘリカーゼ活性をもち、外殻形成を引き起こすために必要であるとともに、ＡＡＶゲノムが宿主細胞の染色体へ組込まれるためにも必要である。一方、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、１：１：１０の比率で合計６０の分子が集合し、正二十面体のＡＡＶ外殻を形成する。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の主な違いはＮ末端領域で、例えば、ＶＰ１のＮ末端にはホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２：ＰＬＡ２）ドメインが存在する。ＰＬＡ２ドメインはＶＰ１にのみ存在するため、ＶＰ１のＮ末端領域はＶＰ１特異領域（ＶＰ１ ｕｎｉｑｕｅ ｒｅｇｉｏｎ：ＶＰ１ｕ）とも呼ばれる。ＰＬＡ２ドメインは、通常はＡＡＶ粒子の内側に存在するが酸性条件下ではＡＡＶ粒子の外側に露出することが知られており、細胞内に侵入したＡＡＶがエンドソームから回避し核移入する際などに必要であると考えられている（非特許文献２）。なお、ＡＡＰはＡＡＶ外殻の形成に必要なタンパク質である。
【0004】
自然界でのＡＡＶの複製はアデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在に左右される。すなわち、ヘルパーウイルスが存在する場合、ＡＡＶゲノムは宿主細胞内で複製され、ＡＡＶゲノムを含む完全なＡＡＶ粒子が形成され、ＡＡＶ粒子は宿主細胞から放出される。一方、ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶゲノムはエピソームに維持されるか又は宿主染色体に組込まれ、潜伏状態となる。
【0005】
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であることなどから、先天性遺伝子疾患の治療の他、癌や感染症の治療を目的とした遺伝子治療法に用いる遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が、近年注目されている。
【0006】
遺伝子組換えＡＡＶ（以下、組換えＡＡＶ）の製造は、通常、ＡＡＶ粒子形成に必須な要素を核酸構築物の形で細胞に導入することにより、ウイルスを産生する能力を有する細胞（以下、ウイルス産生細胞）を作製し、当該細胞を培養してＡＡＶ粒子形成に必須な要素を発現させることで行われる。一般的には、前記ＡＡＶ粒子形成に必須な要素のうち、シス供給を要するものとトランス供給可能なものとをそれぞれ別の核酸構築物として細胞に導入することで、野生型ＡＡＶの産生、及び組換えＡＡＶの感染先での自立複製を防ぐ方法が取られる。
【0007】
すなわち、一般的には、以下の３種のプラスミドを細胞に導入することにより、ウイルス産生細胞を作製する。１）両端のＩＴＲ配列を残し、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子を除去し、代わりに所望の異種ポリヌクレオチド（導入遺伝子と記載する場合もある）を搭載した組換えＡＡＶゲノム、を供給するためのプラスミド（以下、ベクタープラスミド）、２）Ｒｅｐタンパク質とキャプシドタンパク質とを供給するためのプラスミド（以下、パッケージングプラスミド）、３）アデノウイルス由来要素のうち、ＡＡＶ粒子形成に必須な要素のみを供給するためのプラスミド（以下、ヘルパープラスミド）。
【0008】
所望の異種ポリヌクレオチドを搭載した組換えＡＡＶ粒子を使用することで、さまざまな標的細胞または標的臓器に長期的に安定した遺伝子導入が可能である。現在までに、骨格筋細胞、肝細胞（肝臓）、心筋細胞（心臓）、神経細胞、膵腺細胞、膵島細胞に遺伝子を導入できることが示されている。更に組換えＡＡＶは、ヒト臨床試験において使用された実績を有する。
【0009】
一方で、キャプシドタンパク質を改変することにより、ＡＡＶの細胞指向性を変化させたり（特許文献１）、遺伝子導入効率を向上させたりする試み（例えば、特許文献２や特許文献３）が行われている。例えば、特許文献２には、ＡＡＶの外殻表面に存在にする抗原性の残基を別のアミノ酸に置換することにより、中和抗体によるＡＡＶ粒子の除去を回避することでＡＡＶは長時間生体内で存在可能となり、結果として遺伝子導入効率が向上することが記載されている。また、特許文献３には、ＡＡＶの外殻表面に存在にするチロシン残基を別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）に置換することにより、細胞内でのチロシンのユビキチン化が阻害され、ＡＡＶはユビキチン－プロテアソーム系加水分解を回避することにより長時間生体内で存在可能となり、結果として遺伝子導入効率が向上することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】国際公開第ＷＯ２０１４／１０３９５７号パンフレット
【特許文献2】国際公開第ＷＯ２０１４／１９４１３２号パンフレット
【特許文献3】国際公開第ＷＯ２００８／１２４７２４号パンフレット
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第２１巻、１２５１－１２５７頁、２０１０年
【非特許文献2】Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７９巻、５２９６－５３０３頁、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
上述のように、これまでに、ＡＡＶキャプシドタンパク質を改変することにより、遺伝子導入効率を向上させる試みが行われてきた。しかし、組換えＡＡＶによる遺伝子導入効率の向上及び／又は遺伝子発現効率の向上には、未だ改善の余地がある。すなわち、標的細胞へのＡＡＶの感染及び導入遺伝子の発現は複数のステップを経るため、各ステップを改善することにより、相乗的に、遺伝子導入効率の向上及び／又は遺伝子発現効率の向上が可能であると考えられる。
【0013】
本発明の目的は、組換えＡＡＶによる標的細胞への遺伝子導入効率の向上及び／又は遺伝子発現効率の向上のために、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、新規のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を利用することにより、高効率で標的細胞に所望の遺伝子を導入し、該細胞内で該遺伝子を強く発現させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【0015】
すなわち、本発明は
［１］アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体であって、該変異体は野生型のＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比べてＰＬＡ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、当該アミノ酸置換は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
（１）３位のアラニン、
（２）６位のチロシン、
（３）６８位のアラニン、
（４）８７位のアスパラギン酸、
（５）９１位のロイシン、
（６）１４９位のセリン、
（７）１５０位のプロリン、および
（８）１５６位のセリン
からなる群より選択される１以上の位置、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（８）に対応する1以上の位置にある、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体、
［２］アミノ酸置換が、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
（１）３位のアラニンからトレオニンへの置換（Ａ３Ｔ）、
（２）６位のチロシンからヒスチジンへの置換（Ｙ６Ｈ）、
（３）６８位のアラニンからバリンへの置換（Ａ６８Ｖ）、
（４）８７位のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換（Ｄ８７Ｎ）、
（５）９１位のロイシンからプロリンへの置換（Ｌ９１Ｐ）、
（６）１４９位のセリンからチロシンへの置換（Ｓ１４９Ｙ）、
（７）１５０位のプロリンからヒスチジンへの置換（Ｐ１５０Ｈ）、および
（８）１５６位のセリンからチロシンへの置換（Ｓ１５６Ｙ）
からなる群より選択される１以上のアミノ酸置換、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（８）に対応する1以上のアミノ酸置換である、［１］に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体、
［３］アミノ酸置換が、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
（１）３位のアラニンからトレオニンへの置換（Ａ３Ｔ）、
（２）６位のチロシンからヒスチジンへの置換（Ｙ６Ｈ）、および
（３）６８位のアラニンからバリンへの置換（Ａ６８Ｖ）
からなる群より選択される１以上のアミノ酸置換、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（３）に対応する1以上のアミノ酸置換である、［１］に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体、
［４］ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の変異体である、［１］～［３］のいずれかに記載の変異体、
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸、
［６］［５］に記載の核酸を含む細胞、
［７］［６］に記載の細胞を培養して組換えＡＡＶ粒子を産生させる工程を包含する、組換えＡＡＶ粒子の製造方法、
［８］ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸、ＡＡＶ粒子形成に必要なアデノウイルス由来要素をコードする核酸およびＡＡＶゲノムＤＮＡの塩基配列を有する核酸をさらに含む［６］に記載の細胞を培養する工程を包含する、［７］に記載の組換えＡＡＶ粒子の製造方法、
［９］［１］～［４］のいずれかに記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を含む組換えＡＡＶ粒子、
［１０］［９］に記載の組換えＡＡＶ粒子を含む組成物、および
［１１］［９］に記載の組換えＡＡＶ粒子を標的細胞に接触させる工程を含む、標的細胞への遺伝子導入方法
に関する。
［１］アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体であって、該変異体は野生型のＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比べてＰＬＡ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、当該アミノ酸置換は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
（１）３位のアラニン、
（２）６位のチロシン、
（３）６８位のアラニン、
（４）８７位のアスパラギン酸、
（５）９１位のロイシン、
（６）１４９位のセリン、
（７）１５０位のプロリン、および
（８）１５６位のセリン
からなる群より選択される１以上の位置、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（８）に対応する1以上の位置にある、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体、
［２］アミノ酸置換が、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
（１）３位のアラニンからトレオニンへの置換（Ａ３Ｔ）、
（２）６位のチロシンからヒスチジンへの置換（Ｙ６Ｈ）、
（３）６８位のアラニンからバリンへの置換（Ａ６８Ｖ）、
（４）８７位のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換（Ｄ８７Ｎ）、
（５）９１位のロイシンからプロリンへの置換（Ｌ９１Ｐ）、
（６）１４９位のセリンからチロシンへの置換（Ｓ１４９Ｙ）、
（７）１５０位のプロリンからヒスチジンへの置換（Ｐ１５０Ｈ）、および
（８）１５６位のセリンからチロシンへの置換（Ｓ１５６Ｙ）
からなる群より選択される１以上のアミノ酸置換、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（８）に対応する1以上のアミノ酸置換である、［１］に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体、
［３］アミノ酸置換が、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
（１）３位のアラニンからトレオニンへの置換（Ａ３Ｔ）、
（２）６位のチロシンからヒスチジンへの置換（Ｙ６Ｈ）、および
（３）６８位のアラニンからバリンへの置換（Ａ６８Ｖ）
からなる群より選択される１以上のアミノ酸置換、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（３）に対応する1以上のアミノ酸置換である、［１］に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体、
［４］ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の変異体である、［１］～［３］のいずれかに記載の変異体、
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸、
［６］［５］に記載の核酸を含む細胞、
［７］［６］に記載の細胞を培養して組換えＡＡＶ粒子を産生させる工程を包含する、組換えＡＡＶ粒子の製造方法、
［８］ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸、ＡＡＶ粒子形成に必要なアデノウイルス由来要素をコードする核酸およびＡＡＶゲノムＤＮＡの塩基配列を有する核酸をさらに含む［６］に記載の細胞を培養する工程を包含する、［７］に記載の組換えＡＡＶ粒子の製造方法、
［９］［１］～［４］のいずれかに記載のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を含む組換えＡＡＶ粒子、
［１０］［９］に記載の組換えＡＡＶ粒子を含む組成物、および
［１１］［９］に記載の組換えＡＡＶ粒子を標的細胞に接触させる工程を含む、標的細胞への遺伝子導入方法
に関する。
【発明の効果】
【0016】
本発明により、標的細胞への遺伝子導入に有用な遺伝子導入システムが提供される。本発明の組換えＡＡＶ粒子は、高効率で標的細胞に遺伝子を導入し、標的細胞内に導入した遺伝子を高効率で転写させ、強く発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【発明を実施するための形態】
【0018】
本明細書において「アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）」とは、パルボウイルス科、ディペンドウイルス属に分類される、ヒトを含む霊長目の動物やその他の哺乳類に感染する小型のウイルスを指す。ＡＡＶはエンベロープを持たない正２０面体の外殻とその内部に一本鎖ゲノムＤＮＡを有する。本明細書において、特に記載する場合を除き、ＡＡＶは野生型ウイルス及びその派生物を含み、また、全ての血清型及びクレードを含む。なお、本明細書においてＡＡＶ粒子の血清型について述べる場合、キャプシドの由来となる血清型を基準とする。すなわち、組換えＡＡＶ粒子の調製時に使用されるｃａｐ遺伝子の由来に基づいてその組換えＡＡＶ粒子の血清型を決定するものとし、組換えＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノムの血清型には依存しないものとする。例えば、キャプシドタンパク質がＡＡＶ６由来で、組換えＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノム中のＩＴＲ配列がＡＡＶ２由来の場合は、本明細書中では当該組換えＡＡＶ粒子は血清型６とする。
【0019】
本明細書において「キャプシドタンパク質」とは、ウイルスのゲノムに存在するｃａｐ遺伝子にコードされるタンパク質で、ウイルスの外殻を構成するタンパク質を意味する。野生型ＡＡＶゲノムまたはｃａｐ遺伝子は、３種類のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）をコードする。本明細書においては、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のいずれもがキャプシドタンパク質に含まれる。
【0020】
本明細書において「ＡＡＶ粒子」とは、完全な外殻構造を持つ粒子を意味する。外殻の内側にＡＡＶゲノムを含んでいてもよいし、ＡＡＶゲノムを含んでいなくてもよい。すなわち、本明細書において、組換えＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子（ＡＡＶベクターと呼ぶこともある）も、ＡＡＶゲノムを含んでいないＡＡＶ様粒子（例えば、ＡＡＶ中空粒子：国際公開第２０１２／１４４４４６号パンフレット）もＡＡＶ粒子の範疇である。
【0021】
本明細書において「組換え」とは、遺伝子組換え技術を用いて作製することを意味する。すなわち、例えば、組換えＡＡＶ粒子とは遺伝子組換え技術を用いて作製されたＡＡＶ粒子を意味し、組換えＤＮＡとは遺伝子組換え技術を用いて作製されたＤＮＡを意味する。
【0022】
本明細書において「野生型」とは、種の中で、野生の集団に最も多くみられる型を意味する。突然変異型に対して、野生型は基本と考えられる表現型またはその個体を指す。野生型は、別名として「正常型」とも呼ばれる。一方、本明細書において「変異体」とは、変異を起こした遺伝子が形質的な変化として現れているタンパク質、ウイルス、細胞、個体などを意味する。また、本明細書において「変異体」とは、変異を起こした遺伝子自体を指すこともある。
【0023】
本明細書において「アミノ酸置換」とは、非同義な（ｎｏｎ－ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）変異により、タンパク質分子中のあるアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。アミノ酸置換は種間や個体差に起因して天然に生ずるものであってもよく、また、人工的に誘発されたものであってもよい。人工的な誘発は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、ポリペプチドをコードする核酸に塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入を導入することにより、当該ポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造することができる。
【0024】
本発明を以下に詳細に説明する。
（Ｉ）ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体
本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体は、ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換されることにより、作製される。当該ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を利用することにより、高効率で標的細胞に遺伝子を導入し、該細胞内で該遺伝子を強く発現させることができる。
（Ｉ）ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体
本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体は、ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換されることにより、作製される。当該ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を利用することにより、高効率で標的細胞に遺伝子を導入し、該細胞内で該遺伝子を強く発現させることができる。
【0025】
本発明で使用できるＡＡＶキャプシドタンパク質の血清型や由来は特に限定はなく、公知のいずれの血清型または由来のＡＡＶのキャプシドタンパク質も使用できる。本発明で使用できるＡＡＶキャプシドタンパク質として、特に限定されないが、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３ａおよびＡＡＶ３ｂ）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ１０）、１１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１１）、１２型ＡＡＶ（ＡＡＶ１２）、１３型ＡＡＶ（ＡＡＶ１３）などの霊長類由来のＡＡＶ、およびトリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶなどの霊長類以外の動物由来のＡＡＶなど、任意のＡＡＶのキャプシドタンパク質が例示される。また、公知のいずれの血清型のＡＡＶから派生したＡＡＶキャプシドタンパク質や、公知のいずれの組換えＡＡＶのキャプシドタンパク質も本発明で使用できる。例えば、遺伝子導入効率及び／又は遺伝子発現効率が向上することが知られている公知の変異と、本発明で同定されたアミノ酸置換とを同時にＡＡＶキャプシドタンパク質に導入することにより、該キャプシドタンパク質を有するＡＡＶによる遺伝子導入効率及び／又は遺伝子発現効率を相乗的に増加させることができる可能性がある。さらに、本発明は安定性や細胞指向性を変化させる公知の変異と組み合わせてもよい。本発明においては、ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質が好適に使用できる。野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【0026】
ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の各アミノ酸位置に対応する、ＡＡＶ２以外の血清型またはクレードのＡＡＶのキャプシドタンパク質のアミノ酸配列における位置を、当業者は容易に特定することができる。例えば、Ｇａｏら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．）、第９９巻、第１８号、１１８５４－１１８５９頁、２００２年に記載されるＶＰ１のアミノ酸配列のアライメントを参照することができる。
【0027】
本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体におけるアミノ酸置換の位置は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における（１）３位のアラニン、（２）６位のチロシン、（３）６８位のアラニン、（４）８７位のアスパラギン酸、（５）９１位のロイシン、（６）１４９位のセリン、（７）１５０位のプロリン、および（８）１５６位のセリンから選択されるか、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（８）に対応する位置から選択される。本明細書において、「ＡＡＶ２以外のＡＡＶ」とは、ＡＡＶ２以外の血清型またはクレードのＡＡＶを意味し、例えば、限定するものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３ａおよびＡＡＶ３ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ならびにトリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、およびヤギＡＡＶなどの霊長類以外の動物由来のＡＡＶが含まれる。本明細書において、「対応する位置」または「対応する１以上の位置」とは、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体がＡＡＶ２キャプシドタンパク質変異体である場合は、上記（１）～（８）で示されたアミノ酸位置であり、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体がＡＡＶ２以外の血清型またはクレードのＡＡＶのキャプシドタンパク質変異体である場合は、当該血清型またはクレードのＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質アミノ酸配列における上記（１）～（８）に相当する位置を意味する。このようなＡＡＶ２以外の血清型またはクレードのＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質アミノ酸配列における対応する位置は、上記したように、当業者により容易に特定される。
【0028】
前記アミノ酸置換の位置は、すべてＰＬＡ２ドメインに存在する。ＰＬＡ２ドメインはＶＰ１には存在するが、ＶＰ２やＶＰ３には存在しない。すなわち、本発明で使用できるキャプシドタンパク質は、ＶＰ１など、ＰＬＡ２ドメインを含むタンパク質が好適である。ＰＬＡ２ドメインを含むタンパク質として、特に限定されないが、全長ＶＰ１、ＶＰ１フラグメント、ＰＬＡ２ドメイン、ＰＬＡ２ドメインと別のタンパク質との融合蛋白質、などが例示される。
【0029】
本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体では、所望の機能が得られるのであれば、置換後のアミノ酸残基は特に限定されない。また、所望の機能が得られるのであれば、置換後のアミノ酸残基は、天然のアミノ酸でもよいし、人工のアミノ酸でもよい。一部の特殊なものを除き、天然には２０種類のアミノ酸が存在するが、それらのアミノ酸は構造によって、いくつかの群に分類される。特に限定されないが、例えば、Ａ群．グリシン、アラニン； Ｂ群．バリン、ロイシン、イソロイシン； Ｃ群．アスパラギン酸、グルタミン酸； Ｄ群．アスパラギン、グルタミン； Ｅ群．セリン、トレオニン； Ｆ群．リシン、アルギニン、ヒスチジン； Ｇ群．フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン； Ｈ群．システイン、メチオニン； Ｉ群．プロリン、である。同一群に含まれるアミノ酸残基は同様の性質を示すため、相互に置き換えることが可能であると予想される。
【0030】
特に限定はされないが、アミノ酸置換として、例えば、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における（１）３位のアラニンからトレオニンへの置換（Ａ３Ｔ）、（２）６位のチロシンからヒスチジンへの置換（Ｙ６Ｈ）、（３）６８位のアラニンからバリンへの置換（Ａ６８Ｖ）、（４）８７位のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換（Ｄ８７Ｎ）、（５）９１位のロイシンからプロリンへの置換（Ｌ９１Ｐ）、（６）１４９位のセリンからチロシンへの置換（Ｓ１４９Ｙ）、（７）１５０位のプロリンからヒスチジンへの置換（Ｐ１５０Ｈ）、および（８）１５６位のセリンからチロシンへの置換（Ｓ１５６Ｙ）、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（８）に対応するアミノ酸置換が例示される。本明細書において、「対応するアミノ酸置換」または「対応する１以上のアミノ酸置換」とは、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体がＡＡＶ２キャプシドタンパク質変異体である場合は、上記（１）～（８）で示されたアミノ酸置換であり、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体がＡＡＶ２以外の血清型またはクレードのＡＡＶのキャプシドタンパク質変異体である場合は、当該血清型またはクレードのＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質アミノ酸配列における上記（１）～（８）に示されるアミノ酸位置に相当する位置における同様のアミノ酸置換を意味する。上記したように、ＡＡＶ２以外の血清型またはクレードのＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質アミノ酸配列における対応するアミノ酸位置は、当業者により容易に特定される。
【0031】
好適には、アミノ酸置換として、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における（１）３位のアラニンからトレオニンへの置換（Ａ３Ｔ）、（２）６位のチロシンからヒスチジンへの置換（Ｙ６Ｈ）、および（３）６８位のアラニンからバリンへの置換（Ａ６８Ｖ）からなる群より選択される１以上のアミノ酸置換、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（３）に対応するアミノ酸置換の群より選択される1以上のアミノ酸置換が例示される。
【0032】
さらに好適には、アミノ酸置換として、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における（１）３位のアラニンからトレオニンへの置換（Ａ３Ｔ）、（２）６位のチロシンからヒスチジンへの置換（Ｙ６Ｈ）、および（３）６８位のアラニンからバリンへの置換（Ａ６８Ｖ）からなる３つのアミノ酸置換、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記（１）～（３）に対応するアミノ酸置換からなる３つのアミノ酸置換が例示される。例えば、野生型ＡＡＶ２のＶＰ１に３つのアミノ酸置換（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）を導入することにより得られる、配列番号６で表されるタンパク質は、本発明の一例である。
【0033】
（ＩＩ）ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸
本発明は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸を提供する。本発明の核酸は、前記（Ｉ）のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする。本発明の核酸は、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸（ｃａｐ遺伝子）の核酸配列において少なくとも１つの塩基が別の塩基に置換されることにより、作製される。
本発明は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸を提供する。本発明の核酸は、前記（Ｉ）のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする。本発明の核酸は、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸（ｃａｐ遺伝子）の核酸配列において少なくとも１つの塩基が別の塩基に置換されることにより、作製される。
【0034】
本発明の核酸は、ＤＮＡの形態で存在し得るが、場合によってはＲＮＡの形態や、ＤＮＡとＲＮＡとのキメラであってもよい。また、本発明の核酸には、相補的な核酸（例えば、ｃＤＮＡ）も含まれる。本発明の核酸は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。
【0035】
本発明で使用できるＡＡＶのｃａｐ遺伝子の血清型や由来は特に限定はなく、公知のいずれの血清型のＡＡＶのｃａｐ遺伝子も使用できる。本発明で使用できるＡＡＶの血清型として、特に限定されないが、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３ａまたはＡＡＶ３ｂ）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ１０）、１１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１１）、１２型ＡＡＶ（ＡＡＶ１２）、１３型ＡＡＶ（ＡＡＶ１３）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶなど、任意のＡＡＶが例示される。また、公知のいずれの血清型のＡＡＶから派生したＡＡＶのｃａｐ遺伝子や、公知のいずれの組換えＡＡＶのｃａｐ遺伝子も本発明で使用できる。本発明においては、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子が好適に使用できる。野生型ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子の核酸配列（ＶＰ１をコードする核酸配列）を配列番号１に示す。
【0036】
ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸として、特に限定されないが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ６８Ｖ）をコードする核酸配列（配列番号３）やＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）をコードする核酸配列（配列番号５）が例示される。
【0037】
本発明の核酸は、適切な制御配列と作動可能に連結してもよい。制御配列には、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流の調節ドメイン、内部リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ：ＩＲＥＳ）、エンハンサーなどが含まれる。プロモーター配列には、誘導性プロモーター配列、構成的プロモーター配列が含まれる。制御配列はキャプシドタンパク質の由来となるＡＡＶに固有のものであっても外来性のものであってもよく、天然配列であっても合成配列であってもよい。本発明の核酸を含む、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を発現可能な組換えＤＮＡも本発明に包含される。
【0038】
前記組換えＤＮＡは、試験管内、生体外及び生体内の細胞へ本発明の核酸を送達し、当該細胞にＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を発現する能力を付与するのに有用である。そして、本発明の核酸が送達された細胞は組換えＡＡＶ粒子を製造するのにも有用である。当該組換えＤＮＡは特に、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞へ本発明の核酸を送達又は導入するのに用いることができる。
【0039】
本発明では、ベクターとして使用されているＤＮＡに本発明の核酸を保持させて組換えＤＮＡを作製することができる。例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーマルＤＮＡ、ウイルスゲノムなどが使用できる。
【0040】
例えば、プラスミドに、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸（ｃａｐ遺伝子）を保持させることにより、パッケージングプラスミドを作製することができる。パッケージングプラスミドは、更にＲｅｐタンパク質をコードする核酸（ｒｅｐ遺伝子）など、任意の核酸配列を含んでもよい。
【0041】
公知のパッケージングプラスミドに搭載されたｃａｐ遺伝子の核酸配列において、ＰＬＡ２ドメインコーディング領域における少なくとも１つの塩基を別の塩基に置換することによっても、本発明の核酸を含む組換えＤＮＡを作製することができる。前記パッケージングプラスミドとして、特に限定はされないが、ｃａｐ遺伝子を搭載したパッケージングプラスミド、好適にはｃａｐ遺伝子とｒｅｐ遺伝子とを搭載したパッケージングプラスミド、が例示される。ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２（配列番号７）は、ｃａｐ遺伝子とｒｅｐ遺伝子とを搭載したパッケージングプラスミドの一例である。
【0042】
核酸に塩基の置換を導入する方法は、公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、市販の試薬、例えばＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用して、キットに付属の説明書に従ってＰＣＲを行うことにより、達成できる。
【0043】
（ＩＩＩ）本発明の核酸を含む細胞
本発明はまた、本発明の核酸、具体的には前記（ＩＩ）の組換えＤＮＡを含む細胞、例えば単離された細胞を提供する。単離された細胞は、例えばインビトロで維持されている細胞株である。本発明の細胞は、以下に説明するように本発明の組換えＡＡＶ粒子の製造に有用である。本発明の細胞がウイルス粒子を製造するために使用される場合、該細胞は「ウイルス産生細胞」と称される（パッケージング細胞、又はプロデューサー細胞と称されることもある）。本発明の細胞は、前記（ＩＩ）記載の本発明の組換えＤＮＡがゲノムに組み込まれても良く、ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を一過性に発現するように前記の組換えＤＮＡが細胞内に保持されていても良い。
本発明はまた、本発明の核酸、具体的には前記（ＩＩ）の組換えＤＮＡを含む細胞、例えば単離された細胞を提供する。単離された細胞は、例えばインビトロで維持されている細胞株である。本発明の細胞は、以下に説明するように本発明の組換えＡＡＶ粒子の製造に有用である。本発明の細胞がウイルス粒子を製造するために使用される場合、該細胞は「ウイルス産生細胞」と称される（パッケージング細胞、又はプロデューサー細胞と称されることもある）。本発明の細胞は、前記（ＩＩ）記載の本発明の組換えＤＮＡがゲノムに組み込まれても良く、ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を一過性に発現するように前記の組換えＤＮＡが細胞内に保持されていても良い。
【0044】
本発明の核酸を含む組換えＤＮＡ（核酸構築物）を細胞に導入する方法としては、一過性、又は恒常的な導入方法が例示される。一過性に導入する方法には特に限定はなく、公知の一過性導入方法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリエチレンイミン法、エレクトロポレーション法等が使用可能である。また市販の試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２０２０（以上、Ｍｉｒｕｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ２０００ＣＤ Ｒｅａｇｅｎｔ（以上、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）、ＦｕＧｅｎｅ（登録商標） Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等を用いてもよい。また、バキュロウイルスを用いて昆虫細胞に核酸構築物を導入することもできる。
【0045】
また恒常的に導入する方法には特に限定はなく、公知の恒常的導入方法、例えばレトロウイルスベクターを用いる方法、プラスミドを上記の一過性導入方法で導入し、染色体に組み込まれた細胞を選択する方法等が使用可能である。レトロウイルスベクターを用いる方法においては、市販の試薬、例えばＲｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）を用いてもよい。
【0046】
このような確立された技術を用いて、本発明の組換えＤＮＡは細胞に安定的に、又は一過性に導入される。安定した形質転換のために、選択マーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードしている）やハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードしている）などの周知の選択マーカーを本発明の組換えＤＮＡに連結することができる。
【0047】
本発明の核酸を導入する細胞には、例えば、げっ歯類細胞及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）などを含む哺乳類細胞や、昆虫細胞などの、様々な真核細胞が使用できる。本発明の核酸を導入する細胞は、初代培養細胞であっても細胞株であってもよい。適当な細胞株として、２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、２９３Ｔ細胞、２９３Ｆ細胞、２９３ＦＴ細胞、２９３ＥＢ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）、ＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）やこれら細胞から派生した細胞などが挙げられる。また、例えば、前記２９３細胞等はアデノウイルスＥ１タンパク質を恒常的に発現するが、このような、組換えＡＡＶの産生に必要なタンパク質の１つ又はいくつかを一過的もしくは恒常的に発現するように改変した細胞は本発明に好適である。
【0048】
（ＩＶ）組換えＡＡＶ粒子および組換えＡＡＶ粒子の製造方法
本発明の組換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を含む組換えＡＡＶ粒子である。当該組換えＡＡＶ粒子は、前記（ＩＩＩ）に記載される細胞により製造することができる。本発明の組換えＡＡＶ粒子は、標的細胞への遺伝子導入に有用である。本発明の組換えＡＡＶ粒子により導入された遺伝子は、前記標的細胞で強く発現される。
本発明の組換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を含む組換えＡＡＶ粒子である。当該組換えＡＡＶ粒子は、前記（ＩＩＩ）に記載される細胞により製造することができる。本発明の組換えＡＡＶ粒子は、標的細胞への遺伝子導入に有用である。本発明の組換えＡＡＶ粒子により導入された遺伝子は、前記標的細胞で強く発現される。
【0049】
組換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ粒子の製造に必要ないくつかの成分を含む細胞をウイルス産生細胞として利用して製造することができる。第１の成分は、細胞内で複製され、ＡＡＶ粒子にパッケージングされ得る「組換えＡＡＶゲノム」である。組換えＡＡＶゲノムは、所望の異種ポリヌクレオチドと、その両側に、すなわち５’及び３’側に２つの逆方向末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ：ＩＴＲ）配列が位置する。所望の異種ポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子が感染した細胞において発現が望まれる遺伝子と、その発現のための制御配列を有しうる。ＩＴＲ配列の塩基配列は公知であり、例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ配列については、Ｋｏｔｉｎ Ｒ．Ｍら、ヒューマン ジーン セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第５巻、７９３－８０１頁、１９９４年を参照することができる。さらに、ＩＴＲ配列として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７など、様々なＡＡＶ血清型のいずれかに由来するＩＴＲ配列を使用することができる。本発明において使用されるＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ由来の配列でも良く、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により変更されていても良い。ＩＴＲ配列は、Ｒｅｐタンパク質の存在下で、組換えＡＡＶゲノムの複製を可能にし、ＡＡＶ粒子形成の際にキャプシド粒子内への組換えＡＡＶゲノムのパッケージングを可能にする。
【0050】
組換えＡＡＶゲノムに搭載可能な所望の異種ポリヌクレオチドは、一般にサイズが約５キロベース（ｋｂ）未満である。例えば、レシピエントに欠損した又は失われた所望のタンパク質をコードする遺伝子、所望の生物学的又は治療的作用（例えば、抗菌、抗ウイルス又は抗腫瘍作用）を有するタンパク質をコードする遺伝子、有害な又は望ましくないタンパク質の産生を阻害又は低下させるＲＮＡをコードする所望のヌクレオチド配列、抗原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列、マーカータンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ）をコードする遺伝子など、目的に応じた異種ヌクレオチドを、組換えＡＡＶゲノムに搭載することができる。
【0051】
本発明の一態様として、組換えＡＡＶゲノムは、ｃａｐ遺伝子領域及び／又はｒｅｐ遺伝子領域を欠いており、この態様の組換えＡＡＶゲノムがパッケージングされたＡＡＶ粒子は、感染した細胞内で単独で再度ＡＡＶ粒子に複製されない。
【0052】
特に限定されないが、プラスミドを用いて細胞に第１の成分（組換えＡＡＶゲノム）を導入してもよい。第１の成分をプラスミドによって細胞に導入する場合、該プラスミドのことをベクタープラスミドと称する。
【0053】
組換えＡＡＶ粒子の製造に必要な第２の成分は、「パッケージング機能を提供する核酸構築物」である。この核酸構築物は、ＡＡＶ粒子の形成のために必要なタンパク質を提供するＡＡＶ由来の遺伝子をコードしている。すなわち、ＡＡＶの主要なＯＲＦであるｒｅｐ遺伝子領域及びｃａｐ遺伝子領域の一方又は両方を含む。本発明の組換えＡＡＶ粒子を製造するために、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸がｃａｐ遺伝子として使用される。この変異体を発現する能力を有している、前記（ＩＩＩ）に記載されるウイルス産生細胞をＡＡＶ粒子の製造に使用することができる。ＡＡＶ粒子の外殻は多数のキャプシドタンパク質分子ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が集合して形成されたものであるが、本発明の組み換えＡＡＶ粒子において、全てのキャプシドタンパク質ＶＰ１が変異体であっても良く、またはＡＡＶ粒子の外殻を構成する複数のキャプシドタンパク質ＶＰ１の一部が変異体で残りが野生型のキャプシドタンパク質ＶＰ１でもあっても良い。さらに、本発明の組み換えＡＡＶ粒子の外殻を構成するキャプシドタンパク質ＶＰ２およびＶＰ３もまた、変異を有していてもよい。さらに、本発明の組換えＡＡＶ粒子に含まれるキャプシドタンパク質変異体は１種類の変異体であっても良く、複数種の変異体であっても良い。
【0054】
ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子は、４種のＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）をコードする。これらのＲｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノムのＤＮＡ複製起点の認識、結合及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性及びＡＡＶ由来プロモーターの転写の変更など、多くの機能を有することが示されている。
【0055】
特に限定されないが、プラスミドを用いて細胞に第２の成分（パッケージング機能を提供する核酸構築物）を導入してもよい。第２の成分をプラスミドによって細胞に導入する場合、該プラスミドのことをパッケージングプラスミドと称する。
【0056】
ＡＡＶ粒子の製造に必要な第３の成分は、ＡＡＶ複製のための「ヘルパーウイルス機能（アクセサリー機能とも呼ばれる）」である。ヘルパーウイルス機能の導入には、ウイルスを使用することもできるし、核酸構築物を使用することもできる。ウイルスを使用する場合、一般的にアデノウイルスが使用されるが、例えば１型又は２型単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのウイルスも使用することができる。ウイルスを使用する場合は、前記第１の成分及び第２の成分が導入された細胞にウイルスをヘルパーウイルスとして感染させる。ＡＡＶ粒子のパッケージングには、アデノウイルスの初期遺伝子の発現のみが必要なので、例えば、後期遺伝子発現を呈さないアデノウイルスを用いてもよい。後期遺伝子発現を欠損するアデノウイルス変異体（例えば、ｔｓ１００Ｋ又はｔｓ１４９アデノウイルス変異体）を使用することができる。一方、核酸構築物を使用する場合は、ヘルパーウイルスから単離したヘルパーウイルス機能に必要な核酸から、ヘルパーウイルス機能を提供する核酸構築物を作製して、該構築物を細胞に導入する。ヘルパーウイルス機能を提供する核酸構築物は、１種又は複数のヘルパーウイルス機能を提供するヌクレオチド配列を含み、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド又は他のウイルスの形で細胞に提供される。
【0057】
特に限定されないが、プラスミドを用いて細胞に第３の成分（ヘルパーウイルス機能）を導入してもよい。第３の成分をプラスミドによって細胞に導入する場合、該プラスミドのことをヘルパープラスミドと称する。市販のヘルパープラスミド、例えばｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いてもよい。
【0058】
ＡＡＶ粒子を製造するために、前記１）第１の成分である組換えＡＡＶゲノムを細胞に導入する工程、２）第２の成分であるパッケージング機能を提供する核酸構築物を細胞に導入する工程、３）第３の成分であるヘルパーウイルス機能を細胞に導入する工程、を実施する。これらの工程は同時に実施されても良く、順番に実施されても良い。工程１）～３）の順番はどのような順番であっても良い。このようにして作製されたウイルス産生細胞を培養する。ウイルス産生細胞内で、ｒｅｐ遺伝子の発現産物は組換えＡＡＶゲノムを切出し、複製させる。発現されたキャプシドタンパク質は外殻を形成し、組換えＡＡＶゲノムが外殻にパッケージングされてＡＡＶ粒子が産生される。ウイルス産生細胞がＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を発現する場合、産生されたＡＡＶ粒子の外殻にはＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体が含まれている。なお、第１～第３の成分を導入する細胞は、上記（ＩＩＩ）に記載した「本発明の核酸を導入する細胞」と同様である。
【0059】
ウイルス産生細胞の培養は公知の培養条件で行うことができる。例えば、温度３０～４０℃、好ましくは温度３７℃での培養、湿度９０～９９％、好ましくは湿度９５％での培養、ＣＯ２濃度２～１０％、好ましくはＣＯ２濃度５％での培養、が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望のウイルス産生細胞の増殖、組換えＡＡＶの産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。また、培養時間は特に限定はなく、例えば１２～１５０時間、好適には４８～１２０時間である。ウイルス産生細胞の培養に使用される培地は、細胞の培養に必要な成分を含んでいればよく、例えば、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ：Ｆ－１２等の基本合成培地や、必要に応じてこれらの基本合成培地にウシ胎児血清、成長因子類、ペプチド類を添加した培地や、アミノ酸類を増量した培地などが挙げられる。
【0060】
ウイルス産生細胞内で形成された組換えＡＡＶ粒子は、細胞内に留まるか、又は培養上清に放出される。ＡＡＶの血清型によって、ウイルス産生細胞内と培養上清中とでの組換えＡＡＶ粒子の存在比が異なることが知られている（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、第５巻、３１－５５頁、２０１０年）。ウイルス産生細胞から組換えＡＡＶ粒子を精製する場合、公知の方法で細胞を破砕するか、又は、細胞と酸性の溶液とを接触させることで（国際公開第ＷＯ２０１５／００５４３０号パンフレット）、組換えＡＡＶ粒子を含むサンプルを調製する。このようにして調製したサンプルを、精製工程に供する。一方、培養上清から組換えＡＡＶ粒子を精製する場合、培養上清をそのまま精製工程に供してもよいし、培養上清を濃縮してから精製工程に供してもよい。公知の方法で培養上清を濃縮してもよいし、市販の試薬、例えばＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いて、培養上清を濃縮することができる。
【0061】
ＡＡＶ粒子の精製法として、特に限定はされないが、ＣｓＣｌ勾配超遠心、クロマトグラフィー、及び限外ろ過などの様々な精製法が例示される。これらの精製法を適宜用いることにより、組換えＡＡＶ粒子を含むサンプルから、ＡＡＶ粒子を単離、精製することができる。市販の試薬、例えばＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｌｌ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ）（タカラバイオ社製）を用いて、ＡＡＶ粒子を精製することもできる。
【0062】
前記３）工程（第３の成分であるヘルパーウイルス機能を細胞に導入する工程）にヘルパーウイルスが使用される場合、例えば、ＡＡＶ粒子とヘルパーウイルスとを、サイズに基づいて分離する工程を加えてもよい。また、ヘパリンに対する親和性の差に基づいて、ＡＡＶ粒子をヘルパーウイルスから分離することもできる。さらに、残存するヘルパーウイルスは、公知の方法を用いて失活させることができる。例えばアデノウイルスは、約６０℃の温度で、例えば２０分間又はそれ以上加熱することにより失活させることができる。ＡＡＶ粒子は熱に極めて安定であるため、この処置はヘルパーウイルスとして使用したアデノウイルスの選択的除去に有効である。
【0063】
組換えＡＡＶ粒子の量は、組換えＡＡＶ粒子の力価等を用いて示される。組換えＡＡＶ粒子の力価は、特に限定はないが、一定量の試料中の（ａ）ＡＡＶゲノムの個数（ゲノム力価）、（ｂ）実験的に測定されるＡＡＶの細胞への感染能力（感染力価）、又は（ｃ）ＡＡＶを構成するタンパク質量（あるいはタンパク質純度）のいずれかでによって表され、本明細書において必要に応じて明示される。
【0064】
上記（ａ）を測定する方法としては、ＡＡＶ粒子を含有する試料中のＡＡＶゲノムのコピー数（ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ：ｇ．ｃ．）をＰＣＲ法で測定する方法が例示される。特に限定はされないが、例えば、ゲノム力価測定には、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ） Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を使用し、取扱説明書に記載された方法でゲノム力価を算出することができる。また、上記（ｂ）を測定する方法としては、例えばＡＡＶ粒子を含有する試料の希釈系列液を適当な標的細胞に接触させ、細胞の形状変化（細胞変性）を検出する方法、導入遺伝子の発現を検出する方法、細胞に導入されたＡＡＶゲノムのコピー数を測定する方法等が例示される。さらに上記（ｃ）を測定する方法としては、例えば当該タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析する方法あるいは免疫学的手法で定量する方法等が例示される。
【0065】
（Ｖ）組換えＡＡＶ粒子を標的細胞に接触させる工程を含む、標的細胞への遺伝子導入方法
精製された本発明の組換えＡＡＶ粒子は、遺伝子治療やその他の目的で、所望の異種ポリヌクレオチドの標的細胞への送達のために使用される。一般にＡＡＶ粒子は、インビボ又はインビトロのいずれかで標的細胞へ所望の遺伝子を導入させる。インビトロで遺伝子導入する場合、生体より取得された細胞にＡＡＶ粒子を接触させる。この細胞を生体に移植することもできる。細胞を生体に移植する場合は、薬学的組成物として製剤化し、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内投与などの様々な技術が利用できる。インビボで遺伝子導入する場合は、ＡＡＶ粒子を薬学的組成物として製剤化し、一般に非経口投与する（例えば、筋肉内、皮下、腫瘍内、経皮、髄腔内などの投与経路に投与する）。ＡＡＶ粒子を含む薬学的組成物は、薬剤として許容される担体、及び必要に応じて他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈液などを含む。
精製された本発明の組換えＡＡＶ粒子は、遺伝子治療やその他の目的で、所望の異種ポリヌクレオチドの標的細胞への送達のために使用される。一般にＡＡＶ粒子は、インビボ又はインビトロのいずれかで標的細胞へ所望の遺伝子を導入させる。インビトロで遺伝子導入する場合、生体より取得された細胞にＡＡＶ粒子を接触させる。この細胞を生体に移植することもできる。細胞を生体に移植する場合は、薬学的組成物として製剤化し、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内投与などの様々な技術が利用できる。インビボで遺伝子導入する場合は、ＡＡＶ粒子を薬学的組成物として製剤化し、一般に非経口投与する（例えば、筋肉内、皮下、腫瘍内、経皮、髄腔内などの投与経路に投与する）。ＡＡＶ粒子を含む薬学的組成物は、薬剤として許容される担体、及び必要に応じて他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈液などを含む。
【0066】
標的細胞には、例えば、げっ歯類細胞及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）などを含む哺乳類細胞や、昆虫細胞などの、様々な真核細胞が使用できる。標的細胞は、初代培養細胞であっても細胞株であってもよい。特に限定されないが、標的細胞としてＣＨＯ細胞、好適にはＣＨＯ－Ｋ１細胞が例示される。
【0067】
本発明において、「遺伝子導入効率」とは、遺伝子導入に供された細胞数あたりの、ＡＡＶゲノムを獲得した細胞数を意味する。また、標的細胞あたりの所望の異種ヌクレオチドの導入の程度、すなわち、１細胞あたりのＡＡＶゲノムのコピー数、を指標として遺伝子導入効率を推定することが可能である。導入されたＡＡＶゲノムは、標的細胞の染色体に組込まれてもよいし、エピソームに維持されてもよい。本発明の組換えＡＡＶ粒子を使用する場合、従来の組換えＡＡＶ粒子を用いる場合と比較して同等か又は高い遺伝子導入効率を達成することが可能である。
【0068】
本発明において、「遺伝子発現効率」とは、標的細胞あたりの所望の異種ヌクレオチドの発現の程度、を意味する。発現産物（タンパク質）量を測定する代わりに、転写産物（ｍＲＮＡ）量を測定した場合でも、本明細書では「遺伝子発現効率」という名称を用いる。本発明の組換えＡＡＶ粒子を使用する場合、従来の組換えＡＡＶ粒子を用いる場合と比較して、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上又は１０倍以上の遺伝子発現効率を達成することが可能である。
【実施例0069】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されないものとする。
【0070】
実施例１ マーモセットＡＡＶの単離
老齢のコモンマーモセット（１０歳以上、衰弱死）の脳、心臓及び骨格筋からそれぞれゲノムＤＮＡを採取した。各ゲノムＤＮＡ、ｐＡｄ５（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｐＳＶ３ｎｅｏ－ＬａｒｇｅＴ及びｐＥ１Δ５５（ＷＯ２０１２／１４４４４６）を２９３ＥＢ細胞にトランスフェクションし、細胞を培養した。細胞を回収し、細胞の溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を調製した。該溶解物とアデノウイルス５型（Ａｄ５）とを２９３細胞にトランスフェクションし、細胞を培養した。細胞を回収し、細胞の溶解物を調製した。該溶解物を鋳型として、ＡＡＶの保存性の高い領域に設計したプライマーセット、及びＴｋｓ Ｇｆｌｅｘ（商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１０秒、６１℃で１５秒を１サイクルとした５０サイクルでＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルにロードして電気泳動したところ、脳由来ゲノムＤＮＡをトランスフェクションした２９３ＥＢ細胞に由来するサンプルから、ＡＡＶに対応する増幅産物のバンドが確認された（図１）。該バンドから抽出したＤＮＡ断片をクローニングし、その核酸配列を決定した。その結果、複数のマーモセットＡＡＶクローンが得られた。
老齢のコモンマーモセット（１０歳以上、衰弱死）の脳、心臓及び骨格筋からそれぞれゲノムＤＮＡを採取した。各ゲノムＤＮＡ、ｐＡｄ５（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｐＳＶ３ｎｅｏ－ＬａｒｇｅＴ及びｐＥ１Δ５５（ＷＯ２０１２／１４４４４６）を２９３ＥＢ細胞にトランスフェクションし、細胞を培養した。細胞を回収し、細胞の溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を調製した。該溶解物とアデノウイルス５型（Ａｄ５）とを２９３細胞にトランスフェクションし、細胞を培養した。細胞を回収し、細胞の溶解物を調製した。該溶解物を鋳型として、ＡＡＶの保存性の高い領域に設計したプライマーセット、及びＴｋｓ Ｇｆｌｅｘ（商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１０秒、６１℃で１５秒を１サイクルとした５０サイクルでＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルにロードして電気泳動したところ、脳由来ゲノムＤＮＡをトランスフェクションした２９３ＥＢ細胞に由来するサンプルから、ＡＡＶに対応する増幅産物のバンドが確認された（図１）。該バンドから抽出したＤＮＡ断片をクローニングし、その核酸配列を決定した。その結果、複数のマーモセットＡＡＶクローンが得られた。
【0071】
実施例２ ＡＡＶ２とマーモセットＡＡＶとの比較
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と、実施例１で決定したマーモセットＡＡＶのＶＰ１のアミノ酸配列とを比較したところ、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸が１１箇所で見出された（Ａ３Ｔ、Ｙ６Ｈ、Ａ６８Ｖ、Ｄ８７Ｎ、Ｌ９１Ｐ、Ｓ１４９Ｙ、Ｐ１５０Ｈ、Ｓ１５６Ｙ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ）。
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と、実施例１で決定したマーモセットＡＡＶのＶＰ１のアミノ酸配列とを比較したところ、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸が１１箇所で見出された（Ａ３Ｔ、Ｙ６Ｈ、Ａ６８Ｖ、Ｄ８７Ｎ、Ｌ９１Ｐ、Ｓ１４９Ｙ、Ｐ１５０Ｈ、Ｓ１５６Ｙ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ）。
【0072】
このうち、Ｎ末端側の８箇所のアミノ酸残基（３位のトレオニン、６位のヒスチジン、６８位のバリン、８７位のアスパラギン、９１位のプロリン、１４９位のチロシン、１５０位のヒスチジン、１５６位のチロシン）は他のＡＡＶ血清型で知られていないアミノ酸残基であり、すべてＶＰ１特異領域（ＶＰ１ ｕｎｉｑｕｅ ｒｅｇｉｏｎ：ＶＰ１ｕ）に位置する。
【0073】
一方、Ｃ末端側の３箇所のアミノ酸残基（４４４位、５００位、７３０位のフェニルアラニン）は他のＡＡＶ血清型で知られているアミノ酸残基であり、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の共通領域に位置する。
【0074】
実施例３ ＡＡＶ２変異体の作製
ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子に変異を導入し、ＶＰ１のアミノ酸配列の一部がマーモセットＡＡＶのＶＰ１に由来するアミノ酸配列に置換された２種類のＡＡＶ２変異体、すなわちＡＡＶ２（Ａ６８Ｖ）とＡＡＶ２（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）とを作製した。各ＡＡＶ２変異体のＶＰ１について、それをコードするｃａｐ遺伝子の核酸配列と、ＶＰ１全長のアミノ酸配列とを表１に示す。
ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子に変異を導入し、ＶＰ１のアミノ酸配列の一部がマーモセットＡＡＶのＶＰ１に由来するアミノ酸配列に置換された２種類のＡＡＶ２変異体、すなわちＡＡＶ２（Ａ６８Ｖ）とＡＡＶ２（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）とを作製した。各ＡＡＶ２変異体のＶＰ１について、それをコードするｃａｐ遺伝子の核酸配列と、ＶＰ１全長のアミノ酸配列とを表１に示す。
【0075】
【表1】
【0076】
これらのＡＡＶ２変異体は、ウイルスゲノム上にＥＧＦＰ遺伝子が搭載されており、細胞に感染するとＥＧＦＰを発現することができる。これらのＡＡＶ２変異体の作製方法を以下に示す。
【0077】
（１）パッケージングプラスミド変異体の作製
ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２（配列番号７）はＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子とＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子とを含むパッケージングプラスミドである。ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２を鋳型として、ｍｕｔａｎｔ－１Ｆプライマー（配列番号８）とｍｕｔａｎｔ－１Ｒプライマー（配列番号９）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用して、キットに付属の説明書に従ってＰＣＲを行うことにより、パッケージングプラスミド変異体であるｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２（Ａ６８Ｖ）を作製した。本変異体プラスミド上にあるｃａｐ遺伝子はＶＰ１コード領域に配列番号３に示される塩基配列を含んでいる。さらに、上記ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２（Ａ６８Ｖ）を鋳型として、ｍｕｔａｎｔ－２Ｆプライマー（配列番号１０）とｍｕｔａｎｔ－２Ｒプライマー（配列番号１１）とを使用して、同様にＰＣＲを行うことにより、ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）を更に作製した。本変異体プラスミド上にあるｃａｐ遺伝子はＶＰ１コード領域に配列番号５に示される塩基配列を含んでいる。
ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２（配列番号７）はＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子とＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子とを含むパッケージングプラスミドである。ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２を鋳型として、ｍｕｔａｎｔ－１Ｆプライマー（配列番号８）とｍｕｔａｎｔ－１Ｒプライマー（配列番号９）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用して、キットに付属の説明書に従ってＰＣＲを行うことにより、パッケージングプラスミド変異体であるｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２（Ａ６８Ｖ）を作製した。本変異体プラスミド上にあるｃａｐ遺伝子はＶＰ１コード領域に配列番号３に示される塩基配列を含んでいる。さらに、上記ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２（Ａ６８Ｖ）を鋳型として、ｍｕｔａｎｔ－２Ｆプライマー（配列番号１０）とｍｕｔａｎｔ－２Ｒプライマー（配列番号１１）とを使用して、同様にＰＣＲを行うことにより、ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）を更に作製した。本変異体プラスミド上にあるｃａｐ遺伝子はＶＰ１コード領域に配列番号５に示される塩基配列を含んでいる。
【0078】
（２）２９３ＥＢ細胞へのプラスミド導入
実施例３－（１）で作製したそれぞれのパッケージングプラスミド変異体、ヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ、タカラバイオ社製）、及びベクタープラスミド（ｐＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰ、配列番号１２）を、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（コスモバイオ社製）を用いたトランスフェクション法で、２９３ＥＢ細胞に導入した。２９３ＥＢ細胞を、１／１００容量のＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。
実施例３－（１）で作製したそれぞれのパッケージングプラスミド変異体、ヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ、タカラバイオ社製）、及びベクタープラスミド（ｐＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰ、配列番号１２）を、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（コスモバイオ社製）を用いたトランスフェクション法で、２９３ＥＢ細胞に導入した。２９３ＥＢ細胞を、１／１００容量のＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。
【0079】
（３）ＡＡＶ２変異体の精製
実施例３－（２）で培養した２９３ＥＢ細胞と培養上清とから、それぞれＡＡＶ２変異体を精製した。すなわち、２９３ＥＢ細胞からは、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｌｌ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ）（タカラバイオ社製）を用いて、キットに付属の説明書に従って、ＡＡＶ２変異体を精製した。一方、培養上清からは、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いて、キットに付属の説明書に従って、ＡＡＶ２変異体を精製した。２９３ＥＢ細胞から精製したＡＡＶ２変異体と培養上清から精製したＡＡＶ２変異体とを混合し、以下の実験に用いた。なお、２種のＡＡＶ２変異体はそれぞれＡＡＶ２（Ａ６８Ｖ）、ＡＡＶ２（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）と命名した。
実施例３－（２）で培養した２９３ＥＢ細胞と培養上清とから、それぞれＡＡＶ２変異体を精製した。すなわち、２９３ＥＢ細胞からは、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｌｌ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ）（タカラバイオ社製）を用いて、キットに付属の説明書に従って、ＡＡＶ２変異体を精製した。一方、培養上清からは、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いて、キットに付属の説明書に従って、ＡＡＶ２変異体を精製した。２９３ＥＢ細胞から精製したＡＡＶ２変異体と培養上清から精製したＡＡＶ２変異体とを混合し、以下の実験に用いた。なお、２種のＡＡＶ２変異体はそれぞれＡＡＶ２（Ａ６８Ｖ）、ＡＡＶ２（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）と命名した。
【0080】
（４）ＡＡＶ２変異体の力価測定
実施例３－（３）で得られたＡＡＶ２変異体の溶液５μＬ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） ８４．５μＬ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０μＬ、２５０Ｕ／μＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ ０．５μＬを混合し、室温で１時間インキュベートし、遊離のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを分解した。次に、ＰＢＳ １００μＬを加えた後、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、キットに付属の説明書に従って、ＡＡＶのゲノムＤＮＡを精製した。このＡＡＶのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＴＲ－Ｆプライマー（配列番号１３）とＩＴＲ－Ｒプライマー（配列番号１４）、及びＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒ（商標） （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を使用して、キットに添付の説明書に従い、定量的ＰＣＲを行った。一方、標準品として、制限酵素ＳａｃＩで消化し、線状化したベクタープラスミドを用いた同条件での定量的ＰＣＲを実施し、検量線を作成した。こうして、実施例３－（３）で得られたＡＡＶ２変異体のゲノム力価を測定した。
実施例３－（３）で得られたＡＡＶ２変異体の溶液５μＬ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） ８４．５μＬ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０μＬ、２５０Ｕ／μＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ ０．５μＬを混合し、室温で１時間インキュベートし、遊離のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを分解した。次に、ＰＢＳ １００μＬを加えた後、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、キットに付属の説明書に従って、ＡＡＶのゲノムＤＮＡを精製した。このＡＡＶのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＴＲ－Ｆプライマー（配列番号１３）とＩＴＲ－Ｒプライマー（配列番号１４）、及びＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒ（商標） （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を使用して、キットに添付の説明書に従い、定量的ＰＣＲを行った。一方、標準品として、制限酵素ＳａｃＩで消化し、線状化したベクタープラスミドを用いた同条件での定量的ＰＣＲを実施し、検量線を作成した。こうして、実施例３－（３）で得られたＡＡＶ２変異体のゲノム力価を測定した。
【0081】
実施例４ ＡＡＶ２変異体の感染
実施例３－（３）で得られたそれぞれのＡＡＶ２変異体を、ＣＨＯ－Ｋ１細胞（２ｘ１０４ｃｅｌｌ）に対して５ｘ１０５ｇ．ｃ．／ｃｅｌｌで感染させた（ｎ＝３）。また、対照として野生型のＡＡＶ２を同じ条件でＣＨＯ－Ｋ１細胞に感染させた。これらのＣＨＯ－Ｋ１細胞をコラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した後、ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で観察した（図２）。
実施例３－（３）で得られたそれぞれのＡＡＶ２変異体を、ＣＨＯ－Ｋ１細胞（２ｘ１０４ｃｅｌｌ）に対して５ｘ１０５ｇ．ｃ．／ｃｅｌｌで感染させた（ｎ＝３）。また、対照として野生型のＡＡＶ２を同じ条件でＣＨＯ－Ｋ１細胞に感染させた。これらのＣＨＯ－Ｋ１細胞をコラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した後、ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で観察した（図２）。
【0082】
ＣＨＯ－Ｋ１細胞にＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、７５℃で１０分間インキュベートすることにより、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を抽出した。ＤＮＡとＲＮＡの混合物は使用するまで－８０℃で保存し、以下の３通りの試験を実施した。
【0083】
まず、混合物中のＤＮＡを鋳型として、ｈａｍｓｔｅｒ－ａｃｔｉｎ－Ｆプライマー（配列番号１５）とｈａｍｓｔｅｒ－ａｃｔｉｎ－Ｒプライマー（配列番号１６）、及びＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標） （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を使用した定量的ＰＣＲを行った。ＰＣＲの操作はキットに添付の説明書に従った。この結果より各ウェルの細胞数（ｃｅｌｌ）を求めた。次に、混合物中のＤＮＡを鋳型として、ＩＴＲ－Ｆプライマー（配列番号１３）とＩＴＲ－Ｒプライマー（配列番号１４）、及びＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒ（商標） （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を使用した定量的ＰＣＲを行った。ＰＣＲの操作はキットに添付の説明書に従った。この結果より、各ウェルに存在するＡＡＶのゲノムコピー数（ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ：ｇ．ｃ．）を求めた。これらの値より、一細胞あたりのＡＡＶゲノムコピー数（ｇ．ｃ．／ｃｅｌｌ）を計算した。
【0084】
さらに、混合物中のＲＮＡを鋳型として、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）、及びＥＧＦＰ－Ｆプライマー（配列番号１７）とＥＧＦＰ－Ｒプライマー（配列番号１８）を使用した定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの操作はキットに添付の説明書に従った。この結果より、各ウェルにおけるＥＧＦＰ遺伝子の転写量（ＥＧＦＰ）を求めた。ＥＧＦＰの転写量（ＥＧＦＰ）と細胞数（ｃｅｌｌ）とから、一細胞あたりのＥＧＦＰ転写量（ＥＧＦＰ／ｃｅｌｌ）を計算した。
【0085】
一細胞あたりのＡＡＶゲノムコピー数（ｇ．ｃ．／ｃｅｌｌ）と一細胞あたりのＥＧＦＰ転写量（ＥＧＦＰ／ｃｅｌｌ）とから、一ゲノムコピーあたりのＥＧＦＰ転写量（ＥＧＦＰ／ｇ．ｃ．）を計算した。野生型ＡＡＶ２を１としたときの結果を表２に示す。
【0086】
【表2】
ｇ．ｃ．＝ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ
【0087】
一細胞あたりのＡＡＶゲノムコピー数（ｇ．ｃ．／ｃｅｌｌ）については、それぞれのＡＡＶ２変異体は野生型ＡＡＶ２の２倍以内の値を示し、それほど大きな差は見られなかった。この結果は、ＡＡＶの感染効率や遺伝子の導入効率は、野生型ＡＡＶ２とＡＡＶ２変異体ではあまり変わらないことを示唆する。
【0088】
しかし、一細胞あたりのＥＧＦＰ転写量（ＥＧＦＰ／ｃｅｌｌ）と一ゲノムコピーあたりのＥＧＦＰ転写量（ＥＧＦＰ／ｇ．ｃ）については、野生型ＡＡＶ２と比べて、ＡＡＶ２（Ａ６８Ｖ）とＡＡＶ２（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）は、共に、高い値を示した。特にＡＡＶ２（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）は、一細胞あたりのＥＧＦＰ転写量（ＥＧＦＰ／ｃｅｌｌ）が１８．０倍、一ゲノムコピーあたりのＥＧＦＰ転写量（ＥＧＦＰ／ｇ．ｃ）が１６．８倍という非常に高い値を示した。この結果は、標的細胞に導入された遺伝子からの転写効率が高く、その結果、一細胞あたりの外来遺伝子の転写量も高くなることを示す。すなわち、例えばＡＡＶ２（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）を用いることにより、標的細胞で効率的に外来遺伝子を転写・発現できることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【0089】
本発明により、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体が提供される。本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体は、特に標的細胞への遺伝子の導入及び／又は標的細胞での導入遺伝子の発現に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0090】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １： ＡＡＶ２ ＶＰ１をコードする核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２： ＡＡＶ２ ＶＰ１のアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３： ＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ６８Ｖ）をコードする核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４： ＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ６８Ｖ）のアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５： ＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）をコードする核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６： ＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）のアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７： ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２の核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８： ｍｕｔａｎｔ－１Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９： ｍｕｔａｎｔ－１Ｒプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０： ｍｕｔａｎｔ－２Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１： ｍｕｔａｎｔ－２Ｒプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２： ｐＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３： ＩＴＲ－Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４： ＩＴＲ－Ｒプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５： ｈａｍｓｔｅｒ－ａｃｔｉｎ－Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６： ｈａｍｓｔｅｒ－ａｃｔｉｎ－Ｒプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７： ＥＧＦＰ－Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８： ＥＧＦＰ－Ｒプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２： ＡＡＶ２ ＶＰ１のアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３： ＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ６８Ｖ）をコードする核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４： ＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ６８Ｖ）のアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５： ＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）をコードする核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６： ＡＡＶ２ ＶＰ１（Ａ３Ｔ／Ｙ６Ｈ／Ａ６８Ｖ）のアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７： ｐＡＡＶ－Ａｄ－ＡＣＧ２の核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８： ｍｕｔａｎｔ－１Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９： ｍｕｔａｎｔ－１Ｒプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０： ｍｕｔａｎｔ－２Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１： ｍｕｔａｎｔ－２Ｒプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２： ｐＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３： ＩＴＲ－Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４： ＩＴＲ－Ｒプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５： ｈａｍｓｔｅｒ－ａｃｔｉｎ－Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６： ｈａｍｓｔｅｒ－ａｃｔｉｎ－Ｒプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７： ＥＧＦＰ－Ｆプライマーの核酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８： ＥＧＦＰ－Ｒプライマーの核酸配列
【図1】
【図2】
【配列表】