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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022108185
(43)【公開日】2022-07-25
(54)【発明の名称】セロオリゴ糖の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 19/04 20060101AFI20220715BHJP
【ＦＩ】
C12P19/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021003076
(22)【出願日】2021-01-12
(71)【出願人】
【識別番号】000003506
【氏名又は名称】第一工業製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100076314
【弁理士】
【氏名又は名称】蔦田 正人
(74)【代理人】
【識別番号】100112612
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 哲士
(74)【代理人】
【識別番号】100112623
【弁理士】
【氏名又は名称】富田 克幸
(74)【代理人】
【識別番号】100163393
【弁理士】
【氏名又は名称】有近 康臣
(74)【代理人】
【識別番号】100189393
【弁理士】
【氏名又は名称】前澤 龍
(74)【代理人】
【識別番号】100203091
【弁理士】
【氏名又は名称】水鳥 正裕
(72)【発明者】
【氏名】村瀬 璃奈
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AF04
4B064CA21
4B064CB27
4B064CD09
(57)【要約】
【課題】セロオリゴ糖を安価に高い収率で製造することができる方法を提供する。
【解決手段】実施形態に係るセロオリゴ糖の製造方法では、グルコース、セロビオース及びそれらのアノマー位が修飾された誘導体からなる群から選択される少なくとも一種のプライマーと、スクロースに、リン酸の存在下、スクロースホスホリラーゼとセロデキストリンホスホリラーゼを作用させる。その際、反応系でのリン酸濃度を３ｍｏｌ／ｍ３以上１２０ｍｏｌ／ｍ３以下にする。
【選択図】なし
【解決手段】実施形態に係るセロオリゴ糖の製造方法では、グルコース、セロビオース及びそれらのアノマー位が修飾された誘導体からなる群から選択される少なくとも一種のプライマーと、スクロースに、リン酸の存在下、スクロースホスホリラーゼとセロデキストリンホスホリラーゼを作用させる。その際、反応系でのリン酸濃度を３ｍｏｌ／ｍ３以上１２０ｍｏｌ／ｍ３以下にする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルコース、セロビオース及びそれらのアノマー位が修飾された誘導体からなる群から選択される少なくとも一種のプライマーと、スクロースに、リン酸の存在下、スクロースホスホリラーゼとセロデキストリンホスホリラーゼを作用させる反応工程を含み、中間生成物であるα－グルコース－１－リン酸として含まれる量を含めた反応系でのリン酸濃度が３ｍｏｌ／ｍ３以上１２０ｍｏｌ／ｍ３以下である、セロオリゴ糖の製造方法。
【請求項2】
反応温度が２５℃以上４５℃以下である、請求項１に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項3】
水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、前記プライマーと前記スクロースに前記スクロースホスホリラーゼと前記セロデキストリンホスホリラーゼを作用させる、請求項１又は２に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項4】
前記プライマーが、グルコース及びそのアノマー位が修飾されたグルコース誘導体からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１～３のいずれか１項に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酵素を用いたセロオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
酵素を用いたセルロースオリゴマー、即ちセロオリゴ糖の製造方法として、加リン酸分解酵素であるセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の逆反応を利用した合成法が知られている。
【0003】
例えば、特許文献１には、α－グルコース－１－リン酸と、グルコース等のプライマーとを、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、セロデキストリンホスホリラーゼの作用により反応させて、セロオリゴ糖を合成することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１９－１９３６０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、上記合成法では、出発原料であるα－グルコース－１－リン酸が非常に高額であり、またセロオリゴ糖の収率が必ずしも高いとはいえないという問題がある。
【0006】
本発明の実施形態は、以上の点に鑑み、セロオリゴ糖を安価に高い収率で製造することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の実施形態に係るセロオリゴ糖の製造方法は、グルコース、セロビオース及びそれらのアノマー位が修飾された誘導体からなる群から選択される少なくとも一種のプライマーと、スクロースに、リン酸の存在下、スクロースホスホリラーゼとセロデキストリンホスホリラーゼを作用させる反応工程を含み、中間生成物であるα－グルコース－１－リン酸として含まれる量を含めた反応系でのリン酸濃度が３ｍｏｌ／ｍ３以上１２０ｍｏｌ／ｍ３以下である、セロオリゴ糖の製造方法である。
【発明の効果】
【0008】
本発明の実施形態であると、スクロースホスホリラーゼによりスクロースからα－グルコース－１－リン酸を生成し、これにより得られたα－グルコース－１－リン酸とプライマーからセロデキストリンホスホリラーゼによりセロオリゴ糖を生成するので、セロオリゴ糖を安価に製造することができる。また、反応系のリン酸濃度を規定したことにより、セロオリゴ糖の収率を高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本実施形態に係るセロオリゴ糖の製造方法は、グルコース、セロビオース及びそれらのアノマー位が修飾れた誘導体からなる群から選択される少なくとも一種をプライマーとし、スクロースと該プライマーに、リン酸の存在下、スクロースホスホリラーゼ（以下、ＳＰということがある。）とセロデキストリンホスホリラーゼ（以下、ＣＤＰということがある。）を作用させるものである。
【0010】
この反応は、下記式で表されるように、ＳＰによるスクロースとリン酸からのα－グルコース－１－リン酸（以下、αＧ１Ｐということがある。）の生成反応と、ＣＤＰによるαＧ１Ｐと上記プライマーからのセロオリゴ糖の生成反応とを組み合わせたものであり、スクロースをグルコース供与体とし、上記プライマーをグルコース受容体として、二種の加リン酸分解酵素の作用によりセロオリゴ糖を二段階で合成する。
【0011】
【化1】
【0012】
一段階目の反応は、スクロース加リン酸分解酵素ＳＰによるαＧ１Ｐの生成反応であり、出発原料として安価なスクロースを用いてαＧ１Ｐを合成することができる。二段階目の反応は、加リン酸分解酵素ＣＤＰの逆反応を利用したものであり、グルコース受容体であるプライマーに対してαＧ１Ｐがモノマーとして逐次的に重合され、セルロースＩＩ型の結晶構造を持つセロオリゴ糖が得られる。この二段階合成によれば、安価なスクロースからセロオリゴ糖を１バッチで合成することができる。また、ＣＤＰによる反応で生じるリン酸がＳＰによる反応で消費され、すなわちリン酸が反応系中で循環するため、リン酸の蓄積によって生じる加リン酸分解を抑えることができ、セロオリゴ糖の収率を向上することができる
【0013】
グルコース供与体であるスクロースとしては、特に限定されず、天然に存在するものでも、化学的に合成されたものでもよい。反応系（通常は反応液。以下同じ。）によるスクロースの初期濃度（即ち、仕込み時における濃度。以下同じ。）は、特に限定されず、例えば１０～１０００ｍｏｌ／ｍ３でもよく、１００～５００ｍｏｌ／ｍ３でもよい。
【0014】
グルコース受容体であるプライマーは、上記のように、グルコース、セロビオース及びそれらのアノマー位が修飾された誘導体からなる群から選択される少なくとも一種である。該誘導体は、グルコース又はセロビオースのアノマー位に置換基を持つものであり、より詳細にはアノマー位の炭素原子に結合するヒドロキシ基が他の有機基（置換基）により置換されたものである。置換基としては、例えば、アルコキシ基、アジド基を含む有機基（アジド基がアノマー位の炭素原子に直接結合するものも含む。）、アミノ基を含む有機基（アミノ基がアノマー位の炭素原子に直接結合するものも含む。）などが挙げられる。ここで、アミノ基としては、一級アミノ基でもよく、二級アミノ基でもよく、三級アミノ基でもよい。
【0015】
グルコース誘導体の例としては、下記一般式（１）で示すものが挙げられる。
式（１）中、Ｒ１は、－ＯＲ２、－Ｒ３－Ｎ３、又は－Ｒ４－ＮＨ２で表されることが好ましい。また、式中の波線はアノマー位の立体配位がα体、β体、または、α体とβ体の混合物であることを表す。
【化2】
【0016】
Ｒ２は、炭素数１～１２の炭化水素基で表されることが好ましい。該炭化水素基は脂肪族炭化水素基でもよく、芳香族炭化水素基でもよく、好ましくはアルキル基であり、直鎖でも分岐鎖を有してもよい。該炭化水素基の炭素数は１～５であることが好ましく、より好ましくは１～３である。Ｒ２は、好ましくは炭素数１～５のアルキル基を表し、より好ましくは炭素数１～３のアルキル基を表す。
【0017】
Ｒ１が－ＯＲ２の場合の具体例としては、メチルグルコシド、エチルグルコシド、オクチルグルコシド、デシルグルコシド、ドデシルグルコシドなどのアルキルグルコシド、フェニルグルコシドなどのアリールグルコシドなどが挙げられる。
【0018】
Ｒ３は、直接結合又は－ＯＲ５－を表す。Ｒ５は、炭素数１～２０の２価の炭化水素基を表す。該２価の炭化水素基としては、２価の脂肪族炭化水素基でもよく、２価の芳香族炭化水素基でもよい。２価の脂肪族炭化水素基としては、例えば、アルカンジイル基やアルケンジイル基などが挙げられ、直鎖でも分岐鎖を有してもよい。２価の芳香族炭化水素基としては、例えば、芳香環の置換基を持つ２価の脂肪族炭化水素基や、アレーンジイル基などが挙げられ、これらの芳香環にはアルキル基などの置換基が付加されてもよい。Ｒ５の炭素数は、好ましくは１～１０であり、より好ましくは１～５である。Ｒ５は、好ましくは炭素数１～１０のアルカンジイル基であり、より好ましくは炭素数１～５のアルカンジイル基である。
【0019】
Ｒ１が－Ｒ３－Ｎ３の場合の具体例としては、アジドデオキシグルコシド、アジドアルキルグルコシド（例えば、アジドエチルグルコシド）などが挙げられる。
【0020】
Ｒ４は、直接結合又は－ＯＲ６－を表す。Ｒ６は、炭素数１～２０の２価の炭化水素基を表す。該２価の炭化水素基としては、２価の脂肪族炭化水素基でもよく、２価の芳香族炭化水素基でもよい。２価の脂肪族炭化水素基としては、例えば、アルカンジイル基やアルケンジイル基などが挙げられ、直鎖でも分岐鎖を有してもよい。２価の芳香族炭化水素基としては、例えば、芳香環の置換基を持つ２価の脂肪族炭化水素基や、アレーンジイル基などが挙げられ、これらの芳香環にはアルキル基などの置換基が付加されてもよい。Ｒ６の炭素数は、好ましくは１～１０であり、より好ましくは１～５である。Ｒ６は、好ましくは炭素数１～１０のアルカンジイル基であり、より好ましくは炭素数１～５のアルカンジイル基である。
【0021】
Ｒ１が－Ｒ４－ＮＨ２の場合の具体例としては、アミノデオキシグルコシド、アミノアルキルグルコシド（例えば、アミノエチルグルコシド）などが挙げられる。
【0022】
セロビオース誘導体の例としては、下記一般式（２）で示すものが挙げられる。
式（２）中のＲ７は、式（１）中のＲ１と同じであり、波線はアノマー位の立体配位がα体、β体、または、α体とβ体の混合物であることを表す。
【化3】
【0023】
一実施形態において、プライマーは、グルコース及びそのアノマー位が修飾されたグルコース誘導体からなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。グルコース又はその誘導体を用いた場合、セロビオースを用いた場合に比べて、セロオリゴ糖が沈殿（析出）しやすく、精製がより容易になるというメリットがある。
【0024】
反応系におけるプライマーの初期濃度は、特に限定されず、例えば５～３００ｍｏｌ／ｍ３でもよく、１０～２００ｍｏｌ／ｍ３でもよく、３０～１００ｍｏｌ／ｍ３でもよい。反応系におけるスクロースとプライマーの仕込み時のモル比（スクロース／プライマー比）も、特に限定されず、例えば２０／１～１／１でもよく、１５／１～４／３でもよく、１０／１～２／１でもよい。
【0025】
リン酸は、ＳＰによるαＧ１Ｐの生成反応に用いられ、リン酸が存在することによりスクロースからαＧ１Ｐとフルクトースが生成される。リン酸としては、特に限定されず、無機リン酸でもよく、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウムなどの無機リン酸塩でもよく、これらをいずれか１種または２種以上組み合わせて用いてもよい。リン酸としてはリン酸緩衝液を用いてもよい。
【0026】
本実施形態では、反応系におけるリン酸濃度を３～１２０ｍｏｌ／ｍ３に設定する。リン酸濃度が３ｍｏｌ／ｍ３以上であることにより、ＳＰによるαＧ１Ｐの生成反応を促進してセロオリゴ糖の収率を高めることができる。リン酸濃度が１２０ｍｏｌ／ｍ３以下であることにより、ＣＤＰによる加リン酸分解を抑えてセロオリゴ糖の収率を高めることができる。反応系でのリン酸濃度は、７～８０ｍｏｌ／ｍ３であることが好ましく、より好ましくは８～７０ｍｏｌ／ｍ３である。
【0027】
ここで、反応系におけるリン酸濃度とは、中間生成物であるα－グルコース－１－リン酸として含まれる量を含めた反応系中の全リン酸濃度（モル濃度）であり、上記無機リン酸及び／又は無機リン酸塩のモル濃度とαＧ１Ｐのモル濃度の合計である。上記のようなリン酸濃度にするためには、例えば、上記無機リン酸及び／又は無機リン酸塩として反応系に仕込むリン酸の初期濃度を３～１２０ｍｏｌ／ｍ３、好ましくは７～８０ｍｏｌ／ｍ３、より好ましくは８～７０ｍｏｌ／ｍ３にすればよい。
【0028】
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）としては、由来は特に限定されず、例えば、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）やストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcusmutans）などの微生物由来のものを用いてもよい。
【0029】
反応系におけるＳＰの使用量は特に限定されず、例えば、０．００１～１０Ｕ／ｍＬでもよく、０．０１～１Ｕ／ｍＬでもよい。ＳＰの酵素量は、３７℃、ｐＨ７で１００ｍｏｌ／ｍ３のスクロースと５０ｍｏｌ／ｍ３のリン酸から１分間当たり１μｍｏｌのαＧ１Ｐを遊離する酵素量を１Ｕとして求められる。
【0030】
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）としては、由来は特に限定されず、例えば、クロストリジウム・サーモセラリム（Clostridium thermocellum）、セルロモナス（Cellulomonas）属などの微生物由来のものを用いてもよい。一例として、ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１－８に記載の方法に準じて、大腸菌発現系によりClostridium thermocellum YM4由来ＣＤＰを調製することができる。
【0031】
反応系におけるＣＤＰの使用量は特に限定されず、例えば、０．０１～１０Ｕ／ｍＬでもよく、０．１～１Ｕ／ｍＬでもよい。ＣＤＰの酵素量は、５０ｍｏｌ／ｍ３のαＧ１Ｐと５０ｍｏｌ／ｍ３のＤ－（＋）－セロビオース、および反応時間が１００分の際におけるαＧ１Ｐの転化率が１０％以下になるように所定倍率にて希釈したＣＤＰを含む３－モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を３７℃でインキュベーションし、ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間当たり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕとして求められる。
【0032】
本実施形態に係るＳＰとＣＤＰを用いた酵素反応は、通常は溶媒として水を含む反応液中で実施され、より詳細には、スクロースとプライマーとリン酸とＳＰとＣＤＰが所定濃度となるように溶媒とともに混合して調製された反応液を、所定温度に維持してインキュベーションすることにより行われる。
【0033】
反応温度としては、２５～４５℃であることが好ましい。反応温度が２５℃以上であることにより、酵素の反応速度を高めることができる。また、４５℃以下であることにより、セロオリゴ糖の収率低下を抑えることができる。
【0034】
反応時間としては、特に限定されず、例えば１時間～１５日間でもよく、１日間～１０日間でもよい。
【0035】
反応液のｐＨは約５．０～約９．０であることが好ましい。反応液のｐＨの調整は、反応に関与するリン酸緩衝液以外に、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝液、クエン酸、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）等を添加することにより行ってもよい。
【0036】
一実施形態において、上記酵素反応における溶媒として、水と水溶性有機溶媒を混合してなる混合溶媒を用いてもよい。すなわち、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、プライマーとスクロースにＳＰとＣＤＰを作用させてもよい。かかる混合溶媒を用いることにより、セロオリゴ糖の重合度分布を小さくすることができる。なお、混合溶液は、例えば、水溶液である緩衝液と水溶性有機溶媒とを混合して得られる。
【0037】
水溶性有機溶媒とは、２０℃において水１００ｍＬへの溶解度が５ｍＬ以上の有機溶媒であり、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔ－ブタノールなどの炭素数１～４のアルコール類； アセトンなどのケトン類； テトラヒドロフランなどのエーテル類 Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアミド類； アセトニトリルなどのニトリル類； ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類などが挙げられる。これらはいずれか一種用いても、２種以上組み合わせて用いてもよい。水溶性有機溶媒として、より好ましくは、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる群から選択される少なくとも一種を用いることである。
【0038】
水溶性有機溶媒と混合する緩衝液としては、特に限定されず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられ、反応温度において反応溶媒のｐＨを５～９程度に維持できる緩衝液が好ましく用いられる。
【0039】
水と水溶性有機溶媒との使用割合は、特に限定されず、混合溶媒１００体積％として、水溶性有機溶媒が５～５０体積％であることが好ましく、より好ましくは５～３０体積％であり、更に好ましくは８～２０体積％である。
【0040】
反応終了後、セロオリゴ糖を含む反応液を得ることができる。該反応液には酵素であるＳＰやＣＤＰ、スクロース、プライマーなどが含まれることがあるため、これらを除去するために洗浄を行ってもよい。洗浄は、遠心により沈殿物と上清を分離し、水などの洗浄溶媒を用いて沈殿物を再分散させる工程を繰り返すことにより行うことができ、セロオリゴ糖が得られる。
【0041】
得られるセロオリゴ糖は、グルコースがβ－１，４グリコシド結合により連結された構造を持つオリゴ糖である。セロオリゴ糖の重合度は、例えば４以上でもよく、５以上でもよく、６以上でもよく、また、例えば１６以下でもよく、１５以下でもよく、１３以下でもよい。平均重合度（ＤＰ）は、特に限定しないが、例えば５．５以上でもよく、６．０以上でもよく、６．５以上でもよく、７．０以上でもよい。平均重合度（ＤＰ）は、また、例えば１０．０以下でもよく、９．５以下でもよく、９．０以下でもよい。
【0042】
得られるセロオリゴ糖の一例としては、下記一般式（３）で表されるものが挙げられる。
式（３）中、Ｒ８は、ヒドロキシ基、Ｒ１、又はＲ７で表されることが好ましく、ｎは整数であり、セロオリゴ糖の重合度を示す。式中の波線はアノマー位の立体配位がα体、β体、または、α体とβ体の混合物であることを表す。
【化4】
【0043】
プライマーとしてグルコース又はセロビオースを用いた場合、Ｒ８はヒドロキシ基である。プライマーとして、上記式（１）で表されるグルコース誘導体を用いた場合、Ｒ８は上記一般式（１）のＲ１である。プライマーとして、上記式（２）で表されるセロビオース誘導体を用いた場合、Ｒ８は上記一般式（２）のＲ７である。このようにグルコース誘導体やセロビオース誘導体をプライマーとして用いた場合、還元末端のアノマー位が修飾された還元末端修飾セロオリゴ糖が得られる。本実施形態に係るセロオリゴ糖は、このようなセロオリゴ糖の誘導体も包含するものであり、ナトリウムイオン付加体やカリウムイオン付加体などのアルカリ金属イオン付加体も当然に包含される。なお、Ｒ８がアルコキシ基であるセロオリゴ糖を合成した後、加水分解することにより、Ｒ８がヒドロキシ基であるセロオリゴ糖を製造してもよい。
【0044】
本実施形態に係るセロオリゴ糖の用途は、特に限定されず、例えば医薬品分野など、公知の様々な用途に用いることができる。
【実施例0045】
以下、実施例により更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例においては、「ｍｏｌ／ｍ３」および「ｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ「ｍＭ」および「Ｍ」と表記する。
【0046】
［試薬］
本実施例において水は、特に記載しない限り、Ｍｉｌｌｉ－Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ａ－１０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製された超純水を使用した。
本実施例において水は、特に記載しない限り、Ｍｉｌｌｉ－Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ａ－１０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製された超純水を使用した。
【0047】
２００ｍＭリン酸緩衝液は、０．２Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液に、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を添加してｐＨ７．４に調整したものを用いた。なお、本実施例におけるリン酸の初期濃度は、リン酸二水素ナトリウムの濃度とリン酸水素二ナトリウムの濃度の合計である。
【0048】
１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液は、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）２３．８ｇを６０ｍＬの水に溶解させた水溶液に４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ７．５に調整した後、水で１００ｍＬにメスアップしたものを用いた。
【0049】
２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液は、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）４.１８ｇを６００ｍＬの水に溶解させた水溶液に４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ７．５に調整した後、水で１Ｌにメスアップし、さらにＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌したものを用いた。
【0050】
ＳＰ溶液は、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）粉末（Leuconostoc mesenteroides由来、オリエンタル酵母工業（株）社製）と２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）とを混合し、ＳＰが１０Ｕ／ｍＬとなるように調整したものを用いた。
【0051】
ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．、２００２年、４９、１－８に記載の方法に基づき調製した。詳細には、特許文献１（特開２０１９－１９３６０１号公報）の段落００６１～００７０に記載の方法によりＣＤＰを調製し、得られたＣＤＰを２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）とを混合し、ＣＤＰが１０Ｕ／ｍＬとなるように調整したものを用いた。
【0052】
ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ １－７ ＭＡＬＤＩ－ＭＳスタンダード（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｐ１４Ｒ ＭＡＬＤＩ－ＭＳスタンダード（Ｐ１４Ｒ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ ＡＣＴＨ Ｆｒａｇｍｅｎｔ １８－３９ ＭＡＬＤＩ－ＭＳスタンダード（ＡＣＴＨ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、アセトニトリルはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。
【0053】
スクロースは、ナカライテスクより購入した。プライマーとしては、グルコース、メチルグルコシド（Ｍｅ－ＧＬＣ）、アジドデオキシグルコシド（Ｎ３－ｄＧＬＣ）を用いた。グルコースとしては、Ｄ－（＋）－グルコースをナカライテスクより購入した。メチルグルコシドとしては、１－メチル－α－Ｄ－グルコピラノシドをナカライテスクより購入した。アジドデオキシグルコシドとしては、１－アジド－１－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシドをＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。
【0054】
その他の試薬は、特に表記しない限りナカライテスクより購入し、特級以上の試薬を使用した。
【0055】
［実施例１～５、比較例１］
２００ｍＭリン酸緩衝液、１Ｍスクロース水溶液、１Ｍグルコース水溶液、ＳＰ溶液、ＣＤＰ溶液および水を用いて、５ｍＬ容量のチューブに各成分の濃度が下記表１に記載の濃度となるように加えて５ｍＬ反応液を調製した。反応液のｐＨを表１に示す。該反応液をパラフィルムで密閉して４０℃で３日間インキュベートした。その後、チューブを１００℃で５分間加熱して酵素を失活させた。反応液を５０ｍＬ容量の遠沈管に移し、水で２０ｍＬにメスアップし、遠心分離（１５０００ｇ）を１０分間行い、上清を除去することにより精製した。この精製操作を５回繰り返し、セロオリゴ糖の水分散液を得た。得られた水分散液を７０℃で２４時間乾燥することにより、生成物としてセロオリゴ糖の乾燥物を得て、収量を測定した。
２００ｍＭリン酸緩衝液、１Ｍスクロース水溶液、１Ｍグルコース水溶液、ＳＰ溶液、ＣＤＰ溶液および水を用いて、５ｍＬ容量のチューブに各成分の濃度が下記表１に記載の濃度となるように加えて５ｍＬ反応液を調製した。反応液のｐＨを表１に示す。該反応液をパラフィルムで密閉して４０℃で３日間インキュベートした。その後、チューブを１００℃で５分間加熱して酵素を失活させた。反応液を５０ｍＬ容量の遠沈管に移し、水で２０ｍＬにメスアップし、遠心分離（１５０００ｇ）を１０分間行い、上清を除去することにより精製した。この精製操作を５回繰り返し、セロオリゴ糖の水分散液を得た。得られた水分散液を７０℃で２４時間乾燥することにより、生成物としてセロオリゴ糖の乾燥物を得て、収量を測定した。
【0056】
得られた生成物は下記式（４）で表されるセロオリゴ糖である。
【化5】
【0057】
［実施例６，７］
プライマーとしてグルコースに代えて、実施例６ではメチルグルコシド（Ｍｅ－ＧＬＣ）を用い、実施例７ではアジドデオキシグルコシド（Ｎ３－ｄＧＬＣ）を用い、その他は実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
プライマーとしてグルコースに代えて、実施例６ではメチルグルコシド（Ｍｅ－ＧＬＣ）を用い、実施例７ではアジドデオキシグルコシド（Ｎ３－ｄＧＬＣ）を用い、その他は実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
【0058】
得られた生成物は、実施例６では下記式（５）、実施例７では下記式（６）でそれぞれ表される還元末端修飾セロオリゴ糖である。
【化6】
【0059】
［実施例８］
実施例２において、インキュベートの温度を３０℃とした以外は、実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
実施例２において、インキュベートの温度を３０℃とした以外は、実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
【0060】
［実施例９］
実施例２において、反応液を調製する際に使用した水のうち０．２５ｍＬをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に置き換えることにより、反応液の溶媒をＤＭＳＯ５体積％を含む混合溶媒とした以外は、実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
実施例２において、反応液を調製する際に使用した水のうち０．２５ｍＬをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に置き換えることにより、反応液の溶媒をＤＭＳＯ５体積％を含む混合溶媒とした以外は、実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
【0061】
［実施例１０］
実施例２において、反応液を調製する際に使用した水のうち０．５ｍＬをＤＭＳＯに置き換えることにより、反応液の溶媒をＤＭＳＯ１０体積％を含む混合溶媒とした以外は実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
実施例２において、反応液を調製する際に使用した水のうち０．５ｍＬをＤＭＳＯに置き換えることにより、反応液の溶媒をＤＭＳＯ１０体積％を含む混合溶媒とした以外は実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
【0062】
［実施例１１］
実施例２において、反応液を調製する際に使用した水のうち０．５ｍＬをメタノールに置き換えることにより、反応液の溶媒をメタノール１０体積％を含む混合溶媒とした以外は実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
実施例２において、反応液を調製する際に使用した水のうち０．５ｍＬをメタノールに置き換えることにより、反応液の溶媒をメタノール１０体積％を含む混合溶媒とした以外は実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
【0063】
［実施例１２］
実施例２において、反応液を調製する際に使用した水のうち０．５ｍＬをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に置き換えることにより、反応液の溶媒をＤＭＦ１０体積％を含む混合溶媒とした以外は実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
実施例２において、反応液を調製する際に使用した水のうち０．５ｍＬをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に置き換えることにより、反応液の溶媒をＤＭＦ１０体積％を含む混合溶媒とした以外は実施例２と同様の操作を行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
【0064】
［比較例２］
１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１Ｍ αＧ１Ｐ水溶液、１Ｍグルコース水溶液、ＣＤＰ溶液および水を用いて、５ｍＬ容量のチューブに各成分の濃度がそれぞれ５００ｍＭ、２００ｍＭ、５０ｍＭ、および０．２Ｕ／ｍＬとなるように加えて５ｍＬの反応液を調製し、パラフィルムで密閉して４０℃で３日間インキュベートした。その後、チューブを１００℃で５分間加熱して酵素を失活させた。以降の精製および乾燥の工程は実施例１と同様の操作に行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１Ｍ αＧ１Ｐ水溶液、１Ｍグルコース水溶液、ＣＤＰ溶液および水を用いて、５ｍＬ容量のチューブに各成分の濃度がそれぞれ５００ｍＭ、２００ｍＭ、５０ｍＭ、および０．２Ｕ／ｍＬとなるように加えて５ｍＬの反応液を調製し、パラフィルムで密閉して４０℃で３日間インキュベートした。その後、チューブを１００℃で５分間加熱して酵素を失活させた。以降の精製および乾燥の工程は実施例１と同様の操作に行うことにより生成物を得て、収量を測定した。
【0065】
上記で得られた生成物について、セロオリゴ糖の平均重合度（ＤＰ）、重合度分布、収率を測定した。結果を表１に示す。なお、測定方法は以下のとおりである。
【0066】
（１）平均重合度
セロオリゴ糖の平均重合度は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）法により測定した。
セロオリゴ糖の平均重合度は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）法により測定した。
【0067】
質量電荷比の校正に用いる標準サンプルはＢｒａｄｙｋｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ １－７水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ１－７、０．０５質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５０質量％アセトニトリル）、Ｐ１４Ｒ水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ Ｐ１４Ｒ、０．１質量％ＴＦＡ）、ＡＣＴＨ ｆｒａｇｍｅｎｔ１８－３９水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ ＡＣＴＨ ｆｒａｇｍｅｎｔ１８－３９、０．１質量％ＴＦＡ）それぞれ５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＢＡ水溶液５μＬ、１．０質量％ＴＦＡ水溶液１μＬ、アセトニトリル４μＬを１．７ｍＬチューブ中で混合して調製した。
【0068】
生成物の測定サンプルは、０．１％（ｗ／ｖ）とした生成物の水分散液１μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＢＡ水溶液１μＬ、トリフルオロ酢酸（０．２体積％）のアセトニトリル溶液３μＬを、水酸化カリウム（３．３質量％）のメタノール溶液により洗浄したマイティーバイアル中で混合して調製した。
【0069】
標準サンプル及び生成物の測定サンプルそれぞれ１μＬをサンプルプレートにマウントし、風乾させる操作を５回繰り返した。１時間以上、真空乾燥し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＡＸＩＭＡ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、島津製作所）で測定した。測定条件はＭｏｄｅ：Ｌｉｎｅｒ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、Ｍａｓｓ Ｒａｎｇｅ：１．０－３０００．０、Ｍａｘ Ｌｅａｓｅｒ Ｒａｐ Ｒａｔｅ：１０、ｐｏｗｅｒ：１００、ｐｒｏｆｉｌｅｓ：１００、ｓｈｏｔｓ：２、Ｉｏｎ Ｇａｔｅ（Ｄａ）：Ｂｌａｎｋ５００、Ｐｕｌｓｅｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｔ （Ｄａ）：１０００．０とした。
【0070】
測定により得られたＭＳスペクトルは、Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ：Ｇａｕｓｓｉａｎ、Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ ｗｉｄｔｈ：１９、Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｆｉｌｔｅｒ ｗｉｄｔｈ：１０００の条件で処理した。
【0071】
測定サンプルにはナトリウムイオン付加体とカリウムイオン付加体が含まれるため、これらのピーク面積を合計し、各重合度のピーク面積を算出した。算出した各重合度のピーク面積の割合から重合度の平均値を算出し、平均重合度とした。
【0072】
（２）重合度分布
重合度分布は、上記で得られたＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを以下の式に従って解析することにより、平均重合度からの標準偏差を求め、該標準偏差を重合度分布とした。
重合度分布は、上記で得られたＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを以下の式に従って解析することにより、平均重合度からの標準偏差を求め、該標準偏差を重合度分布とした。
【数1】
【0073】
（３）収率
収率は、セロオリゴ糖（生成物）の収量と平均重合度から、下記式により、出発物質であるスクロースの転化率を算出した。
収率は、セロオリゴ糖（生成物）の収量と平均重合度から、下記式により、出発物質であるスクロースの転化率を算出した。
【数2】
【0074】
【表1】
【0075】
得られた生成物について赤外分光法（ＩＲ）によりセルロースＩＩ型の結晶構造を持つことを確認した。実施例１～１２によれば二段階合成により、比較例２の一段階合成と同様のセロオリゴ糖が得られており、平均重合度にも大きな差はなかった。
【0076】
一方、実施例１～１２であると、一段階合成である比較例２と比べて、セロオリゴ糖の収率が大きく向上していた。特に、実施例１～４の対比より、リン酸濃度が１０ｍＭおよび５０ｍＭの場合に収率が顕著に高かった。これに対し、リン酸濃度が１２０ｍＭを超える比較例１であると、収率が低く、一段階合成であると比較例２と同程度の収率しか得られなかった。
【0077】
実施例６はプライマーとしてメチルグルコシドを用いたものであり、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより還元末端がメトキシ基で置換されたセロオリゴ糖が生成されていることを確認した。すなわち、還元末端修飾セロオリゴ糖についても二段階合成で生成することができた。また、表１に示されるように、かかる還元末端修飾セロオリゴ糖を、未修飾のセロオリゴ糖と同等の収率および重合度分布で生成できることが分かる。
【0078】
実施例７はプライマーとしてアジドデオキシグルコシドを用いたものであり、プロトン核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）測定により、未修飾のセロオリゴ糖と比較して還元末端由来のピークが消失していることを確認した。また、フーリエ変換赤外分光スペクトル（ＦＴ－ＩＲ）測定により、２１２０ｃｍ－１付近にアジド基由来のピークを確認した。これにより、還元末端にアジド基を修飾できていることを確認した。また、表１に示されるように、かかるアジド付加セロオリゴ糖を、未修飾のセロオリゴ糖と同等の収率および重合度分布で生成できることが分かる。
【0079】
ここで、１Ｈ－ＮＭＲおよびＦＴ－ＩＲは、生成物の凍結乾燥物を用いて測定した。１Ｈ－ＮＭＲについては、Ｂｒｕｋｅｒ製ＡＶ－４００Ｍを用い、およそ１５ｍｇのセロオリゴ糖を５００μＬの４％重水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、積算回数１６回の条件で測定した。ＦＴ－ＩＲについては、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｎｉｃｏｌｅｔ６７００を用い、ＡＴＲ法、分解能２ｃｍ－１、積算回数３２回の条件で測定した。
【0080】
実施例９～１１は、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いた例であり、二段階合成の反応系において混合溶媒を用いることにより、実施例２に比べて重合度分布を小さくすることができた。
【0081】
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。