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特開2022-109136不死化間葉系細胞を含む細胞集団を製造する方法及び不死化間葉系細胞を含む細胞集団
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022109136
(43)【公開日】2022-07-27
(54)【発明の名称】不死化間葉系細胞を含む細胞集団を製造する方法及び不死化間葉系細胞を含む細胞集団
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20220720BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20220720BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220720BHJP
C12N 15/34 20060101ALN20220720BHJP
C12N 15/37 20060101ALN20220720BHJP
C12N 15/35 20060101ALN20220720BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20220720BHJP
A61K 35/28 20150101ALN20220720BHJP
A61K 35/50 20150101ALN20220720BHJP
A61L 27/36 20060101ALN20220720BHJP
A61L 27/38 20060101ALN20220720BHJP
A61K 48/00 20060101ALN20220720BHJP
A61K 35/76 20150101ALN20220720BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N5/077
C12N15/12
C12N15/34
C12N15/37
C12N15/35
A61P43/00 107
A61K35/28
A61K35/50
A61L27/36 100
A61L27/38 300
A61K48/00
A61K35/76
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021004492
(22)【出願日】2021-01-14
(71)【出願人】
【識別番号】500557048
【氏名又は名称】学校法人日本医科大学
(71)【出願人】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】林 真広
(72)【発明者】
【氏名】中石 智之
(72)【発明者】
【氏名】岡田 尚巳
(72)【発明者】
【氏名】山崎 吉之
【テーマコード（参考）】
4B065
4C081
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065BB40
4B065BD39
4B065CA44
4C081AB11
4C081BA12
4C081BC01
4C081CD34
4C081EA02
4C081EA11
4C081EA13
4C084AA13
4C084NA20
4C084ZB221
4C087AA03
4C087BB44
4C087BB58
4C087BB64
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA20
4C087ZB22
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、本発明は、継代培養が可能な不死化間葉系細胞を含む細胞集団を安定的に製造する方法、及び不死化間葉系細胞を含む細胞集団を提供することである。
【解決手段】本発明は、ａ）間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程；ｂ）ａ）の細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程；及びｃ）ｂ）の間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に、アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域をそれぞれコードする遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子、並びにＢｃｌ―ｘＬタンパク質をコードする遺伝子を備えたプラスミドを導入する工程；を含む、不死化間葉系細胞を含む細胞集団を製造する方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、ａ）間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程；ｂ）ａ）の細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程；及びｃ）ｂ）の間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に、アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域をそれぞれコードする遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子、並びにＢｃｌ―ｘＬタンパク質をコードする遺伝子を備えたプラスミドを導入する工程；を含む、不死化間葉系細胞を含む細胞集団を製造する方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程；
ｂ）ａ）の細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程；及び
ｃ）ｂ）の間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に、アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域をそれぞれコードする遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子、並びにＢｃｌ－ｘＬタンパク質をコードする遺伝子を備えたプラスミドを導入する工程；を含む、
不死化間葉系細胞を含む細胞集団を製造する方法。
ｂ）ａ）の細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程；及び
ｃ）ｂ）の間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に、アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域をそれぞれコードする遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子、並びにＢｃｌ－ｘＬタンパク質をコードする遺伝子を備えたプラスミドを導入する工程；を含む、
不死化間葉系細胞を含む細胞集団を製造する方法。
【請求項2】
前記工程ａ）で調製される細胞集団において、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上であり、かつ、ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記工程ａ）で調製される細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記工程ａ）で調製される細胞集団において、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ４５陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下であり、かつＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記間葉系細胞が、胎児付属物に由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞集団を無血清培地中で浮遊培養する工程をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で製造された細胞集団を構成する細胞にアデノ随伴ウイルスを産生するための遺伝子を導入する工程を含む、アデノ随伴ウイルスを産生する細胞を含む細胞集団を製造する方法。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で製造された、不死化間葉系細胞を含む細胞集団。
【請求項9】
不死化間葉系細胞を含む細胞集団であって、
前記細胞集団が、アデノウイルスのＥ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びＢｃｌ－ｘＬタンパク質をコードする遺伝子のうち、少なくとも１つを含む細胞を含み、かつ、
ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞を含む、細胞集団。
前記細胞集団が、アデノウイルスのＥ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びＢｃｌ－ｘＬタンパク質をコードする遺伝子のうち、少なくとも１つを含む細胞を含み、かつ、
ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞を含む、細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学、生化学等の分野で利用することができ、かつ、安定的に継代培養が可能な不死化した間葉系細胞を含む細胞集団を製造する方法及び不死化間葉系細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
間質性細胞に含まれる間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）は、骨髄、脂肪組織、歯髄、及び胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物に存在する体性幹細胞として知られる。体性幹細胞は、特に再生医療への応用が進められており、近年、間葉系細胞などの細胞を患者に投与し、組織や臓器の再生や機能改善を促進する新たな治療法の実用化が急速に進んでいる。例えば、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）や脊髄損傷の患者を対象とした骨髄間葉系細胞製剤や、重症心不全の患者を対象とした骨格筋芽細胞シートが、再生医療等製品として国内で販売されている。
【0003】
間葉系細胞は、通常、培養基材に接着する性質を有しており、前記細胞製剤を製造する際は、細胞を培養基材に接着させて増殖培養する工程に加えて、培養基材に接着した細胞を剥離する工程を要する。上述した骨髄間葉系細胞も培養基材に接着する性質を有しており、細胞を培養基材に接着させた状態で増殖培養した後、細胞を培養基材から剥離する工程を経て、細胞懸濁液を回収する。前記細胞を培養基材から剥離する方法としては、例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素や化学薬品を用いた化学的手段や、セルスクレーパーのような物理的に細胞を剥離する器具を用いた物理的手段が挙げられる。例えば、特許文献１は、トリプシンを培養基材に添加し、間葉系細胞を剥離させる方法を開示している。また、特許文献２には、温度によって細胞接着性が変化する温度応答性高分子を表面に被覆した培養基材を用い、温度変化によって培養基材から細胞を剥離する方法が開示されている。
【0004】
間葉系細胞は、通常、その細胞分裂の回数には制限がある。有用性の高い間葉系細胞、特に間葉系幹細胞を永久的に使用するために、骨髄間葉系細胞、羊膜間葉系細胞等の間葉系細胞を不死化する技術が知られる。非特許文献１には、骨髄幹細胞に、ｂｍｉ－１、ｈＴＥＲＴ、並びにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６及びＥ７をコードする塩基配列を有する遺伝子を導入することで、細胞の寿命が延長されたことが示されている。また、特許文献３には、羊膜細胞に、Ｅ１Ａ領域及びＥ２Ｂ領域の遺伝子産物の発現を引き起こす少なくとも１つの核酸を導入することを含む、永久羊膜細胞株を生成する方法が開示されている。特許文献４には、初代ヒト羊膜細胞に、アデノウイルス遺伝子機能Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする塩基配列を含む核酸分子を導入する工程、続いてＳＶ４０大型Ｔ抗原又はエブスタイ－バーウイルス（ＥＢＶ）核抗原１（ＥＢＮＡ－１）をコードする塩基配列を含む核酸分子を導入する工程を含む、永久ヒト羊膜細胞株の作製方法が開示されている。
【0005】
医薬用組成物等に使用される組換えポリペプチド又は組換えタンパク質の多くは、動物細胞、特に哺乳動物細胞、特にヒト由来の細胞を用いて産生される。哺乳動物、特にヒト由来の間葉系細胞を宿主とする組換えペプチド又は組換えタンパク質の産生についても研究が進められている。特許文献５には、Ａ５４９、ＨＥＲ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ等の動物細胞に、（ａ）動物細胞で作動可能なプロモーター、及び（ｂ）アデノウイルスＥ１コーディング変形遺伝子配列を含む発現コンストラクトが導入された、アデノウイルス生産細胞株が開示されている。上記の動物細胞として、ヒト羊膜細胞を使用可能であることも開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第５３９４９３２号公報
【特許文献2】国際公開公報２００１／０６８７９９
【特許文献3】特表２００３－５１４５２６
【特許文献4】特表２０１２－５１６６９０
【特許文献5】特表２０１５－５００００７
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Mori, T. et al. Combination of hTERT and bmi-1, E6, or E7 induces prolongation of the life span of bone marrow stromal cells from an elderly donor without affecting their neurogenic potential, Mol. Cell Biol., 25: 5183-5195, (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
特許文献３、４及び非特許文献１のように、不死化した、永久的に継代培養可能な間葉系細胞を取得する方法は知られている。しかし、本発明者らは、公知の方法で不死化遺伝子を導入した間葉系細胞が、必ずしも安定的に不死化細胞とはならないことを見出した。したがって、より安定的に不死化間葉系細胞を取得する方法が望まれる。
【0009】
本発明は、不死化間葉系細胞を含む細胞集団を安定的かつ効率的に製造する方法、及び不死化間葉系細胞を含む細胞集団を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、鋭意検討の結果、間葉系細胞を含む細胞集団を血小板溶解物を含む培地を用いて培養し、次いで、細胞集団を構成する細胞にアデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域をそれぞれコードする遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子、並びにＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子を備えたプラスミドを導入することで、安定的に不死化間葉系細胞を含む細胞集団が得らえることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
【0011】
（１）ａ）間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程；
ｂ）ａ）の細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程；及び
ｃ）ｂ）の間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に、アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域をそれぞれコードする遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子、並びにＢｃｌ－ｘＬタンパク質をコードする遺伝子を備えたプラスミドを導入する工程；を含む、
不死化間葉系細胞を含む細胞集団を製造する方法。
（２）前記工程ａ）で調製される細胞集団において、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつ、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上であり、かつ、ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞を含む、（１）の方法。
（３）前記工程ａ）で調製される細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下である、（１）又は（２）の方法。
（４）前記工程ａ）で調製される細胞集団において、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ４５陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下であり、かつＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、（１）～（３）のいずれかの方法。
（５）前記間葉系細胞が、胎児付属物に由来する、（１）～（４）のいずれかの方法。
（６）前記細胞集団を無血清培地中で浮遊培養する工程をさらに含む、（１）～（５）のいずれかの方法。
（７）（１）～（６）のいずれかの方法で製造された細胞集団を構成する細胞にアデノ随伴ウイルスを産生するための遺伝子を導入する工程を含む、アデノ随伴ウイルスを産生する細胞を含む細胞集団を製造する方法。
（８）（１）～（６）のいずれかの方法で製造された、不死化間葉系細胞を含む細胞集団。
（９）不死化間葉系細胞を含む細胞集団であって、前記細胞集団が、アデノウイルスのＥ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びＢｃｌ－ｘＬタンパク質をコードする遺伝子のうち少なくとも１つを含む細胞を含み、かつ、ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞を含む、細胞集団。
ｂ）ａ）の細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程；及び
ｃ）ｂ）の間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に、アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域をそれぞれコードする遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子、並びにＢｃｌ－ｘＬタンパク質をコードする遺伝子を備えたプラスミドを導入する工程；を含む、
不死化間葉系細胞を含む細胞集団を製造する方法。
（２）前記工程ａ）で調製される細胞集団において、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつ、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上であり、かつ、ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞を含む、（１）の方法。
（３）前記工程ａ）で調製される細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下である、（１）又は（２）の方法。
（４）前記工程ａ）で調製される細胞集団において、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ４５陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下であり、かつＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、（１）～（３）のいずれかの方法。
（５）前記間葉系細胞が、胎児付属物に由来する、（１）～（４）のいずれかの方法。
（６）前記細胞集団を無血清培地中で浮遊培養する工程をさらに含む、（１）～（５）のいずれかの方法。
（７）（１）～（６）のいずれかの方法で製造された細胞集団を構成する細胞にアデノ随伴ウイルスを産生するための遺伝子を導入する工程を含む、アデノ随伴ウイルスを産生する細胞を含む細胞集団を製造する方法。
（８）（１）～（６）のいずれかの方法で製造された、不死化間葉系細胞を含む細胞集団。
（９）不死化間葉系細胞を含む細胞集団であって、前記細胞集団が、アデノウイルスのＥ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びＢｃｌ－ｘＬタンパク質をコードする遺伝子のうち少なくとも１つを含む細胞を含み、かつ、ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞を含む、細胞集団。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、永久的に継代培養が可能な不死化間葉系細胞を含む細胞集団を、安定的かつ効率的に製造する方法、及び不死化間葉系細胞を含む細胞集団を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図5】図５は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生遺伝子を導入した、不死化羊膜間葉系細胞（羊膜細胞）、不死化骨髄間葉系細胞（骨髄細胞）及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、産生されたＡＡＶ２ゲノム濃度を比較するグラフである。いずれの細胞においてもＡＡＶ２が産生されることが確認された。
【発明を実施するための形態】
【0014】
［１］用語の説明
本明細書における「間葉系細胞」は「間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）」を含み、以下の定義を満たす細胞を指す。
本明細書における「間葉系細胞」は「間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）」を含み、以下の定義を満たす細胞を指す。
【0015】
「間葉系細胞」としては、各種組織及び器官から採取することができる体性細胞（組織細胞）のうち、下記の定義を満たす細胞を使用することができる。前記体性細胞としては例えば、骨髄細胞、骨髄幹細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、歯髄細胞、歯髄幹細胞、神経細胞、神経幹細胞、心筋細胞、心筋幹細胞、肝細胞、肝幹細胞、上皮細胞、上皮幹細胞、骨格筋細胞、骨格筋幹細胞、造血細胞、造血幹細胞、間葉系細胞、間葉系幹細胞、羊膜上皮由来の間葉系幹細胞、羊膜上皮由来の間葉系細胞、消化管上皮細胞、消化管上皮幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、滑膜幹細胞などが挙げられる。
【0016】
間葉系細胞の定義
ｉ）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。標準培地は、基礎培地（例：αＭＥＭ培地）に血清、血清代替試薬又は増殖因子（例：血清代替試薬であるヒト血小板溶解物）を添加した培地である。
ｉｉ）表面抗原のＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３２６が陰性である。
ｉ）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。標準培地は、基礎培地（例：αＭＥＭ培地）に血清、血清代替試薬又は増殖因子（例：血清代替試薬であるヒト血小板溶解物）を添加した培地である。
ｉｉ）表面抗原のＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３２６が陰性である。
【0017】
前記「間葉系細胞」は、上記ｉ)、ｉｉ）の定義を満たしていればよく、骨、軟骨、脂肪等への分化能の有無については特に限定されない。本明細書における「間葉系細胞」には、間葉系幹細胞のように、骨、軟骨及び脂肪への分化能を有している細胞も含まれる。また、前記「間葉系細胞」には、上記定義を満たしているものの、骨、軟骨、脂肪への分化能を有していない細胞も含まれる。また、前記「間葉系細胞」には、上記の定義を満たしているものの、骨、軟骨、脂肪のうち何れか１つ、又は２つにのみ分化する細胞も含まれる。
【0018】
本明細書において「不死化」間葉系細胞とは、当該細胞が生育可能な条件において、死滅することなく安定して分裂、増殖することが可能な細胞を指す。本明細書において、不死化間葉系細胞は、少なくとも６０回以上、７０回以上、８０回以上、９０回以上、１００回以上、１１０回以上、１２０回以上、１３０回以上、１４０回以上、１５０回以上、１６０回以上、１７０回以上、１８０回以上、１９０回以上、２００回以上の細胞分裂が可能である。
【0019】
本明細書において「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯および羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜および脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜で、内壁は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌する。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系細胞を含む。
【0020】
本明細書における「間葉系細胞を含む細胞集団」は、その形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞凝集塊、細胞シート、細胞浮遊液、細胞懸濁液、これらの凍結物等が挙げられる。
【0021】
本明細書において、所定の表面抗原について「陽性を呈する間葉系細胞の比率」とは、後記する実施例に記載の通り、フローサイトメトリーによって解析した所定の表面抗原について陽性である細胞の比率を示す。本明細書において、所定の表面抗原について陽性を呈する細胞の比率は「陽性率」と記載されることがあり、また、所定の表面抗原について陰性を呈する細胞の比率は「陰性率」と記載されることがある。
【0022】
本明細書において「間葉系細胞」、「間葉系細胞を含む細胞集団」及び「胎児付属物」は、好ましくはヒトに由来するものである。
【0023】
本明細書において、アデノウイルスの「Ｅ１Ａ」は、アデノウイルスの複製において、最初に発現するタンパク質であり、「Ｅ１Ｂ」はその次に発現するタンパク質である。アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂは、動物細胞のがん抑制遺伝子Ｒｂ及びｐ５３に結合して失活させることで、細胞をがん化させ、増殖可能とすることが知られる。Ｅ１Ａタンパク質は、配列番号１～３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するか、配列番号１～３のいずれかで表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。また、Ｅ１Ａタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１～３のいずれかで表される、又は配列番号１～３のいずれかで表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する。Ｅ１Ａタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、これらのタンパク質をコードする限り限定されないが、例えば、配列番号４で表される配列又は配列番号４の配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有する配列とすることができる。Ｅ１Ｂタンパク質は、配列番号５～８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するか、配列番号５～８のいずれかで表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。また、Ｅ１Ｂタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号５～８のいずれかで表される、又は配列番号５～８のいずれかで表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する。Ｅ１Ｂタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、これらのタンパク質をコードする限り限定されないが、例えば、配列番号９で表される配列又は配列番号９の配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有する配列とすることができる。
【0024】
本明細書において、「ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）」とは、ポリオーマウイルスに属するＤＮＡウイルスであり、マウス等の細胞に感染して一部を癌化させることが知られる。「ＳＶ４０大型Ｔ抗原」（以下、「ＬＴＡｇ」とも称する）は、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂタンパク質と同様に、癌抑制遺伝子であるＲｂ及びｐ５３に結合して失活させることが知られる。ＬＴＡｇは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するか、配列番号１０で表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。また、ＬＴＡｇをコードする遺伝子は、配列番号１０で表される、又は配列番号１０で表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する。ＬＴＡｇをコードする遺伝子の塩基配列は、これらのタンパク質をコードする限り限定されないが、例えば、配列番号１１で表される配列又は配列番号１１の配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有する配列とすることができる。
【0025】
本明細書において、「Ｂｃｌ－ｘＬ」とは、Ｂｃｌ２ファミリーに属する、アポトーシスを抑制するタンパク質であり、Ｂｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子は癌遺伝子として知られる。Ｂｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子は、いずれの動物由来であってもよいが、例えばニワトリ由来のものを好適に使用できる。Ｂｃｌ－ｘＬタンパク質は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するか、配列番号１２で表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。また、Ｂｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子は、配列番号１２で表される、又は配列番号１２で表される配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する。Ｂｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子の塩基配列は、これらのタンパク質をコードする限り限定されないが、例えば、配列番号１３で表される配列又は配列番号１３の配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有する配列とすることができる。
【0026】
表面抗原の「ＣＤ３２４」は、分化クラスター３２４を意味し、上皮カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）としても知られているタンパク質である。
【0027】
表面抗原の「ＣＤ９０」は、分化クラスター９０を意味し、Ｔｈｙ－１としても知られているタンパク質である。
【0028】
表面抗原の「ＣＤ３２６」は分化クラスター３２６を意味し、ＥｐＣＡＭとしても知られているタンパク質である。
【0029】
表面抗原の「ＣＤ７３」は、分化クラスター７３を意味し、５－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ、或いはＥｃｔｏ－５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅとしても知られているタンパク質である。
【0030】
表面抗原の「ＣＤ１６６」は、分化クラスター１６６を意味し、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＡＬＣＡＭ）としても知られているタンパク質である。
【0031】
表面抗原の「ＣＤ１０５」は、分化クラスター１０５を意味し、Ｅｎｄｏｇｌｉｎとしても知られているタンパク質である。
【0032】
表面抗原の「ＣＤ４５」は、分化クラスター４５を意味し、ＰＴＰＲＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ，Ｃ）、或いはＬＣＡ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）としても知られているタンパク質である。
【0033】
表面抗原の「ＣＤ３４」は、分化クラスター３４を意味し、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ３４としても知られているタンパク質である。
【0034】
本明細書において、「テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）」は、テロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）とともに複合体のテロメラーゼを構成するタンパク質である。テロメラーゼは、染色体末端に結合し、ＴＥＲＣを鋳型としてテロメアＤＮＡの３’末端にテロメア繰り返し配列を付加する。テロメラーゼは、ヒトにおいて通常の体細胞ではほとんど発現しないが、胎児細胞、生殖細胞等では発現が見られる。テロメラーゼ活性を持たない細胞は、細胞分裂に伴いテロメアが短縮して細胞老化を起こすため、細胞分裂の回数に制限があるが、テロメラーゼ活性を有する細胞は、テロメラーゼ活性によりテロメア長が維持されるため、制限のない細胞増殖が可能である。本明細書において、細胞の不死化の指標として、ＴＥＲＴ遺伝子の発現が使用される。
【0035】
［２］不死化間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明の不死化間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法は、
ａ）間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程；
ｂ）ａ）の細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程；及び
ｃ）ｂ）間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に、アデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂをそれぞれコードする遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子、並びにＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子を備えたプラスミドを導入する工程；を含む、方法である。
本発明の不死化間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法は、
ａ）間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程；
ｂ）ａ）の細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程；及び
ｃ）ｂ）間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に、アデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂをそれぞれコードする遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする遺伝子、並びにＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子を備えたプラスミドを導入する工程；を含む、方法である。
【0036】
［２－１］間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程
本発明の方法において、「間葉系細胞を含む細胞集団」とは、少なくとも間葉系細胞を含む細胞集団であれば特に限定されず、他の細胞を含む集団であってもよい。特に限定されないが、前記間葉系細胞を含む細胞集団における間葉系細胞の比率は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上でもよい。
本発明の方法において、「間葉系細胞を含む細胞集団」とは、少なくとも間葉系細胞を含む細胞集団であれば特に限定されず、他の細胞を含む集団であってもよい。特に限定されないが、前記間葉系細胞を含む細胞集団における間葉系細胞の比率は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上でもよい。
【0037】
また、前記間葉系細胞を含む細胞集団における他の細胞の比率は、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下でもよい。なお、前記他の細胞は、間葉系細胞以外であれば特に限定されないが、例えばリンパ球、顆粒球、赤血球などの血球系細胞を挙げることができる。
【0038】
本発明の方法に使用される間葉系細胞を含む細胞集団は、上記の定義ｉ）及びｉｉ）を満たす細胞を含む細胞集団であれば、特に限定されないが、下記（ａ）及び（ｂ）の特性を有するように調製された細胞集団とすることが好ましい。
（ａ）前記細胞集団においてＣＤ３２４が陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＣＤ９０が陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である。
前記特性を備えることにより、間葉系細胞を含む細胞集団は、培養後に基材から自発的に剥離することができる。これにより、特許文献１又は２に記載の方法のような酵素や特殊な装置を用いることなく、培養後の細胞を効率よく取得することが可能となる。
（ａ）前記細胞集団においてＣＤ３２４が陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＣＤ９０が陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である。
前記特性を備えることにより、間葉系細胞を含む細胞集団は、培養後に基材から自発的に剥離することができる。これにより、特許文献１又は２に記載の方法のような酵素や特殊な装置を用いることなく、培養後の細胞を効率よく取得することが可能となる。
【0039】
前記細胞集団において、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上でもよい。
【0040】
前記細胞集団において、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよく、１００％でもよい。
【0041】
本発明の方法の一以上の実施態様において、前記細胞集団は、好ましくは、ＣＤ３２６陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下である。
【0042】
前記細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、３％以下（陰性率９７％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
【0043】
本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系細胞を含む細胞集団は、好ましくは、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、ＣＤ４５陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下である、ＣＤ３４陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下である、のうち１以上を満足する。
【0044】
前記細胞集団においてＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよく、１００％でもよい。
【0045】
前記細胞集団においてＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよい。
【0046】
前記細胞集団においてＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは７４％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上でもよい。
【0047】
前記細胞集団においてＣＤ４５陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、３％以下（陰性率９７％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
【0048】
前記細胞集団においてＣＤ３４陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、３％以下（陰性率９７％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
【0049】
ここで、ＣＤ３２４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ３２６陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ４５陽性及びＣＤ３４陽性を呈する間葉系細胞とは、それぞれ、ＣＤ３２４、ＣＤ９０、ＣＤ３２６、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５、ＣＤ４５及びＣＤ３４の発現が陽性である間葉系細胞を意味する。
【0050】
本発明の方法の一以上の実施態様で使用される細胞集団について、指標とする発現マーカー（ＣＤ３２４、ＣＤ９０、ＣＤ３２６、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５、ＣＤ４５又はＣＤ３４）は、当該技術分野において公知の任意の検出方法により検出することができる。発現マーカーを検出する方法としては、例えばフローサイトメトリー又は細胞染色が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。なお、本明細書において、発現マーカーと表面抗原は同義であり、両者は置き換えて使うことができる。
【0051】
本発明の方法の一以上の実施態様に使用される細胞集団は、分化能の有無は特に限定されないが、好ましくは、軟骨組織への分化能を有し、且つ、脂肪組織への分化能が低い又は有さず、好ましくは更に、骨組織への分化能が低い又は有さないものである。
【0052】
本発明の方法の一以上の実施態様に使用される細胞集団は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。上記の細胞集団は、間葉系細胞以外に、任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0053】
本発明の方法で使用される間葉系細胞を含む細胞集団は、市販の間葉系幹細胞（例えば、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ間葉系幹細胞、Ｌｏｎｚａ社製）など）を培養して調製してもよい。あるいは、骨髄穿刺にて採取した骨髄液、羊膜などの胎児付属物等より、間葉系細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程を更に含んでもよい。
【0054】
本発明の間葉系細胞を含む細胞集団を製造するための原料は、前記の骨髄液や胎児付属物とすることができるが、これに限定されない。前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を得るために、胎児付属物を使用することが好ましい。以下、胎児付属物を原料とする間葉系細胞を含む細胞集団を調製する態様について、例示的に説明する。
【0055】
羊膜は、上皮細胞層と細胞外基質層からなり、後者には羊膜ＭＳＣが含まれている。上記の細胞集団取得工程は、羊膜を帝王切開により得る工程を更に含む工程でもよい。
【0056】
胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団は、好ましくは、胎児付属物から採取した、上皮細胞層と間葉細胞層とを含む試料を少なくともコラゲナーゼで処理して得た細胞集団である。
【0057】
胎児付属物から採取した試料（好ましくは上皮細胞層と間葉系細胞層とを含む試料）の酵素処理は、好ましくは、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系細胞を遊離することができ、かつ上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）による処理である。かかる酵素としては、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及び／又はディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。
【0058】
コラゲナーゼの活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、コラゲナーゼの活性濃度は、特に限定されないが、例えば、１０００ＰＵ／ｍｌ以下、９００ＰＵ／ｍｌ以下、８００ＰＵ／ｍｌ以下、７００ＰＵ／ｍｌ以下、６００ＰＵ／ｍｌ以下、５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、ＦＩＴＣ－ｃｏｌｌａｇｅｎ １ｕｇを１分間で分解する酵素量と定義する。
【0059】
金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１５０ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１９０ＰＵ／ｍｌ以上である。また、金属プロテイナーゼの活性濃度は、好ましくは１０００ＰＵ／ｍｌ以下、より好ましくは９００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは７００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、金属プロテイナーゼとしてディスパーゼを用いた態様において、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、乳酸カゼインから１分間に１ｕｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、胎児付属物の上皮細胞層に含まれる上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれる間葉系細胞を効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の胎児付属物の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。
【0060】
生細胞を効率的に回収する観点から、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを組み合わせて胎児付属物を処理することが好ましい。さらに好ましくは、前記組み合わせによって胎児付属物を同時一括に処理する。この場合の金属プロテイナーゼとしては、サーモリシン及び／又はディスパーゼを使用することができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを含有する酵素液を用いて胎児付属物を一回のみ処理することにより、間葉系細胞を簡便に取得することができる。また、同時一括に処理することにより、細菌やウイルス等のコンタミネーションのリスクを低減することができる。
【0061】
胎児付属物の酵素処理は、生理食塩水やハンクス平衡塩溶液等の洗浄液を用いて洗浄した羊膜を酵素液に浸漬し、撹拌手段によって撹拌しながら処理することが好ましい。かかる撹拌手段としては、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系細胞を効率よく遊離させる観点から、例えば、スターラー又はシェーカーを使用することができるが、これらに限定されない。撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、５ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、２０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、４０ｒｐｍ以上又は５０ｒｐｍ以上である。また、撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、１００ｒｐｍ以下、９０ｒｐｍ以下、８０ｒｐｍ以下、７０ｒｐｍ以下又は６０ｒｐｍ以下である。酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、６０分以上、７０分以上、８０分以上又は９０分以上である。また、酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１１０分以下、１００分以下である。酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、１５℃以上、１６℃以上、１７℃以上、１８℃以上、１９℃以上、２０℃以上、２１℃以上、２２℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、２６℃以上、２７℃以上、２８℃以上、２９℃以上、３０℃以上、３１℃以上、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、３５℃以上又は３６℃以上である。また、酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、４０℃以下、３９℃以下、３８℃以下又は３７℃以下である。
【0062】
所望により、遊離した間葉系細胞を含む酵素溶液からフィルター、遠心分離や中空糸分離膜、セルソーター等の公知の手段により遊離した間葉系細胞を分離及び／又は回収することができる。好ましくは、フィルターによって遊離した間葉系細胞を含む酵素溶液を濾過する。前記酵素溶液をフィルターによって濾過する態様においては、遊離した細胞のみがフィルターを通過し、分解されなかった上皮細胞層はフィルターを通過できずにフィルター上に残るため、遊離した間葉系細胞を容易に分離及び／又は回収することができるだけでなく、細菌やウイルス等のコンタミネーションのリスクも低減することができる。フィルターとしては、特に限定されないが、例えば、メッシュフィルターを挙げることができる。メッシュフィルターのポアサイズ（メッシュの大きさ）は、特に限定されないが、例えば、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、又は９０μｍ以上である。また、メッシュフィルターのポアサイズは、特に限定されないが、例えば、２００μｍ以下、１９０μｍ以下、１８０μｍ以下、１７０μｍ以下、１６０μｍ以下、１５０μｍ以下、１４０μｍ以下、１３０μｍ以下、１２０μｍ以下、１１０μｍ以下、又は１００μｍ以下である。濾過速度に関しては特に限定されないが、メッシュフィルターのポアサイズを上記の範囲とすることにより、間葉系細胞を含む酵素溶液を自然落下により濾過することができ、これにより細胞生存率の低下を防止することができる。
【0063】
メッシュフィルターの材質としては、ナイロンが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ、９５μｍ又は１００μｍのナイロンメッシュフィルターを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロン及びポリエステル）が利用できる。さらに、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュフィルター、ポアサイズ：４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュフィルター等も用いることが可能である。
【0064】
間葉系細胞をフィルター通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なフィルター通過も可能であるが、細胞に損傷を与えることを避けるため、できるだけ弱い圧力とすることが望ましい。
【0065】
フィルターを通した間葉系細胞を含む細胞集団は、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を用いることができるが、これらに限定されない。
【0066】
［２－２］間葉系細胞を含む細胞集団を血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程
本発明の方法は、［２－１］の項に示す方法で調製された間葉系細胞を含む細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程を含む。
本発明の方法は、［２－１］の項に示す方法で調製された間葉系細胞を含む細胞集団を、血小板溶解物を含む培地を用いて培養する工程を含む。
【0067】
本発明者らは、間葉系細胞を含む細胞集団を不死化して継代培養を行うにあたり、不死化工程の前の細胞集団の培養条件が、その後の継代培養の安定性に影響を与えることを見出した。
【0068】
本発明の方法における「血小板溶解物（ＰＬ：Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅ）」は、好ましくは哺乳動物（例えば、ウシ）の血小板溶解物であり、より好ましくはヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）である。ｈＰＬは、成長因子及び各種サイトカインが含まれ、特に間質系幹細胞の成育に適する成分であることが知られている。本発明の方法は、間葉系細胞を含む細胞集団の培養を、ＰＬ（特にｈＰＬ）を添加した培地（以下、単に「ＰＬ培地」又は「ｈＰＬ培地」とも称する）で行うことで、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の他成分を添加した培地と比較して、後段の不死化工程後の細胞の継代培養時の生存率を顕著に高めることできる。これにより、安定的に不死化間葉系細胞を含む細胞集団を得ることが可能となる。
【0069】
細胞集団を培養する工程における細胞の播種密度は、特に限定されないが例えば、例えば５００～１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種することができる。前記播種密度の下限としては、例えば５００細胞／ｃｍ２以上、１，０００細胞／ｃｍ２以上、２，０００細胞／ｃｍ２以上、３，０００細胞／ｃｍ２以上、４，０００細胞／ｃｍ２以上、５，０００細胞／ｃｍ２以上が好ましい。また、前記播種密度の上限としては、例えば１０，０００細胞／ｃｍ２以下、９，０００細胞／ｃｍ２以下、８，０００細胞／ｃｍ２以下、７，０００細胞／ｃｍ２以下が好ましい。
【0070】
なお、上記培養する工程は、継代工程を含んでもよい。上記の１回の培養の培養期間としては、例えば４～１０日間を挙げることができ、より具体的には、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間を挙げることができる。
【0071】
上記の培養に用いる培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、これにＰＬ、好ましくはｈＰＬを添加して調製される。ｈＰＬの培地中の濃度の下限としては例えば、終濃度として１重量％以上、２重量％以上、３重量％以上を挙げることができる。また、ｈＰＬの培地中の濃度の上限としては例えば、２０重量％以下、１０重量％以下、７重量％以下が好ましい。
【0072】
基礎培地には、さらに、必要に応じて他の成分（血清、増殖因子など）を適宜添加してもよい。なお、前記基礎培地に増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなど）を、増殖因子に加えて、さらに添加することにより調製してもよいし、増殖因子をあらかじめゲルや多糖類などで安定化しておき、その後、安定化した増殖因子を前記基礎培地に対して添加することで調製してもよい。このように、間葉系細胞を含む細胞集団を培養するために、基礎培地にＰＬ、好ましくはｈＰＬを添加した培地を、標準培地と定義する。
【0073】
基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。好ましい基礎培地としてはαＭＥＭ培地が例示できる。
【0074】
基礎培地に添加し得る他の成分としては例えば、アルブミン、ウシ血清、又は増殖因子などが挙げられる。なかでも、アルブミン、ウシ血清及び増殖因子を含まない基礎培地中で培養を行うことが好ましい。
【0075】
間葉系細胞を含む細胞集団の培養は、例えば、以下のような工程にて行うことができる。まず、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いて培養する。上記のような培養により取得した細胞は、１回培養した細胞である。
【0076】
上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回目の培養でコンフルエント率９５％以下となるまで培養した細胞を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上、５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いて培養する。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、ｎ回継代した細胞を取得することができる（ｎは１以上の整数を示す）。継代培養を行う場合は、細胞をコンフルエント率９５％以下となるまで培養し、上記の手順で細胞を剥離して回収し、次代の培養に用いることができる。継代回数ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上である。また、継代回数ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下、３０回以下であることが好ましい。
【0077】
［２－３］細胞集団を選別する工程
本発明の方法は、必要に応じて、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程を含んでもよい。
（ａ）ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、
（ｂ）ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である。
本発明の方法は、必要に応じて、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程を含んでもよい。
（ａ）ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、
（ｂ）ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である。
【0078】
前記特性を指標として細胞集団を選別する手段は、例えばＦＡＣＳ、セルソーター、磁気ビーズによる分取などの物理的な手段や、適切な培養条件によって指標を満たさない細胞を淘汰し、上記指標を満たすように間葉系細胞を含む細胞集団を純化させる化学的な手段を挙げることができるが、その手段は特に限定されず、培養条件等に応じて適宜選択すればよい。なお、選別工程においても、培養は、血小板溶解物を含む培地で実施することが好ましい。
【0079】
上記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別するタイミングは、特に限定されないが、例えば、培養前、培養の途中、培養後、細胞集団の回収前、細胞集団の回収後、細胞の凍結保存ストック作成前、細胞の凍結保存ストックを解凍した後、等を挙げることができる。
【0080】
上記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する手順について、さらに詳細に説明する。
例えば、間葉系細胞を含む細胞集団を培養基材に播種し、培養基材上で増殖培養することにより、ＣＤ３２４陽性、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞がポジティブセレクションされ、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上となった細胞集団を剥離・回収する手段が挙げられる。このとき、抗ＣＤ３２４抗体や抗ＣＤ９０抗体によりコーティングした培養基材を用いて培養しても良い。間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を培養により選別するタイミングは特に限定されず、任意の継代培養において選別することができるが、初代培養において間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を選別することが好ましい。
例えば、間葉系細胞を含む細胞集団を培養基材に播種し、培養基材上で増殖培養することにより、ＣＤ３２４陽性、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞がポジティブセレクションされ、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上となった細胞集団を剥離・回収する手段が挙げられる。このとき、抗ＣＤ３２４抗体や抗ＣＤ９０抗体によりコーティングした培養基材を用いて培養しても良い。間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を培養により選別するタイミングは特に限定されず、任意の継代培養において選別することができるが、初代培養において間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を選別することが好ましい。
【0081】
また、フローサイトメトリーや磁気ビーズを用いた細胞分離法により、間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を選別することもできる。
【0082】
細胞集団の選別は更に、ＣＤ３２６陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下である細胞集団を選別して分取することが好ましく、更に、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、ＣＤ４５陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下である、ＣＤ３４陽性を呈する間葉系細胞の比率が１０％以下である、のうち１以上を満足する細胞集団を選別して分取することが好ましい。選別した細胞集団を、更に上記の手段で培養してもよい。
【0083】
［２－４］間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に不死化プラスミドを導入する工程
本発明の方法は、アデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂをそれぞれコードする遺伝子、ＬＴＡｇをコードする遺伝子、並びにＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子を備えたプラスミド(以下、「不死化プラスミド」とも称する)を、間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に導入する工程を含む。本発明の方法で使用するプラスミドは、１つのプラスミドがＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＬＴＡｇ及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子をすべて備えてもよく、また、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＬＴＡｇ及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子を２種以上のプラスミドが分けて備えていてもよい。好ましくは、１つのプラスミドがＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＬＴＡｇ及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子をすべて備える。
本発明の方法は、アデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂをそれぞれコードする遺伝子、ＬＴＡｇをコードする遺伝子、並びにＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子を備えたプラスミド(以下、「不死化プラスミド」とも称する)を、間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に導入する工程を含む。本発明の方法で使用するプラスミドは、１つのプラスミドがＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＬＴＡｇ及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子をすべて備えてもよく、また、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＬＴＡｇ及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子を２種以上のプラスミドが分けて備えていてもよい。好ましくは、１つのプラスミドがＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＬＴＡｇ及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子をすべて備える。
【0084】
本発明の方法で使用する不死化プラスミドは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＬＴＡｇ及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子に加えて、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＳＶプロモーター等のプロモーター、ＳＶ４０ポリＡ、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）、及び／又はネオマイシン等の耐性遺伝子の塩基配列を有する核酸を備えていてもよい。
【0085】
ＣＭＶプロモーターの塩基配列は、プロモーター活性を有する塩基配列であれば特に限定されないが、例えば、配列番号１４で表される配列又は配列番号１４の配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有する配列とすることができる。
【0086】
ＳＶ４０ポリＡの塩基配列は、ＳＶ４０を構成するポリＡの塩基配列であれば特に限定されないが、例えば、配列番号１５で表される配列又は配列番号１５の配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有する配列とすることができる。
【0087】
ＩＲＥＳ配列は、翻訳開始サイトとしての機能を有すれば特に限定されないが、例えば、配列番号１６で表される配列又は配列番号１６の配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有する配列とすることができる。
【0088】
ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）の塩基配列は、遺伝子産物がネオマイシン耐性活性を有するものであれ特に限定されないが、例えば、配列番号１７で表される配列又は配列番号１７の配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の同一性を有する配列とすることができる。
【0089】
前記プラスミドを、前記間葉系細胞を含む細胞集団を構成する細胞に導入する手段は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびこれらの手段の組み合わせをいずれも使用できる。あるいは、市販のキット（例えば、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）２／２ｂ（Ｌｏｎｚａ社））を用いて実施してもよい。
【0090】
本発明の方法は、必要に応じて、前記細胞集団を構成する細胞に、目的の遺伝子がトランスフェクトされたか確認する工程を備えていてもよい。具体的には、例えば、細胞集団からゲノムを抽出し、抽出したゲノムをテンプレートとしてトランスフェクトした遺伝子のＰＣＲを行う方法が挙げられる。例えば、ゲノムをテンプレートとして、アデノウイルスのＥ１領域を増幅するように設計されたプライマー（例えば、配列番号１８、１９の塩基配列を有する）を用いて、ＰＣＲにおける核酸増幅の有無を観察することで、導入の確認が可能である。
【0091】
また、本発明の方法は、必要に応じて、前記細胞集団が不死化間葉系細胞を含むかを確認する工程を備えていてもよい。不死化は、細胞集団におけるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子の発現量を測定することで確認することができる。具体的には、例えば、細胞集団からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＴＥＲＴ遺伝子を増幅・検出するように設計されたプライマー及びプローブ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ、Ｎｏ：Ｈｓ００９７２６５０＿ｍ１）を用いて、リアルタイムＰＣＲにおける核酸増幅速度を測定することで、ＴＥＲＴ遺伝子の発現量を測定することができる。本発明の方法において、ＴＥＲＴ遺伝子は、好ましくはヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）遺伝子である。
【0092】
［２－５］細胞集団を浮遊培養する工程
本発明の方法は、不死化間葉系細胞を含む細胞集団を浮遊培養する工程を含んでいてもよい。浮遊培養を行う対象となる細胞集団は、上記［２－４］の項で調製した不死化間葉系細胞を含む細胞集団でもよく、また、後述の［２－６］の項でウイルス産生遺伝子を導入した不死化間葉系細胞を含む細胞集団であってもよい。
本発明の方法は、不死化間葉系細胞を含む細胞集団を浮遊培養する工程を含んでいてもよい。浮遊培養を行う対象となる細胞集団は、上記［２－４］の項で調製した不死化間葉系細胞を含む細胞集団でもよく、また、後述の［２－６］の項でウイルス産生遺伝子を導入した不死化間葉系細胞を含む細胞集団であってもよい。
【0093】
間葉系細胞は、通常は接着培養で培養されるが、一部の実施態様において、本発明の方法で製造された不死化間葉系細胞を含む細胞集団は、無血清培地中で浮遊培養することが可能である。無血清培地としては、動物細胞の浮遊培養に適した、血清成分及び血清代替成分を含まない既存の液体培地を使用できる。特にヒト細胞の浮遊培養に適した培地を好適に使用できる。このような無血清培地としては、特に限定されないが、例えば、ＣＤ ２９３ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＤ ２９３ ＡＧＴ（商標） Ｍｅｄｉｕｍ、２９３ ＳＦＭ ＩＩ及びＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＤ ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（商標） Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標） Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ ＩＩ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｐｒｏ２９３（商標）ａ Ｓｅｒｕｍ―ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｐｒｏ２９３（商標）ｓ Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＰｒｏＣＨＯ（商標） ４ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ、ＰｒｏＣＨＯ（商標） ４ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ、ＰｒｏＣＨＯ（商標） ５ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ、ＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標） １ Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標） ２ Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＭｅｄｉｕｍＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標） ３ Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＭｅｄｉｕｍＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標） ＧＳ Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＣＨＯ ＭｅｄｉｕｍＰｏｗｅｒＣＨＯ Ａｄｖａｎｃｅ（商標） Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（いずれもＬｏｎｚａ社）、ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３、ＳＦＭ４ＨＥＫ２９３、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３、ＨｙＣｅｌｌ ＴｒａｎｓＦｘ－Ｈ、ＣＤＭ４ＰＥＲＭＡｂ、ＨｙＣｅｌｌ ＣＨＯ、ＡｃｔｉＰｒｏ、ＡｃｔｉＳＭ（いずれもＣｙｔｉｖａ社）が挙げられる。特に、２９３ ＳＦＭ ＩＩを好適に使用できる。
【0094】
本発明の方法で製造された不死化間葉系細胞を含む細胞集団は、上記の通り、浮遊培養が可能であるため、接着培養のように培養基材を必要とせず、よって、培養基材からの細胞の剥離も必要としない。そのため、継代培養をより簡便に行うことが可能である。また、接着培養と比較して、より効率的な細胞増殖が可能である。
【0095】
［２－６］アデノ随伴ウイルス産生遺伝子を導入する工程
上記の方法で製造された不死化間葉系細胞を含む細胞集団について、これを構成する細胞にアデノ随伴ウイルスを産生するための遺伝子を導入して、アデノ随伴ウイルスを産生する細胞を含む細胞集団を製造することができる。
上記の方法で製造された不死化間葉系細胞を含む細胞集団について、これを構成する細胞にアデノ随伴ウイルスを産生するための遺伝子を導入して、アデノ随伴ウイルスを産生する細胞を含む細胞集団を製造することができる。
【0096】
上記の方法で製造される細胞集団は、不死化細胞を含むことから、ＡＡＶ産生遺伝子を導入し、ＡＡＶを産生させることが可能となった。
【0097】
ＡＡＶは、パルボウイルスに属する非病原性のウイルスであり、自己複製能を欠くため、自律的増殖が出来ず、通常は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスの共感染を必要とする。感染性及び免疫原性が低いことから、安全性が高く、かつ、宿主域が広いウイルスである。このような特徴から、ＡＡＶは遺伝子導入のベクターとして、遺伝子治療等への幅広い応用が期待されるウイルスである。
【0098】
ＡＡＶのゲノムは、約４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡで、両端にＩＴＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれるＴ字型のヘアピン構造が存在し、間にＲｅｐ（複製、転写に関連）、Ｃａｐ（外殻タンパク質をコード）及びＡＡＰ（ウイルス粒子形成）の３つのＯＲＦが存在する。ＡＡＶには複数の血清型が存在する。ヒト細胞から発見された血清型としては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５及びＡＡＶ６が知られる。
【0099】
ＡＡＶを産生するための遺伝子は、不死化間葉系細胞に導入することでＡＡＶが産生されるものであれば特に限定されないが、例えば、以下の３つのプラスミドベクターで構成されてもよい。
・ｐＡＡＶベクター：目的遺伝子の発現カセットと２つのＩＴＲを含むベクタープラスミド
・ｐＲＣベクター：ＡＡＶ２のＲｅｐ遺伝子と各血清型のＣａｐ遺伝子を含むプラスミド
・ｐＨｅｌｐｅｒベクター：アデノウイルス由来のＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡを含むプラスミド
・ｐＡＡＶベクター：目的遺伝子の発現カセットと２つのＩＴＲを含むベクタープラスミド
・ｐＲＣベクター：ＡＡＶ２のＲｅｐ遺伝子と各血清型のＣａｐ遺伝子を含むプラスミド
・ｐＨｅｌｐｅｒベクター：アデノウイルス由来のＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡを含むプラスミド
【0100】
ＡＡＶを産生するための遺伝子として上記のプラスミドベクターを使用する態様において、プラスミドベクターを細胞に導入する手段は、既知の手段のいずれを使用してもよい。例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法を用いて、プラスミドを目的とする細胞に導入してもよい。ＰＥＩ法の詳細な条件は、例えば、Ｙ．Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．２，ｅ９（２００２）等の記載を参照して決定してもよい。
【0101】
［２－７］細胞集団を凍結保存する工程
また、本発明の方法は、間葉系細胞を含む細胞集団を凍結保存する工程を含むことができる。凍結保存の対象となる細胞集団は、培養前、培養後、不死化後、浮遊培養後、及びウイルス産生遺伝子の導入後のいずれの細胞集団であってもよい。細胞集団を凍結保存する工程を含む態様においては、前記細胞集団を解凍後、必要に応じて前記細胞集団を分離、回収及び／又は培養してもよい。また、前記細胞集団を解凍後、そのまま使用してもよい。
また、本発明の方法は、間葉系細胞を含む細胞集団を凍結保存する工程を含むことができる。凍結保存の対象となる細胞集団は、培養前、培養後、不死化後、浮遊培養後、及びウイルス産生遺伝子の導入後のいずれの細胞集団であってもよい。細胞集団を凍結保存する工程を含む態様においては、前記細胞集団を解凍後、必要に応じて前記細胞集団を分離、回収及び／又は培養してもよい。また、前記細胞集団を解凍後、そのまま使用してもよい。
【0102】
前記間葉系細胞を含む細胞集団を凍結保存するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素への浸漬などが挙げられる。凍結する際の温度は、好ましくは－３０℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－６０℃以下、－７０℃以下、－８０℃以下、－９０℃以下、－１００℃以下、－１１０℃以下、－１２０℃以下、－１３０℃以下、－１４０℃以下、－１５０℃以下、－１６０℃以下、－１７０℃以下、－１８０℃以下、－１９０℃以下、又は－１９６℃（液体窒素温度）以下である。凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、－１℃／分、－２℃／分、－３℃／分、－４℃／分、－５℃／分、－６℃／分、－７℃／分、－８℃／分、－９℃／分、－１０℃／分、－１１℃／分、－１２℃／分、－１３℃／分、－１４℃／分又は－１５℃／分である。かかる凍結手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、－２℃／分以上－１℃／分以下の凍結速度で－５０℃以上－３０℃以下の間の温度（例えば、－４０℃）まで温度を下げ、さらに－１１℃／分以上－９℃／分以下（例えば、－１０℃／分）の凍結速度で－１００℃以上－８０℃以下の温度（例えば、－９０℃）まで温度を下げることができる。
【0103】
上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。かかる保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0104】
凍結用保存液は、相対的に増殖能が高いＭＳＣの生存率を高める観点から、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有することが好ましい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上又は８質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これに限定されない。
【0105】
［３］間葉系細胞を含む細胞集団
本発明の細胞集団は、「［２］不死化間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法」の項に記載した方法で製造された、不死化間葉系細胞を含む細胞集団である。あるいは、本発明の細胞集団は、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子のうち、少なくとも１つを含む細胞を含み、かつ、ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞を含む、不死化間葉系細胞を含む細胞集団である。
本発明の細胞集団は、「［２］不死化間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法」の項に記載した方法で製造された、不死化間葉系細胞を含む細胞集団である。あるいは、本発明の細胞集団は、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子のうち、少なくとも１つを含む細胞を含み、かつ、ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞を含む、不死化間葉系細胞を含む細胞集団である。
【0106】
本発明の細胞集団は、以下に特に記載がない限り、「［２］不死化間葉系細胞を含む細胞集団の製造方法」の項に記載した細胞集団と共通の特徴を有する。
【0107】
本発明の細胞集団において、「アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子のうち、少なくとも１つを含む細胞」とは、具体的には、ゲノムＤＮＡに、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原又はＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子が既存の方法で検出可能なレベルで存在している細胞を示す。本発明の細胞集団において、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子のうち、少なくとも１つを含む細胞の比率は、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよく、１００％以上でもよい。
【0108】
本発明の細胞集団において、「ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞」とは、具体的には、ＴＥＲＴをコードする塩基配列を有するｍＲＮＡが、定量リアルタイムＰＣＲ等の既存のいずれかの方法で検出可能なレベルで存在している細胞を示す。本発明の細胞集団において、ＴＥＲＴ遺伝子を発現する細胞の比率は、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよく、１００％以上でもよい。
【実施例0109】
＜比較例１：羊膜由来の間葉系細胞の不死化（ＦＢＳ培地培養系）＞
（工程１－１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（ドナー♯１）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
（工程１－１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（ドナー♯１）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
【0110】
（工程１－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収）
上皮細胞層と間葉系細胞層とを含む羊膜を２４０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、間葉系細胞を含む細胞懸濁液を回収した。
上皮細胞層と間葉系細胞層とを含む羊膜を２４０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、間葉系細胞を含む細胞懸濁液を回収した。
【0111】
（工程１－３：間葉系細胞の培養）
上述の「工程１－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング社製）に播種した。播種密度は、６，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。細胞播種後は、終濃度が１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。
上述の「工程１－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング社製）に播種した。播種密度は、６，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。細胞播種後は、終濃度が１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。
【0112】
その後、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１５，０００～１８，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において、前記１継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は２継代目の細胞集団である。
【0113】
その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は３継代目の細胞集団である。前記細胞集団について、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において前記３継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は４継代目の細胞集団である。
【0114】
その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は５継代目の細胞集団である。その後、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移して－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
【0115】
（工程１－４：間葉系細胞の表面抗原解析）
上記の培養方法で培養した５継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４の陽性率は７０％未満（具体的には３３％）、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的には９３％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的にはＣＤ７３：９９％、ＣＤ９０：９３％、ＣＤ１６６：９７％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的にはＣＤ４５：１００％、ＣＤ３２６：１００％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞集団は、間葉系細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、比較例１の５継代目の細胞集団は、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上という条件は満たすものの、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であるという条件は満たさない細胞集団であることが分かった。
上記の培養方法で培養した５継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４の陽性率は７０％未満（具体的には３３％）、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的には９３％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的にはＣＤ７３：９９％、ＣＤ９０：９３％、ＣＤ１６６：９７％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的にはＣＤ４５：１００％、ＣＤ３２６：１００％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞集団は、間葉系細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、比較例１の５継代目の細胞集団は、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上という条件は満たすものの、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であるという条件は満たさない細胞集団であることが分かった。
【0116】
なお、本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＲＥＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓ）ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ２９３、型番：１３０－１１３－４３４）を使用し、ＣＤ３２４抗原に対する抗体として、ＣＤ３２４－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ８１１、型番：１３０－１１１－８４０）を、ＣＤ７３抗原に対する抗体として、ＣＤ７３－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ８０４、型番：１３０－１１１－９０９）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体として、ＣＤ９０－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ８９７、型番：１３０－１１４－８６１）を、ＣＤ１０５抗原に対する抗体として、ＣＤ１０５－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ７９４、型番：１３０－１１２－１６６）を、ＣＤ１６６抗原に対する抗体として、ＣＤ１６６－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ４４２、型番：１３０－１０６－５７６）を、ＣＤ４５抗原に対する抗体として、ＣＤ４５－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ７４７、型番：１３０－１１０－６３３）を、ＣＤ３２６抗原に対する抗体として、ＣＤ３２６－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ７６４、型番：１３０－１１１－０００）を使用した。表面抗原解析は、メルク社のＧｕａｖａ(登録商標) ｅａｓｙＣｙｔｅを用い、測定条件は解析細胞数：３０，０００ｃｅｌｌｓ、流速設定：３５．４μＬ／ｍｉｎ）とした。また、各抗原に対する陽性細胞の比率（陽性率）は、以下の手順で算出した。
【0117】
（１）アイソタイプコントロールの測定結果を、縦軸にＳＳＣ、横軸にＦＳＣとしたドットプロットで展開した。
（２）間葉系細胞に該当する細胞集団のゲートを設定し、その細胞集団に対して、縦軸にカウント数、横軸をＡＰＣの傾向強度としたヒストグラムで展開した。
（３）（２）のヒストグラムにおいて、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．５％以下となる全ての領域（ゲート）を選択した。
（４）表面抗原マーカーに対応する抗体で測定した総細胞のうち、（２）で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出した。
（２）間葉系細胞に該当する細胞集団のゲートを設定し、その細胞集団に対して、縦軸にカウント数、横軸をＡＰＣの傾向強度としたヒストグラムで展開した。
（３）（２）のヒストグラムにおいて、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．５％以下となる全ての領域（ゲート）を選択した。
（４）表面抗原マーカーに対応する抗体で測定した総細胞のうち、（２）で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出した。
【0118】
（工程１－５：間葉系細胞の不死化）
比較例１に準ずる培養方法に従って分離・培養した細胞集団に対し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）２／２ｂ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、２．５μｇの不死化プラスミド（Ｅ１Ａ遺伝子（配列番号４）、Ｅ１Ｂ遺伝子（配列番号９）、ニワトリＢｃｌ－ｘＬ遺伝子（配列番号１３）、ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子（配列番号１１）、ネオマイシン耐性遺伝子（配列番号１７）を含む）を形質移入した（細胞懸濁液バッファー：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌ、プログラム：Ｘ－００１）。形質移入後の細胞を６ウェルシャーレに播種し、５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで培養した。サブコンフルエントに達した後、２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養した。その結果、全ての細胞が死滅し、形質転換された羊膜由来の間葉系細胞は取得できなかった。
比較例１に準ずる培養方法に従って分離・培養した細胞集団に対し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）２／２ｂ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、２．５μｇの不死化プラスミド（Ｅ１Ａ遺伝子（配列番号４）、Ｅ１Ｂ遺伝子（配列番号９）、ニワトリＢｃｌ－ｘＬ遺伝子（配列番号１３）、ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子（配列番号１１）、ネオマイシン耐性遺伝子（配列番号１７）を含む）を形質移入した（細胞懸濁液バッファー：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌ、プログラム：Ｘ－００１）。形質移入後の細胞を６ウェルシャーレに播種し、５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで培養した。サブコンフルエントに達した後、２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養した。その結果、全ての細胞が死滅し、形質転換された羊膜由来の間葉系細胞は取得できなかった。
【0119】
＜実施例１：羊膜由来の間葉系細胞の不死化（ｈＰＬ培地培養系）＞
（工程２－１：羊膜の採取）
比較例１と同じドナー（ドナー♯１）から、比較例１と同様の手法にて羊膜を取得した。
（工程２－１：羊膜の採取）
比較例１と同じドナー（ドナー♯１）から、比較例１と同様の手法にて羊膜を取得した。
【0120】
（工程２－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収）
比較例１と同じ手法にて間葉系細胞を含む細胞集団を取得した。
比較例１と同じ手法にて間葉系細胞を含む細胞集団を取得した。
【0121】
（工程２－３：間葉系細胞の培養）
上述の「工程２－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング社製）に播種した。播種密度は、６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度とした。細胞播種後は、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。
上述の「工程２－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング社製）に播種した。播種密度は、６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度とした。細胞播種後は、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。
【0122】
その後、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１５，０００～１８，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において、前記１継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は２継代目の細胞集団である。
【0123】
次いで、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は３継代目の細胞集団である。
【0124】
その後、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１溶液（登録商標）（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において、前記３継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は４継代目の細胞集団である。
【0125】
次いで、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は５継代目の細胞集団である。前記細胞集団について、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
【0126】
（工程２－４：間葉系細胞の表面抗原解析）
上記の培養方法で培養した５継代目の間葉系細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＭＳＣマーカーと知られているＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的にはＣＤ３２４：９１％、ＣＤ１０５：９５％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的にはＣＤ７３：１００％、ＣＤ９０：１００％、ＣＤ１６６：９９％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的にはＣＤ４５：１００％、ＣＤ３２６：９９％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞は、間葉系細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、実施例１に記載の細胞集団は、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である細胞集団であることが確認された。
なお、本測定の方法、試薬は比較例１と同じである。
上記の培養方法で培養した５継代目の間葉系細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＭＳＣマーカーと知られているＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的にはＣＤ３２４：９１％、ＣＤ１０５：９５％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的にはＣＤ７３：１００％、ＣＤ９０：１００％、ＣＤ１６６：９９％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的にはＣＤ４５：１００％、ＣＤ３２６：９９％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞は、間葉系細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、実施例１に記載の細胞集団は、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である細胞集団であることが確認された。
なお、本測定の方法、試薬は比較例１と同じである。
【0127】
（工程２－５：間葉系細胞の不死化）
実施例１に準ずる培養方法に従って分離・培養した間葉系細胞に対し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）２／２ｂ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、２．５μｇの不死化プラスミド（Ｅ１Ａ遺伝子（配列番号４）、Ｅ１Ｂ遺伝子（配列番号９）、ニワトリＢｃｌ－ｘＬ遺伝子（配列番号１３）、ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子（配列番号１１）、ネオマイシン耐性遺伝子（配列番号１７）を含む）を形質移入した（細胞懸濁液バッファー：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌ、プログラム：Ｘ－００１）。形質移入後の細胞を６ウェルシャーレに播種し、５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで培養した。サブコンフルエントに達した後、２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を繰り返し、形質転換された間葉系細胞のみを選択した。選択された間葉系細胞を、以下「不死化羊膜間葉系細胞」とも称する。形質転換されていない間葉系細胞の細胞形態は紡錘形であったが、形質転換された不死化羊膜間葉系細胞の細胞形態は敷石状であった。各細胞の顕微鏡観察写真を図１、２に示す（倍率４０倍）。
実施例１に準ずる培養方法に従って分離・培養した間葉系細胞に対し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）２／２ｂ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、２．５μｇの不死化プラスミド（Ｅ１Ａ遺伝子（配列番号４）、Ｅ１Ｂ遺伝子（配列番号９）、ニワトリＢｃｌ－ｘＬ遺伝子（配列番号１３）、ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子（配列番号１１）、ネオマイシン耐性遺伝子（配列番号１７）を含む）を形質移入した（細胞懸濁液バッファー：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌ、プログラム：Ｘ－００１）。形質移入後の細胞を６ウェルシャーレに播種し、５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで培養した。サブコンフルエントに達した後、２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を繰り返し、形質転換された間葉系細胞のみを選択した。選択された間葉系細胞を、以下「不死化羊膜間葉系細胞」とも称する。形質転換されていない間葉系細胞の細胞形態は紡錘形であったが、形質転換された不死化羊膜間葉系細胞の細胞形態は敷石状であった。各細胞の顕微鏡観察写真を図１、２に示す（倍率４０倍）。
【0128】
（工程２－６：不死化羊膜間葉系細胞のプラスミド組み込み確認）
ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、不死化羊膜間葉系細胞からゲノムを抽出した。抽出ゲノムをテンプレートとし、形質移入に用いた不死化プラスミドのＥ１遺伝子領域に設計したプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。使用した２つのプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号１８及び１９で表される。ＰＣＲ反応液（酵素と蛍光色素の混合反応液）はＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした（融解曲線の反応条件はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムの標準条件とした）。その結果、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを指標とした核酸増幅が検出され、融解曲線の結果から、特異的な増幅であることが確認された。また、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動した結果、増幅産物の長さは、使用したプライマーによって目的領域が増幅された場合と同等であることがわかった。本結果から、不死化羊膜間葉系細胞のゲノムには、不死化プラスミドが組み込まれていることが確認された。
ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、不死化羊膜間葉系細胞からゲノムを抽出した。抽出ゲノムをテンプレートとし、形質移入に用いた不死化プラスミドのＥ１遺伝子領域に設計したプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。使用した２つのプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号１８及び１９で表される。ＰＣＲ反応液（酵素と蛍光色素の混合反応液）はＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした（融解曲線の反応条件はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムの標準条件とした）。その結果、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを指標とした核酸増幅が検出され、融解曲線の結果から、特異的な増幅であることが確認された。また、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動した結果、増幅産物の長さは、使用したプライマーによって目的領域が増幅された場合と同等であることがわかった。本結果から、不死化羊膜間葉系細胞のゲノムには、不死化プラスミドが組み込まれていることが確認された。
【0129】
（工程２－７：不死化羊膜間葉系細胞のｈＴＥＲＴ遺伝子発現確認）
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、不死化羊膜間葉系細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。続いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ社）を用い、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。本ｃＤＮＡをテンプレートとし、ｈＴＥＲＴを標的としたプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ、Ｎｏ：Ｈｓ００９７２６５０＿ｍ１）を用いて定量リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（酵素含有の混合反応液）はＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした。その結果、ＦＡＭ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を指標として、ｈＴＥＲＴ遺伝子に特異的な核酸増幅が検出された。本結果から、不死化羊膜間葉系細胞はｈＴＥＲＴを発現しており、不死化されていることが確認された。
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、不死化羊膜間葉系細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。続いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ社）を用い、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。本ｃＤＮＡをテンプレートとし、ｈＴＥＲＴを標的としたプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ、Ｎｏ：Ｈｓ００９７２６５０＿ｍ１）を用いて定量リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（酵素含有の混合反応液）はＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした。その結果、ＦＡＭ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を指標として、ｈＴＥＲＴ遺伝子に特異的な核酸増幅が検出された。本結果から、不死化羊膜間葉系細胞はｈＴＥＲＴを発現しており、不死化されていることが確認された。
【0130】
＜実施例２：骨髄由来の間葉系細胞の不死化＞
（工程３－１：骨髄由来の間葉系細胞の培養）
健常ドナーより骨髄穿刺にて採取した骨髄液を、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭもしくは５％ｈＰＬを含むαＭＥＭで６倍希釈し、接着培養用の培養容器（例えば接着細胞培養シャーレ１５０（住友ベークライト社））に播種した。３～４日おきに培地交換を行い、接着細胞が増殖するまで培養した。接着細胞が増殖してサブコンフルエントに達した後、継代して拡大培養した。拡大培養した後、細胞をバンバンカー（登録商標）（日本ジェネティクス社）に懸濁して凍結保存した。以下、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭで培養して得られた骨髄由来の間葉系細胞を「骨髄間葉系細胞（ＦＢＳ）」、５％ｈＰＬを含むαＭＥＭで培養して得られた骨髄由来の間葉系細胞を「骨髄間葉系細胞（ｈＰＬ）」とも称する。
（工程３－１：骨髄由来の間葉系細胞の培養）
健常ドナーより骨髄穿刺にて採取した骨髄液を、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭもしくは５％ｈＰＬを含むαＭＥＭで６倍希釈し、接着培養用の培養容器（例えば接着細胞培養シャーレ１５０（住友ベークライト社））に播種した。３～４日おきに培地交換を行い、接着細胞が増殖するまで培養した。接着細胞が増殖してサブコンフルエントに達した後、継代して拡大培養した。拡大培養した後、細胞をバンバンカー（登録商標）（日本ジェネティクス社）に懸濁して凍結保存した。以下、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭで培養して得られた骨髄由来の間葉系細胞を「骨髄間葉系細胞（ＦＢＳ）」、５％ｈＰＬを含むαＭＥＭで培養して得られた骨髄由来の間葉系細胞を「骨髄間葉系細胞（ｈＰＬ）」とも称する。
【0131】
（工程３－２：骨髄間葉系細胞の不死化）
工程３－１に準ずる培養方法に従って分離・培養した骨髄間葉系細胞（ＦＢＳ）及び骨髄間葉系細胞（ｈＰＬ）に対し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）２／２ｂ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、２．５μｇの不死化プラスミド（Ｅ１Ａ遺伝子（配列番号４）、Ｅ１Ｂ遺伝子（配列番号９）、ニワトリＢｃｌ－ｘＬ遺伝子（配列番号１３）、ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子（配列番号１１）、ネオマイシン耐性遺伝子（配列番号１７）を含む）を形質移入した（細胞懸濁液バッファー：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌ、プログラム：Ｘ－００１）。形質移入後の細胞を６ウェルシャーレに播種し、形質移入前と同じ培養培地（１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭもしくは５％ｈＰＬを含むαＭＥＭ）にてサブコンフルエントになるまで培養した。サブコンフルエントに達した後、２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ、もしくは２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を繰り返した。２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭで培養した細胞は全て死滅し、２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び５％ｈＰＬを含むαＭＥＭ培養した細胞は増殖し形質転換された骨髄由来の間葉系細胞を取得出来た。形質転換された骨髄由来の間葉系細胞を、以下「不死化骨髄間葉系細胞」とも称する。形質転換されていない骨髄間葉系細胞（ｈＰＬ）の細胞形態は紡錘形であったが、形質転換された不死化骨髄間葉系細胞の細胞形態は敷石状に近くなった。各細胞の顕微鏡観察写真を図３、４に示す（倍率４０倍）。
工程３－１に準ずる培養方法に従って分離・培養した骨髄間葉系細胞（ＦＢＳ）及び骨髄間葉系細胞（ｈＰＬ）に対し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）２／２ｂ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、２．５μｇの不死化プラスミド（Ｅ１Ａ遺伝子（配列番号４）、Ｅ１Ｂ遺伝子（配列番号９）、ニワトリＢｃｌ－ｘＬ遺伝子（配列番号１３）、ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子（配列番号１１）、ネオマイシン耐性遺伝子（配列番号１７）を含む）を形質移入した（細胞懸濁液バッファー：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌ、プログラム：Ｘ－００１）。形質移入後の細胞を６ウェルシャーレに播種し、形質移入前と同じ培養培地（１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭもしくは５％ｈＰＬを含むαＭＥＭ）にてサブコンフルエントになるまで培養した。サブコンフルエントに達した後、２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ、もしくは２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び５％ｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を繰り返した。２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭで培養した細胞は全て死滅し、２０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び５％ｈＰＬを含むαＭＥＭ培養した細胞は増殖し形質転換された骨髄由来の間葉系細胞を取得出来た。形質転換された骨髄由来の間葉系細胞を、以下「不死化骨髄間葉系細胞」とも称する。形質転換されていない骨髄間葉系細胞（ｈＰＬ）の細胞形態は紡錘形であったが、形質転換された不死化骨髄間葉系細胞の細胞形態は敷石状に近くなった。各細胞の顕微鏡観察写真を図３、４に示す（倍率４０倍）。
【0132】
（工程３－３：不死化骨髄間葉系細胞のプラスミド組み込み確認）
ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、不死化骨髄間葉系細胞からゲノムを抽出した。抽出ゲノムをテンプレートとし、形質移入に用いた不死化プラスミドのＥ１遺伝子領域に設計したプライマー（配列番号１３、１４）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（酵素と蛍光色素の混合反応液）はＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした（融解曲線の反応条件はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムの標準条件とした）。その結果、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを指標とした核酸増幅が検出され、融解曲線の結果から、特異的な増幅であることが確認された。本結果から、不死化骨髄間葉系細胞のゲノムには、不死化プラスミドが組み込まれていることが確認された。
ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、不死化骨髄間葉系細胞からゲノムを抽出した。抽出ゲノムをテンプレートとし、形質移入に用いた不死化プラスミドのＥ１遺伝子領域に設計したプライマー（配列番号１３、１４）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（酵素と蛍光色素の混合反応液）はＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした（融解曲線の反応条件はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムの標準条件とした）。その結果、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを指標とした核酸増幅が検出され、融解曲線の結果から、特異的な増幅であることが確認された。本結果から、不死化骨髄間葉系細胞のゲノムには、不死化プラスミドが組み込まれていることが確認された。
【0133】
（工程３－４：不死化骨髄間葉系細胞のｈＴＥＲＴ遺伝子発現確認）
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、不死化骨髄間葉系細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。続いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ社）を用い、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。本ｃＤＮＡをテンプレートとし、ｈＴＥＲＴを標的としたプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ、Ｎｏ：Ｈｓ００９７２６５０＿ｍ１）を用いて定量リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（酵素含有の混合反応液）はＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした。その結果、ＦＡＭを指標として、ｈＴＥＲＴ遺伝子に特異的な核酸増幅が検出された。本結果から、不死化骨髄間葉系細胞はｈＴＥＲＴを発現しており、不死化されていることが確認された。
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、不死化骨髄間葉系細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。続いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ社）を用い、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。本ｃＤＮＡをテンプレートとし、ｈＴＥＲＴを標的としたプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ、Ｎｏ：Ｈｓ００９７２６５０＿ｍ１）を用いて定量リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（酵素含有の混合反応液）はＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした。その結果、ＦＡＭを指標として、ｈＴＥＲＴ遺伝子に特異的な核酸増幅が検出された。本結果から、不死化骨髄間葉系細胞はｈＴＥＲＴを発現しており、不死化されていることが確認された。
【0134】
＜実施例３：不死化羊膜間葉系細胞、不死化骨髄間葉系細胞によるＡＡＶ生産＞
（工程４－１：不死化羊膜間葉系細胞、不死化骨髄間葉系細胞によるＡＡＶ産生）
不死化羊膜間葉系細胞、不死化骨髄間葉系細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ（対照として設定）に対し、ＰＥＩトランスフェクション法にて、ｐＡＡＶベクター（ＡＡＶのＩＴＲ配列とＡｋａｌｕｃ遺伝子を含む）、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ベクター（血清型２ ＡＡＶ（ＡＡＶ２）のＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子を含む）、ｐＨｅｌｐｅｒベクター（アデノウイルス由来のＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡを含む）を形質移入した。形質移入から７２時間、無血清培地で培養した。その後、培養上清にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することでＡＡＶ粒子を沈降させ、界面活性剤処理によりＡＡＶを回収した。また、界面活性剤を用いて細胞を溶解させ、細胞からもＡＡＶを回収した。培養上清及び細胞から回収したＡＡＶをテンプレートとし、ｐＡＡＶプラスミド中の配列に対して設計したプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。使用した２つのプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号１８及び１９で表される。ＰＣＲ反応液（酵素と蛍光色素の混合反応液）はＰｏｗｅｒｕｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステムを用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした（融解曲線の反応条件はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステムの標準条件とした）。なお、今回は同時にＡＡＶ２ゲノム濃度が既知のサンプルを段階希釈したものも同時にテンプレートとすることで、各テンプレート中のＡＡＶ２ゲノム濃度を定量した。その結果、不死化羊膜間葉系細胞、不死化骨髄間葉系細胞及びＨＥＫ２９３Ｔの培養上清及び細胞から回収したＡＡＶ２をテンプレートとした全ての場合において、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを指標とした核酸増幅が検出され、融解曲線の結果から、特異的な増幅であることが確認された。本結果から、不死化羊膜間葉系細胞、不死化骨髄間葉系細胞及びＨＥＫ２９３ＴからＡＡＶが産生されたことが確認された。各テンプレートのＡＡＶ２ゲノム濃度を図５に示す。
（工程４－１：不死化羊膜間葉系細胞、不死化骨髄間葉系細胞によるＡＡＶ産生）
不死化羊膜間葉系細胞、不死化骨髄間葉系細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ（対照として設定）に対し、ＰＥＩトランスフェクション法にて、ｐＡＡＶベクター（ＡＡＶのＩＴＲ配列とＡｋａｌｕｃ遺伝子を含む）、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ベクター（血清型２ ＡＡＶ（ＡＡＶ２）のＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子を含む）、ｐＨｅｌｐｅｒベクター（アデノウイルス由来のＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡを含む）を形質移入した。形質移入から７２時間、無血清培地で培養した。その後、培養上清にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することでＡＡＶ粒子を沈降させ、界面活性剤処理によりＡＡＶを回収した。また、界面活性剤を用いて細胞を溶解させ、細胞からもＡＡＶを回収した。培養上清及び細胞から回収したＡＡＶをテンプレートとし、ｐＡＡＶプラスミド中の配列に対して設計したプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。使用した２つのプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号１８及び１９で表される。ＰＣＲ反応液（酵素と蛍光色素の混合反応液）はＰｏｗｅｒｕｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、リアルタイムＰＣＲ装置はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステムを用いた。反応条件は、（５０℃、２分）→（９５℃、２０秒）→［（９５℃、１秒）→（６０℃、３０秒）］×４０サイクルとした（融解曲線の反応条件はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステムの標準条件とした）。なお、今回は同時にＡＡＶ２ゲノム濃度が既知のサンプルを段階希釈したものも同時にテンプレートとすることで、各テンプレート中のＡＡＶ２ゲノム濃度を定量した。その結果、不死化羊膜間葉系細胞、不死化骨髄間葉系細胞及びＨＥＫ２９３Ｔの培養上清及び細胞から回収したＡＡＶ２をテンプレートとした全ての場合において、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを指標とした核酸増幅が検出され、融解曲線の結果から、特異的な増幅であることが確認された。本結果から、不死化羊膜間葉系細胞、不死化骨髄間葉系細胞及びＨＥＫ２９３ＴからＡＡＶが産生されたことが確認された。各テンプレートのＡＡＶ２ゲノム濃度を図５に示す。
【0135】
＜実施例４：不死化羊膜間葉系細胞の浮遊培養＞
（工程５－１：無血清培地による不死化羊膜間葉系細胞の浮遊化）
接着細胞用の培養容器（例えば接着細胞培養シャーレ１５０（住友ベークライト社））で接着培養中の不死化羊膜間葉系細胞、ＨＥＫ２９３Ｔの培地を無血清培地であるＦｒｅｅＳｔｙｌｅＦ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、２９３ ＳＦＭＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にそれぞれ交換した。維持培養を続け、接着細胞が自然に剥離されたことを確認した後、培養上清を回収して細胞を継代した。以降は全て浮遊状態で継代を繰り返した。その結果、不死化羊膜間葉系細胞は、２９３ ＳＦＭ ＩＩで浮遊培養できた。ＨＥＫ２９３Ｔは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＦ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍで浮遊培養できた。その後、浮遊化した羊膜間葉系細胞は、ベントキャップ付き三角フラスコ（例えば、ポリカーボネート製三角フラスコ ベントキャップ１２５ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で撹拌培養した。不死化羊膜間葉系細胞は単一細胞が分散した状態で浮遊培養されていたが、ＨＥＫ２９３Ｔは複数の細胞が凝集した状態で浮遊培養されていた。浮遊培養された各細胞の顕微鏡観察写真を図６、７、８に示す（倍率４０倍）。
（工程５－１：無血清培地による不死化羊膜間葉系細胞の浮遊化）
接着細胞用の培養容器（例えば接着細胞培養シャーレ１５０（住友ベークライト社））で接着培養中の不死化羊膜間葉系細胞、ＨＥＫ２９３Ｔの培地を無血清培地であるＦｒｅｅＳｔｙｌｅＦ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、２９３ ＳＦＭＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にそれぞれ交換した。維持培養を続け、接着細胞が自然に剥離されたことを確認した後、培養上清を回収して細胞を継代した。以降は全て浮遊状態で継代を繰り返した。その結果、不死化羊膜間葉系細胞は、２９３ ＳＦＭ ＩＩで浮遊培養できた。ＨＥＫ２９３Ｔは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＦ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍで浮遊培養できた。その後、浮遊化した羊膜間葉系細胞は、ベントキャップ付き三角フラスコ（例えば、ポリカーボネート製三角フラスコ ベントキャップ１２５ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で撹拌培養した。不死化羊膜間葉系細胞は単一細胞が分散した状態で浮遊培養されていたが、ＨＥＫ２９３Ｔは複数の細胞が凝集した状態で浮遊培養されていた。浮遊培養された各細胞の顕微鏡観察写真を図６、７、８に示す（倍率４０倍）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】