特開 2022-109973 ５’キャップ付ＲＮＡを合成するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022109973

(43)【公開日】2022-07-28

(54)【発明の名称】５’キャップ付ＲＮＡを合成するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6876 20180101AFI20220721BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20220721BHJP

   C12Q 1/6853 20180101ALI20220721BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220721BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220721BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220721BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6876 Z

C12Q1/6806 Z

C12Q1/6853 Z

A61K31/7088

A61K48/00

C12N15/11 Z ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】114

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022070512

(22)【出願日】2022-04-22

(62)【分割の表示】P 2020204713の分割

【原出願日】2016-09-20

(31)【優先権主張番号】62/221,248

(32)【優先日】2015-09-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508353008

【氏名又は名称】トリリンク バイオテクノロジーズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(72)【発明者】

【氏名】ホグリフ，リチャード アイ．

(72)【発明者】

【氏名】レベデフ，アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】マキャフェリー，アントン ピー．

(72)【発明者】

【氏名】シン，ドンウォン

【テーマコード（参考）】

4B063

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR06

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR56

4B063QR62

4B063QS24

4B063QS34

4B063QX02

4C084AA13

4C084NA14

4C086AA01

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

(57)【要約】      （修正有）

【課題】開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【解決手段】開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、一般形態^ｍ７Ｇｐｐｐ［Ｎ_{２’Ｏｍ ｅ}］_ｎ［Ｎ］_ｍ（式中、^ｍ７Ｇは、Ｎ７－メチル化グアノシンまたは任意のグアノシン類似体であり、Ｎは、任意の天然、修飾または非天然ヌクレオシドであり、「ｎ」は、０～４の任意の整数であり得、「ｍ」は、１～９の任意の整数であり得る）を有する、５’キャップ付ＲＮＡ、前記ＲＮＡを合成するための方法および前記ＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の構造を含む開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー：

【化1】

［式中、
Ｂ_１からＢ_１０の各々は独立に、天然、修飾または非天然ヌクレオシド塩基であり、
Ｍは、０または１であり、
Ｌは、０または１であり、
ｑ_１は、１であり、ｑ_２からｑ_９の各々は独立に、０または１であり、
Ｒ_１は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、Ｏ－アルキル、ハロゲン、リンカーま
たは検出可能なマーカーであり、
Ｘ_１からＸ_１３の各々は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｙ_１からＹ_１３の各々は独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ_３、アリール、アルキル、Ｏ－アル
キルまたはＯ－アリールであり、
Ｚ_１からＺ_２２の各々は独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ_２、Ｃ（ハロゲン）_２またはＣＨ
（ハロゲン）であり、
Ｒ_４からＲ_１２の各々は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅまたは検出可能なマーカーである］
。

【請求項2】

ｑ１＝１であり
ｑ２～ｑ９の各々＝０または１である、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレ
オチドプライマー。

【請求項3】

Ｂ_１が、転写鋳型位置＋１で核酸鋳型上のヌクレオシド塩基と完全に相補的であり、
Ｂ_２からＢ_９が、存在する場合には、位置＋２以降の転写開始部位で核酸鋳型上のそれ
ぞれのヌクレオシド塩基と完全に相補的であり、
Ｂ_１０、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの最後のヌクレオシド塩基が、
最後のハイブリダイズされる転写鋳型ヌクレオチドと完全に相補的である、請求項１また
は２に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。

【請求項4】

ｑ２～ｑ９＝０、かつ
Ｂ１０が、鋳型ヌクレオチド２とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ
付オリゴヌクレオチドプライマー。

【請求項5】

ｑ１～ｑ２＝１、
ｑ３～９＝０、かつ
Ｂ２およびＢ１０が、それぞれ鋳型ヌクレオチド２および３とハイブリダイズする、請
求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。

【請求項6】

ｑ１～ｑ３＝１、
ｑ４～９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３および４とハイブリダ
イズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。

【請求項7】

ｑ１～ｑ４＝１、
ｑ５～９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３、４および５と
ハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。

【請求項8】

ｑ１～ｑ５＝１、
ｑ６～９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３、４、５
および６とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプ
ライマー。

【請求項9】

ｑ１～ｑ６＝１、
ｑ７～９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３、
４、５、６および７とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌク
レオチドプライマー。

【請求項10】

ｑ１～ｑ７＝１、
ｑ８～９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２
、３、４、５、６、７および８とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付
オリゴヌクレオチドプライマー。

【請求項11】

ｑ１～ｑ８＝１、
ｑ９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８およびＢ１０が、それぞれ鋳型ヌクレオチ
ド２、３、４、５、６、７、８および９とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キ
ャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。

【請求項12】

ｑ１～ｑ９＝１、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌ
クレオチド２、３、４、５、６、７、８、９および１０とハイブリダイズする、請求項１
に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。

【請求項13】

ｑ１～ｑ２＝１、
ｑ３～９＝０、かつ
Ｂ２およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２および３とハイブリダイズする、
請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。

【請求項14】

請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子。

【請求項15】

請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子を含
有する細胞。

【請求項16】

請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡから翻訳
されたタンパク質またはペプチドを含有する細胞。

【請求項17】

請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子およ
び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項18】

十分に鋳型となるＲＮＡ分子を合成するための方法であって、以下の構造を有する開始
キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを、ポリヌクレオチド鋳型のＲＮＡポリメラー
ゼによる転写を促す条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを含む混合物中に入れるステップと、

【化2】

［式中、
Ｂ_１からＢ_１０の各々は独立に、天然、修飾または非天然ヌクレオシド塩基であり、
Ｍは、０または１であり、
Ｌは、０または１であり、
Ｒ_１は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、Ｏ－アルキル、ハロゲン、リンカーま
たは検出可能なマーカーであり、
Ｘ_１からＸ_１３の各々は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｙ_１からＹ_１３の各々は独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ_３、アリール、アルキル、Ｏ－アル
キルまたはＯ－アリールであり、
Ｚ_１からＺ_２２の各々は独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ_２、Ｃ（ハロゲン）_２またはＣＨ
（ハロゲン）であり、
Ｒ_４からＲ_１２の各々は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅまたは検出可能なマーカーである］
前記混合物を、前記鋳型の転写を可能にするのに十分な時間インキュベートするステッ
プと
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月２１日に出願された米国特許仮出願番号第６２／２２１，２
４８号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含有し、その全体が参照
により本明細書に組み込まれる。２０１６年１１月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコ
ピーは、０９５１０９－０００５００ＰＣ－１０２２５４３＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ
、７８５バイトの大きさである。

【0002】

本発明は、５’キャップ付ＲＮＡを合成するための方法および組成物に関する。特定の
態様では、本発明は、天然の、または修飾された５’－キャップ０、キャップ１、キャッ
プ２またはトリメチルグアノシン－キャップ（ＴＭＧ－キャップ）構造を有する新規キャ
ップ含有開始オリゴヌクレオチドプライマーに関する。さらなる態様では、本発明は、５
’キャップ付ＲＮＡを効率的に作製し、それを使用するための方法に関し、５’キャップ
付ＲＮＡを調製するための方法が提供される。

【背景技術】

【0003】

読者の理解を補助するために以下の説明を提供する。提供される情報または引用される
参考文献のうち、本発明において先行技術であると認められるものはない。

【0004】

治療的適用にとって生理学的に重要なタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（
ｍＲＮＡ）は、遺伝物質を送達するためのＤＮＡベースのプラスミドおよびウイルスベク
ターを上回る相当な利点を示している。これらの利点のうち最も重要なものとして以下が
ある：
（ｉ）高レベルの安全性（ウイルスまたはプラスミド組込みからのゲノム損傷の可能性
を低減する）、
（ｉｉ）ｍＲＮＡ送達は、即時のタンパク質発現をもたらす（プラスミドを用いる場合
に一般に起こる遅延応答とは異なる）、
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡは、タンパク質の発現に対する頑強な用量依存性制御を可能にする
、および
（ｉｖ）プラスミドおよびウイルスベクターの製造と比較した、ｍＲＮＡの大規模合成
の単純性。

【0005】

メッセンジャーＲＮＡは、実質的に任意の公知のタンパク質をコードすることができ、
当業者に公知の種々の方法によって特定の組織および臓器に送達することができる。これ
らのｍＲＮＡは、ひとたび送達されると、標的とされる組織内でリボソームタンパク質発
現を指示し、ｍＲＮＡ分子１つあたり数百のタンパク質の生成をもたらす。

【0006】

コードされるタンパク質を効率的に翻訳するために、活性なｍＲＮＡ分子各々中に存在
するいくつかの構造エレメントが利用される。これらのエレメントのうち１種が、ｍＲＮ
Ａの５’末端上のキャップ構造であり、これは、すべての真核生物（およびいくつかのウ
イルス）中に存在する。天然に存在するキャップ構造は、グアニン塩基のＮ７位置でメチ
ル化されるリボ－グアノシン残基を含む。この７－メチルグアノシン（^７ｍＧ）は、ｍＲ
ＮＡ分子の５’末端での５’－対５’－三リン酸鎖を介して連結される。本出願を通じて
、７ｍおよびｍ７は、同義的に使用され、同等の意味を有する。５’末端上の^７ｍＧｐｐ
ｐ断片の存在は、ｍＲＮＡ成熟にとって必須であり、
ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、
核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促進し、
翻訳開始複合体の組み立てにおいて重要な役割を果たす（Ｃｅｌｌ第９巻：６４５～６
５３頁、（１９７６年）；Ｎａｔｕｒｅ第２６６巻：２３５頁（１９７７年）；Ｆｅｄｅ
ｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔ
ｙ Ｌｅｔｔｅｒ第９６巻：１～１１頁（１９７８年）；Ｃｅｌｌ第４０巻：２２３～２
４頁、（１９８５年）；Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．第３５巻：１７３～２０
７頁、（１９８８年）；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６８巻：９１３～９６３頁
、（１９９９年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻：３０３３７～３０４０頁（１
９９９年））。

【0007】

キャップ依存性翻訳においては、キャップ構造を保持するｍＲＮＡのみが活性である；
ｍＲＮＡの「キャップ除去」は、タンパク質合成のためのその鋳型活性のほとんど完全な
喪失をもたらす（Ｎａｔｕｒｅ、第２５５巻：３３～３７頁、（１９７５年）；Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５３巻：５２２８～５２３１頁、（１９７８年）；およびＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７２巻：１１８９～１１９３頁、（１９７
５年））。

【0008】

真核細胞のｍＲＮＡの別のエレメントは、転写物位置１（キャップ１）での、いくつか
の場合には、転写物位置１および２（キャップ２）での２’－Ｏ－メチルヌクレオシド残
基の存在である。ｍＲＮＡの２’－Ｏ－メチル化は、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ翻訳の
より高い有効性にとって必要であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
第７７巻：３９５２～３９５６頁（１９８０年））、５’キャップ付ｍＲＮＡのヌクレア
ーゼ安定性をさらに改善する。キャップ１（およびキャップ２）を有するｍＲＮＡは、細
胞が真正のｍＲＮＡ ５’末端を認識するのを可能にし、いくつかの例では、感染性遺伝
要素から生じる転写物を識別する特有の印である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ第４３巻：４８２～４９２頁（２０１５年））。

【0009】

一次ｍＲＮＡ転写物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＮＴＰ（通常、ＧＴＰ）で出発するＲＮＡ合
成の開始に起因する５’－三リン酸基（５’－ｐｐｐｍＲＮＡ）を保持する。ｍＲＮＡ転
写物の５’－三リン酸化末端のキャップ構造（キャップ０）への変換は、いくつかの酵素
ステップによって起こる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５０巻：９３２２頁（１９７５
年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻：１１９３６頁（１９９６年）；Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻：１６４３０頁、（１９９２年））。これらの酵素反応ステッ
プとして以下がある：
ステップ１：ＲＮＡ三リン酸分解酵素が、ｍＲＮＡの５’－三リン酸を５’－二リン酸
に変換する、ｐｐｐＮ_１（ｐＮ）_ｘ→ｐｐＮ_１（ｐＮ）_ｘ＋無機リン酸、
ステップ２：ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼが、ＧＴＰを使用して、ＧＭＰ残基を
ｍＲＮＡの５’－二リン酸に移す、ｐｐＮ_１（ｐＮ）_ｘ＋ＧＴＰ→Ｇ（５’）ｐｐｐ（５
’）Ｎ_１（ｐＮ）_ｘ＋無機ピロリン酸、および
ステップ３：グアニン－７－メチルトランスフェラーゼが、補因子としてＳ－アデノシ
ル－メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）を使用し、ＡｄｏＭｅｔからグアニン塩基の７－窒素に
メチル基を移す、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ_１（ｐＮ）_ｘ＋ＡｄｏＭｅｔ→^７ｍＧ（５
’）ｐｐｐ（５’）Ｎ_１（ｐＮ）_ｘ＋ＡｄｏＨｙｃ）。
これらの酵素活性から得られたＲＮＡは、「５’キャップ付ＲＮＡ」または「キャップ
付ＲＮＡ」と呼ばれ、「キャップ付ＲＮＡ」の形成をもたらすこのプロセスに関与する酵
素の組合せは、「キャップ形成（capping）酵素」と呼ばれる。このような酵素のクロー
ニングされた形態を含むキャップ形成酵素は、同定されており、多数の供給源から精製さ
れており、当技術分野で周知である（Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．第６６巻：１～４０頁、（２００１年）；Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第５０巻：１０１～１２９頁、（１９９５年）；
およびＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．第４４巻：１７５頁、（１９８０年））。キャップ
形成酵素による一次ＲＮＡの５’末端へのキャップヌクレオチドの付加から得られるキャ
ップ付ＲＮＡは、「キャップ０構造」を有するキャップ付ＲＮＡと呼ばれている（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：１４９７４～１４９８１頁、（１９９４年）；Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻：１１９３６～１１９４４頁（１９９６年））。キャップ形
成酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでキャップ０構造を有するキャップ付ＲＮＡを合成するため
に使用されてきた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５５巻：１１５８８頁、（１９８０年
）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９４巻：９５７３頁、（１９９７
年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻：１６４３０頁、（１９９２年）；Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：１４９７４頁、（１９９４年）；およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．第２７１巻：１１９３６頁、（１９９６年））。

【0010】

５’－キャップ０構造を有するキャップ付ＲＮＡは、（ヌクレオシド－２’－Ｏ－）メ
チルトランスフェラーゼの作用によって「キャップ１」構造にｉｎ ｖｉｖｏでさらに変
換され得る（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：１４９７４～１４９８１頁、（１９
９４年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻：１１９３６～１１９４４頁、（１９９
６年）；およびＥＭＢＯ第２１巻：２７５７～２７６８頁、（２００２年））。例えば、
ワクシニアｍＲＮＡ（ヌクレオシド－２’－Ｏ）メチルトランスフェラーゼは、以下の反
応によって、キャップ０構造を有する５’キャップ付ＲＮＡの５’の最後から２番目のヌ
クレオチドの２’－ヒドロキシル基のメチル化を触媒できる：
^７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ_１ｐＮ_２（ｐＮ）_ｘ＋ＡｄｏＭｅｔ→^７ｍＧ（５’）
ｐｐｐ（５’）Ｎ_１ ^{２’－ＯＭｅ}ｐＮ２（ｐＮ）_ｘ＋ＡｄｏＨｙｃ。

【0011】

キャップ１構造を有するジメチル化キャップ付ＲＮＡは、キャップ０構造を有するキャ
ップ付ＲＮＡよりも効率的に翻訳されると報告されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．第２６巻：３２０８頁、（１９９８年））。真核細胞は、別の（ヌクレオシド
－２’－Ｏ）メチルトランスフェラーゼ（例えば、ヒト細胞ではｈＭＴＲ２（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第３９巻：４７５６頁（２０１１年））を利用して、以下の
反応によって、５’キャップ付ＲＮＡの第２の転写されるヌクレオチドの２’－ヒドロキ
シル基のメチル化を触媒して、キャップ１構造をキャップ２構造に変換する：
^７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ_１ ^{２’－ＯＭｅ}ｐＮ_２（ｐＮ）_ｘ＋ＡｄｏＭｅｔ→^７
ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ_１ ^{２’－ＯＭｅ}ｐＮ_２ ^{２’－ＯＭｅ}（ｐＮ）_ｘ＋ＡｄｏＨ
ｙｃ。
真核細胞ｍＲＮＡのおよそ５０％が、キャップ２構造を有する。

【0012】

種々の生物学的研究のために長い機能的ＲＮＡを生成するために、１９８０年代中盤に
、一次ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素的合成の方法が開発された（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．第１８０巻：５１～６２頁、（１９８９年）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、第１０巻：６３５３～６３６２頁、（１９８２年）；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
、第１８０巻：４２～５０頁（１９８９年）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１２
巻：７０３５～７０５６頁、（１９８４年）およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ第１５巻：８７８３～８７９８頁、（１９８７年））。

【0013】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写後、５’－三リン酸基を保持する一次ｍＲＮＡ転写物を、キャッ
プ形成酵素を用いてさらにキャップすることができる。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素的
５’－キャップ形成は、高価であり、労力を要するものであり、効率的でなく、制御する
ことが困難である。

【0014】

これらの不利点を考慮して、化学的に合成されたジヌクレオチド^７ｍＧ（５’）ｐｐｐ
（５’）Ｇ（ｍＣＡＰとも呼ばれる）を使用して転写を開始する、キャップ付ｍＲＮＡの
ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための別の方法が開発された（ＲＮＡ第１巻：９５７～９６７頁
、（１９９５年））。ｍＣＡＰジヌクレオチドは、成熟ｍＲＮＡの５’－キャップ０構造
を含有するが、キャップ１およびキャップ２構造に特徴的な２’－Ｏ－メチルヌクレオシ
ドを有さない。

【0015】

しかし、合成ｍＣＡＰジヌクレオチドを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の開始に起因す
る２つの主な不利点がある。第１は、ｍＲＮＡ合成の開始のためのｍＣＡＰおよびｐｐｐ
Ｇの強力な競合である。ｐｐｐＧを用いてｍＲＮＡが開始される場合には、得られたｐｐ
ｐ－ｍＲＮＡは、５’－三リン酸の存在のために翻訳および免疫原性において不活性であ
る。対応して、ｍＲＮＡがｍＣＡＰを用いて開始される場合には、得られた５’キャップ
付ｍＲＮＡは、翻訳において活性であり、免疫原性としては活性ではない。

【0016】

５’キャップを有するまたは５’キャップのない（または５’－三リン酸化；ｐｐｐｍ
ＲＮＡ）ｍＲＮＡの割合を改善するために、５’－キャップ構造ｍＲＮＡ転写物（最大８
０～９０％）の生成に好都合であるために、ｐｐｐＧを上回る過剰の^７ｍＧｐｐｐＧ（４
：１～１０：１）を使用しなくてはならない。このアプローチのマイナス面は、転写の際
のＧＴＰ供給の迅速な枯渇および多量の高価であり得る合成ｍＣＡＰ二量体が必要である
ことによるｍＲＮＡの全体的な収率の大幅な低減である。転写後、５’キャップ付ｍＲＮ
Ａおよび５’ｐｐｐｍＲＮＡの両方を含有する粗混合物の、アルカリホスファターゼでの
さらなる処理が、合成されたｍＲＮＡの免疫原性を低減するためにｐｐｐｍＲＮＡからキ
ャップのない５’－三リン酸基を除去するために必要である。ホスファターゼ処理後に得
られたｍＲＮＡのキャップのない５’－ＯＨ型は、不活性であり、翻訳プロセスに関与し
ない。

【0017】

非対称ｍＣＡＰジヌクレオチドを使用する場合には、別の不利点、二方向性の開始が起
こり得る。^７ｍＧｐｐｐＧのＧまたは^７ｍＧ部分のいずれかの３’－ヒドロキシル基の、
およそ同程度の確率で転写伸長の開始点として役立つ傾向がある。通常、転写反応の条件
に応じて、およそ同等の割合での、形態^７ｍＧ（５’）ｐｐｐＧ（ｐＮ）_ｎおよびＧ（５
’）ｐｐｐ^７ｍＧ（ｐＮ）_ｎの２種の異性体ＲＮＡの合成につながる（ＲＮＡ第１巻：９
５７～９６７頁、（１９９５年））。

【0018】

ｍＣＡＰジヌクレオチドを用いた場合のｍＲＮＡ合成の二方向性開始を排除するために
、^７ｍＧ残基の３’－ＯＨ基が、ＯＣＨ_３で置換された新規修飾ｍＣＡＰ類似体（「ＯＭ
ｅ」）：^７ｍＧ（３’－Ｏ－Ｍｅ）ｐｐｐＧ（アンチリバースキャップ類似体（Ａｎｔｉ
－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）としても知られる）が開発され
た。ＡＲＣＡは、正しいフォワード配向でのみｍＲＮＡ合成を開始する（ＲＮＡ第７巻：
１４８６～１４９５頁（２００１年））。いくつかの種類のＡＲＣＡ類似体が当技術分野
で公知である（例えば、米国特許第７，０７４，５９６号を参照のこと）。しかし、ほと
んどのｍＲＮＡ転写物分子が５’－キャップ構造を有することを確実にするには、ｐｐｐ
Ｇを上回る大モル過剰のＡＲＣＡが依然として必要である。さらなる不利点は、キャップ
１構造を有するｍＲＮＡは、^７ｍＧｐｐｐＧ^{２’－ＯＭｅ}キャップ二量体（ＲＮＡ第１巻
：９５７頁、（１９９５年））またはそのＡＲＣＡ類似体を使用して合成できないという
ことである。

【0019】

現在、キャップ１構造を含有する活性な長いｍＲＮＡの生成のための公知の経路は、酵
素的キャップ形成および５’－三リン酸化ｍＲＮＡ転写物の酵素的２’Ｏ－メチル化また
はｍＣＡＰキャップもしくはＡＲＣＡキャップ付ｍＲＮＡ前駆体の酵素的２’－Ｏ－メチ
ル化（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ、第２５巻：３３７～３４０頁、（２００６年）およびＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ
，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ第２５巻（３号）：３
０７～１４頁、（２００６年））からなる。両アプローチは、かなり労力を要するもので
あり、制御することが困難であり、実質的な最適化を行っても、どちらのアプローチも、
キャップを有し、メチル化されたｍＲＮＡ前駆体の高収率を保証できない（Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．、第９１巻：１１２～１２１頁、（２０１０年））。さらに、キャップ２構
造を有するｍＲＮＡを調製するための方法は、一層より困難であり、結果は、予測可能性
が低い。キャップ１からキャップ２に変換するための酵素は、現在市販されていない。

【0020】

特に大規模製造におけるｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成の別の重要な複雑性は、不活
性であり、いくつかの場合には、免疫原性であるすべてのキャップのないｍＲＮＡ形態か
ら、キャップを保持する活性ｍＲＮＡ分子を単離および精製することが必要であることで
ある。残念ながら、これらの方法は、些細なものではなく、キャップ付ＲＮＡ転写物の、
より容易な単離および精製を可能にする親和性タグ部分がコンジュゲートされた修飾され
たｍＣＡＰ類似体の合成が必要であることが多い。リポーター／親和性部分として親和性
タグを有するｍＣＡＰ類似体を合成する方法および転写反応混合物からのキャップ付ＲＮ
Ａの単離のための新規プロトコールは、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第８
，３４４，１１８号を参照のこと）。これらのアプローチは効率的であるが、それらはよ
り多くの高価なｍＣＡＰ類似体の使用を必要とし、キャップ０構造のみを含有するｍＲＮ
Ａの調製および単離を可能にする。

【0021】

天然および修飾ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成は、リボザイム、アンチセンス、生物物
理学的および生化学的研究を含む種々の適用において使用される。さらに、キャップ付ｍ
ＲＮＡ転写物は、ｉｎ ｖｉｖｏ発現実験（マイクロインジェクション、トランスフェク
ションおよび感染を使用する）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳実験およびアッセイならびに治療
薬、診断薬、ワクチン開発、標識および検出における種々の適用abo-thibタンパク質合成
を必要とする適用のために使用される。

【0022】

結果として、（ａ）従来の方法よりも労力を要するものではない、（ｂ）転写の際に二
方向性開始を排除または低減する、（ｄ）現在の方法と比較して低減した費用で（ｃ）ｍ
ＲＮＡのより高い収率をもたらす、（ｅ）異なる５’配列を有する不均一生成物の生成を
低減する、（ｆ）合成されたｍＲＮＡにキャップ１およびキャップ２構造を組み込むため
にさらなる酵素反応を必要としない、ｍＲＮＡの大規模合成を可能にする組成物および方
法が、当業界で必要である。また、分子の５’末端にまたはその付近に、特定の修飾およ
び／または蛍光色素、放射性同位元素、質量タグなどの親和性タグおよび／またはビオチ
ンなどの分子結合対の一方のパートナーを保持する、修飾されたおよび／または非天然ヌ
クレオシドを含有する種々のｍＲＮＡの合成も必要である。

【発明の概要】

【0023】

本明細書において、５’キャップ付ＲＮＡを合成するための方法および組成物が提供さ
れる。本発明の一態様では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、式Ｉ：

【化1】

［式中、
Ｂ_１からＢ_１０の各々は独立に、天然、修飾または非天然ヌクレオシド塩基であり、
Ｍは、０または１であり、
Ｌは、０または１であり、
ｑ_１は、１であり、
ｑ_２からｑ_９の各々は独立に、０または１であり、
Ｒ_１は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、Ｏ－アルキル、ハロゲン、アミン、ア
ジド、リンカーまたは検出可能なマーカーであり、
Ｘ_１からＸ_１３の各々は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｙ_１からＹ_１３の各々は独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ_３、アリール、アルキル、Ｏ－アル
キルまたはＯ－アリールであり、
Ｚ_１からＺ_２２の各々は独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ_２、Ｃ（ハロゲン）_２またはＣＨ
（ハロゲン）であり、
Ｒ_４からＲ_１２の各々は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、リンカーまたは検出可能なマーカ
ーである］
で示される一般構造を含む。

【0024】

本発明の別の態様では、式Ｉのキャップ含有開始オリゴヌクレオチドプライマーを含む
ＲＮＡ分子、このようなＲＮＡを含む医薬組成物、このようなＲＮＡを含有する細胞およ
びこのようなＲＮＡから翻訳されたタンパク質またはペプチドを含有する細胞が提供され
る。

【0025】

本発明のさらに別の態様では、ポリヌクレオチド鋳型のＲＮＡポリメラーゼによる転写
を促す条件下で、式Ｉのキャップ含有開始オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分
子を、ポリヌクレオチド鋳型およびＲＮＡポリメラーゼを含む混合物に合成し、その後、
得られた混合物を、前記鋳型の転写を可能にするのに十分な時間インキュベートする方法
が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】グアノシン５’－二リン酸から７－メチルグアノシン５－二リン酸（ｐｐ^{７ ｍ}Ｇ）を調製する例示的方法を示す図である。

【図2】ｐｐ^７ｍＧから７－メチルグアノシン５’－二リン酸イミダゾリド（Ｉｍ－ｐｐ^７ｍＧ）を調製する例示的方法を示す図である。

【図3】３’－Ｏ－メチルグアノシンから３’－Ｏ－メチルグアノシン５’－リン酸（ｐＧ_{３’Ｏｍｅ}）を調製する例示的方法を示す図である。

【図4】ｐＧ_{３’Ｏｍｅ}から３’－Ｏ－メチルグアノシン５’－ホスホルイミダゾリド（Ｉｍ－ｐＧ_{３’Ｏｍｅ}）を調製する例示的方法を示す図である。

【図5】Ｉｍ－ｐＧ_{３’Ｏｍｅ}から３’－Ｏ－メチルグアノシン５’－二リン酸（ｐｐＧ_{３’Ｏｍｅ}）を調製する例示的方法を示す図である。

【図6】ｐｐＧ_{３’Ｏｍｅ}から７－メチル－３’－Ｏ－メチルグアノシン５－二リン酸（ｐｐ^７ｍＧ_{３’Ｏｍｅ}）を調製するための例示的方法を示す図である。

【図7】ｐｐ^７ｍＧ_{３’Ｏｍｅ}から７－メチル－３’－Ｏ－メチルグアノシン５－二リン酸イミダゾリド（Ｉｍ－ｐｐ^７ｍＧ_{３’Ｏｍｅ}）を調製するための例示的方法を示す図である。

【図8】ｐＮ_{２’－ＯＲ１}ｐＮオリゴヌクレオチド（Ｒ_１＝ＨまたはＭｅ）の調製のための一般手順を示す図である。

【図9】キャップ０、キャップ１またはキャップ２構造を有する開始オリゴヌクレオチドの合成のための一般手順を示す図である。

【図10A】式Ｉ［式中、Ｂ_１はグアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ_１からｑ_９は、０であり、Ｒ_１は、Ｈであり、Ｒ_２は、Ｈであり、Ｒ_３は、Ｏ－メチルであり、Ｘ_１は、Ｏであり、Ｘ_２は、Ｏであり、Ｘ_１３は、Ｏであり、Ｙ_１３は、ＯＨであり、Ｚ_０は、Ｏであり、Ｚ_１は、Ｏであり、Ｚ_２は、Ｏであり、Ｚ_２２は、Ｏである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。

【図10B】式Ｉ［式中、Ｂ_１は、グアニンであり、Ｂ_１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ_１は、１であり、ｑ_２からｑ_９は、０であり、Ｒ_１は、Ｈであり、Ｒ_２は、Ｈであり、Ｒ_３は、Ｈであり、Ｘ_１は、Ｏであり、Ｘ_２は、Ｏであり、Ｘ_４は、Ｏであり、Ｘ_１３は、Ｏであり、Ｙ_１は、ＯＨであり、Ｙ_２は、ＯＨであり、Ｙ_４は、ＯＨであり、Ｙ_１３は、ＯＨであり、Ｚ_０は、Ｏであり、Ｚ_１は、Ｏであり、Ｚ_２は、Ｏであり、Ｚ_４は、Ｏであり、Ｚ_５は、Ｏであり、Ｚ_２２は、Ｏであり、Ｒ_４は、Ｏ－メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。

【図10C】式Ｉ［式中、Ｂ_１は、グアニンであり、Ｂ_１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ_１は、１であり、ｑ_２からｑ_９は、０であり、Ｒ_１は、Ｈであり、Ｒ_２は、Ｈであり、Ｒ_３は、Ｏ－メチルであり、Ｘ_１は、Ｏであり、Ｘ_２は、Ｏであり、Ｘ_４は、Ｏであり、Ｘ_１３は、Ｏであり、Ｙ_１は、ＯＨであり、Ｙ_２は、ＯＨであり、Ｙ_４は、ＯＨであり、Ｙ_１３は、ＯＨであり、Ｚ_０は、Ｏであり、Ｚ_１は、Ｏであり、Ｚ_２は、Ｏであり、Ｚ_４は、Ｏであり、Ｚ_５は、Ｏであり、Ｚ_２２は、Ｏであり、Ｒ_４は、Ｏ－メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。

【図10D】式Ｉ［式中、Ｂ_１は、アデニンであり、Ｂ_１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ_１は、１であり、ｑ_２からｑ_９は、０であり、Ｒ_１は、Ｈであり、Ｒ_２は、Ｈであり、Ｒ_３は、Ｈであり、Ｘ_１は、Ｏであり、Ｘ_２は、Ｏであり、Ｘ_４は、Ｏであり、Ｘ_１３は、Ｏであり、Ｙ_１は、ＯＨであり、Ｙ_２は、ＯＨであり、Ｙ_４は、ＯＨであり、Ｙ_１３は、ＯＨであり、Ｚ_０は、Ｏであり、Ｚ_１は、Ｏであり、Ｚ_２は、Ｏであり、Ｚ_４は、Ｏであり、Ｚ_５は、Ｏであり、Ｚ_２２は、Ｏであり、Ｒ_４は、Ｏ－メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。

【図10E】式Ｉ［式中、Ｂ_１は、アデニンであり、Ｂ_１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ_１は、１であり、ｑ_２からｑ_９は、０であり、Ｒ_１は、Ｈであり、Ｒ_２は、Ｈであり、Ｒ_３は、Ｏ－メチルであり、Ｘ_１は、Ｏであり、Ｘ_２は、Ｏであり、Ｘ_４は、Ｏであり、Ｘ_１３は、Ｏであり、Ｙ_１は、ＯＨであり、Ｙ_２は、ＯＨであり、Ｙ_４は、ＯＨであり、Ｙ_１３は、ＯＨであり、Ｚ_０は、Ｏであり、Ｚ_１は、Ｏであり、Ｚ_２は、Ｏであり、Ｚ_４は、Ｏであり、Ｚ_５は、Ｏであり、Ｚ_２２は、Ｏであり、Ｒ_４は、Ｏ－メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。

【図10F】式Ｉ［式中、Ｂ_１は、シトシンであり、Ｂ_１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ_１は、１であり、ｑ_２からｑ_９は、０であり、Ｒ_１は、Ｈであり、Ｒ_２は、Ｈであり、Ｒ_３は、Ｈであり、Ｘ_１は、Ｏであり、Ｘ_２は、Ｏであり、Ｘ_４は、Ｏであり、Ｘ_１３は、Ｏであり、Ｙ_１は、ＯＨであり、Ｙ_２は、ＯＨであり、Ｙ_４は、ＯＨであり、Ｙ_１３は、ＯＨであり、Ｚ_０は、Ｏであり、Ｚ_１は、Ｏであり、Ｚ_２は、Ｏであり、Ｚ_４は、Ｏであり、Ｚ_５は、Ｏであり、Ｚ_２２は、Ｏであり、Ｒ_４は、Ｏ－メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。

【図10G】式Ｉ［式中、Ｂ_１は、シトシンであり、Ｂ_１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ_１は、１であり、ｑ_２からｑ_９は、０であり、Ｒ_１は、Ｈであり、Ｒ_２は、Ｈであり、Ｒ_３は、Ｏ－メチルであり、Ｘ_１は、Ｏであり、Ｘ_２は、Ｏであり、Ｘ_４は、Ｏであり、Ｘ_１３は、Ｏであり、Ｙ_１は、ＯＨであり、Ｙ_２は、ＯＨであり、Ｙ_４は、ＯＨであり、Ｙ_１３は、ＯＨであり、Ｚ_０は、Ｏであり、Ｚ_１は、Ｏであり、Ｚ_２は、Ｏであり、Ｚ_４は、Ｏであり、Ｚ_５は、Ｏであり、Ｚ_２２は、Ｏであり、Ｒ_４は、Ｏ－メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。

【図10H】式Ｉ［式中、Ｂ_１は、アデニンであり、Ｂ_２は、グアニンであり、Ｂ_{１ ０}は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ_１は、１であり、ｑ_２は、１であり、ｑ_３からｑ_９は、０であり、Ｒ_１は、Ｈであり、Ｒ_２は、Ｈであり、Ｒ_３は、Ｏ－メチルであり、Ｘ_１は、Ｏであり、Ｘ_２は、Ｏであり、Ｘ_４は、Ｏであり、Ｘ_５は、Ｏであり、Ｘ_１３は、Ｏであり、Ｙ_１は、ＯＨであり、Ｙ_２は、ＯＨであり、Ｙ_４は、ＯＨであり、Ｙ_５は、ＯＨであり、Ｙ_１３は、ＯＨであり、Ｚ_０は、Ｏであり、Ｚ_１は、Ｏであり、Ｚ_２は、Ｏであり、Ｚ_４は、Ｏであり、Ｚ_５は、Ｏであり、Ｚ_６は、Ｏであり、Ｚ_２２は、Ｏであり、Ｒ_４は、Ｏ－メチルであり、Ｒ_５は、Ｏ－メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。

【図11】ｍＲＮＡ同時転写によってキャップ形成されたｍＲＮＡのルシフェラーゼ活性を示す図である。

【図12A-12H】１２Ａ）ＡＲＣＡを用いて、１２Ｂ）^ｍ７ＧｐｐｐＧ_{２’Ｏｍ ｅ}ｐＧを用いて、１２Ｃ）^ｍ７Ｇ_{３’Ｏｍｅ}ｐｐｐＧ_{２’Ｏｍｅ}ｐＧを用いて、１２Ｄ）^ｍ７ＧｐｐｐＡ_{２’Ｏｍｅ}ｐＧを用いて、１２Ｅ）^ｍ７Ｇ_{３’Ｏｍｅ}ｐｐｐＡ_{２’－ＯＭ ｅ}ｐＧを用いて、１２Ｆ）^ｍ７ＧｐｐｐＣ_{２’Ｏｍｅ}ｐＧを用いて、１２Ｇ）^ｍ７Ｇ_{３’ Ｏｍｅ}ｐｐｐＣ_{２’Ｏｍｅ}ｐＧを用いて、１２Ｈ）^ｍ７Ｇ_{３’Ｏｍｅ}ｐｐｐＡ_{２’Ｏｍｅ}ｐＧ_{２’Ｏｍｅ}ｐＧを用いて同時転写によってキャップが付けられたｍＲＮＡのキャップ形成効率を合わせて示す図である。図１１Ｂ～１１Ｇにおけるキャップ形成効率は、図１１Ａにおいて観察されたものと同等であるか、またはそれを大幅に超える。

【図13A-13D】転写鋳型上の^ｍ７ＧｐｐｐＡ_{２’Ｏｍｅ}ｐＧを用いる同時転写によりキャップ形成されるｍＲＮＡの開始のキャップ形成効率および忠実度をまとめて示す図であり、図１３Ａはプライマー／ＮＴＰ処方２を使用する、鋳型位置＋１および＋２での２’－デオキシチミジンおよび２’－デオキシシチジン残基の使用を例示し、図１３Ｂは、プライマー／ＮＴＰ処方３を使用する、鋳型位置＋１および＋２での２’－デオキシチミジンおよび２’－デオキシシチジン残基の使用を例示し、図１３Ｃは、プライマー／ＮＴＰ処方２を使用する、鋳型位置＋１および＋２での２’－デオキシシチジン残基の使用を例示し、図１３Ｄは、プライマー／ＮＴＰ処方３を使用する、鋳型位置＋１および＋２での２’－デオキシシチジン残基の使用を例示する。

【図14A-14B】鋳型位置＋１および＋２に２’－デオキシチミジンおよび２’－デオキシシチジン残基を有する転写鋳型対鋳型位置＋１および＋２にシチジン残基を有する転写鋳型での、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドを用いて作製されたｍＲＮＡの、分化したＴＨＰ－１細胞における翻訳の比較をまとめて示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

別段の定めがない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、本発明が属する
技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本開示を通じて
言及されるすべての特許、特許出願および刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる
。本明細書において用語について複数の定義がある事象では、この節にあるものが優先す
る。

【0028】

本明細書において、数値に関連して、用語「およそ」または「約」は、記載された値を
含む定義される範囲内のすべての値を含む示される値のプラスまたはマイナス３０％を意
味する。

【0029】

本明細書において、用語「核酸」、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」とは、オ
リゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはその任意の断片、任意のリボまたはデオキシ
リボ誘導体ならびに天然および／もしくは修飾ヌクレオチド残基およびヌクレオチド間連
結を含有する天然に存在する分子または合成分子を指す。これらの語句はまた、一本鎖、
二本鎖、三本鎖もしくは四本鎖であり得、センスもしくはアンチセンス鎖を表し得る、天
然起源（例えば、ゲノム）または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、または任意のＤＮＡ様
もしくはＲＮＡ様材料を指す。ＤＮＡ配列に関して「ＲＮＡ等価物」は、窒素塩基チミン
のすべてまたはほとんどの出現が、ウラシルと置換され、糖骨格が、２’－デオキシリボ
ースの代わりにリボースから構成される点を除いて、参照ＤＮＡ配列と同一のヌクレオチ
ドの直線配列から構成される。本明細書において提供される方法および組成物に適したさ
らなる代替核酸骨格として、それだけには限らないが、ホスホロチオエート、ホスホロセ
レノエート、アルキルホスホトリエステル、アリールホスホトリエステル、アルキルホス
ホネート、アリールホスホネート、ホスホボロネート、モルホリノ核酸（ＭＮＡ）、ロッ
クド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。

【0030】

本明細書において、用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」とは
、リボ－もしくはデオキシリボ－またはキメラリボ／デオキシリボ－オリゴヌクレオチド
を指し、一本鎖は、天然に存在するものであっても、合成であってもよく、通常、約２か
ら約１０ヌクレオチド、約３から約８ヌクレオチドまたは約３から約５の間のヌクレオチ
ドの配列を含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、１つまたは複数の修飾基を含有し得
る。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはその他の修飾ヌク
レオシドを含み得る。当業者は、ＤＮＡ鋳型配列の転写にとって適当であるオリゴヌクレ
オチドプライマーを設計および調製可能である。

【0031】

本明細書において、用語「開始キャップ付オリゴヌクレオチド類似体」または「開始キ
ャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」とは、プライマーの５’末端にキャップ０、キ
ャップ１、キャップ２またはＴＭＧ－キャップ構造を含有する、開始オリゴヌクレオチド
プライマーを指す。キャップ付プライマーは、非修飾または開放３’－ＯＨ基を有し、プ
ライマーの３’末端でのＮＴＰの組込みによってＲＮＡポリメラーゼによって延長され得
る。必要な成分：ＤＮＡ鋳型（例えば、ＤＮＡプラスミド）、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌク
レオシド５’－三リン酸および適当なバッファーを含有する転写系においてプロモーター
の制御下でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を開始することができる。また、本明細書において同様
に使用される「開始プライマー」または「開始オリゴヌクレオチドプライマー」とは、Ｒ
ＮＡポリメラーゼの妥当な基質である末端３’－ＯＨ基を保持するオリゴヌクレオチドを
指す。特定の実施形態では、開始オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼ
の基質であり、プライマーの３’末端でのＮＴＰの組込みによって伸長され得る。開始オ
リゴヌクレオチドプライマーは、開始部位でＤＮＡ鋳型と相補的である。

【0032】

本明細書において、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＮＴＰとの関
連で、用語「非置換」または「非修飾」とは、修飾されていない、開始キャップ付オリゴ
ヌクレオチドプライマーおよびＮＴＰを指す。

【0033】

本明細書において、用語「修飾された開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」
とは、１つまたは複数のさらなる修飾基を含有する開始キャップ付オリゴヌクレオチドプ
ライマーを指す。

【0034】

本明細書において、用語「修飾基」とは、それだけには限らないが、糖、ヌクレオシド
塩基、三リン酸架橋および／またはヌクレオチド間リン酸を含む位置で開始プライマーと
結合され得る任意の化学部分を指す（例えば、米国特許出願第２００７０２８１３０８号
）。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの修飾基は、転写のプロセスと適合す
る任意の性質の基であり得る。

【0035】

本明細書において、用語「ヌクレオチド間連結」とは、オリゴヌクレオチドプライマー
または核酸の２つのヌクレオシドをつなげる結合（単数または複数）を指し、天然ホスホ
ジエステル連結または修飾された連結であり得る。

【0036】

本明細書において、用語「標識」または「検出可能な標識」とは、分子が標識を検出す
ることによって直接的または間接的に検出され得るように、分子に結合され得る、または
そうでなければ分子と会合され得る化合物または化合物の組合せを指す。検出可能な標識
は、放射性同位元素（例えば、炭素、リン、ヨウ素、インジウム、硫黄、トリチウムなど
）、質量同位体（例えば、Ｈ^２、Ｃ^１３またはＮ^１５）、色素またはフルオロフォア（例
えば、シアニン、フルオレセインまたはクマリン）、ハプテン（例えば、ビオチン）また
は直接的もしくは間接的に検出され得る任意のその他の薬剤であり得る。

【0037】

本明細書において、用語「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする
」とは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、転写反応の際に適当にストリ
ンジェントな条件下でＤＮＡ鋳型とアニールするプロセスを指す。ＤＮＡとのハイブリダ
イゼーションは、特定の実施形態では、５’－５’逆位キャップ構造を含む３～１０ヌク
レオチドの長さである開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される
。核酸ハイブリダイゼーション技術は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｓｅｃａｕｃｕｓ、Ｎ．Ｊ．（１９９４））。

【0038】

本明細書において、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ鋳型の
複合体との関連で、用語「相補体」、「相補的な」または「相補性」とは、標準ワトソン
／クリック塩基対形成ルールを指す。例えば、配列「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－３’」は、
配列「３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－Ｇ－５’」と相補的である。特定の非天然または合成ヌクレオ
チドは、本明細書において記載される核酸中に含まれてもよく、これらとして、それだけ
には限らないが、イノシン、７－デアザグアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’
－フルオロ－２’－デオキシシチジン、プソイドウリジン、ロックド核酸（ＬＮＡ）およ
びペプチド核酸（ＰＮＡ）などの、塩基および糖修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび
核酸が挙げられる。相補性は、完全であることを必要とせず、二本鎖は、ミスマッチした
塩基対、変性または非対応ヌクレオチドを含有し得る。当業者は、例えば、オリゴヌクレ
オチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチドの配列、ミスマッチした塩基対の出現
率、イオン強度、ハイブリダイゼーションバッファーの成分および反応条件を含むいくつ
かの変数を考慮して二本鎖安定性を経験的に決定できる。

【0039】

相補性は、２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基のすべてが、認識されている塩基対形成ル
ールに従って対応している「完全」または「全面的（total）」であっても、開始キャッ
プ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ標的のヌクレオチド塩基の一部のみが、
認識されている塩基対形成ルールに従って対応している「部分的」であってもよく、また
は２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基のうち、認識されている塩基対形成ルールに従って対
応するものがない「存在しない」場合もある。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライ
マーおよびＤＮＡ鋳型の間の相補性の程度は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドとＤＮ
Ａ鋳型の間のハイブリダイゼーション力に対して、それに応じて、反応の効率に対して相
当な効果を有し得る。用語相補性はまた、個々のヌクレオチドに関しても使用され得る。
例えば、オリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドは、開始キャップ付オリゴヌクレオ
チドプライマーの残部とＤＮＡ鎖の間の相補性と対照的な、またはそれと比較した、別の
鎖内のヌクレオチドに対するその相補性について、またはそれがないことについて述べら
れることもある。

【0040】

本明細書において、用語「完全な」、「全面的な」または「完璧な（perfectly）」相
補性とは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド塩基の各々と、
ＤＮＡ標的が、認識されている塩基対形成ルールに従って正確に対応することを意味する
。

【0041】

本明細書において、用語「実質的に相補的な」とは、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下でハイブリダイズする２つの配列を指す。当業者ならば、実質的に相補
的な配列は、その全長に沿ってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。
特に、実質的に相補的な配列は、標的配列とハイブリダイズしない塩基の連続配列を含む
こともあり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダ
イズする塩基の連続配列の３’または５’に位置し得る。

【0042】

本明細書において、用語「特異的な」とは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライ
マー配列およびＤＮＡ鋳型とハイブリダイズするその能力に関して使用される場合、開始
キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ鎖がアラインされる場合、ＤＮＡ
鋳型の部分と少なくとも５０％の配列同一性を有する配列である。好ましいものであり得
るより高いレベルの配列同一性として、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％および最も好ましく
は、１００％の配列同一性が挙げられる。

【0043】

本明細書において、用語「ヌクレオシド」は、天然に見られるヌクレオシド塩基および
フラノシドのすべての形態を含む、すべての天然に存在するヌクレオシドを含む。天然に
存在するヌクレオシド中に最もよく見られる塩基環は、プリンおよびピリミジン環である
。天然に存在するプリン環として、例えば、アデニン、グアニンおよびＮ^６－メチルアデ
ニンが挙げられる。天然に存在するピリミジン環として、例えば、シトシン、チミン、５
－メチルシトシン、プソイドウラシルが挙げられる。天然に存在するヌクレオシドとして
、例えば、それだけには限らないが、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウ
リジン、イノシン、７－メチルグアノシンまたはプソイドウリジンのリボ、２’－Ｏ－メ
チルまたは２’－デオキシリボ誘導体が挙げられる。

【0044】

本明細書において、用語「ヌクレオシド類似体」、「修飾ヌクレオシド」または「ヌク
レオシド誘導体」として、本明細書において記載されるような合成ヌクレオシドが挙げら
れる。ヌクレオシド誘導体はまた、保護基とともに、または伴わずに、修飾塩基または／
および糖部分を有するヌクレオシドを含み、例えば、２’－デオキシ－２’－フルオロウ
リジン、５－フルオロウリジンなどが挙げられる。本明細書において提供される化合物お
よび方法として、このような塩基環およびその合成類似体ならびに非天然複素環置換塩基
糖および非環式置換塩基糖が挙げられる。本発明とともに利用できるその他のヌクレオシ
ド誘導体として、例えば、ＬＮＡヌクレオシド、ハロゲン置換プリン（例えば、６－フル
オロプリン）、ハロゲン置換ピリミジン、Ｎ^６－エチルアデニン、Ｎ^４－（アルキル）－
シトシン、５－エチルシトシンなど（米国特許第６，７６２，２９８号）が挙げられる。

【0045】

本明細書において、用語「ユニバーサル塩基」、「縮重塩基」、「ユニバーサル塩基類
似体」および「縮重塩基類似体」として、例えば、特定の実施形態では、天然ＮＴＰ（例
えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ）またはその他の特定のＮＴＰのうちの１種
の代理としてＲＮＡポリメラーゼによって認識されることが可能である人工塩基を有する
ヌクレオシド類似体が挙げられる。ユニバーサル塩基または縮重塩基は、Ｌｏａｋｅｓ，
Ｄ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２９巻：２４３７～２４４７頁（２０
０１年）；Ｃｒｅｙ－Ｄｅｓｂｉｏｌｌｅｓ，Ｃ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．、第３３巻：１５３２～１５４３頁（２００５年）；Ｋｉｎｃａｉｄ，Ｋ．ら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第３３巻：２６２０～２６２８頁（２００５年）
；Ｐｒｅｐａｒａｔａ，ＦＰ、Ｏｌｉｖｅｒ，ＪＳ、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７５
３～７６５頁（２００４年）；およびＨｉｌｌ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９５巻：４２５８～４２６３頁（１９９８年））に開示されている
。

【0046】

本明細書において、用語「修飾されたＮＴＰ」とは、糖、塩基、三リン酸鎖を含む任意
の位置またはこれら３つの位置の何らかの組合せに結合された、化学部分の基を有するヌ
クレオシド５’－三リン酸を指す。このようなＮＴＰの例は、例えば、「Ｎｕｃｌｅｏｓ
ｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｖａｇｈｅｆｉ，Ｍ．ら、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ
、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（２００５年）に見出すことができる。

【0047】

本明細書において、用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、例えば、修飾ヌクレオシド、
修飾ヌクレオチド間連結を含有する、または修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド間連結
の何らかの組合せを有するオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドヌクレオチド
間連結修飾の例として、ホスホロチオエート、ホスホトリエステルおよびメチルホスホネ
ート誘導体が挙げられる（Ｓｔｅｃ、Ｗ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．
、第３３巻：７０９～７２２頁（１９９４年）；Ｌｅｂｅｄｅｖ，Ａ．Ｖ．ら、Ｅ．，Ｐ
ｅｒｓｐｅｃｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｓ．、第４巻：１７～４０頁（１９９６
年）；およびＺｏｎら、米国特許出願第２００７０２８１３０８号）。ヌクレオチド間連
結修飾のその他の例は、Ｗａｌｄｎｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ第６巻：２３６３～２３６６頁（１９９６年）に見出すことができる。

【0048】

用語「プロモーター」とは、本明細書において、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）
の転写の開始を指示および制御するｄｓＤＮＡ鋳型の領域を指す。プロモーターは、同一
鎖上およびＤＮＡの上流に位置する（センス鎖の５’領域に向けて）。プロモーターは、
通常、転写されるＤＮＡ配列のすぐ隣である（または部分的に重複している）。プロモー
ター中のヌクレオチド位置は、ＤＮＡの転写が始まる転写開始部位（位置＋１）に対して
指定される。開始オリゴヌクレオチドプライマーは、プロモーター配列の開始部位（特定
の実施形態では、位置＋１および＋２にあり、開始四量体の場合には、位置＋１、＋２お
よび＋３にある）に対して相補的である。

【0049】

本明細書において、用語「転写」または「転写反応」とは、ＤＮＡ鋳型と相補的である
ＲＮＡを酵素的に作製し、それによって、ＤＮＡ配列のいくつかのＲＮＡコピーを生成す
るための当技術分野で公知の方法を指す。転写反応において合成されたＲＮＡ分子は、「
ＲＮＡ転写物」、「一次転写物」または「転写物」と呼ばれる。本明細書において提供さ
れる組成物および方法が関与する転写反応は、「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプラ
イマー」を使用する。ＤＮＡ鋳型の転写は、指数関数的、非線形または線形であり得る。
ＤＮＡ鋳型は、二本鎖直鎖状ＤＮＡ、部分的に二本鎖の直鎖状ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ
、ＤＮＡプラスミド、ＰＣＲアンプリコン、ＲＮＡポリメラーゼと適合する修飾核酸鋳型
であり得る。

【0050】

本明細書において、用語「アシル」とは、基－Ｃ（Ｏ）Ｒ^ａ（式中、Ｒ^ａは、水素、低
級アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールなどである）
を示す。

【0051】

本明細書において、用語「置換アシル」とは、基－Ｃ（Ｏ）Ｒ^ａ’（式中、Ｒ^ａ’は、
置換低級アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、置換アリール、置換ヘテ
ロアリールなどである）を示す。

【0052】

本明細書において、用語「アシルオキシ」とは、基－ＯＣ（Ｏ）Ｒ^ｂ（式中、Ｒ^ｂは、
水素、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロ
シクリル、置換ヘテロシクリル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロ
アリールなどである）を示す。

【0053】

本明細書において、用語「アルキル」とは、いくつかの実施形態では、１～２０個の炭
素原子の範囲の、いくつかの実施形態では、１～８個の炭素原子の範囲の炭化水素の単結
合鎖を指し、例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ
－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、オクチル
、ドデカニルなどが挙げられる。

【0054】

本明細書において、用語「低級アルキル」とは、いくつかの実施形態では、１～６個の
炭素原子の範囲の、いくつかの実施形態では、２～５個の炭素原子の範囲の炭化水素の直
鎖または分枝鎖を指す。例として、エチル、プロピル、イソプロピルなどが挙げられる。

【0055】

本明細書において、用語「アルケニル」とは、１つまたは複数の二重結合を有し、特に
断りのない限り、約２～約２０個の、いくつかの実施形態では、約２～約１０個の炭素原
子の範囲の、いくつかの実施形態では、約２～約８個の炭素原子の、いくつかの実施形態
では、約２～約６個の炭素原子の範囲の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖ヒドロカル
ビルを指す。アルケニルラジカルの例として、ビニル、アリル、１，４－ブタジエニル、
イソプロペニルなどが挙げられる。

【0056】

本明細書において、用語「アルケニルアリール」とは、アルケニル置換アリール基を指
し、「置換アルケニルアリール」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数
の置換基をさらに保持するアルケニルアリール基を指す。

【0057】

本明細書において、用語「アルケニレン」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合
を有し、通常、２～２０個の炭素原子、いくつかの実施形態では、２～１２個の範囲の炭
素原子、いくつかの実施形態では、２～８個の範囲の炭素原子を含有する、二価直鎖また
は分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、「置換アルケニレン」とは、本明細書において示され
るような１つまたは複数の置換基をさらに保持するアルケニレン基を指す。

【0058】

本明細書において、用語「アルキレン」とは、１～２０個の炭素原子、いくつかの実施
形態では、１～１５個の範囲の炭素原子の、２個の水素原子が同一炭素原子から、または
異なる炭素原子からとられる直鎖または分岐鎖を含有する二価ヒドロカルビル基を指す。
アルキレンの例として、それだけには限らないが、メチレン（－ＣＨ_２－）、エチレン（
－ＣＨ_２ＣＨ_２－）などが挙げられる。

【0059】

本明細書において、用語「アルキニル」とは、１つまたは複数の三重結合を有し、約２
～２０個の炭素原子、いくつかの実施形態では、約２～１０個の範囲の炭素原子、いくつ
かの実施形態では、約２～８個の範囲の炭素原子、いくつかの実施形態では、約２～６個
の範囲の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖ヒドロカルビルを指す。アルキニルラジ
カルの例として、エチニル、プロピニル（プロパルギル）、ブチニルなどが挙げられる。

【0060】

本明細書において、用語「アルキニルアリール」とは、アルキニル置換アリール基を指
し、「置換アルキニルアリール」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数
の置換基をさらに保持するアルキニルアリール基を指す。

【0061】

本明細書において、用語「アルコキシ」は、基－ＯＲ^ｃ（式中、Ｒ^ｃは、定義されるよ
うな、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換ア
ラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアル
キル、シクロヘテロアルキルまたは置換シクロヘテロアルキルである）を示す。

【0062】

本明細書において、用語「低級アルコキシ」とは、基－ＯＲ^ｄ（式中、Ｒ^ｄは、低級ア
ルキルである）を示す。

【0063】

本明細書において、用語「アルキルアリール」とは、アルキル置換アリール基を指し、
「置換アルキルアリール」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数の置換
基をさらに保持するアルキルアリール基を指す。

【0064】

本明細書において、用語「アルキルチオ」とは、基－Ｓ－Ｒ^ｈ（式中、Ｒ^ｈは、アルキ
ルである）を指す。

【0065】

本明細書において、用語「置換アルキルチオ」とは、基－Ｓ－Ｒ^ｉ（式中、Ｒ^ｉは、置
換アルキルである）を指す。

【0066】

本明細書において、用語「アルキニレン」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合
を有し、通常、約２～１２個の範囲の炭素原子、いくつかの実施形態では、約２～８個の
範囲の炭素原子を有する二価直鎖または分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、「置換アルキニ
レン」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数の置換基をさらに保持する
アルキニレン基を指す。

【0067】

本明細書において、用語「アミド」とは、基－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｊＲ^ｊ’（式中、Ｒ^ｊおよ
びＲ^ｊ’は独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、
アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり得る）を示す
。

【0068】

本明細書において、用語「置換アミド」とは、基－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｋＲ^ｋ’（式中、Ｒ^ｋ
およびＲ^ｋ’は独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリー
ル、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、ただし、Ｒ^ｋおよびＲ^ｋ’のうち
少なくとも一方は、水素ではない）を示す。窒素と組み合わせたＲ^ｋＲ^ｋ’は、任意選択
で、置換複素環式環またはヘテロアリール環を形成し得る。

【0069】

本明細書において、用語「アミノ」または「アミン」とは、基－ＮＲ^ｎＲ^ｎ’（式中、
Ｒ^ｎおよびＲ^ｎ’は独立に、本明細書において定義されるような、水素、低級アルキル、
置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール
または置換ヘテロアリールであり得る）を示す。「二価アミン」は、基－ＮＨ－を示す。
「置換二価アミン」とは、基－ＮＲ－（式中、Ｒは、低級アルキル、置換低級アルキル、
アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロア
リールである）を示す。

【0070】

本明細書において、用語「置換アミノ」または「置換アミン」とは、基－ＮＲ^ｐＲ^ｐ’
（式中、Ｒ^ｐおよびＲ^ｐ’は独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル
、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールであり
、ただし、Ｒ^ｐおよびＲ^ｐ’のうち少なくとも一方は、水素ではない）を示す。窒素と組
み合わせたＲ^ｐＲ^ｐ’は、任意選択で、置換複素環式環またはヘテロアリール環を形成し
得る。

【0071】

本明細書において、用語「アロイル」とは、ベンゾイルなどのアリール－カルボニル種
を指し、「置換アロイル」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数の置換
基をさらに保持するアロイル基を指す。

【0072】

本明細書において、用語「アリール」は、単独または組み合わせて、フェニル、ナフチ
ルまたは任意選択で、５～１０の環員の、いくつかの実施形態では、５～６の環員のシク
ロアルキルを有する、および／または任意選択で、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アル
キルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ
、ヘテロアリールオキシ、任意選択で、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で
一置換もしくは二置換されていてもよいアミノ、アミジノ、任意選択で、アルキル、アリ
ール、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリル基で置換されていてもよい尿素、任意選択
で、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基でＮ－一置換もしくはＮ，Ｎ－二置換
されていてもよいアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルア
ミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニ
ルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノなどの１～３の基もしくは置換基で置換され
ていてもよい、縮合芳香族複素環を指す。

【0073】

本明細書において、用語「アリールオキシ」とは、基－ＯＡｒ（式中、Ａｒは、アリー
ルまたは置換アリール基である）を示す。

【0074】

本明細書において、用語「炭素環」とは、連結された炭素原子から構成される単環また
は複数の縮合環を有する飽和、不飽和または芳香族基を指す。環（単数または複数）は、
任意選択で、非置換であっても、または例えば、ハロゲン、低級アルキル、アルコキシ、
アルキルチオ、アセチレン（－Ｃ＝ＣＨ）、アミノ、アミド、アジド、カルボキシル、ヒ
ドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール
、ニトロ（－ＮＯ_２）、シアノ（－ＣＮ）、チオール（－ＳＨ）、スルファミド（－Ｓ（
Ｏ）_２ＮＨ_２などで置換されていてもよい。

【0075】

本明細書において、用語「グアニジニル」とは、基－Ｎ＝Ｃ（ＮＨ_２）_２を示し、「置
換グアニジニル」とは、基－Ｎ＝Ｃ（ＮＲ_２）_２（式中、各Ｒは独立に、本明細書におい
て示されるようなＨ、アルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリールである）を
示す。

【0076】

本明細書において、用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、すべてのハロゲン、すなわ
ち、クロロ（Ｃｌ）、フルオロ（Ｆ）、ブロモ（Ｂｒ）およびヨード（Ｉ）を指す。

【0077】

本明細書において、用語「ヘテロアリール」とは、群Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択さ
れる、１個もしくは複数の、いくつかの実施形態では、１～４個の、いくつかの実施形態
では、１～３個の、いくつかの実施形態では、１～２個のヘテロ原子を含有する、任意選
択で、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキル
スルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、任意選択で、アル
キル、アリールもしくはヘテロアリール基で一置換もしくは二置換されていてもよいアミ
ノ、アミジノ、任意選択で、アルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリ
ル基で置換されていてもよい尿素、任意選択で、アルキル、アリールもしくはヘテロアリ
ール基でＮ－一置換もしくはＮ，Ｎ－二置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキ
ルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ア
ルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ
などの１～３の基もしくは置換基で置換された、５もしくは６個の環原子を含有する単環
式芳香環構造または８～１０個の原子を有する二環式芳香族基を指す。ヘテロアリールは
また、スルフィニル、スルホニルおよび第三級環窒素のＮ－オキシドなどの酸化Ｓまたは
Ｎを含むものとする。炭素または窒素原子は、安定な芳香環が保持されるようなヘテロア
リール環構造の結合点である。ヘテロアリール基の例として、フタルイミド、ピリジニル
、ピリダジニル、ピラジニル、キナゾリニル、プリニル、インドリル、キノリニル、ピリ
ミジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、イソキサゾリル、オキサチ
アジアゾリル、イソチアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアジニル、フラニル
、ベンゾフリル、インドリルなどがある。置換ヘテロアリールは、安定な化合物を生成す
るために利用可能な炭素または窒素で結合された置換基を含有する。

【0078】

本明細書において、用語「置換ヘテロアリール」とは、任意選択で、１つまたは複数の
官能基、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン
、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、
置換複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドな
どで一置換または多置換された複素環を指す。

【0079】

本明細書において、用語「複素環」とは、任意選択で、非置換であってもよく、または
、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミ
ノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘタリ
ール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドなどで置換されていて
もよい、単環（例えば、モルホリノ、ピリジルまたはフリル）または多環縮合環（例えば
、ナフトピリジル、キノキサリル、キノリニル、インドリジニルまたはベンゾ［ｂ］チエ
ニル）を有し、環内に炭素原子およびＮ、ＯまたはＳなどの少なくとも１個のヘテロ原子
を有する、飽和、不飽和または芳香族基を指す。

【0080】

本明細書において、用語「置換複素環」とは、安定な化合物を生成するように任意の利
用可能な点で結合された、任意選択で置換されていてもよいアルキル、任意選択で置換さ
れていてもよいアルケニル、任意選択で置換されていてもよいアルキニル、ハロ、ヒドロ
キシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシル
オキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アミノ、ア
ミド、アミジノ、任意選択で、アルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはヘテロシク
リル基で置換されていてもよい尿素、任意選択で、アルキル、アリールもしくはヘテロア
リール基でＮ－一置換もしくはＮ，Ｎ－二置換されていてもよいアミノスルホニル、アル
キルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、
アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミ
ノ、アシル、カルボキシル、複素環、置換複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ
、シアノ、チオール、スルホンアミドおよびオキソからなる群から選択される１つまたは
複数の、例えば、１、２または３つの置換基で置換された複素環を指す。

【0081】

本明細書において、用語「ヒドロカルビル」とは、その骨格が、炭素および水素のみを
含む任意の有機ラジカルを指す。したがって、ヒドロカルビルは、アルキル、シクロアル
キル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アリ
ールアルキル、アリールアルケニル、アルケニルアリール、アリールアルキニル、アルキ
ニルアリールなどを包含する。

【0082】

本明細書において、用語「置換ヒドロカルビル」とは、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－（式
中、Ｒは、水素、アルキルまたは置換アルキルである）、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、
－Ｃ（＝ＮＲ’）－、－Ｃ（＝ＣＲ’_２）－（式中、Ｒ’は、アルキルまたは置換アルキ
ルである）、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ－（また
は－ＮＲ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、－ＮＲ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ－、－Ｓ－
Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－、－
Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－ＮＲ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）
－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－ＮＲ－、－Ｏ－ＮＲ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－ＮＲ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ
－、－Ｏ－ＮＲ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ－、－ＮＲ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－
Ｏ－、－ＮＲ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ－、－Ｏ－ＮＲ－Ｃ（Ｓ）－、－Ｏ－ＮＲ－Ｃ（Ｓ）
－Ｏ－、－Ｏ－ＮＲ－Ｃ（Ｓ）－ＮＲ－、－ＮＲ－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－、－ＮＲ－Ｏ－Ｃ（Ｓ
）－Ｏ－、－ＮＲ－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－ＮＲ－、－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－Ｏ－、
－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－ＮＲ－（または－ＮＲ－Ｃ（Ｓ）－Ｏ－）、－ＮＲ－Ｃ（Ｓ）－、－Ｎ
Ｒ－Ｃ（Ｓ）－ＮＲ－、－Ｓ－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｓ－Ｓ（Ｏ）
_２－ＮＲ－、－ＮＲ－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－、－ＮＲ－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－Ｏ－、－ＮＲ－Ｏ－Ｓ（
Ｏ）－ＮＲ－、－ＮＲ－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｏ－、－ＮＲ－Ｏ
－Ｓ（Ｏ）_２－ＮＲ－、－Ｏ－ＮＲ－Ｓ（Ｏ）－、－Ｏ－ＮＲ－Ｓ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－
ＮＲ－Ｓ（Ｏ）－ＮＲ－、－Ｏ－ＮＲ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－ＮＲ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｎ
Ｒ－、－Ｏ－ＮＲ－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）Ｒ_２－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）Ｒ_２－または
－ＮＲ－Ｐ（Ｏ）Ｒ_２－（式中、各Ｒは独立に、水素、アルキルまたは置換アルキルであ
る）などのようなリンカー／スペーサー部分によってヒドロカルビル部分と結合された、
ヒドロキシ、ヒドロカルビルオキシ、置換ヒドロカルビルオキシ、アルキルチオ、置換ア
ルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、アミノ、アルキルアミノ、置換アルキル
アミノ、カルボキシ、－Ｃ（Ｓ）ＳＲ、－Ｃ（Ｏ）ＳＲ、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ_２（式中、各Ｒ
は独立に、水素、アルキルまたは置換アルキルである）、ニトロ、シアノ、ハロ、－ＳＯ
_３Ｍまたは－ＯＳＯ_３Ｍ（式中、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、Ｚｎ、Ｃａまたはメグルミンであ
る）、グアニジニル、置換グアニジニル、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、ヒドロ
カルビルカルボニル、置換ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル
、置換ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、置換ヒドロ
カルビルカルボニルオキシ、アシル、アシルオキシ、複素環、置換複素環、ヘテロアリー
ル、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニル、置換ヘテロアリールカルボニル、
カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールカルバモ
イル、カルバメート基、ジチオカルバメート基、アロイル、置換アロイル、有機スルホニ
ル、置換有機スルホニル、有機スルフィニル、置換アルキルスルフィニル、アルキルスル
ホニルアミノ、置換アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、置換アリー
ルスルホニルアミノ、スルホンアミド基、スルフリルなどから選択される１つまたは複数
の置換基をさらに保持する上記で言及されたヒドロカルビル基のいずれかを指す。

【0083】

本明細書において、用語「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」とは、基－ＯＨを指す
。

【0084】

本明細書において、用語「オキソ」とは、結合している炭素に二重結合された酸素置換
基を指す。

【0085】

本明細書において、用語「スルフィニル」は、基－Ｓ（Ｏ）－を示す。

【0086】

本明細書において、用語「置換スルフィニル」とは、基－Ｓ（Ｏ）Ｒ^ｔ（式中、Ｒ^ｔは
、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアル
キルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘ
テロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリル（hetereocyclyl）アルキル、アリール、置
換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、へテロアラルキル、置換へテロアラ
ルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである）を示す。

【0087】

本明細書において、用語「スルホニル」とは、基－Ｓ（Ｏ）_２－を示す。

【0088】

本明細書において、用語「置換スルホニル」とは、基－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^ｔ（式中、Ｒ^ｔは
、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアル
キルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘ
テロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリル（hetereocyclyl）アルキル、アリール、置
換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、へテロアラルキル、置換へテロアラ
ルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである）を示す。

【0089】

本明細書において、用語「スルフリル」とは、基－Ｓ（Ｏ）_２－を示す。

【0090】

本発明は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、一般形態^ｍ７Ｇｐｐｐ［
Ｎ_{２’Ｏｍｅ}］_ｎ［Ｎ］_ｍ（式中、^ｍ７Ｇは、Ｎ７－メチル化グアノシンまたは任意のグ
アノシン類似体であり、Ｎは、任意の天然、修飾または非天然ヌクレオシドであり、「ｎ
」は、１～４の任意の整数であり得、「ｍ」は、１～９の整数であり得る）を有する、５
’キャップ付ＲＮＡを合成するための方法および組成物を提供する。本発明の一態様では
、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、式Ｉ：

【化2】

［式中、
Ｂ_１からＢ_１０の各々は独立に、天然、修飾または非天然ヌクレオシド塩基であり、
Ｍは、０または１であり、
Ｌは、０または１であり、
ｑ_１は、１であり、
ｑ_２からｑ_９の各々は独立に、０または１であり、
Ｒ_１は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、Ｏ－アルキル、アミン、アジド、ハロ
ゲン、リンカーまたは検出可能なマーカーであり、
Ｘ_１からＸ_１３の各々は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｙ_１からＹ_１３の各々は独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ_３、アリール、アルキル、Ｏ－アル
キルまたはＯ－アリールであり、
Ｚ_１からＺ_２２の各々は独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ_２、Ｃ（ハロゲン）_２またはＣＨ
（ハロゲン）であり、
Ｒ_４からＲ_１２の各々は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、または検出可能なマーカーである
］
で示される構造を有する。

【0091】

特定の実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、三量体（ｑ^２
－ｑ^９＝０）、四量体（ｑ^３－ｑ^９＝０）、五量体（ｑ^４－ｑ^９＝０）、六量体（ｑ^５－
ｑ^９＝０）、七量体（ｑ^６－ｑ^９＝０）、八量体（ｑ^７－ｑ^９＝０）、九量体（ｑ^８－ｑ
^９＝０）、十量体（ｑ^９＝０）または十一量体である。開始キャップ付オリゴヌクレオチ
ド三量体プライマーのいくつかの例を、以下の表Ｉに提示する：

【0092】

【表1】

【0093】

本発明によって包含されるその他の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、
既知または新規塩基類似体を有するプライマーを含む。開始キャップ付オリゴヌクレオチ
ドプライマーを合成するための方法を以下の実施例において例示する。

【0094】

転写
真核生物では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ
によって行われる。これは、複雑な調節を有する複雑な多サブユニット酵素である。ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの大規模転写を実施するために、研究者らは、一般に、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ
６、Ｋ１－５、Ｋ１Ｅ、Ｋ１ＦまたはＫ１１バクテリオファージに由来する単一サブユニ
ットファージポリメラーゼを使用する。このファミリーのポリメラーゼは、アクセサリー
タンパク質を必要とせず、開始ヌクレオチド配列の最小の制約を有する約１７ヌクレオチ
ドの簡単な最小プロモーター配列を有する。本出願は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７
ＲＮＡＰ）に焦点を当てているが、当業者ならば、本発明は、その他のＲＮＡポリメラ
ーゼを用いても実施できるということは理解するであろう。

【0095】

Ｔ７ ＲＮＡＰは、少なくとも２つのタンパク質状態で存在する。第１のものは、「ア
ボーティブ（abortive）複合体」と呼ばれ、転写開始と関連している。第２のものは、「
伸長複合体」と呼ばれる極めて前進性のコンホメーションである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
は、６つのステップに分けることができる：１）ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
との結合、２）転写の開始、３）アボーティブ転写と呼ばれ、その間に、ポリメラーゼが
ＤＮＡ鋳型および短いアボーティブ転写物を頻繁に放出する非前進性伸長、４）開放複合
体の閉鎖複合体への変換、５）前進性伸長および６）転写終結。転写の際に生成された相
当な量のＲＮＡは、約２～８ヌクレオチド長の短いアボーティブ断片からなる（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ第１９巻：３２４５～３２５３頁（１９８０年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第９巻：３１～４５頁（１９８１年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．第１５巻：８７８３～８７９８頁（１９８７年）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
第２７巻：３９６６～３９７４頁（１９８８年））。約１０～１４塩基の合成後、ＲＮＡ
ポリメラーゼは、アボーティブサイクリングから逃れ、同時にプロモーターＤＮＡとの配
列特異的接触を失い、前進性伸長複合体を形成し、これでは、ＲＮＡ鎖が配列非依存的に
延長される（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１８３巻：１６５～１７７頁（１９８５年）；Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８３巻：３６１４～３６１８頁（
１９８６年）；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．第７巻：３３７１～３３７９頁（１９８７
年））。

【0096】

最も活性なクラスＩＩＩ Ｔ７プロモーターのコンセンサス配列は、転写開始部位の上
流の１７ｂｐの配列および下流の６ｂｐを包含する（Ｃｅｌｌ第１６環：８１５～２５頁
（１９７９年））。最初に転写されるヌクレオチドの位置は、一般に、ＲＮＡの＋１転写
物ヌクレオチドと呼ばれ、２番目に転写されるヌクレオチドは、＋２転写物ヌクレオチド
などと呼ばれる（表２）。転写の際、２つの鎖が融解し、転写バブルを形成し、二本鎖の
ボトム鎖（表２において３’から５’で示されている）は、転写の鋳型である。転写物ヌ
クレオチド＋３およびそれを超えるものについては、鋳型鎖は、主にワトソン－クリック
塩基対形成相互作用によって転写されるヌクレオチドの同一性を規定する。ここで、第１
のＲＮＡ転写物ヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、鋳型の＋１ヌクレオチドと定
義される。表２に示される例では、＋１転写物ヌクレオチドは、Ｇであり、＋１鋳型ヌク
レオチドは、Ｃである。同様に、＋４転写物ヌクレオチドは、Ａであり、＋４鋳型ヌクレ
オチドは、Ｔである。

【0097】

【表2】

【0098】

ＤＮＡポリメラーゼとは異なり、Ｔ７ ＲＮＡＰは、プライマーの不在下でＲＮＡ合成
を開始する。開始における第１のステップは、ｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成と呼ばれ、こ
れでは、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型上の特異的配列を認識し、位置＋１および＋
２の鋳型残基と相補的であるヌクレオチド三リン酸の第１の対を選択し、ジヌクレオチド
を形成するリン酸ジエステル結合の形成を触媒する。開始ヌクレオチドは、ポリメラーゼ
に対して伸長の際に使用されるものよりも低い親和性を有する。Ｋｄ値は、第１の開始Ｎ
ＴＰについて２ｍＭであり、第２については、８０μＭであるのに対し、Ｋｄは、伸長の
際のＮＴＰについてはおよそ５μＭである（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７年）第３
７０巻、２５６～２６８頁）。ｄｅ ｎｏｖｏ合成が、転写の際の律速ステップであると
いうことがわかっている。Ｔ７ ＲＮＡＰは、開始ヌクレオチドとしてＧＴＰに対して強
いバイアスを示す（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２４８巻：２２３５～２２４４頁（１９
７３年））。ゲノム中の１７のＴ７プロモーター中、１５がＧＴＰで（また、１３がｐｐ
ｐＧｐＧで）開始するのに対し、転写伸長の際には明らかなＮＴＰ優先はない（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．第３７０巻：２５６～２６８頁（２００７年））。Ｔ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼは、位置＋１にＡをコードするプロモーターでは不十分にしか開始せず、代わりに、
転写は、主に位置＋２のコードされるＧで開始する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７８
巻：２８１９～２８２３頁（２００３年））。

【0099】

ｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成の際には、開始ヌクレオチドの結合は、塩基スタッキング
、ポリメラーゼ残基、開始ヌクレオチドのグアニン部分の間の特異的相互作用および塩基
相補性相互作用によって生じた自由エネルギーによって主に達成される（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．第３７０巻：２５６～２６８頁（２００７年））。

【0100】

Ｔ７ ＲＮＡＰはまた、短いオリゴヌクレオチドプライマーを用いても開始できること
がわかっている。例えば、Ｔ７ゲノム中の１３のプロモーターは、ｐｐｐＧｐＧを用いて
開始することがわかっている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第３７０巻：２５６～２６８頁（
２００７年））。いくつかのグループが、Ｔ７ ＲＮＡＰが、ジヌクレオチドプライマー
から開始できることを示した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２４巻：５７１６～５７２３
頁（１９８５年））。Ａｘｅｌｒｏｄらは、キャップのないＧｐＡジヌクレオチドは、そ
れぞれ、２’－デオキシシチジンおよび２’－デオキシチミジンである＋１および＋２鋳
型ヌクレオチド（「ＣＴ」鋳型）から開始できることを示した。彼らの反応条件は、２０
０マイクロモル（μＭ）の二量体ならびに１００μＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵ
ＴＰであった。彼らの反応混合物はまた、１００μＭの３’ ｄＡＴＰ、３’ ｄＣＴＰ
３’ ｄＵＴＰまたは５０μＭの３’ ｄＧＴＰを含有していた。彼らは、ＧｐＡ開始
されたＲＮＡのみを観察し、ＧｐＡの混合物で開始したＲＮＡおよびＧＴＰ開始からの５
’三リン酸ＲＮＡを観察しなかった。これは、使用された反応条件によるものである可能
性がある。１００μＭ ＧＴＰは、第１の開始グアノシンに対するＴ７ポリメラーゼの２
ｍＭ Ｋｄよりもかなり低い（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７年）第３７０巻、２５
６～２６８頁）。ＧＴＰは、開始オリゴヌクレオチドを用いる開始について競合するので
、低ＧＴＰ濃度を使用することは、ＧｐＡ開始に好都合であるが、低い転写収率をもたら
す（＜１５０μｇ／反応物１ｍＬであると推定される、最大の算出された収率）。ＡｐＧ
、ＣｐＧ、ＵｐＧまたはＧｐＧを用いる「ＣＴ」鋳型での転写を開始する場合には、彼ら
は、ＲＮＡ転写物の形成およびさらなる鋳型にならない（untemplated）５’ヌクレオチ
ド（それぞれ、Ａ、Ｃ、ＵまたはＧ）を観察した。

【0101】

Ａｘｅｌｒｏｄらはまた、キャップのないＧｐＧジヌクレオチドを使用して、鋳型ヌク
レオチド＋１および＋２は、２’－デオキシシチジンである（「ＣＣ」鋳型）プロモータ
ーでＲＮＡ合成を開始した。彼らは、開始の低忠実度を観察し、３種の異なる転写産物を
観察した。彼らは、「オートラジオグラフの試験は、各トリプレットのあるメンバーは、
正常な（＋１）位置のＧｐＧでの開始に起因し、各トリプレットの第２のメンバーは、異
常な（－１）位置のＧｐＧでの開始に起因し、各トリプレットの第３のメンバーは、正常
位置のグアノシン三リン酸での開始に起因することを示す。したがって、ＧｐＧは、φ１
０プロモーター（「ＣＣ」鋳型）ならびにφ１．１Ａプロモーター（「ＣＴ」鋳型）を用
いた場合、相対的に弱いイニシエーターであり、使用された濃度のグアノシン三リン酸を
用いる正常な開始を防ぐことはできない。」と述べている。彼らは、φ１０プロモーター
（「ＣＣ」鋳型）を用いるＧｐＡジヌクレオチドを用いる開始を観察しなかった。ＣｐＡ
、ＡｐＣおよびＡｐＡは、上記の「ＴＣ」および「ＣＣ」鋳型のいずれかでイニシエータ
ーとして働かなかったが、これは、おそらくは、これらが、位置＋１および＋２の鋳型ヌ
クレオチドとハイブリダイズできないためである。Ａｘｅｌｒｏｄらに記載される方法は
、シーケンシングのための極めて少量の放射活性転写物の生成のために設計されたもので
あり、有用な製薬量のＲＮＡの大規模生成には適していない。より高い濃度（約５ｍＭ）
の開始二量体およびＧＴＰを含むＮＴＰを使用して、ＲＮＡの収率を増大する場合には、
予測される結果は、ＧＴＰが、Ｋｄ（２ｍＭ）に近いＮＴＰ濃度で＋１ヌクレオチドから
の開始について二量体と効率的に競合するので、開始二量体を用いて出発する低い割合の
ＲＮＡであり、ｐｐｐＧを用いて出発する大きな割合のＲＮＡが生成する。

【0102】

Ｐｉｔｕｌｌｅらは、Ｔ７ ＲＮＡＰを用いる転写は、キャップのないオリゴヌクレオ
チド（２マー～６マー）を用いて開始され得ることを示した（Ｇｅｎｅ、第１１２巻：１
０１～１０５頁（１９９２年））。これらのオリゴヌクレオチドは、５’－ＯＨまたは５
’一リン酸のいずれかを有していた。それらはまた、構造ビオチン－ＡｐＧのオリゴヌク
レオチドを用いて転写を開始した。この研究に使用されたオリゴヌクレオチドのすべては
、３’末端Ｇを含有していた。Ｐｉｔｕｌｌｅらはまた、ＲＮＡの５’末端にまたは５’
末端付近に２’－Ｏ－メチル化または２’－デオキシ残基を有するＲＮＡ転写物を生成す
るために、プライマー配列内に２’－Ｏ－メチル残基およびデオキシ残基を含めることが
できることを示した。この刊行物において、任意の開始オリゴヌクレオチドの３’末端グ
アノシン残基が、＋１鋳型ヌクレオチドと対形成したことは明確である。これは、転写さ
れたＲＮＡの５’末端に付加された鋳型にならないヌクレオチドをもたらす。具体的には
、著者は、「Ｙ末端Ｇは別として、鋳型ＤＮＡとの塩基対合は必要ではないので、このセ
グメントにおける配列変動も容易にあり得る」と述べている。したがって、開始オリゴヌ
クレオチドプライマーのうち、位置＋１の鋳型ヌクレオチド「Ｃ」に対してのみ完全に相
補的であり、以降の位置（＋２、＋３など）の任意のヌクレオチドに対して相補的ではな
いものはない。これは、このグループによるその後の方法の論文において確認される（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．第７４巻：９９～１１０頁（１９９７年）、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２５２巻：９～１７頁、（２００４年））。それらの方法
は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーのすべてのヌクレオチドが、位置＋１
および以降の位置の鋳型ヌクレオチドと完全に相補的である本明細書において記載される
方法とは異なる。Ｋｌｅｉｎｅｉｄａｍらは、２’－デオキシまたは２’－Ｏ－メチル糖
で修飾された二量体または三量体を用いる開始によって５’修飾ｔＲＮＡ転写物を作出し
た（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２１巻：１０９７～１１０１頁（
１９９３年）。やはり、著者らは、プライマーの３’－末端グアノシンは、＋１鋳型ヌク
レオチド「Ｃ」で開始することを述べている。

【0103】

Ｉｓｈｉｋａｗａらによる別の研究は、構造^ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、^ｍ７Ｇｐｐｐ^ｍ６Ａ
ｐＧ、^ｍ７ＧｐｐｐＡ_{２’Ｏｍｅ}ｐＧまたは^ｍ７Ｇｐｐｐ^ｍ６Ａ_{２’Ｏｍｅ}ｐＧのキャッ
プ形成開始オリゴヌクレオチド三量体は、鋳型位置＋１および＋２に２’－デオキシシチ
ジン残基を有する鋳型で（「ＣＣ」鋳型；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ第５３号：１２９（２００９年））転写を開始できることを示した。
著者らは、「^ｍ７Ｇ５’ｐｐｐＧを使用するケースから得られた異なる結果は、－１位置
での、^ｍ７Ｇ５’ｐｐｐＮ１ｐＧ中のさらなるアデノシン（Ｎ１）と、Ｔ７プロモーター
中の２’－デオキシチミジンの間の塩基対形成から引き起こされ得る」と述べている。こ
の方法は、開始キャップ付オリゴヌクレオチド三量体の＋１および＋２ヌクレオチドが、
鋳型ヌクレオチドの＋１および＋２と対形成する本発明において記載される方法とは明確
に異なる。Ｉｓｈｉｋａｗａらは、６ｍＭの開始オリゴヌクレオチド三量体、０．９ｍＭ
ＧＴＰおよび７．５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの各々を使用した。著者らは、
転写反応を、ｐｐｐＲＮＡを上回ってキャップ形成ＲＮＡに向けて指示するために、競合
ＧＴＰを上回る、６倍超過剰のキャップ付開始オリゴヌクレオチドプライマーを使用した
、これは転写反応の最も高価なヌクレオチド成分であり、これが、合成されたＲＮＡの総
費用を増大させる。他方、低濃度のＧＴＰ（０．９ｍＭ）は、転写反応におけるＲＮＡの
総収量を制限する（理論的には、１．４ｍｇ／ｍＬ未満に）。それに反して、本明細書に
おいて記載される方法は、効率的なＲＮＡキャップ形成およびＲＮＡのより高い収量（２
～６ｍｇ／ｍＬ）の両方を達成し、ひいては、商業的に有用な費用での高品質ｍＲＮＡの
生成を可能にするために、任意のＮＴＰの濃度を制限することを必要としない。

【0104】

上記で論じられた刊行物のうち、ＲＮＡキャップ形成効率を直接的に測定したものはな
く、そのため、それらの研究におけるキャップ形成の程度は、未知である。

【0105】

重要なことに、上記で記載されたすべての研究において、＋１鋳型ヌクレオチドは、２
’－デオキシシチジンである（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２４巻：５７１６～５７２３
頁（１９８５年）、Ｇｅｎｅ、第１１２巻：１０１～１０５頁（１９９２年）、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第７４巻：９９～１１０頁（１９９７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２５２巻：９～１７頁、（２００４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２１巻：１０９７～１１０１頁（１９９３年）、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ第５３号：１２９（２００９年）
）。

【0106】

オリゴヌクレオチドプライマーを用いる転写開始研究の公開から２０年超において、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ第５３号：１２９（２０
０９）における短い報告の公開まで、５’－対５’逆位キャップ構造を含有する開始オリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いる転写開始の公開された例はなかった。

【0107】

５’キャップ付ＲＮＡを調製するための本明細書において提供される方法および組成物
として、それだけには限らないが、ｍＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体
低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、小カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）が挙げられ
る。これらの方法は、ＤＮＡを鋳型とし、プロモーターによって制御されるＲＮＡの合成
のための、キャップ含有オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオシド５’－三リン酸（
ＮＴＰ）およびＲＮＡポリメラーゼの使用を含む。特定の態様では、方法は、ＲＮＡ合成
、特に、キャップ付ＲＮＡの合成において有用性を提供する開始キャップ付オリゴヌクレ
オチドプライマーを使用する。開始オリゴヌクレオチドプライマーは、天然ＲＮＡ分子の
キャップ０、キャップ１、キャップ２またはＴＭＧ－キャップに似ている構造を有し、Ｔ
ＭＧ－キャップはＲＮＡの５’位置に、キャップ１はその２番目に、キャップ２はその２
番目の隣に２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドユニットを含む。天然のキャップ０構造は、
２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドユニットを有さない。

【0108】

ＲＮＡを調製するための方法および組成物は、それだけには限らないが、分子の５’末
端に、または５’末端の付近に修飾を保持する、ｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、
ｓｃａＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およ
びトランスファー－メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）を含む。これらの方法は、ＤＮ
Ａを鋳型とし、プロモーターによって制御されるＲＮＡの合成のための、キャップを有す
る、または有さない開始オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオシド５’－三リン酸（
ＮＴＰ）およびＲＮＡポリメラーゼの使用を含む。特定の態様では、方法は、ＲＮＡ合成
において、特に、５’修飾されたＲＮＡの合成において有用性を提供する、構造的修飾を
保持する修飾された開始オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。

【0109】

開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、プライマーの３’末端にヌクレオチ
ドユニットを付加することによって、ＤＮＡ鋳型でのＲＮＡのＲＮＡポリメラーゼ媒介性
合成の開始を可能にする開放３’－ＯＨ基を有する。開始キャップ付オリゴヌクレオチド
プライマーは、転写開始部位（すなわち、開始部位は、プロモーター配列の３’末端に近
接して位置し、プロモーター配列と重複し得る）で鋳型ＤＮＡ配列と実質的に相補的であ
る。特定の実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、プライマー
の３’末端から出発して主に一方向で（「フォワード」）ＲＮＡの合成を指示する。特定
の態様および実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮＡ合
成の開始についてあらゆるヌクレオシド５’－三リン酸を打ち負かし、それによって、開
始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーで出発するＲＮＡの生成を最大にし、５’－
三リン酸－ヌクレオシド（通常、ＧＴＰ）で出発するＲＮＡの生成を最小にする。

【0110】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によるｍＲＮＡの製造は、高度に活性なファージＲＮＡポリメラ
ーゼ（Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６およびその他）を利用する。ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ヌク
レオチド配列の前にＤＮＡプラスミド構築物に組み込まれている特定のプロモーターの制
御下で働く。転写プロセスは、通常、プリンヌクレオシド５’－三リン酸（通常、ＧＴＰ
）で出発し、ＲＮＡポリメラーゼが終結配列と遭遇するか、またはＤＮＡ鋳型を完了する
まで継続する。

【0111】

上記で論じたように、ｍＣＡＰジヌクレオチド類似体、キャップ０を含有する^７ｍＧ（
５’）ｐｐｐ（５’）Ｎが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写における開始のために使用されている
（例えば、ＲＮＡ第１巻：９５７～９６７頁（１９９５年））。これらのジヌクレオチド
類似体を使用して生成されるキャップ付ＲＮＡ分子は、キャップ０を含有する。しかし、
合成されたキャップ付ＲＮＡ分子の約５０％のみ、キャップ０の正しい「フォワード」方
向を有する。キャップ０を有するＲＮＡを、キャップ１を有するＲＮＡに変換するために
、（ヌクレオシド－２’－Ｏ）メチルトランスフェラーゼを使用するさらなる酵素反応を
実施しなくてはならない。しかし、この変換は、定量的でない場合もあり、制御すること
は容易ではなく、残存するキャップ０ＲＮＡを、キャップ１ＲＮＡから分離することは困
難である。さらに、転写を開始するためのＮＴＰ（具体的には、ＧＴＰ）からの競合は、
生成される活性キャップ形成ＲＮＡ分子の量をさらに低減する。

【0112】

さらに、リボース上のブロックされた３’および／または２’位置を有する修飾^７ｍＧ
残基を保持する、^７ｍＧ_{３’Ｏｍｅ}（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎおよびその他の関連ＡＲＣ
Ａ類似体などの修飾ジヌクレオチド類似体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の開始のために使用
されている（例えば、ＲＮＡ第７巻：１４８６～１４９５頁（２００１年））。これらの
ＡＲＣＡキャップ類似体は、「フォワード」方向においてのみＲＮＡ合成を指示し、した
がって、５’末端（^７ｍＧ残基の２’および／または３’修飾を有する）に（天然）キャ
ップ０を有するＲＮＡ分子を生成する。このようなＲＮＡは、標準ジヌクレオチド類似体
、^７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎを使用して調製されたＲＮＡと比較して、翻訳系にお
いてより活性である。ＡＲＣＡキャップ０を有するＲＮＡを、ＡＲＣＡキャップ１を有す
るＲＮＡに変換するために、これまでに論じられたジヌクレオチド類似体に必要なものと
同様の（ヌクレオシド－２’－Ｏ）メチルトランスフェラーゼを用いるさらなる酵素反応
を実施しなくてはならない。この方法は、ｍＣＡＰジヌクレオチド類似体について詳細に
述べられたものと同一の不利点を有し、キャップ０を有するＲＮＡの、ＡＲＣＡキャップ
１を有するＲＮＡへの変換は、定量的でない場合もあり、反応は、制御することが容易で
はなく、残存するキャップ０ＲＮＡを、キャップ１ＲＮＡから分離することは困難であり
、転写の開始のためのＮＴＰ（具体的には、ＧＴＰ）からの競合は、生成される活性キャ
ップ形成ＲＮＡ分子の量をさらに低減する。

【0113】

３’末端グアノシン残基を有する短いオリゴヌクレオチドプライマー（２～６マー）が
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の開始のために使用されている（Ｐｉｔｕｌｌｅ，Ｃ．ら、Ｇｅ
ｎｅ、第１１２巻：１０１～１０５頁（１９９２年））。これらのオリゴヌクレオチドプ
ライマーは、修飾および非修飾リボヌクレオシド残基を含有していた（例えば、修飾リボ
ヌクレオシド残基は、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド残基および２’－デオキシリボヌ
クレオシド残基を含んでいた）。より短いオリゴヌクレオチドプライマー（二量体～四量
体）は、転写の開始についてＧＴＰを実質的に打ち負かし、より長いプライマー（五量体
～六量体）は、ＧＴＰと比較して、転写の開始においてかなり効率的ではない。それは、
これらのより長いプライマー（それらが設計されるような）が、開始部位でＤＮＡ鋳型と
の低いパーセントの相補性を有するためであり得る。対照的に、二量体、ＡＧ（設計され
るような）は、開始部位でＤＮＡ鋳型と相補的であった。この節において論じられた、オ
リゴヌクレオチドプライマーを使用して生成されたＲＮＡ分子は、内部２’－Ｏ－メチル
化ヌクレオシドを有するが、５’－キャップ０、キャップ１、キャップ２またはＴＭＧ－
キャップを含有しなかった。キャップ構造を有さないＲＮＡを、キャップ１、キャップ２
またはＴＭＧ－キャップ構造を有するＲＮＡに変換するために、キャップ形成酵素を使用
するさらなる酵素反応を実施しなくてはならない。しかし、このような変換は、上記で記
載されたものと同一の不利点を有する。

【0114】

キャップ構造および内部２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド残基を含有するその他の短い
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、化学的に調製されている（Ｏｈｋｕｂｏら、Ｏｒｇ．Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ第１５巻：４３８６～４３８９頁（２０１３年））。これらの短いキャップ形
成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよび相補的ＤＮＡスプリンターオリゴ
ヌクレオチドを使用して長いＲＮＡの「キャップ除去された」（５’－キャップ構造を有
さない）断片とライゲートした。この化学的－酵素的方法を使用して合成された最終ＲＮ
Ａは、内部２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド残基および５’－ＴＭＧ－キャップ構造の両
方を有していた。しかし、このライゲーションアプローチを使用すると、短いキャップ形
成ＲＮＡ（＜２００マー）のみが調製された。さらに、収率は低かった（１５～３０％）
。Ｔ４ ＤＮＡライゲーション反応を制御し、最適化することは容易ではなく、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を使用する労力を要する分離プロセスおよび残存するキャップの
ないＲＮＡからのキャップ形成ＲＮＡの単離を必要とする。ＰＡＧＥ法による、残存する
キャップのないｍＲＮＡからの、長い（５００～１００００塩基）キャップ形成ｍＲＮＡ
の分離は、実現可能ではない。

【0115】

最後に、ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を開始するために、５’修飾ヌクレオシドまた
は５’修飾モノヌクレオチドまたは５’修飾ジヌクレオチド、通常、グアノシンの誘導体
が使用されている（Ｇｅｎｅ、第１１２巻：１０１～１０５頁（１９９２年）およびＢｉ
ｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１０３７１～３７８頁（１９９９年））。これらのイニシ
エーターヌクレオシドおよびヌクレオチドは、標識または親和性基（例えば、ビオチン）
を保持することができ、ＲＮＡの５’末端に組み込まれる場合には、合成されたＲＮＡの
容易な検出、単離および精製を可能にするであろう。この５’標識された、またはタグが
付けられたＲＮＡは、一部の適用にとって必要であり得る。しかし、この戦略は、キャッ
プ０、キャップ１、キャップ２またはＴＭＧ－キャップ構造を有するｍＲＮＡの調製には
使用されなかった。

【0116】

本発明の特定の態様では、式Ｉの開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの組成
物が提供される。関連する態様では、ＲＮＡが、式Ｉの開始キャップ付オリゴヌクレオチ
ドプライマーを使用して合成される方法である。

【0117】

開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー
本発明の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、開始部位でＤＮＡ鋳型上の
配列と相補的であり得るハイブリダイゼーション配列を有する。本明細書において提供さ
れる方法および組成物において使用するためのプライマーのハイブリダイゼーション配列
の長さは、鋳型ヌクレオチド配列の同一性およびこのプライマーが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転
写の際にＤＮＡ鋳型とハイブリダイズされ、使用される温度を含むいくつかの因子に応じ
て変わる。転写において使用するための開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの
特異的ヌクレオチド配列の所望の長さの決定は、当業者によって、または通例の実験によ
って容易に決定できる。例えば、核酸またはオリゴヌクレオチドの長さは、所望のハイブ
リダイゼーション特異性または選択性に基づいて決定できる。

【0118】

いくつかの実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー（逆位５’－
５’キャップヌクレオチドを含む）のヌクレオチド長は、３～約９の間であり、いくつか
の実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー（キャップを含む）のヌ
クレオチド長は、３～約７の間であり、いくつかの実施形態では、開始キャップ付オリゴ
ヌクレオチドプライマー（キャップを含む）のヌクレオチド長は、３～約５の間であり、
いくつかの実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー（キャップを含
む）のヌクレオチド長は、約３である。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー内
のハイブリダイゼーション配列の長さは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー
の全長以下であり得る。

【0119】

ハイブリダイゼーション配列の存在が、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー
に、所望の方向（すなわち、「フォワード」方向）のみで開始部位でＤＮＡ鋳型の相補的
配列と主にアラインさせる。フォワード方向では、ＲＮＡ転写物は、逆位グアノシン残基
（すなわち、^７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ）で始まる。不正確な「逆」方向を超える
、ＤＮＡ鋳型でのプライマーアラインメントのフォワード方向の優位（図１）は、ハイブ
リダイゼーション複合体の熱力学によって維持される。後者は、開始キャップ付オリゴヌ
クレオチドプライマーのハイブリダイゼーション配列の長さおよびＤＮＡ鋳型とのハイブ
リダイゼーションに関与する塩基の同一性によって決定される。所望のフォワード方向の
ハイブリダイゼーションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の際に、ＤＮＡ鋳型および開始キャッ
プ付オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされ、または使用される温度および
反応条件に応じても変わり得る。

【0120】

本発明の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、標準ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴ
ＰまたはＵＴＰでの開始の有効性と比較して、転写の開始の有効性を増強する。いくつか
の実施形態では、転写の開始は、ＲＮＡの合成が、転写混合物中の任意のＮＴＰからでは
なく、主に、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーから出発する場合に増強され
ると考えられる。増強された転写の開始の効率は、ＲＮＡ転写物のより高い収率をもたら
す。増強された転写の開始の効率は、開始キャップ付プライマーを用いない従来法を用い
るＲＮＡの合成を約１０％、約２０％、約４０％、約６０％、約８０％、約９０％、約１
００％、約１５０％、約２００％または約５００％上回って増大され得る。特定の実施形
態では、「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」は、転写の開始について任意
のＮＴＰ（ＧＴＰを含む）を打ち負かす。当業者ならば、開始キャップ付オリゴヌクレオ
チドプライマーの基質活性および有効性のレベルを容易に決定できる。基質有効性を決定
する方法の一例は、実施例１３）に例示される。特定の実施形態では、開始は、ＮＴＰで
はなくキャップ付オリゴヌクレオチドプライマーから起こり、これは、より高いレベルの
転写されたｍＲＮＡのキャップ形成をもたらす。

【0121】

一部の態様では、ＲＮＡが、置換または修飾を有する開始キャップ付オリゴヌクレオチ
ドプライマーを利用して合成される方法が提供される。一部の態様では、開始キャップ付
オリゴヌクレオチドプライマーの置換および修飾は、ＲＮＡの合成を実質的に損なわない
。通例の試験合成を実施して、修飾された開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー
を用いて望ましい合成結果を得ることができるか否かを調べることができる。当業者は、
このような通例の実験を実施して、望ましい結果を得ることができるか否かを調べること
ができる。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの置換または修飾は、例えば、
１つまたは複数の修飾されたヌクレオシド塩基、１つまたは複数の修飾された糖、１つま
たは複数の修飾されたヌクレオチド間連結および／または１つまたは複数の修飾された三
リン酸橋を含む。

【0122】

本明細書において提供される方法および組成物の１つまたは複数の修飾基を含み得る、
修飾された開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、ＮＴＰの開放３’－ＯＨ基
への組込みによって、ＤＮＡ鋳型上でＲＮＡポリメラーゼによって伸長され得る。開始キ
ャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、天然ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオシド、修飾
されたヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含み得る。開始キャップ付オリゴヌクレ
オチドプライマーは、天然ヌクレオチド間ホスホジエステル連結またはその修飾またはそ
れらの組合せを含有し得る。

【0123】

一実施形態では、修飾基は、酵素反応媒体の温度が上がるにつれ、増大する速度で、修
飾された開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーから解離する、熱的に不安定な基
であり得る。オリゴヌクレオチドおよびＮＴＰの熱的に不安定な基の例は、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第３６巻：ｅ１３１（２００８年）、Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｓｙ
ｍｐ．Ｓｅｒ．、第１０巻：２５９～２６３頁（２００８年）およびＡｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第８１巻：４９５５～４９６２頁（２００９年）に記載されて
いる。

【0124】

一部の態様では、本明細書において開示されるような修飾を有し得る、少なくとも１種
のまたはより多くのＮＴＰが、転写反応に付加される場合にＲＮＡが合成される方法が提
供される。一部の態様では、少なくとも１種のＮＴＰの修飾は、ＲＮＡポリメラーゼ媒介
性のＲＮＡの合成を実質的に損なわない。ＮＴＰの修飾は、例えば、１種または複数の修
飾されたヌクレオシド塩基、１種または複数の修飾された糖、１種または複数の修飾され
た５’－三リン酸を含み得る。修飾されたＮＴＰは、開始キャップ付オリゴヌクレオチド
プライマーの３’末端に組み込まれ得、転写を遮断せず、プライマーのさらなる伸長を支
持する。

【0125】

別の実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの修飾基は、検出可
能な標識または検出可能なマーカーであり得る。したがって、転写後、検出可能な標識ま
たはマーカーを含有する標的ＲＮＡを、大きさ、質量、色および／または親和性捕獲によ
って同定できる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識またはマーカーは、蛍光色素
であり、親和性捕獲標識は、ビオチンである。特定の実施形態では、転写反応の１つまた
は複数の成分（開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはＮＴＰ）を
、検出可能な標識またはマーカーを用いて標識できる。したがって、転写後、ＲＮＡ分子
を、例えば、大きさ、質量、親和性捕獲または色によって同定できる。いくつかの実施形
態では、検出可能な標識は、蛍光色素であり、親和性捕獲標識は、ビオチンである。

【0126】

本発明の「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」を合成するために標準化学
的および酵素的合成方法を利用でき、実施例の節において本明細書において開示される。

【0127】

キット
転写を実施するための「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」を含むキット
も考慮される。例えば、キットは、一般的なＲＮＡ（例えば、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ）の合
成のためのすべての転写試薬を含有し得る。より詳しくは、キットは、「開始キャップ付
オリゴヌクレオチドプライマー」、転写のための印がつけられた容器、ＲＮＡ合成を実施
するための使用説明書および１種もしくは複数の修飾されたもしくは非修飾開始キャップ
付オリゴヌクレオチドプライマー、１種もしくは複数の非修飾ＮＴＰ、１種もしくは複数
の修飾されたＮＴＰ（例えば、プソイドウリジン５’－三リン酸）、ＲＮＡポリメラーゼ
、その他の酵素、反応バッファー、マグネシウムおよびＤＮＡ鋳型からなる群から選択さ
れる１種または複数の試薬を含有し得る。

【0128】

本発明の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、種々の開始ヌクレオシド、
ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの使用またはｍＣＡＰおよびＡＲＣＡなどのキャ
ップ０構造を含有するポリホスフェートジヌクレオチド誘導体の使用を含む、現在の方法
および組成物を上回る相当な利点を有する。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、既存の転写系および試薬と適合可能であり、さらなる酵素または試薬は必要ではな
い。さらに、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの使用は、いくつかの非酵素
的および酵素的ステップ（キャップ形成および２’－Ｏ－メチル化など）を不要なものに
し、ひいては、ＲＮＡ合成のプロセスの複雑性および費用を低減する。

【0129】

本明細書において記載される例示的方法は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ媒介性転写反応
に関し、転写反応における使用のための当技術分野で公知のいくつかのその他のＲＮＡポ
リメラーゼを、本発明の組成物および方法を用いて利用できる。利用することができる天
然または突然変異した変異体を含むその他の酵素として、例えば、ＳＰ６およびＴ３ Ｒ
ＮＡポリメラーゼおよび熱安定性ＲＮＡポリメラーゼを含むその他の供給源由来のＲＮＡ
ポリメラーゼが挙げられる。

【0130】

一部の核酸複製および増幅方法は、プロセスの一部として転写を含み得る。これらの方
法の中に、当技術分野で公知の転写媒介性増幅（ＴＭＡ）ならびに核酸配列ベースの増幅
（ＮＡＳＢＡ）、ＤＮＡおよびＲＮＡシーケンシングならびにその他の核酸延長反応があ
る。当業者ならば、将来開発される転写反応の変法を含むその他の方法を転写方法の代わ
りに、転写方法と一緒に使用してもよいということは理解するであろう。

【0131】

治療的使用
本発明はまた、医薬組成物中の治療薬として使用するための、開始キャップ付オリゴヌ
クレオチドプライマーを含有するＲＮＡを細胞中に導入して、細胞の医学的状態を治療す
るための、または開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するＲＮＡを、そ
れらのＲＮＡを利用する細胞中に導入して、宿主細胞に対して治療的影響を有し得るタン
パク質を生成するための、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するｍＲ
ＮＡの生成を考慮する。

【0132】

開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するＲＮＡを利用する状態を治療
するための１つの方法は、式Ｉの開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有す
るＲＮＡまたはこのようなＲＮＡを含む組成物を、その症状／総体症状が重症度において
低減され得る、または排除され得る状態を有する、または有すると疑われる対象に投与す
るステップを含む。

【0133】

式Ｉの「化合物」の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するＲＮＡは
、４ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容され
る塩に製剤化される場合に、薬学的に許容される担体単独を用いた治療されない個体より
も、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％また
はそれ以上に症状および／または総体症状の低減をもたらすのに有効である。

【0134】

特定の状態を治療するために、注射または当業者に公知のその他の適当な経路による投
与のために、医薬組成物が製剤化され得る。非経口投与用の注射用物質組成物は、通常、
滅菌生理食塩水などの適した溶液および／または薬剤担体中に活性化合物を含有する。組
成物はまた、脂質またはリン脂質中の、リポソーム懸濁液中の、または水性エマルジョン
中の懸濁液として、製剤化され得る。

【0135】

種々の組成物および／または製剤を調製するための方法は、当業者に公知であり、Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５年）を参照のこと。投与されるべき組成物は
、標的細胞または組織中の所望のタンパク質の発現を増大するために、製薬上安全な、有
効な量で一定量の選択された化合物を含有する。

【0136】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の化合物を含
有する、上記のように、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、０．１％超を含有する
、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大約１０％を含有する、いくつかの実施形
態では、医薬組成物は、最大約５％を含有する、いくつかの実施形態では、医薬組成物は
、最大約１％（ｗ／ｖ）の化合物を含有する。適した濃度の選択は、所望の用量、頻度お
よび活性薬剤の送達の方法などの因子に応じて変わる。

【0137】

哺乳動物またはヒトなどの対象の治療のために、対象の体重および全体的な健康、治療
される状態、症状の重症度などといった因子に基づいて投与量が決定される。投与量およ
び濃度は、あらゆる望ましくない副作用を避けながら、所望の利益をもたらすように決定
される。対象化合物の通常の投与量は、ヒト患者のために約０．０００５～５００ｍｇ／
日の範囲、いくつかの実施形態では、約１～１００ｍｇ／日の間の範囲である。例えば、
より高い用法は、例えば、５０～１００、７５～１００または５０～７５ｍｇ／日を含み
、より低い用法は、例えば、１～５０、２５～５０または１～２５ｍｇ／日を含む。

【0138】

本発明の種々の態様を、以下の限定されない例によって例示する。実施例は、例示目的
であって、本発明のいかなる実施に対しても制限ではない。本発明の趣旨および範囲から
逸脱することなく変法および改変を行うことができるということは理解されよう。当業者
ならば、本明細書において記載される試薬および成分を合成する、または商業的に入手す
る方法を容易に承知する。

【実施例0139】

グアノシン５’－二リン酸からの７－メチルグアノシン５－二リン酸（ｐｐ^７ｍＧ）の調
製（図１）
４０．０ｍＬの水中のグアノシン５’－二リン酸（２．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、酢
酸を添加して、溶液のｐＨを４．０に調整する。この混合物に、硫酸ジメチル（４．０ｍ
Ｌ）を、３０分間にわたって滴加し、反応混合物を、０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して
反応混合物のｐＨを約４．０で維持しながら、室温で４時間撹拌する。４時間後、反応混
合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５０ｍＬ）を用いて抽出して、未反応の硫酸ジメチルを除去す
る。水層を、水を用いて５００ｍＬに希釈し、１Ｍ ＴＥＡＢを用いてｐＨ６．５に調整
し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（３×５０ｃｍ）にロードする。０～１Ｍ ＴＥ
ＡＢ、ｐＨ７．５の直線勾配（３Ｌ）を使用して生成物を溶出する。純粋なｐｐ^７ｍＧ（
トリエチルアンモニウム塩）を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥する
と、微細な白色粉末が得られる（収率：８０％）。同様の手順は、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ第１７巻：５２９５～５２９９頁（２００７年）に開示
されている。

【実施例0140】

ｐｐ^７ｍＧからの７－メチルグアノシン５’－二リン酸イミダゾリド（Ｉｍ－ｐｐ^７ｍＧ
）の調製
（図２）
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中で、ｐｐ^７ｍＧのトリエチルアンモニウム塩（０．４ｍｍｏ
ｌ）を、イミダゾール（４ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２ｍｍｏｌ）および２
、２’－ジピリジルジスルフィド（２ｍｍｏｌ）と８時間反応させる。反応混合物を、２
５０ｍＬの０．２Ｍ過塩素酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れることによって、粗Ｉｍ－ｐｐ
^７ｍＧが沈殿する。混合物を－２０℃に冷却し、得られた沈殿を遠心分離によって回収し
、アセトン（３×５０ｍＬ）を用いて洗浄し、高真空下で乾燥させる。Ｉｍ－ｐｐ^７ｍＧ
の単離収率は、およそ１００％である。同様の手順は、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ第２４巻：１１３１～１１３４
頁（２００５年）およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第６４巻：５８３６～５８４０頁（１９
９９年）に開示されている。