特開 2022-111231 メッセンジャーＲＮＡを送達するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022111231

(43)【公開日】2022-07-29

(54)【発明の名称】メッセンジャーＲＮＡを送達するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20220722BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20220722BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20220722BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20220722BHJP

   A61K 47/14 20060101ALI20220722BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20220722BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20220722BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20220722BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220722BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220722BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7105

A61K31/573

A61K9/127

A61K9/51

A61K47/14

A61K47/18

A61K47/24

A61K47/28

A61P43/00 105

A61P37/02

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022092262

(22)【出願日】2022-06-07

(62)【分割の表示】P 2018567951の分割

【原出願日】2017-06-30

(31)【優先権主張番号】62/357,189

(32)【優先日】2016-06-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/375,292

(32)【優先日】2016-08-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】513146871

【氏名又は名称】アルブータス・バイオファーマー・コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・ジェイ・エイブラムス

(72)【発明者】

【氏名】ジェームズ・ヘイズ

(72)【発明者】

【氏名】アダム・ジャッジ

(72)【発明者】

【氏名】キュー・モン・ラム

(72)【発明者】

【氏名】ローン・ラルフ・パーマー

(72)【発明者】

【氏名】スティーヴン・ピー・リード

(72)【発明者】

【氏名】エドワード・ディー・ヤウォルスキー

(57)【要約】

【課題】本発明が解決しようとする課題は、機能性タンパク質の完全なまたは部分的な欠如によって引き起こされる疾患に罹患しているヒト内で機能的形態の該タンパク質を発現させるための組成物及び方法を提供することである。
【解決手段】本発明は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、（ｃ）コルチコステロイド、及び（ｄ）核酸を含み、前記核酸及び前記コルチコステロイドが内部に封入されている脂質ナノ粒子に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂質ナノ粒子であって、
（ａ）カチオン性脂質、
（ｂ）非カチオン性脂質、
（ｃ）コルチコステロイド、及び
（ｄ）核酸を含み、前記核酸及び前記コルチコステロイドが前記脂質ナノ粒子内に封入される、前記脂質ナノ粒子。

【請求項2】

請求項１に記載の脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子の集団。

【請求項3】

脂質ナノ粒子の集団であって、
（ａ）各々がカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びコルチコステロイドを含む脂質ナノ粒子の第一の集団、ならびに
（ｂ）各々がカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び核酸を含む脂質ナノ粒子の第二の集団
から選択される脂質ナノ粒子の少なくとも１つの集団を含み、
脂質ナノ粒子の前記第一の集団は核酸を含まず、脂質ナノ粒子の前記第二の集団はコルチコステロイドを含まない、前記集団。

【請求項4】

請求項３に記載の脂質ナノ粒子の前記第一及び第二の集団を含む脂質ナノ粒子の集団。

【請求項5】

前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１～４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項6】

前記コルチコステロイドが、３．０より大きいｌｏｇＰを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項7】

前記コルチコステロイドがグルココルチコイドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項8】

前記コルチコステロイドが鉱質コルチコイドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項9】

前記コルチコステロイドがクロベタゾールである、請求項１～６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項10】

前記非カチオン性脂質が、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート及びリン脂質から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項11】

さらにコレステロールを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項12】

前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはそれらの混合物を含む、請求項１０及び１１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項13】

前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ－リン脂質コンジュゲート、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０及び１１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項14】

前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートである、請求項１３に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項15】

前記ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートが、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ_１０）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ_１２）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ_１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ_１６）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ_１８）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項16】

脂質：核酸の質量比が、約９：１～約２０：１である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項17】

前記ｍＲＮＡが化学的に修飾される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項18】

高電子密度のコアを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項19】

高電子密度のコアを含み、前記ｍＲＮＡが、前記高電子密度のコア内に位置する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項20】

多様な請求項１に記載の脂質ナノ粒子を含む脂質粒子の集団。

【請求項21】

リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項22】

少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び脂質粒子内に封入されたｍＲＮＡを有する請求項１～２１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団であって、前記脂質粒子が、リン脂質を０．５モルパーセント未満含むことを条件とする、前記脂質ナノ粒子またはその集団。

【請求項23】

請求項１～２２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項24】

タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞に導入する方法であって、前記ｍＲＮＡが前記細胞に導入され、そこで発現して前記タンパク質を生成する条件下、前記細胞を請求項５～２３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団と接触させることを含む、前記方法。

【請求項25】

ヒトにおける、前記ヒトのタンパク質の発現障害によって引き起こされる疾患に関連する１つ以上の症状を治療及び／または改善する方法であって、治療有効量の請求項５～２３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子またはその集団を前記ヒトに投与することを含む前記方法であり、前記脂質粒子内に封入された前記ｍＲＮＡが前記タンパク質をコードする、前記方法。

【請求項26】

多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤であって、各脂質ナノ粒子が、
（ａ）カチオン性脂質、
（ｂ）非カチオン性脂質、及び
（ｃ）前記脂質粒子内に封入されるｍＲＮＡを含み、
リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する、前記脂質ナノ粒子製剤。

【請求項27】

脂質ナノ粒子の製造方法であって、
（ａ）カチオン性脂質、
（ｂ）非カチオン性脂質、及び
（ｃ）精製されたｍＲＮＡ
を混合して脂質ナノ粒子を形成することを含む前記方法であり、前記ｍＲＮＡは、前記脂質ナノ粒子内に封入され、前記脂質ナノ粒子は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する、前記方法。

【請求項28】

多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤の製造方法であって、
（ａ）カチオン性脂質、
（ｂ）非カチオン性脂質、及び
（ｃ）精製されたｍＲＮＡ
を混合して多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成するステップを含む前記方法であり、前記ｍＲＮＡは、前記脂質ナノ粒子製剤の脂質粒子内に封入され、前記脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する、前記方法。

【請求項29】

（ａ）カチオン性脂質、
（ｂ）非カチオン性脂質、及び
（ｃ）精製されたｍＲＮＡ
を混合して多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成するステップを含む工程により製造される、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤であって、前記ｍＲＮＡは、前記脂質ナノ粒子製剤の脂質粒子内に封入され、前記脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する、前記脂質ナノ粒子製剤。

【請求項30】

（ａ）カチオン性脂質、
（ｂ）少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び
（ｃ）脂質粒子内に封入されるｍＲＮＡ
を含む脂質ナノ粒子であって、前記脂質粒子は、リン脂質を０．５モルパーセント未満含むことを条件とする、前記脂質ナノ粒子。

【請求項31】

脂質ナノ粒子の集団であって、前記集団の各脂質ナノ粒子が、
（ａ）カチオン性脂質、
（ｂ）少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び
（ｃ）前記脂質ナノ粒子内に封入されるｍＲＮＡ
を含み、前記脂質ナノ粒子は、リン脂質を０．５モルパーセント未満含むことを条件とする、前記集団。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１６年６月３０日に出願された米国特許出願第６２／３５７，１８９号、及び２０１６年８月１５日に出願された米国特許出願第６２／３７５，２９２号の優先権の利益を主張する。当該出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ヒトのいくつかの疾患は、機能性タンパク質が通常存在し、これが活性である細胞型における該タンパク質の欠如またはその機能障害によって引き起こされる。該機能性タンパク質は、例えば、そのコード遺伝子の転写不活性により、または、該タンパク質を完全にもしくは部分的に機能しないようにするコード遺伝子の変異の存在により、完全にまたは部分的に欠ける場合がある。

【0003】

タンパク質の完全なまたは部分的な不活性化によって引き起こされるヒトの疾患の例としては、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（Ｘ－ＳＣＩＤ）、及び副腎白質ジストロフィー（Ｘ－ＡＬＤ）が挙げられる。Ｘ－ＳＣＩＤは、免疫系内のＢ細胞及びＴ細胞の発生ならびに成熟に関与するいくつかのインターロイキンに対する受容体の成分である共通ガンマ鎖タンパク質をコードする遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる。Ｘ－ＡＬＤは、ＡＢＣＤ１と呼ばれるペルオキシソーム膜輸送タンパク質遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる。Ｘ－ＡＬＤに罹患した個体は、体全体の組織中に極めて高レベルの長鎖脂肪酸を有し、精神障害または死につながり得る様々な症状を引き起こす。

【0004】

遺伝子治療を用いて、機能性タンパク質が通常存在し、これが活性である細胞型における該タンパク質の欠如またはその機能障害によって引き起こされるいくつかの疾患を治療する試みがなされている。遺伝子治療は通常、影響を受けたタンパク質の機能的形態をコードする遺伝子を含むベクターを、罹患したヒトに導入すること及び該機能性タンパク質を発現させて該疾患を治療することを含む。これまでのところ、遺伝子治療はある程度の成功を収めている。

【0005】

従って、機能性タンパク質の完全なまたは部分的な欠如によって引き起こされる疾患に罹患しているヒト内で機能的形態の該タンパク質を発現させるための組成物及び方法が継続的に必要であり、当該治療に対する免疫反応をそれほど誘発しない方法及び組成物による核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の送達が必要である。

【発明の概要】

【0006】

上記に基づき、本発明は、ある特定の実施形態において、例えば、生細胞（例えば、ヒト体内の細胞）で１つ以上のｍＲＮＡ分子を発現させるため、核酸を送達するのに使用することができる組成物及び方法を提供する。該ｍＲＮＡ分子は、生細胞内で発現される１つ以上のポリペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、罹患生物（例えば、ヒト等の哺乳類）内で発現され、該ポリペプチドの発現が当該疾患の１つ以上の症状を改善する。本発明のある特定の実施形態の組成物及び方法は、ヒト体内での機能性ポリペプチドの欠如またはレベルの低下によって引き起こされるヒトの疾患の治療に特に有用である。

【0007】

１つの態様において、本発明は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、（ｃ）コルチコステロイド、及び（ｄ）核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供し、この場合、該核酸及び該コルチコステロイドは、該脂質ナノ粒子内に封入される。本発明のある特定の実施形態は、該脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子の集団を提供する。本発明のある特定の実施形態は、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質粒子の集団を提供する。ある特定の実施形態では、該核酸は、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。

【0008】

本発明のある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子の集団を提供し、これは、（ａ）各々がカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びコルチコステロイドを含む脂質ナノ粒子の第一の集団、ならびに（ｂ）各々がカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び核酸を含む脂質ナノ粒子の第二の集団から選択される脂質ナノ粒子の少なくとも１つの集団を含み、この場合、脂質ナノ粒子の該第一の集団は核酸を含まず、脂質ナノ粒子の該第二の集団はコルチコステロイドを含まない。本発明のある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子の該第一及び第二の集団を含む脂質ナノ粒子の集団を提供する。ある特定の実施形態では、該核酸は、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。

【0009】

本発明のある特定の実施形態は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び（ｃ）当該脂質粒子内に封入されるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。ただし、該脂質粒子は、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。

【0010】

ある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子の集団を提供し、この場合、該集団の各脂質ナノ粒子は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び（ｃ）当該脂質ナノ粒子内に封入されるｍＲＮＡを含む。ただし、該脂質ナノ粒子は、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、ＬＮＰの該集団は、コルチコステロイドを含むＬＮＰを含む。ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。

【0011】

本発明のある特定の実施形態は、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を提供し、この場合、各脂質ナノ粒子は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、及び（ｃ）当該脂質粒子内に封入されるｍＲＮＡを含み、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。

【0012】

本発明のある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子の製造方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、及び（ｃ）精製されたｍＲＮＡを混合して脂質ナノ粒子を形成することを含み、この場合、該ｍＲＮＡは、当該脂質ナノ粒子内に封入され、該脂質ナノ粒子は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。

【0013】

本発明のある特定の実施形態は、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤の製造方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、及び（ｃ）精製されたｍＲＮＡを混合して多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成するステップを含み、この場合、該ｍＲＮＡは、当該脂質ナノ粒子製剤の脂質粒子内に封入され、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。

【0014】

本発明のある特定の実施形態は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、及び（ｃ）精製されたｍＲＮＡを混合して多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成するステップを含む工程により製造される、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を提供し、この場合、該ｍＲＮＡは、当該脂質ナノ粒子製剤の脂質粒子内に封入され、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。

【0015】

従って、１つの態様において、本発明は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び当該脂質粒子内に封入されるｍＲＮＡ分子を含む脂質粒子を提供する。

【0016】

本発明はまた、核酸－脂質粒子を提供し、これらは各々、（ａ）カチオン性脂質、ＰＥＧ－脂質、及びリン脂質を含む脂質粒子、ならびに（ｂ）ｍＲＮＡ分子を含み、該ｍＲＮＡ分子は、該脂質粒子内に封入される。該脂質粒子は、任意にコレステロールを含むことができる。該ｍＲＮＡは、該脂質粒子内に完全に封入されても部分的に封入されてもよい。いくつかの実施形態では、該核酸－脂質粒子は、脂質：ｍＲＮＡ質量比が約９：１～約２０：１である。特定の実施形態では、該核酸－脂質粒子は、脂質：ｍＲＮＡ質量比が約１２：１である。該ｍＲＮＡは、例えば、ウリジンの代わりにプソイドウリジンを組み込むこと、及び／またはシチジンの代わりに５－メチルシチジンを組み込むことにより、化学的に修飾することができる。本発明はまた、本発明の核酸－脂質粒子を含む医薬組成物を提供する。通常、該医薬組成物は、賦形剤を含む。

【0017】

別の態様において、本発明は、タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞に導入する方法を提供する。該方法は各々、該ｍＲＮＡが該細胞に導入され、そこで発現して該タンパク質を生成する条件下、該細胞を本発明の核酸－脂質粒子（通常、多様な本発明の核酸－脂質粒子）と接触させるステップを含む。該方法は、インビボでもインビトロでも実施することができる。例えば、該細胞は、生体内（例えば、ヒト体内等の哺乳類の体内）にあり、該核酸－脂質粒子は、注入によって該生体内に導入することができる。

【0018】

さらなる態様において、本発明は、ヒトにおける、該ヒトのタンパク質の発現障害によって引き起こされる疾患に関連する１つ以上の症状を治療及び／または改善する方法を提供する。本発明の本態様の方法は、治療有効量の本発明の核酸－脂質粒子（通常、多様な本発明の核酸－脂質粒子）を該ヒトに投与するステップを含み、この場合、該核酸－脂質粒子内に封入されたｍＲＮＡが該タンパク質をコードする。コードされたタンパク質は、該ヒト内で発現され、それにより、該疾患の少なくとも１つの症状が改善される。

【0019】

１つの実施形態では、本発明の粒子に使用される脂質粒子における脂質の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に対する比は、約１３：１である。

【0020】

本発明の方法及び組成物は、例えば、少なくとも部分的に、ヒト体内の細胞、組織、及び／または器官におけるポリペプチドの欠如によって、もしくはポリペプチドのレベルの低下によって、またはポリペプチドの非機能的な（もしくは部分的に機能的な、または異常に機能的な）形態の発現によって引き起こされる任意の疾患を治療するために使用することができる。

【0021】

本発明の他の目的、特徴、及び利益は、以下の詳細な説明及び図面から当業者には明らかになろう。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本明細書に記載の核酸－脂質粒子、方法、及び製剤処方は、ヒト等の哺乳類生物におけるタンパク質の発現のための重要な新たな組成物及び方法を有利に提供する。本発明の実施形態は、例えば、１日１回、１週間に１回、もしくは数週間に１回（例えば、２週、３週、４週、５週、もしくは６週間に１回）、もしくは１ヶ月に１回、または１年に１回施すことができる。脂質粒子内にｍＲＮＡを封入することは、１つ以上の利点、例えば、血流中のヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護すること、標的組織にｍＲＮＡを優先的に蓄積させること、及び当該ｍＲＮＡがコードされたタンパク質を発現することができる細胞質へのｍＲＮＡの導入方法を提供すること等を与える。

【0023】

１つの態様において、本発明は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、（ｃ）コルチコステロイド、及び（ｄ）核酸を含む脂質ナノ粒子を提供し、この場合、該核酸及び該コルチコステロイドは、該脂質ナノ粒子内に封入される。本発明のある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子を含む当該脂質ナノ粒子の集団を提供する。本発明のある特定の実施形態は、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質粒子の集団を提供する。ある特定の実施形態では、該核酸は、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。

【0024】

本発明のある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子の集団を提供し、これは、（ａ）各々がカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びコルチコステロイドを含む脂質ナノ粒子の第一の集団、ならびに（ｂ）各々がカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び核酸を含む脂質ナノ粒子の第二の集団から選択される脂質ナノ粒子の少なくとも１つの集団を含み、この場合、脂質ナノ粒子の該第一の集団は核酸を含まず、脂質ナノ粒子の該第二の集団はコルチコステロイドを含まない。本発明のある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子の該第一及び第二の集団を含む脂質ナノ粒子の集団を提供する。ある特定の実施形態では、該核酸は、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。

【0025】

本発明のある特定の実施形態は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び（ｃ）当該脂質粒子内に封入されるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。ただし、該脂質粒子はリン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。

【0026】

ある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子の集団を提供し、この場合、該集団の各脂質ナノ粒子は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び（ｃ）当該脂質ナノ粒子内に封入されるｍＲＮＡを含む。ただし、該脂質ナノ粒子は、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、ＬＮＰの該集団は、コルチコステロイドを含むＬＮＰを含む。ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。

【0027】

本発明のある特定の実施形態は、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を提供し、この場合、各脂質ナノ粒子は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、及び（ｃ）当該脂質粒子内に封入されるｍＲＮＡを含み、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、精製されたｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３．５モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．０５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。ある特定の実施形態では、該製剤中の実質的にすべての脂質ナノ粒子は、該脂質ナノ粒子内に封入されたコルチコステロイドを含む。例えば、ある特定の実施形態では、該製剤中の脂質ナノ粒子の少なくとも約８０％は、さらに、該脂質ナノ粒子内に封入されたコルチコステロイドを含む。ある特定の実施形態では、該製剤中の脂質ナノ粒子の少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、さらに、該脂質ナノ粒子内に封入されたコルチコステロイドを含む。

【0028】

本発明のある特定の実施形態は、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を提供し、この場合、各脂質ナノ粒子は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、及び（ｃ）当該脂質粒子内に封入されるｍＲＮＡを含み、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有し、該非カチオン性脂質は、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートである。ただし、該脂質ナノ粒子は、リン脂質を０．５モルパーセント未満含み、該製剤中の脂質ナノ粒子の少なくとも９０％は、さらに、該脂質ナノ粒子内に封入されたコルチコステロイドを含む。

【0029】

本発明のある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子製剤を提供し、これは、
（ａ）各々がカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び当該脂質ナノ粒子内に封入されるコルチコステロイドを含む脂質ナノ粒子の第一の集団、ならびに
（ｂ）各々がカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び当該脂質ナノ粒子内に封入されるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子の第二の集団を含み、この場合、脂質ナノ粒子の該第一の集団はｍＲＮＡを含まず、脂質ナノ粒子の該第二の集団はコルチコステロイドを含まず、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。

【0030】

本発明のある特定の実施形態は、脂質ナノ粒子の製造方法を提供し、これは、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、及び（ｃ）精製されたｍＲＮＡを混合して脂質ナノ粒子製剤を形成することを含み、この場合、該ｍＲＮＡは、当該脂質ナノ粒子内に封入され、該脂質ナノ粒子は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。ある特定の実施形態では、該方法は、さらに、ｍＲＮＡを精製して、該精製されたｍＲＮＡを提供することを含む。

【0031】

本発明のある特定の実施形態は、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤の製造方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、及び（ｃ）精製されたｍＲＮＡを混合して多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成するステップを含み、この場合、該ｍＲＮＡは、当該脂質ナノ粒子製剤の脂質粒子内に封入され、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。ある特定の実施形態では、該方法は、さらに、ｍＲＮＡを精製して（例えば、ＨＰＬＣで）、該精製されたｍＲＮＡを提供することを含む。

【0032】

本発明のある特定の実施形態は、（ａ）カチオン性脂質、（ｂ）非カチオン性脂質、及び（ｃ）精製されたｍＲＮＡを混合して多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成するステップを含む工程により製造される、多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を提供し、この場合、該ｍＲＮＡは、当該脂質ナノ粒子製剤の脂質粒子内に封入され、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、コルチコステロイドを含む。ある特定の実施形態では、該方法は、さらに、ｍＲＮＡを精製して（例えば、ＨＰＬＣで）、該精製されたｍＲＮＡを提供することを含む。

【0033】

ある特定の実施形態では、該核酸はｍＲＮＡである。

【0034】

ある特定の実施形態では、該核酸は、精製されたｍＲＮＡである。

【0035】

ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡである。

【0036】

ある特定の実施形態では、該コルチコステロイドは、ｌｏｇＰが３．０より大きい。

【0037】

ある特定の実施形態では、製剤／集団中の実質的にすべての脂質ナノ粒子は、該脂質ナノ粒子内に封入されたコルチコステロイドを含む。例えば、ある特定の実施形態では、製剤／集団中の脂質ナノ粒子の少なくとも約８０％は、さらに、該脂質ナノ粒子内に封入されたコルチコステロイドを含む。ある特定の実施形態では、該製剤／集団中の脂質ナノ粒子の少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、さらに、該脂質ナノ粒子内に封入されたコルチコステロイドを含む。

【0038】

ある特定の実施形態では、該コルチコステロイドは、グルココルチコイドである。

【0039】

ある特定の実施形態では、該コルチコステロイドは、鉱質コルチコイドである。

【0040】

ある特定の実施形態では、該コルチコステロイドは、クロベタゾールである。

【0041】

ある特定の実施形態では、該グルココルチコイドは、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、アルドステロン、フルチカゾン、クロベタゾン、クロベタゾール、及びロテプレドノール、ならびにそれらの医薬的に許容される塩、ならびにそれらの混合物から選択される。

【0042】

ある特定の実施形態では、該非カチオン性脂質は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート及びリン脂質から選択される。

【0043】

ある特定の実施形態では、該非カチオン性脂質は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、リン脂質、またはＰＥＧ－脂質コンジュゲート及びリン脂質の混合物から選択される。

【0044】

ある特定の実施形態では、該非カチオン性脂質は、リン脂質を含む。

【0045】

ある特定の実施形態では、該非カチオン性脂質は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。

【0046】

ある特定の実施形態では、該非カチオン性脂質は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート及びリン脂質の混合物を含む。

【0047】

ある特定の実施形態では、該非カチオン性脂質は、リン脂質である。

【0048】

ある特定の実施形態では、該非カチオン性脂質は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートである。

【0049】

ある特定の実施形態では、該非カチオン性脂質は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート及びリン脂質の混合物である。

【0050】

ある特定の実施形態では、該脂質ナノ粒子は、さらに、コレステロールを含む。

【0051】

ある特定の実施形態では、該リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはそれらの混合物を含む。

【0052】

ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ－リン脂質コンジュゲート、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される。

【0053】

ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－２０００－Ｃ－ＤＭＡ、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ－リン脂質コンジュゲート、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される。

【0054】

ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートである。

【0055】

ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ_１０）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ_１２）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ_１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ_１６）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ_１８）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される。

【0056】

ある特定の実施形態では、該脂質ナノ粒子は、脂質：核酸の質量比が約９：１～約２０：１である。

【0057】

ある特定の実施形態では、該脂質ナノ粒子製剤の多様な脂質ナノ粒子は、脂質：核酸の質量比が約９：１～約２０：１である。

【0058】

ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、化学的に修飾される。

【0059】

ある特定の実施形態では、該脂質ナノ粒子は、高電子密度のコアを含む。

【0060】

ある特定の実施形態では、該脂質ナノ粒子は、高電子密度のコアを含み、該ｍＲＮＡは該高電子密度のコア内に位置する。

【0061】

ある特定の実施形態は、本明細書に記載の脂質ナノ粒子またはその集団、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0062】

ある特定の実施形態は、タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞に導入する方法を提供する。該方法は、該ｍＲＮＡが該細胞に導入され、そこで発現して該タンパク質を産生する条件下、該細胞を本明細書に記載の脂質ナノ粒子またはその集団と接触させることを含む。

【0063】

ある特定の実施形態は、ヒトにおける、該ヒトのタンパク質の発現障害によって引き起こされる疾患に関連する１つ以上の症状を治療及び／または改善する方法を提供する。該方法は、治療有効量の本明細書に記載の脂質ナノ粒子またはその集団を該ヒトに投与することを含み、この場合、該脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡが該タンパク質をコードする。

【0064】

ある特定の実施形態では、該リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。

【0065】

ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－２０００－Ｃ－ＤＭＡである。

【0066】

ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、該ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを少なくとも３．５モルパーセント（例えば、少なくとも約３．５、４、４．５、５、５．５、または６モルパーセント）含む。

【0067】

ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの量は、少なくとも３モルパーセント（例えば、少なくとも３．１モルパーセント、少なくとも３．２モルパーセント、少なくとも３．３モルパーセント、少なくとも３．４モルパーセント、少なくとも３．５モルパーセント、少なくとも３．６モルパーセント、少なくとも３．７モルパーセント、少なくとも３．８モルパーセント、少なくとも３．９モルパーセント、少なくとも４モルパーセント）である。リン脂質に関しては、ある特定の実施形態では、本発明を実施する上でリン脂質は使用されない。ある特定の実施形態では、該脂質粒子は、リン脂質を２モルパーセント未満、例えば、リン脂質を１．９ｍｏｌ％、リン脂質を１．８ｍｏｌ％、リン脂質を１．７ｍｏｌ％、リン脂質を１．６ｍｏｌ％、リン脂質を１．５ｍｏｌ％、リン脂質を１．４ｍｏｌ％、リン脂質を１．３ｍｏｌ％、リン脂質を１．２ｍｏｌ％、リン脂質を１．１ｍｏｌ％、リン脂質を１．０ｍｏｌ％、リン脂質を０．９ｍｏｌ％、リン脂質を０．８ｍｏｌ％、リン脂質を０．７ｍｏｌ％、リン脂質を０．６ｍｏｌ％、リン脂質を０．５ｍｏｌ％、リン脂質を０．４ｍｏｌ％、リン脂質を０．３ｍｏｌ％、リン脂質を０．２ｍｏｌ％、リン脂質を０．１ｍｏｌ％、またはリン脂質を０．０％、例えば、リン脂質を１．９ｍｏｌ％未満、リン脂質を１．８ｍｏｌ％未満、リン脂質を１．７ｍｏｌ％未満、リン脂質を１．６ｍｏｌ％未満、リン脂質を１．５ｍｏｌ％未満、リン脂質を１．４ｍｏｌ％未満、リン脂質を１．３ｍｏｌ％未満、リン脂質を１．２ｍｏｌ％未満、リン脂質を１．１ｍｏｌ％未満、リン脂質を１．０ｍｏｌ％未満、リン脂質を０．９ｍｏｌ％未満、リン脂質を０．８ｍｏｌ％未満、リン脂質を０．７ｍｏｌ％未満、リン脂質を０．６ｍｏｌ％未満、リン脂質を０．５ｍｏｌ％未満、リン脂質を０．４ｍｏｌ％未満、リン脂質を０．３ｍｏｌ％未満、リン脂質を０．２ｍｏｌ％未満、リン脂質を０．１ｍｏｌ％未満含む。

【0068】

ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、少なくとも３モルパーセントの量で存在するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ただし、該ＬＮＰは、リン脂質を０．５モルパーセント未満含む。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、少なくとも３．５モルパーセント（例えば、少なくとも約３．５、４、４．５、５、５．５、または６モルパーセント）の量で存在する。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、リン脂質を０．０５モルパーセント未満含む。

【0069】

ある特定の実施形態では、該脂質ナノ粒子は、脂質：ｍＲＮＡの質量比が約９：１～約２０：１である。

【0070】

ある特定の実施形態は、本明細書に記載の方法に従って調製される脂質ナノ粒子を提供する。

【0071】

ある特定の実施形態は、本明細書に記載の多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。

【0072】

ある特定の実施形態は、本明細書に記載の多様な脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を提供し、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水対照の反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、該脂質ナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水対照の反応の約２９、２８、２、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。

【0073】

本明細書で使用される以下の用語は、他に規定のない限り、それらに帰属する意味を有する。

【0074】

ｍＲＮＡ等の治療用核酸の「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果、例えば、当該タンパク質が発現される生物において所望の生物学的効果を引き起こす量のタンパク質のｍＲＮＡ指向性の発現を生じるのに十分な量である。例えば、いくつかの実施形態では、該発現されたタンパク質は、体内のある細胞型で通常発現されるタンパク質の活性型であり、該ｍＲＮＡの治療有効量は、健康な個体の細胞型で通常発現されるタンパク質の量の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、または少なくとも９０％）のコードされたタンパク質量を産生する量である。ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定するのに適切なアッセイとしては、当業者に既知のドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、酵素機能、及び表現型アッセイが挙げられるがこれらに限定されない。

【0075】

ｍＲＮＡによる免疫反応の「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「減少（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「低下（ｒｅｄｕｃｅ）」、または「低下（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」とは、所与のｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）に対する免疫反応の検出可能な減少を意味することを意図している。修飾ｍＲＮＡによる免疫反応の減少量は、未修飾のｍＲＮＡの存在下での免疫反応のレベルに対して決定され得る。検出可能な減少は、未修飾のｍＲＮＡの存在下で検出される免疫反応より約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上低い場合がある。ｍＲＮＡに対する免疫反応の減少は、通常、インビトロでキラー細胞によるサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＩＬ－６、もしくはＩＬ－２）産生の減少または該ｍＲＮＡの投与後の哺乳類対象の血清中でのサイトカイン産生の減少によって測定される。

【0076】

「実質同一性」とは、ストリンジェントな条件下で参照配列にハイブリダイズする配列、または参照配列の特定の領域にわたって特定のパーセント同一性を有する配列を指す。

【0077】

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という成句は、核酸が、通常は核酸の複雑な混合物中で、他の配列ではなくその標的配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、状況により異なるであろう。配列が長いほど、高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見られる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの該特定の配列に対する熱融点（Ｔ_ｍ）より約５～１０℃低くなるように選択される。該Ｔ_ｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）である（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔ_ｍで、プローブの５０％が平衡状態で使用される）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、正のシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。

【0078】

例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の通りでよい。５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または、５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２ｘＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄。ＰＣＲの場合、温度約３６℃が低ストリンジェンシー増幅に対して典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さにより約３２℃～４８℃の間で変化し得る。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅の場合、温度約６２℃が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマーの長さ及び特異性によって、約５０℃～約６５℃に及ぶ場合がある。高及び低ストリンジェンシー増幅の両方にとって典型的なサイクル条件は、９０℃～９５℃で３０秒～２分間の変性段階、３０秒～２分間続くアニーリング段階、及び約７２℃で１～２分間の伸長段階を含む。低及び高ストリンジェンシー増幅反応のプロトコル及び指針は、例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）に示されている。

【0079】

ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、なお実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号によって許容される最大のコドンの縮退を用いて作成される場合に生じる。かかる場合には、該核酸は、通常、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、４０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１ＸＳＳＣ中、４５℃での洗浄を含む。正のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者には、代替的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて同様のストリンジェンシーの条件を与えることができることが容易に認識されよう。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するためのさらなる指針は、多数の参考文献、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．に示されている。

【0080】

２つ以上の核酸との関連での「実質的に同一」または「実質同一性」という用語は、比較ウィンドウ、または指定された領域にわたる最大の一致について比較及び整列させた場合に、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、もしくは手作業でのアラインメント及び目視検査によって測定されるときの同じである２つ以上の配列もしくは部分配列、または同じであるヌクレオチドを特定のパーセンテージ有する２つ以上の配列もしくは部分配列を指す（すなわち、特定の領域にわたって少なくとも約６０％、好ましくは、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一）。この定義は、その文脈が示す場合、配列の相補体も同様に指す。好ましくは、実質同一性は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ヌクレオチド長である領域にわたって存在する。

【0081】

配列比較に関して、通常は１つの配列が参照配列となり、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを用いても、別のパラメータを指定してもよい。該配列比較アルゴリズムは、その後、該プログラムパラメータを基に、該参照配列に対する該試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0082】

本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、約５～約６０、通常約１０～約４５、より通常は約１５～約３０からなる群から選択される複数の隣接位置のいずれか１つのセグメントへの言及を含み、ここでは、ある配列は、同数の隣接位置の参照配列と、これら２つの配列を最適に並べた後に比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野では周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性の探索方法により、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＡＬＤＨＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＡＬＤＨＡＳＴＡ）により、または手作業でのアラインメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）により行うことができる。

【0083】

パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの非限定的な例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０を本明細書に記載のパラメータとともに使用し、本発明の核酸のパーセント配列同一性を決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より公表されている。別の例は、タンパク質またはヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）配列を整列させるための、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム等のパーセント配列同一性を決定するためのグローバルアラインメントアルゴリズムである。

【0084】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然生じる確率を示す。例えば、核酸は、当該試験核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合に、参照配列と類似であると見なされる。

【0085】

本明細書で使用される「核酸」という用語は、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドを一本鎖または二本鎖のいずれかの形態で含むポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、事前濃縮ＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（例えば、Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体及び組み合わせの形態でよい。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びそれらの組み合わせの形態でよい。核酸には、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含む核酸が含まれ、これらは、合成、自然発生、及び非自然発生であり、参照核酸と同様の結合特性を有する。かかる類似体の例としては、制限なく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、及びペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。特に限定されない限り、該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。核酸配列は、ある特定の実施形態では、「ロック解除された核酸塩基類似体」（「ＵＮＡ」と略す）を含んでもよい。

【0086】

「ロック解除された核酸塩基類似体」（「ＵＮＡ」と略す）という用語は、リボース環のＣ２’及びＣ３’原子が共有結合していない非環式核酸塩基を指す。該「ロック解除された核酸塩基類似体」という用語は、構造Ａとして特定される以下の構造を有する核酸塩基類似体を含む。

【化1】

ここで、Ｒは、ヒドロキシルであり、塩基は、任意の天然または非天然塩基、例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）等である。本発明を実施する上で有用なＵＮＡとしては、非環式２’－３’－ｓｅｃｏ－ヌクレオチドモノマーとして米国特許第８，３１４，２２７号で特定されている分子が挙げられる。当該特許は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0087】

別段の指示のない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列を、明確に示された配列と同様に暗黙的に包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第三の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１－９８（１９９４））。

【0088】

本明細書で使用される「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、該ｓｉＲＮＡが標的遺伝子もしくは配列と同じ細胞にある場合に、該標的遺伝子もしくは配列の発現を低下させることまたは阻害することが可能な（例えば、該ｓｉＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介することによって、またはその翻訳を阻害することによって）二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ＲＮＡ（すなわち、二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）ＲＮＡ）を指す。該ｓｉＲＮＡは、該標的遺伝子もしくは配列に対して実質もしくは完全同一性を有する場合もあれば、ミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含む場合もある。ある特定の実施形態では、該ｓｉＲＮＡは、約１９～２５（二本鎖）ヌクレオチド長を有する場合があり、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３（二本鎖）ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、約１～約４ヌクレオチドまたは約２～約３ヌクレオチドの３’突出及び５’リン酸末端を含み得る。ｓｉＲＮＡの例としては、制限なく、１本の鎖がセンス鎖であり、他方が相補的アンチセンス鎖である２本の別々の鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子が挙げられる。

【0089】

好ましくは、ｓｉＲＮＡは化学合成される。ｓｉＲＮＡはまた、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮａｓｅＩＩＩまたはダイサーによる、より長いｄｓＲＮＡ（例えば、約２５ヌクレオチド長を超えるｄｓＲＮＡ）の切断によって生成することもできる。これらの酵素は、該ｄｓＲＮＡを生物学的に活性なｓｉＲＮＡに加工する（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９９４２－９９４７（２００２）、Ｃａｌｅｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３６（２００２）、Ｂｙｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｂｉｏｎ ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ，１０（１）：４－６（２００３）、Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：９８１－９８７（２００３）、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２２６９－２２７１（２００１）、及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：８２（１９６８）参照）。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド～約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチド長の長さでも、それより長くてもよい。該ｄｓＲＮＡは、全遺伝子転写物をコードしても部分的な遺伝子転写物をコードしてもよい。場合によっては、ｓｉＲＮＡは、プラスミドによってコードされ得る（例えば、ヘアピンループを有する二本鎖に自動的に折りたたまれる配列として転写される）。

【0090】

「ヌクレオチド」は、糖であるデオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を介して結合している。「塩基」には、プリン及びピリミジンが含まれ、これらはさらに、天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体を含み、また、「塩基」には、プリン及びピリミジンの合成誘導体が含まれ、これらとしては、限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、及びアルキルハライド等の新たな反応性の基を付ける修飾が挙げられるがこれらに限定されない。

【0091】

「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの産生に必要な部分長もしくは全長コード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。

【0092】

本明細書で使用される「遺伝子産物」とは、遺伝子の生成物、例えば、ＲＮＡ転写物またはポリペプチドを指す。

【0093】

「脂質」という用語は、限定されないが脂肪酸のエステルを含み、水に不溶であるが多くの有機溶媒には可溶であることを特徴とする有機化合物の群を指す。それらは、通常、少なくとも３つのクラス、すなわち、（１）油脂だけでなくワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、ならびに（３）ステロイド等の「誘導脂質」に分けられる。

【0094】

「脂質粒子」という用語は、目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官等）に治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）を送達するために使用することができる脂質製剤を含む。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸－脂質粒子であり、これは通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質）、該粒子の凝集を防ぐ複合脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質）、及び任意にコレステロールから生成される。通常、該治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、該粒子の脂質部分に封入される場合があり、それにより、酵素分解から保護される。

【0095】

本発明の脂質粒子を説明するために使用される場合、「高電子密度のコア」という用語は、低温透過型電子顕微鏡法（「ｃｒｙｏＴＥＭ」）を用いて可視化した際の脂質粒子の内側部分の暗い外観を指す。本発明のいくつかの脂質粒子は、高電子密度のコアを有し、脂質二重層構造を欠いている。本発明のいくつかの脂質粒子は、高電子密度のコアを有し、脂質二重層構造を欠き、逆六方または立方相構造を有する。理論に拘束されることを望むものではないが、非二重層脂質充填は、水及び核酸を内部に含む脂質柱の３次元ネットワーク、すなわち、本質的に、核酸を含む水のチャンネルが相互貫入した脂質滴を与えると考えられる。

【0096】

本明細書で使用される「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定な核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐ複合脂質）から製造される粒子であり、この場合、該核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、該脂質内に完全に封入される。場合によっては、ＳＮＡＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の循環寿命の延長を示すことができ、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）で蓄積することができ、これら遠位部位でｍＲＮＡ発現を媒介することができるため、全身適用に極めて有用である。該核酸は、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０３６８３号に記載の通り、縮合剤と複合体を形成し、ＳＮＡＬＰ内に封入され得る。該公開の開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0097】

本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、通常、平均径が約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍであり、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の脂質粒子に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許公開第２００４０１４２０２５号及び第２００７００４２０３１号に開示されており、これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0098】

本明細書で使用される「脂質封入」は、ｍＲＮＡ等の治療用核酸を、完全に封入して、部分的に封入して、またはその両方で提供する脂質粒子を指すことができる。好ましい実施形態では、該核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、該脂質粒子に完全に封入される（例えば、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸－脂質粒子を形成する）。

【0099】

「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質を指す。かかる脂質コンジュゲートとしては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、ジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールに結合したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ、及びセラミドに複合したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号参照）、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、及びそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートのさらなる例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接複合化することができ、またはリンカー部分を介して脂質に結合してもよい。ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質に結合させるのに適した任意のリンカー部分を使用することができ、例えば、エステルを含まないリンカー部分及びエステルを含むリンカー部分が含まれる。ある特定の好ましい実施形態では、エステルを含まないリンカー部分、例えば、アミドまたはカルバメートが使用される。上記特許文献の各々の開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0100】

「両親媒性脂質」という用語は、一部には、脂質物質の疎水性部分が疎水性相に配向し、親水性部分が水相に配向する任意の適切な物質を指す。親水性の特徴は、炭水化物、ホスフェート、カルボン酸、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシル、及び他の類似の基等の極性基または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、またはヘテロ環式基で置換されたかかる基が挙げられるがこれらに限定されない無極性基の包含によって与えられ得る。両親媒性化合物の例としては、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質が挙げられるがこれらに限定されない。

【0101】

リン脂質の代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるがこれらに限定されない。リンを欠く他の化合物、例えば、スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びβ－アシルオキシ酸もまた、両親媒性脂質として指定される群内である。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールを含めた他の脂質と混合することができる。

【0102】

「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電または中性双性イオン形態のいずれかで存在する複数の脂質種のいずれかを指す。生理的ｐＨでは、かかる脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが含まれる。

【0103】

「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質及び任意の他の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。

【0104】

「アニオン性脂質」という用語は、生理的ｐＨで負に荷電している任意の脂質を指す。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるがこれらに限定されない。

【0105】

「疎水性脂質」という用語は、無極性基を有する化合物を指し、これらとしては、限定されないが、長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基が挙げられ、かかる基は任意に、１つ以上の芳香族、脂環式、またはヘテロ環式基で置換される。適切な例としては、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、及び１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが挙げられるがこれらに限定されない。

【0106】

「カチオン性脂質」及び「アミノ脂質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、１、２、３、もしくはそれ以上の脂肪酸または脂肪族アルキル鎖及びｐＨ滴定可能なアミノ頭部基（例えば、アルキルアミノもしくはジアルキルアミノ頭部基）を有する脂質ならびにその塩を含む。該カチオン性脂質は通常、該カチオン性脂質のｐＫ_ａ未満のｐＨでプロトン化され（すなわち、正に荷電され）、該ｐＫ_ａを超えるｐＨでは実質的に中性である。本発明のカチオン性脂質はまた、滴定可能なカチオン性脂質と呼んでもよい。いくつかの実施形態では、該カチオン性脂質は、プロトン化可能な３級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）頭部基、各アルキル鎖が独立して０～３（例えば、０、１、２、または３）個の二重結合を有するＣ_１８アルキル鎖、ならびに該頭部基及びアルキル鎖の間のエーテル、エステル、またはケタール結合を含む。かかるカチオン性脂質としては、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２、及びＣ２Ｋとしても知られる）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＭＣ２としても知られる）、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（ＭＣ３としても知られる）、ならびに（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂ１１としても知られる）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0107】

「アルキルアミノ」という用語には、式－Ｎ（Ｈ）Ｒの基が含まれ、ここで、Ｒは、本明細書で定義されるアルキルである。

【0108】

「ジアルキルアミノ」という用語には、式－ＮＲ_２の基が含まれ、ここで、各Ｒは、独立して、本明細書で定義されるアルキルである。

【0109】

「塩」という用語は、任意のアニオン及びカチオン錯体、例えば、カチオン性脂質と１つ以上のアニオンとの間で形成される錯体を含む。アニオンの非限定的な例としては、無機及び有機アニオン、例えば、ヒドリド、フルオライド、クロリド、ブロミド、ヨージド、オキサレート（例えば、ヘミオキサレート）、ホスフェート、ホスホネート、ハイドロジェンホスフェート、ジハイドロジェンホスフェート、オキシド、カーボネート、ビカーボネート、ニトレート、ニトライト、ニトライド、ビスルファイト、スルフィド、スルファイト、ビスルフェート、スルフェート、チオスルフェート、ハイドロジェンスルフェート、ボレート、ホルメート、アセテート、ベンゾエート、シトレート、タータレート、ラクテート、アクリレート、ポリアクリレート、フマレート、マレエート、イタコネート、グリコレート、グルコネート、マレート、マンデレート、チグレート、アスコルベート、サリシレート、ポリメタクリレート、パークロレート、クロレート、クロライト、ハイポクロライト、ブロメート、ハイポブロマイト、ヨーデート、アルキルスルホネート、アリールスルホネート、アーセネート、アーセナイト、クロメート、ジクロメート、シアニド、シアネート、チオシアネート、ヒドロキシド、ペルオキシド、パーマンガネート、及びそれらの混合物が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示のカチオン性脂質の塩は、結晶塩である。

【0110】

「アルキル」という用語は、１～２４個の炭素原子を含む直鎖もしくは分岐非環式または環式飽和脂肪族炭化水素を含む。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル等が挙げられるがこれらに限定されず、飽和分岐アルキルとしては、制限なく、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル等が挙げられる。代表的な飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられるがこれらに限定されず、不飽和環式アルキルとしては、制限なく、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等が挙げられる。

【0111】

「アルケニル」という用語は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含む上記で定義されるアルキルを含む。アルケニルは、ｃｉｓ及びｔｒａｎｓの両異性体を含む。代表的な直鎖及び分岐アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニル等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0112】

「アルキニル」という用語は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの三重結合をさらに含む上記で定義される任意のアルキルまたはアルケニルを含む。代表的な直鎖及び分岐鎖アルキニルとしては、制限なく、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－メチル－１ブチニル等が挙げられる。

【0113】

「アシル」という用語は、結合点の炭素が以下で定義されるオキソ基で置換された任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを含む。以下はアシル基の非限定的な例である。－Ｃ（＝Ｏ）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、及び－Ｃ（＝Ｏ）アルキニル。

【0114】

「ヘテロ環」という用語は、５～７員の単環式、または７～１０員の二環式のヘテロ環式環を含み、これは飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または２個のヘテロ原子を含み、該窒素及び硫黄のヘテロ原子は、任意に酸化されてもよく、該窒素ヘテロ原子は、任意に４級化されてもよく、上記ヘテロ環のいずれかがベンゼン環に縮合した二環式環を含む。該ヘテロ環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。ヘテロ環としては、以下で定義されるヘテロアリール、ならびにモルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0115】

「任意に置換されるアルキル」、「任意に置換されるアルケニル」、「任意に置換されるアルキニル」、「任意に置換されるアシル」、及び「任意に置換されるヘテロ環」という用語は、置換される場合、少なくとも１つの水素原子が置換基と交換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が交換される。これに関して、置換基としては、限定されないが、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙが挙げられ、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、同一または異なって、独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、該アルキル及びヘテロ環置換基の各々は、さらに、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙのうちの１つ以上で置換されてもよい。「任意に置換される」という用語が置換基のリストの前に使用される場合、該リストの置換基の各々が、本明細書に記載の通りに任意に置換されてもよいことを意味する。

【0116】

「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを含む。

【0117】

「融合性」という用語は、ＳＮＡＬＰ等の脂質粒子が細胞膜に融合する能力を指す。これらの膜は、原形質膜でも細胞小器官、例えば、エンドソーム、核等を囲む膜でもよい。

【0118】

本明細書で使用される「水溶液」という用語は、全体または一部において水を含む組成物を指す。

【0119】

本明細書で使用される「有機脂質溶液」という用語は、全体または一部において、脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。

【0120】

本明細書で使用される「遠位部位」とは、物理的に分離された部位を指し、これは、隣接する毛細血管床に限定されないが、ある生物全体に広く分布する部位を含む。

【0121】

ＳＮＡＬＰ等の核酸－脂質粒子に関して「血清安定性」とは、遊離のＤＮＡまたはＲＮＡを著しく分解するであろう血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に該粒子が大きく分解されないことを意味する。適切なアッセイとしては、例えば、標準血清アッセイ、ＤＮＡ分解酵素アッセイ、またはＲＮＡ分解酵素アッセイが挙げられる。

【0122】

本明細書で使用される「全身送達」とは、生物内でｍＲＮＡ等の活性薬剤の広い生体内分布をもたらす脂質粒子の送達を指す。いくつかの投与技術は、ある特定の薬剤の全身送達をもたらすことができるが、他のものの全身送達はもたらさない。全身送達とは、有用な、好ましくは治療的な量の薬剤が体の大部分に曝露されることを意味する。広い生体内分布を得ることは一般に、該薬剤が、投与部位に対して遠位の疾患部位に達する前に急速に分解または除去（例えば、初回通過器官（肝臓、肺等）によって、または急速な非特異的細胞結合によって）されないように、血中寿命が必要とされる。脂質粒子の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、及び腹腔内等の当技術分野で既知の任意の方法によることができる。好ましい実施形態では、脂質粒子の全身送達は静脈内送達による。

【0123】

本明細書で使用される「局所送達」とは、生物内でｍＲＮＡ等の活性薬剤を標的部位へ直接送達することを指す。例えば、薬剤を、疾患部位、他の標的部位、または肝臓、心臓、膵臓、腎臓等の標的器官への直接の注入によって局所的に送達することができる。

【0124】

「哺乳類」という用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜等の任意の哺乳類種を指す。

【0125】

脂質：ｍＲＮＡの比を記載するために本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、当該粒子の全脂質を指す。

【0126】

本明細書で特に明記しない限り、「約」という用語は、値または値の範囲に関連して使用される場合、記載された値または値の範囲のプラスマイナス５％を意味する。

【0127】

特定の実施形態の説明
１つの態様において、本発明は、核酸－脂質粒子を提供し、これは各々、（ａ）カチオン性脂質を含む脂質粒子、及び（ｂ）該脂質粒子内に封入されるｍＲＮＡ分子を含む。通常、ｍＲＮＡ分子の集団が該脂質粒子内に封入される。該脂質粒子は通常、内側部分を画定する外層を含み、ここで、該ｍＲＮＡ分子（複数可）は該内側部分内に位置する。該ｍＲＮＡ分子（複数可）は、通常、該脂質粒子内に完全に封入される。該脂質粒子は、球状でも非球状でもよい。該脂質粒子は、ｃｒｙｏＴＥＭを用いて可視化した際の高電子密度のコアを有し得る。通常、該高電子密度のコアは、主に脂質からなるが、含水物が該脂質の量未満の量で存在してもよい。

【0128】

１つの態様において、本発明は、ＰＥＧ脂質、非カチオン性脂質、トリアルキルカチオン性脂質及びテトラアルキルカチオン性脂質から選択されるカチオン性脂質、ならびにｍＲＮＡを含む脂質粒子を提供し、該脂質粒子は高電子密度のコアを有し、該ｍＲＮＡは、該高電子密度のコア内に封入される。

【0129】

本発明のいくつかの実施形態では、該脂質粒子は、（ａ）カチオン性脂質、ＰＥＧ－脂質、及びリン脂質を含む脂質粒子、ならびに（ｂ）ｍＲＮＡ分子を含み、該ｍＲＮＡ分子は、該脂質粒子内に封入される。該脂質粒子は、任意にコレステロールを含むことができる。該ｍＲＮＡは、該脂質粒子内に完全に封入されても部分的に封入されてもよい。

【0130】

粒子１００の生成は、１つ以上の実施形態では、脂質を第一の流体、例えばエタノール中に配置し、ｍＲＮＡを第二の流体、例えば水性緩衝液中に配置し、該第一及び第二の流体を制御された条件下で混合して粒子１００を形成することを含む。得られた粒子１００は、低温透過型電子顕微鏡法で見た際に脂質粒子内に高電子密度のコアを含む。

【0131】

ｍＲＮＡ
本発明の粒子において有用なｍＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチド、例えば２’ＯＭｅヌクレオチドを含み得る。好ましくは、該ｍＲＮＡのウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドが２’ＯＭｅヌクレオチドで修飾される。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、さらに、修飾された（例えば、２’ＯＭｅで修飾された）アデノシン及び／または修飾された（例えば、２’ＯＭｅで修飾された）シトシンヌクレオチドを含んでもよい。

【0132】

１つの態様において、本発明は、ｍＲＮＡを含む核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。該核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、通常、１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ、カチオン性脂質、及び非カチオン性脂質を含む。場合によっては、該核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、さらに、粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。好ましくは、該核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡ（複数可）は、該核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）に完全に封入される。ｍＲＮＡカクテルを含む製剤に関しては、該カクテルに存在する異なるタイプのｍＲＮＡ種（例えば、異なる配列を有するｍＲＮＡ）が同じ粒子に共に封入されても、該カクテルに存在する各タイプのｍＲＮＡ種が別々の粒子に封入されてもよい。該ｍＲＮＡカクテルは、２つ以上の個々のｍＲＮＡ（各々が固有の配列を有する）の同一の、類似の、もしくは異なる濃度またはモル比の混合物を用いて本明細書に記載の粒子に製剤化され得る。１つの実施形態では、ｍＲＮＡのカクテル（異なる配列の複数のｍＲＮＡに対応する）は、同一の、類似の、もしくは異なる濃度またはモル比の各ｍＲＮＡ種を用いて製剤化され、これら異なるタイプのｍＲＮＡが同じ粒子に共に封入される。別の実施形態では、該カクテルに存在する各タイプのｍＲＮＡ種は、同一の、類似の、もしくは異なるｍＲＮＡ濃度またはモル比で異なる粒子に封入され、そのようにして生成された粒子（各々が異なるｍＲＮＡペイロードを含む）が別々に投与され（例えば、治療計画に応じて異なる時点で）、または、混合されて単一の単位用量として（例えば、医薬的に許容される担体とともに）一緒に投与される。本明細書に記載の粒子は、血清安定性であり、ヌクレアーゼ分解に対して耐性があり、ヒト等の哺乳類に対して実質的に非毒性である。

【0134】

本発明の核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）におけるカチオン性脂質は、例えば、本明細書に記載の式Ｉ～ＩＩＩの１つ以上のカチオン性脂質または任意の他のカチオン性脂質種を含み得る。１つの特定の実施形態では、該カチオン性脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル－３－ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ）、それらの塩、及びそれらの混合物からなる群から選択される。

【0135】

本発明の核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）における非カチオン性脂質は、例えば、１つ以上のアニオン性脂質及び／または中性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、該非カチオン性脂質は、以下の中性脂質成分、すなわち、（１）リン脂質及びコレステロールもしくはその誘導体の混合物、（２）コレステロールもしくはその誘導体、または（３）リン脂質のうちの１つを含む。ある特定の好ましい実施形態では、該リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはそれらの混合物を含む。特に好ましい実施形態では、該非カチオン性脂質は、ＤＰＰＣ及びコレステロールの混合物である。

【0136】

本発明の核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）における脂質コンジュゲートは、粒子の凝集を阻害し、例えば、本明細書に記載の１つ以上の脂質コンジュゲートを含み得る。１つの特定の実施形態では、該脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの例としては、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、該脂質粒子のＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ_１０）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ_１２）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ_１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ_１６）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ_１８）コンジュゲート、またはそれらの混合物を含み得る。別の実施形態では、該脂質コンジュゲートは、ＰＯＺ－脂質コンジュゲート、例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲートを含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）各々がタンパク質をコードする１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）当該粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％を構成する１つ以上のカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）当該粒子に存在する全脂質の約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％を構成する１つ以上の非カチオン性脂質、及び（ｄ）当該粒子に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質を含む核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。

【0138】

本実施形態の１つの態様において、該核酸－脂質粒子は、（ａ）各々がタンパク質をコードする１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）該粒子に存在する全脂質の約５２ｍｏｌ％～約６２ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）該粒子に存在する全脂質の約３６ｍｏｌ％～約４７ｍｏｌ％を構成するリン脂質及びコレステロールまたはその誘導体の混合物、ならびに（ｄ）該粒子に存在する全脂質の約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。核酸－脂質粒子の本実施形態は、通常、本明細書では「１：５７」製剤と呼ばれる。１つの特定の実施形態では、該１：５７製剤は、約１．４ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ）、約５７．１ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）またはその塩、約７．１ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（もしくはＤＳＰＣ）、及び約３４．３ｍｏｌ％のコレステロール（もしくはその誘導体）を含む４成分系である。

【0139】

本実施形態の別の態様において、該核酸－脂質粒子は、（ａ）各々がタンパク質をコードする１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）該粒子に存在する全脂質の約５６．５ｍｏｌ％～約６６．５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）該粒子に存在する全脂質の約３１．５ｍｏｌ％～約４２．５ｍｏｌ％を構成するコレステロールまたはその誘導体、及び（ｄ）該粒子に存在する全脂質の約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。核酸－脂質粒子の本実施形態は、通常、本明細書では「１：６２」製剤と呼ばれる。１つの特定の実施形態では、該１：６２製剤は、リン脂質を含まず、約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ）、約６１．５ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）またはその塩、及び約３６．９ｍｏｌ％のコレステロール（もしくはその誘導体）を含む３成分系である。

【0140】

１：５７及び１：６２製剤に関連するさらなる実施形態は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／１２７０６０号及び公開米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００７１２０８Ａ１号に記載されており、これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0141】

他の実施形態では、本発明は、（ａ）各々がタンパク質をコードする１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）当該粒子に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する１つ以上のカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）当該粒子に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を構成する１つ以上の非カチオン性脂質、及び（ｄ）当該粒子に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質を含む核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。

【0142】

本実施形態の１つの態様において、該核酸－脂質粒子は、（ａ）各々がタンパク質をコードする１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）該粒子に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）該粒子に存在する全脂質の約４７ｍｏｌ％～約６９ｍｏｌ％を構成するリン脂質及びコレステロールまたはその誘導体の混合物、ならびに（ｄ）該粒子に存在する全脂質の約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。核酸－脂質粒子の本実施形態は、通常、本明細書では「２：４０」製剤と呼ばれる。１つの特定の実施形態では、該２：４０製剤は、約２ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ）、約４０ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）またはその塩、約１０ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（もしくはＤＳＰＣ）、及び約４８ｍｏｌ％のコレステロール（もしくはその誘導体）を含む４成分系である。

【0143】

さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）各々がタンパク質をコードする１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）当該粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％を構成する１つ以上のカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）当該粒子に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％を構成する１つ以上の非カチオン性脂質、及び（ｄ）当該粒子に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質を含む核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。

【0144】

本実施形態の１つの態様において、該核酸－脂質粒子は、（ａ）各々がタンパク質をコードする１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）該粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）該粒子に存在する全脂質の約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％を構成するリン脂質及びコレステロールまたはその誘導体の混合物、ならびに（ｄ）該粒子に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。核酸－脂質粒子の本実施形態は、通常、本明細書では「７：５４」製剤と呼ばれる。場合によっては、該７：５４製剤の非カチオン性脂質混合物は、（ｉ）該粒子に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％のリン脂質、及び（ｉｉ）該粒子に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を含む。１つの特定の実施形態では、該７：５４製剤は、約７ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ７５０－Ｃ－ＤＭＡ）、約５４ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）またはその塩、約７ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（もしくはＤＳＰＣ）、及び約３２ｍｏｌ％のコレステロール（もしくはその誘導体）を含む４成分系である。

【0145】

本実施形態の別の態様において、該核酸－脂質粒子は、（ａ）各々がタンパク質をコードする１つ以上の（例えば、カクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）該粒子に存在する全脂質の約５５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）該粒子に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成するコレステロールまたはその誘導体、及び（ｄ）該粒子に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。核酸－脂質粒子の本実施形態は、通常、本明細書では「７：５８」製剤と呼ばれる。１つの特定の実施形態では、該７：５８製剤は、リン脂質を含まず、約７ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ７５０－Ｃ－ＤＭＡ）、約５８ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）またはその塩、及び約３５ｍｏｌ％のコレステロール（もしくはその誘導体）を含む３成分系である。

【0146】

７：５４及び７：５８製剤に関連するさらなる実施形態は、公開米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００７６３３５Ａ１号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0147】

本発明はまた、ＳＮＡＬＰ等の核酸－脂質粒子及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0148】

本発明の核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、１つ以上のタンパク質（完全長タンパク質または完全長タンパク質の生物学的に活性な断片等）を発現するｍＲＮＡの治療的送達に有用である。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質を発現するｍＲＮＡのカクテルは、同一または異なる核酸－脂質粒子に製剤化され、該粒子は、かかる治療を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に投与される。場合によっては、治療有効量の該核酸－脂質粒子を該哺乳類に投与することができる。

【0149】

ある特定の実施形態では、本発明は、細胞と本明細書に記載の核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ製剤）を接触させることにより、１つ以上のｍＲＮＡ分子を該細胞に導入する方法を提供する。１つの特定の実施形態では、該細胞は、細網内皮細胞（例えば、単球もしくはマクロファージ）、線維芽細胞、内皮細胞、または血小板細胞である。

【0150】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、以下の投与経路、すなわち、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、及び皮内のうちの１つにより投与される。特定の実施形態では、該核酸－脂質粒子は、全身的に、例えば、経腸または非経口投与経路を介して投与される。

【0151】

特定の実施形態では、本発明の核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、他の組織と比較して肝臓に優先的にｍＲＮＡ等のペイロードを送達することができる。

【0152】

ある特定の態様において、本発明は、タンパク質を、それを必要とする哺乳類（例えば、ヒト）において発現させる方法を提供し、該方法は、１つ以上のタンパク質を該タンパク質（複数可）が該哺乳類で発現できるようにする条件下でコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ製剤）の治療有効量を該哺乳類に投与することを含む。例えば、該ｍＲＮＡが、健康な哺乳類対象で通常発現されるタンパク質をコードする実施形態では、該ＳＮＡＬＰ内に封入された該ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現レベルは、健康な哺乳類対象で通常発現される該タンパク質のレベルの少なくとも１０％、もしくは少なくとも２０％、もしくは少なくとも３０％、もしくは少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％、または１００％超である。

【0153】

他の態様において、本発明は、疾患に伴う１つ以上の症状の治療、予防、発現のリスクもしくは可能性の低減（例えば、それに対する感受性の低減）、発現の遅延、及び／または改善のためのそれを必要とする哺乳類（例えば、ヒト）における方法を提供し、ここで、該疾患は、タンパク質発現の低下または異常によって（少なくとも一部分において）引き起こされる。該方法は各々、治療される対象内で欠如している、または低下したレベルで存在しているタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子を含む核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ製剤）の治療有効量を当該哺乳類に投与するステップを含む。

【0154】

本発明で有用なｍＲＮＡ分子は、化学的に修飾されていても、未修飾であってもよい。通常、ｍＲＮＡ分子は、該ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫反応を誘導する能力を低下させるために化学的に修飾される。

【0155】

ｍＲＮＡに対する修飾
本発明の実施に使用されるｍＲＮＡとしては、１、２個の、または３個以上のヌクレオシドの修飾を含むことができる。いくつかの実施形態では、該修飾ｍＲＮＡは、未修飾の対応するｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡが導入される細胞における分解が低減される。

【0156】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドには、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジンが含まれる。

【0157】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドには、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジンが含まれる。

【0158】

他の実施形態では、修飾ヌクレオシドには、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンが含まれる。

【0159】

特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジン、または５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－プソイドウリジンである。α－チオ置換ホスフェート部分は、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してＲＮＡポリマーに安定性を付与するために提供される。ホスホロチオエートＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性の増加に続いて細胞環境でより長い半減期を有する。ホスホロチオエート結合核酸はまた、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化を介して自然免疫反応を低下させると予想される。

【0160】

ある特定の実施形態では、例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが望まれる場合、細胞に導入された修飾核酸を細胞内で分解することが望ましい。従って、本発明は、細胞内で指向された様式で作用されることが可能な分解ドメインを含む修飾核酸を提供する。

【0161】

他の実施形態では、修飾ヌクレオシドには、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンが含まれる。

【0162】

修飾核酸の任意成分
さらなる実施形態では、該修飾核酸は、他の任意成分を含んでもよく、これはいくつかの実施形態では有益な場合がある。これらの任意成分としては、非翻訳領域、コザック配列、イントロンヌクレオチド配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、キャップ、及びポリＡテールが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲが提供される場合があり、その一方または両方は、独立して、１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含み得る。かかる実施形態では、ヌクレオシド修飾はまた、翻訳可能領域に存在する場合もある。コザック配列を含む核酸もまた提供する。

【0163】

さらに、当該核酸から切除することができる１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0164】

非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写はされるが翻訳はされない。５’ＵＴＲは転写開始部位で始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンは含まない。一方、３’ＵＴＲは終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳の観点から、ＵＴＲが果たすこの調節的役割に関する証拠が増えている。ＵＴＲの調節的特徴を、本発明で使用されるｍＲＮＡに組み込み、該分子の安定性を高めることができる。また、この特異的な特徴を組み込み、それらが望ましくない器官部位に誤って向けられた場合に、転写の制御された下方制御を確実にすることもできる。

【0165】

５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を高め、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合する。ＣＢＰは、細胞内でのｍＲＮＡの安定性及び翻訳能力に、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して関与し、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップは、さらに、ｍＲＮＡスプライシングの過程で５’近位のイントロンの除去を助ける。

【0166】

内因性ｍＲＮＡ分子は、５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドの間に生成する５’末端キャップがなされ得る。この５’－グアニル酸キャップは、その後メチル化されてＮ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。このｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）での転写ヌクレオチドのリボース糖は、任意に２’－Ｏ－メチル化もされ得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断を介した５’－デキャッピングは、核酸分子、例えばｍＲＮＡ分子を分解の標的にし得る。

【0167】

ＩＲＥＳ配列
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むｍＲＮＡもまた、本発明を実施する上で有用である。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として作用する場合も、ｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位のうちの１つとして機能する場合もある。２つ以上の機能的リボソーム結合部位を含むｍＲＮＡは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（「マルチシストロニックｍＲＮＡ」）。ｍＲＮＡがＩＲＥＳを備えている場合、さらに任意に第２の翻訳可能領域を備えている。本発明に従って使用することができるＩＲＥＳ配列の例としては、制限なく、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（Ｓ１Ｖ）、またはコオロギ麻痺病ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。

【0168】

ポリＡテール
ＲＮＡプロセシングの過程で、長鎖のアデニンヌクレオチド（ポリＡテール）がｍＲＮＡ分子等のポリヌクレオチドに付加され、安定性が高められる場合がある。転写の直後、転写物の３’末端が切断されて３’ヒドロキシルを遊離させることがある。その後、ポリＡポリメラーゼがアデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。このプロセスは、ポリアデニル化と呼ばれ、１００～２５０残基長であり得るポリＡテールを付加する。

【0169】

一般に、ポリＡテールの長さは、３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、ポリＡテールは、３５ヌクレオチド長より長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドであるか、またはそれを超える）。

【0170】

これに関連して、ポリＡテールは、修飾ｍＲＮＡより１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くてよい。ポリＡテールはまた、それが属する修飾核酸のほんの一部として設計してもよい。これに関連して、ポリＡテールは、修飾ｍＲＮＡの全長または修飾ｍＲＮＡからポリＡテールを引いた全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％またはそれ以上でよい。

【0171】

ｍＲＮＡ分子の生成
ＲＮＡの単離、ＲＮＡの合成、核酸のハイブリッド形成、ｃＤＮＡライブラリの作製及びスクリーニング、ならびにＰＣＲの実施のための方法は、当技術分野では周知であり（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）参照）、ＰＣＲ法も周知である（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）参照）。発現ライブラリもまた当業者には周知である。本発明における一般的な使用方法を開示するさらなる基本的なテキストとしては、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が挙げられる。これら参考文献の開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0172】

ｓｉＲＮＡ分子の生成
ｓｉＲＮＡは、例えば、１つ以上の単離された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖として、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）として、またはＤＮＡプラスミド中の転写カセットから転写されたｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡとして含むいくつかの形態で提供され得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、酵素的に産生されても、一部／完全有機合成によって生成されてもよく、修飾リボヌクレオチドは、インビトロ酵素合成または有機合成によって導入することができる。場合によっては、各鎖は化学的に調製される。ＲＮＡ分子の合成方法は、当技術分野では既知であり、例えば、Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）に記載のまたは本明細書に記載の化学合成方法である。

【0173】

ＲＮＡの単離、ＲＮＡの合成、核酸のハイブリッド形成、ｃＤＮＡライブラリの作製及びスクリーニング、ならびにＰＣＲの実施のための方法は、当技術分野では周知であり（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記、参照）、ＰＣＲ法も周知である（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）参照）。発現ライブラリもまた当業者には周知である。本発明における一般的な使用方法を開示するさらなる基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が挙げられる。これら参考文献の開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0174】

好ましくは、ｓｉＲＮＡは、化学合成される。本発明のｓｉＲＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドは、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５（１９８７）、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：５４３３（１９９０）、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：２６７７－２６８４（１９９５）、及びＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．，７４：５９（１９９７）に記載のもの等、当技術分野で既知の様々な技術のいずれかを用いて合成することができる。このオリゴヌクレオチド合成は、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホロアミデート等の共通の核酸保護及びカップリング基を使用する。非限定的な例として、小規模の合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシンセサイザーにて、０．２μｍｏｌ規模のプロトコルを用いて行うことができる。別の方法として、０．２μｍｏｌ規模での合成は、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）製の９６ウェルプレートシンセサイザーにて行うことができる。しかしながら、より大きいまたは小さい規模の合成もまた本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチド合成用の適切な試薬、ＲＮＡの脱保護方法、及びＲＮＡの精製方法は、当業者には既知である。

【0175】

ｓｉＲＮＡ分子は、２つの異なるオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、一方のオリゴヌクレオチドはセンス鎖を含み、他方は該ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む。例えば、各鎖を別々に合成し、合成及び／または脱保護の後、ハイブリダイゼーションもしくはライゲーションにより結合させることができる。

【0176】

脂質粒子
ある特定の態様において、本発明は、当該脂質粒子内に封入された１つ以上の治療用ｍＲＮＡ分子を含む脂質粒子を提供する。

【0177】

いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、脂質粒子内の該ｍＲＮＡが水溶液中でヌクレアーゼ分解に対して耐性があるように、脂質粒子の脂質部分内に完全に封入される。他の実施形態では、本明細書に記載の脂質粒子は、実質的にヒト等の哺乳類に対して非毒性である。本発明の脂質粒子は、通常、平均径が約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約７０～約９０ｎｍである。本発明の脂質粒子はまた、通常、脂質：ｍＲＮＡ比（質量／質量比）が、約１：１～約１００：１、約１：１～約５０：１、約２：１～約２５：１、約３：１～約２０：１、約５：１～約１５：１、もしくは約５：１～約１０：１、もしくは約１０：１～約１４：１、または約９：１～約２０：１である。１つの実施形態では、本発明の脂質粒子は、脂質：ｍＲＮＡ比（質量／質量比）が、約１２：１、例えば１２：１である。別の実施形態では、本発明の脂質粒子は、脂質：ｍＲＮＡ比（質量／質量比）が約１３：１、例えば１３：１である。

【0178】

好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、血清安定性核酸－脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）であり、これは、ｍＲＮＡ、カチオン性脂質（例えば、本明細書に記載の１つ以上の式Ｉ～ＩＩＩのカチオン性脂質またはそれらの塩）、リン脂質、及び該粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、１つ以上のＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含む。該脂質粒子はまた、コレステロールを含むことができる。該ＳＮＡＬＰは、１つ以上のポリペプチドを発現する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の未修飾及び／または修飾ｍＲＮＡを含んでもよい。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，７５３，６１３号、第５，７８５，９９２号、第５，７０５，３８５号、第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，１１０，７４５号、及び第６，３２０，０１７号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号に記載されており、これらの開示は、各々、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0179】

本発明の核酸－脂質粒子において、該ｍＲＮＡは、該粒子の脂質部分内に完全に封入されてもよく、それにより、該核酸がヌクレアーゼ分解から保護される。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡを含むＳＮＡＬＰは、該粒子の脂質部分内に完全に封入され、それにより、該核酸がヌクレアーゼ分解から保護される。場合によっては、該ＳＮＡＬＰのｍＲＮＡは、該粒子をヌクレアーゼに対して３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間曝露した後、実質的に分解されない。他の特定の場合には、該ＳＮＡＬＰのｍＲＮＡは、該粒子を血清中、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分間または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間インキュベートした後、実質的に分解されない。他の実施形態では、該ｍＲＮＡは、該粒子の脂質部分と複合化される。本発明の製剤の利点の１つは、該核酸－脂質粒子組成物がヒト等の哺乳類に対して実質的に非毒性であるということである。

【0180】

「完全に封入された」という用語は、核酸－脂質粒子の核酸（ｍＲＮＡ）が、遊離のＲＮＡを著しく分解するであろう血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に大きく分解されないということを示す。完全に封入された系では、好ましくは、遊離の核酸を通常１００％分解するであろう処理において、該粒子の核酸の約２５％未満が分解され、より好ましくは該粒子の核酸の約１０％未満、最も好ましくは、約５％未満が分解される。「完全に封入された」はまた、該核酸－脂質粒子が血清安定性であること、すなわち、インビボ投与の際にそれらが急速にそれらの構成成分に分解されないことを示す。

【0181】

核酸との関連で、完全封入は、膜不透過性蛍光色素排除アッセイを行うことで決定され得る。これは、核酸と会合した場合に蛍光を増強する色素を用いる。特定の色素、例えば、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が、プラスミドＤＮＡ、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、及び／または一本鎖もしくは二本鎖リボヌクレオチドの定量に利用可能である。封入は、該色素をリポソーム製剤に添加し、得られる蛍光を測定し、これを少量の非イオン洗剤を添加した際に観察される蛍光と比較することによって決定される。洗剤によるリポソーム二重層の破壊で、封入された核酸が放出され、それが該膜不透過性色素と相互作用することが可能になる。核酸封入は、Ｅ＝（Ｉ_ｏ－Ｉ）／Ｉ_ｏとして計算することができる。ここで、Ｉ及びＩ_ｏは、洗剤の添加の前後の蛍光強度を指す（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：２７１－２８１（１９９９）参照）。

【0182】

他の実施形態では、本発明は、複数の核酸－脂質粒子を含む核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）組成物を提供する。

【0183】

いくつかの例では、該ＳＮＡＬＰ組成物は、当該粒子の約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約３０％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）が、その中に封入されたｍＲＮＡを有するように、該粒子の脂質部分内に完全に封入されるｍＲＮＡを含む。

【0184】

本発明の脂質粒子の使用目的に応じて、該成分の比率を変更することができ、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを用いて測定することができる。

【0185】

カチオン性脂質
任意の様々なカチオン性脂質またはそれらの塩は、単独で、または１つ以上の他のカチオン性脂質種もしくは非カチオン性脂質種と組み合わせてのいずれかで、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）に用いられ得る。該カチオン性脂質は、それらの（Ｒ）及び／または（Ｓ）エナンチオマーを含む。通常、該カチオン性脂質は、不飽和及び／または飽和炭化水素鎖を含む部分（すなわち、疎水性部分）を含む。

【0186】

１つの態様において、以下の構造を有する式Ｉのカチオン性脂質が本発明において有用である：

【化2】

またはその塩。式中、
Ｒ^１及びＲ^２は、同一または異なって、独立して、水素（Ｈ）または任意に置換されるＣ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、もしくはＣ_２－Ｃ_６アルキニルであるか、またはＲ^１及びＲ^２は、結合して、４～６個の炭素原子ならびに窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及びそれらの混合物からなる群から選択される１個もしくは２個のヘテロ原子の任意に置換されるヘテロ環式環を形成してもよく、
Ｒ^３は、存在しないか、または水素（Ｈ）もしくはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり４級アミンを与え、
Ｒ^４及びＲ^５は、同一または異なって、独立して、任意に置換されるＣ_１０－Ｃ_２４アルキル、Ｃ_１０－Ｃ_２４アルケニル、Ｃ_１０－Ｃ_２４アルキニル、またはＣ_１０－Ｃ_２４アシルであり、ここで、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも一方は、少なくとも２つの不飽和部位を含み、
ｎは、０、１、２、３、または４である。

【0187】

いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_４アルキル、Ｃ_２－Ｃ_４アルケニル、またはＣ_２－Ｃ_４アルキニルである。１つの好ましい実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、両方ともメチル基である。他の好ましい実施形態では、ｎは、１または２である。他の実施形態では、Ｒ^３は、ｐＨが該カチオン性脂質のｐＫ_ａより高い場合は存在せず、Ｒ^３は、ｐＨが該カチオン性脂質のｐＫ_ａより低い場合は、水素であり、従って該アミノ頭部基はプロトン化される。代替的な実施形態では、Ｒ^３は、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_４アルキルであり４級アミンを与える。さらなる実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、独立して、任意に置換されるＣ_１２－Ｃ_２０もしくはＣ_１４－Ｃ_２２アルキル、Ｃ_１２－Ｃ_２０もしくはＣ_１４－Ｃ_２２アルケニル、Ｃ_１２－Ｃ_２０もしくはＣ_１４－Ｃ_２２アルキニル、またはＣ_１２－Ｃ_２０もしくはＣ_１４－Ｃ_２２アシルであり、ここで、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも一方は、少なくとも２つの不飽和部位を含む。

【0188】

ある特定の実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、独立して、ドデカジエニル部分、テトラデカジエニル部分、ヘキサデカジエニル部分、オクタデカジエニル部分、イコサジエニル部分、ドデカトリエニル部分、テトラデカトリエニル部分、ヘキサデカトリエニル部分、オクタデカトリエニル部分、イコサトリエニル部分、アラキドニル部分、及びドコサヘキサエノイル部分、ならびにそれらのアシル誘導体（例えば、リノレオイル、リノレノイル、γ－リノレノイル等）からなる群から選択される。いくつかの例では、Ｒ^４及びＲ^５のうちの一方は、分岐アルキル基（例えば、フィタニル部分）またはそのアシル誘導体（例えば、フィタノイル部分）を含む。場合によっては、該オクタデカジエニル部分はリノレイル部分である。他のある特定の場合には、該オクタデカトリエニル部分はリノレニル部分またはγ－リノレニル部分である。ある特定の実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、両方ともリノレイル部分、リノレニル部分、またはγ－リノレニル部分である。特定の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－（Ｎ，Ｎ－ジメチル）－ブチル－４－アミン（Ｃ２－ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレオイルオキシ－（Ｎ，Ｎ－ジメチル）－ブチル－４－アミン（Ｃ２－ＤＬｉｎＤＡＰ）、またはそれらの混合物である。

【0189】

いくつかの実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、１つ以上のアニオンと塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、そのオキサレート（例えば、ヘミオキサレート）塩であり、これは、好ましくは結晶塩である。

【0190】

ＤＬｉｎＤＭＡ及びＤＬｅｎＤＭＡ等のカチオン性脂質ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、米国特許公開第２００６００８３７８０号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｃ２－ＤＬｉｎＤＭＡ及びＣ２－ＤＬｉｎＤＡＰ等のカチオン性脂質ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、国際特許出願第ＷＯ２０１１／０００１０６号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0191】

別の態様において、以下の構造を有する式ＩＩのカチオン性脂質（またはそれらの塩）が本発明において有用である：

【化3】

式中、Ｒ^１及びＲ^２は、同一または異なって、独立して、任意に置換されるＣ_１２－Ｃ_２４アルキル、Ｃ_１２－Ｃ_２４アルケニル、Ｃ_１２－Ｃ_２４アルキニル、またはＣ_１２－Ｃ_２４アシルであり、Ｒ^３及びＲ^４は、同一または異なって、独立して、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、もしくはＣ_２－Ｃ_６アルキニルであるか、または、Ｒ^３及びＲ^４は、結合して、４～６個の炭素原子ならびに窒素及び酸素から選択される１個もしくは２個のヘテロ原子の任意に置換されるヘテロ環式環を形成してもよく、Ｒ^５は、存在しないか、または水素（Ｈ）もしくはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり４級アミンを与え、ｍ、ｎ、及びｐは、同一または異なって、独立して、０、１、または２のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎ、及びｐは同時に０ではなく、ｑは、０、１、２、３、または４であり、Ｙ及びＺは、同一または異なって、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである。好ましい実施形態では、ｑは２である。

【0192】

いくつかの実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン、２，２－ジオレオイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン、２，２－ジステアロイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－モルホリノ－［１，３］－ジオキソラン、２，２－ジリノレイル－４－トリメチルアミノ－［１，３］－ジオキソランクロリド、２，２－ジリノレイル－４，５－ビス（ジメチルアミノメチル）－［１，３］－ジオキソラン、２，２－ジリノレイル－４－メチルピペラジン－［１，３］－ジオキソラン、またはそれらの混合物である。好ましい実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソランである。

【0193】

いくつかの実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、１つ以上のアニオンと塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、そのオキサレート（例えば、ヘミオキサレート）塩であり、これは、好ましくは結晶塩である。

【0194】

２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン等のカチオン性脂質、及びさらなるカチオン性脂質の合成は、その開示がすべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ０９／０８６５５８号、及びその開示がすべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１号、発明の名称“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”に記載されている。

【0195】

さらなる態様において、以下の構造を有する式ＩＩＩのカチオン性脂質が本発明において有用である：

【化4】

またはその塩。式中、Ｒ^１及びＲ^２は、同一または異なって、独立して、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、もしくはＣ_２－Ｃ_６アルキニルであるか、またはＲ^１及びＲ^２は、結合して、４～６個の炭素原子ならびに窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及びそれらの混合物からなる群から選択される１個もしくは２個のヘテロ原子の任意に置換されるヘテロ環式環を形成してもよく、Ｒ^３は、存在しないか、または水素（Ｈ）もしくはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり４級アミンを与え、Ｒ^４及びＲ^５は、存在しないまたは存在し、存在する場合は、同一または異なって、独立して、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２－Ｃ_１０アルケニルであり、ｎは、０、１、２、３、または４である。

【0196】

いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_４アルキル、Ｃ_２－Ｃ_４アルケニル、またはＣ_２－Ｃ_４アルキニルである。好ましい実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、両方ともメチル基である。別の好ましい実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、両方ともブチル基である。さらに別の好ましい実施形態では、ｎは１である。他の実施形態では、Ｒ^３は、ｐＨが該カチオン性脂質のｐＫ_ａより高い場合は存在せず、Ｒ^３は、ｐＨが該カチオン性脂質のｐＫ_ａより低い場合は、水素であり、従って該アミノ頭部基はプロトン化される。代替的な実施形態では、Ｒ^３は、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_４アルキルであり４級アミンを与える。さらなる実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、独立して、任意に置換されるＣ_２－Ｃ_６もしくはＣ_２－Ｃ_４アルキル、またはＣ_２－Ｃ_６もしくはＣ_２－Ｃ_４アルケニルである。

【0197】

代替的な実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、該アミノ頭部基と該アルキル鎖の一方または両方との間にエステル結合を含む。いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、１つ以上のアニオンと塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、そのオキサレート（例えば、ヘミオキサレート）塩であり、これは、好ましくは結晶塩である。

【0198】

式ＩＩＩのアルキル鎖の各々は、６位、９位、及び１２位にｃｉｓ二重結合を含む（すなわち、ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ－Δ^６，Δ^９，Δ^１２）が、代替的な実施形態では、一方または両方のアルキル鎖におけるこれらの二重結合の１つ、２つ、または３つは、ｔｒａｎｓ配置でもよい。

【0199】

１つの実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、構造

【化5】

を有する。

【0200】

γ－ＤＬｅｎＤＭＡ等のカチオン性脂質、及びさらなるカチオン性脂質の合成は、国際特許出願第ＷＯ２０１１／０００１０６号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0201】

特定の実施形態では、以下の構造を有するカチオン性脂質が本発明において有用である。

【化6】

【0202】

化合物７等のカチオン性脂質、及びさらなるカチオン性脂質の合成は、米国特許第８，１５８，６０１号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１１／０００７２３号に記載されており、それらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0203】

本発明の脂質粒子に含まれ得る他のカチオン性脂質またはそれらの塩の例としては、限定されないが、その開示がすべての目的のため参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０００１０６に記載のもの等のカチオン性脂質だけでなく、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチ－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジオエイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジミリストレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ）、ジリノレイルメチル－３－ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｋ－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－Ｍ－ＤＭＡとしても知られる）、及びそれらの混合物等のカチオン性脂質が挙げられる。本発明の脂質粒子に含まれ得るさらなるカチオン性脂質またはそれらの塩は、米国特許公開第２００９００２３６７３号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0204】

別の実施形態では、トリアルキルカチオン性脂質を用いて本明細書に記載の脂質粒子を調製することができる。かかるトリアルキルカチオン性脂質は、通常、各鎖に６個以上の炭素を有する飽和または不飽和炭化水素鎖を３個含む。本明細書に記載の組成物に組み込むことができるトリアルキルカチオン性脂質は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１２６８０３号に記載の通りに調製することができる。

【0205】

例えば、以下の式Ｂのトリアルキルカチオン性脂質を用いて本発明の脂質粒子を作製することができる：
Ｘ－Ａ－Ｙ－Ｚ
（式Ｂ）
またはその塩。式中、
Ｘは、－Ｎ（Ｈ）Ｒまたは－ＮＲ_２であり、
Ａは、存在しないか、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、またはＣ_２－Ｃ_６アルキニルであり、該Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、及びＣ_２－Ｃ_６アルキニルは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの各アルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、
Ｙは、存在しない、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ^ｂ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ｂ）－、－Ｎ（Ｒ^ｂ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、及び－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ｂ）－からなる群から選択され、
Ｚは、３つの鎖を含む疎水性部分であり、該鎖の各々は、Ｃ_８－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_８－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_８－Ｃ_１１アルキニルから独立して選択され、該Ｃ_８－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_８－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_８－Ｃ_１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの任意のアルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、
各Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの任意のアルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、
各Ｒ^ｂは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルである。

【0206】

いくつかの実施形態では、式ＢのＺは構造

【化7】

を有し、ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、及びＲ_３は、各々独立して、Ｃ_８－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_８－Ｃ_１１アルケニル、またはＣ_８－Ｃ_１１アルキニルであり、該Ｃ_８－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_８－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_８－Ｃ_１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの任意のアルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環である。

【0207】

別の実施形態では、以下の式Ｃのカチオン性脂質を用いて本発明の脂質粒子を作製する：
Ｘ－Ａ－Ｙ－Ｚ^１
（式Ｃ）
またはその塩。式中、
Ｘは、－Ｎ（Ｈ）Ｒまたは－ＮＲ_２であり、
Ａは、存在しないか、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、またはＣ_２－Ｃ_６アルキニルであり、該Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、及びＣ_２－Ｃ_６アルキニルは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの各アルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、
Ｙは、存在しない、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ^ｂ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ｂ）－、－Ｎ（Ｒ^ｂ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、及び－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ｂ）－からなる群から選択され、
Ｚ^１は、３つまたは４つのＲ^ｘ基で置換されるＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、ここで、各Ｒ^ｘは、Ｃ_６－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_６－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_６－Ｃ_１１アルキニルから独立して選択され、該Ｃ_６－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_６－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_６－Ｃ_１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの任意のアルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、
各Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの任意のアルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、
各Ｒ^ｂは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルである。

【0208】

いくつかの実施形態では、式ＣのＺ^１は、構造

【化8】

を有し、ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、及びＲ_３は、各々独立して、Ｃ_８－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_８－Ｃ_１１アルケニル、またはＣ_８－Ｃ_１１アルキニルであり、該Ｃ_８－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_８－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_８－Ｃ_１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの任意のアルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環である。

【0209】

いくつかの実施形態では、式ＣのＺ^１は、構造

【化9】

を有し、ここで、Ｒ^１ｚ及びＲ^２ｚの一方は、

【化10】

からなる群から選択され、
Ｒ^１ｚ及びＲ^２ｚの他方は、

【化11】

からなる群から選択され、
ここで、各Ｒ^３ｚ、Ｒ^４ｚ、Ｒ^５ｚ、Ｒ^６ｚ、及びＲ^７ｚは、Ｃ_６－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_６－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_６－Ｃ_１１アルキニルから独立して選択され、該Ｃ_６－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_６－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_６－Ｃ_１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの任意のアルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環である。

【0210】

いくつかの実施形態では、式ＣのＺ^１は、構造

【化12】

を有し、ここで、各Ｒ^３ｚ、Ｒ^４ｚ、Ｒ^５ｚ、及びＲ^６ｚは、Ｃ_６－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_６－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_６－Ｃ_１１アルキニルから独立して選択され、該Ｃ_６－Ｃ_１１アルキル、Ｃ_６－Ｃ_１１アルケニル、及びＣ_６－Ｃ_１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲ^ｘ、－ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、－ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、－ＳＯ_ｎＲ^ｘ、及び－ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換され、ここで、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの任意のアルキル及びヘテロ環は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲ^ｘ’、ヘテロ環、－ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ’、－ＮＲ^ｘ’ＳＯ_２Ｒ^ｙ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’、－ＳＯ_ｎ’Ｒ^ｘ’、及び－ＳＯ_ｎ’ＮＲ^ｘ’Ｒ^ｙ’から独立して選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよく、ここで、ｎ’は、０、１、または２であり、Ｒ^ｘ’及びＲ^ｙ’は、各々独立して、水素、アルキル、またはヘテロ環である。

【0211】

いくつかの実施形態では、該カチオン性脂質は、

【化13】

ならびにそれらの塩からなる群から選択される。

【0212】

ＣＬｉｎＤＭＡ等のカチオン性脂質及びさらなるカチオン性脂質の合成は、米国特許公開第２００６０２４０５５４号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＣ、ＤＬｉｎＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、及びＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／０８６５５８号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＯ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ等のカチオン性脂質及びさらなるカチオン性脂質の合成は、２００９年１０月９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１号、発明の名称“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。多くの他のカチオン性脂質及び関連する類似体の合成は、米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号、第５，２８３，１８５号、第５，７５３，６１３号、及び第５，７８５，９９２号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９０号に記載されており、それらの開示は各々、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、多くの市販のカチオン性脂質製剤、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能）、ならびにＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ＤＯＧＳを含む。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．より入手可能）を用いることができる。

【0213】

いくつかの実施形態では、該カチオン性脂質は、当該粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、もしくは約５５ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成する。特定の実施形態では、該カチオン性脂質は、当該粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％、５１ｍｏｌ％、５２ｍｏｌ％、５３ｍｏｌ％、５４ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、５６ｍｏｌ％、５７ｍｏｌ％、５８ｍｏｌ％、５９ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、６１ｍｏｌ％、６２ｍｏｌ％、６３ｍｏｌ％、６４ｍｏｌ％、もしくは６５ｍｏｌ％（またはその任意の分数）を構成する。

【0214】

他の実施形態では、該カチオン性脂質は、当該粒子に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、もしくは約４０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成する。

【0215】

本発明の脂質粒子における使用に適したカチオン性脂質のさらなる割合及び範囲は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／１２７０６０号、米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７１２０８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０００１０６号、及び米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７６３３５号に記載されており、これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらのすべてが本明細書に組み込まれる。

【0216】

本発明の脂質粒子に存在するカチオン性脂質の割合は、目標量であり、製剤中に存在するカチオン性脂質の実際の量は、例えば、±５ｍｏｌ％変動し得ることを理解されたい。例えば、１：５７脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）製剤では、カチオン性脂質の目標量は５７．１ｍｏｌ％であるが、カチオン性脂質の実際の量は、その目標量の±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％でよく、当該製剤の残部は、他の脂質成分で構成される（合計で粒子に存在する全脂質の１００ｍｏｌ％になる）。

【0217】

非限定的な例として、カチオン性脂質は、以下の化合物を含む。

【化14】

【化15】

【化16】

【化17】

【化18】

【0218】

非カチオン性脂質
本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）に使用される非カチオン性脂質は、安定な複合体を生成することが可能な様々な中性非荷電、双性イオン性、またはアニオン性脂質のいずれかでよい。

【0219】

非カチオン性脂質の非限定的な例としては、リン脂質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用することができる。これらの脂質のアシル基は、好ましくはＣ_１０－Ｃ_２４炭素鎖を有する脂肪酸から誘導されるアシル基、例えばラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。

【0220】

非カチオン性脂質のさらなる例としては、ステロール、例えば、コレステロール及びその誘導体が挙げられる。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、極性類似体、例えば、５α－コレスタノール、５β－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノール、非極性類似体、例えば、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５β－コレスタノン、及びコレステリルデカノエート、ならびにそれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、該コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル等の極性類似体である。コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテルの合成は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／１２７０６０号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0221】

いくつかの実施形態では、該脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質及びコレステロールまたはその誘導体の混合物を含む、またはそれからなる。他の実施形態では、該脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質、例えば、コレステロールを含まない脂質粒子製剤を含む、またはそれからなる。さらに他の実施形態では、該脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）に存在する非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、リン脂質を含まない脂質粒子製剤を含むか、またはそれからなる。

【0222】

本発明における使用に適した非カチオン性脂質の他の例としては、無リンの脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレアート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン－ラウリルスルフェート、アルキル－アリールスルフェートポリエチルオキシレート化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリン等が挙げられる。

【0223】

いくつかの実施形態では、該非カチオン性脂質は、当該粒子に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％～約４２ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％、もしくは４５ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成する。

【0224】

該脂質粒子がリン脂質及びコレステロールまたはコレステロール誘導体の混合物を含む実施形態では、該混合物は、該粒子に存在する全脂質の最大約４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％を構成し得る。

【0225】

いくつかの実施形態では、該混合物の該リン脂質成分は、当該粒子に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、もしくは約４ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成し得る。ある特定の好ましい実施形態では、該混合物の該リン脂質成分は、当該粒子に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成する。非限定的な例として、リン脂質及びコレステロールの混合物を含む１：５７脂質粒子製剤は、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を、約７ｍｏｌ％（またはその任意の分数）で、例えば、該粒子に存在する全脂質の約３４ｍｏｌ％（またはその任意の分数）でのコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物中に含み得る。別の非限定的な例として、リン脂質及びコレステロールの混合物を含む７：５４脂質粒子製剤は、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を約７ｍｏｌ％（またはその任意の分数）で、例えば、該粒子に存在する全脂質の約３２ｍｏｌ％（またはその任意の分数）でのコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物中に含み得る。

【0226】

他の実施形態では、該混合物の該コレステロール成分は、当該粒子に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％～約３７ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、もしくは約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成し得る。ある特定の好ましい実施形態では、該混合物の該コレステロール成分は、当該粒子に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３４ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％～約３３ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、もしくは３５ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成する。通常、リン脂質及びコレステロールの混合物を含む１：５７脂質粒子製剤は、コレステロールまたはコレステロール誘導体を約３４ｍｏｌ％（またはその任意の分数）で、例えば、該粒子に存在する全脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の分数）でのＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質との混合物中に含み得る。通常、リン脂質及びコレステロールの混合物を含む７：５４脂質粒子製剤は、コレステロールまたはコレステロール誘導体を約３２ｍｏｌ％（またはその任意の分数）で、例えば、該粒子に存在する全脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の分数）でのＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質との混合物中に含み得る。

【0227】

該脂質粒子がリン脂質を含まない実施形態では、該コレステロールまたはその誘導体は、該粒子に存在する全脂質の最大約２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％を構成し得る。

【0228】

いくつかの実施形態では、該リン脂質を含まない脂質粒子製剤における該コレステロールまたはその誘導体は、該粒子に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％～約３９ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％～約３８ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％～約３７ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、もしくは４０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成し得る。非限定的な例として、１：６２脂質粒子製剤は、該粒子に存在する全脂質の約３７ｍｏｌ％（またはその任意の分数）でコレステロールを含み得る。別の非限定的な例として、７：５８脂質粒子製剤は、該粒子に存在する全脂質の約３５ｍｏｌ％（またはその任意の分数）でコレステロールを含み得る。

【0229】

他の実施形態では、該非カチオン性脂質は、当該粒子に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質のみ）、もしくは約６０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質及びコレステロールまたはその誘導体）（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成する。

【0230】

本発明の脂質粒子における使用に適した非カチオン性脂質のさらなる割合及び範囲は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／１２７０６０号、米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７１２０８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０００１０６号、及び米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７６３３５号に記載されており、これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0231】

本発明の脂質粒子に存在する非カチオン性脂質の割合は、目標量であり、製剤中に存在する非カチオン性脂質の実際の量は、例えば、±５ｍｏｌ％変動し得ることを理解されたい。例えば、１：５７脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）製剤では、リン脂質の目標量は７．１ｍｏｌ％であり、コレステロールの目標量は３４．３ｍｏｌ％であるが、リン脂質の実際の量は、その目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％でよく、また、コレステロールの実際の量は、その目標量の±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％でよく、当該製剤の残部は、他の脂質成分で構成される（合計で粒子に存在する全脂質の１００ｍｏｌ％になる）。同様に、７：５４脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）製剤では、リン脂質の目標量は６．７５ｍｏｌ％であり、コレステロールの目標量は３２．４３ｍｏｌ％であるが、リン脂質の実際の量は、その目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％でよく、コレステロールの実際の量は、その目標量の±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％でよく、当該製剤の残部は、他の脂質成分で構成される（合計で粒子に存在する全脂質の１００ｍｏｌ％になる）。

【0232】

脂質コンジュゲート
カチオン性脂質及び非カチオン性脂質に加えて、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、さらに脂質コンジュゲートを含んでよい。この複合脂質は、粒子の凝集を防ぐという点において有用である。適切な複合脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ＰＯＺ－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー－脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）、及びそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、該粒子は、ＣＰＬとともにＰＥＧ－脂質コンジュゲートまたはＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートのいずれかを含む。

【0233】

好ましい実施形態では、該脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－脂質である。ＰＥＧ－脂質の例としては、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０２６３７２号に記載のジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＡ）、例えば、米国特許公開第２００３００７７８２９号及び第２００５００８６８９号に記載のジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質に結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＰＥ）、例えば、米国特許第５，８８５，６１３号に記載のセラミドに結合したＰＥＧ、コレステロールまたはその誘導体に結合したＰＥＧ、ならびにそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。これらの特許文献の開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したさらなるＰＥＧ－脂質としては、制限なく、ｍＰＥＧ２０００－１，２－ジ－Ｏ－アルキル－ｓｎ３－カルバモイルグリセリド（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）が挙げられる。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧの合成は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／０８６５５８号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに追加の適切なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、制限なく、１－［８’－（１，２－ジミリストイル－３－プロパノキシ）－カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－ω－メチル－ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ－ＤＭＧ）が挙げられる。２ＫＰＥＧ－ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0234】

ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を備えたエチレンＰＥＧ繰り返し単位の線状水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、分子量によって分類される。例えば、ＰＥＧ２０００は、平均分子量約２，０００ダルトンを有し、ＰＥＧ５０００は、平均分子量約５，０００ダルトンを有する。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．及び他の会社から市販されており、以下のもの、すなわち、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ－ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－アミン（ＭｅＰＥＧ－ＮＨ_２）、モノメトキシポリエチレングリコール－トレシレート（ＭｅＰＥＧ－ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－イミダゾリル－カルボニル（ＭｅＰＥＧ－ＩＭ）、及び末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシル基を含むかかる化合物（例えば、ＨＯ－ＰＥＧ－Ｓ、ＨＯ－ＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ、ＨＯ－ＰＥＧ－ＮＨ_２等）を含むがこれらに限定されない。他のＰＥＧ、例えば、米国特許第６，７７４，１８０号及び第７，０５３，１５０号に記載されているもの（例えば、ｍＰＥＧ（２０ＫＤａ）アミン）もまた、本発明のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを調製するのに有用である。これら特許の開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール－酢酸（ＭｅＰＥＧ－ＣＨ_２ＣＯＯＨ）は、例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートを含めたＰＥＧ－脂質コンジュゲートの調製に特に有用である。

【0235】

本明細書に記載のＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンに及ぶ平均分子量を含み得る。場合によっては、該ＰＥＧ部分は、約７５０ダルトン～約５，０００ダルトンに及ぶ平均分子量を有する（例えば、約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約２，０００ダルトン等）。好ましい実施形態では、該ＰＥＧ部分は、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。

【0236】

場合によっては、該ＰＥＧは、任意に、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基で置換することができる。該ＰＥＧは、脂質に直接複合化することができ、リンカー部分を介して脂質に結合してもよい。ＰＥＧを脂質に結合させるのに適した任意のリンカー部分を使用することができ、例えば、エステルを含まないリンカー部分及びエステルを含むリンカー部分等である。好ましい実施形態では、該リンカー部分は、エステルを含まないリンカー部分である。本明細書で使用される「エステルを含まないリンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル結合（－ＯＣ（Ｏ）－）を含まないリンカー部分を指す。適切なエステルを含まないリンカー部分としては、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、アミノ（－ＮＲ－）、カルボニル（－Ｃ（Ｏ）－）、カルバメート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、スクシニル（－（Ｏ）ＣＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－）、スクシンアミジル（－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、エーテル、ジスルフィド、ならびにそれらの組み合わせ（カルバメートリンカー部分及びアミドリンカー部分を両方含むリンカー等）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、カルバメートリンカーを用いて該ＰＥＧを該脂質に結合させる。

【0237】

他の実施形態では、エステルを含むリンカー部分を用いて該ＰＥＧを該脂質に結合させる。適切なエステルを含むリンカー部分としては、例えば、カーボネート（－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－）、スクシノイル、ホスフェートエステル（－Ｏ－（Ｏ）ＰＯＨ－Ｏ－）、スルホネートエステル、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0238】

各種鎖長及び飽和度の、様々なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンをＰＥＧに結合させて脂質コンジュゲートを形成することができる。かかるホスファチジルエタノールアミンは、市販されているか、または、当業者に既知の従来の技術を用いて単離もしくは合成することができる。炭素鎖長がＣ_１０～Ｃ_２０の範囲の飽和または不飽和脂肪酸を含むホスファチジル－エタノールアミンが好ましい。モノまたはジ不飽和脂肪酸ならびに飽和及び不飽和脂肪酸の混合物のホスファチジルエタノールアミンもまた使用することができる。適切なホスファチジルエタノールアミンとしては、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0239】

「ＡＴＴＡ」または「ポリアミド」という用語には、制限なく、米国特許第６，３２０，０１７号及び第６，５８６，５５９号に記載の化合物が含まれる。これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの化合物には、式

【化19】

を有する化合物が含まれ、式中、Ｒは、水素、アルキル、及びアシルからなる群から選択される成員であり、Ｒ^１は、水素及びアルキルからなる群から選択される成員であるか、または、任意に、Ｒ及びＲ^１ならびにそれらが結合する窒素は、アジド部分を形成し、Ｒ^２は、水素、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアリール、及びアミノ酸の側鎖から選択される群の成員であり、Ｒ^３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノ、及びＮＲ^４Ｒ^５からなる群から選択される成員であり、ここで、Ｒ^４及びＲ^５は、独立して、水素またはアルキルであり、ｎは、４～８０であり、ｍは、２～６であり、ｐは、１～４であり、ｑは、０または１である。当業者には、他のポリアミドを本発明の化合物に用いることができることは明らかであろう。

【0240】

「ジアシルグリセロール」または「ＤＡＧ」という用語には、両方が独立して、グリセロールの１及び２位にエステル結合によって結合した２～３０個の炭素を有する２つの脂肪族アシル鎖であるＲ^１及びＲ^２を有する化合物が含まれる。これらのアシル基は、飽和でも、様々な不飽和度を有していてもよい。適切なアシル基としては、ラウロイル（Ｃ_１２）、ミリストイル（Ｃ_１４）、パルミトイル（Ｃ_１６）、ステアロイル（Ｃ_１８）、及びイコソイル（Ｃ_２０）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は同じであり、すなわち、Ｒ^１及びＲ^２は、ともにミリストイル（すなわち、ジミリストイル）であり、Ｒ^１及びＲ^２は、ともにステアロイル（すなわち、ジステアロイル）等である。ジアシルグリセロールは、以下の一般式を有する。

【化20】

【0241】

「ジアルキルオキシプロピル」または「ＤＡＡ」という用語には、両方が独立して２～３０個の炭素を有する２つのアルキル鎖であるＲ^１及びＲ^２を有する化合物が含まれる。これらのアルキル基は、飽和でも、様々な不飽和度を有していてもよい。ジアルキルオキシプロピルは、以下の一般式を有する。

【化21】

【0242】

好ましい実施形態では、該ＰＥＧ－脂質は、以下の式

【化22】

を有するＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートであり、式中、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して選択され、約１０～約２２個の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり、Ｌは、上記のエステルを含まないリンカー部分またはエステルを含むリンカー部分である。これら長鎖アルキル基は飽和でも不飽和でもよい。適切なアルキル基としては、デシル（Ｃ_１０）、ラウリル（Ｃ_１２）、ミリスチル（Ｃ_１４）、パルミチル（Ｃ_１６）、ステアリル（Ｃ_１８）、及びイコシル（Ｃ_２０）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は同じであり、すなわち、Ｒ^１及びＲ^２は、ともにミリスチル（すなわち、ジミリスチル）であり、Ｒ^１及びＲ^２は、ともにステアリル（すなわち、ジステアリル）等である。

【0243】

上記式ＶＩＩにおいて、該ＰＥＧは約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンに及ぶ平均分子量を有する。場合によっては、該ＰＥＧは、約７５０ダルトン～約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、該ＰＥＧは、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。該ＰＥＧは、任意に、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基で置換することができる。ある特定の実施形態では、該末端ヒドロキシル基は、メトキシまたはメチル基で置換される。

【0244】

好ましい実施形態では、「Ｌ」は、エステルを含まないリンカー部分である。適切なエステルを含まないリンカーとしては、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、該エステルを含まないリンカー部分は、カルバメートリンカー部分である（すなわち、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＡＡコンジュゲート）。別の好ましい実施形態では、該エステルを含まないリンカー部分は、アミドリンカー部分である（すなわち、ＰＥＧ－Ａ－ＤＡＡコンジュゲート）。さらに別の好ましい実施形態では、該エステルを含まないリンカー部分は、スクシンアミジルリンカー部分である（すなわち、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＡコンジュゲート）。

【0245】

特定の実施形態では、該ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、

【化23】

から選択される。

【0246】

該ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、当業者に既知の標準的な技術及び試薬を用いて合成される。該ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、様々なアミド、アミン、エーテル、チオ、カルバメート、及び尿素結合を含むことが認識されよう。当業者には、これらの結合を形成する方法及び試薬は周知であり、容易に利用可能であることが認識されよう。例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｗｉｌｅｙ １９９２）、Ｌａｒｏｃｋ，ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ（ＶＣＨ １９８９）、及びＦｕｒｎｉｓｓ，ＶＯＧＥＬ’Ｓ ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，５ｔｈ ｅｄ．（Ｌｏｎｇｍａｎ １９８９）を参照されたい。また、含まれる任意の官能基が、該ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートの合成の異なる点で保護及び脱保護を必要とし得ることが理解されよう。当業者には、かかる技術が周知であることが認識されよう。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｗｉｌｅｙ １９９１）を参照されたい。

【0247】

好ましくは、該ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ_１０）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ_１２）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ_１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ_１６）コンジュゲート、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ_１８）コンジュゲートである。これらの実施形態では、該ＰＥＧは、好ましくは、約７５０または約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。１つの特定の好ましい実施形態では、該ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡを含み、ここで、「２０００」は、該ＰＥＧの平均分子量を表し、「Ｃ」は、カルバメートリンカー部分を表し、「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを表す。別の特に好ましい実施形態では、該ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ７５０－Ｃ－ＤＭＡを含み、ここで、「７５０」は、該ＰＥＧの平均分子量を表し、「Ｃ」は、カルバメートリンカー部分を表し、「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを表す。特定の実施形態では、該ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、メチル基で置換される。当業者には、他のジアルキルオキシプロピルを本発明のＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートに使用できることが容易に理解されよう。

【0248】

上記に加えて、当業者には、他の親水性ポリマーをＰＥＧの代わりに用いることができることが容易に明らかであろう。ＰＥＧの代わりに用いることができる適切なポリマーの例としては、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド及びポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ならびにヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが挙げられるがこれらに限定されない。

【0249】

上記成分に加えて、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、さらに、カチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質またはＣＰＬを含むことができる（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１１：４３３－４３７（２０００）、米国特許第６，８５２，３３４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／６２８１３号参照、これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。

【0250】

適切なＣＰＬとしては、式ＶＩＩＩ
Ａ－Ｗ－Ｙ（ＶＩＩＩ）
の化合物が挙げられ、式中、Ａ、Ｗ、及びＹは以下に記載の通りである。

【0251】

式ＶＩＩＩに関して、「Ａ」は、脂質アンカーとして作用する両親媒性脂質、中性脂質、または疎水性脂質等の脂質部分である。適切な脂質の例としては、ジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、及び１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが挙げられるがこれらに限定されない。

【0252】

「Ｗ」は、ポリマーまたはオリゴマー、例えば、親水性ポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、該親水性ポリマーは、非免疫原性であるか、または固有の免疫原性が低い生体適合性のポリマーである。代替的に、該親水性ポリマーは、適切なアジュバントとともに使用された場合に弱抗原性であり得る。適切な非免疫原性ポリマーとしては、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、該ポリマーは、約２５０～約７，０００ダルトンの分子量を有する。

【0253】

「Ｙ」は、ポリカチオン性部分である。ポリカチオン性部分という用語は、選択されたｐＨ、好ましくは生理的ｐＨで正電荷、好ましくは少なくとも２つの正電荷を有する化合物、誘導体、または官能基を指す。適切なポリカチオン性部分としては、塩基性アミノ酸及びそれらの誘導体、例えば、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、及びヒスチジン、スペルミン、スペルミジン、カチオン性デンドリマー、ポリアミン、ポリアミン糖、ならびにアミノ多糖が挙げられる。該ポリカチオン性部分は、構造が線状、例えば、線状テトラリシン、分岐、またはデンドリマーであり得る。ポリカチオン性部分は、約２～約１５個の正電荷、好ましくは、約２～約１２個の正電荷、より好ましくは約２～約８個の正電荷を選択されたｐＨ値で有する。どのポリカチオン性部分を使用するかの選択は、所望の粒子用途の種類によって決定され得る。

【0254】

該ポリカチオン性部分の電荷は、粒子部分全体の至る所に分布していてもよく、代替的に、該粒子部分の１つの特定の領域での個別の集中電荷密度、例えば、電荷スパイクでもよい。該電荷密度が粒子に分布している場合、該電荷密度は、均等に分布していても不均等に分布していてもよい。該ポリカチオン性部分の電荷分布のすべての変形が本発明によって包含される。

【0255】

脂質「Ａ」及び非免疫原性ポリマー「Ｗ」は、様々な方法で、好ましくは共有結合により結合することができる。当業者に既知の方法を「Ａ」及び「Ｗ」の共有結合のために用いることができる。適切な結合としては、アミド、アミン、カルボキシル、カーボネート、カルバメート、エステル、及びヒドラゾン結合が挙げられるがこれらに限定されない。当業者には、該結合を生じさせるためには、「Ａ」及び「Ｗ」が相補的官能基を有する必要があることが明らかであろう。これら２つの基、すなわち、１つは脂質上及び他方はポリマー上の反応が所望の結合をもたらす。例えば、該脂質がジアシルグリセロールであり、末端ヒドロキシルが、例えば、ＮＨＳ及びＤＣＣで活性化されて活性エステルが形成され、その後アミノ基を含むポリマー、例えば、ポリアミドと反応した場合（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号及び第６，５８６，５５９号参照。これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、アミド結合がこれら２つの基の間に生じる。

【0256】

場合によっては、該ポリカチオン性部分は、リガンド、例えば、標的リガンドやカルシウムを錯化するためのキレート化部分が結合していてもよい。好ましくは、リガンドが結合した後、該カチオン性部分は、正電荷を維持する。場合によっては、結合しているリガンドは、正電荷を有する。適切なリガンドとしては、限定されないが、反応性官能基を有する化合物または装置が挙げられ、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生体親和性化合物、生体材料、バイオポリマー、生物医学装置、分析的に検出可能な化合物、治療的に活性な化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫促進剤、放射性標識、蛍光物質、ビオチン、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他の標的化部分、または毒素が挙げられる。

【0257】

いくつかの実施形態では、該脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）は、当該粒子に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、もしくは約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成する。

【0258】

他の実施形態では、該脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）は、当該粒子に存在する全脂質の約０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約１８ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、もしくは約２ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成する。

【0259】

さらなる実施形態では、該脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）は、当該粒子に存在する全脂質の約４ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）を構成する。

【0260】

本発明の脂質粒子における使用に適した脂質コンジュゲートのさらなる割合及び範囲は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／１２７０６０号、米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７１２０８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０００１０６号、及び米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７６３３５号に記載されており、これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらのすべてが本明細書に組み込まれる。

【0261】

本発明の脂質粒子に存在する脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）の割合は、目標量であり、製剤中に存在する脂質コンジュゲートの実際の量は、例えば、±２ｍｏｌ％変動し得ることを理解されたい。例えば、１：５７脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）製剤では、脂質コンジュゲートの目標量は１．４ｍｏｌ％であるが、脂質コンジュゲートの実際の量は、その目標量の±０．５ｍｏｌ％、±０．４ｍｏｌ％、±０．３ｍｏｌ％、±０．２ｍｏｌ％、±０．１ｍｏｌ％、または±０．０５ｍｏｌ％でよく、当該製剤の残部は、他の脂質成分で構成される（合計で粒子に存在する全脂質の１００ｍｏｌ％になる）。同様に、７：５４脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）製剤では、脂質コンジュゲートの目標量は６．７６ｍｏｌ％であるが、脂質コンジュゲートの実際の量は、その目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％でよく、当該製剤の残部は、他の脂質成分で構成される（合計で粒子に存在する全脂質の１００ｍｏｌ％になる）。

【0262】

当業者には、該脂質コンジュゲートの濃度は、使用される脂質コンジュゲートに応じて、及び当該脂質粒子が融合性になる率に応じて変動し得ることが理解されよう。

【0263】

該脂質コンジュゲートの組成及び濃度を制御することにより、該脂質コンジュゲートが当該脂質粒子の外で交換する率、ひいては、該脂質粒子が融合性になる率を制御することができる。例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートが脂質コンジュゲートとして使用された場合、当該脂質粒子が融合性になる率は、例えば、該脂質コンジュゲートの濃度を変えることによって、ＰＥＧの分子量を変えることによって、または、該ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートのアルキル基の鎖長及び飽和度を変えることによって変動し得る。さらに、例えば、ｐＨ、温度、イオン強度等を含めた他の変数を用いて、脂質粒子が融合性になる率を変えること及び／または制御することができる。脂質粒子が融合性になる率を制御するために使用することができる他の方法は、当業者には、本開示を読んだ上で明らかになるであろう。また、該脂質コンジュゲートの組成及び濃度を制御することによって、当該脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）のサイズを制御することができる。

【0264】

脂質粒子の調製
本発明の脂質粒子、例えば、ＳＮＡＬＰは、その中でｍＲＮＡが該粒子の脂質部分に取り込まれて分解から保護されており、これらに限定されないが、連続混合法、直接希釈法、及びインライン希釈法を含めた当技術分野で既知の任意の方法で形成することができる。

【0265】

ある特定の実施形態では、本発明は、連続混合法、例えば、第一の容器に核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む水溶液を準備すること、第二の容器に有機脂質溶液を準備すること（ここでは、該有機脂質溶液に含まれる脂質は、有機溶媒、例えば、エタノール等の低級アルカノールに可溶化される）、及び該水溶液を該有機脂質溶液と混合することを含み、それにより、該有機脂質溶液が該水溶液と混ざり、実質的に即座に脂質小胞（例えば、リポソーム）を生成し、該脂質小胞内に該核酸を封入する工程を介して生成される核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。この工程及びこの工程を行うための装置は、米国特許公開第２００４０１４２０２５号に詳細に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0266】

脂質溶液及び緩衝液を混合環境、例えば、混合チャンバーに連続的に導入するという行為が、該脂質溶液の該緩衝液での連続希釈を引き起こし、それにより、混合後実質的に即座に脂質小胞が生成する。本明細書で使用される、「脂質溶液を緩衝液で連続的に希釈する」という表現（及びその変形）は、概して、該脂質溶液が、小胞生成を達成するのに十分な力で、水和過程で十分急速に希釈されることを意味する。核酸を含む該水溶液を該有機脂質溶液と混合することにより、該有機脂質溶液は、該緩衝液（すなわち、水溶液）の存在下で連続的な段階的希釈を受け、核酸－脂質粒子を生成する。

【0267】

該連続混合法を用いて形成された核酸－脂質粒子は、通常、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ未満、１１０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、もしくは８０ｎｍ未満、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍ（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）のサイズを有する。このようにして形成される粒子は、凝集せず、均一な粒径を達成するために任意に分類される。

【0268】

別の実施形態では、本発明は、直接希釈法を介して生成される核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供する。この方法は、脂質小胞（例えば、リポソーム）溶液を形成し、直ちに直接この脂質小胞溶液を、調節された量の希釈用緩衝液を含む収集容器に導入することを含む。好ましい態様において、該収集容器は、該収集容器の内容物を攪拌して希釈を容易にするように構成された１つ以上の要素を含む。１つの態様において、該収集容器に含まれる希釈用緩衝液の量は、そこに導入される脂質小胞溶液の体積と実質的に等しい。非限定的な例として、４５％エタノール中の脂質小胞溶液が、同量の希釈用緩衝液を含む収集容器に導入された場合、より小さい粒子を有利に生じるであろう

【0269】

さらに別の実施形態では、本発明は、インライン希釈法を介して生成される核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）を提供し、ここでは、希釈用緩衝液を含む第三の容器が第二の混合領域と流動的に連結されている。この実施形態では、第一の混合領域で生成された脂質小胞（例えば、リポソーム）溶液は、直ちに直接第二の混合領域で希釈用緩衝液と混合される。好ましい態様において、該第二の混合領域は、該脂質小胞溶液の流れと該希釈用緩衝液の流れが対抗する１８０°の流れとして合流するように配置されたＴ字型コネクタを含むが、より浅い角度、例えば、約２７°～約１８０°（例えば、約９０°）を与えるコネクタを用いてもよい。ポンプ機構が、該第二の混合領域への制御可能な緩衝液の流れを供給する。１つの態様において、該第二の混合領域に提供される希釈用緩衝液の流量は、第一の混合領域からそこに導入される脂質小胞溶液の流量と実質的に等しくなるように制御される。この実施形態は、有利には、第二の混合領域における希釈用緩衝液の流れと脂質小胞溶液の混合を、ひいては、緩衝液中の脂質小胞溶液の濃度もまた、第二の混合過程を通してさらに制御することを可能にする。希釈用緩衝液の流量のかかる制御は、低濃度での小粒径形成を有利に可能にする。

【0270】

これらの方法ならびにこれら直接希釈法及びインライン希釈法を行うための装置は、米国特許公開第２００７００４２０３１号に詳細に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0271】

該直接希釈法及びインライン希釈法を用いて形成される核酸－脂質粒子は、通常、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ未満、１１０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、もしくは８０ｎｍ未満、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍ（またはその任意の分数もしくはその中の範囲）のサイズを有する。このようにして形成される粒子は、凝集せず、均一な粒径を達成するために任意に分類される。

【0272】

必要に応じて、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、リポソームの分類に利用可能ないずれかの方法によって分類することができる。分類を行い、所望のサイズ範囲及び比較的狭い粒径分布を得てもよい。

【0273】

粒子を所望のサイズに分類するためにいくつかの技術が利用可能である。リポソームに使用され、本発明の粒子に等しく適用可能な１つの分類方法が米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。浴またはプローブのいずれかによる超音波処理で粒子懸濁液を超音波処理することで、約５０ｎｍ未満のサイズの粒子へのサイズの漸減が生じる。ホモジナイズは別の方法であり、これは、大きな粒子を小さい粒子に砕くためのせん断エネルギーに依存している。通常のホモジナイズ手順では、選択された粒径、通常は約６０～約８０ｎｍが認められるまで、粒子を標準的なエマルションホモジナイザーを通して再循環させる。どちらの方法でも、粒径分布は従来のレーザービーム粒径識別、またはＱＥＬＳで観察することができる。

【0274】

小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通す粒子の押し出しもまた、粒径を比較的明確な粒径分布に減少させるための有効な方法である。通常、所望の粒径分布が達成されるまで、この膜を通して懸濁液を１回以上循環させる。粒子を連続してより小孔の膜を通して押し出し、段階的なサイズの減少を達成してもよい。

【0275】

他の実施形態では、これらの方法はさらに、本発明の組成物を用いて細胞のリポフェクションをもたらすのに有用な非脂質ポリカチオンを加えることを含む場合がある。適切な非脂質ポリカチオンの例としては、ヘキサジメトリンブロミド（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡからＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）のブランド名で販売されている。）またはヘキサジメトリンの他の塩が挙げられる。他の適切なポリカチオンとしては、例えば、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ポリアリルアミン、及びポリエチレンイミンの塩が挙げられる。これらの塩の添加は、好ましくは粒子が形成された後である。

【0276】

いくつかの実施形態では、形成される核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）における核酸対脂質比（質量／質量比）は、約０．０１～約０．２、約０．０５～約０．２、約０．０２～約０．１、約０．０３～約０．１、または約０．０１～約０．０８に及ぶ。出発物質（投入量）の比もまたこの範囲内である。他の実施形態では、該粒子調製は、約４００μｇの核酸を全脂質１０ｍｇ当たり使用するか、または、核酸対脂質の質量比は、約０．０１～約０．０８、より好ましくは、約０．０４であり、これは、５０μｇの核酸につき全脂質１．２５ｍｇに相当する。他の好ましい実施形態では、該粒子は、核酸：脂質の質量比が約０．０８である。

【0277】

他の実施形態では、形成される核酸－脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）における脂質対核酸比（質量／質量比）は、約１（１：１）～約１００（１００：１）、約５（５：１）～約１００（１００：１）、約１（１：１）～約５０（５０：１）、約２（２：１）～約５０（５０：１）、約３（３：１）～約５０（５０：１）、約４（４：１）～約５０（５０：１）、約５（５：１）～約５０（５０：１）、約１（１：１）～約２５（２５：１）、約２（２：１）～約２５（２５：１）、約３（３：１）～約２５（２５：１）、約４（４：１）～約２５（２５：１）、約５（５：１）～約２５（２５：１）、約５（５：１）～約２０（２０：１）、約５（５：１）～約１５（１５：１）、約５（５：１）～約１０（１０：１）、または約５（５：１）、６（６：１）、７（７：１）、８（８：１）、９（９：１）、１０（１０：１）、１１（１１：１）、１２（１２：１）、１３（１３：１）、１４（１４：１）、１５（１５：１）、１６（１６：１）、１７（１７：１）、１８（１８：１）、１９（１９：１）、２０（２０：１）、２１（２１：１）、２２（２２：１）、２３（２３：１）、２４（２４：１）、もしくは２５（２５：１）、またはその任意の分数もしくはその中の範囲に及ぶ。出発物質（投入量）の比もまたこの範囲内である。

【0278】

前述の通り、該複合脂質はさらにＣＰＬを含んでもよい。ＳＮＡＬＰ－ＣＰＬ（ＣＰＬを含むＳＮＡＬＰ）を作製するための様々な一般的な方法が本明細書で議論されている。２つの一般的な方法に含まれるのは、「後挿入」技術、すなわち、ＣＰＬの、例えば、予め形成されたＳＮＡＬＰへの挿入、及びＣＰＬが脂質混合物に、例えば、ＳＮＡＬＰ形成段階の間に含まれる「標準的」技術である。該後挿入技術は、ＳＮＡＬＰの二重膜の主に外面にＣＰＬを有するＳＮＡＬＰを生じる一方、標準的技術は、ＣＰＬを内面と外面の両方に有するＳＮＡＬＰをもたらす。この方法は、特にリン脂質からなる小胞（これはコレステロールを含むことができる）、及び同様にＰＥＧ－脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡ及びＰＥＧ－ＤＡＧ）を含む小胞にも有用である。ＳＮＡＬＰ－ＣＰＬの作製方法は、例えば、米国特許第５，７０５，３８５号、第６，５８６，４１０号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、及び第６，８５２，３３４号、米国特許公開第２００２００７２１２１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ００／６２８１３号に教示されており、これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0279】

脂質粒子の投与
形成後、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、細胞に核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を導入するのに特に有用である。従って、本発明はまた、細胞に核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を導入する方法を提供する。特定の実施形態では、該核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、細網内皮細胞（例えば、マクロファージ、単球等）等の感染細胞、ならびに線維芽細胞、内皮細胞（血管の内面を補強するもの等）、及び／または血小板細胞を含めた他の細胞型に導入される。これらの方法は、最初に本明細書に記載の粒子を形成し、その後、該粒子を細胞に、該細胞に対するｍＲＮＡの送達が生じるのに十分な時間接触させることによりインビトロまたはインビボで実施され得る。

【0280】

本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、それらが混合または接触されるほとんどすべての細胞型に吸着することができる。吸着後、これらの粒子は、当該細胞の一部に取り込まれ、細胞膜と脂質を交換する場合も、当該細胞と融合する場合もある。当該粒子の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）部分の移動または取り込みは、これらの経路のうちのいずれか１つを介して起こり得る。特に、融合が起こる場合、該粒子の膜は細胞膜に統合され、該粒子の内容物は細胞内液と混合する。

【0281】

本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、単独で投与することも、投与経路及び標準的な薬務に応じて選択される医薬的に許容される担体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）との混合物で投与することもできる。一般に、通常の緩衝食塩水（例えば、１３５～１５０ｍＭのＮａＣｌ）が医薬的に許容される担体として使用される。他の適切な担体としては、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等が挙げられ、安定性の向上のため、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の糖タンパク質を含む。さらなる適切な担体は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に記載されている。本明細書で使用される「担体」には、あらゆるすべての溶媒、分散媒、媒体、コーティング、希釈剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等が含まれる。「医薬的に許容される」という表現は、ヒトに投与された場合にアレルギーまたは同様の有害反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。

【0282】

医薬的に許容される担体は、通常、脂質粒子の形成後に添加される。従って、脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）が形成された後、該粒子は、通常の緩衝食塩水等の医薬的に許容される担体に希釈され得る。

【0283】

製剤処方中の粒子の濃度は、選択される特定の投与方法に応じて、広く、すなわち、約０．０５重量％未満から、通常は約２～５重量％で、または少なくとも約２～５重量％で、約１０～９０重量％まで変動する場合があり、主に液量、粘度等で選択される。例えば、該濃度を高め、治療に伴う液体負荷を低下させてもよい。これは、特に、アテローム性動脈硬化に伴う鬱血性心不全または重症高血圧を有する患者で望まれる場合がある。代替的に、刺激性の脂質からなる粒子を希釈して低濃度にし、投与部位の炎症を軽減する場合もある。

【0284】

本発明の医薬組成物は、従来周知の滅菌技術で滅菌され得る。水溶液は、使用するために包装しても、無菌条件下で濾過して凍結乾燥してもよく、凍結乾燥された製剤は、投与の前に滅菌水溶液と混合される。該組成物は、生理的条件に近づけるために必要な医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張化調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウムを含むことができる。さらに、該粒子の懸濁液は、貯蔵中のフリーラジカル及び脂質の過酸化傷害に対して脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。脂溶性のフリーラジカルクエンチャー、例えば、アルファトコフェロール、及び水溶性の鉄特異的キレート剤、例えば、フェリオキサミンが適切である。

【0285】

いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、１つ以上のｍＲＮＡの治療的送達のための方法に特に有用である。

【0286】

インビボ投与
インビボ治療のための全身送達、例えば、循環等の体のシステムを介した遠位標的細胞への治療用核酸の送達は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／００７１９６号、第ＷＯ０５／１２１３４８号、第ＷＯ０５／１２０１５２号、及び第ＷＯ０４／００２４５３号に記載されているもの等の核酸－脂質粒子を用いて達成されている。これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本発明はまた、完全に封入された脂質粒子を提供し、これらは、核酸を血清中のヌクレアーゼ分解から保護し、非免疫原性であり、サイズが小さく、反復投与に適している。

【0287】

インビボ投与に関しては、投与は当技術分野で既知の任意の方法で、例えば、注入、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内もしくは気管内）、経皮投与、または直腸投与によることができる。投与は、単回投与または分割投与を介して達成され得る。該医薬組成物は、非経口的に、すなわち、関節内に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または筋肉内に投与することができる。いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、静脈内にまたは腹腔内に、ボーラス注入によって投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号参照）。細胞内核酸送達はまた、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：５１２（１９８３）、Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）、Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，６：２３９（１９８９）、及びＢｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６：２７４（１９９３）にも論じられている。脂質系の治療薬のさらに他の投与方法は、例えば、米国特許第３，９９３，７５４号、第４，１４５，４１０号、第４，２３５，８７１号、第４，２２４，１７９号、第４，５２２，８０３号、及び第４，５８８，５７８号に記載されている。これら脂質粒子は、疾患部位での直接注入によって投与することも、疾患部位から遠位部位での注入によって投与することもできる（例えば、Ｃｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０－７１（１９９４）参照）。上記参考文献の開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0288】

本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）が静脈内に投与される実施形態では、注入された粒子の全用量の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％が注入後約８、１２、２４、３６、または４８時間血漿中に存在する。他の実施形態では、注入された脂質粒子の全用量の約２０％超、３０％超、４０％超、及び約６０％、７０％、または８０％が、注入後約８、１２、２４、３６、または４８時間血漿中に存在する。場合によっては、複数の粒子の約１０％超が、投与後約１時間、哺乳類の血漿中に存在する。ある特定の他の場合では、該脂質粒子の存在は、該粒子の投与後少なくとも約１時間検出可能である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子等の治療用核酸の存在は、投与後約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、または９６時間の時点で、細胞内で検出可能である。他の実施形態では、本発明に従って生体内に導入されたｍＲＮＡがコードするポリペプチドの発現は、投与後約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、または９６時間の時点で検出可能である。さらなる実施形態では、投与部位の近位もしくは遠位部位での細胞におけるｍＲＮＡの存在または効果は、投与後約１２、２４、４８、７２、もしくは９６時間、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２６、もしくは２８日の時点で検出可能である。さらなる実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、非経口的にまたは腹腔内に投与される。

【0289】

本発明の組成物は、単独でまたは他の適切な成分と組み合わせて、吸入を介して（例えば、鼻腔内にまたは気管内に）投与されるように、エアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらを「霧状にする」ことができる）（Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）参照）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の許容される加圧噴射剤に入れることができる。

【0290】

ある特定の実施形態では、該医薬組成物は、鼻内噴霧、吸入、及び／または他のエアロゾル送達媒体によって送達され得る。鼻内エアロゾル噴霧を介して肺に直接核酸組成物を送達する方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号及び第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂及びリソホスファチジル－グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を用いた薬物送達もまた製薬分野で知られている。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達が米国特許第５，７８０，０４５号に記載されている。上記特許の開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0291】

非経口投与、例えば、関節内（関節に）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路による投与に適切な製剤に含まれるのは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及び当該製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができる水性ならびに非水性の等張滅菌注射液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存料を含むことができる水性ならびに非水性の滅菌懸濁液である。本発明の実施において、組成物は好ましくは、例えば、静脈内注入によって、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に投与される。

【0292】

一般に、静脈内に投与される場合、該脂質粒子製剤は、適切な医薬担体とともに製剤化される。多くの医薬的に許容される担体が本発明の組成物及び方法に使用され得る。本発明での使用に適切な製剤は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等が用いられる場合があり、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の糖タンパク質を安定性向上のために含んでもよい。一般に、通常の緩衝食塩水（１３５～１５０ｍＭのＮａＣｌ）が医薬的に許容される担体として使用されるが、他の適切な担体で十分である。これらの組成物は、濾過等の従来のリポソーム滅菌技術で滅菌することができる。該組成物は、生理的条件に近づけるために必要な医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張化調整剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含むことができる。これらの組成物は、上記の技術を用いて滅菌することができるが、代替的に、それらを無菌条件下で製造してもよい。得られる水溶液は、使用するために包装しても、無菌条件下で濾過して凍結乾燥してもよく、凍結乾燥された製剤は、投与の前に滅菌水溶液と混合される。

【0293】

ある特定の用途では、本明細書に開示する脂質粒子は、経口投与を介して個体に送達され得る。該粒子は、賦形剤と組み合わされ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、ロゼンジ剤、エリキシル剤、マウスウォッシュ剤、懸濁液剤、経口噴霧剤、シロップ剤、カシェ剤等の形態で使用され得る（例えば、米国特許第５，６４１，５１５号、第５，５８０，５７９号、及び第５，７９２，４５１号参照。これらの開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。これらの経口剤形はまた、以下のもの、すなわち、結合剤、ゼラチン、賦形剤、滑沢剤、及び／または香味剤を含んでもよい。該単位剤形がカプセル剤の場合、それは、上記の材料に加えて、液体担体を含んでもよい。様々な他の材料がコーティングとして、または該投与単位の物理的形状を変更するために存在してもよい。当然のことながら、あらゆる単位剤形を調製するために使用されるいかなる材料も、医薬的に純粋であるべきであり、使用される量において実質的に非毒性であるべきである。

【0294】

通常、これらの経口製剤は、該脂質粒子を少なくとも約０．１％以上含み得るが、該粒子のパーセンテージは、当然のことながら、変動してもよく、便宜上、製剤全体の重量または体積の約１％もしくは２％～約６０％もしくは７０％またはそれ以上でよい。必然的に、各々の治療上有用な組成物中の粒子の量は、適切な用量が、当該化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方法で調製されうる。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の保存期間、及び他の薬理学的留意事項等の要因は、かかる製剤処方を調製する当業者によって企図され、従って、様々な用量及び治療計画が望ましい場合がある。

【0295】

経口投与に適した製剤は、（ａ）溶液、例えば、水、生理食塩水、またはＰＥＧ４００等の希釈剤に懸濁された有効量のパッケージされた治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、（ｂ）各々が所定量の治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして含むカプセル剤、サシェ剤、または錠剤、（ｃ）適切な液体の懸濁液、及び（ｄ）適切なエマルションからなることができる。錠剤型は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料、香味剤、染料、崩壊剤、ならびに医薬的に適合する担体のうちの１つ以上を含むことができる。ロゼンジ型は、香味料、例えばスクロース中に治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含むことができ、同様に、トローチは、該治療用核酸に加えて、当技術分野で既知の担体を含むゼラチン及びグリセリンまたはスクロース及びアカシアゴムエマルション、ゲル等の不活性基剤中に治療用核酸を含む。

【0296】

それらの使用の別の例では、脂質粒子は、様々な局所剤形に組み込むことができる。例えば、ＳＮＡＬＰ等の核酸－脂質粒子を含む懸濁液を製剤化し、ゲル、油、エマルション、局所クリーム、ペースト、軟膏、ローション、フォーム、ムース等として投与することができる。

【0297】

本発明の脂質粒子の医薬品を調製する場合、空の粒子もしくは核酸等の治療薬が外表面に会合した粒子を減少させるためまたは除去するために精製された量の粒子を使用することが好ましい。

【0298】

本発明の方法は、様々な宿主で実施することができる。好ましい宿主としては、哺乳類種、例えば、霊長類（例えばヒト及びチンパンジーならびに他の非ヒト霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類（例えば、ラット及びマウス）、ウサギ目、及びブタが挙げられる。

【0299】

粒子の投与量は、治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の脂質に対する比、使用される特定の治療用核酸、治療される疾患または障害、患者の年齢、体重、及び状態、ならびに臨床医の判断に依存するが、一般的には、投与（例えば注入）につき、体重１キログラム当たり約０．０１～約５０ｍｇ、好ましくは、体重の約０．１～約５ｍｇ／ｋｇ、または約１０^８～１０^１０粒子である。

【0300】

インビトロ投与
インビトロ適用に関しては、治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の送達は、植物もしくは動物起源、脊椎動物もしくは無脊椎動物、及び任意の組織または型のものにかかわらず、培養された任意の細胞に対してすることができる。好ましい実施形態では、該細胞は、動物細胞、より好ましくは、哺乳類細胞、最も好ましくは、ヒト細胞である。

【0301】

該細胞と脂質粒子の間の接触は、インビトロで行われる場合、生物学的に適合する媒体中で行われる。粒子の濃度は、具体的な用途に応じて大きく異なるが、一般には約１μｍｏｌ～約１０ｍｍｏｌである。該細胞の該脂質粒子による処理は、一般に、生理的温度（約３７℃）にて、約１～４８時間、好ましくは約２～４時間の期間行われる。

【0302】

１つの好ましい実施形態の群では、脂質粒子懸濁液は、細胞密度約１０^３～約１０^５細胞／ｍｌ、より好ましくは、約２×１０^４細胞／ｍｌを有する６０～８０％コンフルエントの播種細胞に添加される。該細胞に添加される懸濁液の濃度は、好ましくは、約０．０１～０．２μｇ／ｍｌ、より好ましくは、約０．１μｇ／ｍｌである。

【0303】

細胞の組織培養が必要とされ得る程度は、当業者には周知である。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）、Ｋｕｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．（１９７７）、及びそこに引用されている参考文献が、細胞培養の一般的な手引きを提供している。培養細胞系は多くの場合細胞の単分子層の形態であるが、細胞の懸濁液もまた使用される。

【0304】

エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを用いて、ＳＮＡＬＰまたは本発明の他の脂質粒子の送達効率を最適化することができる。ＥＲＰアッセイは、米国特許公開第２００３００７７８２９号に詳細に記載されており、その開示は、すべての目的のため、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。より具体的には、ＥＲＰアッセイの目的は、ＳＮＡＬＰもしくは他の脂質粒子の様々なカチオン性脂質及びヘルパー脂質成分が、それらの相対的効果に基づいて、エンドソーム膜の結合／取り込みまたは融合／不安定化に及ぼす影響を見分けることである。本アッセイは、ＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子の各成分がどのように送達効率に作用するかを定量的に測定することを可能にし、それにより、ＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子を最適化する。通常、ＥＲＰアッセイは、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）の発現を測定し、いくつかの例では、発現プラスミドに最適化されたＳＮＡＬＰ製剤もまたｍＲＮＡの封入に適切である。様々なＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子の各々に対するＥＲＰを比較することで、最適化された系、例えば、細胞内における取り込みが最も大きいＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子を容易に決定することができる。

【0305】

脂質粒子送達用細胞
本発明は、哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、及びモルモット）、ウサギ目、ブタ、ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びヒト）を含めた任意の脊椎動物種由来の多種多様な細胞型で実施することができる。

【0306】

脂質粒子の検出
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、対象において、約１、２、３、４、５、６、７、８時間、またはそれ以上の時点で検出可能である。他の実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）は、対象において、該粒子の投与後約８、１２、２４、４８、６０、７２、もしくは９６時間、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２２、２４、２５、もしくは２８日の時点で検出可能である。該粒子の存在は、対象由来の細胞、組織、または他の生体試料で検出することができる。該粒子は、例えば、該粒子の直接の検出、及び／または当該脂質粒子内に封入されたｍＲＮＡ配列の検出、及び／またはｍＲＮＡから発現されるポリペプチドの検出によって検出されうる。

【0307】

粒子の検出
本発明のＳＮＡＬＰ等の脂質粒子は、当技術分野で既知の任意の方法を用いて検出することができる。例えば、標識を直接または間接的に該脂質粒子の成分に対して、当技術分野で周知の方法を用いて結合させることができる。多種多様な標識を用いることができ、標識の選択は、必要とされる感度、当該脂質粒子成分との結合の容易さ、安定性の必要条件、ならびに利用可能な機器及び廃棄規定に依存する。適切な標識としては、スペクトル標識、例えば、蛍光染料（例えば、フルオレセイン及び誘導体、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）、ローダミン及び誘導体、例えば、テキサスレッド、テトラロジミンイソチオシアネート）ＴＲＩＴＣ）等、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅｓ（商標）等、放射性標識、例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３３Ｐ等、酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等、分光測色標識、例えば、コロイド金または着色ガラスもしくはプラスチックビーズ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等が挙げられるがこれらに限定されない。該標識は、当技術分野で既知の任意の方法を用いて検出することができる。

【0308】

核酸の検出
核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書では、当業者に周知の多くの方法のいずれかで検出及び定量される。核酸の検出は、サザン解析、ノーザン解析、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、放射性標識、シンチレーション測定、及びアフィニティークロマトグラフィー等の周知の方法で進行し得る。さらなる生化学的解析法、例えば、分光測光法、Ｘ線撮影、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及び超拡散クロマトグラフィーもまた使用され得る。

【0309】

核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーション形式が当業者に知られている。例えば、一般的な形式には、サンドイッチアッセイ及び競合または置換アッセイが含まれる。ハイブリダイゼーション技術は、一般に、例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｅｄｓ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）に記載されている。

【0310】

ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増加させる核酸増幅システムの使用によって高められる場合がある。分子プローブとして使用するために配列を増幅させるのに適した、または後続のサブクローニングのために核酸フラグメントを生成するのに適したインビトロ増幅技術が知られている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ－レプリカーゼ増幅、及び他のＲＮＡポリメラーゼによる技術（例えば、ＮＡＳＢＡ（商標））を含めたかかるインビトロ増幅法で当業者を指揮するのに十分な技術の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）、ならびに米国特許第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ １，１９９０），Ｃ＆ＥＮ ３６、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３：８１（１９９１）、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９）、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０）、Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１（１９９０）、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｅ，４：５６０（１９８９）、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）、ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５６３（１９９５）に見出される。インビトロ増幅核酸のクローニング法の改良は、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。当技術分野で記載される他の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ（商標）、Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）及びＱβ－レプリカーゼシステムである。これらのシステムは、ＰＣＲまたはＬＣＲプライマーが、選択された配列が存在する場合のみ伸長または結合されるように設計された変異体を直接特定するために使用することができる。代替的に、選択された配列は、一般に、例えば、非特異的ＰＣＲプライマーを用いて増幅することができ、増幅された標的領域は、後に、変異を示す特定の配列についてプローブされる。上記の参考文献の開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0311】

プローブとして、例えば、インビトロ増幅法における使用のため、遺伝子プローブとしての使用のため、または阻害剤成分としての核酸は、通常、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９ １８６２（１９８１）に記載の固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従い、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：６１５９（１９８４）に記載の通り、自動合成装置を用いて化学的に合成される。必要に応じて、ポリヌクレオチドの精製は、通常、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動またはＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，２５５：１３７ １４９（１９８３）に記載の通りアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって行われる。合成ポリヌクレオチドの配列は、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）ｉｎ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９の化学分解法を用いて確認することができる。

【0312】

転写のレベルを測定するための代替手段は、インサイチュハイブリダイゼーションである。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、周知であり、概してＡｎｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６４９（１９８７）に記載されている。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞は固体支持体、通常はスライドガラスに固定される。ＤＮＡがプローブされる場合、細胞は熱またはアルカリで変性される。細胞はその後、標識される特定のプローブのアニーリングを可能にする適温のハイブリダイゼーション溶液と接触される。プローブは、好ましくは、放射性同位体または蛍光レポーターで標識される。

【実施例0313】

本発明を具体的な実施例によってさらに詳細に説明する。以下の実施例は、例示を目的として提供するものであり、いかなる方法によっても本発明を限定することを意図しない。当業者には、本質的に同じ結果を得るために変更または修正することができる様々な重要でないパラメータが容易に認識されよう。当業者にはまた、「表１」が複数の実施例に含まれ得ると同時に、実施例１の「表１」への言及は、実施例１に含まれる表１を指すことが理解されよう。

【0314】

実施例１～１３ 脂質ナノ粒子中の核酸ペイロードとステロイドの共送達
コルチコステロイドは、脊椎動物の副腎皮質で産生されるステロイドホルモン及びこれらホルモンの合成類似体の種類である。コルチコステロイドは、ストレス反応、免疫反応、及び炎症の調節、炭水化物代謝、タンパク質異化作用、血中電解質レベル、ならびに行動を含めた広範な生理的過程に関与している。

【0315】

コルチコステロイドには２種類ある。コルチゾール等のグルココルチコイドは、炭水化物、脂肪、及びタンパク質の代謝を制御し、リン脂質の放出を防ぎ、好酸球の作用及びいくつかの他の機序を低下させることによって抗炎症性である。アルドステロン等の鉱質コルチコイドは、主に腎臓でのナトリウム貯留を促進することにより、電解質及び水分のレベルを制御する。

【0316】

「グルココルチコイド」という用語は、炭水化物、タンパク質、及び脂肪の代謝を制御し、抗炎症性及び／または免疫抑制作用を有する天然または合成ステロイドホルモンの群のいずれかを指す。本発明のある特定の実施形態での使用に適したグルココルチコイドとしては、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、アルドステロン、フルチカゾン、クロベタゾン、クロベタゾール、及びロテプレドノール、ならびにそれらの医薬的に許容される塩、ならびにそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。

【0317】

ステロイドは、多くの点で治療を助けることができることから、様々な疾患の治療にしばしば使用される。がんの治療では、例えば、ステロイドは、化学療法及び放射線に伴う吐気を低下させ、炎症を低減し、アレルギー反応を低下させ（例えば、輸液前）、または、単に患者が眠れ、食べられ、及び気分がよくなることを可能にすることによって生活の質の向上を助けることができる。

【0318】

脂質ナノ粒子の使用は、証明された送達プラットフォームである一方、いくつかの安全性及び耐容性の問題を克服することによって、ＬＮＰの治療的有用性及び患者の利便性をさらに広げることが必要とされる。クリニックでは、及び前投薬がない場合、ほとんどのＬＮＰ治療関連の副作用は、容量制限毒性を表し得るある特定の炎症性バイオマーカーの増加に関連する注入型の反応と一致する（例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗ：Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９，２００８参照）。

【0319】

グルココルチコイドのＬＮＰへの同時製剤化の効果を調べ、静脈内投与後に炎症反応が抑えられるかどうか、及び該プラットフォームの治療指数が拡大するかどうかが検討されている。マウスモデルで生成された前臨床データでは、ステロイドとＬＮＰの同時製剤化は、同じレベルの遺伝子サイレンシング能力を維持しつつ、免疫刺激の低下を達成するための実行可能な方策であることを示している。さらに、ＮＨＰ及びブタモデルでの初期の前臨床データは、マウスのデータとよく相関し、この新規な方策にさらなる確信を与えた。

【0320】

一般的手順
脂質ナノ粒子製剤化
脂質ナノ粒子は、Ｊｅｆｆら（米国特許第９，００５，６５４号参照）によって記載された直接希釈またはインライン希釈法のいずれかによって作製した。脂質組成物は、典型的には、特記しない限り、以下の脂質をそれぞれのモル比で含有した。ＰＥＧ－脂質（ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、１．１ｍｏｌ％）、カチオン性脂質（化合物１３、５４．９ｍｏｌ％）、コレステロール（３３．０ｍｏｌ％）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ、１１．０ｍｏｌ％）。核酸は、ｐＨ４．５の２０ｍＭのＥＤＴＡに可溶化した。これらの溶液をＴ字型コネクタにて流量４００ｍＬ／分で混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで希釈した（インラインまたは直接）。エタノールをその後除去し、Ｍｉｄｇｅｅフープカートリッジ（ＭＷカットオフ５００Ｋ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて接線流限外濾過により、キャリア緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳで置換した。これらのＬＮＰを滅菌濾過し（０．２μｍシリンジフィルター）、試料濃度をＤＥＮＡＸ－ＨＰＬＣまたはＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイのいずれかによって測定した。粒径及び多分散性は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いて測定した。脂質及びステロイドの最終濃度は、ＵＰＬＣで測定した。

【0321】

動物モデル
ＬＰＳ感作サイトカインマウスモデル
雌のＩＣＲマウス（１群当たりｎ＝５、５～６週齢）を、時点＝０で０．０５ｍｇ／ｋｇのリポ多糖（ＬＰＳ）で前処理し、免疫系を感作する。ｔ＝２時間で、これらマウスは、静脈内投与にてＬＮＰを１ｍｇ／ｋｇの用量で受ける。ＬＮＰ処理の４時間後、血液試料をナトリウムＥＤＴＡマイクロティナチューブに採取し（末端採血）、１６０００×ｇで５分間、１６℃での遠心分離により血漿に加工する。血漿試料をインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、及び単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）サイトカインレベルについてＥＬＩＳＡにより分析する。

【0322】

急性サイトカインマウスモデル
雌のＩＣＲマウス（１群当たりｎ＝５、５～６週齢）を、１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰで静脈内投与により処理する。処理後２時間で血液を５０ｍＭのＥＤＴＡを含むチューブに尾の切れ目を介して採取し、１６０００×ｇで５分間、１６℃での遠心分離により血漿に加工する。処理後６時間で、末端血液試料をナトリウムＥＤＴＡマイクロティナチューブに採取し、上記と同じ手順を用いて血漿まで加工する。血漿試料をＥＬＩＳＡによりインターロイキン－６（ＩＬ－６）及び単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）サイトカインレベルについて分析する。

【0323】

活性マウスモデル
アポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）を標的とするｓｉＲＮＡとともに製剤化されたＬＮＰをＩＶ投与し、雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（１群当たりｎ＝３、５～６週齢）における用量反応曲線（典型的な用量：０．０１ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ全ｓｉＲＮＡ）を作成した。終了時点は、ＬＮＰの静脈内投与後４８時間である。肝臓の左葉をＲＮＡｌａｔｅｒに採取し、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０分析によりアポＢレベルをアッセイする。結果は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化する。

【0324】

実施例１：ＬＰＳ感作サイトカインマウスモデルにおけるデキサメタゾン２１－パルミテートを含むＬＮＰ
デキサメタゾン２１－パルミテート（Ｄｅｘ－Ｐ）は、事実上デキサメタゾンのプロドラッグであり、ステロイド（デキサメタゾン）を放出するための酵素作用を必要とする。これは、遊離型のステロイドと比較してあまり好都合ではない（インビボでその活性型への変換を必要とするため）が、デキサメタゾン２１－パルミテートは、遊離のデキサメタゾンよりｌｏｇＰが高く、より多くのＬＮＰへの組み込みを容易にする。

【0325】

一般的手順に記載のベース組成物を用い、Ｄｅｘ－Ｐ含量を徐々に増加させた一連の用量漸増組成物を調製した（０．５ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、または５ｍｏｌ％Ｄｅｘ－Ｐ）。Ｄｅｘ－Ｐは、９０％エタノール脂質原液中の追加の脂質成分として単に含めた。粒子特性は、ベース組成物と本質的に同一であった（表１）。

【表1】

【0326】

上記製剤を、一般的手順に記載のＬＰＳ感作マウスサイトカインモデルにて試験した。追加の対照として、ベース製剤を遊離のデキサメタゾンとともに投与した。この遊離のステロイドは、０．３ｍｇ／ｋｇの用量（臨床的に意義のある用量）で静脈投与した。

【0327】

リポ多糖（ＬＰＳ）で０．０５ｍｇ／ｋｇにて前処理したＩＣＲマウスは、ＰＢＳで前処理した動物と比較してサイトカイン反応を誘導した。ＬＮＰの静脈内投与後、３種のサイトカインすべてがさらに増加した。代表的なサイトカインのデータ（ＭＣＰ－１）を表２に示す。サイトカインのレベルは、ステロイドの非存在下でのベース製剤で処理した群で最も高かった。Ｄｅｘ－ＰとＬＮＰの共製剤化でサイトカインレベルは著しく低下した。さらに、これらのサイトカインレベルは、ＬＮＰに共製剤化された場合、低（０．５ｍｏｌ％）及び高（５ｍｏｌ％）ステロイド用量間で類似しており、潜在的に飽和効果を示した。ＬＮＰへの５ｍｏｌ％のＤｅｘ－Ｐの組み込みとの単回静脈内注入における投与された遊離のデキサメタゾンの同等の用量は、０．３ｍｇ／ｋｇであった。この用量でのＤｅｘ－Ｐ ＬＮＰで達成されるサイトカインレベルは、対照のＬＮＰと０．３ｍｇ／ｋｇの遊離のデキサメタゾンの２つの別々の連続注入での共投与と同様であった。

【表2】

【0328】

実施例２：急性サイトカインマウスモデルにおけるデキサメタゾン２１－パルミテートを含むＬＮＰ
コルチコステロイドの共製剤化の概念を、急性サイトカインモデルからのデータでさらに裏付けた。同じ製剤パネルを試験したところ（このモデルでは１０ｍｇ／ｋｇで投与した）、データは、この場合もやはり、共製剤化されたＤｅｘ－Ｐ ＬＮＰは、免疫刺激を低下させる有効な手段であることを示し、ＬＮＰと遊離のデキサメタゾンを共投与した場合と、同じかまたはより低い用量で同様のサイトカインレベルを達成した（表３）。

【表3】

【0329】

実施例３：ＬＰＳ感作モデルにおける減少されたデキサメタゾン２１－パルミテートを含むＬＮＰ
Ｄｅｘ－Ｐの濃度をさらに減らした（０．５ｍｏｌ％、０．１ｍｏｌ％、及び０．０１ｍｏｌ％まで）。ＵＰＬＣによる製剤化後の分析で、Ｄｅｘ－Ｐが容易に粒子に取り込まれたことが示された。粒子の特性は、ＬＮＰ製剤間で同等であった（表４）。

【表4】

【0330】

代表的なサイトカインの値（ＭＣＰ－１）についての結果を表５に示す。Ｄｅｘ－Ｐ濃度とサイトカインレベルの間に相関関係が認められた（Ｄｅｘ－Ｐが多いほどサイトカインが低下する）。０．５％のＤｅｘ－Ｐ ＬＮＰは、およそ０．０３ｍｇ／ｋｇ用量の遊離デキサメタゾンに相当する。これらの２つの群を比較するデータによって、サイトカインの低下は、コルチコステロイドがＬＮＰに組み込まれた場合に著しく大きいことを示した。実際、このＬＮＰ（０．５％Ｄｅｘ－Ｐ）は、実質的には０．３ｍｇ／ｋｇ用量の遊離デキサメタゾン、すなわち、１０倍量のコルチコステロイドの用量と同様に機能した。この驚くべき結果は、さらにいっそう効果的なコルチコステロイドの「標的送達」に起因し得ると仮定された。ＬＮＰを取り込む、及びそうでなければ免疫反応を引き起こした可能性がある免疫細胞は、同時に免疫抑制性のコルチコステロイドを受けている。

【表5】

【0331】

実施例４：Ｄｅｘ－Ｐと共製剤化されたＬＮＰの活性
Ｄｅｘ－ＰのＬＮＰへの組み込みが効力に影響を及ぼさないことを確認するため、製剤を一般的手順に記載の活性マウスモデルで評価した。様々な量のＤｅｘ－Ｐを含む試料を２つの用量、すなわち、０．０２５ｍｇ／ｋｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇで試験した。同様のサイレンシング活性がすべての製剤に関して各用量で認められた。０．５％のＤｅｘ－Ｐを含むベース製剤及び非標的対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ－２）を陰性対照として含めた。このペイロードでは、サイレンシングは予想も観察もされない。結果を表６に示す。

【表6】

【0332】

実施例５：ＬＰＳ感作マウスモデルにおけるクロベタゾールを含むＬＮＰ
次に、コルチコステロイドであるクロベタゾール－１７－プロピオネート（クロベタゾール）をＬＮＰに共製剤化することを試み、再度、粒子に対する炎症反応を抑制するその能力を検討した。ｐＨ４．５の４０ｍＭ酢酸緩衝液を用いて核酸を可溶化した。脂質の最終組成を表７に示す。ｌｏｇＰが低い（約３．５）クロベタゾールは、Ｄｅｘ－Ｐ（ｌｏｇＰ約９）ほど容易にＬＮＰに組み込まれなかった。従って、最終製品に実際に望まれるより８倍高い濃度のクロベタゾールをこの過程に投入した。ＵＰＬＣによる分析で、クロベタゾールの組み込みが確認された。

【表7】

【0333】

表８に要約するように、製剤特性はこれら２つの組成間で同等であった。粒径、多分散性、及びペイロードの封入は、均一な粒子集団を示した。

【表8】

【0334】

これら２つの組成物をＬＰＳ感作マウスモデルで評価した。代表的なサイトカインの値（ＭＣＰ－１）を表９に示す。このＬＮＰに対する炎症反応は、クロベタゾールＬＮＰで著しく低下する。これらのＭＣＰ－１レベルは、Ｄｅｘ－Ｐを含むＬＮＰと同様であるが、クロベタゾールはプロドラッグではなく、活性化について酵素作用に依存しない。このことは、ＬＮＰをその標的作用部位に送達後、このコルチコステロイドが自発的に作用するため、Ｄｅｘ－Ｐより著しく有益である。

【表9】

【0335】

実施例６：急性サイトカインマウスモデルにおけるクロベタゾールを含むＬＮＰ
同じＬＮＰ組成物（ベース及びベース＋クロベタゾール）を急性サイトカインモデルで試験した。ＭＣＰ－１及びＩＬ－６サイトカインレベルを２時間及び６時間の両時点で測定した。どちらのサイトカインも、共製剤化されたクロベタゾールＬＮＰに関して著しく低いレベルを記録した。後者の製剤は、両時点でＩＬ－６のベースラインレベルを記録したのみであった（表１０）。

【表10】

【0336】

拡大した急性サイトカイン試験をより多くの時点で行い、クロベタゾールＬＮＰでの最大のサイトカイン反応がより早いまたは遅い時点に単純に移動しないことを確実なものとした。最大のサイトカイン反応は、このモデルでは通常ＬＮＰ処理後２時間で観察される。結果は、このステロイドが、この試験の時間経過を通して免疫反応を抑制するのに有効であることを確認した（表１１）。

【表11】

【0337】

実施例７：マウスの用量反応試験におけるクロベタゾールを含むＬＮＰの活性
クロベタゾールのＬＮＰへの組み込み及びこの方法のわずかな修正が効力に影響を及ぼさないことを確認するため、製剤を一般的手順に記載の活性モデルで評価した。同様のサイレンシング活性が両製剤に関して各用量で認められた（表１２）。これは、クロベタゾールＬＮＰが劇的に改善された治療指数を有することを強調している。すなわち、それらは同等の効力と、はるかに優れた耐容性を有する。

【表12】

【0338】

実施例８：シクレソニドを含むＬＮＰによる免疫抑制
次に、コルチコステロイドであるシクレソニドを試験した。脂質の最終組成を表１３に示す。ＵＰＬＣによる分析で、シクレソニドの取り込みが確認された。シクレソニドはｌｏｇＰが約５．３であり、容易に粒子に組み込まれる。

【表13】

【0339】

表１４に要約するように、製剤特性はこれら２つの組成間で同等であった。粒径、多分散性、及びペイロードの封入は、均一な粒子集団を示した。

【表14】

【0340】

このシクレソニドＬＮＰをＬＰＳ感作マウスモデルで試験し、ベース製剤及びＤｅｘ－Ｐ ＬＮＰと比較した。このシクレソニドＬＮＰもまた、ベース製剤と比較して、著しく低下した炎症性サイトカイン反応を示した。代表的なサイトカイン（ＭＣＰ－１）のデータを表１５に示す。

【表15】

【0341】

実施例９：シクレソニドを含むＬＮＰの活性
シクレソニドＬＮＰを一般的手順に記載の活性モデルでも評価した。Ｄｅｘ－Ｐ ＬＮＰと同様、シクレソニドＬＮＰは、ベース製剤と同様の効力を示した（表１６）。

【表16】

【0342】

実施例１０：クロベタゾールを含むＬＮＰは非ヒト霊長類において免疫刺激を低下させた
静脈内薬理学的研究をカニクイザルで実施し、クロベタゾールＬＮＰ製剤を評価し、対照の製剤（先に用いた「ベース製剤」）と比較した。実施例５と同様、８倍高い濃度のクロベタゾールをこの過程に投入し、所望の１ｍｏｌ％を最終組成で得た（表１７）。ｐＨ４．５の４０ｍＭ酢酸緩衝液を用いて核酸を可溶化した。

【表17】

【0343】

ＬＮＰ製剤を４匹のカニクイザル（カンボジア起源、雄２匹、雌２匹、２～５歳齢）の群に対して、２．０ｍｇ／ｋｇ全ｓｉＲＮＡの用量にて、６０分間の静脈内注入を介して投与した。投与前ならびに注入後２、６、及び２４時間での採血を炎症マーカーのパネルについて試験した。クロベタゾールＬＮＰは、いくつかの炎症マーカーの著しい低下を示し、この方策の有効性がさらに確認された。表１８は、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、及びＩＬ－１ｒａ（インターロイキン－１受容体アンタゴニスト）のレベルを注入後６時間の２組成物間で比較している。

【表18】

【0344】

実施例１１：麻酔雌ゲッティンゲンミニブタにおけるＬＮＰ製剤の単回注入の心臓血管系作用の試験
ＬＮＰ製剤の１時間の単回注入が血行動態パラメータ及び炎症性バイオマーカーに及ぼす被験物質関連の影響を麻酔雌ゲッティンゲンミニブタで評価した。ＬＮＰを表１９の組成で製剤化した。実施例５と同様、８倍高い濃度のクロベタゾールをこの過程に投入し、所望の１ｍｏｌ％を最終組成で得た。ｐＨ４．５の４０ｍＭ酢酸緩衝液を用いて核酸を可溶化した。

【表19】

【0345】

３匹のナイーブミニブタに外科手術で機器を取り付け、ベースラインデータを集め、その後、媒体（生理食塩水）、ベースＬＮＰ、またはクロベタゾールＬＮＰを６０分間の静脈内注入により単回投与した。ＬＮＰ製剤は、０．３ｍｇ／ｋｇ全核酸の用量にて投与した。最初の注入の直前、ならびに注入開始後約５、６０、９０、１２０、１８０、及び２４０分で血液試料を取り、血漿と血清に加工し、サイトカイン及びトロンボキサン（１１－デヒドロトロンボキサンＢ２）について分析した。血行動態データを、この実験を通して合計４時間連続して集めた。注入後４時間で、ブタを麻酔下でバルビツール酸過剰投与により安楽死させた。

【0346】

ベース製剤での処理は、ベース製剤による相当な測定可能なトロンボキサン（表２０）及びサイトカイン（表２１）の増加をもたらした。さらに、肺動脈圧の増加等の血行動態変化が認められた（表２２）。これらのパラメータはすべて、ベースＬＮＰに対する炎症反応を示しており、これは、ＬＮＰ製剤にクロベタゾールを組み込むことによって抑制される。これは、動物が共製剤化ステロイドＬＮＰで処理された場合のホスホリパーゼＡ２のグルココルチコイドによる阻害及び炎症性サイトカイン転写の転写抑制である可能性がある。

【表20】

【表21】

【表22】

【0347】

実施例１２ 共製剤化されたクロベタゾールは、ｍＲＮＡペイロードを有するＬＮＰに対する免疫反応を低下させるのに有効である
ステロイドのＬＮＰとの共製剤化の概念を、ｍＲＮＡペイロードを担持させてさらに試験した。この実施例は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫刺激の低下がコルチコステロイドであるクロベタゾールの組み込みによってどのように達成され得るかを示す。

【0348】

ＬＮＰ（ＰＬ含有及びＰＬを含まない）をＪｅｆｆらによって記載された直接希釈法によって調製した。簡潔には、脂質原液を１００％エタノール中、全脂質濃度６～７ｍｇ／ｍＬで調製した。レポーター遺伝子であるルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ転写物（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をｐＨ４．５の４０ｍＭのＥＤＴＡに０．３６６ｍｇ／ｍＬで可溶化した。これら溶液の等量をＴ字型コネクタにて流量２５０ｍＬ／分で混合し、直ちにｐＨ７．４のＰＢＳ（脂質原液の４倍量）に希釈した。エタノールをその後除去し、１００容量のＰＢＳに対して一夜透析して、キャリア緩衝液をＰＢＳと透析（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒユニット、ＭＷＣＯ １０ｋ）により交換した。透析後、これらの製剤を、ＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮装置（ＭＷＣＯ １００，０００）を用いて約０．３ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ｓｉＲＮＡとの製剤と同様に、低ｌｏｇＰのクロベタゾールは、約１５％しかＬＮＰ粒子に組み込まれないため、最終組成の望ましい量の約８倍で投入することが必要であった。残りは透析の間に失われる。これらのＬＮＰ試料は、滅菌濾過し（０．２μｍシリンジフィルター）、試料濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイによって測定した。粒径及び多分散性は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いて測定した。最終組成におけるクロベタゾール及び他の脂質の量は、ＵＰＬＣで測定したとともに、表２３に示す。

【表23】

【0349】

注入の前に製剤を０．０５ｍｇ／ｍＬに希釈した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５）に、外側尾部を介した静脈内経路を介して０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍＲＮＡ）を注入した。注入の４時間後、動物を致死量のケタミン／キシラジンで安楽死させた。末端血液の少量（２０μＬ）を５μＬの５０ｍｇ／Ｌヘパリンを含むチューブに採取し、残りの血液はナトリウムＥＤＴＡのマイクロティナチューブに採取した。これらのチューブはすべて１６０００×ｇ及び１６℃で５分間遠心分離し、血漿を単離した。肝臓の左側葉のごく一部（約２００ｍｇ）を採取し、ＲＮＡＬａｔｅｒ中、４℃で一夜保存した。

【0350】

ヘパリン血漿（ＥＬＩＳＡ希釈剤で１：４０００に希釈）を標準マウスＥＰＯ ＥＬＩＳＡ分析（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのキット）に用いた。表２４に示すように、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ内へのクロベタゾールの組み込みで効力がわずかに低下した可能性があるが、恐らくは実験上のばらつきの境界内である。これらマウスの血漿内に見られるＥＰＯの通常のレベルは０．１～０．２ｎｇ／ｍＬである。従って、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ内へのクロベタゾールの組み込みは、この製剤の有効性に実際には影響を及ぼさない。

【表24】

【0351】

免疫刺激への影響を評価するため、ＥＤＴＡ血漿試料を希釈し（１：８）、ＥＬＩＳＡによりサイトカイン（ＭＣＰ－１及びＩＬ－６）について分析した（ＥＬＩＳＡアッセイならびにキャプチャー及び検出抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。表２５は、クロベタゾールが製剤に組み込まれた場合にサイトカイン産生が著しく低下することを示している。

【表25】

【0352】

これら２製剤に対する肝臓のＩＦＩＴ（テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質）の反応もまた測定した。ＩＦＩＴバイオマーカーは、このペイロードに対するＩ型インターフェロン反応を示す。肝臓試料（２０～２５ｍｇ）をホモジナイズし、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０アッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて肝臓のＩＦＩＴレベルを評価した（ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化した）。結果は、ＰＢＳ対照群に対する倍数増加としてプロットされており、クロベタゾールの共製剤化が、ｍＲＮＡペイロードに対するＩＦＩＴ反応の抑制にも効果的であることを示している（表２６）。

【表26】

【0353】

総合すれば、これらの結果は、ＬＮＰ粒子へのクロベタゾールの組み込みが、ｍＲＮＡ－ＬＮＰに対する免疫刺激を著しく無効にし、治療指数の向上が認められることを示している。

【0354】

実施例１３ 共製剤化されたデキサメタゾンパルミテートは、ｍＲＮＡペイロードを有するＬＮＰに対する免疫反応を低下させるのに有効である
この実施例は、ステロイドのプロドラッグであるデキサメタゾン２１－パルミテート（Ｄｅｘ－Ｐ）がどのようにｍＲＮＡペイロードを有するＬＮＰに対する炎症反応を低下させるためにも使用され得るかを示す。実施例１２に記載のＤｅｘ－Ｐを含むｍＲＮＡ－ＬＮＰを表２７に記載の組成で製剤化した。マウスＥＰＯ ｍＲＮＡ転写物（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をペイロードに用いた。

【表27】

【0355】

これらの製剤をＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５）に０．５ｍｇ／ｋｇ（全ｍＲＮＡ）の用量で静脈内に注入した。注入の６時間後、動物を致死量のケタミン／キシラジンの投与で安楽死させた。末端血液のごく一部（７５μＬ）を５μＬの５０ｍｇ／Ｌヘパリンを含むチューブに採取し、残りの血液はナトリウムＥＤＴＡのマイクロティナチューブに採取した。血液試料を１６０００×ｇ及び１６℃で５分間遠心分離し、血漿を単離した。

【0356】

ヘパリン血漿（ＥＬＩＳＡ希釈剤で１：４０００に希釈）をＥＰＯレベルについてＥＬＩＳＡで分析した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのキット）。表２８に示すように、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ内へのＤｅｘ－Ｐの組み込みで効力が向上した可能性があるが、恐らくは実験上のばらつきの範囲内である。

【表28】

【0357】

ＥＤＴＡ血漿をサイトカインレベル（ＭＣＰ－１及びＩＬ－６）についてＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。表２９は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰへのＤｅｘ－Ｐの組み込みで、サイトカインレベルの顕著な低下が得られることを示している。

【表29】

このデータは、デキサメタゾン－パルミテートの組み込みで、ｍＲＮＡ－ＬＮＰに対する炎症反応が低減され、ｍＲＮＡ－ＬＮＰに対する治療指数の顕著な改善がもたらされることを示している。

【0358】

実施例１４～２０．ＬＮＰにおける低または無リン脂質及び高ＰＥＧ
リン酸エステル結合は極めて不安定であると考えられるため、リン脂質の存在が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の保存期間を短縮する可能性がある。ほとんどすべてのリン脂質をＬＮＰから除去し、ｍＲＮＡを含むＬＮＰの保存期間への影響を調べた。これらの実験の間で、製剤の免疫原性が、効力に影響を与えることなく大きく減少されることが分かった。本明細書に記載の通り、本発明のある特定の実施形態は、低または無リン脂質及び通常より多いＰＥＧの組み合わせを有するＬＮＰに関する。興味深いことに、低リン脂質及び高モルパーセントのＰＥＧの組み合わせは、ｓｉＲＮＡに対するよりｍＲＮＡに対する免疫刺激を効果的に減少させる。

【0359】

ある特定の実施形態では、ＰＥＧの量は、少なくとも３モルパーセント（例えば、少なくとも３．１モルパーセント、少なくとも３．２モルパーセント、少なくとも３．３モルパーセント、少なくとも３．４モルパーセント、少なくとも３．５モルパーセント、少なくとも３．６モルパーセント、少なくとも３．７モルパーセント、少なくとも３．８モルパーセント、少なくとも３．９モルパーセント、少なくとも４モルパーセント）である。リン脂質に関しては、ある特定の実施形態では、本発明の実施においてリン脂質を使用しない。ある特定の実施形態では、脂質粒子は、２モルパーセント未満のリン脂質、例えば、１．９ｍｏｌ％のリン脂質、１．８ｍｏｌ％のリン脂質、１．７ｍｏｌ％のリン脂質、１．６ｍｏｌ％のリン脂質、１．５ｍｏｌ％のリン脂質、１．４ｍｏｌ％のリン脂質、１．３ｍｏｌ％のリン脂質、１．２ｍｏｌ％のリン脂質、１．１ｍｏｌ％のリン脂質、１．０ｍｏｌ％のリン脂質、０．９ｍｏｌ％のリン脂質、０．８ｍｏｌ％のリン脂質、０．７ｍｏｌ％のリン脂質、０．６ｍｏｌ％のリン脂質、０．５ｍｏｌ％のリン脂質、０．４ｍｏｌ％のリン脂質、０．３ｍｏｌ％のリン脂質、０．２ｍｏｌ％のリン脂質、０．１ｍｏｌ％のリン脂質、または０．０％のリン脂質、例えば、１．９ｍｏｌ％未満のリン脂質、１．８ｍｏｌ％未満のリン脂質、１．７ｍｏｌ％未満のリン脂質、１．６ｍｏｌ％未満のリン脂質、１．５ｍｏｌ％未満のリン脂質、１．４ｍｏｌ％未満のリン脂質、１．３ｍｏｌ％未満のリン脂質、１．２ｍｏｌ％未満のリン脂質、１．１ｍｏｌ％未満のリン脂質、１．０ｍｏｌ％未満のリン脂質、０．９ｍｏｌ％未満のリン脂質、０．８ｍｏｌ％未満のリン脂質、０．７ｍｏｌ％未満のリン脂質、０．６ｍｏｌ％未満のリン脂質、０．５ｍｏｌ％未満のリン脂質、０．４ｍｏｌ％未満のリン脂質、０．３ｍｏｌ％未満のリン脂質、０．２ｍｏｌ％未満のリン脂質、０．１ｍｏｌ％未満のリン脂質を含む。

【0360】

一般的手順
脂質ナノ粒子の製剤化
ＬＮＰ製剤は、Ｊｅｆｆらによって記載されたＬｉｐｏＭｉｘｅｒ法により、直接希釈またはインライン希釈のいずれかを用いて調製した。脂質組成物は、記載の通り、通常、記載のモル比で３または４つの脂質を含有した。脂質を１００％エタノールに全脂質濃度約１２ｍｇ／ｍＬで可溶化した。核酸は、ＬＮＰにリン脂質が存在する場合はｐＨ４．５の２０ｍＭのＥＤＴＡに可溶化し、リン脂質が存在しない場合はｐＨ４．５の４０ｍＭのＥＤＴＡに可溶化した。等量のこれら溶液をＴ字型コネクタ内で流量４００ｍＬ／分で混合し、直ちにｐＨ７．４のＰＢＳ（脂質原液の４倍の体積）で希釈した（インラインまたは直接）。エタノールをその後除去し、透析（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒユニット、ＭＷＣＯ １０ｋ）またはＭｉｄｇｅｅフープカートリッジ（ＭＷＣＯ ５００ｋ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた接線流限外濾過のいずれかにより、キャリア緩衝液をＰＢＳで置換した。これらＬＮＰ試料を滅菌濾過し（０．２μｍシリンジフィルター）、試料濃度をＤＥＮＡＸ－ＨＰＬＣまたはＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイのいずれかによって測定した。粒径及び多分散性は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いて測定した。最終脂質は、ＵＰＬＣで測定した。

【0361】

動物モデル
３つの動物モデル、すなわち、２つの免疫刺激モデル及び１つの効力モデルを用いて製剤を評価した。説明は以下の通りである。

【0362】

ＬＰＳ感作サイトカインマウスモデル
雌のＩＣＲマウス（ｎ＝５、５～６週齢）を、時点＝０で０．０５ｍｇ／ｋｇのリポ多糖（ＬＰＳ）で前処理し、免疫系を感作する。ｔ＝２時間で、これらマウスは、静脈内投与にてＬＮＰを１ｍｇ／ｋｇの用量で受ける。ＬＮＰ処理の４時間後、血液試料をナトリウムＥＤＴＡマイクロティナチューブに採取し（末端採血）、１６０００×ｇで５分間、１６℃での遠心分離により血漿に加工する。血漿試料をＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＭＣＰ－１のサイトカインレベルについてＥＬＩＳＡにより分析する。

【0363】

急性サイトカインマウスモデル
雌のＩＣＲマウス（ｎ＝５、５～６週齢）を、１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰで静脈内投与により処理する。処理後２時間で血液を５０ｍＭのＥＤＴＡを含むチューブに尾の切れ目を介して採取し、１６０００×ｇで５分間、１６℃での遠心分離により血漿に加工する。処理後６時間で、末端血液試料をナトリウムＥＤＴＡマイクロティナチューブに採取し、上記と同じ手順を用いて血漿まで加工する。血漿試料をＥＬＩＳＡによりＩＬ－６及びＭＣＰ－１のサイトカインレベルについて分析する。

【0364】

活性マウスモデル
アポリポタンパク質Ｂを標的とするｓｉＲＮＡとともに製剤化されたＬＮＰをＩＶ投与し、雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝３、５～６週齢）における用量反応曲線（典型的な用量：ＬＮＰに封入された全ｓｉＲＮＡ０．０１ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ）を作成した。終了時点は、ＬＮＰの静脈内投与後４８時間である。肝臓の左葉をＲＮＡｌａｔｅｒに採取し、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０分析によりアポＢレベルをアッセイする。結果は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化し、ＰＢＳ対照の％として表す。アポＢの値が「ＰＢＳの２０％」である群は、「ＰＢＳの８０％」のものより強い遺伝子サイレンシング活性を受けている。

【0365】

実施例１４：ＬＮＰ製剤からリン脂質を除去することで効力を損なうことなく免疫刺激が減少される
アポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）を標的とするオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡペイロードを用いて２種のＬＮＰ製剤を作製した。「ベース」組成物、及びリン脂質を省略したもの（「リン脂質を含まない」、すなわち「ＰＬフリー」）。組成の詳細を表３０に要約する。

【表30】

【0366】

ＬＰＳ感作マウスサイトカインモデルでは、結果は、ＰＬフリーのＬＮＰは、リン脂質を含むその親組成物より刺激が少ないことを明らかに示している（表３１）。

【表31】

【0367】

炎症反応を減少させることは重要な目的であるが、効力が同時に損なわれないこともまた重要である。従って、同じＬＮＰのパネルをアポＢサイレンシング活性モデル（一般的手順に記載）において評価した。遺伝子サイレンシングデータ（表３２）により、リン脂質を除去することで効力が損なわれないことは明らかである。

【表32】

【0368】

実施例１５：リン脂質を含まないＬＮＰにおけるＰＥＧ脂質含量を増加させることで、効力に大きな影響を与えることなくさらにサイトカインレベルの減少がもたらされた
アポＢのｓｉＲＮＡペイロードを用いて以下のＬＮＰを製剤化した。「ベース」組成物から始め、リン脂質を第一に除去し、その後ＰＥＧ含量を２倍または３倍のいずれかにした（表３３）。

【表33】

このＬＮＰのパネルを、急性マウスサイトカインモデルにおいて、２時間及び６時間の時点で評価した。この場合もやはり、リン脂質が組成物から除去された場合にサイトカインの減少が認められた。代表的なサイトカインデータ（ＭＣＰ－１）を表３４に示す。続いて、ＰＥＧ含量が増加するにつれ、さらにいっそう顕著なサイトカインの減少が認められた。

【表34】

興味深いことに、これら高ＰＥＧのＰＬフリー組成物の効力は、大きく影響を受けることはなかった（表３５）。先の実験では、ＰＥＧ含量がより高い製剤は、多くの場合活性が損なわれることが分かった。例えば、標準的なリン脂質含量で、同様のＰＥＧの一連の用量漸増での３つの関連するＬＮＰを評価し（表３６）、代表的な活性データを表３７に示す。ＰＥＧ含量が増加するにつれ、活性の顕著な減衰が認められる。それ故、上記の高ＰＥＧのＰＬフリー系でより強い、相応の効力の損失なくサイトカインの顕著な減少を認めることは意外である。

【表35】

【表36】

【表37】

【0369】

実施例１６：炎症反応の低下にも有効なリン脂質含量の減少
免疫刺激を無効にするためにＬＮＰ製剤から完全にリン脂質を除去する必要はない可能性があること、及び、この効果は、単にＰＬ含量を減じることによって達成することができるということが仮定された。ＰＬ含量を減少させたもの（３ｍｏｌ％または８ｍｏｌ％）と親組成物（１１ｍｏｌ％）を用いて組成物のパネルを調製した（表３８）。

【表38】

これらの組成物を急性サイトカインモデルにおける免疫刺激について評価した。表３９に示すように、リン脂質が減少された組成物は、サイトカイン産生を刺激する傾向が減少した。さらに、リン脂質含量の減少は、効力に大きな影響を与えなかった（表４０）。

【表39】

【表40】

【0370】

実施例１７ リン脂質を除去することで、効力を損なうことなくｍＲＮＡを含むＬＮＰの免疫刺激が減少される
この実施例は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫刺激の低下がＬＮＰ組成物からリン脂質を除去すること（すなわち、ＰＬフリーのｍＲＮＡ－ＬＮＰの生成）によってどのように達成され得るかを示す。これらｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、表４１に示す脂質組成で作製した。２種の異なるベース製剤（１．１：５５及び１．６：５５）はリン脂質含量を除去し（「ＰＬフリー」組成物）、コレステロール含量は維持またはわずかに増加のいずれかであった。

【表41】

ＬＮＰ（ＰＬ含有及びＰＬフリー）をＪｅｆｆらによって記載された直接希釈法によって調製した。簡潔には、脂質原液を１００％エタノール中、全脂質濃度６～７ｍｇ／ｍＬで調製した。レポーター遺伝子であるルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ転写物をｐＨ４．５の４０ｍＭのＥＤＴＡに０．３６６ｍｇ／ｍＬで可溶化した。これら溶液の等量をＴ字型コネクタにて流量２５０ｍＬ／分で混合し、直ちにｐＨ７．４のＰＢＳ（脂質原液の４倍量）に希釈した。エタノールをその後除去し、１００容量のＰＢＳに対して一夜透析して、キャリア緩衝液をＰＢＳと透析（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒユニット、ＭＷＣＯ １０ｋ）により交換した。透析後、これらの製剤を、ＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮装置（ＭＷＣＯ １００，０００）を用いて約０．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。これらのＬＮＰ試料は、滅菌濾過し（０．２μｍシリンジフィルター）、試料濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイによって測定した。粒径及び多分散性は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いて測定した。

【0371】

注入の前にＬＮＰを０．０５ｍｇ／ｍＬに希釈した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に外側尾静脈を介して０．５ｍｇ／ｋｇ（全ｍＲＮＡ）の用量（１０ｍＬ／ｋｇの体積用量を用いて）を投与した。処理の４時間後、動物をケタミン／キシラジンで安楽死させた。末端血液をナトリウムＥＤＴＡのマイクロティナチューブに採取し、１６０００×ｇ及び１６℃で５分間遠心分離し、血漿を単離した。肝臓切片をＦａｓｔＰｒｅｐチューブに採取し、分析まで－８０℃で保存した。

【0372】

効力を評価するため、肝臓を１×培養細胞溶解剤（ＣＣＬＲ）緩衝液にホモジナイズし、その後ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を分析した。表４２に示すように、組成物からリン脂質を除去した場合に効力に有害作用はない。

【表42】

【0373】

免疫刺激への影響を評価するため、血漿試料を希釈し（１：８）、ＥＬＩＳＡによりサイトカイン（ＭＣＰ－１及びＩＬ－６）について分析した（ＥＬＩＳＡアッセイならびにキャプチャー及び検出抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。表４３は、サイトカイン産生は、リン脂質が除去された場合に両方の「ベース」製剤で著しく減少することを示している。１．１：５５ベースに対する影響が特に強い。

【表43】

【0374】

総合すれば、これらの結果は、ＰＬフリー製剤の使用で、ＰＬ含有製剤と比較して、製剤の免疫刺激の減少がもたらされることを示している。有効性が影響を受けないと思われることを考えると、このことは、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの治療指数の向上をもたらすはずである。

【0375】

実施例１８ リン脂質を除去することで、効力を損なうことなくｍＲＮＡを含むＬＮＰの免疫刺激が減少される
実施例１７の結果を２つの異なるｍＲＮＡ転写物、すなわち、ｍＬｕｃ（表４４ａ）及びｍＥＰＯ（表４４ｂ）を用いて製剤化された組成物のサブセットでさらに裏付けた。使用した転写物は、ルシフェラーゼ（レポーター遺伝子）またはエリスロポエチン（赤血球生成、すなわち、赤血球産生を制御するホルモン）のいずれかをコードした。

【表44】

【0376】

ｍＲＮＡ－ＬＮＰを実施例１７に記載の通りに調製した。雌のＢａｌｂ／Ｃ（ｎ＝４）が０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍＲＮＡ）のＬＮＰの静脈内投与を受けた。６時間後、動物をケタミン／キシラジンで安楽死させた。末端血液のごく一部（７５μＬ）を１８．８μＬの５０ｍｇ／Ｌヘパリンを含むチューブに採取し、残りの血液はナトリウムＥＤＴＡのマイクロティナチューブに採取した。これらチューブはすべて１６０００×ｇ及び１６℃で５分間遠心分離し、血漿を単離した。さらに、肝臓の一部をＦａｓｔＰｒｅｐチューブに採取し、分析まで－８０℃に置いた。

【0377】

肝臓を１×ＣＣＬＲ緩衝液にホモジナイズし、ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を分析した。表４５に見られるように、ＰＬフリーのｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤の有効性は、ベース（ＰＬ含有）製剤のものと同様である。

【表45】

【0378】

ヘパリン血漿（ＥＬＩＳＡ希釈剤で１：４０００に希釈）を標準マウスＥＰＯ ＥＬＩＳＡ分析（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に用いた。表４６に示すように、ｍＥＰＯ－ＬＮＰの有効性の傾向は、ｍＬｕｃ－ＬＮＰで見られるものと同様であり、ここでは、ＰＬフリーＬｕｃ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの有効性は、ベース（ＰＬ含有）製剤のものと同様である。

【表46】

【0379】

免疫刺激を評価するため、血漿試料をサイトカインＭＣＰ－１及びＩＬ－６についてＥＬＩＳＡにより分析した（ＥＬＩＳＡアッセイならびにキャプチャー／検出抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。表４７ａ（ｍＥＰＯ）及び表４７ｂ（ｍＬｕｃ）の結果もやはり、ＰＬフリーのＬＮＰ組成物に対する炎症反応がどのようにベース組成物と比較して著しく減少されたかを示している。これは、両方のＬＮＰ群（ルシフェラーゼ及びＥＰＯ）に当てはまる。これらＰＬフリーの組成物の有効性が影響を受けていないことを考えると、それらのサイトカイン誘導の減少は、治療指数の著しい向上をもたらす。

【表47】

【0380】

実施例１９ ＰＥＧ含量を増加させたＰＬフリーＬＮＰは刺激性が低い
この実施例は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫刺激のさらなる減少が、ＰＬフリーのｍＲＮＡ－ＬＮＰのＰＥＧ成分を増加させることによって、この場合もやはり活性を損なうことなく、どのように達成され得るかを示している。以下のｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物（表４８）を、ＥＰＯ ｍＲＮＡペイロードを用いて実施例１７に記載の通りに調製した。

【表48】

【0381】

雌のＢａｌｂ／Ｃ（ｎ＝４）がその後０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍＲＮＡ）のＬＮＰの静脈内投与を受けた。６時間後、動物をケタミン／キシラジンで安楽死させた。血液をナトリウムＥＤＴＡのマイクロティナチューブに採取した。これらチューブはすべて１６０００×ｇ及び１６℃で５分間遠心分離し、血漿を単離した。血漿試料をサイトカインＭＣＰ－１及びＩＬ－６についてＥＬＩＳＡにより分析した（ＥＬＩＳＡアッセイならびにキャプチャー／検出抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。表４９の結果もやはり、ＰＬフリーのＬＮＰ組成物に対する炎症反応がどのようにベース組成物と比較して著しく減少されたかを示している。これらＰＬフリーの組成物の有効性が影響を受けていないことを考えると、それらのサイトカイン誘導の減少は、治療指数の著しい向上をもたらす。

【表49】

【0382】

これらの結果は、ＰＬフリー製剤内でＰＥＧ脂質の量を３．３ｍｏｌ％まで増加させることで（３．３：５５の化合物１３ＰＬフリーｍＲＮＡ－ＬＮＰ）、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫刺激のさらなる減少が達成され得ることを示している。３．３：５５組成物の効力を次に調べた。

【0383】

実施例２０ 高ＰＥＧのＰＬフリーｍＲＮＡ－ＬＮＰは、驚異的な強さを維持し、より高い治療指数を示す
この実施例は、高ＰＥＧのＰＬフリーの３．３：５５ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物が、ベースのＰＬ含有組成物と全く同じように有効であることを示す。この場合もやはり、３．３：５５組成物の免疫刺激の低下、ひいては治療指数の改善を示している。以下のＬＮＰを、ＥＰＯペイロードを用いて実施例１７に記載の方法を用いて調製した（表５０）。

【表50】

【0384】

雌のＢａｌｂ／Ｃ（ｎ＝４）がその後０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍＲＮＡ）のＬＮＰの静脈内投与を受けた。６時間後、動物をケタミン／キシラジンで安楽死させた。２時間、３時間、４時間、及び５時間の時点で採血を行い、２０μＬの血液を、５μＬの５０ｍｇ／Ｌヘパリンを含むチューブに採取した。６時間の時点で、動物を致死量のケタミン／キシラジンで安楽死させた。少量（２０μＬ）の末端血液を５μＬの５０ｍｇ／Ｌヘパリンを含むチューブに採取し、残りの血液はナトリウムＥＤＴＡマイクロティナチューブに採取した。チューブは１６０００×ｇ及び１６℃で５分間遠心分離し、血漿を単離した。

【0385】

ヘパリン血漿をＥＰＯ濃度についてＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製のキット）で分析した。表５１に示すように、すべての時点で、ＰＬ含有ｍＲＮＡ－ＬＮＰ及び３．３：５５のＰＬフリー製剤の有効性は同等である。

【表51】

【0386】

血漿試料をサイトカインＭＣＰ－１及びＩＬ－６についてＥＬＩＳＡにより分析した（ＥＬＩＳＡアッセイならびにキャプチャー／検出抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。表５２の結果は、実施例１９のデータを裏付け、この場合もやはり、高ＰＥＧのＰＬフリーのＬＮＰ組成物に対する炎症反応がどのようにベース組成物と比較して著しく減少されるかを示している。

【表52】

【0387】

総合すれば、これらの結果は、ＰＬフリー製剤の使用で、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤の治療指数を高めることができ、さらに、ＰＥＧをより多くの量（例えば、３．３ｍｏｌ％）含めるように製剤を変更することで、治療指数をさらに高くすることができることを示している。

【0388】

実施例２１ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫刺激の無効化のためのＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡの使用
この実施例は、通常のシリカ膜で精製されたＬＮＰ中のｍＲＮＡを、逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡで置き換えることによって、どのようにｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫刺激の低減が達成され得るかを示す。いずれかの方法で精製されたマウスエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡをＬＮＰに製剤化し、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにｉｖ経路で注入した。注入の４時間後、動物をサクリファイスし、血漿及び肝臓組織を有効性ならびに免疫刺激について分析した。

【0389】

ＬＮＰは、通常のＬｉｐｏＭｉｘｅｒ技術で調製した。簡潔には、１００％エタノール中、７．３６ｍｇ／ｍＬの脂質溶液を、脂質ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ_２０００－Ｃ－ＤＭＡ：化合物１３を以下のモル比、すなわち、１０．９：３２．８：１．６４：５４．６、ｍｏｌ％で含めて調製した。ｍＲＮＡペイロードを４０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ４．５）に濃度０．３６６ｍｇ／ｍＬで可溶化した。Ｊｅｆｆらによって記載された直接希釈法を用いて、各溶液の等量（１．６ｍＬ）を、Ｔ字型コネクタを通して２５０ｍＬ／分で混合した。得られた混合物を続いて約４容量のｐＨ７．４のＰＢＳ（５．９ｍＬ）を含むチューブに直接採取した。これらの製剤をＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析ユニット（ＭＷＣＯ １０，０００）に入れ、１００容量のｐＨ７．４のＰＢＳに対して一夜透析した。透析後、それらの製剤を、ＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮装置（ＭＷＣＯ １００，０００）を用いて約０．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0390】

雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５）が、ＰＢＳ、または通常通りに精製された（シリカ膜）もしくはＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡペイロードのいずれかを有するＬＮＰの静脈（尾静脈）投与を受けた。このｍＲＮＡ転写物は、マウスエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードした。各動物は、０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡに相当する用量を受けた。注入の４時間後、動物を致死量のケタミン／キシラジンで安楽死させた。末端血液の少量（２０μＬ）を５μＬの５０ｍｇ／Ｌヘパリンを含むチューブに採取し、残りの血液はＮａ ＥＤＴＡのマイクロティナチューブに採取した。チューブはすべて１６０００×ｇ及び１６℃で５分間遠心分離し、血漿を単離した。左側葉の半分を１．５ｍＬのＲＮＡＬａｔｅｒに採取し、４℃で少なくとも１６時間保存した。

【0391】

ヘパリン血漿（ＥＬＩＳＡ希釈剤で１：４０００に希釈）を標準マウスＥＰＯ ＥＬＩＳＡ分析（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのキット）に用いた。表５３に見られるように、高度に（ＨＰＬＣ）精製されたＥＰＯ ｍＲＮＡを含むＬＮＰの有効性は、通常通り（シリカ膜）精製されたＥＰＯ ｍＲＮＡのものと極めて類似している。ＰＢＳで処理されたマウスの血漿内に見られるＥＰＯの通常のレベルは１００～２００ｎｇ／ｍＬである。従って、組み込まれるＥＰＯ ｍＲＮＡの純度にかかわらず、封入されたｍＥＰＯからのＥＰＯの肝臓の遺伝子発現のレベルは極めて高い。

【0392】

ｍＲＮＡ－ＬＮＰによって引き起こされる免疫刺激のレベルを測定するため、ＬＮＰで処理された動物に関する肝臓内のＩＦＩＴ ｍＲＮＡの倍数増加（ＰＢＳで処理された動物に対して）を測定した。これは、当業者がｍＲＮＡ－ＬＮＰによって引き起こされる免疫刺激のレベルを評価するために使用することができるアッセイの一例である。ある特定の実施形態では、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡ－ＬＮＰは、対照より大幅に低い免疫刺激を誘導し、これは、ある特定の実施形態では、ＩＦＩＴ反応で特徴づけられる。ＩＦＮ誘導性ＩＦＩＴ１ ｍＲＮＡ、すなわち、Ｉ型ＩＦＮに反応して最も強く誘導されるｍＲＮＡを、免疫刺激のより高感度な尺度として用いた。検出可能な血漿ＩＦＮタンパク質の非存在下であっても、核酸を有するＬＮＰで処理されたマウスにおいて、肝臓及び脾臓の両方で強いＩＦＩＴ１ ｍＲＮＡの誘導を観察することができる。これは、恐らく全身性のサイトカイン反応として現れない局所的なＩＦＮの誘導を反映する。このＩＦＩＴ１アッセイでは、ＩＦＩＴ１ ｍＲＮＡの肝細胞中の量を定量し、通常は一定のままであるハウスキーピング遺伝子（通常はＧＡＰＤ）のｍＲＮＡレベルに対して正規化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０キット（分岐ＤＮＡに基づくアッセイ）を用いて、両遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定した。

【0393】

肝臓の左側葉約２０～２５ｍｇ（ＲＮＡＬａｔｅｒ中で保存）をホモジナイズした。ＩＦＩＴ及びハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤ両方の相対的ｍＲＮＡレベルを、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０アッセイを用いて測定した。ＩＦＩＴ値は各動物群についてＧＡＰＤに対して正規化し、ＰＢＳ対照群に対する倍数増加として表した。表５４の結果は、シリカ膜で精製されたｍＲＮＡペイロードを有するＬＮＰは、ＰＢＳ群に対して６２７倍のＩＦＩＴの増加をもたらしたことを示している。ＨＰＬＣで精製されたペイロードを有するＬＮＰで処理されたマウスは、ＰＢＳに対して２１倍の増加しか示していない。従って、それらはシリカ膜で精製されたｍＲＮＡを有する粒子より刺激性が約３０倍低い。ある特定の実施形態では、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡを有するナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の３０倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。ある特定の実施形態では、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡを有するナノ粒子製剤は、リン酸緩衝生理食塩水の参照ＩＦＩＴ反応の１０もしくは２０もしくは３０もしくは４０もしくは５０もしくは６０もしくは７０もしくは８０もしくは９０または１００倍を超えないＩＦＩＴ反応を有する。

【0394】

免疫刺激能のさらなる比較を、サイトカイン（ＭＣＰ－１及びＩＬ－６）ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＥＤＴＡ血漿の分析によって得た。血漿をＥＬＩＳＡ希釈剤に希釈し（１：８または１：８０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製キャプチャー及び検出抗体によるＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＭＣＰ－１及びＩＬ－６の存在レベルについて分析した。ＭＣＰ－１のレベルは、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡの組み込みで劇的に減少している（３７１０６ｐｇ／ｍＬから１０５ｐｇ／ｍＬに減少）。同様に、別のサイトカイン（ＩＬ－６）もまた、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡを使用した場合に劇的に減少している（４８０５ｐｇ／ｍＬから２２ｐｇ／ｍＬに減少）。結果を表５５に示す。

【0395】

総合すれば、これらの結果は、ＨＰＬＣで精製されたｍＲＮＡペイロードを有するＬＮＰ粒子は、精製度が低い（例えば、通常のシリカ膜で精製された）ｍＲＮＡペイロードを備えたものより大幅に刺激性が低いことを示している。有効性が悪影響を受けないことを考えると、このことは、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの治療指数の劇的な向上を表す。

【表53】

【表54】

【表55】

【0396】

本明細書で引用されたすべての文書は参照することにより組み込まれる。発明のある特定の実施形態を説明し、多くの詳細を例示の目的で記載してきたが、該詳細の一部は、本発明の基本原則から逸脱することなく変更することができる。

【0397】

発明の実施形態を記載する文脈における「ａ」及び「ａｎ」ならびに「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の用語の使用は、本明細書で別段に示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に断りのない限り、オープンエンドな用語であると解釈される（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）。本明細書における値の範囲の記述は、本明細書において別段の指示がない限り、該範囲内に含まれる別々の値の各々に個々に言及する簡単な方法としての機能を果たすことを単に意図し、別々の値の各々は、それが本明細書に個々に記載されたものとして本明細書に組み込まれる。本明細書に詳述された順序に加えて、本明細書に記載の方法は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾がない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書に提供するありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「等」）の使用は、発明の実施形態を単により良好に明らかにすることを意図し、特許請求の範囲において具体的に記載されない限り、必ずしも本発明の範囲を制限するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、請求されていない任意の要素が本発明を実施する上で必須であることを示すと解釈されるべきではない。

【手続補正書】

【提出日】2022-07-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【外国語明細書】