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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022112027
(43)【公開日】2022-08-01
(54)【発明の名称】抗ＥＧＦＲ抗体－薬剤コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C07K 16/22 20060101AFI20220725BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220725BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220725BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20220725BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220725BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220725BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220725BHJP
【ＦＩ】
C07K16/22 ZNA
C07K16/46
A61P35/00
A61K38/07
A61K39/395 L
A61K47/68
C12N15/13
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022006937
(22)【出願日】2022-01-20
(31)【優先権主張番号】63/139,766
(32)【優先日】2021-01-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】512212195
【氏名又は名称】アッヴィ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アーウィン・アール・ボガート
(72)【発明者】
【氏名】ミラン・ブランコ
(72)【発明者】
【氏名】アンドリュー・シー・フィリップス
(72)【発明者】
【氏名】アンドリュー・ジェイ・サワーズ
(72)【発明者】
【氏名】カメル・イゼラドジェン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン・イー・ハーラン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB13
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF11
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA16
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA59
4C084DA32
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA14
4C085AA27
4C085BB36
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA51
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA50
4H045FA74
4H045GA21
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Ｂｃｌ－ｘＬを阻害する新規な抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製方法、およびそれを用いて非小細胞肺がんを治療する方法を提供する。
【解決手段】特定の構造を有するＢｃｌ－ｘＬ阻害剤にコンジュゲートした、特定のアミノ酸配列を有する抗ヒト上皮成長因子受容体（ｈＥＧＦＲ）抗体薬剤コンジュゲートを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】特定の構造を有するＢｃｌ－ｘＬ阻害剤にコンジュゲートした、特定のアミノ酸配列を有する抗ヒト上皮成長因子受容体（ｈＥＧＦＲ）抗体薬剤コンジュゲートを提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の構造を含む抗ヒト上皮成長因子受容体（ｈＥＧＦＲ）抗体－薬剤コンジュゲート：
（式中、Ａｂは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＩｇＧ１抗ｈＥＧＦＲ抗体であり、ｍは２である）。
【化1】
【請求項2】
式（Ｉ）の構造が、抗体Ａｂに重鎖のＣ２２０を介してコンジュゲートしている、請求項１に記載の抗体－薬剤コンジュゲート。
【請求項3】
式（ＩＩ）の構造を含む、請求項１に記載のＡＤＣ：
【化2】
【請求項4】
式（ＩＩＩ）の構造を含む、請求項１に記載のＡＤＣ：
【化3】
【請求項5】
抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を製造する方法であって、モノクローナルヒトＩｇＧ１抗ＥＧＦＲ抗体を、以下の構造を含むシントンとコンジュゲートさせて、
抗ＥＧＦＲ抗体にコンジュゲートした薬剤－リンカーを含む抗体－薬剤コンジュゲートを形成するステップを含み、前記抗ＥＧＦＲ抗体が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、前記薬剤－リンカーが、前記抗体に重鎖のＣ２２０を介してコンジュゲートしている、方法。
【化4】
【請求項6】
以下の構造を含む抗ヒト上皮成長因子受容体抗体－薬剤コンジュゲートを調製する製法であって：
（式中、Ａｂは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＩｇＧ１抗ヒト上皮成長因子受容体抗体であり、ｍは２である。）
前記製法は、
約１６～２４時間、有効量のジスルフィド還元剤を含む緩衝水溶液中で抗体を処理することと、
還元された抗体溶液に、以下の構造を有するシントンを含むジメチルアセトアミドの溶液を添加し、
反応させて、ＡＤＣを形成させることと
を含み、
電子スプレー質量分析によって測定したとき、質量が、スクシンイミドのスクシンアミドへの各加水分解において１８±２ａｍｕシフトし、
ＡＤＣが、任意選択的に疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製される、製法。
【化5】
前記製法は、
約１６～２４時間、有効量のジスルフィド還元剤を含む緩衝水溶液中で抗体を処理することと、
還元された抗体溶液に、以下の構造を有するシントンを含むジメチルアセトアミドの溶液を添加し、
【化6】
を含み、
電子スプレー質量分析によって測定したとき、質量が、スクシンイミドのスクシンアミドへの各加水分解において１８±２ａｍｕシフトし、
ＡＤＣが、任意選択的に疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製される、製法。
【請求項7】
請求項５又は６のいずれか一項により調製された抗体－薬剤コンジュゲート。
【請求項8】
非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療上有効量の請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体－薬剤コンジュゲートを投与することを含む方法。
【請求項9】
有効量の請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体－薬剤コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、Ｂｃｌ－ｘＬを阻害する新規な抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関し、これは、かかるＡＤＣを用いた組成物及び方法、並びにかかるＡＤＣの作製方法も含む。
【背景技術】
【0002】
ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ－１又はＥｒｂ－Ｂ１としても公知であり、本明細書においては「ＥＧＦＲ」と称する。）は、ｃ－ｅｒｂＢプロトオンコジーンによってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通受容体である。（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３：２２８－２３５（１９９６）、Ｈｅｒｂｓｔ ａｎｄ Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ ９４：１５９３－１６１１（２００２））。ヒトＥＧＦＲの配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３として提供されている。
【0003】
ＥＧＦＲによるリガンド結合は、受容体のホモ－及び／又はヘテロ二量体化、並びに鍵となる細胞質側の残基及びＭＵＣ１の自己リン酸化を始動させる。リン酸化されたＥＧＦＲは、複雑な下流側のシグナル伝達カスケードを活性化する。ＥＧＦＲの過剰発現は、多数のヒトの悪性症状において報告され、患者の予後不良と関連するものであることが分かっている。（Ｈｅｒｂｓｔ ａｎｄ Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ ９４：１５９３－１６１１（２００２）、及びＭｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３：２２８－２３５（１９９６））。
【0004】
抗体薬剤コンジュゲートは、化学リンカーを介して細胞毒性薬剤にコンジュゲートした抗体を含む治療薬のクラスを表す。皮膚におけるＥＧＦＲ発現、及びＥＧＦＲを標的とする抗体における公知の皮膚毒性のため、ＥＧＦＲに対するＡＤＣを設計することは困難であった。抗ＥＧＦＲ抗体及び抗体－薬剤コンジュゲートは、米国特許第９，４９３，５６８号及び米国特許出願公開第２０１９／０３４３９６１号にも記載されており、それらは全体が本明細書において参照により組み込まれる。ＥＧＦＲ ＡＤＣの第１世代は、デパツキシズマブ マフォドチンであり、それはマレイミドカプロイルリンカー及び微小管細胞毒のモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を使用するものである。しかしながら、ｄｅｐａｔｕｘ－ｍの投与を受ける患者は、頻繁な眼の副作用（例えば、ドライアイ、不明瞭な見え方、目の痛み、羞明、角膜炎、角膜沈着及び流涙）を経験する。
【0005】
ｄｅｐａｔｕｘ－ｍの眼毒性を踏まえ、ＥＧＦＲを標的とする第２世代のＡＤＣであるロサツキシズマブ ベドチンは、異なる毒素とコンジュゲートさせたものであった。このＡＤＣの抗体成分であるロサツキシズマブは親和性成熟されたものであり、それはｄｅｐａｔｕｘ－ｍと比較しＥＧＦＲ（野生型及び突然変異体）に対してより高い親和性を有するものであった。しかしながら、比較的高い頻度でインフュージョンリアクションが生じたため、ロサツキシズマブ ベドチンのフェーズ１試験は早期に中止された。Ｃｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ３８，１４８３－１４９４（２０２０）を参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許第９，４９３，５６８号明細書
【特許文献2】米国特許出願公開第２０１９／０３４３９６１号明細書
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３：２２８－２３５（１９９６）
【非特許文献2】Ｈｅｒｂｓｔ ａｎｄ Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ ９４：１５９３－１６１１（２００２）
【非特許文献3】Ｃｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ３８，１４８３－１４９４（２０２０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
したがって、新規な抗ＥＧＦＲ ＡＤＣの開発に対するニーズが存在し、特にＢｃｌ－ｘＬを選択的に標的がん細胞（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞）に送達することができるＥＧＦＲ ＡＤＣは、重要な発見となる。
【課題を解決するための手段】
【0009】
（要旨）
１つの態様は、抗体Ａｂにコンジュゲートした式（Ｉ）の構造を含む、抗ヒト上皮成長因子受容体（ｈＥＧＦＲ）抗体薬剤コンジュゲートに関し：
１つの態様は、抗体Ａｂにコンジュゲートした式（Ｉ）の構造を含む、抗ヒト上皮成長因子受容体（ｈＥＧＦＲ）抗体薬剤コンジュゲートに関し：
【0010】
【化1】
【0011】
他の態様は、抗体Ａｂにコンジュゲートした式（ＩＩ）の構造を含む、抗ヒト上皮成長因子受容体抗体－薬剤コンジュゲートに関し：
【0012】
【化2】
【0013】
他の態様は、抗体Ａｂにコンジュゲートした式（ＩＩＩ）の構造を含む、抗ヒト上皮成長因子受容体抗体－薬剤コンジュゲートに関し：
【0014】
【化3】
【0015】
他の態様は、抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製する方法に関し、それはモノクローナルヒトＩｇＧ１抗ＥＧＦＲ抗体を、構造（ＡＡＡ）を含むシントンとコンジュゲートして、
【0016】
【化4】
【0017】
他の態様は、式（Ｉ）の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製のための製法に関し：
【0018】
【化5】
ｍは２であり、
製法は、
約１６～２４時間、有効量のジスルフィド還元剤を含む緩衝水溶液中で抗体を処理することと、
還元された抗体溶液に、以下の構造を有するシントンを含むジメチルアセトアミドの溶液を添加することと：
【0019】
【化6】
を含み、
電子スプレー質量分析によって測定したとき、質量は、スクシンイミドのスクシンアミドへの各加水分解において１８±２ａｍｕシフトし、
ＡＤＣは任意選択的に疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製される。実施形態において、緩衝水溶液は、約ｐＨ７．４で緩衝された水溶液である。実施形態において、抗体は、約４℃で約１６～２４時間、緩衝水溶液中のジスルフィド還元剤で処理される。実施形態において、還元された抗体は、シントンを含むジメチルアセトアミドの溶液に添加され、反応は約６０分間実施され、ＡＤＣが形成される。実施形態において、ＡＤＣが形成された後、約２当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインによって反応はクエンチされる。実施形態において、製法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により精製することを更に含む。実施形態において、製法は、ｐＨ緩衝液（例えば約８～９のｐＨ緩衝液）によりスクシンイミドを加水分解することを更に含む。実施形態において、製法は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により精製することを更に含む。実施形態において、リンカー－薬剤は、重鎖のＣ２２０（すなわち、配列番号１のＣ２１９）を介して抗ＥＧＦＲ抗体Ａｂにコンジュゲートされる。
【0020】
他の態様は、モノクローナルヒトＩｇＧ１抗ＥＧＦＲ抗体を、以下の構造を含むシントンとコンジュゲートさせるステップを含む方法により調製された、抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関し、
【0021】
【化7】
【0022】
他の態様は、式（Ｉ）の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製のための製法に関し：
【0023】
【化8】
ｍは２であり、
製法は、
約４℃で約１６～２４時間、有効量のジスルフィド還元剤を含む約ｐＨ７．４の緩衝水溶液中で抗体を処理することと、
還元された抗体溶液を周囲温度に加温することと、
還元された抗体溶液に、以下の構造を有するシントンを含むジメチルアセトアミドの溶液を添加することと：
【0024】
【化9】
約２当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインによってクエンチすることと、
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製することと、
タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって精製することと、
約８～９のｐＨの緩衝液によってスクシンイミドを加水分解することと、
タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって精製することと
を含み、
電子スプレー質量分析によって測定したとき、質量は、スクシンイミドのスクシンアミドへの各加水分解において１８±２ａｍｕシフトし、
ＡＤＣは、任意選択的に疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製される。実施形態において、リンカー－薬剤は、重鎖のＣ２２０（すなわち、配列番号１のＣ２１９）を介して抗ＥＧＦＲ抗体にコンジュゲートしている。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【発明を実施するための形態】
【0026】
（配列表の簡単な説明）
本明細書において開示される配列番号１から配列番号３０のアミノ酸配列を含む、「ＡＢＶ１２６０８ＵＳＯ１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題する配列表は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。配列表は、ＥＦＳを通じて、ＡＳＣＩＩテキストフォーマットにおいて本明細書と共に提出された。配列表は最初に、２０２２年１月１３日に製造され、７１，０５２バイトのサイズである。
本明細書において開示される配列番号１から配列番号３０のアミノ酸配列を含む、「ＡＢＶ１２６０８ＵＳＯ１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題する配列表は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。配列表は、ＥＦＳを通じて、ＡＳＣＩＩテキストフォーマットにおいて本明細書と共に提出された。配列表は最初に、２０２２年１月１３日に製造され、７１，０５２バイトのサイズである。
【0027】
（詳細な説明）
本開示の各種の態様は、新規な抗ＥＧＦＲ抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ、また免疫複合体とも呼ばれる。）及びその医薬組成物に関する。特に、本開示は、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤を含む新規な抗ＥＧＦＲ ＡＤＣ、ＡＤＣを合成するために有用なシントン、ＡＤＣを含む組成物、ＡＤＣを製造する方法、及びＡＤＣを使用する各種の方法を記載する。
本開示の各種の態様は、新規な抗ＥＧＦＲ抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ、また免疫複合体とも呼ばれる。）及びその医薬組成物に関する。特に、本開示は、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤を含む新規な抗ＥＧＦＲ ＡＤＣ、ＡＤＣを合成するために有用なシントン、ＡＤＣを含む組成物、ＡＤＣを製造する方法、及びＡＤＣを使用する各種の方法を記載する。
【0028】
当業者に明らかなように、本明細書において記載される各種のＢｃｌ－ｘＬ阻害剤、ＡＤＣ及び／又はＡＤＣシントンは、塩の形態であってもよく、また特定の実施形態では、特に薬学的に許容される塩であってもよい。十分に酸性の、十分に塩基性の、又はそれらの両方の官能性基を有する本開示の化合物は、いくつかの無機塩基、並びに無機及び有機酸のいずれかと反応して塩を形成することができる。あるいは、固有的に荷電された化合物（例えば四級窒素を有するもの）は、適切な対イオンと共に塩を形成することができる。
【0029】
本明細書の開示において、構造図及び命名法が含まれる場合であって、命名法が構造図と矛盾する場合、構造図が優先される。
【0030】
定義
本発明をより容易に理解するため、特定の用語については最初に定義する。加えて、パラメータの数値又は数値範囲が記載されるときは、記載された値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されている点に留意すべきである。更に、本明細書において特に定義されない限り、本開示に関連して使用する科学的及び技術的用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。
本発明をより容易に理解するため、特定の用語については最初に定義する。加えて、パラメータの数値又は数値範囲が記載されるときは、記載された値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されている点に留意すべきである。更に、本明細書において特に定義されない限り、本開示に関連して使用する科学的及び技術的用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。
【0031】
本明細書中で使用する「抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体」なる用語は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体を指す。目的の抗原（すなわちＥＧＦＲ）に「結合する」抗体は、十分な親和性でその抗原に結合することができるものであり、それにより、抗体はその抗原を発現する細胞を標的とする際に有用である。実施形態において、抗体は、ヒトＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ）と特異的に結合する。抗ＥＧＦＲ抗体の例は、以下で開示する。特に明記しない限り、用語「抗ＥＧＦＲ抗体」は、野生型ＥＧＦＲ又はいかなるＥＧＦＲの変異体（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）とも結合する抗体を指すものとする。
【0032】
野生型ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列は、シグナルペプチド（アミノ酸残基１～２４）及び細胞外ドメイン（ＥＣＤ、アミノ酸残基２５～６４５）のアミノ酸残基を含むものとして下記の配列番号１５として示す。ＥＧＦＲの短縮された野生型ＥＣＤ（また、本明細書においてＥＧＦＲ（１－５２５）と称する。）は、配列番号１６に対応し、配列番号１５のアミノ酸１～５２５に相当する。野生型ＥＧＦＲの成熟形態は、シグナルペプチドのないタンパク質（すなわち、配列番号１５のアミノ酸残基２５～１２１０）に対応する。
【0033】
ヒトＥＧＦＲのＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号１７として下記に示され、シグナル配列を含む。
【0034】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ヒトがんにおいて最も一般に生じるＥＧＦＲ変異体である（Ｋｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３－９６（２００１））。遺伝子増幅プロセスの間、融合ジャンクションにグリシン残基が挿入された形で、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける２６７アミノ酸の欠失が生じる。すなわち、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、野生型ＥＧＦＲの細胞外ドメインのアミノ酸６～２７３を欠失し、及びジャンクションにおけるグリシン残基挿入を含む。ＥＧＦＲのＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体は、細胞外ドメインにおいて２６７アミノ酸残基が欠失し、そこでは欠失ジャンクションにおいてグリシンが挿入されている。ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸配列を配列番号１８として下記に示す。
【0035】
本明細書で用いられる用語「特異的な結合」又は「特異的に結合」は、抗体又はＡＤＣの第２の化学種との相互作用に関しては、その相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依ることを意味し、例えば、抗体は、タンパク質一般というよりは、むしろ特異的なタンパク質の構造を認識し、結合する。抗体又はＡＤＣがエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」及び抗体を含む反応においては、エピトープＡ（又は、遊離の非標識のＡ）を含む分子の存在により、抗体又はＡＤＣに結合する標識されたＡの量は減少する。
【0036】
用語「抗体」は、抗原に特異的に結合し、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨとして本明細書において略記する。）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬとして本明細書において略記する。）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨ及びＶＬの領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域と、それと共に点在するより保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域と、に更に分割することができる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて以下の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【0037】
ある種の実施形態では、抗体は、重鎖のカルボキシ末端における１～５つのアミノ酸の欠失を有する重鎖を含むことができる。
【0038】
本明細書で用いられる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、ＥＧＦＲと特異的に結合する単離された抗体は、ＥＧＦＲ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。しかしながら、ＥＧＦＲと特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（例えば他の種由来のＥＧＦＲ分子）と交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞性の材料及び／又は化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【0039】
用語「エピトープ」は、抗体又はＡＤＣが結合する抗原の領域を指す。実施形態において、エピトープの決定要素としては、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの、分子表面の化学的に活性な基の群が挙げられ、実施形態において、特異的な３次元構造特徴及び／又は特異的な電荷特性を有し得る。実施形態において、抗体は、それがタンパク質及び／又は巨大分子の複合体混合物中においてその標的抗原を優先的に認識するとき、抗原と特異的に結合するという。実施形態において、本発明の抗体は、ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号２０）（ｈＥＧＦＲの成熟形態のアミノ酸残基２８７～３０２に対応する。）のアミノ酸配列によって定義されるエピトープに対して結合する。
【0040】
本明細書で用いられる用語「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス（例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する。）の中でタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムな生物学的特異的相互作用の分析を可能にする光学的現象を指す。更なる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９－２６、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０－６２７、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５－１３１、及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８－２７７を参照されたい。
【0041】
本明細書で使用される用語「ｋａ」は、抗原に対して抗体が会合して抗体／抗原複合体を形成する際の結合速度定数を指すものとする。
【0042】
本明細書で使用される用語「ｋｄ」は、抗体／抗原複合体から抗体が解離する際の解離速度定数を指すものとする。
【0043】
本明細書で使用される用語「ＫＤ」、は、特定の抗体－抗原相互作用（例えば、ＡＭ２抗体及びＥＧＦＲ）の平衡解離定数を指すものとする。ＫＤは、ｋａ／ｋｄによって算出される。
【0044】
用語「抗体－薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」は、任意に治療薬又は細胞毒性剤であり得る１つ以上の化学薬剤（また、本明細書において、薬剤、弾頭又はペイロードと称される。）に化学的に連結された結合タンパク質（例えば抗体又はその抗原結合フラグメント）を指す。実施形態において、ＡＤＣは、抗体と、細胞毒性剤又は治療薬と、抗体への薬剤の付着又はコンジュゲーションを可能にするリンカーとを含む。本発明では、ＡＤＣは、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤にリンカーを介してコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ抗体を含む。
【0045】
用語「抗上皮成長因子抗体薬剤コンジュゲート」、「抗ＥＧＦＲ抗体薬剤コンジュゲート」又は「抗ＥＧＦＲ ＡＤＣ」（本明細書において交換可能に使用される。）は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体を含むＡＤＣであり、そこでは該抗体は１つ以上の化学薬剤にコンジュゲートしている。本発明では、抗ＥＧＦＲ ＡＤＣは、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤にコンジュゲートした抗体ＡＭ２を含む。
【0046】
抗ＥＧＦＲ抗体及び抗体薬剤コンジュゲート
本明細書に記載されている抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲに結合する能力を有する本開示のＡＤＣをもたらし、それにより、抗体に結合した細胞毒性的なＢｃｌ－ｘＬ薬剤が、ＥＧＦＲを発現する細胞に送達され得るようになる。
本明細書に記載されている抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲに結合する能力を有する本開示のＡＤＣをもたらし、それにより、抗体に結合した細胞毒性的なＢｃｌ－ｘＬ薬剤が、ＥＧＦＲを発現する細胞に送達され得るようになる。
【0047】
実施形態において、本開示は、抗ＥＧＦＲ ＩｇＧ１抗体を提供する。実施形態において、ヒト化ＩｇＧ１抗ＥＧＦＲ抗体は、ＡＭ２である。ＡＭ２抗体は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号４で表わされるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号６で表わされるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン、配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８で表わされるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域とを含む。ＡＭ２抗体は、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３で表わされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。ＡＭ２抗体は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【0048】
ＡＭ２抗体は、デパツキシズマブ（デパツキシズマブ マフォドチンＡＢＴ－４１４の抗体成分として使用される。）よりも高い親和性で、活性ＥＧＦＲの高次構造を模倣するＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の短縮形態に結合する。ＥＧＦＲの活性形態に対するこの著しく増加された親和性にもかかわらず、ＡＭ２は、全長の野生型ＥＧＦＲ ＥＣＤに対する結合性は全く欠いている。ＡＭ２抗体は、ＡＭ１抗体（ロサツキシズマブ、ロサツキシズマブ ベドチンＡＢＢＶ－２２１の抗体成分として使用される。）の結合特徴を維持するが、異なる配列を有し、潜在的な安全性の問題（例えばＡＢＢＶ－２２１によって観察されるインフュージョンリアクション）を緩和する。ＡＭ２抗体は、ロサツキシズマブのｚ、非ａアロタイプとは対照的に、ｚ、ａアロタイプである。ＡＭ２抗体は、ＬＡＬＡ突然変異が組み込まれており、それによりＦｃγ受容体との相互作用が低減される。ＡＭ２はまた、Ｃ６ｖ１（ＬＣ：Ｃ２１４Ａ）突然変異が組み込まれており、部位特異的なコンジュゲーション及びＤＡＲの制御が可能である。まとめると、ＡＭ２の新規な配列は、従来の抗ＥＧＦＲ ＡＤＣに存在する潜在的な安全性の問題が緩和されている。
【0049】
抗体は、いくつかの技術のいずれかによって産生され得る。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクションし、その宿主細胞から発現させる。
【0050】
実施形態において、本開示は、シントンにコンジュゲートした抗ｈＥＧＦＲ抗体を含む抗ｈＥＧＦＲ ＡＤＣを提供し、シントンは、６－｛８－［（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）カルバモイル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル｝－３－［１－（｛３－［２－（｛［（２－｛２－［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－６－カルボキシ－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル］エチル｝－４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（２－｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝アセトアミド）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝フェニル）メトキシ］カルボニル｝［（３Ｓ）－３，４－ジヒドロキシブチル］アミノ）エトキシ］－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル｝メチル）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］ピリジン－２－カルボン酸（「ＡＡＡ」）である：
【0051】
【化10】
【0052】
実施形態において、本開示は、以下の構造を含む抗ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体－薬剤コンジュゲートを提供する：
【0053】
【化11】
【0054】
実施形態において、本開示は、以下の構造を含む抗ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体－薬剤コンジュゲートを提供する：
【0055】
【化12】
【0056】
実施形態において、本開示は、以下の構造を含む抗ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体－薬剤コンジュゲートを提供する：
【0057】
【化13】
【0058】
実施形態において、本開示の抗体及び抗体－薬剤コンジュゲート（例えばＡＭ２抗体及びＡＭ２－ＡＡＡ ＡＤＣ）は、ＥＧＦＲ（１～５２５）（配列番号１６）と、表面プラズモン共鳴により測定したとき、１ｘ１０－６Ｍ以下の、例えば１ｘ１０－６Ｍ～１ｘ１０－１０Ｍの、又は約１ｘ１０－６Ｍ～１ｘ１０－７Ｍの解離定数（ＫＤ）で結合する。
【0059】
実施形態において、本開示の抗体（例えばＡＭ２抗体及びＡＭ２－ＡＡＡ ＡＤＣ）は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号１８）と、表面プラズモン共鳴により測定したとき、約６ｘ１０－９Ｍ以下の、又は約５．５ｘ１０－９Ｍ以下の、又は５．０ｘ１０－９Ｍ以下のＫＤで結合する。
【0060】
使用方法
一実施形態は、非小細胞肺がんを治療する方法に関し、該方法は、非小細胞肺がんを有する対象に、有効量の、本明細書に記載されている抗ＥＧＦＲ ＡＤＣを投与して、治療的利点を提供することを含む。
一実施形態は、非小細胞肺がんを治療する方法に関し、該方法は、非小細胞肺がんを有する対象に、有効量の、本明細書に記載されている抗ＥＧＦＲ ＡＤＣを投与して、治療的利点を提供することを含む。
【実施例0061】
以下の実施例は、Ｂｃｌ－ＸＬ阻害剤（実施例１．１．１７）及びシントン（ＡＡＡ、実施例１）の場合の合成法を提供する。例えばｂｃｌ－ｘＬ阻害剤及びＡＡＡなどのシントンを合成する方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１９／０３４３９６１号（ＡｂｂＶｉｅ，Ｉｎｃ．）に見出すことができ、その全開示内容を参照により本明細書に組み込む。
【0062】
実施例における命名は、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ ２０１２ ｒｅｌｅａｓｅ（Ｂｕｉｌｄ ５６０８４，０５ Ａｐｒｉｌ ２０１２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ ２０１４ ｒｅｌｅａｓｅ（Ｂｕｉｌｄ ６６６８７，２５ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ ２０１９．１．１ ｒｅｌｅａｓｅ（Ｂｕｉｌｄ １１０５５５，１８ Ｊｕｌｙ ２０１９，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｖｅｒ．９．０．７（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｖｅｒ．１２．０（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、又はＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖｅｒ．１５．０．０．１０６を用いて行った。ＢＣＬ－ＸＬ阻害剤及びシントン中間体の命名は、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ ２０１２ ｒｅｌｅａｓｅ（Ｂｕｉｌｄ ５６０８４，０５ Ａｐｒｉｌ ２０１２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ ２０１４ ｒｅｌｅａｓｅ（Ｂｕｉｌｄ ６６６８７，２５ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ ２０１９．１．１ ｒｅｌｅａｓｅ（Ｂｕｉｌｄ １１０５５５，１８ Ｊｕｌｙ ２０１９，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｖｅｒ．９．０．７（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｖｅｒ．１２．０（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖｅｒ．１５．０．０．１０６により行った。
【0063】
本明細書で用いられる略語は、以下のとおりである：
【0064】
【表1】
【0065】
［実施例１］：６－｛８－［（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）カルバモイル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル｝－３－［１－（｛３－［２－（｛［（２－｛２－［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－６－カルボキシ－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル］エチル｝－４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（２－｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝アセトアミド）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝フェニル）メトキシ］カルボニル｝［（３Ｓ）－３，４－ジヒドロキシブチル］アミノ）エトキシ］－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル｝メチル）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］ピリジン－２－カルボン酸（シントンＡＡＡ）
【0066】
【化14】
【0067】
［実施例１．１．１］：３－ブロモ－５，７－ジメチルアダマンタン－１－カルボン酸
５０ｍＬの丸底フラスコに、０℃で臭素（１６ｍＬ）を添加した。鉄粉（７ｇ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。３，５－ジメチルアダマンタン－１－カルボン酸（１２ｇ）を添加した。混合物を室温に加温し、３日間撹拌した。氷及び濃ＨＣｌの混合物を反応混合物に注入した。得られた懸濁液を２回にわたりＮａ２ＳＯ３（２００ｍＬの水中、５０ｇ）で処理し、ジクロロメタンによって３回抽出した。有機画分を混合し、１ＮのＨＣｌ水溶液によって洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
５０ｍＬの丸底フラスコに、０℃で臭素（１６ｍＬ）を添加した。鉄粉（７ｇ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。３，５－ジメチルアダマンタン－１－カルボン酸（１２ｇ）を添加した。混合物を室温に加温し、３日間撹拌した。氷及び濃ＨＣｌの混合物を反応混合物に注入した。得られた懸濁液を２回にわたりＮａ２ＳＯ３（２００ｍＬの水中、５０ｇ）で処理し、ジクロロメタンによって３回抽出した。有機画分を混合し、１ＮのＨＣｌ水溶液によって洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
【0068】
【化15】
【0069】
［実施例１．１．２］：（３－ブロモ－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル）メタノール
テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）中の実施例１．１．１の溶液（１５．４ｇ）に、ＢＨ３（テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）中、１Ｍ）を添加し、混合物を一晩室温で撹拌した。次に反応混合物にメタノールを滴下して添加することによって慎重にクエンチした。次に混合物を真空下で濃縮し、残留物を酢酸エチル（５００ｍＬ）及び２Ｎ ＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）に分割した。水層を酢酸エチルによって２回更に抽出し、有機抽出液を混合して水及びブラインによって洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を濃縮し、標題化合物を得た。
テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）中の実施例１．１．１の溶液（１５．４ｇ）に、ＢＨ３（テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）中、１Ｍ）を添加し、混合物を一晩室温で撹拌した。次に反応混合物にメタノールを滴下して添加することによって慎重にクエンチした。次に混合物を真空下で濃縮し、残留物を酢酸エチル（５００ｍＬ）及び２Ｎ ＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）に分割した。水層を酢酸エチルによって２回更に抽出し、有機抽出液を混合して水及びブラインによって洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を濃縮し、標題化合物を得た。
【0070】
【化16】
【0071】
［実施例１．１．３］：１－［（３－ブロモ－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル）メチル］－１Ｈ－ピラゾール
トルエン（６０ｍＬ）中の実施例１．１．２（８．０ｇ）の溶液に、１Ｈ－ピラゾール（１．５５ｇ）及びシアノメチレントリブチルホスホラン（２．０ｇ）を添加し、混合物を一晩９０℃で撹拌した。反応混合物を濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し（１０：１のヘプタン：酢酸エチル）、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３２４．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
トルエン（６０ｍＬ）中の実施例１．１．２（８．０ｇ）の溶液に、１Ｈ－ピラゾール（１．５５ｇ）及びシアノメチレントリブチルホスホラン（２．０ｇ）を添加し、混合物を一晩９０℃で撹拌した。反応混合物を濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し（１０：１のヘプタン：酢酸エチル）、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３２４．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0072】
【化17】
【0073】
［実施例１．１．４］：２－（｛３，５－ジメチル－７－［（１Ｈ－ピラゾル－１－イル）メチル］アダマンタン－１－イル｝オキシ）エタン－１－オル
実施例１．１．３（４．０ｇ）のエタン－１，２－ジオール（１２ｍＬ）中の溶液に、トリエチルアミン（３ｍＬ）を添加した。混合物を、マイクロ波条件（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）下、１５０℃で４５分間撹拌した。混合物を水（１００ｍＬ）に注入し、酢酸エチルによって３回抽出した。混合した有機抽出液を水及びブラインによって洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の２０％酢酸エチルによって、続いてジクロロメタン中の５％のメタノールによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３０５．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１．１．３（４．０ｇ）のエタン－１，２－ジオール（１２ｍＬ）中の溶液に、トリエチルアミン（３ｍＬ）を添加した。混合物を、マイクロ波条件（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）下、１５０℃で４５分間撹拌した。混合物を水（１００ｍＬ）に注入し、酢酸エチルによって３回抽出した。混合した有機抽出液を水及びブラインによって洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の２０％酢酸エチルによって、続いてジクロロメタン中の５％のメタノールによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３０５．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0074】
【化18】
【0075】
［実施例１．１．５］：２－（｛３，５－ジメチル－７－［（５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－１－イル）メチル］アダマンタン－１－イル｝オキシ）エタン－１－オル
テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の実施例１．１．４（６．０５ｇ）の冷却（－７８℃）溶液に、ｎ－ブチルリチウム（４０ｍＬ、ヘキサン中の２．５Ｍ）を添加し、混合物を１．５時間－７８℃で撹拌した。ヨードメタン（１０ｍＬ）をシリンジによって添加し、混合物を３時間－７８℃で撹拌した。反応混合物を次にＮＨ４Ｃｌ水溶液によってクエンチし、酢酸エチルで２度抽出し、混合した有機抽出液を水及びブラインによって洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水した後、溶液を濾過及び濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の５％メタノールによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３１９．５（Ｍ＋Ｈ）＋．
テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の実施例１．１．４（６．０５ｇ）の冷却（－７８℃）溶液に、ｎ－ブチルリチウム（４０ｍＬ、ヘキサン中の２．５Ｍ）を添加し、混合物を１．５時間－７８℃で撹拌した。ヨードメタン（１０ｍＬ）をシリンジによって添加し、混合物を３時間－７８℃で撹拌した。反応混合物を次にＮＨ４Ｃｌ水溶液によってクエンチし、酢酸エチルで２度抽出し、混合した有機抽出液を水及びブラインによって洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水した後、溶液を濾過及び濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の５％メタノールによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３１９．５（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0076】
【化19】
【0077】
［実施例１．１．６］：２－（｛３－［（４－ヨード－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－１－イル）メチル］－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル｝オキシ）エタン－１－オル
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中の実施例１．１．５（３．５ｇ）の溶液に、Ｎ－ヨードスクシンイミド（３．２ｇ）を添加し、混合物を１．５時間室温で撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（６００ｍＬ）で希釈し、１０％ｗ／ｗ ＮａＨＳＯ３水溶液、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ４４５．３（Ｍ＋Ｈ）＋．
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中の実施例１．１．５（３．５ｇ）の溶液に、Ｎ－ヨードスクシンイミド（３．２ｇ）を添加し、混合物を１．５時間室温で撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（６００ｍＬ）で希釈し、１０％ｗ／ｗ ＮａＨＳＯ３水溶液、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ４４５．３（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0078】
【化20】
【0079】
［実施例１．１．７］：３－ブロモ－６－フルオロピリジン－２－カルボン酸
１：１ジクロロメタン／クロロホルム（４００ｍＬ）中の６－アミノ－３－ブロモピリジン－２－カルボン酸（２５ｇ）のスラリーを、１時間にわたり５℃のジクロロメタン（１００ｍＬ）中のニトロソニウムテトラフルオロボレート（１８．２ｇ）に添加した。得られた混合物を更に３０分間撹拌し、次に３５℃に加温し、一晩撹拌した。反応物を室温に冷却し、次にＮａＨ２ＰＯ４水溶液でｐＨを４に調整した。得られた溶液をジクロロメタンによって３回抽出し、混合した抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
１：１ジクロロメタン／クロロホルム（４００ｍＬ）中の６－アミノ－３－ブロモピリジン－２－カルボン酸（２５ｇ）のスラリーを、１時間にわたり５℃のジクロロメタン（１００ｍＬ）中のニトロソニウムテトラフルオロボレート（１８．２ｇ）に添加した。得られた混合物を更に３０分間撹拌し、次に３５℃に加温し、一晩撹拌した。反応物を室温に冷却し、次にＮａＨ２ＰＯ４水溶液でｐＨを４に調整した。得られた溶液をジクロロメタンによって３回抽出し、混合した抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
【0080】
【化21】
【0081】
［実施例１．１．８］：ｔｅｒｔ－ブチル３－ブロモ－６－フルオロピリジン－２－カルボキシレート
塩化パラトルエンスルホニル（２７．６ｇ）を、０℃でジクロロメタン（１００ｍＬ）及びｔｅｒｔ－ブタノール（８０ｍＬ）中の実施例１．１．７（１４．５ｇ）及びピリジン（２６．７ｍＬ）の溶液に添加した。反応物を１５分間撹拌し、次に室温に加温し、一晩撹拌した。溶液を濃縮し、酢酸エチルと飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液との間に分割した。層を分離し、水層を酢酸エチルによって抽出した。有機層を一つに混合し、Ｎａ２ＣＯ３水溶液及びブラインですすぎ、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
塩化パラトルエンスルホニル（２７．６ｇ）を、０℃でジクロロメタン（１００ｍＬ）及びｔｅｒｔ－ブタノール（８０ｍＬ）中の実施例１．１．７（１４．５ｇ）及びピリジン（２６．７ｍＬ）の溶液に添加した。反応物を１５分間撹拌し、次に室温に加温し、一晩撹拌した。溶液を濃縮し、酢酸エチルと飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液との間に分割した。層を分離し、水層を酢酸エチルによって抽出した。有機層を一つに混合し、Ｎａ２ＣＯ３水溶液及びブラインですすぎ、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
【0082】
【化22】
【0083】
［実施例１．１．９］：メチル２－［５－ブロモ－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピリジン－２－イル］－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－８－カルボキシレート
ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）中のメチル１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－８－カルボキシレート塩酸塩（１２．３７ｇ）及び実施例１．１．８（１５ｇ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１２ｍＬ）を添加し、混合物を２４時間５０℃で撹拌した。混合物を次に酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ４４８．４（Ｍ＋Ｈ）＋．
ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）中のメチル１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－８－カルボキシレート塩酸塩（１２．３７ｇ）及び実施例１．１．８（１５ｇ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１２ｍＬ）を添加し、混合物を２４時間５０℃で撹拌した。混合物を次に酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ４４８．４（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0084】
【化23】
【0085】
［実施例１．１．１０］：メチル２－［６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン－２－イル］－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－８－カルボキシレート
アセトニトリル（３０ｍＬ）中の実施例１．１．９（２．２５ｇ）及び［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（２０５ｍｇ）の溶液に、トリエチルアミン（３ｍＬ）及びピナコールボラン（２ｍＬ）を添加し、混合物を３時間還流下で撹拌した。混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。
アセトニトリル（３０ｍＬ）中の実施例１．１．９（２．２５ｇ）及び［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（２０５ｍｇ）の溶液に、トリエチルアミン（３ｍＬ）及びピナコールボラン（２ｍＬ）を添加し、混合物を３時間還流下で撹拌した。混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。
【0086】
【化24】
【0087】
［実施例１．１．１１］：メチル２－［６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－５－（１－｛［３－（２－ヒドロキシエトキシ）－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル］メチル｝－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル）ピリジン－２－イル］－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－８－カルボキシレート
テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）中の実施例１．１．１０（２．２５ｇ）の溶液に、実施例１．１．６（２．０ｇ）、１，３，５，７－テトラメチル－６－フェニル－２，４，８－トリオキサ－６－ホスファアダマンタン（３２９ｍｇ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２０６ｍｇ）及び三塩基性リン酸カリウム（４．７８ｇ）を添加した。混合物を一晩還流し、冷却し、酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈した。得られた混合物を水及びブラインで洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の２０％酢酸エチル、続いてジクロロメタン中の５％メタノールによって溶出させ、標題化合物を得た。
テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）中の実施例１．１．１０（２．２５ｇ）の溶液に、実施例１．１．６（２．０ｇ）、１，３，５，７－テトラメチル－６－フェニル－２，４，８－トリオキサ－６－ホスファアダマンタン（３２９ｍｇ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２０６ｍｇ）及び三塩基性リン酸カリウム（４．７８ｇ）を添加した。混合物を一晩還流し、冷却し、酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈した。得られた混合物を水及びブラインで洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の２０％酢酸エチル、続いてジクロロメタン中の５％メタノールによって溶出させ、標題化合物を得た。
【0088】
【化25】
【0089】
［実施例１．１．１２］：メチル２－［６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－５－｛１－［（３－｛２－［（メタンスルホニル）オキシ］エトキシ｝－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル）メチル］－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル｝ピリジン－２－イル］－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－８－カルボキシレート
氷浴中のジクロロメタン（１００ｍＬ）中の実施例１．１．１１（３．３２ｇ）の冷却した溶液に、トリエチルアミン（３ｍＬ）及びメタンスルホニルクロリド（１．１ｇ）を順次添加した。反応混合物を１．５時間室温で撹拌し、酢酸エチルで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
氷浴中のジクロロメタン（１００ｍＬ）中の実施例１．１．１１（３．３２ｇ）の冷却した溶液に、トリエチルアミン（３ｍＬ）及びメタンスルホニルクロリド（１．１ｇ）を順次添加した。反応混合物を１．５時間室温で撹拌し、酢酸エチルで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
【0090】
【化26】
【0091】
［実施例１．１．１３］：メチル２－［５－（１－｛［３－（２－アジドエトキシ）－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル］メチル｝－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル）－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピリジン－２－イル］－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－８－カルボキシレート
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１２０ｍＬ）中の実施例１．１．１２（１６．５ｇ）の溶液に、アジ化ナトリウム（４．２２ｇ）を添加した。混合物を３時間８０℃で加熱し、冷却し、酢酸エチルで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１２０ｍＬ）中の実施例１．１．１２（１６．５ｇ）の溶液に、アジ化ナトリウム（４．２２ｇ）を添加した。混合物を３時間８０℃で加熱し、冷却し、酢酸エチルで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。
【0092】
【化27】
【0093】
［実施例１．１．１４］：２－［５－（１－｛［３－（２－アジドエトキシ）－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル］メチル｝－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル）－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピリジン－２－イル］－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－８－カルボン酸
テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）、メタノール（３０ｍＬ）及び水（３０ｍＬ）の混合液中の実施例１．１．１３（１０ｇ）の溶液に、水酸化リチウム一水和物（１．２ｇ）を添加した。混合物を一晩室温で撹拌し、２％のＨＣｌ水溶液によって中和した。得られた混合物を濃縮し、残留物を酢酸エチル（８００ｍＬ）に溶解させ、ブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）、メタノール（３０ｍＬ）及び水（３０ｍＬ）の混合液中の実施例１．１．１３（１０ｇ）の溶液に、水酸化リチウム一水和物（１．２ｇ）を添加した。混合物を一晩室温で撹拌し、２％のＨＣｌ水溶液によって中和した。得られた混合物を濃縮し、残留物を酢酸エチル（８００ｍＬ）に溶解させ、ブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。
【0094】
【化28】
【0095】
［実施例１．１．１５］：ｔｅｒｔ－ブチル３－（１－｛［３－（２－アジドエトキシ）－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル］メチル｝－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル）－６－｛８－［（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）カルバモイル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル｝ピリジン－２－カルボキシレート
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中の実施例１．１．１４（１０ｇ）、ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン（３．２４ｇ）、フルオロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（５．６９ｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５．５７ｇ）の混合物を、３時間６０℃で加熱し、冷却し、酢酸エチルで希釈した。得られた混合物を、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中の実施例１．１．１４（１０ｇ）、ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン（３．２４ｇ）、フルオロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（５．６９ｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５．５７ｇ）の混合物を、３時間６０℃で加熱し、冷却し、酢酸エチルで希釈した。得られた混合物を、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の２０％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。
【0096】
【化29】
【0097】
［実施例１．１．１６］：ｔｅｒｔ－ブチル３－（１－｛［３－（２－アミノエトキシ）－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル］メチル｝－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル）－６－｛８－［（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）カルバモイル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル｝ピリジン－２－カルボキシレート
テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の実施例１．１．１５（２．０ｇ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％、２００ｍｇ）を添加した。混合物を一晩水素雰囲気（１８ｐｓｉ）下で撹拌した。不溶性物質を濾過して取り除き、濾液を濃縮し、標題化合物を得た。
テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の実施例１．１．１５（２．０ｇ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％、２００ｍｇ）を添加した。混合物を一晩水素雰囲気（１８ｐｓｉ）下で撹拌した。不溶性物質を濾過して取り除き、濾液を濃縮し、標題化合物を得た。
【0098】
【化30】
【0099】
［実施例１．１．１７］：６－｛８－［（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）カルバモイル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル｝－３－（１－｛［３－（２－｛［（３Ｓ）－３，４－ジヒドロキシブチル］アミノ｝エトキシ）－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル］メチル｝－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル）ピリジン－２－カルボン酸
ジクロロメタン（２ｍＬ）中の実施例１．１．１６（２１３ｍｇ）の溶液に、（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）アセトアルデヒド（４２ｍｇ）を添加した。３０分間室温で撹拌した後、ナトリウムトリアセトキシホウ化水素（１４４ｍｇ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加し、撹拌を一晩継続した。反応混合物を濃縮し、残留物を、Ｇｉｌｓｏｎシステムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製し（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８ ２５０×５０ｍｍカラム）、０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（１００ｍＬ／分）を含む水中の５～８５％のアセトニトリルによって溶出させた。望ましい画分を混合し、凍結乾燥し、標題化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．８６ （ｓ， １Ｈ）， ８．２２ （ｄ， ２Ｈ）， ８．０５ － ８．０１ （ｍ， １Ｈ）， ７．７９ （ｄ， １Ｈ）， ７．６１ （ｄ， １Ｈ）， ７．５３ － ７．４１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．３６ （ｔｄ， ２Ｈ）， ７．２８ （ｓ， １Ｈ）， ６．９５ （ｄ， １Ｈ）， ４．９５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．８８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．８２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．２６ － ２．９４ （ｍ， ７Ｈ）， ２．１０ （ｓ， ３Ｈ）， １．８４ － １．７５ （ｍ， １Ｈ）， １．５２－１．６３ （ｍ， １Ｈ）， １．４５ － １．２３ （ｍ， ６Ｈ）， １．１９ － ０．９６ （ｍ， ７Ｈ）， ０．８６ （ｓ， ６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ８３４．３（Ｍ＋Ｈ）＋．
ジクロロメタン（２ｍＬ）中の実施例１．１．１６（２１３ｍｇ）の溶液に、（Ｓ）－２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）アセトアルデヒド（４２ｍｇ）を添加した。３０分間室温で撹拌した後、ナトリウムトリアセトキシホウ化水素（１４４ｍｇ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加し、撹拌を一晩継続した。反応混合物を濃縮し、残留物を、Ｇｉｌｓｏｎシステムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製し（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８ ２５０×５０ｍｍカラム）、０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（１００ｍＬ／分）を含む水中の５～８５％のアセトニトリルによって溶出させた。望ましい画分を混合し、凍結乾燥し、標題化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．８６ （ｓ， １Ｈ）， ８．２２ （ｄ， ２Ｈ）， ８．０５ － ８．０１ （ｍ， １Ｈ）， ７．７９ （ｄ， １Ｈ）， ７．６１ （ｄ， １Ｈ）， ７．５３ － ７．４１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．３６ （ｔｄ， ２Ｈ）， ７．２８ （ｓ， １Ｈ）， ６．９５ （ｄ， １Ｈ）， ４．９５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．８８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．８２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．２６ － ２．９４ （ｍ， ７Ｈ）， ２．１０ （ｓ， ３Ｈ）， １．８４ － １．７５ （ｍ， １Ｈ）， １．５２－１．６３ （ｍ， １Ｈ）， １．４５ － １．２３ （ｍ， ６Ｈ）， １．１９ － ０．９６ （ｍ， ７Ｈ）， ０．８６ （ｓ， ６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ８３４．３（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0100】
【化31】
【0101】
［実施例１．２．１］：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，４，５－トリス（ベンジルオキシ）－６－［（ベンジルオキシ）メチル］オキサン－２－オン
０℃のジメチルスルホキシド（４００ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，４，５－トリス（ベンジルオキシ）－６－［（ベンジルオキシ）メチル］オキサン－２－オル（７５ｇ）の混合物に、無水酢酸（２２５ｍＬ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、次に０℃に冷却した。大量の水を添加し、撹拌を停止し、反応混合物を３時間静置した（粗製のラクトンがフラスコの底に移動した。）。上清を除去し、粗製の混合物を酢酸エチルで希釈し、３回水で洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ３水混合物で中和し、２回再び水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ５６１（Ｍ＋Ｎａ）＋．
０℃のジメチルスルホキシド（４００ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，４，５－トリス（ベンジルオキシ）－６－［（ベンジルオキシ）メチル］オキサン－２－オル（７５ｇ）の混合物に、無水酢酸（２２５ｍＬ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、次に０℃に冷却した。大量の水を添加し、撹拌を停止し、反応混合物を３時間静置した（粗製のラクトンがフラスコの底に移動した。）。上清を除去し、粗製の混合物を酢酸エチルで希釈し、３回水で洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ３水混合物で中和し、２回再び水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ５６１（Ｍ＋Ｎａ）＋．
【0102】
【化32】
【0103】
［実施例１．２．２］：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，４，５－トリス（ベンジルオキシ）－６－（（ベンジルオキシ）メチル）－２－（（トリメチルシリル）エチニル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－オル
テトラヒドロフラン（４００ｍＬ）中のエチニルトリメチルシラン（１８．２３ｇ）の混合物に、窒素下で、ドライアイス／アセトン浴（内部温度－６５℃）において冷却しながら、ヘキサン（５５．７ｍＬ）中の２．５Ｍのブチルリチウムを滴下して添加し、－６０℃未満の温度を維持した。混合物を４０分間冷浴において、続いて４０分間氷水浴（内部温度は０．４℃まで上昇）において撹拌し、最後に再び－７５℃に冷却した。テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の実施例１．２．１（５０ｇ）の混合物を滴下して添加し、－７０℃未満の内部温度を維持した。混合物を更に３時間、ドライアイス／アセトン浴において撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２５０ｍＬ）によって反応をクエンチした。混合物を室温に加温し、酢酸エチル（３×３００ｍＬ）によって抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ６５９（Ｍ＋Ｎａ）＋．
テトラヒドロフラン（４００ｍＬ）中のエチニルトリメチルシラン（１８．２３ｇ）の混合物に、窒素下で、ドライアイス／アセトン浴（内部温度－６５℃）において冷却しながら、ヘキサン（５５．７ｍＬ）中の２．５Ｍのブチルリチウムを滴下して添加し、－６０℃未満の温度を維持した。混合物を４０分間冷浴において、続いて４０分間氷水浴（内部温度は０．４℃まで上昇）において撹拌し、最後に再び－７５℃に冷却した。テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の実施例１．２．１（５０ｇ）の混合物を滴下して添加し、－７０℃未満の内部温度を維持した。混合物を更に３時間、ドライアイス／アセトン浴において撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２５０ｍＬ）によって反応をクエンチした。混合物を室温に加温し、酢酸エチル（３×３００ｍＬ）によって抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ６５９（Ｍ＋Ｎａ）＋．
【0104】
【化33】
【0105】
［実施例１．２．３］：トリメチル（｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３，４，５－トリス（ベンジルオキシ）－６－［（ベンジルオキシ）メチル］オキサン－２－イル｝エチニル）シラン
氷塩水浴中の－１５℃のアセトニトリル（４５０ｍＬ）及びジクロロメタン（１５０ｍＬ）中の実施例１．２．２（６０ｇ）の混合された混合物に、トリエチルシラン（８１ｍＬ）を滴下して添加し、続いて、内部温度が－１０℃を超えない速度で、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル複合体（４０．６ｍＬ）を添加した。混合物を次に、２時間－１５℃～－１０℃で撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２７５ｍＬ）によって反応をクエンチし、室温で１時間撹拌した。次に混合物を酢酸エチル（３×５５０ｍＬ）によって抽出した。混合された抽出物を、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、濃縮した。残留物を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して０％～７％の酢酸エチル／石油エーテルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ６４３（Ｍ＋Ｎａ）＋．
氷塩水浴中の－１５℃のアセトニトリル（４５０ｍＬ）及びジクロロメタン（１５０ｍＬ）中の実施例１．２．２（６０ｇ）の混合された混合物に、トリエチルシラン（８１ｍＬ）を滴下して添加し、続いて、内部温度が－１０℃を超えない速度で、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル複合体（４０．６ｍＬ）を添加した。混合物を次に、２時間－１５℃～－１０℃で撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２７５ｍＬ）によって反応をクエンチし、室温で１時間撹拌した。次に混合物を酢酸エチル（３×５５０ｍＬ）によって抽出した。混合された抽出物を、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、濃縮した。残留物を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して０％～７％の酢酸エチル／石油エーテルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ６４３（Ｍ＋Ｎａ）＋．
【0106】
【化34】
【0107】
［実施例１．２．４］：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，４，５－トリス（ベンジルオキシ）－２－［（ベンジルオキシ）メチル］－６－エチニルオキサン
ジクロロメタン（２００ｍＬ）及びメタノール（１０００ｍＬ）中の実施例１．２．３（８０ｇ）の混合物に、１Ｎ ＮａＯＨ水（２５８ｍＬ）を添加した。混合物を２時間室温で撹拌し、次に濃縮した。残留物を次に水とジクロロメタンとに分割した。混合された有機抽出物をブラインによって洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ５７１（Ｍ＋Ｎａ）＋．
ジクロロメタン（２００ｍＬ）及びメタノール（１０００ｍＬ）中の実施例１．２．３（８０ｇ）の混合物に、１Ｎ ＮａＯＨ水（２５８ｍＬ）を添加した。混合物を２時間室温で撹拌し、次に濃縮した。残留物を次に水とジクロロメタンとに分割した。混合された有機抽出物をブラインによって洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ５７１（Ｍ＋Ｎａ）＋．
【0108】
【化35】
【0109】
［実施例１．２．５］：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－２－［（アセチルオキシ）メチル］－６－エチニルオキサン－３，４，５－トリイルトリアセテート
氷／水浴によって冷却した無水酢酸（５００ｍＬ）中の実施例１．２．４（６６ｇ）の混合物に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル複合体（１５２ｍＬ）を滴下して添加した。混合物を１６時間室温で撹拌し、氷／水浴によって冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液によって中和した。混合物を酢酸エチル（３×５００ｍＬ）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮した。残留物を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して０％～３０％の酢酸エチル／石油エーテルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３５７（Ｍ＋Ｈ）＋．
氷／水浴によって冷却した無水酢酸（５００ｍＬ）中の実施例１．２．４（６６ｇ）の混合物に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル複合体（１５２ｍＬ）を滴下して添加した。混合物を１６時間室温で撹拌し、氷／水浴によって冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液によって中和した。混合物を酢酸エチル（３×５００ｍＬ）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮した。残留物を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して０％～３０％の酢酸エチル／石油エーテルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３５７（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0110】
【化36】
【0111】
［実施例１．２．６］：（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－エチニル－６－（ヒドロキシメチル）オキサン－３，４，５－トリオール
メタノール（４４０ｍＬ）中の実施例１．２．５（２５ｇ）の混合物に、ナトリウムメタノール酸（２．１ｇ）を添加した。混合物を２時間室温で撹拌し、次にジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌによって中和した。混合物を濃縮し、残留物をシリカゲル上へ吸着させ、シリカゲルカラム上にロードした。カラムを０～１００％の酢酸エチル／石油エーテル、次に０～１２％のメタノール／酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ２１１（Ｍ＋Ｎａ）＋．
メタノール（４４０ｍＬ）中の実施例１．２．５（２５ｇ）の混合物に、ナトリウムメタノール酸（２．１ｇ）を添加した。混合物を２時間室温で撹拌し、次にジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌによって中和した。混合物を濃縮し、残留物をシリカゲル上へ吸着させ、シリカゲルカラム上にロードした。カラムを０～１００％の酢酸エチル／石油エーテル、次に０～１２％のメタノール／酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ２１１（Ｍ＋Ｎａ）＋．
【0112】
【化37】
【0113】
［実施例１．２．７］：（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）－６－エチニル－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸
３首の丸底フラスコに、実施例１．２．６（６．００ｇ）、ＫＢｒ（０．３０ｇ）、臭化テトラブチルアンモニウム（０．４１ｇ）及び６０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を投入した。ジクロロメタン（６０ｍＬ）中のＴＥＭＰＯ（（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－イル）オキシル、０．１５ｇ）を添加した。混合物を激しく撹拌し、－２℃の内部温度となるまで氷塩水浴において冷却した。内部温度を２℃未満に維持されるよう、ブライン（１２ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２４ｍＬ）及び１０重量％のＮａＯＣｌ水溶液（１５４ｍＬ）の混合溶液を滴下して添加した。固形Ｎａ２ＣＯ３を添加して反応混合物のｐＨを８．２～８．４の範囲に維持した。合計６時間後に、反応混合物を３℃の内部温度まで冷却し、エタノール（約２０ｍＬ）を滴下して添加した。混合物を約３０分撹拌した。混合物を分液漏斗へ移し、ジクロロメタン層を廃棄した。水層のｐＨを１ＭのＨＣｌ水溶液を用いて２～３に調整した。次に水層を乾燥するまで濃縮し、固体を得た。乾燥固体にメタノール（１００ｍＬ）を添加し、スラリーを約３０分間撹拌した。混合物を珪藻土のパッドを通じて濾過し、漏斗の残留物をメタノール約１００ｍＬによって洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、標題化合物を得た。
３首の丸底フラスコに、実施例１．２．６（６．００ｇ）、ＫＢｒ（０．３０ｇ）、臭化テトラブチルアンモニウム（０．４１ｇ）及び６０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を投入した。ジクロロメタン（６０ｍＬ）中のＴＥＭＰＯ（（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－イル）オキシル、０．１５ｇ）を添加した。混合物を激しく撹拌し、－２℃の内部温度となるまで氷塩水浴において冷却した。内部温度を２℃未満に維持されるよう、ブライン（１２ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２４ｍＬ）及び１０重量％のＮａＯＣｌ水溶液（１５４ｍＬ）の混合溶液を滴下して添加した。固形Ｎａ２ＣＯ３を添加して反応混合物のｐＨを８．２～８．４の範囲に維持した。合計６時間後に、反応混合物を３℃の内部温度まで冷却し、エタノール（約２０ｍＬ）を滴下して添加した。混合物を約３０分撹拌した。混合物を分液漏斗へ移し、ジクロロメタン層を廃棄した。水層のｐＨを１ＭのＨＣｌ水溶液を用いて２～３に調整した。次に水層を乾燥するまで濃縮し、固体を得た。乾燥固体にメタノール（１００ｍＬ）を添加し、スラリーを約３０分間撹拌した。混合物を珪藻土のパッドを通じて濾過し、漏斗の残留物をメタノール約１００ｍＬによって洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、標題化合物を得た。
【0114】
【化38】
【0115】
［実施例１．２．８］：メチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）－６－エチニル－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボキシレート
５００ｍＬの３首の丸底フラスコに、メタノール（９６ｍＬ）中の実施例１．２．７（６．４５ｇ）の懸濁液を投入し、混合物を－１℃の内部温度となるよう氷塩水浴において冷却した。無水の塩化チオニル（２．７９ｍＬ）を慎重に添加した。添加の際に内部温度が上昇し続けたが、１０℃を超えなかった。反応液を２．５時間にわたり、徐々に最高１５～２０℃となるまで加温した。２．５時間後に、反応液を濃縮し、標題化合物を得た。
５００ｍＬの３首の丸底フラスコに、メタノール（９６ｍＬ）中の実施例１．２．７（６．４５ｇ）の懸濁液を投入し、混合物を－１℃の内部温度となるよう氷塩水浴において冷却した。無水の塩化チオニル（２．７９ｍＬ）を慎重に添加した。添加の際に内部温度が上昇し続けたが、１０℃を超えなかった。反応液を２．５時間にわたり、徐々に最高１５～２０℃となるまで加温した。２．５時間後に、反応液を濃縮し、標題化合物を得た。
【0116】
【化39】
【0117】
［実施例１．２．９］：メチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，４，５－トリス（アセチルオキシ）－６－エチニルオキサン－２－カルボキシレート
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）中の混合物としての実施例１．２．８（６．９ｇ）に、４－（ジメチルアミノ）ピリジン（０．１７ｇ）及び無水酢酸（３６．１ｍＬ）を添加した。懸濁液を氷浴において冷却し、ピリジン（１８．０４ｍＬ）を１５分間にわたりシリンジを介して添加した。反応液を一晩室温に加温した。更なる無水酢酸（１２ｍＬ）及びピリジン（６ｍＬ）を添加し、更に６時間撹拌を継続した。反応物を氷浴において冷却し、２５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３水混合物を添加し、１時間にわたり撹拌した。水（１００ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチルによって抽出した。有機抽出物を２回飽和ＣｕＳＯ４混合物で洗浄し、乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、５０％の酢酸エチル／石油エーテルによって溶出させ、標題化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， メタノール－ｄ４） δ ｐｐｍ ５．２９ （ｔ， １Ｈ）， ５．０８ （ｔｄ， ２Ｈ）， ４．４８ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．２３ （ｄ， １Ｈ）， ３．７１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．０４ （ｄ， １Ｈ）， ２．０３ （ｓ， ３Ｈ）， １．９９ （ｓ， ３Ｈ）， １．９８ （ｓ， ４Ｈ）．
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）中の混合物としての実施例１．２．８（６．９ｇ）に、４－（ジメチルアミノ）ピリジン（０．１７ｇ）及び無水酢酸（３６．１ｍＬ）を添加した。懸濁液を氷浴において冷却し、ピリジン（１８．０４ｍＬ）を１５分間にわたりシリンジを介して添加した。反応液を一晩室温に加温した。更なる無水酢酸（１２ｍＬ）及びピリジン（６ｍＬ）を添加し、更に６時間撹拌を継続した。反応物を氷浴において冷却し、２５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３水混合物を添加し、１時間にわたり撹拌した。水（１００ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチルによって抽出した。有機抽出物を２回飽和ＣｕＳＯ４混合物で洗浄し、乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、５０％の酢酸エチル／石油エーテルによって溶出させ、標題化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， メタノール－ｄ４） δ ｐｐｍ ５．２９ （ｔ， １Ｈ）， ５．０８ （ｔｄ， ２Ｈ）， ４．４８ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．２３ （ｄ， １Ｈ）， ３．７１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．０４ （ｄ， １Ｈ）， ２．０３ （ｓ， ３Ｈ）， １．９９ （ｓ， ３Ｈ）， １．９８ （ｓ， ４Ｈ）．
【0118】
【化40】
【0119】
［実施例１．２．１０］：２－ヨード－４－ニトロ安息香酸
機械式撹拌機、温度プローブ及び添加漏斗を備えた、３Ｌのフルジャケット装備型のフラスコに、窒素雰囲気下、２－アミノ－４－ニトロ安息香酸（６９．１ｇ、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ）及び１．５Ｍ硫酸水溶液（６９６ｍＬ）を添加した。得られた懸濁物を０℃の内部温度まで冷却し、水（２５０ｍＬ）中の亜硝酸ナトリウム（２８．８ｇ）の混合物を４３分間にわたり滴下して添加し、１℃未満の温度を維持した。反応液を１時間約０℃で撹拌した。水（２５０ｍＬ）中のヨウ化カリウム（１０７ｇ）の混合物を、内部温度を１℃未満に維持しながら４４分間にわたり滴下して添加した（最初に、添加により放熱が起こり、気体が発生した。）。反応液を０℃で１時間撹拌した。温度が２０℃まで上昇し、次に一晩周囲温度で撹拌した。反応混合物は懸濁液となった。反応混合物を濾過し、回収された固体を水によって洗浄した。湿った固体（約１０８ｇ）を、３０分間にわたり１０％亜硫酸ナトリウム（３５０ｍＬ、固体の洗浄用の約２００ｍＬの水を有する。）において撹拌した。懸濁液を濃塩酸（３５ｍＬ）で酸性化し、固体を濾過によって回収し、水によって洗浄した。固体を水（１Ｌ）においてスラリー化し、再度濾過し、固体を一晩漏斗中で乾燥させた。次に固体を６０℃で２時間真空オーブンにおいて乾燥させた。得られた固体をジクロロメタン（５００ｍＬ）とすり混ぜ、懸濁液を濾過し、更にジクロロメタンによって洗浄した。固体を空気乾燥し、標題化合物を得た。
機械式撹拌機、温度プローブ及び添加漏斗を備えた、３Ｌのフルジャケット装備型のフラスコに、窒素雰囲気下、２－アミノ－４－ニトロ安息香酸（６９．１ｇ、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ）及び１．５Ｍ硫酸水溶液（６９６ｍＬ）を添加した。得られた懸濁物を０℃の内部温度まで冷却し、水（２５０ｍＬ）中の亜硝酸ナトリウム（２８．８ｇ）の混合物を４３分間にわたり滴下して添加し、１℃未満の温度を維持した。反応液を１時間約０℃で撹拌した。水（２５０ｍＬ）中のヨウ化カリウム（１０７ｇ）の混合物を、内部温度を１℃未満に維持しながら４４分間にわたり滴下して添加した（最初に、添加により放熱が起こり、気体が発生した。）。反応液を０℃で１時間撹拌した。温度が２０℃まで上昇し、次に一晩周囲温度で撹拌した。反応混合物は懸濁液となった。反応混合物を濾過し、回収された固体を水によって洗浄した。湿った固体（約１０８ｇ）を、３０分間にわたり１０％亜硫酸ナトリウム（３５０ｍＬ、固体の洗浄用の約２００ｍＬの水を有する。）において撹拌した。懸濁液を濃塩酸（３５ｍＬ）で酸性化し、固体を濾過によって回収し、水によって洗浄した。固体を水（１Ｌ）においてスラリー化し、再度濾過し、固体を一晩漏斗中で乾燥させた。次に固体を６０℃で２時間真空オーブンにおいて乾燥させた。得られた固体をジクロロメタン（５００ｍＬ）とすり混ぜ、懸濁液を濾過し、更にジクロロメタンによって洗浄した。固体を空気乾燥し、標題化合物を得た。
【0120】
【化41】
【0121】
［実施例１．２．１１］：（２－ヨード－４－ニトロフェニル）メタノール
火炎により乾燥させた３Ｌの３首フラスコに、実施例１．２．１０（５１．９ｇ）及びテトラヒドロフラン（７００ｍＬ）を投入した。混合物を０．５℃に氷浴において冷却し、ボラン－テトラヒドロフラン錯体（４４３ｍＬ、テトラヒドロフラン中１Ｍ）を５０分間にわたり滴下して添加し（気体発生）、１．３℃の最終的な内部温度に達した。反応混合物を１５分間撹拌し、氷浴を除去した。反応液を３０分間周囲温度に静置した。加熱マントルを設置し、反応液を３時間にわたり６５．５℃の内部温度まで加熱し、次に一晩撹拌しながら室温に冷却した。反応混合物を、氷浴において冷却し０℃にして、メタノール（４００ｍＬ）を滴下して添加しクエンチした。短いインキュベート時間の後、温度は急速に２．５℃まで上昇し、気体発生を伴った。最初の１００ｍＬを約３０分間にわたり添加した後は、添加してももはや放熱せず、気体発生も終了した。氷浴を除去し、混合物を一晩窒素下で周囲温度にて撹拌した。混合物を濃縮して固体とし、ジクロロメタン／メタノールに溶解させ、シリカゲル（約１５０ｇ）に吸着させた。残留物をシリカゲル（３０００ｍＬ）のプラグ上にロードし、ジクロロメタンによって溶出させ、標題化合物を得た。
火炎により乾燥させた３Ｌの３首フラスコに、実施例１．２．１０（５１．９ｇ）及びテトラヒドロフラン（７００ｍＬ）を投入した。混合物を０．５℃に氷浴において冷却し、ボラン－テトラヒドロフラン錯体（４４３ｍＬ、テトラヒドロフラン中１Ｍ）を５０分間にわたり滴下して添加し（気体発生）、１．３℃の最終的な内部温度に達した。反応混合物を１５分間撹拌し、氷浴を除去した。反応液を３０分間周囲温度に静置した。加熱マントルを設置し、反応液を３時間にわたり６５．５℃の内部温度まで加熱し、次に一晩撹拌しながら室温に冷却した。反応混合物を、氷浴において冷却し０℃にして、メタノール（４００ｍＬ）を滴下して添加しクエンチした。短いインキュベート時間の後、温度は急速に２．５℃まで上昇し、気体発生を伴った。最初の１００ｍＬを約３０分間にわたり添加した後は、添加してももはや放熱せず、気体発生も終了した。氷浴を除去し、混合物を一晩窒素下で周囲温度にて撹拌した。混合物を濃縮して固体とし、ジクロロメタン／メタノールに溶解させ、シリカゲル（約１５０ｇ）に吸着させた。残留物をシリカゲル（３０００ｍＬ）のプラグ上にロードし、ジクロロメタンによって溶出させ、標題化合物を得た。
【0122】
【化42】
【0123】
［実施例１．２．１２］：（４－アミノ－２－ヨードフェニル）メタノール
機械式撹拌機、ＪＫＥＭ温度プローブによって制御される加熱マントル、及び凝縮器を備えた５Ｌのフラスコに、実施例１．２．１１（９８．８３ｇ）及びエタノール（２Ｌ）を投入した。反応液を急速に撹拌し、鉄（９９ｇ）を添加し、続いて水（５００ｍＬ）中の塩化アンモニウム（２０．８４ｇ）の混合物を添加した。８０．３℃の内部温度となるまで、反応液を２０分間にわたって加熱し、その際に還流が激しく開始した。還流が鎮まるまでマントルを落とした。その後、混合物を１．５時間８０℃に加熱した。反応液を加熱しながらメンブランフィルターに通し、鉄の残留物を加熱した５０％の酢酸エチル／メタノール（８００ｍＬ）によって洗浄した。溶出物を珪藻土パッドに通過させ、濾液を濃縮した。残留物を５０％のブライン（１５００ｍＬ）と酢酸エチル（１５００ｍＬ）とに分割した。層を分離し、水層を酢酸エチル（４００ｍＬ×３）によって抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得、それを更なる精製なしで用いた。
機械式撹拌機、ＪＫＥＭ温度プローブによって制御される加熱マントル、及び凝縮器を備えた５Ｌのフラスコに、実施例１．２．１１（９８．８３ｇ）及びエタノール（２Ｌ）を投入した。反応液を急速に撹拌し、鉄（９９ｇ）を添加し、続いて水（５００ｍＬ）中の塩化アンモニウム（２０．８４ｇ）の混合物を添加した。８０．３℃の内部温度となるまで、反応液を２０分間にわたって加熱し、その際に還流が激しく開始した。還流が鎮まるまでマントルを落とした。その後、混合物を１．５時間８０℃に加熱した。反応液を加熱しながらメンブランフィルターに通し、鉄の残留物を加熱した５０％の酢酸エチル／メタノール（８００ｍＬ）によって洗浄した。溶出物を珪藻土パッドに通過させ、濾液を濃縮した。残留物を５０％のブライン（１５００ｍＬ）と酢酸エチル（１５００ｍＬ）とに分割した。層を分離し、水層を酢酸エチル（４００ｍＬ×３）によって抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得、それを更なる精製なしで用いた。
【0124】
【化43】
【0125】
［実施例１．２．１３］：４－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－３－ヨードアニリン
機械式撹拌機を有する５Ｌのフラスコに、実施例１．２．１２（８８ｇ）及びジクロロメタン（２Ｌ）を投入した。懸濁液を２．５℃の内部温度となるまで氷浴において冷却し、ｔｅｒｔ－ブチルクロロジメチルシラン（５３．３ｇ）を８分間にわたり数回に分けて添加した。１０分後、１Ｈ－イミダゾール（３３．７ｇ）を、冷却した反応液に数回に分けて添加した。反応液を９０分間撹拌し、その間内部温度が１５℃まで上昇した。反応混合物を、水（３Ｌ）及びジクロロメタン（１Ｌ）で希釈した。層を分離させ、有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、油状物を得た。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（１６００ｇのシリカゲル）によって精製し、ヘプタン中０～２５％の酢酸エチルの勾配で溶出させ、標題化合物を得た。
機械式撹拌機を有する５Ｌのフラスコに、実施例１．２．１２（８８ｇ）及びジクロロメタン（２Ｌ）を投入した。懸濁液を２．５℃の内部温度となるまで氷浴において冷却し、ｔｅｒｔ－ブチルクロロジメチルシラン（５３．３ｇ）を８分間にわたり数回に分けて添加した。１０分後、１Ｈ－イミダゾール（３３．７ｇ）を、冷却した反応液に数回に分けて添加した。反応液を９０分間撹拌し、その間内部温度が１５℃まで上昇した。反応混合物を、水（３Ｌ）及びジクロロメタン（１Ｌ）で希釈した。層を分離させ、有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮し、油状物を得た。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（１６００ｇのシリカゲル）によって精製し、ヘプタン中０～２５％の酢酸エチルの勾配で溶出させ、標題化合物を得た。
【0126】
【化44】
【0127】
［実施例１．２．１４］：（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパン酸
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル｛（２ＲＳ）－１－［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル｝カルバメート（６．５ｇ）のジメトキシエタン（４０ｍＬ）中の混合物に、水（４０ｍＬ）中の（２Ｓ）－２－アミノプロパン酸（１．３９３ｇ）及び重炭酸ナトリウム（１．３１４ｇ）を添加した。テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）を添加し、溶解を補助した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。クエン酸水溶液（１５％、７５ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）中の１０％ ２－プロパノールによって抽出した。沈殿物が有機層において生じた。混合した有機層を水（２×１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧下で濃縮し、次にジエチルエーテル（８０ｍＬ）とすり混ぜた。短い音波処理の後、標題化合物を濾過及び風乾によって回収した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ４１１（Ｍ＋Ｈ）＋．
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル｛（２ＲＳ）－１－［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル｝カルバメート（６．５ｇ）のジメトキシエタン（４０ｍＬ）中の混合物に、水（４０ｍＬ）中の（２Ｓ）－２－アミノプロパン酸（１．３９３ｇ）及び重炭酸ナトリウム（１．３１４ｇ）を添加した。テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）を添加し、溶解を補助した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。クエン酸水溶液（１５％、７５ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）中の１０％ ２－プロパノールによって抽出した。沈殿物が有機層において生じた。混合した有機層を水（２×１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧下で濃縮し、次にジエチルエーテル（８０ｍＬ）とすり混ぜた。短い音波処理の後、標題化合物を濾過及び風乾によって回収した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ４１１（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0128】
【化45】
【0129】
［実施例１．２．１５］：（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル［（２Ｓ）－１－（｛（２Ｓ）－１－［４－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－３－ヨードアニリノ］－１－オキソプロパン－２－イル｝アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル］カルバメート
ジクロロメタン（７０ｍＬ）及びメタノール（３５．０ｍＬ）の混合物中の、実施例１．２．１３（５．４４ｇ）及び実施例１．２．１４（６．１５ｇ）の混合物に、エチル２－エトキシキノリン－１（２Ｈ）－カルボキシレート（４．０８ｇ）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、残留物をシリカゲル上にロードし、ヘプタン中の１０％～９５％酢酸エチル勾配、続いてジクロロメタン中の５％メタノールによって溶出させた。生成物を含有する画分を濃縮し、残留物を０．２％のジクロロメタン中のメタノール（５０ｍＬ）において溶解させ、シリカゲル上にロードし、ジクロロメタン中の０．２％～２％メタノールの勾配によって溶出させた。生成物含有画分を回収し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ７５６．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
ジクロロメタン（７０ｍＬ）及びメタノール（３５．０ｍＬ）の混合物中の、実施例１．２．１３（５．４４ｇ）及び実施例１．２．１４（６．１５ｇ）の混合物に、エチル２－エトキシキノリン－１（２Ｈ）－カルボキシレート（４．０８ｇ）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、残留物をシリカゲル上にロードし、ヘプタン中の１０％～９５％酢酸エチル勾配、続いてジクロロメタン中の５％メタノールによって溶出させた。生成物を含有する画分を濃縮し、残留物を０．２％のジクロロメタン中のメタノール（５０ｍＬ）において溶解させ、シリカゲル上にロードし、ジクロロメタン中の０．２％～２％メタノールの勾配によって溶出させた。生成物含有画分を回収し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ７５６．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0130】
【化46】
【0131】
［実施例１．２．１６］：メチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，４，５－トリス（アセチルオキシ）－６－｛［２－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－５－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝フェニル］エチニル｝オキサン－２－カルボキシレート
実施例１．２．９（４．５００ｇ）、実施例１．２．１５（６．６２ｇ）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．０８３ｇ）及びビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）二塩化物（０．３０８ｇ）の混合物を、バイアルにおいて混合し、脱気した。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４５ｍＬ）及びＮ－エチル－Ｎ－（プロパン－２－イル）プロパン－２－アミン（４．５５ｍＬ）を添加し、反応器を窒素によってフラッシュ洗浄し、一晩室温で撹拌した。反応液を、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（２５０ｍＬ）とに分割した。層を分離させ、有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中５％～９５％の酢酸エチルの勾配で溶出させた。生成物を含む画分を回収し、濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の０．２５％～２．５％メタノールの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ９７０．４（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１．２．９（４．５００ｇ）、実施例１．２．１５（６．６２ｇ）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．０８３ｇ）及びビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）二塩化物（０．３０８ｇ）の混合物を、バイアルにおいて混合し、脱気した。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４５ｍＬ）及びＮ－エチル－Ｎ－（プロパン－２－イル）プロパン－２－アミン（４．５５ｍＬ）を添加し、反応器を窒素によってフラッシュ洗浄し、一晩室温で撹拌した。反応液を、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（２５０ｍＬ）とに分割した。層を分離させ、有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中５％～９５％の酢酸エチルの勾配で溶出させた。生成物を含む画分を回収し、濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の０．２５％～２．５％メタノールの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ９７０．４（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0132】
【化47】
【0133】
［実施例１．２．１７］：メチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，４，５－トリス（アセチルオキシ）－６－｛２－［２－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－５－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝フェニル］エチル｝オキサン－２－カルボキシレート
実施例１．２．１６（４．７ｇ）及びテトラヒドロフラン（９５ｍＬ）を、５０ｍＬの耐圧ボトル中、５％のＰｔ／Ｃ（２．４２ｇ、湿状態）に添加し、５０ｐｓｉの水素下、室温で９０分間振とうした。反応混合物を濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ９７４．６（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１．２．１６（４．７ｇ）及びテトラヒドロフラン（９５ｍＬ）を、５０ｍＬの耐圧ボトル中、５％のＰｔ／Ｃ（２．４２ｇ、湿状態）に添加し、５０ｐｓｉの水素下、室温で９０分間振とうした。反応混合物を濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ９７４．６（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0134】
【化48】
【0135】
［実施例１．２．１８］：メチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，４，５－トリス（アセチルオキシ）－６－｛２－［５－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝－２－（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル｝オキサン－２－カルボキシレート
テトラヒドロフラン（７ｍＬ）、水（７ｍＬ）及び氷酢酸（２１ｍＬ）中の実施例１．２．１７（５．４ｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機画分を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の０．５％～５％メタノールの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ８６０．４（Ｍ＋Ｈ）＋．
テトラヒドロフラン（７ｍＬ）、水（７ｍＬ）及び氷酢酸（２１ｍＬ）中の実施例１．２．１７（５．４ｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機画分を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の０．５％～５％メタノールの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ８６０．４（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0136】
【化49】
【0137】
［実施例１．２．１９］：メチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，４，５－トリス（アセチルオキシ）－６－｛２－［５－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝－２－（｛［（４－ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］エチル｝オキサン－２－カルボキシレート
実施例１．２．１８（４．００ｇ）及びビス（４－ニトロフェニル）カルボキシレート（２．８３ｇ）のアセトニトリル（８０ｍＬ）中の混合物に、室温で、Ｎ－エチル－Ｎ－（プロパン－２－イル）プロパン－２－アミン（１．２２ｍＬ）を添加した。一晩撹拌した後、反応液を濃縮し、ジクロロメタン（２５０ｍＬ）中に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水混合物（４×１５０ｍＬ）によって洗浄した。有機層を、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮した。得られた泡沫をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の５％～７５％酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ １０２５．５（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１．２．１８（４．００ｇ）及びビス（４－ニトロフェニル）カルボキシレート（２．８３ｇ）のアセトニトリル（８０ｍＬ）中の混合物に、室温で、Ｎ－エチル－Ｎ－（プロパン－２－イル）プロパン－２－アミン（１．２２ｍＬ）を添加した。一晩撹拌した後、反応液を濃縮し、ジクロロメタン（２５０ｍＬ）中に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水混合物（４×１５０ｍＬ）によって洗浄した。有機層を、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮した。得られた泡沫をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の５％～７５％酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ １０２５．５（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0138】
【化50】
【0139】
［実施例１．３．１］：（３Ｒ，７ａＳ）－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾル－５－オン
トルエン（３００ｍＬ）中の（５Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）ピロリジン－２－オン（２５ｇ）、ベンズアルデヒド（２５．５ｇ）及びｐａｒａ－トルエンスルホン酸一水和物（０．５０ｇ）の混合物を、１６時間、乾燥管下で、Ｄｅａｎ－Ｓｔａｒｋトラップを用いて還流加熱した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を不溶性物質からデカントした。デカントされた有機層を、飽和重炭酸ナトリウム混合水溶液（２回）及びブライン（１回）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製し３５／６５のヘプタン／酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ２０４．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
トルエン（３００ｍＬ）中の（５Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）ピロリジン－２－オン（２５ｇ）、ベンズアルデヒド（２５．５ｇ）及びｐａｒａ－トルエンスルホン酸一水和物（０．５０ｇ）の混合物を、１６時間、乾燥管下で、Ｄｅａｎ－Ｓｔａｒｋトラップを用いて還流加熱した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を不溶性物質からデカントした。デカントされた有機層を、飽和重炭酸ナトリウム混合水溶液（２回）及びブライン（１回）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製し３５／６５のヘプタン／酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ２０４．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0140】
【化51】
【0141】
［実施例１．３．２］：（３Ｒ，６Ｒ，７ａＳ）－６－ブロモ－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾル－５－オン
冷却（－７７℃）した、テトラヒドロフラン（６７０ｍＬ）中の実施例１．３．１（４４．６ｇ）の混合物に、４０分間にわたりリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ヘキサン（２５０ｍＬ）中１．０Ｍ）を滴下して添加し、－７３℃以下の反応混合物温度を維持した。反応液を２時間にわたり－７７℃で撹拌し、臭素（１２．５ｍＬ）を２０分間にわたり滴下して添加し、－６４℃以下の反応混合物温度を維持した。反応液を７５分間にわたり－７７℃で撹拌し、－７７℃の反応液に、冷却した１０％のチオ硫酸ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）を添加してクエンチした。混合物を室温に加温し、半飽和の塩化アンモニウム水溶液と酢酸エチルとに分割した。層を分離させ、有機層を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによって残留物を精製し、８０／２０、７５／２５及び、７０／３０のヘプタン／酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ２９９．０及び３０１．０（Ｍ＋ＮＨ３＋Ｈ）＋．
冷却（－７７℃）した、テトラヒドロフラン（６７０ｍＬ）中の実施例１．３．１（４４．６ｇ）の混合物に、４０分間にわたりリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ヘキサン（２５０ｍＬ）中１．０Ｍ）を滴下して添加し、－７３℃以下の反応混合物温度を維持した。反応液を２時間にわたり－７７℃で撹拌し、臭素（１２．５ｍＬ）を２０分間にわたり滴下して添加し、－６４℃以下の反応混合物温度を維持した。反応液を７５分間にわたり－７７℃で撹拌し、－７７℃の反応液に、冷却した１０％のチオ硫酸ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）を添加してクエンチした。混合物を室温に加温し、半飽和の塩化アンモニウム水溶液と酢酸エチルとに分割した。層を分離させ、有機層を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによって残留物を精製し、８０／２０、７５／２５及び、７０／３０のヘプタン／酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ２９９．０及び３０１．０（Ｍ＋ＮＨ３＋Ｈ）＋．
【0142】
【化52】
【0143】
［実施例１．３．３］：（３Ｒ，６Ｓ，７ａＳ）－６－アジド－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾル－５－オン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中の実施例１．３．２（１９．３ｇ）の混合物に、アジ化ナトリウム（１３．５ｇ）を添加した。反応液を２．５時間６０℃に加熱した。反応液を室温に冷却し、水（５００ｍＬ）及び酢酸エチル（２００ｍＬ）を添加してクエンチした。層を分離し、有機層をブラインによって洗浄した。混合した水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）によって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、７８／２２のヘプタン／酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ２６２．０（Ｍ＋ＮＨ３＋Ｈ）＋．
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中の実施例１．３．２（１９．３ｇ）の混合物に、アジ化ナトリウム（１３．５ｇ）を添加した。反応液を２．５時間６０℃に加熱した。反応液を室温に冷却し、水（５００ｍＬ）及び酢酸エチル（２００ｍＬ）を添加してクエンチした。層を分離し、有機層をブラインによって洗浄した。混合した水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）によって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、７８／２２のヘプタン／酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ２６２．０（Ｍ＋ＮＨ３＋Ｈ）＋．
【0144】
【化53】
【0145】
［実施例１．３．４］：（３Ｒ，６Ｓ，７ａＳ）－６－アミノ－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾル－５－オン
テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）中の実施例１．３．３（１３．５ｇ）の混合物に、ポリマーにより担持されたトリフェニルホスフィン（５５ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃３６６４５５、ローディング３ｍｍｏｌ／ｇ）を添加した。反応混合物を室温で一晩機械的に撹拌した。反応混合物を珪藻土で濾過し、酢酸エチル及びトルエンによって溶出させた。混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、硫酸ナトリウムによって脱水し、次に濾過し、濃縮し、標題化合物を得、それを更なる精製をせずに次のステップで用いた。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ２１９．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）中の実施例１．３．３（１３．５ｇ）の混合物に、ポリマーにより担持されたトリフェニルホスフィン（５５ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃３６６４５５、ローディング３ｍｍｏｌ／ｇ）を添加した。反応混合物を室温で一晩機械的に撹拌した。反応混合物を珪藻土で濾過し、酢酸エチル及びトルエンによって溶出させた。混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、硫酸ナトリウムによって脱水し、次に濾過し、濃縮し、標題化合物を得、それを更なる精製をせずに次のステップで用いた。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ２１９．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0146】
【化54】
【0147】
［実施例１．３．５］：（３Ｒ，６Ｓ，７ａＳ）－６－（ジベンジルアミノ）－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾル－５－オン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中の実施例１．３．４（１１．３ｇ）の混合物に、炭酸カリウム（７．０ｇ）、ヨウ化カリウム（４．２ｇ）及び臭化ベンジル（１４．５ｍＬ）を添加した。反応混合物を一晩室温で撹拌し、水及び酢酸エチルを添加してクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層を酢酸エチルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の１０～１５％酢酸エチルの勾配によって溶出させて固体を得、それをヘプタンとすり混ぜ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ３９９．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中の実施例１．３．４（１１．３ｇ）の混合物に、炭酸カリウム（７．０ｇ）、ヨウ化カリウム（４．２ｇ）及び臭化ベンジル（１４．５ｍＬ）を添加した。反応混合物を一晩室温で撹拌し、水及び酢酸エチルを添加してクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層を酢酸エチルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の１０～１５％酢酸エチルの勾配によって溶出させて固体を得、それをヘプタンとすり混ぜ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ３９９．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0148】
【化55】
【0149】
［実施例１．３．６］：（３Ｓ，５Ｓ）－３－（ジベンジルアミノ）－５－（ヒドロキシメチル）ピロリジン－２－オン
テトラヒドロフラン（１３０ｍＬ）中の実施例１．３．５（１３ｇ）の混合物に、ｐａｒａ－トルエンスルホン酸一水和物（１２．４ｇ）及び水（５０ｍＬ）を添加し、反応液を６日間６５℃で加熱した。反応液を室温に冷却し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及び酢酸エチルの添加によってクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層を酢酸エチルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。ワックス状の固体をヘプタン（１５０ｍＬ）とすり混ぜ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ３１１．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
テトラヒドロフラン（１３０ｍＬ）中の実施例１．３．５（１３ｇ）の混合物に、ｐａｒａ－トルエンスルホン酸一水和物（１２．４ｇ）及び水（５０ｍＬ）を添加し、反応液を６日間６５℃で加熱した。反応液を室温に冷却し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及び酢酸エチルの添加によってクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層を酢酸エチルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。ワックス状の固体をヘプタン（１５０ｍＬ）とすり混ぜ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ３１１．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0150】
【化56】
【0151】
［実施例１．３．７］：（３Ｓ，５Ｓ）－５－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－３－（ジベンジルアミノ）ピロリジン－２－オン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド中の実施例１．３．６（９．３ｇ）及び１Ｈ－イミダゾール（２．２ｇ）の混合物に、ｔｅｒｔ－ブチルクロロジメチルシラン（１１．２ｍＬ、トルエン中の５０重量％）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。水及びジエチルエーテルを添加して反応混合物をクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層をジエチルエーテルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の３５％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ４２５．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド中の実施例１．３．６（９．３ｇ）及び１Ｈ－イミダゾール（２．２ｇ）の混合物に、ｔｅｒｔ－ブチルクロロジメチルシラン（１１．２ｍＬ、トルエン中の５０重量％）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。水及びジエチルエーテルを添加して反応混合物をクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層をジエチルエーテルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の３５％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ４２５．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0152】
【化57】
【0153】
［実施例１．３．８］：ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－５－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－３－（ジベンジルアミノ）－２－オキソピロリジン－１－イル］アセテート
冷却（０℃）した、テトラヒドロフラン（４５ｍＬ）中の実施例１．３．７（４．５ｇ）の混合物に、２回に分けて９５％水素化ナトリウム（３２０ｍｇ）を添加した。冷却した混合物を４０分間撹拌し、ｔｅｒｔ－ブチル２－ブロモアセテート（３．２ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温に加温し、一晩撹拌した。水及び酢酸エチルを添加して反応をクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層を酢酸エチルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の５～１２％酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ５３９．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
冷却（０℃）した、テトラヒドロフラン（４５ｍＬ）中の実施例１．３．７（４．５ｇ）の混合物に、２回に分けて９５％水素化ナトリウム（３２０ｍｇ）を添加した。冷却した混合物を４０分間撹拌し、ｔｅｒｔ－ブチル２－ブロモアセテート（３．２ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温に加温し、一晩撹拌した。水及び酢酸エチルを添加して反応をクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層を酢酸エチルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の５～１２％酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ５３９．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0154】
【化58】
【0155】
［実施例１．３．９］：ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－（ジベンジルアミノ）－５－（ヒドロキシメチル）－２－オキソピロリジン－１－イル］アセテート
テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）中の実施例１．３．８（５．３ｇ）の混合物に、フッ化テトラブチルアンモニウム（１１ｍＬ、９５／５のテトラヒドロフラン／水中、１．０Ｍ）を添加した。反応混合物を１時間室温で撹拌し、次に飽和塩化アンモニウム水溶液、水及び酢酸エチルの添加によってクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層を酢酸エチルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の３５％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ４２５．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）中の実施例１．３．８（５．３ｇ）の混合物に、フッ化テトラブチルアンモニウム（１１ｍＬ、９５／５のテトラヒドロフラン／水中、１．０Ｍ）を添加した。反応混合物を１時間室温で撹拌し、次に飽和塩化アンモニウム水溶液、水及び酢酸エチルの添加によってクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層を酢酸エチルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の３５％酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＤＣＩ）ｍ／ｚ ４２５．１（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0156】
【化59】
【0157】
［実施例１．３．１０］：ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－（ジベンジルアミノ）－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－１－イル］アセテート
ジメチルスルホキシド（１４ｍＬ）中の実施例１．３．９（４．７ｇ）の混合物に、ジメチルスルホキシド（１４ｍＬ）中の４－（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）－２，２－ジメチルブチルエタンスルホネート（１４．５ｇ）の混合物を添加した。炭酸カリウム（２．６ｇ）及び水（２８μＬ）を添加し、反応混合物を１日間窒素下で６０℃で加熱した。反応液を室温に冷却し、次にブライン、水及びジエチルエーテルの添加によってクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層をジエチルエーテルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の１５～２５％酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ ８７１．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
ジメチルスルホキシド（１４ｍＬ）中の実施例１．３．９（４．７ｇ）の混合物に、ジメチルスルホキシド（１４ｍＬ）中の４－（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）－２，２－ジメチルブチルエタンスルホネート（１４．５ｇ）の混合物を添加した。炭酸カリウム（２．６ｇ）及び水（２８μＬ）を添加し、反応混合物を１日間窒素下で６０℃で加熱した。反応液を室温に冷却し、次にブライン、水及びジエチルエーテルの添加によってクエンチした。層を分離し、有機層をブラインで洗浄した。混合した水層をジエチルエーテルによって逆抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムによって脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の１５～２５％酢酸エチルの勾配によって溶出させ、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ ８７１．２（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0158】
【化60】
【0159】
［実施例１．３．１１］：ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－アミノ－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－１－イル］
実施例１．３．１０（８７３ｍｇ）を酢酸エチル（５ｍＬ）及びメタノール（１５ｍＬ）中に溶解させ、水酸化パラジウム／炭素（２０重量％）（１８０ｍｇ）を添加した。反応混合物を、３０時間室温で、次に１時間５０℃で、水素雰囲気（３０ｐｓｉ）下で撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ ６９１．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１．３．１０（８７３ｍｇ）を酢酸エチル（５ｍＬ）及びメタノール（１５ｍＬ）中に溶解させ、水酸化パラジウム／炭素（２０重量％）（１８０ｍｇ）を添加した。反応混合物を、３０時間室温で、次に１時間５０℃で、水素雰囲気（３０ｐｓｉ）下で撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、濾過し、濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ ６９１．０（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0160】
【化61】
【0161】
［実施例１．３．１２］：（２Ｚ）－４－｛［（３Ｓ，５Ｓ）－１－（２－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－オキソエチル）－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シアテトラデカン－１－イル）ピロリジン－３－イル］アミノ｝－４－オキソブタ－２－エン酸
無水マレイン酸（１００ｍｇ）をジクロロメタン（０．９０ｍＬ）に溶解させ、ジクロロメタン（０．９０ｍＬ）中の実施例１．３．１１（６５０ｍｇ）の混合物を滴下して添加し、続いて２時間４０℃で加熱した。反応混合物をシリカゲルクロマトグラフィーによって直接精製し、０．２％の酢酸を含むジクロロメタン中の１．０～２．５％メタノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分を濃縮した後、トルエン（１０ｍＬ）を添加し、混合物を再度濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ－）ｍ／ｚ ７８７．３（Ｍ－Ｈ）－．
無水マレイン酸（１００ｍｇ）をジクロロメタン（０．９０ｍＬ）に溶解させ、ジクロロメタン（０．９０ｍＬ）中の実施例１．３．１１（６５０ｍｇ）の混合物を滴下して添加し、続いて２時間４０℃で加熱した。反応混合物をシリカゲルクロマトグラフィーによって直接精製し、０．２％の酢酸を含むジクロロメタン中の１．０～２．５％メタノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分を濃縮した後、トルエン（１０ｍＬ）を添加し、混合物を再度濃縮し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ－）ｍ／ｚ ７８７．３（Ｍ－Ｈ）－．
【0162】
【化62】
【0163】
［実施例１．３．１３］：ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－１－イル］アセテート
実施例１．３．１２（５６０ｍｇ）をトルエン（７ｍＬ）中においてスラリー化し、トリエチルアミン（２２０μＬ）及び硫酸ナトリウム（５２５ｍｇ）を添加した。反応液を６時間窒素雰囲気下で還流加熱し、反応混合物を一晩室温で撹拌した。混合物を濾過し、固体を酢酸エチルですすいだ。溶出物を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、４５／５５のヘプタン／酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。
実施例１．３．１２（５６０ｍｇ）をトルエン（７ｍＬ）中においてスラリー化し、トリエチルアミン（２２０μＬ）及び硫酸ナトリウム（５２５ｍｇ）を添加した。反応液を６時間窒素雰囲気下で還流加熱し、反応混合物を一晩室温で撹拌した。混合物を濾過し、固体を酢酸エチルですすいだ。溶出物を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、４５／５５のヘプタン／酢酸エチルによって溶出させ、標題化合物を得た。
【0164】
【化63】
【0165】
［実施例１．３．１４］：｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝酢酸
実施例１．３．１３（１．２ｇ）を、トリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）に溶解させ、一晩窒素下で６５～７０℃で加熱した。トリフルオロ酢酸を減圧下で除去した。残留物をアセトニトリル（２．５ｍＬ）に溶解させ、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水（７０ｍＬ／分）中の５～７５％アセトニトリルの勾配を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）ＡＸＩＡ（商標）カラム（２５０×５０ｍｍ、１０μｍ粒径）における調製的逆相高圧液体クロマトグラフィーによって３０分間にわたり精製し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ－）ｍ／ｚ ３７５．２（Ｍ－Ｈ）－．
実施例１．３．１３（１．２ｇ）を、トリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）に溶解させ、一晩窒素下で６５～７０℃で加熱した。トリフルオロ酢酸を減圧下で除去した。残留物をアセトニトリル（２．５ｍＬ）に溶解させ、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水（７０ｍＬ／分）中の５～７５％アセトニトリルの勾配を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）ＡＸＩＡ（商標）カラム（２５０×５０ｍｍ、１０μｍ粒径）における調製的逆相高圧液体クロマトグラフィーによって３０分間にわたり精製し、標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ－）ｍ／ｚ ３７５．２（Ｍ－Ｈ）－．
【0166】
【化64】
【0167】
［実施例１．４．１］：３－［１－（｛３－［２－（｛［（４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝－２－｛２－［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－６－カルボキシ－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル］エチル｝フェニル）メトキシ］カルボニル｝［（３Ｓ）－３，４－ジヒドロキシブチル］アミノ）エトキシ］－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル｝メチル）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］－６－｛８－［（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）カルバモイル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル｝ピリジン－２カルボン酸
適切にサイズ設定された反応装置に、実施例１．１．１７（５．１７ｇ）、実施例１．２．１９（６．９９ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７．６ｍＬ）を投入した。固体を溶解させた後、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１．２１ｇ）を反応装置に投入し、反応の進捗をＨＰＬＣ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、１．５ｍＬ／分の流速、１８分間にわたり水中０．０５％のＨＣｌＯ４中の４０～１００％アセトニトリルの勾配によって溶出）によってモニターした。カップリングが完了したことを確認した後、テトラヒドロフラン（６２ｍＬ）を反応装置に投入し、及び、反応混合物は０℃に冷却された。リチウムメトキシド（６２ｍＬ、メタノールの１．０Ｍの溶液）を１時間にわたって投入し、反応混合物を周囲温度に加温した。反応の進捗をＨＰＬＣ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、１．５ｍＬ／分の流速、１８分間にわたり水中０．０５％のＨＣｌＯ４中の４０～１００％アセトニトリルの勾配によって溶出）によってモニターし、加水分解が完了したことを確認した後、アセトニトリル（１１０ｍＬ）を２時間にわたり反応装置に投入した。スラリーを更に２時間撹拌し、固体を真空濾過して単離し、続いてアセトニトリル（２×１０ｍＬ）で湿状態のケーキを洗浄した。残留物を逆相クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８、５０×２５０ｍｍ、１０μｍ、８０ｍＬ／分の流速、２５ｍＭの酢酸アンモニウム／アセトニトリル、６４／３６のアイソクラチック）により精製し、望ましい画分を凍結乾燥し、酢酸塩として標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ １３５７．５（Ｍ＋Ｈ）＋．
適切にサイズ設定された反応装置に、実施例１．１．１７（５．１７ｇ）、実施例１．２．１９（６．９９ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７．６ｍＬ）を投入した。固体を溶解させた後、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１．２１ｇ）を反応装置に投入し、反応の進捗をＨＰＬＣ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、１．５ｍＬ／分の流速、１８分間にわたり水中０．０５％のＨＣｌＯ４中の４０～１００％アセトニトリルの勾配によって溶出）によってモニターした。カップリングが完了したことを確認した後、テトラヒドロフラン（６２ｍＬ）を反応装置に投入し、及び、反応混合物は０℃に冷却された。リチウムメトキシド（６２ｍＬ、メタノールの１．０Ｍの溶液）を１時間にわたって投入し、反応混合物を周囲温度に加温した。反応の進捗をＨＰＬＣ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、１．５ｍＬ／分の流速、１８分間にわたり水中０．０５％のＨＣｌＯ４中の４０～１００％アセトニトリルの勾配によって溶出）によってモニターし、加水分解が完了したことを確認した後、アセトニトリル（１１０ｍＬ）を２時間にわたり反応装置に投入した。スラリーを更に２時間撹拌し、固体を真空濾過して単離し、続いてアセトニトリル（２×１０ｍＬ）で湿状態のケーキを洗浄した。残留物を逆相クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８、５０×２５０ｍｍ、１０μｍ、８０ｍＬ／分の流速、２５ｍＭの酢酸アンモニウム／アセトニトリル、６４／３６のアイソクラチック）により精製し、望ましい画分を凍結乾燥し、酢酸塩として標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ １３５７．５（Ｍ＋Ｈ）＋．
【0168】
【化65】
【0169】
［実施例１］：６－｛８－［（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）カルバモイル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル｝－３－［１－（｛３－［２－（｛［（２－｛２－［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－６－カルボキシ－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル］エチル｝－４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（２－｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝アセトアミド）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝フェニル）メトキシ］カルボニル｝［（３Ｓ）－３，４－ジヒドロキシブチル］アミノ）エトキシ］－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル｝メチル）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］ピリジン－２－カルボン酸（シントンＡＡＡ）
実施例１．３．１４（１７．７ｍｇ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．１４ｍＬ）に溶解させ、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾル－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１６．９ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１８．５μＬ）を添加した。混合物を室温で３分間撹拌し、次にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．２ｍＬ）中の実施例１．４．１（５２．０ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２４．７μＬ）の混合物に添加した。１時間後に、反応液をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド／水＝１／１（１．０ｍＬ）で希釈し、逆相ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８ ２５０×５０ｍｍのカラム）によって精製し、０．１％のトリフルオロ酢酸／水（１００ｍＬ／分）中の５～７５％アセトニトリルによって溶出させ、標題化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド－ｄ６） δ ｐｐｍ ９．８６ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ８．１７ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ８．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７８ （ｄ， １Ｈ）， ７．６１ （ｄ， １Ｈ）， ７．５１ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ７．４９－７．３９ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２１ （ｄ， １Ｈ）， ７．０７ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９５ （ｄ， １Ｈ）， ５．００ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６４ （ｔ， １Ｈ）， ４．３６ （ｍ， １Ｈ）， ４．１９ （ｍ， １Ｈ）， ４．１６ （ｄ， １Ｈ）， ４．０１ （ｄ， １Ｈ）， ３．８８ （ｂｒ ｔ， ２Ｈ）， ３．８２ （ｂｒ ｍ， ３Ｈ）， ３．７５ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， ３．６４ （ｔ， ２Ｈ）， ３．５４ （ｄ， ２Ｈ）， ３．４７ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４３ （ｂｒ ｍ， ４Ｈ）， ３．２３ （ｂｒ ｍ， ５Ｈ）， ３．１３ （ｔ， １Ｈ）， ３．１０ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， ３．０１ （ｂｒ ｍ， ２Ｈ）， ２．９３ （ｔ， １Ｈ）， ２．８３－２．６８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．３７ （ｍ， １Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）， １．９９ （ｂｒ ｍ， ２Ｈ）， １．８５ （ｍ， １Ｈ）， １．５５ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， １．３７ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， １．２８ （ｂｒ ｍ， ６Ｈ）， １．１０ （ｂｒ ｍ， ７Ｈ）， ０．９３ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， ０．８８－０．６９ （ｍ， １２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ １７１３．６（Ｍ－Ｈ）－．
実施例１．３．１４（１７．７ｍｇ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．１４ｍＬ）に溶解させ、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾル－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１６．９ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１８．５μＬ）を添加した。混合物を室温で３分間撹拌し、次にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．２ｍＬ）中の実施例１．４．１（５２．０ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２４．７μＬ）の混合物に添加した。１時間後に、反応液をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド／水＝１／１（１．０ｍＬ）で希釈し、逆相ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８ ２５０×５０ｍｍのカラム）によって精製し、０．１％のトリフルオロ酢酸／水（１００ｍＬ／分）中の５～７５％アセトニトリルによって溶出させ、標題化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド－ｄ６） δ ｐｐｍ ９．８６ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ８．１７ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ８．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７８ （ｄ， １Ｈ）， ７．６１ （ｄ， １Ｈ）， ７．５１ （ｂｒ ｄ， １Ｈ）， ７．４９－７．３９ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２１ （ｄ， １Ｈ）， ７．０７ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９５ （ｄ， １Ｈ）， ５．００ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６４ （ｔ， １Ｈ）， ４．３６ （ｍ， １Ｈ）， ４．１９ （ｍ， １Ｈ）， ４．１６ （ｄ， １Ｈ）， ４．０１ （ｄ， １Ｈ）， ３．８８ （ｂｒ ｔ， ２Ｈ）， ３．８２ （ｂｒ ｍ， ３Ｈ）， ３．７５ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， ３．６４ （ｔ， ２Ｈ）， ３．５４ （ｄ， ２Ｈ）， ３．４７ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４３ （ｂｒ ｍ， ４Ｈ）， ３．２３ （ｂｒ ｍ， ５Ｈ）， ３．１３ （ｔ， １Ｈ）， ３．１０ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， ３．０１ （ｂｒ ｍ， ２Ｈ）， ２．９３ （ｔ， １Ｈ）， ２．８３－２．６８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．３７ （ｍ， １Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）， １．９９ （ｂｒ ｍ， ２Ｈ）， １．８５ （ｍ， １Ｈ）， １．５５ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， １．３７ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， １．２８ （ｂｒ ｍ， ６Ｈ）， １．１０ （ｂｒ ｍ， ７Ｈ）， ０．９３ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， ０．８８－０．６９ （ｍ， １２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ １７１３．６（Ｍ－Ｈ）－．
【0170】
［実施例２］：ＡＭ２抗体の調製
ＡＭ２のＶＨ領域のアミノ酸配列を、配列番号２２において示す。ＡＭ２のＶＬ領域のアミノ酸配列を、配列番号２３において示す。ＡＭ２の重鎖を配列番号１として示し、軽鎖を配列番号５として示す。
ＡＭ２のＶＨ領域のアミノ酸配列を、配列番号２２において示す。ＡＭ２のＶＬ領域のアミノ酸配列を、配列番号２３において示す。ＡＭ２の重鎖を配列番号１として示し、軽鎖を配列番号５として示す。
【0171】
ＡＭ２の重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ＡＭ２の重鎖及び軽鎖の全長の核酸配列を発現させた。重鎖の発現のために使用するリーダー配列のアミノ酸配列をＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号２５）とし、一方、軽鎖の発現のために使用するアミノ酸配列をＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣ（配列番号２６）とした。ＡＭ２は、配列番号１の重鎖及び配列番号５の軽鎖を有し、次の機能性評価のためにその後精製した。
【0172】
配列番号２１の重鎖及び配列番号２４の軽鎖を含む抗ＥＧＦＲ抗体ＡＭ２Ｂに対して、ＡＭ２のアミノ酸突然変異は、（１）：ｚ、非ａアロタイプからｚ、ａアロタイプへ変更したヒトＩｇＧアロタイプ、（２）：Ｃ６ｖ１（ＬＣ：Ｃ２１４Ａ）突然変異、部位特異的コンジュゲーションが可能、及び（３）ＬＡＬＡ突然変異（２つのロイシンのアラニンへの置換、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）とした。
【0173】
［実施例３］：ＥＧＦＲ ＡＭ２抗体によるシントンＡＡＡのコンジュゲーション
ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中の１０ｍＭの２－（ジフェニルホスフィノ）安息香酸（ＤＰＰＢＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を調製した。２．４２当量のＤＰＰＢＡを、４℃で、ＥＧＦＲ ＡＭ２抗体の予備平衡溶液（約１０ｍｇ／ｍＬ、１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中に調合し、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）でｐＨ７．４）に添加した。反応混合物を１６～２４時間、４℃で穏やかに混合し、インキュベートした。３．７当量の１０ｍＭシントンＡＡＡ（６－｛８－［（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）カルバモイル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル｝－３－［１－（｛３－［２－（｛［（２－｛２－［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－６－カルボキシ－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル］エチル｝－４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（２－｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝アセトアミド）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝フェニル）メトキシ］カルボニル｝［（３Ｓ）－３，４－ジヒドロキシブチル］アミノ）エトキシ］－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル｝メチル）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］ピリジン－２－カルボン酸）（米国特許出願公開第２０１９／０３４３９６１号を参照）（ＤＭＡに溶解）を、還元した抗体溶液に添加し、穏やかに混合した。反応混合物を６０分間室温でインキュベートし、次に２当量のＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ－８１９９－１０Ｇ）によってクエンチした。抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製した。
ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中の１０ｍＭの２－（ジフェニルホスフィノ）安息香酸（ＤＰＰＢＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を調製した。２．４２当量のＤＰＰＢＡを、４℃で、ＥＧＦＲ ＡＭ２抗体の予備平衡溶液（約１０ｍｇ／ｍＬ、１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中に調合し、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）でｐＨ７．４）に添加した。反応混合物を１６～２４時間、４℃で穏やかに混合し、インキュベートした。３．７当量の１０ｍＭシントンＡＡＡ（６－｛８－［（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）カルバモイル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル｝－３－［１－（｛３－［２－（｛［（２－｛２－［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－６－カルボキシ－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル］エチル｝－４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（２－｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝アセトアミド）－３－メチルブタノイル］アミノ｝プロパノイル］アミノ｝フェニル）メトキシ］カルボニル｝［（３Ｓ）－３，４－ジヒドロキシブチル］アミノ）エトキシ］－５，７－ジメチルアダマンタン－１－イル｝メチル）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］ピリジン－２－カルボン酸）（米国特許出願公開第２０１９／０３４３９６１号を参照）（ＤＭＡに溶解）を、還元した抗体溶液に添加し、穏やかに混合した。反応混合物を６０分間室温でインキュベートし、次に２当量のＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ－８１９９－１０Ｇ）によってクエンチした。抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製した。
【0174】
［実施例４］：ＥＧＦＲを標的とするＡＤＣは、インビボにおいてがん細胞の成長を阻害する
ＮＳＣＬＣ細胞株、ＥＢＣ－１及びＮＣＩ－Ｈ４４１（以降Ｈ４４１と称する。）は、それぞれ、ＪＣＲＢ及びＡＴＣＣから得た。細胞は、供給元の勧告に従い、最大３回の継代単層培養において維持した。培地中５×１０６細胞の懸濁液をＭａｔｒｉｇｅｌと混合し（１：１＝体積：体積）、雌のＳＣＩＤ／ベージュマウスの右側脇腹に皮下に注入した。横腹の腫瘍サイズがおよそ２００ｍｍ３となったとき、処理を開始した。
ＮＳＣＬＣ細胞株、ＥＢＣ－１及びＮＣＩ－Ｈ４４１（以降Ｈ４４１と称する。）は、それぞれ、ＪＣＲＢ及びＡＴＣＣから得た。細胞は、供給元の勧告に従い、最大３回の継代単層培養において維持した。培地中５×１０６細胞の懸濁液をＭａｔｒｉｇｅｌと混合し（１：１＝体積：体積）、雌のＳＣＩＤ／ベージュマウスの右側脇腹に皮下に注入した。横腹の腫瘍サイズがおよそ２００ｍｍ３となったとき、処理を開始した。
【0175】
【表2】
【0176】
平均ＤＡＲは、組成物中の抗体に連結する薬剤の平均数を表す。
【0177】
図３は、ＡＭ２Ｂ－ＡＡＡ及びＡＭ７－ＡＡＡが、免疫を損なわれたマウスにおける異種移植として増殖するヒトＮＳＣＬＣの成長を阻害したことを示す。適度な成長阻害が、単一薬剤としてのＡＤＣの投与後に観察された。ドセタキセル（ＤＴＸ）によって生じる阻害の耐久性が、ＡＭ２Ｂ－ＡＡＡ又はＡＭ７－ＡＡＡによる同時投与の後に増加した。ＡＤＣの活性を、非標的化ＩｇＧ抗体（ＡＢ０９５）（破傷風トキソイドを認識するヒトＩｇＧｌ抗体；Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６９－８５を参照）と比較した。
【0178】
図３Ａ及び３Ｂは、乳頭状腺がん（Ｈ４４１）の処理後の腫瘍体積の変化を示す。
【0179】
図３Ｃ及び３Ｄは、扁平上皮癌（ＥＢＣ－１）の処理後の腫瘍体積の変化を示す。
【0180】
曲線の各位置は、８つの腫瘍の平均体積を表す。
【0181】
エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【0182】
［実施例５］：ＦＡＣＳ分析による、ＥＧＦＲを過剰発現する細胞におけるＡＭ２－ＡＡＡによるＢｃｌ－ｘＬの阻害
細胞表面に過剰発現させた野生型ＥＧＦＲに対する、及びＮＳＣＬＣにおいて存在する活性化突然変異を含むＥＧＦＲの突然変異形態（ｍｕｔＥＧＦＲ）に対する、ＡＭ２－ＡＡＡの結合をアッセイするため、野生型ＥＧＦＲ（Ａ４３１）及びｍｕｔＥＧＦＲ（ＮＣＩ－Ｈ１６５０）を過剰発現する腫瘍細胞を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって評価した。
細胞表面に過剰発現させた野生型ＥＧＦＲに対する、及びＮＳＣＬＣにおいて存在する活性化突然変異を含むＥＧＦＲの突然変異形態（ｍｕｔＥＧＦＲ）に対する、ＡＭ２－ＡＡＡの結合をアッセイするため、野生型ＥＧＦＲ（Ａ４３１）及びｍｕｔＥＧＦＲ（ＮＣＩ－Ｈ１６５０）を過剰発現する腫瘍細胞を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって評価した。
【0183】
およそ１．５×１０６細胞／ｍＬとなったときに、細胞をフラスコから回収した。ＰＢＳ／１％のＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で細胞を１回洗浄し、次にＦＡＣＳ緩衝液中に２．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μＬの細胞を、丸底９６ウエルプレートに添加した。２ｘ濃度のｍＡｂ／ＡＤＣ（最終濃度を図に示す。）５０μＬをウェルに添加し、プレートを１時間４℃でインキュベートした。細胞を２回ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５０μＬの、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した１：１００希釈の二次Ａｂ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１０１３）に再懸濁した。プレートを１時間４℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、１００μＬのＰＢＳ／１％のホルムアルデヒド中に再懸濁させ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析した。データを、ＷｉｎＬｉｓｔフローサイトメトリー分析ソフトウェアを使用して分析した。
【0184】
【表3】
【0185】
ＡＭ２－ＡＡＡ及びＡＭ２は、両方の細胞株に同様の見かけの親和性で結合することを示し、すなわちＡｂ結合特性に対するリンカー薬剤の影響がないことを示した。結合しない対照ＭＳＬ１０９ ｈＩｇＧ（図１）を使用したとき、結合は観察されなかった。ＣＭＶ糖タンパク質Ｈ（ＭＳＬ１０９）に対するモノクローナル抗体は、配列番号２９で表わされる重鎖と配列番号３０で表わされる軽鎖とを有する非標的化対照である。
【0186】
［実施例６］：ＢＩＭ－Ｂｃｌ－ｘＬ複合体破壊アッセイ
ＡＭ２－ＡＡＡによる細胞の処理が、ＥＧＦＲ依存的にＢｃｌ－ｘＬを阻害したか否かを判断するため、野生型ＥＧＦＲ及びｍｕｔＥＧＦＲを発現する細胞株におけるＢｃｌ－ｘＬ－ＢＩＭ複合体の破壊を評価した。
ＡＭ２－ＡＡＡによる細胞の処理が、ＥＧＦＲ依存的にＢｃｌ－ｘＬを阻害したか否かを判断するため、野生型ＥＧＦＲ及びｍｕｔＥＧＦＲを発現する細胞株におけるＢｃｌ－ｘＬ－ＢＩＭ複合体の破壊を評価した。
【0187】
朝、１０％のウシ胎児血清を補充した増殖培地ＲＰＭＩ－１６４０（ＧｉｂｃｏＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２２４００－０８９）中、９６ウエルプレートにおいて５０×１０３細胞／ウェルで細胞を播種した。午後に、処理剤を新しい培地に添加し、３つの同じウェルを用意した。２４時間後に、細胞を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＣＨＡＰＳ緩衝液によって溶解させ、予め抗Ｂｃｌ－ｘＬ捕捉抗体（Ｒ＆Ｄシステム、ビオチン化抗Ｂｃｌ－ｘＬ ８４０７６８、ＤＹＣ８９４－２キット）でコーティングしたプレート（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬＬＣ、Ｌ１５ＳＡ－１）上で、タンパク質ライセート中のＢｃｌ－ｘＬ／ＢＩＭ複合体を捕捉した。プレートをＰＢＳによって洗浄し、検出用抗体の抗ＢＩＭ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２９３３）を室温で１時間にわたりウェルに添加した。次にプレートをＰＢＳによって洗浄し、Ｓｕｌｆｏタグを有する抗ウサギ抗体（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬＬＣ、Ｒ３２ＡＢ－１）をウェルに添加し、次に１時間室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、ＭＳＤリード緩衝液（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬＬＣ、Ｒ９２ＴＣ－２）をウェルに添加し、プレートをＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬＬＣ装置（Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ ６００）で測定した。データを、残留するＢＩＭ／ＢＣＬ－ｘＬ複合体のパーセントとしてプロットした。（図２）
【0188】
［実施例７］：カスパーゼアッセイ
【0189】
【表4】
【0190】
Ａ４３１細胞を増殖培地中、ウェル当たり５０，０００細胞で、９６ウェルプレート（Ｃｏａｓｔａｒ、３６１０）に播種した。３７℃で２４時間の培養後に、ＡＤＣをウェルに添加し、２４時間のＣＯ２インキュベータ内で３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、１００μＬのカスパーゼ－Ｇｌｏ３／７ Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ８０９３）を各ウェルに添加し、１０分間振とうした。次にプレートを２０分間３７℃でインキュベートした。カスパーゼ３／７活性は、Ｖｉｃｔｏｒ発光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して評価した。
【0191】
非標的化ＡＤＣ（ＭＳＬ１０９ ｈＩｇＧ－ＡＡＡ）又はＡＭ２が、Ｂｃｌ－ｘＬ－ＢＩＭ複合体を破壊できなかった一方、ＡＭ２－ＡＡＡ処理の結果、両方の細胞株において効率的な複合体の破壊がもたらされた。これらの結果は、ＡＡＡ弾頭がＡＭ２－ＡＡＡを介してＥＧＦＲ発現細胞に特異的に送達され（図２を参照）及びＢｃｌ－ｘＬ活性を阻害したことを示す。
【0192】
カスパーゼ活性化（Ｂｃｌ－ｘＬ阻害の下流側の結果）を促進するＡＭ２－ＡＡＡの能力を、Ａ－４３１細胞においても評価した。ＡＭ２－ＡＡＡは、ＡＭ２又は非標的化ＭＳＬ１０９ ｈＩｇＧ－ＡＡＡとは異なりカスパーゼ活性化を誘導し、これは標的化されたＡＤＣの、ＥＧＦＲ依存的なオンメカニズム活性（ＥＧＦＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を裏付ける。
【0193】
［実施例８］：毒性試験
【0194】
【表5】
【0195】
試験Ａ：カニクイザルにおけるＡＭ２Ｂ－ＡＡＡの２回の静脈内投与（３週毎に１回）の４週間にわたる毒性試験
ＡＭ２Ｂ－ＡＡＡの２回の静脈内投与を、以下の４つの群の雄及び雌のカニクイザルに投与した：対照（０ｍｇ／ｋｇ／用量）、用量Ａ（低用量；Ｘｍｇ／ｋｇ／用量）、用量Ｂ（中用量；３Ｘｍｇ／ｋｇ／用量）、及び用量Ｃ（高用量；６Ｘｍｇ／ｋｇ／用量）。ＡＭ２Ｂ－ＡＡＡの投与の結果、高用量（用量Ｃ）では複数の器官の動脈において有害効果の所見が得られた。ヒトＩｇＧ及び補体のための明確な免疫組織化学的染色の結果、用量Ｃにより、異種タンパク質の投与による二次免疫複合体病に対応する、動脈における（低度～中度の）炎症が観察された。これは、免疫組織化学によって示されるように、補体の結合による免疫複合体の形成及び堆積による副次的なものであると解釈された。ＡＢ２Ｂ－ＡＡＡに起因する有害効果ではない所見として、すべての用量レベルでの腎臓における糸球体マトリックスの増加が挙げられた。
ＡＭ２Ｂ－ＡＡＡの２回の静脈内投与を、以下の４つの群の雄及び雌のカニクイザルに投与した：対照（０ｍｇ／ｋｇ／用量）、用量Ａ（低用量；Ｘｍｇ／ｋｇ／用量）、用量Ｂ（中用量；３Ｘｍｇ／ｋｇ／用量）、及び用量Ｃ（高用量；６Ｘｍｇ／ｋｇ／用量）。ＡＭ２Ｂ－ＡＡＡの投与の結果、高用量（用量Ｃ）では複数の器官の動脈において有害効果の所見が得られた。ヒトＩｇＧ及び補体のための明確な免疫組織化学的染色の結果、用量Ｃにより、異種タンパク質の投与による二次免疫複合体病に対応する、動脈における（低度～中度の）炎症が観察された。これは、免疫組織化学によって示されるように、補体の結合による免疫複合体の形成及び堆積による副次的なものであると解釈された。ＡＢ２Ｂ－ＡＡＡに起因する有害効果ではない所見として、すべての用量レベルでの腎臓における糸球体マトリックスの増加が挙げられた。
【0196】
注目すべきことに、程度が低く、機能効果がないために、有害効果であるとはみなされない、腎臓における試験項目関連の変化としては、≧用量Ａにおける糸球体マトリックスの増加（低度～軽度）、≧用量Ｂにおける細管の拡張（低度）、赤血球量（減少、≧用量Ｂで低度）、血小板数（減少、≧用量Ｂで軽度～中度）、グロブリンを特徴とする急性期炎症反応（用量Ａ及び用量Ｂで低度の増加、用量Ｃで軽度～中度の増加）、ＣＲＰ（用量Ｃで軽度の増加）、アルブミン（≧用量Ｂで低度～軽度の減少）及びフィブリノーゲン（≧用量Ｂで低度の増加）が挙げられた。
【0197】
試験Ｂ：カニクイザルにおける５週間にわたるＡＭ２－ＡＡＡの静脈内投与（２つの用量；Ｑ３Ｗ）における毒性診査試験
ＡＭ２－ＡＡＡの２つの静脈内投与として、０ｍｇ／ｋｇ／用量（対照）、用量１（６Ｘｍｇ／ｋｇ／用量、Ｘは試験Ａと同じ）及び用量２（１５Ｘｍｇ／ｋｇ／用量）にて、雄及び雌のカニクイザルに投与した。検出可能な免疫複合体病の所見はなかった。
ＡＭ２－ＡＡＡの２つの静脈内投与として、０ｍｇ／ｋｇ／用量（対照）、用量１（６Ｘｍｇ／ｋｇ／用量、Ｘは試験Ａと同じ）及び用量２（１５Ｘｍｇ／ｋｇ／用量）にて、雄及び雌のカニクイザルに投与した。検出可能な免疫複合体病の所見はなかった。
【0198】
腎臓における所見は、≧用量１では、尿素窒素の軽度の増加を伴う、糸球体マトリックスの軽度～中度の増加であった。血液学所見としては、試験項目関連の軽度～中度のＲＢＣの質量減少、非有害な網状赤血球の減少、及び≧用量１での中度～顕著な血小板減少（用量２の場合のみ有害とみなされる。）が挙げられた。有害であるとはみなされない他の試験項目関連の変化としては、≧用量１での胸腺のリンパ球数の軽度～中度の減少、ＡＳＴ活性の低度～軽度の増加、用量１でのビリルビンの増加、≧用量１での軽度～中度のカルシウムの減少、及び≧用量１での低度～軽度のアルブミンの減少が挙げられた。
【0199】
［実施例９］：ＡＭ２及びＡＭ２－ＡＡＡのＢｉａｃｏｒｅ結合分析
ＡＭ２抗体及びＡＭ２－ＡＡＡ ＡＤＣの、組換えＥＧＦＲ、具体的には、野生型ＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＥＧＦＲ（ｈ）（１～６４５））、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲ（ｈ）（１～２９）－Ｇ－（２９８～６４５））及び短縮された野生型ＥＧＦＲ １～５２５（ＥＧＦＲ１（ｈ）（１～５２５））に対する親和性を、３つの形態間で比較するため、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を行った。ＡＭ２は、配列番号１及び５においてそれぞれ提供されるＡＭ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を含み、標準的な方法に従って作製した。配列番号１及び５においてそれぞれ提供される重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有するＡＭ２抗体を含むＡＭ２－ＡＡＡを、ＡＡＡシントン（平均ＤＡＲ ２）にコンジュゲートした。
ＡＭ２抗体及びＡＭ２－ＡＡＡ ＡＤＣの、組換えＥＧＦＲ、具体的には、野生型ＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＥＧＦＲ（ｈ）（１～６４５））、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲ（ｈ）（１～２９）－Ｇ－（２９８～６４５））及び短縮された野生型ＥＧＦＲ １～５２５（ＥＧＦＲ１（ｈ）（１～５２５））に対する親和性を、３つの形態間で比較するため、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を行った。ＡＭ２は、配列番号１及び５においてそれぞれ提供されるＡＭ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を含み、標準的な方法に従って作製した。配列番号１及び５においてそれぞれ提供される重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有するＡＭ２抗体を含むＡＭ２－ＡＡＡを、ＡＡＡシントン（平均ＤＡＲ ２）にコンジュゲートした。
【0200】
ＡＭ２及びＡＭ２－ＡＡＡの組換え可溶性ＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する結合動態学を、抗Ｆｃ捕捉アッセイ手法を用い、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において構成した表面プラズモン共鳴ベースの測定によって測定した。ＥＧＦＲの３つのアイソフォームの組換え可溶性ＥＣＤを、Ｃ末端にｍｙｃ及びヒスチジンタグを有する分泌タンパク質として、一過性トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞から発現させ、Ｎｉ－ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）及びＳＥＣによって精製した。特に、試験したＥＧＦＲ ＥＣＤは、ｍｙｃ及びヒスチジンタグに融合するＥＧＦＲのアミノ酸１～６４５［（ＥＧＦＲ（１～６４５）－ＬＥＳＲＧＰＦ－Ｍｙｃ－ＮＭＨＴＧ－６Ｈｉｓ（「ＬＥＳＲＧＰＦ」（配列番号２７））］を含んだ。ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体も、ｍｙｃ及びヒスチジンタグに融合し（ＥＧＦＲ（ｈ）（１～２９）－Ｇ－（２９８～６４５）－ＬＥＳＲＧＰＦ－Ｍｙｃ－ＮＭＨＴＧ－６Ｈｉｓ）、またＥＣＤ ＥＧＦＲ １～５２５も［ＥＧＦＲ１（ｈ）（１～５２５）］－ＬＥＳＲＧＰＦ－Ｍｙｃ－ＮＭＨＴＧ－６Ｈｉｓ（「ＬＥＳＲＧＰＦ」（配列番号２８））］であった。すべてのＥＣＤは、シグナル配列ＭＲＰＳＧＴＡＧＡＡＬＬＡＬＬＡＡＬＣＰＡＳＲＡと共に発現し、それは分泌の間に切断された。
【0201】
チップの調製及び結合動態の測定は、アッセイ緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）において行った。抗Ｆｃ捕捉チップの調製の際、約２０００ＲＵのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、カタログ番号３１１２５）を２５μｇ／ｍＬまで１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）で希釈し、製造業者の指示及び手順（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って、標準的なアミンカップリングキットを使用してＣＭ５バイオセンサーチップ全体に直接固定した。バイオセンサー表面上の未反応の部分を、エタノールアミンによってブロックした。結合動態を測定するため、各アッセイサイクルでは以下のステップを含めた：（１）試験表面上のみにおける試験抗体の捕捉、（２）参照及び試験表面（２４０μＬ、８０μＬ／分）上への検体注入（ＥＧＦＲ ＥＣＤ又は緩衝液のみ）、その後、９００秒間、８０μｌ／分で分離をモニター、（３）参照及び試験表面への１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の注入による捕捉表面の再生。
【0202】
動態測定の際、検体を、３μＭの最大用量からランダムに３倍の希釈系列として調製した。アッセイの間、すべての測定は、捕捉表面単独（すなわち、捕捉される試験抗体なし）を参照として行い、また緩衝液のみの注入を２次的参照として用いた。データを処理し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、１：１の結合モデルに全体的にフィットさせ、結合動態反応速度定数、ｋａ（Ｍ－１ｓ－１）及びｋｄ（ｓ－１）、及び平衡解離定数ＫＤ（Ｍ）を決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ分析の結果を表１に示す。
【0203】
【表6】
【0204】
様々な具体的実施形態を例示及び記載したが、様々な変更が、本開示の技術思想及び範囲から逸脱することなく可能であることはいうまでもない。
【0205】
【表7】
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【外国語明細書】