特開 2022-112518 変異型ｐ５３と関連している疾患、障害または病状の処置におけるペプチドおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022112518

(43)【公開日】2022-08-02

(54)【発明の名称】変異型ｐ５３と関連している疾患、障害または病状の処置におけるペプチドおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20220726BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20220726BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220726BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220726BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220726BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220726BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06 ZNA

A61K38/08

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 105

C12N15/11 Z

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022077818

(22)【出願日】2022-05-10

(62)【分割の表示】P 2018540383の分割

【原出願日】2017-02-03

(31)【優先権主張番号】62/291,003

(32)【優先日】2016-02-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

２．ＴＷＥＥＮ

３．ＢＲＩＪ

４．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516040109

【氏名又は名称】イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＹＥＤＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯ．ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】ａｔ ｔｈｅ Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ９５， ７６１０００２ Ｒｅｈｏｖｏｔ， Ｉｓｒａｅｌ

(74)【代理人】

【識別番号】100133503

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 一哉

(72)【発明者】

【氏名】ロッター， ヴァルダ

(72)【発明者】

【氏名】オーレン， モシェ

(72)【発明者】

【氏名】タル， ペリー

(72)【発明者】

【氏名】アイゼンベルガー， シェイ

(72)【発明者】

【氏名】ベン－シモン， アヴィ

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA02

4C084BA08

4C084BA09

4C084BA17

4C084BA23

4C084CA59

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA15

4H045BA55

4H045EA28

(57)【要約】      （修正有）

【課題】単離ペプチドを提供する。
【解決手段】単離ペプチドは、ある空間および立体構成で配置されたアミノ酸配列を含むものであり、該空間および立体構成は、該ペプチドがｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、ｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）が該ＤＢＤに結合する際の該ＤＢＤ内の少なくとも１個の残基によって相互作用することを可能にするものであり、ここで、該ペプチドは少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させるものである、ただし、該ペプチドは特定の配列番号に該当しないものとする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６（配列番号：５３）のアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、
ここで、
Ｘ_１およびＸ_５は正荷電アミノ酸であり；
Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＧｌｙからなる群より選択され；
Ｘ_３は、極性無電荷アミノ酸および疎水性アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘ_４およびＸ_６は、αメチルアミノ酸およびβブレイカーアミノ酸からなる群より選択される
を含む単離ペプチドであって；
８～９個のアミノ酸からなり；
Ｎ末端に結合している脂肪酸部分をさらに含み；
少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させ、前記相互作用が前記ＤＢＤのヘリックス－２およびＬ１によるものである単離ペプチド。

【請求項2】

Ｘ_１およびＸ_５が、Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択され；
Ｘ_４およびＸ_６が各々、ＰｒｏおよびＡｌａから選択されるβブレイカーアミノ酸である、
請求項１に記載の単離ペプチド。

【請求項3】

Ｘ_１およびＸ_５が各々、Ｈｉｓであり；
Ｘ_２がＳｅｒであり；
Ｘ_３が極性無電荷アミノ酸であり；
Ｘ_４がＰｒｏであり、Ｘ_６がＡｌａであり；
アミノ酸配列のＣ末端に結合している負荷電アミノ酸を含み；
アミノ酸配列のＮ末端に結合している１個または２個のさらなるＡｒｇアミノ酸を含む、
請求項１に記載の単離ペプチド。

【請求項4】

Ｘ_３がＴｈｒであり；
アミノ酸配列のＣ末端に結合している負荷電アミノ酸がＡｓｐである、
請求項３に記載の単離ペプチド。

【請求項5】

ＲＲＨＳＴＰＨＡＤの配列および脂肪酸部分からなるペプチドを含み、該脂肪酸部分が該ペプチドの配列のＮ末端に結合している、請求項４に記載の単離ペプチド。

【請求項6】

脂肪酸部分が、ミリストイル（Ｃ_１４）；ペンタデカノイル（Ｃ_１５）；パルミトイル（Ｃ_１６）；フタノイル（（ＣＨ_３）_４）；ヘプタデカノイル（Ｃ_１７）；ステアロイル（Ｃ_１８）；およびノナデカノイル（Ｃ_１９）からなる群より選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【請求項7】

変異型ｐ５３と関連している疾患、障害または病状の処置における使用のための請求項１～６のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【請求項8】

疾患ががんである、請求項７に記載の単離ペプチド。

【請求項9】

がんが、乳がん、結腸がん、卵巣がんおよび肺がんからなる群より選択される、請求項８に記載の単離ペプチド。

【請求項10】

がんが血液のがんである、請求項８に記載の単離ペプチド。

【請求項11】

連続輸注および皮下投与から選択される投与経路による、投与を必要とする被験体への治療有効量の投与における使用のための請求項９～１１のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【請求項12】

前記治療有効量が０．０１～０．３ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１１に記載の単離ペプチド。

【請求項13】

処置が治療有効量の白金系化学療法薬を投与することをさらに含む、請求項７～１２のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【請求項14】

白金系化学療法薬がシスプラチンを含む、請求項１３に記載の単離ペプチド。

【請求項15】

請求項１～６のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の単離ペプチドを含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、その一部の実施形態において、変異型ｐ５３と関連している疾患、障害または病状の処置におけるペプチドおよびその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

がんは、先進諸国における主要死因であり、人口の平均年齢は上がり続けているため、診断症例数および経済的関連性も増え続けている。がんは単一疾患ではなく、異常な細胞の制御不能な増殖および拡延を特徴とする２００を超える一群の疾患である。がんは、高度に不均一性の疾患であり、同じ型および悪性度のがんを有する患者間であっても、腫瘍細胞表面マーカーの発現および分布において分子レベルで大きな差がある。さらに、細胞の変異は、がんが進行するにつれて蓄積される傾向にあり、腫瘍の不均一性がさらに大きくなる。ほとんどの腫瘍細胞は、癌遺伝子の高発現および癌抑制遺伝子の不活性化を伴うゲノム不安定性を示す。

【0003】

ｐ５３遺伝子は、がんの進行に対する大きな障壁としての機能を果たす最も重要な癌抑制遺伝子であると考えられている。ｐ５３タンパク質は種々の型の細胞ストレスに応答し、細胞周期の停止、アポトーシスまたは老化を誘発する。これは、ｐ５３ ＤＮＡ結合モチーフを有する特定の標的遺伝子の転写のトランス活性化によって行なわれる。ｐ５３経路が、ほぼすべてのヒトのがんに関与していることは広く承知されている。ｐ５３における変異は、悪性形質転換プロセスにおける極めて重要な段階とみなされており、５０％を超えるがんの症例でｐ５３遺伝子が変異を有している。このような変異のほとんどは、ｐ５３のＤＮＡ結合コアドメイン（ＤＢＤ）を標的化し、それによりｐ５３のその標的部位に対する特異的ＤＮＡ結合を無効にするミスセンス点変異である。このような変異により、ｐ５３依存性の転写が妨げられ、そのため、ｐ５３媒介性の腫瘍抑制が妨げられる。多様な型のヒト腫瘍においてｐ５３変異の頻度が並外れて高いことにより、ｐ５３は、腫瘍発生に関与する遺伝子の中でも特殊であり、変異したｐ５３（Ｍｕｔ－ｐ５３）は、新規ながん治療のための興味深い標的となっている。

【0004】

構造の研究により、ｐ５３のＤＢＤにおける腫瘍由来ミスセンス変異は、共通の効果：生理学的温度でのＤＢＤのフォールディングの不安定化をもたらすことが明らかになっている（Ｊｏｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｍ．Ｄ．Ａｌｌｅｎ，ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｆｅｒｓｈｔ，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｓｕｐｅｒｓｔａｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐ５３ ｃｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｓｃｕｉｎｇ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００４ ２７９（２）：ｐ．１２９１－６）。一部の変異型は、より低温では野生型コンホメーションに戻ってＤＮＡに結合することができるため、この不安定化は可逆的であり得る。したがって、ｐ５３のほとんどの変異は、生理学的温度でｐ５３タンパク質のフォールディングを不安定化させ、部分的変性を引き起こす。

【0005】

変異型ｐ５３タンパク質は腫瘍細胞内に高レベルで蓄積される。これは、主に、ｐ５３の自身の破壊因子Ｍｄｍ２の発現を上方調節することができないためである。さらに、多くのｐ５３活性化性ストレスシグナル（低酸素、ゲノム不安定性および癌遺伝子の発現など）が、がん細胞において構成的に誘導されている。したがって、Ｍｕｔ－ｐ５３の再活性化は、大きな抗腫瘍効果を奏することが予測される。さらに、マウスモデルにおいてｐ５３機能の復元は正常組織において耐容性が良好であり、視認可能な毒性効果はもたらされないことが示されている（Ｖｅｎｔｕｒａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｕｍｏｕｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ，２００７．４４５（７１２８）：ｐ．６６１－５）。

【0006】

構造の研究では、変異型間でミスフォールディングの程度は異なっている。しかしながら、明確な代用倍率はなく、むしろ部分的変性であることが示されている。これは、フォールディングに対するｐ５３変異の効果を逆転させるための「小分子」アプローチが広範な変異型形態に適用可能であるかもしれないことを示唆する。構造の研究からの別の重要な予想は、該タンパク質のうち正しくフォールディングされたものに結合するリガンドは、質量作用の法則に従って平衡を天然状態のフォールディングにシフトさせることが予測されるというものである。

【0007】

いくつかの修正アプローチがｐ５３のコンホメーション領域において試みられた。ペプチドを安定化させるコンホメーションの原理証明がＦｒｉｅｄｌｅｒおよび共同研究者らによって示された（Ｆｒｉｅｄｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｐ５３ ｃｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ：ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２．９９（２）：ｐ．９３７－４２）。９残基のペプチドであるＣＤＢ３は、ｐ５３ ＤＢＤとＡＳＰＰの複合体の結晶構造に基づいて設計された（Ｓａｍｕｅｌｓ－Ｌｅｖ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＳＰＰ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００１．８（４）：ｐ．７８１－９４）。このペプチドはＭｕｔ－ｐ５３に結合し、シャペロンとしての機能を果たし、ＰＡｂ１６２０に対する反応性の増大によって示されるように、平衡をＷＴのコンホメーションにシフトさせることが示された。しかしながら、ＣＤＢ３の生物学的効果（Ｉｓｓａｅｖａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐ５３ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３．１００（２３）：ｐ．１３３０３－７）は、Ｍｕｔ－ｐ５３／ＣＤＢ３複合体のコンホメーションはＷＴと変異型の間の中間状態であるため部分的であるにすぎない。

【0008】

Ｍｕｔ－ｐ５３を標的化する小分子化合物が、タンパク質ベースのアッセイまたは細胞ベースのアッセイのいずれかを用いて同定されている（Ｐｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３．２２（２９）：ｐ．４４７８－８７）。ＣＰ－３１３９８は、単離ｐ５３ ＤＢＤを熱変性から保護する（タンパク質の加熱時のＰＡｂ１６２０の反応性の維持によって評価される）分子についてスクリーニングすることにより同定された（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９．２８６（５４４９）：ｐ．２５０７－１０）。ＣＰ－３１３９８の作用機序は不明なままである。ＮＭＲ試験では、ｐ５３ ＤＢＤに対するＣＰ－３１３９８の結合は全く検出することができなかった（Ｒｉｐｐｉｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３－ｒｅｓｃｕｅ ｄｒｕｇ ＣＰ－３１３９８ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２．２１（１４）：ｐ．２１１９－２９）。ＣＰ－３１３９８は遺伝子の発現に影響を及ぼし、ｐ５３依存性および非依存性の両方の様式で細胞死を誘導する。したがって、ＣＰ－３１３８は、その細胞毒性の説明となり得るｐ５３以外の細胞標的を有すると思われる。

【0009】

がん生細胞のｐ５３機能をレスキューする２つの他の小分子、ＰＲＩＭＡ－１およびＭＩＲＡ－１が、細胞ベースのスクリーニングアッセイを用いることによって見出された。ＰＲＩＭＡ－１とＭＩＲＡ－１は同様の活性プロフィールを有する（Ｂｙｋｏｖ，Ｖ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５．２８０（３４）：ｐ．３０３８４－９１）が、構造的には無関連である。ＰＲＩＭＡ－１はプロドラッグであり、これは、変異型ｐ５３に結合するが他の分子にも結合する活性化合物に変換され（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０１５ Ｊｕｎ １８；６：ｅ１７９４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄｉｓ．２０１５．１４３．）、その効果の一部のものは、変異型ｐ５３の状態に無関係のようである（ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５ Ｏｃｔ １３；１５：６８４．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８８５－０１５－１６６７－１．）。

【0010】

本発明の一部の実施形態の発明者らは、以前に、ｍｕｔｐ５３再活性化ペプチドを選択するためのファージディスプレイの使用を報告している（ＷＯ２０１５／０１９３１８）。ファージペプチドディスプレイライブラリーは、化学物質ライブラリーよりもずっと高い複雑性を有する。この選択プロセスは、固定化した標的に対するペプチドの結合、溶出および増幅、最後にシークエンシングによる同定に基づいたものであり、大量数の分子を短時間でスクリーニングすることが可能であった。異なる選択ストラテジーを併用し、いろいろなペプチドライブラリーおよび選択したプールのディープシークエンシングからリードを選択した。リードペプチドは、インビトロでｍｕｔｐ５３にＷＴｐ５３様活性を付与し、生細胞において、いくつかの異種移植片モデルのｍｕｔｐ５３担持腫瘍の退縮を引き起こすことが示された。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】国際公開第２０１５／０１９３１８号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｊｏｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｍ．Ｄ．Ａｌｌｅｎ，ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｆｅｒｓｈｔ，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｓｕｐｅｒｓｔａｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐ５３ ｃｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｓｃｕｉｎｇ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００４ ２７９（２）：ｐ．１２９１－６

【非特許文献2】Ｖｅｎｔｕｒａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｕｍｏｕｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ，２００７．４４５（７１２８）：ｐ．６６１－５

【非特許文献3】Ｆｒｉｅｄｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｐ５３ ｃｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ：ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２．９９（２）：ｐ．９３７－４２

【非特許文献4】Ｓａｍｕｅｌｓ－Ｌｅｖ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＳＰＰ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００１．８（４）：ｐ．７８１－９４

【非特許文献5】Ｉｓｓａｅｖａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐ５３ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３．１００（２３）：ｐ．１３３０３－７

【非特許文献6】Ｐｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３．２２（２９）：ｐ．４４７８－８７

【非特許文献7】Ｆｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９．２８６（５４４９）：ｐ．２５０７－１０

【非特許文献8】Ｒｉｐｐｉｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３－ｒｅｓｃｕｅ ｄｒｕｇ ＣＰ－３１３９８ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２．２１（１４）：ｐ．２１１９－２９

【非特許文献9】Ｂｙｋｏｖ，Ｖ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５．２８０（３４）：ｐ．３０３８４－９１

【非特許文献10】Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０１５ Ｊｕｎ １８；６：ｅ１７９４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄｉｓ．２０１５．１４３．

【非特許文献11】ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５ Ｏｃｔ １３；１５：６８４．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８８５－０１５－１６６７－１

【発明の概要】

【0013】

本発明の一部の実施形態の一態様により、ある空間および立体構成で配置されたアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、該空間および立体構成が、該ペプチドがｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、ｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）が該ＤＢＤに結合する際の該ＤＢＤ内の少なくとも１個の残基によって相互作用することを可能にするものであり、ここで、該ペプチドは少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させるものである、ただし、該ペプチドは配列番号：５９～３８２のものでないものとする単離ペプチドを提供する。
本発明の一部の実施形態によれば、該相互作用が該ＤＢＤのヘリックス－２およびＬ１によるものである。

【0014】

本発明の一部の実施形態によれば、該相互作用が、該ＤＢＤのヘリックス－２および／またはＬ１の構造安定性に影響を及ぼすものである（ＮＭＲによるアッセイ時）。

【0015】

本発明の一部の実施形態によれば、該少なくとも１個の残基が、ｐ５３のＬ１のＨ１１５、Ｇ１１７ならびにＹ１２６およびＶ２７４およびＧ２７９およびＲ２８０からなる群より選択される。

【0016】

本発明の一部の実施形態によれば、該相互作用が該アミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸によるものである。

【0017】

本発明の一部の実施形態によれば、該相互作用が該アミノ酸配列の少なくとも２個のアミノ酸によるものである。

【0018】

本発明の一部の実施形態によれば、該相互作用が該アミノ酸配列の少なくとも３個のアミノ酸によるものである。

【0019】

本発明の一部の実施形態によれば、該相互作用が該アミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸によるものである。

【0020】

本発明の一部の実施形態によれば、該ペプチドが：
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６（配列番号：５３）
のアミノ酸配列を含むものであり、
ここで、
Ｘ_１およびＸ_５は正荷電アミノ酸であり；
Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＧｌｙからなる群より選択され；
Ｘ_３は任意のアミノ酸であり；
Ｘ_４およびＸ_６は、αメチルアミノ酸およびβブレイカーアミノ酸からなる群より選択される。

【0021】

本発明の一部の実施形態によれば、該ペプチドが：
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６（配列番号：５４）
のアミノ酸配列を含むものであり、
ここで、
Ｘ_１およびＸ_５は、Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択され；
Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＧｌｙからなる群より選択され；
Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６は任意のアミノ酸である。

【0022】

本発明の一部の実施形態によれば、正荷電アミノ酸が、Ｈｉｓ、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択される。

【0023】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｘ_３がＤ－アミノ酸である。

【0024】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｘ_３がリン酸化アミノ酸である。

【0025】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｘ_３が、リン酸化が可能でないアミノ酸である。

【0026】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｘ_３が非水素結合性アミノ酸である。

【0027】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｘ_３が、極性無電荷アミノ酸および疎水性アミノ酸からなる群より選択される。

【0028】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｘ_２がＳｅｒである。

【0029】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｘ_４がαメチルアミノ酸であり、Ｘ_６がアラニンである。

【0030】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチドがアミノ酸配列ＨＳＡＰＨＰ（配列番号：４９）またはＨＳＥＰＨＰ（配列番号：５０）を有するものである。

【0031】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチドが、該アミノ酸配列のＣ末端に結合している少なくとも１個のさらなるアミノ酸（Ｘ_７）を含むものである。

【0032】

本発明の一部の実施形態によれば、該少なくとも１個のさらなるアミノ酸が負荷電アミノ酸である。

【0033】

本発明の一部の実施形態によれば、該少なくとも１個のさらなるアミノ酸が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＳｅｒからなる群より選択される。

【0034】

本発明の一部の実施形態によれば、該少なくとも１個のさらなるアミノ酸が２個のさらなるアミノ酸（Ｘ_７－Ｘ_８）を含み、Ｘ_８が、Ｈｉｓ、Ｄａｂ、ＡｓｐおよびＧｌｕからなる群より選択される。

【0035】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチドが、該アミノ酸配列のＮ末端に結合している少なくとも１個のさらなるアミノ酸を含むものである。

【0036】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチドが、該アミノ酸配列のＮ末端に結合している少なくとも２個のさらなるアミノ酸を含むものである。

【0037】

本発明の一部の実施形態によれば、該アミノ酸配列のＮ末端に結合している該少なくとも１個のさらなるアミノ酸がＡｒｇである。

【0038】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチドがさらに細胞膜透過部分を含むものである。

【0039】

本発明の一部の実施形態によれば、細胞膜透過部分が該ペプチドのＮ末端に結合している。

【0040】

本発明の一部の実施形態によれば、細胞膜透過部分が、脂肪酸部分、タンパク質性部分およびその組合せからなる群より選択される。

【0041】

本発明の一部の実施形態によれば、脂肪酸部分がミリストイル脂肪酸を含み、タンパク質性部分が少なくとも１個の正荷電アミノ酸を含む。

【0042】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチド２０アミノ酸長より長くない。

【0043】

本発明の一部の実施形態によれば、該ペプチドが、少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質のコンホメーションを野生型（ＷＴ）ｐ５３タンパク質のコンホメーションに変化させるものである。

【0044】

本発明の一部の実施形態によれば、該ペプチドが、少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質のコンホメーションを、変異型ｐ５３タンパク質が、ＷＴ ｐ５３タンパク質に対して指向されるモノクローナル抗体によって認識されるように変化させるものである。

【0045】

本発明の一部の実施形態によれば、変異型ｐ５３タンパク質が、ＷＴ ｐ５３タンパク質に対して指向されるモノクローナル抗体によって認識されないものである。

【0046】

本発明の一部の実施形態によれば、変異型ｐ５３タンパク質が、該ペプチドに結合すると、ＷＴ ｐ５３タンパク質に対して指向されるモノクローナル抗体によって認識されるものである。

【0047】

本発明の一部の実施形態によれば、該モノクローナル抗体がＡｂ１６２０である。

【0048】

本発明の一部の実施形態によれば、該ペプチドが、少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質の活性をＷＴ ｐ５３タンパク質の活性に復元させるものである。

【0049】

本発明の一部の実施形態によれば、該活性が、変異型ｐ５３タンパク質発現細胞のバイアビリティを低下させることである。

【0050】

本発明の一部の実施形態によれば、該活性が、変異型ｐ５３タンパク質発現細胞のアポトーシスを促進させることである。

【0051】

本発明の一部の実施形態によれば、該活性が、変異型ｐ５３タンパク質発現細胞内のｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合エレメントに対する結合である。

【0052】

本発明の一部の実施形態によれば、該コンセンサスＤＮＡ結合エレメントが、配列番号：５５および５６）に示す核酸配列を含むものである。

【0053】

本発明の一部の実施形態によれば、該結合が、内在性ｐ５３標的遺伝子の少なくとも一部活性化をもたらすものである。

【0054】

本発明の一部の実施形態によれば、内在性標的遺伝子が、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＰＵＭＡからなる群より選択される。

【0055】

本発明の一部の実施形態によれば、変異型ｐ５３タンパク質が、ＷＴ ｐ５３タンパク質と異なるコンホメーションのものである。

【0056】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチドが配列番号：４２９または４４８に示すものである。

【0057】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチドが配列番号：４２９、４４８、４４６、４４９または４６２に示すものである。

【0058】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチドが、配列番号：８および４１２～４６４からなる群より選択される。

【0059】

本発明の一部の実施形態によれば、単離ペプチドが配列番号：５９～３８２に示すいずれかのペプチドではない。

【0060】

本発明の一部の実施形態の一態様により、変異型ｐ５３タンパク質と関連している疾患、障害または病状の処置方法であって、処置を必要とする被験体に治療有効量の本明細書に記載の単離ペプチドを投与し、それにより該疾患、障害または病状を処置することを含む方法を提供する。

【0061】

本発明の一部の実施形態によれば、該方法がさらに、該被験体に治療有効量の白金ベースの化学療法薬を投与することを含むものである。

【0062】

本発明の一部の実施形態の一態様により、変異型ｐ５３タンパク質と関連している疾患、障害または病状の処置方法であって、処置を必要とする被験体に治療有効量で、白金系化学療法薬と、ある空間および立体構成を有するアミノ酸配列を含む単離ペプチドとを投与することを含み、該空間および立体構成が、該ペプチドがｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、ｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）が該ＤＢＤに結合するのと同じ様式で結合することを可能にするものであり、該ペプチドは少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させるものであり、それにより該疾患、障害または病状を処置する方法を提供する。

【0063】

本発明の一部の実施形態の一態様により、変異型ｐ５３タンパク質と関連している疾患、障害または病状の処置方法であって、処置を必要とする被験体に治療有効量で、ある空間および立体構成を有するアミノ酸配列を含む単離ペプチドを投与することを含み、該空間および立体構成が、該ペプチドがｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、ｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）が該ＤＢＤに結合するのと同じ様式で結合することを可能にするものであり、該ペプチドは少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させるものであり、該治療有効量が０．０１～０．３ｍｇ／ｋｇ／日であり、それにより該疾患、障害または病状を処置する方法を提供する。

【0064】

本発明の一部の実施形態によれば、該ペプチドが本明細書に記載のペプチドである。

【0065】

本発明の一部の実施形態によれば、該ペプチドがｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）である。

【0066】

本発明の一部の実施形態によれば、該投与が皮下投与を含む。

【0067】

本発明の一部の実施形態によれば、該投与が連続輸注を含む。

【0068】

本発明の一部の実施形態によれば、該疾患ががんである。

【0069】

特に定義していない限り、本明細書で用いる技術用語および／または科学用語はすべて、本発明が関する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料が、本発明の実施形態の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法および／または材料を以下に説明する。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）に支配される。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、必ずしも限定を意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0070】

本発明の一部の実施形態を、単なる一例として、添付の図面を参照しながら本明細書に記載する。次に、図面について具体的に詳細に参照するが、図示した具体的詳細は一例にすぎず、本発明の実施形態の実例の論考の目的のためであることを強調しておく。これに関連して、本記載により、図面とともに考慮すると、当業者には、どのようにして本発明の実施形態が実施され得るかが明らかとなろう。

【0071】

図面において：

【図1】図１は、ＥＳ２卵巣がん細胞のバイアビリティアッセイにおけるｐＣＡＰ－２５０（配列番号：１）の単独またはシスプラチンとの組合せでの用量応答である。細胞を９６ウェルプレート内で、３０００個の細胞／ウェルで培養した。ｐＣＡＰ－２５０の段階希釈列を単独または１μｇ／ｍｌのシスプラチンと一緒のいずれかで添加し、プレートをさらに４８時間、３７℃でインキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞のバイアビリティを、細胞をクリスタルバイオレット（０．０５％）（メタノール／ＰＢＳ（１：５，ｖ／ｖ）中）で１０分間、染色した後、ＰＢＳで３回洗浄することによって測定した。１０％酢酸を各ウェルに１０分間、添加した。ＯＤを５９５ｎｍにおいて測定した。１μｇ／ｍｌで処理したＥＳ２細胞のバイアビリティは３９％であった。ｐＣＡＰ－２５０のＩＣ５０は３．２μＭであると推定され、シスプラチンとの組合せでのｐＣＡＰ－２５０のＩＣ５０は１．９μＭであると推定され、この２つの化合物の相乗効果が示された。

【図2】図２は、ＥＳ２卵巣がん細胞のバイアビリティアッセイにおけるｐ５３ ＤＢＤとの結合に対するｐＣＡＰ－２５０（配列番号：１）およびいろいろな誘導体（配列番号：２～１９）の効果（ＭＳＴによる測定時）を示す棒グラフである。内在性ｍｐ５３^{Ｓ２４１Ｆ}を発現している細胞ＥＳ２ Ｃｏｎ、およびｍｕｔｐ５３に対する特異性の対照にするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてｐ５３を安定的にノックアウトしたＥＳ２ ＫＯ細胞（ＥＳ２ ｐ５３ＫＯ）を９６ウェルプレート内で、３０００個の細胞／ウェルで培養した。表示したペプチドを８μｇ／ｍｌの濃度で添加し、プレートをさらに４８時間、３７℃でインキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞のバイアビリティを、細胞をクリスタルバイオレット（０．０５％）（メタノール／ＰＢＳ（１：５，ｖ／ｖ）中）で１０分間、染色した後、ＰＢＳで３回洗浄することによって測定した。１０％酢酸を各ウェルに１０分間、添加した。ＯＤを５９５ｎｍにおいて測定した。ＥＳ ＫＯと比べたときのＥＳ２ Ｃｏｎに対する特定のペプチドの効果の差は、ｍｕｔｐ５３発現に対するペプチドの特異性を示す。アラニンに置換したアミノ酸（例えば、セリンおよびヒスチジン）のいくつかのペプチド誘導体はＥＳ２ Ｃｏｎ細胞に対する効果の低下を示し、ペプチドの有効性のためのこのようなアミノ酸の重要性を示す。

【図3A】図３Ａは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3B】図３Ｂは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3C】図３Ｃは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3D】図３Ｄは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3E】図３Ｅは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3F】図３Ｆは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3G】図３Ｇは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3H】図３Ｈは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3I】図３Ｉは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3J】図３Ｊは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図3K】図３Ｋは、蛍光標識したＷＴｐ５３ＤＢＤ（図３Ａ）または完全長ｐ５３（図３Ｂ）および表示したペプチド（配列番号：１、４、９）の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析のグラフである。実験は、製造業者の使用説明書に従って行なった；表示した各ペプチドの１０の段階希釈列；（図３Ａ－ ｐＣＡＰ－２５０）（図３Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ ｐＣＡＰ４０２、ｐＣＡＰ ４０４、ｐＣＡＰ４０９およびｐＣＡＰ ３６４）を調製し、標識タンパク質を各ペプチド試料に添加し、キャピラリーにロードした。これらの試料を蛍光ｗｔｐ５３ＤＢＤの移動について、温度勾配において、いろいろな濃度のペプチドを用いて解析した。ＭＳＴ解析の結果を、製造業者のデータ解析ソフトウェアにより得られた曲線として示す。

【図4A】図４Ａは、種々の投与様式の薬物動態を示す。図４Ａ－ １ｍｇ／ｋｇ ｉｖ投与後のｐＣＡＰ－２５０の時間に対する血漿濃度のプロフィール（平均±ＳＤ，ｎ＝３）。

【図4B】図４Ｂは、種々の投与様式の薬物動態を示す。図４Ｂ－ ７日間の連続皮下投与後のｐＣＡＰ－２５０の時間に対する血漿濃度のプロフィール（平均±ＳＤ，ｎ＝３）。

【図4C】図４Ｃは、種々の投与様式の薬物動態を示す。図４Ｃ－ １ｍｇ／ｋｇ ｉｖ投与後のｐＣＡＰ－２５０の時間に対する血漿濃度のプロフィール（平均±ＳＤ，ｎ＝３）。

【図4D】図４Ｄは、種々の投与様式の薬物動態を示す。図４Ｄ－ １ｍｇ／ｋｇの皮下投与後のＰＣＡＰ－２５０の時間に対する血漿濃度のプロフィール（平均±ＳＤ，ｎ＝３）。

【図5】図５Ａは、マウス異種移植片モデルにおけるｐＣＡＰ－２５０ペプチドのインビボ効果である。ルシフェラーゼを発現している２^＊１０^５個のＥＳ２細胞をヌードマウスの臀部に注射した。生物発光を測定した。注射の１２日後、マウスを無作為に４つの群に分け、週に３回、２つの対照ペプチドの混合物（ｐＣＡＰ ７６および１２；５μｇの各ペプチド）またはｐＣＡＰ－２５０（１０μｇ）のいずれかを腫瘍内注射した。択一的に、マウスに、０．８ｍｇ（ＰＢＳ中）の対照ペプチドまたは０．８ｍｇ（ＰＢＳ中）のｐＣＡＰ－２５０を入れたアルゼットミニポンプを埋め込んだ。図５Ａ，実験終了時（２１日目）の対照群マウスおよび腫瘍内ｐＣＡＰ－２５０処置マウスのライブイメージング。

【図5B】図５Ｂは、マウス異種移植片モデルにおけるｐＣＡＰ－２５０ペプチドのインビボ効果である。ルシフェラーゼを発現している２^＊１０^５個のＥＳ２細胞をヌードマウスの臀部に注射した。生物発光を測定した。注射の１２日後、マウスを無作為に４つの群に分け、週に３回、２つの対照ペプチドの混合物（ｐＣＡＰ ７６および１２；５μｇの各ペプチド）またはｐＣＡＰ－２５０（１０μｇ）のいずれかを腫瘍内注射した。択一的に、マウスに、０．８ｍｇ（ＰＢＳ中）の対照ペプチドまたは０．８ｍｇ（ＰＢＳ中）のｐＣＡＰ－２５０を入れたアルゼットミニポンプを埋め込んだ。図５Ｂ－実験終了時（１４日目）の対照群マウスおよびアルゼットミニポンプによるｐＣＡＰ－２５０処置マウスのライブイメージング。

【図5C】図５Ａ～Ｄは、マウス異種移植片モデルにおけるｐＣＡＰ－２５０ペプチドのインビボ効果である。ルシフェラーゼを発現している２^＊１０^５個のＥＳ２細胞をヌードマウスの臀部に注射した。生物発光を測定した。注射の１２日後、マウスを無作為に４つの群に分け、週に３回、２つの対照ペプチドの混合物（ｐＣＡＰ ７６および１２；５μｇの各ペプチド）またはｐＣＡＰ－２５０（１０μｇ）のいずれかを腫瘍内注射した。択一的に、マウスに、０．８ｍｇ（ＰＢＳ中）の対照ペプチドまたは０．８ｍｇ（ＰＢＳ中）のｐＣＡＰ－２５０を入れたアルゼットミニポンプを埋め込んだ。図５Ｃ－対照マウスおよび有効ｐＣＡＰ－２５０群：箱ひげ図は、時間の関数としての腫瘍のルシフェラーゼの読取り値を示す；平均（横線）、標準偏差（箱）、処置の開始の前（０日目まで）および後の最大および最小の読み値を示す。ＩＶＩＳシステムのバックグラウンド検出レベルの閾値は約５×１０^６光子であった。

【図5D】図５Ａ～Ｄは、マウス異種移植片モデルにおけるｐＣＡＰ－２５０ペプチドのインビボ効果である。ルシフェラーゼを発現している２^＊１０^５個のＥＳ２細胞をヌードマウスの臀部に注射した。生物発光を測定した。注射の１２日後、マウスを無作為に４つの群に分け、週に３回、２つの対照ペプチドの混合物（ｐＣＡＰ ７６および１２；５μｇの各ペプチド）またはｐＣＡＰ－２５０（１０μｇ）のいずれかを腫瘍内注射した。択一的に、マウスに、０．８ｍｇ（ＰＢＳ中）の対照ペプチドまたは０．８ｍｇ（ＰＢＳ中）のｐＣＡＰ－２５０を入れたアルゼットミニポンプを埋め込んだ。図５Ｄ－対照マウスおよび有効ｐＣＡＰ－２５０群：箱ひげ図は、時間の関数としての腫瘍のルシフェラーゼの読取り値を示す；平均（横線）、標準偏差（箱）、処置の開始の前（０日目まで）および後の最大および最小の読み値を示す。ＩＶＩＳシステムのバックグラウンド検出レベルの閾値は約５×１０^６光子であった。

【図6A】図６Ａは、Ｐ５３ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の表面上に対するＨＳＴＰＨＰＤペプチド配列の任意選択の予測されるペプチド結合位置を示す。ＤＢＤをカートン（ｃａｒｔｏｎ）シアン表示で示し、予測されるペプチドをマゼンタの棒として示す。図６Ａ．ＤＢＤペプチド複合体の概要。

【図6B】図６Ｂは、Ｐ５３ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の表面上に対するＨＳＴＰＨＰＤペプチド配列の任意選択の予測されるペプチド結合位置を示す。ＤＢＤをカートン（ｃａｒｔｏｎ）シアン表示で示し、予測されるペプチドをマゼンタの棒として示す。図６Ｂ．ＤＢＤ－ペプチド結合界面のより精密な検査。

【図6C】図６Ｃは、Ｐ５３ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の表面上に対するＨＳＴＰＨＰＤペプチド配列の任意選択の予測されるペプチド結合位置を示す。ＤＢＤをカートン（ｃａｒｔｏｎ）シアン表示で示し、予測されるペプチドをマゼンタの棒として示す。図６Ｃ．該ＤＢＤ（鎖Ｂ）と予測されるペプチド結合位置（鎖Ａ）間の非結合型相互作用の詳細な原子リスト。

【図7】図７は、ｐ５３変異型ｐ５３Ｒ２７３Ｈを含む三連ＳＷ４８０細胞株でのｐ５３再活性化ペプチドの用量応答効果を示す。細胞を９６ウェルプレート内で、３０００個の細胞／ウェルで培養した。いろいろなペプチドの段階希釈列を添加し、プレートをさらに７２時間、３７℃でインキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞のバイアビリティを、細胞をクリスタルバイオレット（０．０５％）（メタノール／ＰＢＳ（１：５，ｖ／ｖ）中）で１０分間、染色した後、ＰＢＳで３回洗浄することによって測定した。１０％酢酸を各ウェルに１０分間、添加した。ＯＤを５９５ｎｍにおいて測定した。結果は、非処理細胞のバイアビリティ１００％に対して標準化している。

【図8】図８は、三連でのｐ５３再活性化ペプチドの用量応答効果を示す。ｐ５３変異型Ｓ２４１Ｆを含むＥＳ２細胞株。細胞を９６ウェルプレート内で、３０００個の細胞／ウェルで培養した。いろいろなペプチドの段階希釈列を添加し、プレートをさらに４８時間、３７℃でインキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞のバイアビリティを、細胞をクリスタルバイオレット（０．０５％）（メタノール／ＰＢＳ（１：５，ｖ／ｖ）中）で１０分間、染色した後、ＰＢＳで３回洗浄することによって測定した。１０％酢酸を各ウェルに１０分間、添加した。ＯＤを５９５ｎｍにおいて測定した。結果は、非処理細胞のバイアビリティ１００％に対して標準化している。

【図9】図９は、２９３Ｋにおいて取得した野生型ｐ５３コアドメイン（ＤＢＤ）の１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル、ＤＢＤ（配列番号：４４の９４～３１２）のスペクトルを示し、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌによって得た残基の割り当てを黒で示す［Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｔ－ｓｐｏｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｐ５３ ｃｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ ｅｖｉｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｌｏｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９９．９６（１５）：ｐ．８４３８－４２］。遊離ＤＢＤ（９４～２９６）およびＤＢＤ－ｐＣＡＰ ２５０複合体について得られたＮＭＲスペクトルを、それぞれ青および赤で示す。中くらい（Ｃ２７７とＲ２８０）および大きなピークの変化（Ｇ１１７）の例を、それぞれマゼンタおよび茶色で強調している。Ｈ１１５およびＹ１２６のピーク領域を黄色で強調している。

【図10】図１０は、ＤＢＤに対するｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）の結合の結果としての１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルの変化に対するＤＢＤの構造のマッピングを示す。ＤＢＤの構造をカートゥーン表示で示し、ＤＮＡを黄色に彩色している。Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（上掲）の解析で割り当てられなかった残基を緑に彩色し、ｐＣＡＰ ２５０の添加の際のピークの変化に関与する残基をマゼンタに彩色している。

【図11A】図１１Ａは、Ｈ１１５、Ｇ１１７およびＹ１２６の構造の再組織化を示す。ＤＢＤの構造をカートゥーン表示で示し、ＤＮＡを黄色に彩色している。Ｈ１１５、Ｇ１１７およびＹ１２６を緑の棒として示し、Ｌ１ループをマゼンタに彩色している。図１１Ａおよび１１Ｂは、それぞれ、ＮＭＲ（ｐｄｂコード２ＦＥＪ）によって得られた最良および２番目に最良のエネルギーＤＢＤコンホメーションを示す。

【図11B】１１Ｂは、Ｈ１１５、Ｇ１１７およびＹ１２６の構造の再組織化を示す。ＤＢＤの構造をカートゥーン表示で示し、ＤＮＡを黄色に彩色している。Ｈ１１５、Ｇ１１７およびＹ１２６を緑の棒として示し、Ｌ１ループをマゼンタに彩色している。図１１Ａおよび１１Ｂは、それぞれ、ＮＭＲ（ｐｄｂコード２ＦＥＪ）によって得られた最良および２番目に最良のエネルギーＤＢＤコンホメーションを示す。

【図12】図１２は、２９３Ｋにおいて取得した野生型ｐ５３ ＤＢＤ－ペプチド複合体の１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを示す。ＤＢＤ－ｐＣＡＰ ２５０およびＤＢＤ－ｐＣＡＰ ６１５（配列番号：４６５）タンパク質ペプチド複合体について得られたＮＭＲスペクトルを、それぞれ赤および緑で示す。Ｈ１１５およびＹ１２６のピークを丸で強調している。

【図13】図１３は、２９３Ｋにおいて取得した野生型ｐ５３ ＤＢＤおよびＤＢＤ－ｐＣＡＰ ５５３（配列番号：４２９）複合体の１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを示す。遊離ＤＢＤおよびＤＢＤ－ｐＣＡＰ ５５３タンパク質ペプチド複合体について得られたＮＭＲスペクトルを、それぞれ青および赤で示す。ｐＣＡＰ ５５３ペプチドの編集時に特異的に出現した、割り当てられなかった強いピークを緑の楕円として強調している。ＤＢＤ－ｐＣＡＰ ５５３複合体内でより密集して丸い状態になっているピークの数少ない例を茶色の楕円で強調している。

【図14】図１４は、ＤＢＤ－ｐＣＡＰ ２５０複合体の上位２つの予測されるペプチド結合モデルを示す。ＤＢＤの構造をカートゥーン表示で示し、ＤＮＡを黄色に彩色している。Ｈ１１５、Ｇ１１７およびＹ１２６を緑の棒として示し、Ｌ１ループをマゼンタに彩色している。ＤＢＤ－ｐＣＡＰ ２５０複合体の上位２つの予測されるペプチド結合モデルをシアンに彩色している。

【発明を実施するための形態】

【0072】

本発明は、その一部の実施形態において、変異型ｐ５３と関連している疾患、障害または病状の処置におけるペプチドおよびその使用に関する。

【0073】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしもその適用が、以下の説明に示す詳細事項または本実施例に例示する詳細事項に限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能である、または種々の様式で実施または行なうことが可能である。

【0074】

本発明の一部の実施形態の発明者らは、以前に、ｍｕｔｐ５３再活性化ペプチドを選択するためのファージディスプレイの使用を報告している（ＷＯ２０１５／０１９３１８，これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）を含むリードペプチドは、インビトロでｍｕｔｐ５３にＷＴｐ５３様活性を付与し、生細胞において、いくつかの異種移植片モデルのｍｕｔｐ５３担持腫瘍の退縮を引き起こすことが示された。

【0075】

本発明の実施化にあたり、本発明者らは、ｐＣＡＰ ２５０がｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に結合すること見出した。アラニンスキャニングを用いた構造解析／機能解析により、該ＤＢＤに対するｐＣＡＰ ２５０の結合のためのコンセンサス部が明らかになった。

【0076】

ＮＭＲの実験結果は、ｐ５３タンパク質のＷＴ ＤＢＤに対するｐＣＡＰ ２５０およびそのペプチドバリアントの顕在結合のさらなる証拠を示す。このような結果は、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）解析を用いた該ＤＢＤに対するｐＣＡＰ ２５０の結合に関する所見（図３Ａ～Ｋ）をサポートする。ＮＭＲの結果はさらに、ｐＣＡＰ ２５０およびそのペプチドバリアントの結合によって該ＤＢＤにおいて構造変化が誘導され、この構造変化が、ＤＮＡに対する該ＤＢＤの結合能に必須である該ＤＢＤ－ＤＮＡ結合界面領域、すなわち、ヘリックス－２およびＬ１ループ構造モチーフの完全性および安定性に直接影響を及ぼすことを示す。ｐＣＡＰ ２５０およびそのペプチドバリアントの結合はさらに、ヘリックス２およびＬ１ループ構造モチーフの周囲のさらなる残基に影響を及ぼし、該ＤＢＤ表面上に比較的大きいが確固たる被影響パッチが作出される。

【0077】

このような所見により、ｐ５３のＤＢＤと同じ相互作用を共有しており、少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させることができる新規なペプチドの設計が可能になり、抗がん活性が賦与されたかかるペプチドを実施例５に示す。

【0078】

したがって、本発明の一態様により、ある空間および立体構成で配置されたアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、該空間および立体構成が、該ペプチドがｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、ｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）が該ＤＢＤに結合する際と同じ該ＤＢＤ内の少なくとも１個の残基によって相互作用することを可能にするものであり、前記ペプチドは少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させるものである単離ペプチドを提供する。

【0079】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドがＷＯ２０１５／０１９３１８の配列番号：１～３３８、３６８～３８２（すなわち、本明細書における配列番号：５９～３８２）ではない。

【0080】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドが、ＷＯ２０１５／０１９３１８（これは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に変異型ｐ５３を再活性化させる活性を有すると教示されたいずれかのペプチドではない。

【0081】

本明細書で用いる場合、用語「単離（された）」とは、天然環境、例えば体内から、またはペプチドライブラリーから少なくとも部分的に分離されていることをいう。

【0082】

本明細書で用いる場合、用語「ｐ５３」（「ＴＰ５３」としても知られている）は、一般的に転写因子としての機能を果たし、細胞周期を調節し、したがって野生型形態では癌抑制遺伝子としての機能を果たすＥＣ ２．７．１．３７のタンパク質産物をコードしている遺伝子配列をいう。具体的な一実施形態によれば、ｐ５３はヒトｐ５３である。

【0083】

本明細書で用いる場合、用語「野生型ｐ５３」、「ｗｔ ｐ５３」および「ＷＴ ｐ５３」は互換的に使用され得、野生型ｐ５３タンパク質のコンホメーションを有し、したがって野生型ｐ５３タンパク質の活性を有する野生型ｐ５３タンパク質を指す。一部の実施形態では、野生型ｐ５３は特異的モノクローナル抗体によって同定され得る。一部の特定の実施形態では、該モノクローナル抗体がＡｂ１６２０である。

【0084】

該タンパク質の構造データはＰＤＢｅ ＲＣＳＢから入手可能である。

【0085】

タンパク質に関する用語「コンホメーション」は、空間内におけるタンパク質の構造的配置（フォールディング）を指す。

【0086】

本明細書で用いる場合、用語「変異型ｐ５３」、「Ｍｕｔ－ｐ５３」、「変異したｐ５３」および「ｐ５３変異型」は互換的に使用され得、標的細胞において効率的に機能することができない変異したｐ５３タンパク質を指す。一部の実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３が、その標的部位に結合することができないものである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３が、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）領域が変異しているものである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３が、不活性なコンホメーションにおいてミスフォールディングされたものである。一部の例示的な実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３が、温度感受性（ｔｓ）ｍｕｔ ｐ５３ Ｒ２４９Ｓ（Ｒ２４９Ｓ ｐ５３）、ホットスポット完全長変異型ｐ５３ Ｍｕｔ－ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ（Ｒ１７５Ｈ ｐ５３）、または任意の他のＭｕｔ－ｐ５３タンパク質である。一部の実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３が、ｐ５３のミスフォールディングコンホメーション（ｐ５３の変異によって誘導される）を認識し得る特異的モノクローナル抗体によって同定されるものである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３が、特異的モノクローナル抗体によって同定されるものである。一部の特定の実施形態では、該モノクローナル抗体がＡｂ４２０である。

【0087】

一部の特定の実施形態では、変異型ｐ５３タンパク質が、Ｒ１７５Ｈ、Ｖ１４３Ａ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２８０Ｋ、Ｐ３０９Ｓ、Ｐ１５１Ｓ、Ｐ１５１Ｈ、Ｃ１７６Ｓ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｌ、Ｑ１９２Ｒ、Ｒ２１３Ｑ、Ｙ２２０Ｃ、Ｙ２２０Ｄ、Ｒ２４５Ｓ、Ｒ２８２Ｗ、Ｄ２８１Ｇ、Ｓ２４１Ｆ、Ｃ２４２Ｒ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｄ２８１Ｇ、Ｒ２７３ＣおよびＶ２７４Ｆからなる群より選択される変異を含むものである。各可能性は本発明の個々の実施形態を表す。

【0088】

本明細書において言及する場合、用語「再活性化ペプチド」、「Ｍｕｔ－ｐ５３再活性化ペプチド」または「該ペプチド」は互換的に使用され得、Ｍｕｔ－ｐ５３に対する活性を少なくとも部分的に復元させ得るペプチドを指す。フレーズ「変異型ｐ５３タンパク質の再活性化」は、本明細書で用いる場合、変異型ｐ５３タンパク質と相互作用すると、該変異型ｐ５３タンパク質の活性の少なくとも１つが高まるペプチドをいい、ここで、該活性は野生型ｐ５３タンパク質の活性である。例えば、本発明によって提供されるペプチドと相互作用すると、変異型ｐ５３タンパク質は、がん細胞において、カスパーゼなどのアポトーシス促進タンパク質の発現が、同様の状況における野生型ｐ５３タンパク質で考えられ得るものと同様の様式で直接または間接的に高まり得るか、あるいはインビボで腫瘍が抑制され得る（これは、該疾患の異種移植片マウスモデルを用いてアッセイされ得る）。

【0089】

理論に拘束されないが、該再活性化性ペプチドは、ｍｕｔ ｐ５３に該ＤＢＤにおいて結合し、ＷＴｐ５３タンパク質のフォールディングを熱力学的に安定化させ、したがって腫瘍抑制機能を復元させると提案される。

【0090】

一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドはＭｕｔ－ｐ５３を、Ｍｕｔ－ｐ５３のコンホメーションに影響を及ぼし、天然状態のＷＴ ｐ５３にもっと類似した、または同一のコンホメーションにすることにより再活性化させ得るものである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドはＭｕｔ－ｐ５３を、標的ＤＮＡ内のＷＴ ｐ５３結合部位へのＭｕｔ－ｐ５３の結合が復元されるように再活性化させ得るものである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドは、Ｍｕｔ－ｐ５３の生化学的特性を復元させ得るものである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドは、Ｍｕｔ－ｐ５３タンパク質が、がん細胞のｐ５３選択的阻害を示すことを誘導し得るものである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドはＭｕｔ－ｐ５３を、ＷＴ ｐ５３タンパク質と同様（すなわち、Ｍｕｔ－ｐ５３とＷＴ ｐ５３間の差が±１０％，２０％、３０％）または同一の構造特性、生化学的特性、生理学的特性および／または機能特性を有するように再活性化させ得るものである（例えば、本明細書に記載の結合アッセイ／構造アッセイ、例えばＭＳＴおよびＮＭＲにおいて測定時）。

【0091】

一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが３～３０アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが７～３０アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが１２～３０アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが３～２５アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが７～２５アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが１２～２５アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが３～２２アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが７～２２アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが１２～２２アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが７～９アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが６～９アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが７～１０アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが６～１０アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが、９～１０アミノ酸長であるペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが８～１０アミノ酸長であるペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが６～９アミノ酸長であるペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが６～８アミノ酸長であるペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが６～７アミノ酸長であるペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが７～８アミノ酸長であるペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが７～９アミノ酸長であるペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが５～２０アミノ酸長であるペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが６～１５アミノ酸長であるペプチドである。一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドが７または１２アミノ酸長であるペプチドである。

【0092】

用語「少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させ得る」または「少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させる」は、本明細書において互換的に用いており、変異型ｐ５３タンパク質に結合すると、該変異型ｐ５３タンパク質が、野生型ｐ５３タンパク質の対応する活性と同様の活性を獲得するか、または該活性が高まるペプチドをいう。

【0093】

本明細書で用いる場合、「ｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン」または「ＤＢＤ」は、標的タンパク質内のｐ５３応答性エレメントに結合するｐ５３のドメインであって（例えば、コンセンサスＤＮＡ結合エレメントは、配列番号：４４に示すアミノ酸配列を含むもの、または該アミノ酸配列からなるものである）、典型的には、ヒトｐ５３（完全長ｐ５３ ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＣ１６７９９．１，配列番号：４４）残基９４～２９２、９１～２９２、９４～２９３、９４～２９６、９１～２９６、９１～２９３、９４～３１２または９２～３１２に帰属されるドメインをいう。具体的な一実施形態によれば、該ＤＢＤは、変異したｐ５３のものである。

【0094】

記載のように、該ペプチドは、ある空間および立体構成で配置されたアミノ酸配列を含むものであって、該空間および立体構成が、該ペプチドがｐ５３のＤＢＤと、ｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）が該ＤＢＤに結合する際の該ＤＢＤ内の少なくとも１個の残基によって相互作用することを可能にするものである。

【0095】

したがって、本発明の一部の実施形態による再活性化性ペプチドはｐ５３の該ＤＢＤドメインと、典型的には、該ＤＢＤ内において有効濃度の該ペプチドの存在が可能となるように該ペプチドの反応性基（１つまたは複数）が該ＤＢＤ内の対応する反応性基（１つまたは複数）（典型的には、アミノ酸残基の側鎖）に充分に近接して位置するように会合し、また、該ペプチドの反応性基が正しい向きで位置し、オーパーラップ、したがって、強力な化学的相互作用および低解離が可能となるように会合している。したがって、本発明の一部の実施形態による再活性化性ペプチドは、典型的には、該相互作用に関与することがわかっている構造要素を含むものであり、また、ｐ５３のＤＢＤとの会合に影響を及ぼすか、または弱めるかもしれないコンホメーションの変化が回避されるようにコンホメーションの柔軟性を制限するものを有していてもよい。

【0096】

一部の実施形態によれば、該相互作用が前記ＤＢＤのヘリックス－２とＬ１によるものである。

【0097】

典型的には、ｈｅｌｉｘ－２はアミノ酸２７６～２８９間に位置し、Ｌ１はアミノ酸１１２～１２４間に位置する。

【0098】

一部の実施形態によれば、該相互作用が、前記ＤＢＤのヘリックス－２および／またはＬ１の構造安定性に影響を及ぼすものである（ＮＭＲによるアッセイ時）。

【0099】

一部の実施形態によれば、該ペプチドとの該相互作用を媒介する該ＤＢＤ内の該少なくとも１個の残基が、ｐ５３のＬ１のＨ１１５、Ｇ１１７ならびにｐ５３（ｗｔまたは変異型（アミノ酸の違いが典型的にはアミノ酸の番号付けに有意に影響しない１種類のアミノ酸である）のＹ１２６およびＶ２７４およびＧ２７９およびＲ２８０からなる群より選択される。しかしながら、当業者であれば、どのようにして対応アミノ酸を見つけるか（変異型ｐ５３における組成および位置に関して）がわかるであろう

【0100】

一部の実施形態によれば、該ペプチドと該ＤＢＤとの該相互作用が非共有結合性、例えば、水媒介性水素結合性相互作用である。

【0101】

一部の実施形態によれば、該相互作用が該アミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸によるものである。

【0102】

一部の実施形態によれば、該相互作用が該アミノ酸配列の少なくとも２個のアミノ酸によるものである。

【0103】

一部の実施形態によれば、該相互作用が該アミノ酸配列の少なくとも３個のアミノ酸によるものである。

【0104】

一部の実施形態によれば、該相互作用が該アミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸によるものである。

【0105】

具体的な一実施形態によれば、該相互作用が、ヒトｐ５３のアミノ酸Ｔｒｐ１４６および／またはＧｌｎ１４４とのものである。この相互作用は、おそらく、ｐＣＡＰ ２５０のＳｅｒまたは本明細書において以下にさらに記載する類似構造内の同様のものによるものである。

【0106】

具体的な一実施形態によれば、該相互作用がヒトｐ５３のアミノ酸Ｔｙｒ１２６、Ａｓｎ１２８および／またはＡｓｐ２６８とのものである。

【0107】

別の具体的な実施形態によれば、該相互作用が、ｐＣＡＰ ２５０のＡｓｐ１０または本明細書において以下にさらに記載する類似構造内の同様のものによるヒトｐ５３のアミノ酸Ｌｙｓ１０１とのものである。

【0108】

別の具体的な実施形態によれば、該相互作用が、ｐＣＡＰ ２５０のＡｓｐ１０または本明細書において以下にさらに記載する類似構造内の同様のものによるヒトｐ５３のアミノ酸Ｔｈｒ１０２とのものである。

【0109】

別の具体的な実施形態によれば、該相互作用が、ｐＣＡＰ ２５０のＴｈｒ６または本明細書において以下にさらに記載する類似構造内の同様のものによるヒトｐ５３のアミノ酸Ｐｈｅ１１３とのものである。

【0110】

別の具体的な実施形態によれば、該相互作用が、ｐＣＡＰ ２５０のＳｅｒ５または本明細書において以下にさらに記載する類似構造内の同様のものによるヒトｐ５３のアミノ酸Ｔｒｐ１４６とのものである。

【0111】

別の具体的な実施形態によれば、該相互作用が、ｐＣＡＰ ２５０のＴｈｒ６または本明細書において以下にさらに記載する類似構造内の同様のものによるヒトｐ５３のアミノ酸Ｓｅｒ５とのものである。

【0112】

別の具体的な実施形態によれば、該相互作用が、ｐＣＡＰ ２５０のＴｈｒ６または本明細書において以下にさらに記載する類似構造内の同様のものによるヒトｐ５３のアミノ酸Ｈｉｓ８とのものである。

【0113】

別の具体的な実施形態によれば、該相互作用が、ｐＣＡＰ ２５０のＳｅｒ５または本明細書において以下にさらに記載する類似構造内の同様のものによるヒトｐ５３のアミノ酸Ｇｌｙ１１２とのものである。

【0114】

別の具体的な実施形態によれば、該相互作用が、ｐＣＡＰ ２５０のＴｈｒ６または本明細書において以下にさらに記載する類似構造内の同様のものによるヒトｐ５３のアミノ酸Ｇｌｙ１１２とのものである。

【0115】

該相互作用のためのｐ５３ ＤＢＤの表面上の他の提案される位置を図６Ａ～Ｃ（これは本明細書の一部とみなし、ここで、各可能性は独立した実施形態を表す）に示す。

【0116】

該相互作用のためのｐ５３ ＤＢＤの表面上の他の提案される位置を図９～１４（これは本明細書の一部とみなし、ここで、各可能性は独立した実施形態を表す）に示す。

【0117】

該ペプチド内または該ＤＢＤ内のいずれかの該相互作用に極めて重要なアミノ酸を解明する方法は当該技術分野でよく知られており、限定されないが、結晶学ならびにコンピュータベースのアルゴリズム、例えばＡｎｃｈｏｒＤｏｃｋ（Ｂｅｎ Ｓｈｉｍｏｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１５ Ｍａｙ ５；２３（５）：９２９－４０）、Ｖｉｒｔｕａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒｓ Ｖ．２．などの使用が挙げられる。

【0118】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドがコンセンサスモチーフを含むものである。

【0119】

用語「コンセンサスモチーフ」は、本明細書で用いる場合、連続であっても非連続であってもよい少なくとも３個のアミノ酸、４、５または６個のアミノ酸のアミノ酸配列をいう。具体的な一実施形態によれば、コンセンサスモチーフは連続６アミノ酸長である。

【0120】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドが：
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６（配列番号：５３）
のアミノ酸配列を含むものであり、
ここで、
Ｘ_１およびＸ_５は正荷電アミノ酸であり；
Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＧｌｙからなる群より選択され；
Ｘ_３は任意のアミノ酸であり；
Ｘ_４およびＸ_６は、αメチルアミノおよびβ－ブレイカーアミノ酸からなる群より選択される。

【0121】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドが：
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６（配列番号：５４）
のアミノ酸配列を含むものであり、
ここで、
Ｘ_１およびＸ_５は、Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択され；
Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＧｌｙからなる群より選択され；
Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６は任意のアミノ酸である。

【0122】

本明細書で用いる場合、「正荷電アミノ酸」は、生理学的ｐＨで正電荷を有し得る（すなわち、プロトン化され得る）アミノ酸である。

【0123】

一実施形態によれば、正荷電アミノ酸が、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択される（である）。

【0124】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_３がＤ－アミノ酸である。

【0125】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_３が、リン酸化型（例えば、ホスホセリン）またはそのリン酸化模倣体（例えば、ＧｌｕもしくはＡｓｐ）である。

【0126】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_３が、リン酸化が可能でないアミノ酸（例えば、Ｖａｌ）である。

【0127】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_３が非水素結合性アミノ酸（例えば、Ａｌａ）である。

【0128】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_３が、極性無電荷アミノ酸（例えば、Ｓｅｒ）および疎水性アミノ酸（例えば、Ｉｌｅ）からなる群より選択される。

【0129】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_２がＳｅｒである。

【0130】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_４およびＸ_６が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＧｌｙからなる群より選択される。

【0131】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_４がαメチルアミノ酸またはβブレイカー、例えば、Ｐｒｏ、ＡｉｂまたはＡｌａである。

【0132】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_４がαメチルアミノ酸である。

【0133】

具体的な一実施形態によれば、Ｘ_６がＡｌａである。

【0134】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドがアミノ酸配列ＨＳＡＰＨＰ（配列番号：４６）を有するものである。

【0135】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドが、前記アミノ酸配列のＣ末端に結合している少なくとも１個のさらなるアミノ酸（Ｘ_７）を含むものである。

【0136】

具体的な一実施形態によれば、該少なくとも１個のさらなるアミノ酸が負荷電アミノ酸（すなわち、典型的には、生理学的ｐＨで負電荷を有する（すなわち、脱プロトン化される）アミノ酸）または小分子アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ）である。

【0137】

具体的な一実施形態によれば、該少なくとも１個のさらなるアミノ酸が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＳｅｒからなる群より選択される。

【0138】

具体的な一実施形態によれば、該少なくとも１個の負荷電アミノ酸がＡｓｐである。

【0139】

具体的な一実施形態によれば、該少なくとも１個のさらなるアミノ酸が２個のさらなるアミノ酸（Ｘ_７－Ｘ_８）を含み、前記Ｘ８が、Ｈｉｓ、Ｄａｂ、ＡｓｐおよびＧｌｕからなる群より選択される。

【0140】

具体的な一実施形態によれば、該少なくとも１個の負荷電アミノ酸がＡｓｐまたは連続する２個のＡｓｐ残基である。

【0141】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドが、前記アミノ酸配列のＮ末端に結合している少なくとも１個のさらなるアミノ酸を含むものである。

【0142】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドが、前記アミノ酸配列のＮ末端に結合している少なくとも２個のさらなるアミノ酸を含むものである。

【0143】

具体的な一実施形態によれば、前記アミノ酸配列のＮ末端に結合している該少なくとも１個のさらなるアミノ酸がＡｒｇまたは連続する２個のＡｒｇ残基である。

【0144】

該ＤＢＤに対する該ペプチドの結合は、当該技術分野で知られた任意の方法を用いて、例えば、可溶性ＤＢＤを競合剤として使用する競合アッセイを用いて調べることができる。

【0145】

用語「組換えまたは合成のペプチド」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で知られた標準的なバイオテクノロジーによる方法によって、例えば、細菌内での発現または固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって作製されたペプチドをいう。

【0146】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドがさらに細胞膜透過部分を含むものであり、これは、該ペプチドのＮ末端に結合していても、該ペプチドのＣ末端に結合していても、該ペプチドの両末端に結合していてもよい。また、この部分は、該ＤＢＤに対する該ペプチドの結合に干渉しない限り、末端にではなく該ペプチドの主部に結合していてもよいことは認識されよう。この部分は、天然状態では同じ様式（すなわち、位置またはケミストリー）で該ペプチドに結合していない異種部分であることは認識されよう。

【0147】

用語「浸透性」は、本明細書で用いる場合、薬剤または物質がバリア、膜または皮膚層を透過する、しみこむ、または全体に拡散することができる能力をいう。「細胞浸透性」または「細胞透過」部分は、分子が膜を透過するのを助長または向上させることができる当該技術分野で知られた任意の分子をいう。

【0148】

本明細書で用いる場合、フレーズ「浸透性向上性部分」は、結合した該ペプチド（あれば）が細胞膜を通過して輸送されるのを向上させる薬剤をいう。

【0149】

細胞内への組成物の浸透性を能動的もしくは受動的に助長する、または向上させる当該技術分野で知られた任意の部分が、本発明による該ペプチドのコアとのコンジュゲーションに使用され得る。非限定的な例としては：疎水性部分、例えば脂肪酸、ステロイドおよびバルキーな芳香族もしくは脂肪族の化合物；細胞膜受容体もしくは担体を有するものであり得る部分、例えばステロイド、ビタミン類および糖類、天然アミノ酸（例えば、正荷電アミノ酸、例えばＬｙｓもしくはＡｒｇ）および非天然アミノ酸ならびにタンパク質性部分、例えばトランスポーターペプチド（「細胞膜透過ペプチド」もしくはＣＰＰとも称される）、ポリアルギニンもしくはポリリシン、その組合せまたは抗体が挙げられる。一部の実施形態によれば、該タンパク質性部分がＣＰＰである。一部の実施形態によれば、該タンパク質性部分がポリアルギニンである。一部の実施形態によれば、疎水性部分が脂質部分またはアミノ酸部分である。本発明の一部の実施形態によれば、細胞膜透過部分は、タンパク質性部分と脂質ベースの部分の組合せ（例えば、該ペプチドのＮ末端に一方およびＣ末端に他方）である。

【0150】

細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）は、ほぼどの細胞の内側にもアクセスできる能力を有する短いペプチド（≦４０個のアミノ酸）である。このペプチドはカチオン性が高く、通常、アミノ酸アルギニンおよびリシンを高含有である。実際に、本発明者らは、正荷電アミノ酸（いずれかのペプチド末端に）またはポリカチオンアミノ酸（少なくとも２、例えば２～１２個）のポリ－Ａｒｇを使用し、該ペプチドに細胞浸透性を付与した。このペプチドは、細胞内に、共有結合および非共有結合によってコンジュゲートされた多種多様な積み荷、例えばタンパク質、オリゴヌクレオチド、さらには２００ｎｍのリポソームをも運ぶという並外れた特性を有する。したがって、さらなる例示的な実施形態によれば、ＣＰＰは、該ペプチドを細胞の内側に輸送するために使用され得る。

【0151】

ＴＡＴ（ＨＩＶ－１由来の転写アクチベータ）、ｐＡｎｔｐ（ペネトラチンとも称される，ショウジョウバエのアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ホメオドメイン転写因子）およびＶＰ２２（単純ヘルペルウイルス由来）は、細胞内に無毒性で効率的な様式で進入することができ、本発明の一部の実施形態での使用に好適であり得るＣＰＰの例である。ＣＰＰ－積み荷コンジュゲートの作製およびかかるコンジュゲートでの細胞の感染のためのプロトコルは、例えば、Ｌ Ｔｈｅｏｄｏｒｅ ｅｔ ａｌ．［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９５）１５（１１）：７１５８－７１６７］、Ｆａｗｅｌｌ Ｓ，ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，（１９９４）９１：６６４－６６８］、およびＪｉｎｇ Ｂｉａｎ ｅｔ ａｌ．［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１００：１６２６－１６３３］をみるとよい。

【0152】

しかしながら、本開示はそれに限定されず、当業者に知られた任意の適当な透過剤が使用され得る。

【0153】

本発明のペプチドが細胞膜透過ペプチドに結合されている場合、ペプチドの全長は５０個以下のアミノ酸、４０個以下のアミノ酸、３５個以下のアミノ酸、３０個以下のアミノ酸、２５個以下のアミノ酸、２２個以下のアミノ酸、２０個以下のアミノ酸、１５個以下のアミノ酸、１２個以下のアミノ酸、１０個以下のアミノ酸、９個以下のアミノ酸、８個以下のアミノ酸、または７個以下のアミノ酸であることが想定される。

【0154】

非タンパク質性の細胞膜透過部分の非限定的な例としては：疎水性部分、例えば脂質、脂肪酸、ステロイドおよびバルキーな芳香族もしくは脂肪族の化合物；細胞膜受容体もしくは担体を有するものであり得る部分、例えばステロイド、ビタミン類および糖類、ナノ粒子ならびにリポソームが挙げられる。

【0155】

用語「脂肪酸部分」は、本明細書で用いる場合、対応する完全脂肪酸起源の分子と同様の特定の一組の化学的および薬理学的特徴を示す脂肪酸の一部分をいう。この用語はさらに、脂肪（カルボン酸）酸のアシル成分を含む任意の分子種および／または分子断片をいう。

【0156】

本発明による浸透性向上性部分は、好ましくは、該ペプチドの配列に直接結合またはリンカーによって共有結合により連結され、ペプチドコンジュゲートを形成するものである。浸透性向上性部分は、該ペプチドの部分内の任意の位置に直接またはスペーサーを介して、好ましくは該ペプチドのアミノ末端に連結され得る。一部の特定の実施形態によれば、浸透性向上性部分は脂肪酸である。

【0157】

本発明による疎水性部分は、好ましくは脂質部分またはアミノ酸部分を含むものであり得る。具体的な一実施形態によれば、疎水性部分は：リン脂質、ステロイド、スフィンゴシン、セラミド、オクチル－グリシン、２－シクロヘキシルアラニン、ベンゾリルフェニルアラニン、プロピオノイル（Ｃ_３）；ブタノイル（Ｃ_４）；ペンタノイル（Ｃ_５）；カプロイル（Ｃ_６）；ヘプタノイル（Ｃ_７）；カプリロイル（Ｃ_８）；ノナノイル（Ｃ_９）；カプリル（Ｃ_１０）；ウンデカノイル（Ｃ_１１）；ラウロイル（Ｃ_１２）；トリデカノイル（Ｃ_１３）；ミリストイル（Ｃ_１４）；ペンタデカノイル（Ｃ_１５）；パルミトイル（Ｃ_１６）；フタノイル（（ＣＨ_３）_４）；ヘプタデカノイル（Ｃ_１７）；ステアロイル（Ｃ_１８）；ノナデカノイル（Ｃ_１９）；アラキドイル（Ｃ_２０）；ヘンエイコサノイル（ｈｅｎｉｅｃｏｓａｎｏｙｌ）（Ｃ_２１）；ベヘノイル（Ｃ_２２）；トルシサノイル（ｔｒｕｃｉｓａｎｏｙｌ）（Ｃ_２３）；およびリグノセロイル（Ｃ_２４）からなる群より選択され；ここで、前記疎水性部分は前記キメラポリペプチドに、アミド結合、スルフヒドリル、アミン、アルコール、フェノール基または炭素－炭素結合により結合している。

【0158】

本発明に従って使用され得る脂質性部分の他の例：リポフェクタミン、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ、ＤＭＲＩＥ、ＤＬＲＩＥ、ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＭＥＡＰ、ＤＯＤＭＰ、ＤＯＰＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＳＰＡ、ＥＤＬＰＣ、ＥＤＭＰＣ、ＤＰＨ、ＴＭＡＤＰＨ、ＣＴＡＢ、リシル－ＰＥ、ＤＣ－Ｃｈｏ、－アラニルコレステロール；ＤＣＧＳ、ＤＰＰＥＳ、ＤＣＰＥ、ＤＭＡＰ、ＤＭＰＥ、ＤＯＧＳ、ＤＯＨＭＥ、ＤＰＥＰＣ、プルロニック、Ｔｗｅｅｎ、ＢＲＩＪ、プラズマロゲン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、グリセロール－３－エチルホスファチジルコリン、ジメチルアンモニウムプロパン、トリメチルアンモニウムプロパン、ジエチルアンモニウムプロパン、トリエチルアンモニウムプロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、スフィンゴ脂質、スフィンゴミエリン、リゾ脂質、糖脂質、スルファチド、スフィンゴ糖脂質、コレステロール、コレステロールのエステル、コレステロールの塩、油、Ｎ－スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロール、１，３－ジパルミトイル－２－スクシニルグリセロール、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－３－スクシニルグリセロール、１－ヘキサデシル－２－パルミトイルグリセロホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルホモシステイン、Ｎ，Ｎ’－ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）－Ｎ，Ｎ’－ビス（（－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムエチル－アミノカルボニルメチレン）エチレンジアミンテトラヨージド；Ｎ，Ｎ”－ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）－Ｎ，Ｎ’、Ｎ”－トリス（（－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム－エチルアミノカルボニルメチレンジエチレントリアミンヘキサヨージド；Ｎ，Ｎ’－ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）－Ｎ，Ｎ”－ビス（（－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）シクロヘキシレン－１，４－ジアミンテトラヨージド；１，７，７－テトラ－（（－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルアンモニウムエチルアミノ－カルボニルメチレン）－３－ヘキサデシルアミノカルボニル－メチレン－１，３，７－トリアザヘプタンヘプタヨージド；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ（（－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム－エチルアミノカルボニルメチレン）－Ｎ’－（１，２－ジオレオイルグリセロ－３－ホスホエタノールアミノカルボニルメチレン）ジエチレントリアミンテトラヨージド；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸、リゾ脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、糖脂質、グルコリピド、スルファチド、スフィンゴ糖脂質、ホスファチジン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ポリマー担持脂質、スルホン化糖担持脂質、コレステロール、トコフェロールヘミスクシネート、エーテル結合した脂肪酸を有する脂質、エステル結合した脂肪酸を有する脂質、重合脂質、リン酸ジアセチル、ステアリルアミン、カルジオリピン、６～８炭素長の脂肪酸を有するリン脂質、非対称アシル鎖を有するリン脂質、６－（５－コレステン－３ｂ－イルオキシ）－１－チオ－ｂ－Ｄ－ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６－（５－コレステン－３ｂ－イルオキシ）ヘキシル－６－アミノ－６－デオキシ－１－チオ－ｂ－Ｄ－ガラクトピラノシド、６－（５－コレステン－３ｂ－イルオキシ）ヘキシル－６－アミノ－６－デオキシル－１－チオ－ａ－Ｄ－マンノピラノシド、１２－（（（７’－ジエチルアミノ－クマリン－３－イル）カルボニル）メチルアミノ）－オクタデカン酸；Ｎ－［１２－（（（７’－ジエチルアミノクマリン－３－イル）カルボニル）メチル－アミノ）オクタデカノイル］－２－アミノパルミチン酸；コレステリル）４’－トリメチル－アンモニオ）ブタノエート；Ｎ－スクシニルジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロール；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－３－スクシニル－グリセロール；１，３－ジパルミトイル－２－スクシニルグリセロール、１－ヘキサデシル－２－パルミトイルグリセロ－ホスホエタノールアミン、およびパルミトイルホモシステイン。

【0159】

用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において互換的に用いており、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的人工アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。

【0160】

用語「ペプチド」は、本明細書で用いる場合、天然状態のペプチド（分解産物、合成により合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれも）およびペプチド模倣物（典型的には、合成により合成されたペプチド）、ならびにペプチドアナログであり、例えば、該ペプチドを体内でより安定にする修飾または細胞内への透過能をより大きくする修飾を有するものであり得るペプトイドおよび半ペプトイドを包含している。かかる修飾としては、限定されないが、Ｎ末端の修飾、Ｃ末端の修飾、ペプチド結合の修飾、主鎖の修飾および残基の修飾が挙げられる。ペプチド模倣化合物の調製方法は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に明記されており、これは、引用により、あたかも本明細書にすべてが示されているかのごとく組み込まれる。これに関するさらなる詳細は本明細書において以下に示す。

【0161】

該ペプチド内のペプチド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）を、例えば、Ｎ－メチル化アミド結合（－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＯ－）、エステル結合（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、ケトメチレン結合（－ＣＯ－ＣＨ２－）、スルフィニルメチレン結合（－Ｓ（＝Ｏ）－ＣＨ２－）、α－アザ結合（－ＮＨ－Ｎ（Ｒ）－ＣＯ－）（ここで、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、アミン結合（－ＣＨ２－ＮＨ－）、スルフィド結合（－ＣＨ２－Ｓ－）、エチレン結合（－ＣＨ２－ＣＨ２－）、ヒドロキシエチレン結合（－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－）、チオアミド結合（－ＣＳ－ＮＨ－）、オレフィン性二重結合（－ＣＨ＝ＣＨ－）、含フッ素オレフィン性二重結合（－ＣＦ＝ＣＨ－）、レトロアミド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）、ペプチド誘導体（－Ｎ（Ｒ）－ＣＨ２－ＣＯ－）（ここで、Ｒは、炭素原子上に天然状態で存在している「通常の」側鎖である）で置き換えてもよい。

【0162】

このような修飾は、該ペプチド鎖上のどの結合に行なってもよく、さらには、いくつか（２～３）の結合に同時に行なってもよい。

【0163】

「保存的置換」は、あるクラスのアミノ酸の同じクラスのアミノ酸での置換をいい、ここで、クラスは、例えば、標準的なデイホフ頻度交換行列またはＢＬＯＳＵＭ行列による測定時の、共通する物理化学的なアミノ酸側鎖の特性および自然界にみられる相同タンパク質における高い置換頻度によって規定される。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスがカテゴリー化されており、：クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｉｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む。例えば、Ａｓｐの別のクラスＩＩＩ残基、例えばＡｓｎ、ＧｉｎまたはＧｌｕでの置換は保存的置換である。

【0164】

他の分類としては、正電荷アミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、負電荷アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、極性無電荷（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、疎水性側鎖（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が挙げられる。

【0165】

「非保存的置換」は、あるクラスのアミノ酸の別のクラスのアミノ酸での置換；例えば、クラスＩＩ残基であるＡｌａのクラスＩＩＩ残基、例えばＡｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＧｉｎでの置換をいう。

【0166】

天然の芳香族アミノ酸Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅを、非天然の芳香族アミノ酸、例えば１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）、ナフチルアラニン、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体またはＯ－メチル－Ｔｙｒで置換してもよい。他の合成の選択肢を本明細書において以下に表２に示す。

【0167】

また、本発明の一部の実施形態のペプチドは、１個以上の修飾アミノ酸または１個以上の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複雑な糖鎖など）を含むものであってもよい。

【0168】

用語「アミノ酸（“ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ”または“ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ”）」は、天然に存在する２０種類のアミノ酸；しばしばインビボで翻訳後修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンなど；ならびに他の珍しいアミノ酸、例えば限定されないが、２－アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノル－バリン、ノル－ロイシンおよびオルニチンを包含していると理解されたい。さらに、用語「アミノ酸」は、Ｄ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸の両方を包含している。

【0169】

以下の表１および２に、本発明の一部の実施形態で使用され得る天然に存在するアミノ酸（表１）および非通常または修飾アミノ酸（例えば合成のもの，表２）を示す。

【表1】

【表2】

【0170】

本発明の一部の実施形態のペプチドは、好ましくは線状形態で使用されるが、環化がペプチドの特徴に大幅に干渉しない場合は、環状形態の該ペプチドもまた使用され得ることは認識されよう。

【0171】

バイオアベイラビリティを改善するため、該ペプチドに少なくとも１個のＤアミノ酸を含めてもよい（例えば、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３個）。具体的な一実施形態によれば、該ペプチドのすべてのアミノ酸がＤアミノ酸である。

【0172】

一部の実施形態では、該ペプチドが化学修飾されたものである。

【0173】

「化学修飾された」とは、アミノ酸が、天然のプロセスまたは当該技術分野でよく知られた化学的修飾手法のいずれかによって修飾されていることをいう。数多くの既知の修飾の中でも、典型的だが排他的でない例としては：アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰ－リボシル化、グリコシル化、グリコサミノグリカン化、ＧＰＩアンカー形成、脂質または脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｌｙａｔｉｏｎ）、ペグ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化、または任意の同様のプロセスが挙げられる（例えば配列番号：２、１７～１９参照）。

【0174】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドはＣ末端のアミド化を含むものであり得る。

【0175】

さらに、択一的または付加的に、該ペプチドを非タンパク質性の無毒性部分に、例えば限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレンコマレイン酸無水物）（ＳＭＡ）およびジビニルエーテルとマレイン酸無水物のコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）にコンジュゲートさせてもよい。

【0176】

また、本発明のペプチドに、所望の活性（例えば、ｐ５３変異型の再活性化）を示すペプチドホモログ（また、本明細書において機能的等価物とも称する）を使用してもよいことは認識され、ここで、ペプチドホモログの活性は、当該技術分野で知られた方法、例えば本明細書に記載の方法に従って調べる。かかるホモログは、配列番号：５３または５４または１（ただし、ＷＯ２０１５／０１９３１８に開示されたペプチド（例えば、配列番号：２８６～３２１ではないものとする）と、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のものであり得る。

【0177】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドは、配列番号：８、４１２～４６４に示すアミノ酸配列を含むもの、または該配列番号に示すものである。

【0178】

具体的な一実施形態によれば、該ペプチドは、配列番号：４２９、４４８、４４９、４４６および４６２配列の群から選択される。

【0179】

一部の特定の実施形態では、該ペプチドが、少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質のコンホメーションを野生型（ＷＴ）ｐ５３タンパク質のコンホメーションに変化させるものである。

【0180】

当該技術分野において、野生型ｐ５３タンパク質のみを特異的に認識する抗体が知られている。かかる抗体は、特定のｐ５３タンパク質が、野生型であれ変異型であれ、野生型の機能性ｐ５３タンパク質のコンホメーションを保持しているかどうかを調べるのに非常に有用である。したがって、一部の特定の実施形態では、該ペプチドが、少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質のコンホメーションを、変異型ｐ５３タンパク質が、ＷＴ ｐ５３タンパク質に対して排他的に指向されるモノクローナル抗体によって、またはＷＴ ｐ５３タンパク質のコンホメーションを保持しているｐ５３タンパク質に対するモノクローナル抗体によって認識されるように変化させるものである。一部の特定の実施形態では、該モノクローナル抗体がＡｂ１６２０である。

【0181】

ｐ５３はどちらの対立遺伝子からも発現されるため、細胞内ｐ５３の全体的な内容は、野生型（ｗｔ／ｗｔ）、ｗｔおよび変異型ｐ５３の混合（ｗｔ／ｍｕｔ）または変異型ｐ５３のみ（両方の対立遺伝子が変異している場合（ｍｕｔ／ｍｕｔ）、もしくは一方の対立遺伝子が欠失している場合（ｍｕｔ／－））のいずれかであり得ることは理解されよう。がんでは、この状況は多くの場合、ｗｔ／ｍｕｔ、ｍｕｔ／ｍｕｔまたはｍｕｔ／－である。ｐ５３は四量体として機能を果たすため、変異型ｐ５３タンパク質は、がんの細胞内に存在しているかもしれない野生型ｐ５３タンパク質の活性を消去し得る。したがって、本発明によって提供されるペプチドは、野生型ｐ５３タンパク質レベルの増大が豊かでないがんの処置に特に有用である。

【0182】

一部の特定の実施形態では、該ペプチドが、少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質の活性をＷＴ ｐ５３タンパク質の少なくとも１つの活性に復元させるものである。

【0183】

本明細書で用いる場合、用語「低下する」とは、特定の表現型が、同じアッセイ条件下で対照（例えば、対照ビヒクルで処置した、または全く処置していない同じ細胞／動物の系）と比べて少なくとも約１０％，２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％ ７５％、８０％、９５％またはさらには１００％、統計学的に有意に減少することをいう。

【0184】

本明細書で用いる場合、用語「高まる／増大する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」または「改善する」とは、特定の表現型が、同じアッセイ条件下で対照（例えば、対照ビヒクルで処置した、または全く処置していない同じ細胞／動物の系）と比べて少なくとも約１０％，２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９５％またはさらには１００％、統計学的に有意に高まる／増大することをいう。

【0185】

用語「変異型ｐ５３タンパク質発現細胞」は、本明細書で用いる場合、少なくとも一方の対立遺伝子から変異型ｐ５３タンパク質を発現する細胞をいう。一部の特定の実施形態では、用語「変異型ｐ５３タンパク質発現細胞」は「がん細胞」と互換的である。

【0186】

用語「アポトーシス促進遺伝子」は、直接（例えば、特定のカスパーゼ）または間接的（例えば、シグナル伝達カスケードの一部として）のいずれかでアポトーシスに関与している遺伝子または多数の遺伝子をいう。

【0187】

一部の特定の実施形態では、該活性が、変異型ｐ５３タンパク質発現細胞のバイアビリティを低下させることである。一部の特定の実施形態では、該活性が、変異型ｐ５３タンパク質発現細胞のアポトーシスを促進させることである。一部の特定の実施形態では、該活性が、前記変異型ｐ５３タンパク質発現細胞のアポトーシス促進遺伝子を活性化させることである。一部の特定の実施形態では、アポトーシス促進遺伝子が、ＣＤ９５、Ｂａｘ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、Ｂｉｄ、５３ＡＩＰ１およびＰＥＲＰからなる群より選択される。各可能性は本発明の個々の実施形態を表す。

【0188】

一部の特定の実施形態では、該活性が、変異型ｐ５３タンパク質発現細胞内のｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合エレメントに対する結合である。一部の特定の実施形態では、該コンセンサスＤＮＡ結合エレメントが、配列番号：５５および５６に示すヌクレオチド配列を含むもの、または該ヌクレオチド配列からなるものである。

【0189】

本発明の任意のペプチドによって誘導される細胞の変化をモニタリングする方法は当該技術分野で知られており、例えば、ＭＴＴ試験、これは、生細胞が、黄色の塩ＭＴＴ（３－（４、５－ジメチルチアゾリル－２）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を青紫の不溶性ホルマザン沈殿物に還元する選択能に基づいたものである；ＢｒＤｕアッセイ［Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ＢｒｄＵ比色分析キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ］；ＴＵＮＥＬアッセイ［Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ］；アネキシンＶアッセイ［ＡｐｏＡｌｅｒｔ（登録商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）］；老化関連－β－ガラクトシダーゼアッセイ（Ｄｉｍｒｉ ＧＰ，Ｌｅｅ Ｘ，ｅｔ ａｌ．１９９５．Ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｔｈａｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ａｇｉｎｇ ｓｋｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２：９３６３－９３６７）；ならびに本明細書において以下にさらに記載する種々のＲＮＡおよびタンパク質の検出方法（発現レベルおよび／または活性レベルを検出するもの）が挙げられる。

【0190】

一部の特定の実施形態では、該結合が、内在性ｐ５３標的遺伝子の少なくとも一部活性化をもたらすものである。一部の特定の実施形態では、該内在性標的遺伝子が、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＰＵＭＡからなる群より選択される。各可能性は本発明の個々の実施形態を表す。

【0191】

一部の特定の実施形態では、変異型ｐ５３タンパク質が、ＷＴ ｐ５３タンパク質と異なるコンホメーションのものである。一部の特定の実施形態では、変異型ｐ５３タンパク質が、ＷＴ ｐ５３タンパク質と比べて少なくとも部分的に不活性化する。

【0192】

一部の特定の実施形態では、変異型ｐ５３タンパク質が、ＷＴ ｐ５３タンパク質に対して指向されるモノクローナル抗体によって認識されないものである。一部の特定の実施形態では、変異型ｐ５３タンパク質、該ペプチドに結合すると、ＷＴ ｐ５３タンパク質に対して指向されるモノクローナル抗体によって認識されるものである。一部の特定の実施形態では、該モノクローナル抗体がＡｂ１６２０である。

【0193】

一部の実施形態では、該再活性化性ペプチドはＭｕｔ－ｐ５３を、ＷＴ ｐ５３タンパク質と同様または同一の構造特性、生化学的特性、生理学的特性および／または機能特性を有するように再活性化させ得るものである。

【0194】

一部の実施形態により、約３～２５個のアミノ酸の長さであるＭｕｔ－ｐ５３再活性化ペプチドを提供する。一部の実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３再活性化ペプチドが約４～１５個のアミノ酸の長さである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３再活性化ペプチドが約７～１２個のアミノ酸の長さである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３再活性化ペプチドが７個のアミノ酸の長さである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ－ｐ５３再活性化ペプチドが１２個のアミノ酸の長さである。各可能性は本発明の個々の実施形態を表す。

【0195】

本出願書類の至る箇所に他のペプチド長を記載している。各可能性は本発明の個々の実施形態を表す。

【0196】

一部の実施形態によれば、Ｍｕｔ－ｐ５３再活性化ペプチドはＭｕｔ－ｐ５３に、これが、ＷＴ ｐ５３結合エレメントをそのプロモーター内に有するレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）をトランス活性化し得るように影響を及ぼし得るものである。一部の実施形態では、レポーター遺伝子のトランス活性化がインビトロ（例えば、試験管もしくはウェル内）で、またはインビボで、該レポーター遺伝子構築物を有する細胞内で行なわれ得る。

【0197】

一部の実施形態によれば、Ｍｕｔ－ｐ５３再活性化ペプチドは、変異したｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に結合し得るものである。一部の実施形態では、変異したｐ５３は変異をそのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）内に有するものである。

【0198】

用語「医薬組成物」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１種類の医薬活性成分を含む任意の組成物をいう。

【0199】

用語「変異型ｐ５３タンパク質と関連している」とは、本明細書で用いる場合、任意の疾患、障害または病状が変異型ｐ５３タンパク質によって引き起こされるものであるか、あるいはその進行が、細胞または器官内における変異型ｐ５３タンパク質の存在と関連していることをいう。

【0200】

ｐ５３はどちらの対立遺伝子からも発現されるため、細胞内ｐ５３の全体的な内容は、野生型（ｗｔ／ｗｔ）、ｗｔおよび変異型ｐ５３の混合（ｗｔ／ｍｕｔ）または変異型ｐ５３のみ（両方の対立遺伝子が変異している場合（ｍｕｔ／ｍｕｔ）、もしくは一方の対立遺伝子が欠失している場合（ｍｕｔ／－））のいずれかであり得ることは理解されよう。がんでは、この状況は多くの場合、ｗｔ／ｍｕｔ、ｍｕｔ／ｍｕｔまたはｍｕｔ／－である。ｐ５３は四量体として機能を果たすため、変異型ｐ５３タンパク質は、がんの細胞内に存在する野生型ｐ５３タンパク質の活性を消去し得る。したがって、本発明によって提供されるペプチドは、がんの処置に特に有用である。特筆すべきことに、該細胞は、２つより多いｐ５３対立遺伝子を有し、そのうちの少なくとも１つが変異型ｐ５３であるものであってもよい。

【0201】

用語「治療有効量」は、本明細書で用いる場合、個体において疾患、障害または病状が低減、減少および／または抑止されるのに充分な本発明によるペプチド含有組成物の量をいう。

【0202】

本発明の一態様により、変異型ｐ５３タンパク質と関連している疾患、障害または病状の処置方法であって、処置を必要とする被験体に治療有効量の本明細書に記載の単離ペプチド（例えば、配列番号：８、４１２～４６４）を投与し、それにより前記疾患、障害または病状を処置することを含む方法を提供する。

【0203】

本発明の一態様により、変異型ｐ５３タンパク質と関連している疾患、障害または病状の処置方法であって、処置を必要とする被験体に治療有効量で、ある空間および立体構成を有するアミノ酸配列を含む単離ペプチドを投与することを含み、該空間および立体構成が、該ペプチドがｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、ｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）が前記ＤＢＤに結合するのと同じ様式で結合することを可能にするものであり、前記ペプチドは少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させるものであり、前記治療有効量が０．０１～０．３ｍｇ／ｋｇ／日または０．０１～０．２ｍｇ／ｋｇ／日（例えば、０．０１～０．３５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．３５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．１５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０９５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０９ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０８５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０８ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０７ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０６５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０６ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０５５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．４５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０４ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０３５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０３ｍｇ／ｋｇ／日）であり、それにより前記疾患、障害または病状を処置する方法を提供する。

【0204】

本明細書において言及する場合、用語「疾患を処置する」または「病状を処置する」とは、少なくとも１種類の薬剤を含む疾患と関連している症状を改善するのに有効な組成物を投与して、該疾患の重症度を低下させる、もしくは該疾患を治癒すること、または、被験体において該疾患が起こるのを妨げることを指す。投与には、任意の投与経路が包含され得る。一部の実施形態では、疾患が、細胞、組織、器官、身体などにおける変異したｐ５３の存在によって引き起こされる疾患または該存在と関連している疾患である。一部の実施形態では、疾患ががんである。一部の実施形態では、がんが、乳がん、結腸がん、卵巣がんおよび肺がんからなる群より選択される。

【0205】

一部の実施形態では、がんが転移性がんである。

【0206】

一部の実施形態では、がんが転移性乳がん、転移性結腸がん、転移性卵巣がんまたは転移性肺がんである。

【0207】

各可能性は本発明の個々の実施形態を表す。一部の実施形態では、被験体がが哺乳類、例えばヒトである。一部の実施形態では、被験体が哺乳類の動物である。一部の実施形態では、被験体が哺乳類でない動物である。一部の実施形態では、被験体が、該疾患、病状または障害と診断された被験体である。

【0208】

一部の実施形態では、がんが副腎皮質癌、肛門がん、膀胱がん、脳腫瘍、脳幹膠腫、脳腫瘍、小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫（ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）、松果体部腫瘍、視床下部神経膠腫、乳がん、カルチノイド腫瘍、癌、子宮頚がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、肝臓外胆管がん、ユーイングファミリー腫瘍（ｐｎｅｔ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、目のがん、眼内黒色腫、胆嚢がん、胃がん、胚細胞腫瘍、性腺外、妊娠性絨毛腫瘍、頭頸部がん、下咽頭がん、島細胞癌、喉頭がん、白血病、急性リンパ芽球性、白血病、口腔がん、肝臓がん、肺がん、小細胞、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連、リンパ腫、中枢神経系（原発性）、リンパ腫、皮膚Ｔ細胞性、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、転移性扁平上皮癌、多発性骨髄腫、形質細胞性新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、鼻咽腔がん、神経芽細胞腫、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、外分泌、膵がん、島細胞癌、副鼻腔および鼻腔のがん、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫がん、下垂体がん、形質細胞新生物、前立腺がん、横紋筋肉腫、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚がん、カポジ肉腫、皮膚がん、黒色腫、小腸のがん、軟部組織肉腫、軟部組織肉腫、精巣がん、胸腺腫、悪性、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、肉腫、珍しい小児がん、膣がん、外陰がんまたはウィルムス腫瘍である。

【0209】

一部の実施形態では、がんが肺がんである。

【0210】

一部の実施形態では、がんが卵巣がんである。

【0211】

一部の実施形態では、がんがトリプルネガティブ乳がんである。

【0212】

一部の実施形態では、がんが転移性肺がんである。

【0213】

一部の実施形態では、がんが転移性卵巣がんである。

【0214】

一部の実施形態では、がんが転移性トリプルネガティブ乳がんである。

【0215】

一部の実施形態では、がんが非充実性腫瘍、例えば血液のがんである。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんが白血病またはリンパ腫であるである。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんが急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんが急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＡＭＬ）である。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんが慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんが小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんが慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんが急性単球性白血病（ＡＭＯＬ）である。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんがホジキンリンパ腫（４つの亜型のいずれか）である。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんが非ホジキンリンパ腫（いずれかの亜型）である。別の実施形態では、非充実性腫瘍または血液のがんが骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病である。

【0216】

本発明の方法における使用のため、該再活性化性ペプチドは慣用的な様式で、医薬組成物を形成するための当該技術分野で知られた、特にタンパク質である活性薬剤に関する１種類以上の薬学的に許容され得る担体、安定剤または賦形剤（ビヒクル）を用いて製剤化され得る。担体（１種類または複数種）は、組成物のその他の成分と適合性であり、そのレシピエントに対して有害でないという意味において「許容され得る」ものである。好適な担体としては典型的には、生理食塩水またはエタノール ポリオール、例えばグリセロールもしくはプロピレングリコールが挙げられる。

【0217】

該再活性化性ペプチドを中性形態または塩形態として製剤化してもよい。薬学的に許容され得る塩としては、酸付加塩（遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、これは、無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマレイン酸などの有機酸を用いて形成される。また、遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノ エタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどの有機塩基から誘導され得る。

【0218】

組成物は、静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内投与のために好適に製剤化され得、好都合には、該再活性化性ペプチドの滅菌された水性液剤（これは好ましくはレシピエントの血液と等張性である）を含むものであり得る。かかる製剤は典型的には、固形の活性成分を、生理学的に適合性の物質、例えば塩化ナトリウム、グリシンなどを含有しており、生理学的条件と適合性の緩衝ｐＨを有する水に溶解させて水性液剤を作製し、前記液剤を滅菌状態にすることにより調製される。該製剤は、単位用量容器に調製してもよく、反復用量容器、例えば、密封されたアンプルまたはバイアルに調製してもよい。

【0219】

組成物には安定剤、例えばポリエチレングリコール、タンパク質、糖類（例えば、トレハロース）、アミノ酸、無機酸など、およびその混合物が組み込まれ得る。安定剤は、水性液剤において適切な濃度およびｐＨで使用される。水性液剤のｐＨは、５．０～９．０の範囲内、好ましくは６～８の範囲内となるように調整される。該再活性化性ペプチドの製剤化において、吸着防止剤を使用してもよい。他の好適な賦形剤としては、典型的には酸化防止剤、例えばアスコルビン酸が挙げられ得る。

【0220】

組成物を制御放出調製物として製剤化してもよく、これは、該タンパク質を複合体化または吸収するポリマーの使用によって得られ得る。制御放出製剤のための適切なポリマーとしては、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン酢酸ビニルおよびメチルセルロースが挙げられる。考えられ得る別の制御放出方法は、該再活性化性ペプチドを、高分子物質、例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン酢酸ビニルコポリマーの粒子内に組み込むことである。あるいはまた、このような薬剤をポリマー粒子内に組み込む代わりに、この物質を、例えばコアセルベーション手法または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、あるいは、コロイド状薬物送達系内、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル内またはマクロエマルジョン中に閉じ込めることも可能である。

【0221】

一部の実施形態では、本発明の再活性化性ペプチドは、経口（“ｐｅｒｏｒａｌ”または“ｏｒａｌ”）用組成物に製剤化され得、一部の実施形態では、液状の液剤、乳剤、懸濁剤などを構成し得る。一部の実施形態では、かかる組成物の調製に適した薬学的に許容され得る担体は当該技術分野でよく知られている。一部の実施形態では、液状の経口用組成物は約０．００１％～約０．９％または別の実施形態では約０．０１％～約１０％の該再活性化性ペプチドを含むものである。

【0222】

一部の実施形態では、本発明の方法における使用のための組成物は液剤または乳剤を構成し、これは、一部の実施形態では、安全で有効な量の該再活性化性ペプチドおよび任意選択で他の化合物を含む、経表面鼻腔内投与が意図された水性の液剤または乳剤である。

【0223】

一部の実施形態では、本発明の注射用液剤が水性液剤に製剤化される。一実施形態では、本発明の注射用液剤が、生理学的に適合性のバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液または生理学的塩バッファーで製剤化される。一部の実施形態では、経粘膜投与のため、バリアを透過するのに適切な透過剤が製剤に使用される。かかる透過剤は当該技術分野で一般的に知られている。

【0224】

一実施形態では、本明細書に記載の調製物は、例えばボーラス注射または連続輸注による非経口投与のために製剤化される。一部の実施形態では、注射用製剤は、任意選択で保存料を添加した単位投薬形態に、例えば、アンプルまたは反復用量容器内に提示される。一部の実施形態では、組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤であり、例えば懸濁化剤、可溶化剤および／または分散化剤などの製剤化剤が含有されている。

【0225】

本発明の再活性化性ペプチドは、経口、経表面、経皮または非経口投与から選択される任意の適当な投与経路によって投与され得る。一部の実施形態によれば、投与経路は、皮膚経由、経膣、経直腸、吸入、鼻腔内、接眼、経耳および口腔内から選択される経表面適用によるものである。一部の実施形態によれば、投与経路は、非経口注射によるものである。種々の実施形態において、投与工程は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、動脈内、脳内、脳室内、骨内および髄腔内からなる群より選択される非経口経路によって行なわれる。例えば、該再活性化性ペプチドは、例えば非経口経路、例えば腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下または筋肉内経路によって全身投与され得る。本発明の再活性化性ペプチドおよび／または任意選択の任意のさらなる薬剤を、例えば、鼻腔内投与によって全身投与してもよい。本発明の再活性化性ペプチドおよび／または任意選択の任意のさらなる薬剤を、例えば経口投与により、タンパク質に対する経口バイオアベイラビリティをもたらし得る特定の組成物または製剤を使用することによって全身投与してもよい。本発明の再活性化性ペプチドおよび／または任意選択の任意のさらなる薬剤を局所投与してもよい。

【0226】

具体的な一実施形態によれば、該投与は皮下投与を含む。

【0227】

択一的または付加的に、具体的な一実施形態によれば、該投与は連続輸注を含む。

【0228】

したがって、該再活性化性ペプチド（例えば、配列番号：１、８、または４１２～４６４もしくは４２９、４４８、４４９、４４６、４６２）はまた、低速放出送達系、ポンプ、および連続輸注のための他の既知の送達系によって、例えば、以下の用量、例えば０．０１～０．３ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．１５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０９５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０９ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０８５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０８ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０７ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０６５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０６ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０５５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．４５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０４ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０３５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～０．０３ｍｇ／ｋｇ／日）で送達され得る。投薬レジメンは、具体的な再活性化性ペプチドの所望の循環レベルがもたらされるように、その薬物動態に基づいて変更してもよい。したがって、用量は、治療用薬剤の所望の循環レベルが維持されるように計算される。

【0229】

典型的には、有効用量は、該再活性化性ペプチドの活性および被験体の病状、ならびに処置対象の被験体の体重または体表面積によって決定される。また、用量サイズおよび投与レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）は、具体的な被験体における該再活性化性ペプチドの投与に付随する有害な副作用（あれば）の存在、性質および程度によっても決定される。

【0230】

一部の実施形態において、ｐ５３関連の病状を処置または予防するためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、Ｍｕｔ－ｐ５３再活性化ペプチドを適当なバッファー中に含めた容器（例えば、バイアル）と、該再活性化性ペプチドの投与のための使用のための使用説明書とを備えている。

【0231】

本発明のペプチドでの処置の有効性は、ゴールドスタンダード処置（例えば、抗がん治療）と併用すると増大する場合があり得ることが提案される。したがって、該ペプチドは、ｐ５３と関連している疾患または病状（本明細書に上記のもの）を処置するために単独で使用してもよく、かかる障害のための他の確立された治療レジメンまたは実験的治療レジメンと組み合わせて使用してもよい。さらなる治療方法または治療用組成物を用いた処置は、かかる処置薬の有効臨床用量が有意に低減され、それにより、該処置の多くの場合、計り知れないマイナスの副作用および高額のコストが低下するという可能性を有することは認識されよう。

【0232】

本発明の一部の実施形態のペプチドまたは該ペプチドをコードしているポリヌクレオチドとの組合せに適したがんの処置のための治療レジメンとしては、限定されないが、化学療法、放射線療法、光線療法および光線力学療法、手術、栄養療法、アブレーション治療、放射線療法と化学療法の併用、小線源療法（ｂｒａｃｈｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、陽子線治療、免疫療法、細胞療法および光子線放射線治療（ｐｈｏｔｏｎ ｂｅａｍ ｒａｄｉｏｓｕｒｇｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）が挙げられる。具体的な一実施形態によれば、化学療法薬は白金ベースである。

【0233】

抗がん薬
本発明の化合物とともに共投与され得る抗がん薬としては、限定されないが、アシビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アクラルビシン；アドリアマイシン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン（Ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ）；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ（Ａｚｅｔｅｐａ）；アゾトマイシン（Ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビセレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナール（Ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）ナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン（Ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デクスオルマプラチン（Ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；デザグアニン（Ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン（Ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミツルシン（Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン（Ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）；塩酸エピルビシン；エルブロゾール（Ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸エステルナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターフェロンα－２ａ；インターフェロンα－２ｂ；インターフェロンα－ｎ１；インターフェロンα－ｎ３；インターフェロンβ－Ｉａ；インターフェロンγ－Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸リュープロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール（Ｍｅｌｅｎｇｅｓｔｒｏｌ）；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド（Ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）；ミトカルシン（Ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）；ミトクロミン（Ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）；ミトギリン（Ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）；ミトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；マイトマイシン；ミトスペル（Ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパラガーゼ；ペリオマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン（Ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ペプロマイシン；パーホスファミド（Ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド（Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルホセート（Ｓｐａｒｆｏｓａｔｅ）ナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン（Ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル（Ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）；タリソマイシン；タキソール；テコガラン（Ｔｅｃｏｇａｌａｎ）ナトリウム；テガフール；塩酸テロキサトロン（Ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン（Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキセート；グルクロン酸トリメトレキセート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン（Ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ）；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビノロシジン（Ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ）；硫酸ビンゾリジン（Ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。さらなる抗新生物剤としては、Ｃｈａｐｔｅｒ ５２，Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）およびその序論、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の１２０２～１２６３に開示されているものが挙げられる。

【0234】

本発明の別の態様により、変異型ｐ５３タンパク質と関連している疾患、障害または病状の処置方法であって、処置を必要とする被験体に治療有効量で、白金系化学療法薬と、ある空間および立体構成を有するアミノ酸配列を含む単離ペプチド（例えば、配列番号：１、８、４１２～４６４、４２９、４４８、４４９、４４６、４６２）とを投与することを含み、該空間および立体構成が、該ペプチドがｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、ｐＣＡＰ ２５０（配列番号：１）が前記ＤＢＤに結合するのと同じ様式で結合することを可能にするものであり、前記ペプチドは少なくとも部分的に変異型ｐ５３タンパク質を再活性化させるものであり、それにより前記疾患、障害または病状を処置する方法を提供する。

【0235】

白金ベースの化学療法薬の具体例としては、限定されないが、シスプラチン（最初に開発された）、カルボプラチン（第２世代の白金ベースの抗新生物剤）、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、リポプラチン（リポソーム型のシスプラチン）が挙げられる。

【0236】

本明細書に記載の併用処置（例えば、該ペプチドと一緒に白金ベースの化学療法薬）を行なうためのキットおよび製造物品もまた本明細書において想定される。

【0237】

また、５９～３８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドで上記の方法において実施することも可能であることは認識されよう。

【0238】

本明細書で用いる場合、用語「約」は±１０％をいう。

【0239】

用語“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（～を含む）”、“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（～を含む）”、“ｉｎｃｌｕｄｅｓ（～を含む）”、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（～を含む）”、“ｈａｖｉｎｇ（～を有する）”およびこれらの活用形は“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（限定されないが、～を含む）”を意味する。

【0240】

用語“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（～からなる）”は“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（～を含み、それに限定される）”を意味する。

【0241】

用語“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的に～からなる）”は、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含んでいてもよいが、該さらなる成分、工程および／または部分が請求項に記載の組成物、方法または構造の基本的および新規な特徴を実質的に改変しない場合に限ることを意味する。

【0242】

本明細書で用いる場合、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、本文中にそうでないことを明白に記載していない限り、複数の言及を包含している。例えば、用語“ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（化合物）”または“ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（少なくとも１つの化合物）”には、複数の該化合物（その混合物を含む）が包含され得る。

【0243】

この出願書類全体を通して、本発明の種々の実施形態を範囲形式で示している場合があり得る。範囲形式での記載は、便宜上、略しているにすぎず、本発明の範囲に対する融通の利かない限定であると解釈すべきでないことは理解されよう。したがって、範囲の記載は、該範囲内の考えられ得るすべての部分範囲ならびに個々の数値が具体的に開示されていると解釈されたい。例えば、範囲の記載、例えば１～６は、部分範囲、例えば１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、ならびに該範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５および６が具体的に開示されていると解釈されたい。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0244】

本明細書において数値範囲を示している場合はいつでも、表示した範囲内の挙げられる任意の数（分数または整数）を包含していることを意図する。“ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ”表示された第１の数字と（ａｎｄ）表示された第２の数字（の範囲である／の範囲）、および“ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ ｆｒｏｍ”表示された第１の数字“ｔｏ（から）”表示された第２の数字（の範囲である／の範囲）というフレーズは本明細書において互換的に用いており、表示した第１および第２の数字ならびに両者間のすべての分数および整数を包含していることを意図する。

【0245】

本明細書で用いる場合、用語「方法」は、所与の仕事を行なうための様式、手段、手法および手順、例えば限定されないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実務者に知られているか、または該実務者により既知の様式、手段、手法および手順から容易に開発されるかのいずれかである様式、手段、手法および手順をいう。

【0246】

本明細書で用いる場合、用語「処置する」には、病状を消去すること、病状を実質的に抑止すること、その進行を低速化もしくは逆転させること、病状の臨床症状もしくは美容的症状を実質的に改善すること、または病状の臨床症状もしくは美容的症状の出現を実質的に抑制することが包含される。

【0247】

具体的な配列表に言及している場合、かかる言及は、例えば、シークエンシングエラー、クローニングエラーまたは塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の改変に起因する軽微な配列の差異を含むためその相補配列に実質的に対応する配列もまた包含していると理解されたい。ただし、かかる差異の頻度は５０個のヌクレオチド中１個未満、あるいはまた１００個のヌクレオチド中１個未満、あるいはまた２００個のヌクレオチド中１個未満、あるいはまた５００個のヌクレオチド中１個未満、あるいはまた１０００個のヌクレオチド中１個未満、あるいはまた５，０００個のヌクレオチド中１個未満、あるいはまた１０，０００個のヌクレオチド中１個未満であるものとする。

【0248】

明瞭性重視のため、別々の実施形態の状況において記載している本発明の特定の特色はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供してもよいことは認識されよう。逆に、簡潔性重視のため、単一の実施形態の状況において記載している本発明の種々の特色はまた、別々に、または任意の適当な下位の組合せで、もしくは本発明の記載の任意の他の実施形態において適するものとして提供してもよい。種々の実施形態の状況において記載した特定の特徴は、このような要素なしでは該実施形態が実施不可である場合を除き、該実施形態の必須の特徴であるとみなされるべきでない。

【0249】

本明細書において上記に記載し、以下の特許請求の範囲のセクションの請求項に記載する本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例において、実験による裏付けが見出されよう。

【0250】

実施例
次に、以下の実施例について言及するが、この実施例は上記の説明とともに、非限定的な様式で本発明の実例を示すものである。

【0251】

一般的に、本明細書で用いる専門用語および本発明で使用する実験手順は分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡの手法を含むものである。かかる手法は文献において充分に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に示された方法論；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照のこと；利用可能なイムノアッセイは特許および化学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１－３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと；これらはすべて、引用により、あたかも本明細書にすべてが示されているかのごとく組み込まれる。他の一般的な参考文献は本文書の至る箇所に示している。それに示された手順は当該技術分野でよく知られていると考えられているものであり、読み手の便宜のために示している。該参考文献に含まれている情報はすべて引用により本明細書に組み込まれる。

【0252】

実験手順
クリスタルバイオレット バイアビリティアッセイ
細胞を９６ウェルプレート内で、２５００～４０００個の細胞／ウェルで培養した。いろいろなペプチドの段階希釈列を添加し、プレートをさらに４８時間、３７℃でインキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞のバイアビリティを、細胞をクリスタルバイオレット（０．０５％）（メタノール／ＰＢＳ（１：５，ｖ／ｖ）中）で１０分間、染色した後、ＰＢＳで３回洗浄することによって測定した。１０％酢酸を各ウェルに１０分間、添加した。ＯＤを５９５ｎｍにおいて測定した。

【0253】

ＣｈＩＰ解析
細胞を、ホルムアルデヒド（１％終濃度）を用いて室温で１０分間架橋した。ホルムアルデヒドをグリシン０．２５Ｍで５分間中和した。細胞を１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、掻き取ることによって収集した。最後に、細胞を０．３ｍｌの溶解バッファー（１％ＳＤＳ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１，プロテアーゼ阻害薬カクテル）中に再懸濁させ、超音波浴中で６分間、超音波処理した後、１０分間、氷上で遠心分離し、２００～５００ｂｐの断片を得た。上清みを回収し、ＣｈＩＰ希釈バッファー（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１）中で１０倍希釈した後、４０μｌの予備ブロックプロテインＡ－セファロースを２μｇの断片化処理したサケ精子ＤＮＡおよび１０μｇのＢＳＡとともに用いて４℃で２時間、免疫洗浄（ｉｍｍｕｎｏ－ｃｌｅａｒｉｎｇ）した。免疫沈降は、特異的αｐ５３またはαＲＮＡｐｏｌＩＩポリクローナル抗体を用いて４℃で一晩行なった。免疫沈降後、４０μｌのプロテインＡ－セファロースを添加し、さらに１時間、さらにインキュベートした。続いて、沈殿物をＴＳＥ Ｉ（０．１％ＳＤＳ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、ＴＳＥ ＩＩ（５００ｍＭ ＮａＣｌ）、およびバッファーＩＩＩ（０．２５Ｍ ＬｉＣｌ，１％ ＮＰ－４０，１％デオキシコレート，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．１）中で洗浄した。沈殿物をＴＥバッファーで３回洗浄し、１％ＳＤＳ，０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で２回抽出した。溶出液をプールし、６５℃で一晩加熱し、ホルムアルデヒド架橋を戻した。ＤＮＡ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を用いて精製した。免疫沈降反応は三連で実施した。ビーズのみを非特異的対照として使用した。クローンのＣｈＩＰ産物における活性な、および抑制性のヒストンマークの定量解析を定量ＲＴ－ＰＣＲによって評価した。免疫沈降（ＩＰ）の効率を標準化するため、クロマチンＩＰの標準化を、ｎｅｃｄｉｎプロモーター領域および５’領域に特異的なプライマーを用いて行なった。

【0254】

ＣＲＩＳＰＲ ｐ５３ノックアウト
ＴＰ５３エキソン３短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むプラスミド＃４２２３０はＡｄｄｇｅｎｅ製であった。ＥＳ２細胞を、ｊｅｔＰＥＩ試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を製造業者のプロトコルに従って用いてトランスフェクトした。４８時間後、細胞を９６ウェルプレート内に単一細胞クローンとして播種した。単一細胞クローンを拡大培養し、そのｐ５３の状態を、ＤＯ－１抗ｐ５３抗体を用いたウェスタンブロット解析によって調べた。
ｓｇＲＮＡ配列：
Ｆ：５’－ＣＡＣＣＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧＴＣＣＧ－３’（配列番号：４７）
Ｒ：５’－ＡＡＣＣＧＧＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧ－３’（配列番号：４８）

【0255】

ペプチドの前臨床試験
マウス（６週齢，胸腺欠損，ヌード）の各大腿部に２×１０^５～１０^６個の細胞を皮下注射した。この実験で使用した細胞株はすべて、ライブイメージングによる腫瘍の増殖のモニタリングを可能にするためのルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現するものである。４～１８日後、腫瘍が視認可能なサイズに達したら、マウスを無作為に、いくつかの群：いずれかの１種類の対照ペプチドで処置する対照群、およびいずれかの１種類のペプチドの有効なペプチドで処置する群に分けた。ペプチドは、１０μｇのペプチド（４０μｌのＰＢＳ中）／腫瘍を週に３回の腫瘍内注射または０．８ｍｇをアルゼットミニポンプのいずれかによって２週間投与した。経時的な腫瘍の増殖をライブイメージングにより、ＩＶＩＳ２０００システムを用いて測定した。露光時間は２０秒間に較正した。各腫瘍に対して、８分間で１６個の画像を撮影し、ピーク発光値を得た。実験は、腫瘍が最大許容サイズ１ｃｍ^３に達するまで実施し、この時点でマウスを致死させ、腫瘍を取り出し、測定し、重量計測した。

【0256】

ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮＡを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ Ｋｉｔを細胞ペレットで製造業者のプロトコルに従って用いて取得した。０．４～１μｇアリコートを、Ｂｉｏ－ＲＴ ２０００（Ｂｉｏ－Ｌａｂ）およびランダムヘキサマープライマーを用いて逆転写した。ＱＲＴ－ＰＣＲは、ＡＢＩ ７３００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＦａｓｔＭｉｘ ＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａ）を用いて実施した。ＲＴ－ＰＣＲプライマー（プライマー配列はすべて、５’から３’に向かって示している）：

【0257】

ＮＭＲ
精製１５Ｎ標識ｐ５３コアドメイン（１ｍｌ ４０μＭ）（ａａ ９４～２９６）を１ＬのＮＭＲバッファー－（５２．５ｍＭのＮａＣｌと２．６２５ｍＭのＤＴＴを含有している１５７．５ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２）に対して４８時間透析し、バッファーを交換し、試料を１ＬのＮＭＲバッファーに対してさらに２４～４８時間（合計７２時間）透析した。０．５ｍｌの試料を高分解能ＮＭＲに供した。ＮＭＲ解析はワイツマン科学研究所で行なわれた。

【0258】

１５Ｎ－ｐ５３の単独および表示したペプチドと複合体形成時の二次元１Ｈ－１５Ｎ異種核一量子コヒーレンス（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）（ＨＳＱＣ）スペクトルを２９３Ｋにおいて記録した。スペクトルは、５ｍｍの逆配置検出用三重共鳴ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ（ＴＣＩ）を備えたＢｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩＩ－８００ ＮＭＲ分光器で取得した。溶媒消去はＷＡＴＥＲＧＡＴＥ配列を用いて行なった。

【実施例0259】

実施例１
ｐＣＡＰ－２５０はシスプラチンとともに、ＥＳ２卵巣がん細胞のバイアビリティの低下において相乗作用をもたらす
ＥＳ２細胞を９６ウェルプレート内で、３０００個の細胞／ウェルで培養した。ｐＣＡＰ－２５０の段階希釈列を単独または１μｇ／ｍｌのシスプラチンと一緒のいずれかで添加し、プレートをさらに４８時間、３７℃でインキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞のバイアビリティを、細胞をクリスタルバイオレット（０．０５％）（メタノール／ＰＢＳ（１：５，ｖ／ｖ）中）で１０分間、染色した後、ＰＢＳで３回洗浄することによって測定した。１０％酢酸を各ウェルに１０分間、添加した。ＯＤを５９５ｎｍにおいて測定した。１μｇ／ｍｌで処理したＥＳ２細胞のバイアビリティは３９％であった。ｐＣＡＰ－２５０のＩＣ５０は３．２μＭであると推定され、シスプラチンとの組合せでのｐＣＡＰ－２５０のＩＣ５０は１．９μＭであると推定され、この２つの化合物の相乗効果が示された。

【0260】

図１は、実験の結果を示す。明らかに、がん細胞のバイアビリティは、ｐＣＡＰ ２５０の存在下で有意に低下した。相乗効果は、ｐＣＡＰ ２５０と白金ベースの化学療法薬との併用処置によるものであると予想される。

【実施例0261】

実施例２
ｐＣＡＰ－２５０およびいろいろな誘導体の活性の特性評価
内在性ｍｐ５３Ｓ２４１Ｆを発現している細胞ＥＳ２ Ｃｏｎ、およびｍｕｔｐ５３に対する特異性の対照にするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてｐ５３を安定的にノックアウトしたＥＳ２ ＫＯ細胞（ＥＳ２ ｐ５３ＫＯ）を９６ウェルプレート内で、３０００個の細胞／ウェルで培養した。表示したペプチドを８μｇ／ｍｌの濃度で添加し、プレートをさらに４８時間、３７℃でインキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞のバイアビリティを、細胞をクリスタルバイオレット（０．０５％）（メタノール／ＰＢＳ（１：５，ｖ／ｖ）中）で１０分間、染色した後、ＰＢＳで３回洗浄することによって測定した。１０％酢酸を各ウェルに１０分間、添加した。ＯＤを５９５ｎｍにおいて測定した。

【0262】

図２は、ＥＳ ＫＯと比べたときのＥＳ２ Ｃｏｎに対する特定のペプチドの効果の差は、ｍｕｔｐ５３発現に対するペプチドの特異性を示す。アラニンに置換したアミノ酸（例えば、セリンおよびヒスチジン）のいくつかのペプチド誘導体はＥＳ２ Ｃｏｎ細胞に対する効果の低下を示し、ペプチドの有効性のためのこのようなアミノ酸の重要性を示す。

【0263】

この結果を、後述する親和性結合アッセイにおいてさらに拡張した。