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特開2022-112522標的遺伝子を編集する蛋白質を細胞特異的に制御する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022112522
(43)【公開日】2022-08-03
(54)【発明の名称】標的遺伝子を編集する蛋白質を細胞特異的に制御する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220727BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220727BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/113 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2019102749
(22)【出願日】2019-05-31
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【識別番号】100107319
【氏名又は名称】松島 鉄男
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100170379
【弁理士】
【氏名又は名称】徳本 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100096769
【弁理士】
【氏名又は名称】有原 幸一
(72)【発明者】
【氏名】齊藤 博英
(72)【発明者】
【氏名】弘澤 萌
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ｍｉＲＮＡの活性を指標として、細胞特異的にゲノムを編集することができる、より特異的かつ安全な方法の提供。
【解決手段】標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡとを、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列を含み、前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法。
【選択図】図１
【解決手段】標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡとを、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列を含み、前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法。
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法。
【請求項2】
前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項１に記載の方法。
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項１に記載の方法。
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）が、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターを使用することなく、合成ＲＮＡ分子の形態で細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの非翻訳領域に複数含まれる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記第２蛋白質が、Ｎ末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項7】
標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御するキットであって、
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を含み、当該ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、キット。
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を含み、当該ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、キット。
【請求項8】
前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項７に記載のキット。
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項７に記載のキット。
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、請求項７に記載のキット。
【請求項10】
前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、５’－ＵＴＲに複数含まれる、請求項７～９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項11】
前記第２蛋白質が、N末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、請求項８または９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標的遺伝子を編集する蛋白質を細胞特異的に制御する方法、並びに当該方法に用いることができるキットに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ゲノム編集において、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）Ｓｙｓｔｅｍが広く用いられている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍは、ヌクレアーゼであるＣａｓ９蛋白質（Ｃａｓ９）と標的配列に相補的な２０塩基を組み込んだシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）により、目的遺伝子を切断するものである。しかし、ゲノム編集において、意図しない配列を切断してしまうことや、標的でない細胞のゲノムを編集してしまうことは思わぬ結果をもたらす危険性がある。そのため、ゲノム編集を行うツールを制御することは重要である。
【0003】
細胞を識別するための指標となる対象として、マイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡと指称する）が、着目されている（例えば、特許文献１を参照）。このｍｉＲＮＡを利用して、細胞特異的にＣａｓ９などのヌクレアーゼを制御する方法が考案されてきた（例えば、非特許文献１、２、及び特許文献１を参照）。また、本発明者らにより、ＲＮＡ結合蛋白質を利用し、標的ｍｉＲＮＡの活性が高いときにゲノムを編集する試みもなされてきた（例えば、非特許文献２及び特許文献２を参照）。
【0004】
近年、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の活性を阻害するＡｃｒｌｌＡ４が発見された。このＡｃｒｌｌＡ４をｍｉＲＮＡで制御することで、標的ｍｉＲＮＡの活性が高いときにゲノムを編集することが試みられた（非特許文献３を参照）。この方法は、ＤＮＡデリバリーであり、導入遺伝子がゲノムに組み込まれる危険性がある。また、プラスミドＤＮＡを用いたレポーター（ルシフェラーゼ）により遺伝子活性化を評価している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開ＷＯ２０１５／１０５１７２
【特許文献2】国際公開ＷＯ２０１８／００３３３９
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ． ２０１４ Ｎｏｖ；９（１１）：１４０２－１４１２
【非特許文献2】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１７） ４５：ｅ１１８
【非特許文献3】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１９） １，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｚ２７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
非特許文献１、２、及び特許文献２に開示されたヌクレアーゼの制御方法は、標的となるｍｉＲＮＡの活性が高いときにゲノムが編集されなくなるシステムである。このようなシステムを、本明細書において、ＯＦＦシステムともいう。ＯＦＦシステムを用いて標的細胞特異的にゲノムを編集するためには、特定の標的細胞で特異的に活性の低いｍｉＲＮＡを探す必要があり、煩雑である。一方、非特許文献２及び特許文献２に開示されたＲＮＡ結合蛋白質を使用する方法では、Ｃａｓ９発現を抑えたい場合において、Ｃａｓ９発現のリークがみられた。より特異性を上げるためには、このリークを抑える必要性がある。
【0008】
また、非特許文献３に開示された方法では、内在性の遺伝子、すなわち標的細胞のゲノム上にある遺伝子を実際に活性化できるかは不明である。さらにこの方法はウイルスベクターの使用を必須とする方法であり、細胞の臨床使用における安全性が懸念される。
【0009】
ｍｉＲＮＡの活性を指標として、意図しない遺伝子や細胞に作用することなく、細胞特異的に、かつより精密に、標的遺伝子を編集することができる、安全な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは鋭意検討の結果、標的遺伝子を編集する蛋白質を不活性化する蛋白質の発現を、ｍｉＲＮＡの活性を指標として制御することにより、標的細胞特異的にゲノムを編集することができることを発見し、本発明を完成するに至った。
【0011】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］ 標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法。
［２］ 前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［１］に記載の方法。
［３］ 前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［１］に記載の方法。
［４］ 前記（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）が、ＤＮＡベクターまたはウイルスベ
クターを使用することなく、合成ＲＮＡ分子の形態で細胞に導入される、［１］に記載の方法。
［５］ 前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの非翻訳領域に複数含まれる、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］ 前記第２蛋白質が、Ｎ末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、［２］または［３］に記載の方法。
［７］ 標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御するキットであって、
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を含み、当該ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、キット。
［８］ 前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［７］に記載のキット。
［９］ 前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［７］に記載のキット。
［１０］ 前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、５’－ＵＴＲに複数含まれる、［７］～［９］のいずれか１項に記載のキット。
［１１］ 前記第２蛋白質が、N末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、［８］または［９］に記載のキット。
［１］ 標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法。
［２］ 前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［１］に記載の方法。
［３］ 前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［１］に記載の方法。
［４］ 前記（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）が、ＤＮＡベクターまたはウイルスベ
クターを使用することなく、合成ＲＮＡ分子の形態で細胞に導入される、［１］に記載の方法。
［５］ 前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの非翻訳領域に複数含まれる、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］ 前記第２蛋白質が、Ｎ末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、［２］または［３］に記載の方法。
［７］ 標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御するキットであって、
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を含み、当該ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、キット。
［８］ 前記第１蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［７］に記載のキット。
［９］ 前記第１蛋白質が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質またはその類似体であり、
前記第２蛋白質が、ＡｃｒｌｌＡ４またはその類似体である、［７］に記載のキット。
［１０］ 前記（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列が、５’－ＵＴＲに複数含まれる、［７］～［９］のいずれか１項に記載のキット。
［１１］ 前記第２蛋白質が、N末端側に核移行シグナルを融合したＡｃｒｌｌＡ４である、［８］または［９］に記載のキット。
【発明の効果】
【0012】
本発明に係る方法によれば、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４のようなｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチ、すなわち、ｍｉＲＮＡに応答して特定の蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子を用いることにより、特定の細胞種において発現される標的ｍｉＲＮＡを検出し、細胞特異的にゲノム編集を実現することができた。この方法をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムなどの遺伝子編集システムと組み合わせることにより、細胞工学や臨床治療を含む種々の研究分野への応用が可能となる。
【0013】
本発明は、標的となるｍｉＲＮＡの活性が高いときにゲノムが編集されるシステム、すなわち、ＯＮシステムを実現することができる。かかる方法では、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡにより、遺伝子を編集する蛋白質を不活性化する蛋白質の発現を制御することができ、以下の理由により、標的細胞のゲノムを設計するための有用なツールとなりうる。
［１］ ＯＦＦシステムと比較して、ＯＮシステムは容易にかつ選択的に標的細胞において遺伝子を編集する蛋白質（ヌクレアーゼなど）を活性化することができる。
［２］ モデル生命体における遺伝子機能を同定するために、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは細胞特異的なゲノム編集や、組織特異的なゲノム編集、すなわちゲノムノックアウトによる機能の喪失またはＣＲＩＳＰＲａによる機能の獲得を可能にする。
［３］ ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは、ＲＮＡ送達方法により実施することができる。これにより、ＤＮＡ送達方法において懸念されるゲノム組み込みやオフターゲット効果を避けることができる。
［４］ ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは、非標的細胞におけるゲノム編集を最低限にすることができる。これは、臨床応用において重要であり、例えば、がん治療において、正常細胞におけるゲノム編集を回避し、副作用を低減することができる。
［５］ ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは内在性ｍｉＲＮＡのみならず、合成オリゴヌクレオチド、例えばｍｉＲ－ｍｉｍｉｃにも応答するため、誘導可能なゲノム編集または一時的なゲノム編集にも用いることができる。
［１］ ＯＦＦシステムと比較して、ＯＮシステムは容易にかつ選択的に標的細胞において遺伝子を編集する蛋白質（ヌクレアーゼなど）を活性化することができる。
［２］ モデル生命体における遺伝子機能を同定するために、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは細胞特異的なゲノム編集や、組織特異的なゲノム編集、すなわちゲノムノックアウトによる機能の喪失またはＣＲＩＳＰＲａによる機能の獲得を可能にする。
［３］ ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは、ＲＮＡ送達方法により実施することができる。これにより、ＤＮＡ送達方法において懸念されるゲノム組み込みやオフターゲット効果を避けることができる。
［４］ ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは、非標的細胞におけるゲノム編集を最低限にすることができる。これは、臨床応用において重要であり、例えば、がん治療において、正常細胞におけるゲノム編集を回避し、副作用を低減することができる。
［５］ ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチなどのｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡスイッチは内在性ｍｉＲＮＡのみならず、合成オリゴヌクレオチド、例えばｍｉＲ－ｍｉｍｉｃにも応答するため、誘導可能なゲノム編集または一時的なゲノム編集にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１は、ｍｉＲＮＡ応答性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＯＮスイッチのスキームを表す概念図である。ＡｃｒｌｌＡ４は、Ｃａｓ９の活性を阻害するキープレイヤーであり、このＡｃｒｌｌＡ４の発現は、ｍｉＲＮＡの標的部位をＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲに挿入することで内在性のｍｉＲＮＡにより制御される。つまり、標的ｍｉＲＮＡの活性が高い時はＡｃｒｌｌＡ４の発現が抑制されるため、Ｃａｓ９により遺伝子の編集が、ｄＣａｓ９－ＶＰＲにより遺伝子の活性化が行われる。
【図3A】図３Ａは、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチによりｍｉＲＮＡをセンシングしゲノム編集を制御する、ｍｉＲＮＡ応答性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＯＮシステムの概念図である。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｓｗｉｔｃｈを細胞に導入する。標的ｍｉＲＮＡの活性が低い場合は、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現しＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体に結合し、Ｃａｓ９のＤＮＡ結合を阻害するためゲノムが編集されない（左）。標的ｍｉＲＮＡの活性が高い場合は、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現しない。そのため、Ｃａｓ９がＤＮＡに結合しゲノムが編集される（右）。
【図3D】図３Ｄは、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験を３回実施した結果の棒グラフを示す。結果は、ｍｅａｎ±ＳＤで表示し、＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を示す。
【図4A】図４Ａは、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチが内在性ｍｉＲＮＡを介しＣＲＩＳＰＲａを制御する、ｍｉＲＮＡ応答性ＣＲＩＳＰＲａ ＯＮシステムの概念図である。ｄＣａｓ９－ＶＰＲ ｐｌａｓｍｉｄ（ａ）、ｓｇＲＮＡ ｐｌａｓｍｉｄ（ｃ）、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４ ｐｌａｓｍｉｄ（ｂ）をＴＲＥ－ＰｍｉｎｉＣＭＶ－ｈｍＡＧ１がゲノムに組まれたＨｅＬａ細胞に導入する。ＡｃｒｌｌＡ４はｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ｓｇＲＮＡ複合体のＤＮＡ結合を阻害し、ｈｍＡＧ１発現を抑制する。標的ｍｉＲＮＡ活性が高い場合、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ｓｇＲＮＡ複合体が標的サイトに結合するので、ｈｍＡＧ１が発現する。下図の下線部は標的配列、四角で囲んだ配列はｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）を示す。
【図4D】図４Ｄは、ｄＣａｓ９－ＶＰＲの活性をｈｍＡＧ１発現により評価した実験を３回実施した結果の棒グラフを示す。結果は、ｍｅａｎ±ＳＤで表示し、＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を示す。
【図5A】図５は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び５ ｎｇ のｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを、ＥＧＦＰ遺伝子をゲノム上に組み込んであるｉＰＳ細胞であるｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞に導入し、ｍｉＲＮＡをセンシングしゲノム編集を制御し、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す。図５Ａは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いないコントロール実験（左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加せず、右パネルは標的遺伝子に認識されるｓｇＲＮＡＥＧＦＰを添加せず）の結果、得られた細胞の写真である。
【図5B】図５Ｂは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いないコントロール実験（左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加、中パネルは不活性化したＡｃｒｌｌＡ４変異体を添加、右パネルは未処理）の結果、得られた細胞の写真である。
【図5C】図５Ｃは、標的部位にｍｉＲ－３０２ａにより特異的に認識される配列を１つ用いた、ｍｉＲ－３０２ａ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いてｍｉＲＮＡをセンシングし、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す写真である。
【図5D】図５Ｄは、標的部位にｍｉＲ－３０２ａにより特異的に認識される配列を４つ用いた、４×ｍｉ－３０２ａ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いてｍｉＲＮＡをセンシングし、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す写真である
【図8A】図８Ａ～Ｄは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び１０ ｎｇのｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを、ＥＧＦＰ遺伝子をゲノム上に組み込んであるｉＰＳ細胞であるｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞に導入し、ｍｉＲＮＡをセンシングしゲノム編集を制御し、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す。図８Ａは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いないコントロール実験（左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加せず、右パネルは標的遺伝子に認識されるｓｇＲＮＡＥＧＦＰを添加せず）の結果、得られた細胞の写真である。
【図8B】図８Ｂは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いないコントロール実験（左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加、中パネルは不活性化したＡｃｒｌｌＡ４変異体を添加、右パネルは未処理）の結果、得られた細胞の写真である。
【図8C】図８Ｃは、標的部位にｍｉＲ－３０２ａにより特異的に認識される配列を１つ用いた、ｍｉＲ－３０２ａ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いてｍｉＲＮＡをセンシングし、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す写真である。
【図8D】図８Ｄは、標的部位にｍｉＲ－３０２ａにより特異的に認識される配列を４つ用いた、４×ｍｉＲ－３０２ａ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いてｍｉＲＮＡをセンシングし、Ｃａｓ９の活性をＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した実験の結果を示す写真である
【図11】図１１は、コンストラクトの概略図を示す。（Ａ）は５’－ＵＴＲにｍｉＲＮＡ標的部位を有し、本発明の第２蛋白質として機能するＡｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲをコードする、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの構造概念図を示す。（Ｂ）は、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ標的配列の一例を示す概念図であり、ｍｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅを１リピートまたは４リピート組み込むことができることを示す。（Ｃ）は、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの第２蛋白質の概念図を示しており、上図は野生型のＡｃｒｌｌＡ４蛋白質をコードする配列を、下図はＮ末端に核移行シグナルであるＭ９を融合させたＭ９＿ＡｃｒｌｌＡ４をコードする配列を概念的に示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施の形態によって限定されるものではない。
【0016】
本発明は、一実施形態によれば、標的遺伝子の編集を細胞特異的に制御する方法であって、
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法に関する。
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡと、
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡと
を、細胞に導入する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが下記：
（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および
（ｉｉ）前記第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、前記細胞において特異的に活性が高いｍｉＲＮＡである、方法に関する。
【0017】
本発明における、「細胞」とは、特に限定されるものではなく任意の細胞であってよい。例えば、多細胞生物種から採取した細胞であってもよく、単離された細胞を培養することによって得られる細胞であってもよい。当該細胞は、特には、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）採取した細胞、若しくは哺乳動物より単離された細胞又は哺乳動物細胞株を培養することによって得られる細胞である。体細胞としては、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における細胞として用いることができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【0018】
本発明における細胞は、前期体細胞を採取後に人為的な操作を加えた細胞であってよい。例えば、前記体細胞から調製した多能性幹細胞を含んでなる細胞群であり、あるいは多能性幹細胞を分化させた後に得られる細胞群であって、所望する細胞以外に分化された細胞を含み得る細胞群であってもよい。本発明で使用可能な多能性幹細胞とは、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞である。それらの多能性幹細胞の具体例は、以下のものに限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、およびｉＰＳ細胞である。より好ましい多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、特に好ましくはヒトＥＳ細胞、およびヒトｉＰＳ細胞である。さらに、本発明で使用可能な細胞は、多能性幹細胞だけでなく、多能性幹細胞を経ることなく直接所望の細胞に分化誘導させた、いわゆる「ダイレクトリプログラミング」により誘導された細胞群であってもよい。その他には、本発明における細胞は、がん細胞と正常細胞を含み得る細胞群など、遺伝子の編集が所望される細胞と、遺伝子の編集が所望されない細胞を含み得る細胞群であってもよい。
【0019】
本発明における細胞は、特には生存状態にあることが好ましい。本発明において、細胞が生存状態にあるとは、代謝能を維持した状態の細胞を意味する。本発明においては、細胞に、先の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のＲＮＡを導入した後にも、その生来の特性を失うことなく、生存状態のまま、特に分裂能を維持したまま、続く用途に用いることができる細胞であってよい。
【0020】
本発明における「標的遺伝子」とは、標的となる特定の細胞のゲノム上にある遺伝子である。遺伝子の種類は特には限定されず、後述するｓｇＲＮＡの設計により、任意の所望の遺伝子を標的遺伝子とすることができる。
【0021】
本発明において、標的遺伝子の「編集」とは、標的遺伝子に作用して、遺伝子の機能を変更することをいい、例えば遺伝子の機能を低下させ、損失させ、獲得し、または増強することが含まれる。さらに具体的には、「編集」とは、遺伝子を切断し、遺伝子の発現を活性化し、抑制化し、塩基編集し、ラベリング（ゲノム標識）し、ＤＮＡメチル化・脱メチル化やヒストンのアセチル化などのエピゲノム編集を行うことを含むものとする。
【0022】
また、本発明において、本発明において、「制御する」とは、第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの翻訳を抑制し、これにより、標的遺伝子の編集を行う第１蛋白質が機能しない状態（ＯＦＦ状態）から、機能することができる状態（ＯＮ状態）とすることをいう。
【0023】
また、「細胞特異的に制御する」とは、特定の細胞において、特異的に活性が高いｍｉＲＮＡを指標として、当該細胞において標的遺伝子の編集を制御することをいう。ｍｉＲＮＡを指標とした編集制御は、上記（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを用いて実施することができる。以下、各ＲＮＡの構造及び機能について説明する。
【0024】
（ａ）標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードするｍＲＮＡ
（ａ）のｍＲＮＡは、標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードし、細胞内で翻訳されて第１蛋白質を発現するｍＲＮＡである。標的遺伝子を編集する第１蛋白質とは、一般的には、標的遺伝子を編集することができる酵素活性を有する蛋白質である。第１蛋白質としては、標的遺伝子を切断することができるヌクレアーゼや、標的遺伝子を活性化することができる不活性化型ヌクレアーゼが含まれるが、これらには限定されない。
（ａ）のｍＲＮＡは、標的遺伝子を編集する第１蛋白質をコードし、細胞内で翻訳されて第１蛋白質を発現するｍＲＮＡである。標的遺伝子を編集する第１蛋白質とは、一般的には、標的遺伝子を編集することができる酵素活性を有する蛋白質である。第１蛋白質としては、標的遺伝子を切断することができるヌクレアーゼや、標的遺伝子を活性化することができる不活性化型ヌクレアーゼが含まれるが、これらには限定されない。
【0025】
ヌクレアーゼとしては、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ９（Ｃａｓ９）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。なお、いずれのヌクレアーゼについても、同様の機能、すなわち標的遺伝子の切断活性を備える類似体や、同等の活性を有するその誘導体を用いることもできる。例えば、Ｃａｓ９蛋白質の類似体には、Ｃａｓ９ファミリー蛋白質が含まれ、具体的なＣａｓ９ファミリー蛋白質としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９ （ＳａＣａｓ９）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９，もしくは ＮｍｅＣａｓ９）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１－Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）が挙げられるが、これらには限定されない。Ｃａｓ９蛋白質、類似体もしくは誘導体に他の蛋白質が融合した融合蛋白質もヌクレアーゼに含まれる。
【0026】
不活性化型ヌクレアーゼとしては、転写活性因子に融合した不活性化型ヌクレアーゼを挙げることができ、転写活性化因子ＶＰ６４に融合した不活性化型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ヌクレアーゼであるｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ、ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ、ｄＣａｓ９－ＶＰ１６、ｄＣａｓ９－ＶＰ１６０、ｄＣａｓ９－Ｐ３００を用いることができるが、これらには限定されない。なお、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４とともに、ＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１融合蛋白質と、ガイド鎖にＭＳ２結合配列を有する（ｃ）のｓｇＲＮＡとを用いたＳＡＭシステムや、ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇとともにＶＰＲを用いるＴｒｅｅシステムもまた、用いることができる。これらのシステムに用いるタンパク質は、第１蛋白質をコードするｍＲＮＡとは別のｍＲＮＡによりコードすることもでき、第１蛋白質をコードするｍＲＮＡ上にコードすることもできる。また、これらの不活性化型ヌクレアーゼと同様の機能を備える類似体や誘導体を用いることもできる。
【0027】
（ａ）のｍＲＮＡは、好ましくは、５’末端から、５’から３’の向きに、Ｃａｐ構造（７メチルグアノシン５’リン酸）またはＡｍｂｉｏｎ製のＡｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）などのＣａｐ類似体を含む５’－ＵＴＲ、開始コドン、第１蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム並びに、ポリＡテイルを含む３’－ＵＴＲを備えている。５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの設計は任意であってよい。（ａ）のｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、及び３’－ＵＴＲのいずれにも、ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含まない。これにより、（ａ）の第１蛋白質をコードするｍＲＮＡは、細胞内に導入されて、ｍｉＲＮＡ活性の影響を受けることなく翻訳され、第１蛋白質を発現することができる。
【0028】
（ｂ）前記第１蛋白質を不活性化する第２蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡ
（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、第２蛋白質をコードし、細胞内でｍｉＲＮＡによる翻訳制御下で第２蛋白質を発現することができるｍＲＮＡである。第２蛋白質は、第１蛋白質を不活性化することができる蛋白質である。第２蛋白質は、（ａ）のｍＲＮＡについて説明した第１蛋白質との関係で決定することができる。第２蛋白質は、第１蛋白質を不活性化する蛋白質の融合体であってもよい。
（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、第２蛋白質をコードし、細胞内でｍｉＲＮＡによる翻訳制御下で第２蛋白質を発現することができるｍＲＮＡである。第２蛋白質は、第１蛋白質を不活性化することができる蛋白質である。第２蛋白質は、（ａ）のｍＲＮＡについて説明した第１蛋白質との関係で決定することができる。第２蛋白質は、第１蛋白質を不活性化する蛋白質の融合体であってもよい。
【0029】
例えば、第１蛋白質が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼや、不活性化型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはこれらの類似体の場合には、第２蛋白質としては、これらのヌクレアーゼを不活性化することができるａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲを用いることができる。特には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）を不活性化することができるａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲは、ＡｃｒｌｌＡ２、ＡｃｒｌｌＡ４、ＡｃｒｌｌＡ５、ＡｃｒｌｌＡ７、ＡｃｒｌｌＡ８、ＡｃｒｌｌＡ９、ＡｃｒｌｌＡ１０が挙げられるが、これらには限定されない。第２蛋白質は、例示したａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲと同様の機能を有する、すなわちヌクレアーゼを不活性化することができるａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲの類似体であってもよい。なお、先に例示したＣａｓ９ファミリー蛋白質のＮｍＣａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしては、ＡｃｒｌｌＣ１、ＡｃｒｌｌＣ２、ＡｃｒｌｌＣ３、ＡｃｒｌｌＣ４、ＡｃｒｌｌＡ５が挙げられ、ＣｊＣａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしては、ＡｃｒｌｌＣ１が挙げられ、ＧｅｏＣａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしては、ＡｃｒｌｌＣ１が挙げられ、Ｓｔ１Ｃａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしてはＡｃｒｌｌＡ５、ＡｃｒｌｌＡ６が挙げられ、ＳａＣａｓ９を不活性化するａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲとしては、ＡｃｒｌｌＡ５が挙げられる。第２蛋白質は、ａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲまたはその類似体を含む蛋白質融合体であってもよく、例えば、ＡｃｒｌｌＡ４などのａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲの好ましくはＮ末端側に核移行シグナルＭ９を融合した融合蛋白質であってもよい。ＡｃｒｌｌＡ４に核移行シグナルＭ９を融合した融合蛋白質を用いると、第１蛋白質が編集する標的遺伝子における切断もしくは活性化を増強することができる。
【0030】
好ましい第１蛋白質と第２蛋白質の組み合わせとしては、例えば、ＡｓＣａｓ１２ａとＡｃｒＶＡ１、ＬｂＣａｓ１２ａとＡｃｒＶＡ４もしくはＡｃｒＶＡ５（ＡｃｒＶＡ１）、ＮｍｅＣａｓ９とＡｃｒｌｌＣ１もしくはＡｃｒｌｌＣ３等が挙げられるが、これらには限定されない。
【0031】
ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡとは、ｍｉＲＮＡの活性に応答してコードする蛋白質の翻訳が制御されるメッセンジャーＲＮＡであり、本明細書において、ｍｉＲＮＡスイッチとも指称する。ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの一般的な構造は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする特許文献１（ＷＯ２０１５／１０５１７２）に詳述されている。本発明に用いる（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列、および（ｉｉ）第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列を含み、（ｉ）ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列と（ｉｉ）第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列が機能的に連結されている。
【0032】
（ｉ）のｍｉＲＮＡは、ある特定の細胞において、第１蛋白質により特定の標的遺伝子を編集することを目的として、その細胞で特異的に活性が高いｍｉＲＮＡを適宜選択することができる。本明細書において、ｉ）のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの「標的配列」と指称する場合があり、このようなｍｉＲＮＡを、標的ｍｉＲＮＡと指称する場合がある。特定の細胞で特異的に活性が高いｍｉＲＮＡとは、当該細胞における発現が、他の細胞における発現よりも多いｍｉＲＮＡをいうものとする。ｍｉＲＮＡの「発現」とは、成熟ｍｉＲＮＡが、所定の複数の蛋白質と相互作用して、ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）を形成した状態にあるｍｉＲＮＡが存在していることをいうものとする。「成熟ｍｉＲＮＡ」は、一本鎖ＲＮＡ（２０～２５塩基）であり、核外でＤｉｃｅｒによる切断によってｐｒｅ－ｍｉＲＮＡから生じ、「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」は、Ｄｒｏｓｈａと呼ばれる核内酵素による部分切断によって、ＤＮＡから転写された一本鎖ＲＮＡであるｐｒｉ－ｍＲＮＡから生じる。本発明におけるｍｉＲＮＡとは、少なくとも１０，０００種類以上のｍｉＲＮＡから適宜選択される。詳細には、データベースの情報（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／）に登録されたｍｉＲＮＡ、及び／または当該データベースに記載されている文献情報に記載されたｍｉＲＮＡより適宜選択される。すなわち、本発明においては、（ｉ）のｍｉＲＮＡは特定の配列から構成されるｍｉＲＮＡに限定されるものではない。このような、（ｉ）のｍｉＲＮＡは、本出願時において特定されているｍｉＲＮＡには限定されず、今後、その存在及び機能が特定されるあらゆるｍｉＲＮＡを含むものとする。特定の細胞において発現が多いｍｉＲＮＡとは、他の細胞における発現と比較して、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上あるいはそれ以上の割合で高く発現しているｍｉＲＮＡが例示される。このような特定の細胞において発現が多いｍｉＲＮＡも、上記データベースの情報に基づき適宜選択することができる。
【0033】
本発明において、ｍｉＲＮＡの標的配列は、例えば、当該ｍｉＲＮＡに完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該ｍｉＲＮＡにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該ｍｉＲＮＡに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にｍｉＲＮＡが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、４０～５０％程度の不一致があっても良い。このような不一致は、特に限定されないが、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、若しくは１０塩基又は全認識配列の１％、５％、１０％、２０％、３０％、若しくは４０％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えているｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわち、ｍｉＲＮＡの３’側の１６塩基程度に対応する、標的配列内の５’側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、１塩基、２塩基、若しくは３塩基の不一致を含んでもよい。このような配列は、ＲＩＳＣが特異的に結合する塩基数を含む塩基長であればよく、長さは別段限定されないが、好ましくは、１８塩基以上、２４塩基未満の配列、より好ましくは、２０塩基以上、２２塩基未満の配列である。本発明において、ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列は、所望の細胞および他の細胞へ当該標的配列を有し、視認可能な蛍光蛋白質などのマーカー蛋白質をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを導入し、所望の細胞においてのみ対応するマーカー蛋白質の発現が抑制されることを確認することによって、適宜決定して用いることができる。
【0034】
本発明において、ｍｉＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列（ｉ）と第２蛋白質のコード領域に対応する核酸配列（ｉｉ）が機能的に連結されるとは、第２蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム（ただし、開始コドンを含む。）の５’－ＵＴＲ内、３’－ＵＴＲ内、及び／または当該オープンリーディングフレーム内に、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの標的配列を備えることを意味する。ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、好ましくは、５’末端から、５’から３’の向きに、Ｃａｐ構造（７メチルグアノシン５’リン酸）またはＡＲＣＡなどのＣａｐ類似体、第２蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム並びに、ポリＡテイルを備え、５’－ＵＴＲ内、３’－ＵＴＲ内、及び／またはオープンリーディングフレーム内に少なくとも１つのｍｉＲＮＡの標的配列を備える。以下、Ｃａｐ構造と指称する場合は、Ｃａｐアナログも含むものとする。ｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡの標的配列の位置は、非翻訳領域にあってよく、５’－ＵＴＲであっても、３’－ＵＴＲであってもよい。あるいはｍｉＲＮＡの標的配列の位置は、オープンリーディングフレーム内（開始コドンの３’側）であってもよい。非翻訳領域並びにオープンリーディングフレーム内のすべてにｍｉＲＮＡの標的配列を備えていてもよい。したがって、ｍｉＲＮＡ標的配列の数は、１つであってもよく、複数であってもよく、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つあるいはそれ以上であっても良い。例えば、５’－ＵＴＲに、４つあるいはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を組み込むことが好ましい。
【0035】
図１１は、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの設計例を概念的に示す図である。図１１（Ａ）は、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの全体の構造の一例を概念的に示す。図中、ｍｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅは上記（ｉ）の核酸配列を示し、Ａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲは（ｉｉ）の核酸配列を示す。左側の白丸は、５’末端のＣａｐ構造を表し、右側のＰｏｌｙ（Ａ）は３’末端のポリＡテイルを表す。なお、図１１における（ｉ）の核酸配列と、（ｉｉ）の核酸配列との結合態様は一例であり、本発明を限定するものではない。図１１（Ｂ）は、上記（ｉ）の核酸配列を示し、上図はｍｉＲＮＡ標的配列を１リピート有する（ｉ）の核酸配列、下図はｍｉＲＮＡ標的配列を４リピート有する（ｉ）の核酸配列を例示する。図１１（Ｃ）は、（ｉｉ）の核酸配列の一例を示す概念図であり、上図は第２蛋白質がＡｃｒｌｌＡ４である場合、下図は第２蛋白質が、核移行シグナルＭ９とＡｃｒｌｌＡ４の融合蛋白質である場合の概念図である。
【0036】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列が、５’から３’の方向にこの順序で連結されている。このとき、Ｃａｐ構造とｍｉＲＮＡの標的配列との間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。例えば、Ｃａｐ構造とｍｉＲＮＡ標的配列との間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるように設計することができる。また、ｍｉＲＮＡ標的配列と開始コドンとの間の塩基数及び塩基の種類は、ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡとの結合を阻害するなど、これらの相互作用に影響を与えないことが好ましい。一例としては、ｍｉＲＮＡ標的配列と開始コドンと間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるような配置にて設計することができる。
【0037】
本発明において、（ｉ）のｍｉＲＮＡ標的配列内には、開始コドンとなるＡＵＧが存在しないことが好ましい。例えば、ｍｉＲＮＡの標的配列が５’－ＵＴＲに存在し、かつ、当該標的配列内にＡＵＧを含む場合には、３’側に連結されるマーカー遺伝子との関係上でインフレームとなるように設計されることが好ましい。あるいは、標的配列内にＡＵＧを含む場合、標的配列内のＡＵＧをＧＵＧに変換して使用することも可能である。また、標的配列内のＡＵＧの影響を最小限に留めるために、５’－ＵＴＲ内における標的配列の配置場所を適宜変更することができる。例えば、Ｃａｐ構造と標的配列内のＡＵＧ配列との間の塩基数が、０～６０塩基、例えば、０～１５塩基、１０～２０塩基、２０～３０塩基、３０～４０塩基、４０～５０塩基、５０～６０塩基となるような配置にて設計され得る。なお、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの塩基数は、（ａ）のｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの塩基数とそれぞれ、概ね同程度になるように設計することができる。
【0038】
（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、５－メチルシチジンなどの修飾塩基を含んでいることが好ましい。細胞毒性を低減させるためである。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
【0039】
（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、細胞内に導入され、ｍｉＲＮＡに応答して第２蛋白質の翻訳が制御される。導入された細胞において、上記の標的配列に特異的に結合する特定のｍｉＲＮＡの活性が高い場合は、第２蛋白質の翻訳が抑制される。一方、導入された細胞において、上記の標的配列に特異的に結合する特定のｍｉＲＮＡの活性が低い場合には、第２蛋白質が翻訳され、当該細胞内で第２蛋白質が発現される。
【0040】
（ｃ）前記標的遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるｓｇＲＮＡ
（ｃ）のｓｇＲＮＡは、第１蛋白質が編集する標的となる遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるＲＮＡである。ｓｇＲＮＡ（ｃ）は、標的遺伝子を特異的に認識する、２０程度、例えば、１８～２２の程度の塩基配列を５’末端近傍に組み込むように設計することができる。標的遺伝子を特異的に認識する塩基配列は、標的となる遺伝子に完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該標的となる遺伝子において認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該標的となる遺伝子に完全に相補的な配列からの不一致については、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの設計において、ｍｉＲＮＡとその標的配列について定義したのと同様であってよい。また、この第１蛋白質による編集の標的となる遺伝子を特異的に認識する塩基配列の５’側に、１～５塩基程度の配列があってもよく、約８０塩基程度の配列があってもよい。このような配列を設けることにより、標的配列に結合しゲノムの編集を制御することができる可能性がある。配列さらに、標的遺伝子を特異的に認識する塩基配列の３’側以降の配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ等の遺伝子編集システムのｓｇＲＮＡとして機能することが知られているｓｇＲＮＡの配列であってよく、Ｔｅｔｒａ ｌｏｏｐ、ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ２、３’末端を改変した例やｓｇＲＮＡを構成するＲＮＡに化学修飾を加えた例が知られている。使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍによっては、ｓｇＲＮＡのｔｅｔｒａｌｏｏｐ及び／またはｓｔｅｍ ｌｏｏｐに、関連する蛋白質との結合配列を付加することもできる。が、第１蛋白質と複合体を形成して、標的遺伝子の目的の部位での編集、例えば切断や活性化を可能とする配列であれば、特定の配列には限定されない。
（ｃ）のｓｇＲＮＡは、第１蛋白質が編集する標的となる遺伝子によって特異的に認識されるガイド配列を備えるＲＮＡである。ｓｇＲＮＡ（ｃ）は、標的遺伝子を特異的に認識する、２０程度、例えば、１８～２２の程度の塩基配列を５’末端近傍に組み込むように設計することができる。標的遺伝子を特異的に認識する塩基配列は、標的となる遺伝子に完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該標的となる遺伝子において認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該標的となる遺伝子に完全に相補的な配列からの不一致については、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡの設計において、ｍｉＲＮＡとその標的配列について定義したのと同様であってよい。また、この第１蛋白質による編集の標的となる遺伝子を特異的に認識する塩基配列の５’側に、１～５塩基程度の配列があってもよく、約８０塩基程度の配列があってもよい。このような配列を設けることにより、標的配列に結合しゲノムの編集を制御することができる可能性がある。配列さらに、標的遺伝子を特異的に認識する塩基配列の３’側以降の配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ等の遺伝子編集システムのｓｇＲＮＡとして機能することが知られているｓｇＲＮＡの配列であってよく、Ｔｅｔｒａ ｌｏｏｐ、ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ２、３’末端を改変した例やｓｇＲＮＡを構成するＲＮＡに化学修飾を加えた例が知られている。使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍによっては、ｓｇＲＮＡのｔｅｔｒａｌｏｏｐ及び／またはｓｔｅｍ ｌｏｏｐに、関連する蛋白質との結合配列を付加することもできる。が、第１蛋白質と複合体を形成して、標的遺伝子の目的の部位での編集、例えば切断や活性化を可能とする配列であれば、特定の配列には限定されない。
【0041】
（ｃ）のｓｇＲＮＡは、第１蛋白質が活性な状態で存在する場合、第１蛋白質と複合体を形成して、標的遺伝子を編集する、例えば標的遺伝子を所望の部位で切断し、あるいは標的遺伝子の所望の部位を活性化することができる。
【0042】
（ａ）のｍＲＮＡ、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡ、（ｃ）のｓｇＲＮＡは、上記に従って設計され、配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。特には、プロモーター配列を含むテンプレートＤＮＡを鋳型として用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写合成法により、得ることができるが、合成方法は特には限定されない。
【0043】
本発明の一実施態様において、（ａ）のｍＲＮＡ、（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡ、（ｃ）のｓｇＲＮＡを細胞に導入する方法としては、合成ＲＮＡ分子の形態で細胞に導入することが挙げられる。例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。あるいは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のＲＮＡは、ウイルスベクターやプラスミドベクター、エピソーマルベクター等などのＤＮＡの形態で導入することもでき、導入法は、上記と同様のものを用いることができる。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の三種のＲＮＡは同じ方法で導入することが好ましい。
【0044】
なお、本発明の方法において、細胞に導入する（ｂ）のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡは、１種類であってもよく、２種、３種、４種、５種、６種、７種、あるいは８種類以上であってもよい。２種以上のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを導入する場合には、例えば、（ｉ）のｍｉＲＮＡ標的部位の配列が異なり、異なるｍｉＲＮＡに応答するｍＲＮＡを用いることができる。（ｉ）の配列が異なる複数のｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを用いることにより、例えば、ｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡが導入される細胞群に含まれうる複数種の細胞に対して、第２蛋白質の活性を制御することが可能になる。
【0045】
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のＲＮＡを細胞に導入する場合、（ａ）及び（ｂ）のｍＲＮＡを細胞群に共導入することが好ましい。共導入した２種以上のｍＲＮＡの細胞内での割合は個々の細胞で維持されるため、これらのｍＲＮＡから発現する蛋白質の活性比は、細胞集団内において一定となるためである。この時の導入量は、導入される細胞群、導入するｍＲＮＡ、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量の第１の蛋白質、及び第２の蛋白質を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。（ｃ）のｓｇＲＮＡは、（ａ）及び（ｂ）のｍＲＮＡと共導入することが好ましいが、必ずしも共導入しなくとも適切なタイミングで、独立に導入することもできる。
【0046】
より具体的な例として、第１蛋白質としてＣａｓ９蛋白質を用い、第２蛋白質としてＡｃｒｌｌＡ４を用いる場合の本発明の第１態様による方法を説明する。本発明は、一実施態様によれば、（ａ）のＣａｓ９蛋白質をコードするｍＲＮＡと、（ｂ）のＡｃｒｌｌＡ４をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、（ｃ）のｓｇＲＮＡを細胞に導入する工程を含む。以下の説明において、（ａ）のＣａｓ９蛋白質をコードするｍＲＮＡを、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとも指称し、（ｂ）のＡｃｒｌｌＡ４をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡとも指称する。
【0047】
図１の左側は、（ａ）のＣａｓ９ ｍＲＮＡと、（ｂ）のｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡと、（ｃ）のｓｇＲＮＡとを細胞に導入した場合の、細胞内での作用を模式的に示す図である。ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡの標的配列に認識されるｍｉＲＮＡの活性が高い場合、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の翻訳が抑制され、あるいは、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ分子の分解が生じ、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現されない。一方、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ活性に関わらずＣａｓ９蛋白質を発現する。Ｃａｓ９蛋白質は、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質により不活性化されることがないため、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９蛋白質が複合体を形成し、ゲノム編集、具体的には標的遺伝子の切断が行われる。
【0048】
次に、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡの標的配列に認識されるｍｉＲＮＡの活性が低い場合は、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の翻訳が行われ、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現する。ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡから発現されるＣａｓ９蛋白質を不活性化する。
【0049】
別の具体的な例として、第１蛋白質としてｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質を用い、第２蛋白質としてＡｃｒｌｌＡ４を用いる場合の本発明の第１態様による方法を説明する。本発明は、一実施態様によれば、（ａ）のｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質をコードするｍＲＮＡと、（ｂ）のＡｃｒｌｌＡ４をコードするｍｉＲＮＡ応答性ｍＲＮＡと、（ｃ）のｓｇＲＮＡを細胞に導入する工程を含む。以下の説明において、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質をコードするｍＲＮＡ（ａ）を、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ ｍＲＮＡ（ａ）とも指称する。
【0050】
図１の右側は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ ｍＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡと、ｓｇＲＮＡとを細胞に導入した場合の、細胞内での作用を模式的に示す図である。ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡの標的配列に認識されるｍｉＲＮＡの活性が高い場合、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の翻訳が抑制され、あるいは、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ分子の分解が生じ、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現されない。一方、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ活性に関わらずｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質を発現する。ｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質は、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質により不活性化されることがないため、ｓｇＲＮＡとｄＣａｓ９－ＶＰＲ蛋白質が複合体を形成し、ゲノム編集、具体的には標的遺伝子の活性化が行われる。
【0051】
ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡの標的配列に認識されるｍｉＲＮＡの活性が低い場合は、ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の翻訳が行われ、ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が発現する。ＡｃｒｌｌＡ４蛋白質は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ ｍＲＮＡから発現されるＣａｓ９蛋白質を不活性化する。
【0052】
本発明に係る方法によれば、標的遺伝子の編集を可能とする蛋白質の活性を、ｍｉＲＮＡの活性を指標として細胞特異的に制御することが可能となる。このため、特定の細胞において活性の高いｍｉＲＮＡに応答して、標的遺伝子の編集を実行するＯＮシステムを構築することが可能となった。
【実施例0053】
以下に、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
【0054】
（１）ＡｃｒｌｌＡ４によるＣａｓ９活性の阻害
はじめに、ＡｃｒｌｌＡ４をコードするｍＲＮＡ（ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ）から作製されたＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が、Ｃａｓ９活性を抑制することができるかを検証した。本発明者らは、ＥＧＦＰ遺伝子がゲノムに組み込まれたＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ）を用いてＣａｓ９活性を評価した結果を報告している（Ｈｉｒｏｓａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）、非特許文献２）。本実験では、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）、及びＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡＥＧＦＰを、ＨｅＬａ－ＥＧＦＰにトランスフェクトした。Ｃａｓ９活性は、ＥＧＦＰ陰性細胞集団をフローサイトメトリーにより定量することで評価した。詳細は、方法の欄に示す。
はじめに、ＡｃｒｌｌＡ４をコードするｍＲＮＡ（ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ）から作製されたＡｃｒｌｌＡ４蛋白質が、Ｃａｓ９活性を抑制することができるかを検証した。本発明者らは、ＥＧＦＰ遺伝子がゲノムに組み込まれたＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ）を用いてＣａｓ９活性を評価した結果を報告している（Ｈｉｒｏｓａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）、非特許文献２）。本実験では、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）、及びＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡＥＧＦＰを、ＨｅＬａ－ＥＧＦＰにトランスフェクトした。Ｃａｓ９活性は、ＥＧＦＰ陰性細胞集団をフローサイトメトリーにより定量することで評価した。詳細は、方法の欄に示す。
【0055】
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの活性は、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡをトランスフェクションした場合と、しない場合について評価した。結果を図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃに示す。ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡが存在しなかった場合、およそ７０％の細胞がＥＧＦＰ陰性であり、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡＥＧＦＰにより、ＥＧＦＰ遺伝子の編集が効率的に行われたことを示す。これに対し、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを添加した場合は、ＥＧＦＰ陰性細胞の数が減少した。この結果は、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ（１０～５０ｎｇ）が、標的化していない細胞および未処理の細胞と同程度にまで、Ｃａｓ９活性を効率的に抑制したことを示す。Ｃａｓ９結合活性のないｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＡｃｒｌｌＡ４ ｍｕｔａｎｔ（Ｅ７０Ｒ）（Ｄｏｎｇ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（２０１７） Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－ＳｐｙＣａｓ９ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ ５４６：４３６-４３９．）は、ＥＧＦＰ陰性細胞集団に影響を与えなかった。このことは、Ｃａｓ９活性の効率的な抑制が、Ｃａｓ９とＡｃｒｌｌＡ４の相互作用によるものであることを示唆している。このように、ＡｃｒｌｌＡ４は、ゲノム編集を確実に制御する。すなわち、ＯＦＦ状態におけるオフターゲットを最低限にする。以下の実験（図３）においては、１０ｎｇのＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いた。
【0056】
（２）ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチによるｍｉＲＮＡのセンシングとゲノム編集制御
任意のｍｉＲＮＡ に応答してＣａｓ９活性を誘導するために、ｍｉＲＮＡ 応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ（ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチとも指称する、図３Ａ）の５’－ＵＴＲにｍｉＲＮＡ標的部位（ｍｉＲＮＡのアンチセンス配列）を挿入した。特定のｍｉＲＮＡ活性が低い場合に、ＡｃｒｌｌＡ４がＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡから発現されてＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体に結合し、Ｃａｓ９が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合するのを抑制して、ゲノム編集を中断する（図３Ａ、左側）。一方、特定のｍｉＲＮＡ活性が高い場合には、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡはＡｃｒｌｌＡ４を発現せず、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ－ｄｓＤＮＡ複合体を形成しゲノム編集が促進される（図３Ａ、右側）。このように、ｍｉＲＮＡにより駆動されるＣａｓ９－ＯＮシステムが得られた。
任意のｍｉＲＮＡ に応答してＣａｓ９活性を誘導するために、ｍｉＲＮＡ 応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ（ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチとも指称する、図３Ａ）の５’－ＵＴＲにｍｉＲＮＡ標的部位（ｍｉＲＮＡのアンチセンス配列）を挿入した。特定のｍｉＲＮＡ活性が低い場合に、ＡｃｒｌｌＡ４がＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡから発現されてＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体に結合し、Ｃａｓ９が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合するのを抑制して、ゲノム編集を中断する（図３Ａ、左側）。一方、特定のｍｉＲＮＡ活性が高い場合には、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡはＡｃｒｌｌＡ４を発現せず、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ－ｄｓＤＮＡ複合体を形成しゲノム編集が促進される（図３Ａ、右側）。このように、ｍｉＲＮＡにより駆動されるＣａｓ９－ＯＮシステムが得られた。
【0057】
ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチが、ｍｉＲＮＡ活性を感知してＣａｓ９を活性化できるか否かを調べた。ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓではｍｉＲ－２１活性が高いため、我々は、ｍｉＲ－２１応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ（Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４）を構築し、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡＥＧＦＰをＨｅＬａ－ＥＧＦＰにトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ＥＧＦＰ陰性細胞集団はＣａｓ９活性に基づいて増加した。結果を、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄに示す。このことは、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡからのＡｃｒｌｌＡ４蛋白質の発現がｍｉＲ－２１により抑制されたことを示す。
【0058】
内在性のｍｉＲ－２１がゲノム編集を引き起こすことができるか確認した。ｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、ＥＧＦＰ陰性細胞集団のサイズを、Ｃａｓ９で処理していない細胞と同程度まで減少させた（Ｃａｓ９－ＯＦＦ）。ｍｉＲＮＡに干渉しないネガティブコントロール（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎ．Ｃ．）は、ＥＧＦＰ陰性細胞集団に何の効果も及ぼさなかった（Ｃａｓ９－ＯＮ）。これらの結果から、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４スイッチは内在性のｍｉＲ－２１によりＣａｓ９活性を制御することを示しており、ｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの存在下でのＯＦＦ状態でのＣａｓ９活性のバックグラウンドレベルを明らかにした。すなわち、ＯＦＦ状態ではＣａｓ９活性を効率的に抑制し、標的ｍｉＲＮＡ を検知することによりＣａｓ９を活性化した。また、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲに複数のｍｉＲＮＡ標的配列を直列に挿入することで、ＯＦＦ状態に影響を与えることなくＯＮ状態を改善した（図３Ｄ、４ｘＴ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４ｖｓ．Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４）。ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎ．Ｃ．を用いた場合に、４ｘＴ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡをトランスフェクトした場合のＥＧＦＰ陰性細胞集団は、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡをトランスフェクトした場合のＥＧＦＰ陰性細胞集団と比較して高く、前者が４１．１％、後者が３１．７％であった。しかし、ｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを用いると、４ｘＴ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡをトランスフェクトした場合のＥＧＦＰ陰性細胞集団は１５．６％、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡをトランスフェクトした場合のＥＧＦＰ陰性細胞集団は１５．９％で、同程度の数値であった。このことは、標的としない細胞に対するオフターゲット効果を避けながら、標的ｍｉＲＮＡに対する感度を改善したことを示す。
【0059】
このストラテジーの一般性を確認するために、上記とは異なるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ（ｍｉＲ－３０２ａ）を標的とした。ｍｉＲ－３０２ａは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）のマーカーとして知られている。ＨｅＬａ細胞では、ｍｉＲ－３０２ａの活性が低いため、ｍｉＲ－３０２ａ ｍｉｍｉｃを用いてＣａｓ９活性化を引き起こした。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡＥＧＦＰ、及びＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを、ｍｉＲ－３０２ａ ｍｉｍｉｃまたはｍｉＲ－３０２ａネガティブコントロール（ｍｉｍｉｃ Ｎ．Ｃ．）とともに、コトランスフェクションした。予測どおり、ＥＧＦＰ陰性細胞集団は、ｍｉＲ－３０２ａ ｍｉｍｉｃの存在下では増加したが、ｍｉＲ－３０２ａ ｍｉｍｉｃ Ｎ．Ｃの存在下では増加せず、Ｃａｓ９活性のバックグラウンドレベルをＯＦＦ状態に保持した（図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ）。これは、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチがモジュラーであることを示す。このように、ＡｃｒｌｌＡ４を制御することで、合成ＲＮＡにより送達され、ｍｉＲＮＡに応答するＣａｓ９－ＯＮシステムを設計することに成功した。
【0060】
（３）ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチによるｍｉＲＮＡのセンシングとＣＲＩＳＰＲａの制御
次に、このようなｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチと、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）システムを組み合わせて標的遺伝子の発現を上方制御することができるかどうかを探った。そのために、レポーター細胞として、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）により制御可能なｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ１（ｈｍＡＧ１）遺伝子をゲノムに組み込んだＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１）（図４Ａ）を構築した。ｈｍＡＧ１の活性化には、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ ｓｙｓｔｅｍを用いた（Ｃｈａｖｅｚ Ａ， ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２：３２６-３２８．）。はじめに、ＡｃｒｌｌＡを用いない場合、ｈｍＡＧ１の効率的な発現がなされることを観察した（図４Ｄ、Ｗｉｔｈｏｕｔ ＡｃｒｌｌＡ４）。ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチを用いたＣＲＩＳＰＲａシステムの制御を調べるために、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ、 ｓｇＲＮＡＴＲＥ、 Ｔ２１－ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡのそれぞれをコードするプラスミドを、ｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒまたはｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎ．Ｃ．とともに、ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１にコトランスフェクションした。その結果、ｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ の添加は、選択的かつ顕著にｈｍＡＧ１陽性細胞集団を減少させたが、ｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎ．Ｃ．を添加してもｈｍＡＧ１陽性細胞集団を減少させず、ｈｍＡＧ１の発現はｍｉＲ－２１の活性に依存することがわかった（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４）。この結果から、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチは、ｍｉＲＮＡ活性に応答してゲノムにコードされる遺伝子を活性化できることがわかった。また、ＡｃｒｌｌＡ４のＮ末端を核移行シグナル（ＮＳＬ）であるＭ９に融合することにより、Ｃａｓ９抑制効率を犠牲にすることなく、ｈｍＡＧ１発現レベルを向上させることができた。（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、Ｔ２１－Ｍ９＿ＡｃｒｌｌＡ４（配列番号５５）。さらに、ＡｃｒｌｌＡ４のレベルを変えることにより、ｍｉＲ－２１によりトリガーされるｈｍＡＧ１遺伝子の発現レベルを最適化することができた（図示せず）。さらに、スイッチを、ｍｉＲ－３０２ａを標的とするスイッチに変えても同様の結果が得られることを実験的に確認し、このストラテジーの一般性を確認した（詳細は図示せず）。これらの結果から、ＡｃｒｌｌＡ４の発現レベルを変化させることで、ｍｉＲＮＡを入力信号として用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＯＮシステムの最適なＯＮ／ＯＦＦ状態を達成することができると考えられる。
次に、このようなｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチと、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）システムを組み合わせて標的遺伝子の発現を上方制御することができるかどうかを探った。そのために、レポーター細胞として、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）により制御可能なｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ１（ｈｍＡＧ１）遺伝子をゲノムに組み込んだＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１）（図４Ａ）を構築した。ｈｍＡＧ１の活性化には、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ ｓｙｓｔｅｍを用いた（Ｃｈａｖｅｚ Ａ， ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２：３２６-３２８．）。はじめに、ＡｃｒｌｌＡを用いない場合、ｈｍＡＧ１の効率的な発現がなされることを観察した（図４Ｄ、Ｗｉｔｈｏｕｔ ＡｃｒｌｌＡ４）。ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチを用いたＣＲＩＳＰＲａシステムの制御を調べるために、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ、 ｓｇＲＮＡＴＲＥ、 Ｔ２１－ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡのそれぞれをコードするプラスミドを、ｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒまたはｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎ．Ｃ．とともに、ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１にコトランスフェクションした。その結果、ｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ の添加は、選択的かつ顕著にｈｍＡＧ１陽性細胞集団を減少させたが、ｍｉＲ－２１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎ．Ｃ．を添加してもｈｍＡＧ１陽性細胞集団を減少させず、ｈｍＡＧ１の発現はｍｉＲ－２１の活性に依存することがわかった（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４）。この結果から、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチは、ｍｉＲＮＡ活性に応答してゲノムにコードされる遺伝子を活性化できることがわかった。また、ＡｃｒｌｌＡ４のＮ末端を核移行シグナル（ＮＳＬ）であるＭ９に融合することにより、Ｃａｓ９抑制効率を犠牲にすることなく、ｈｍＡＧ１発現レベルを向上させることができた。（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、Ｔ２１－Ｍ９＿ＡｃｒｌｌＡ４（配列番号５５）。さらに、ＡｃｒｌｌＡ４のレベルを変えることにより、ｍｉＲ－２１によりトリガーされるｈｍＡＧ１遺伝子の発現レベルを最適化することができた（図示せず）。さらに、スイッチを、ｍｉＲ－３０２ａを標的とするスイッチに変えても同様の結果が得られることを実験的に確認し、このストラテジーの一般性を確認した（詳細は図示せず）。これらの結果から、ＡｃｒｌｌＡ４の発現レベルを変化させることで、ｍｉＲＮＡを入力信号として用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＯＮシステムの最適なＯＮ／ＯＦＦ状態を達成することができると考えられる。
【0061】
（４）ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチ（５ｎｇ）によるｍｉＲＮＡのセンシングとゲノム編集制御
先の（１）と同様の実験を、ＥＧＦＰ遺伝子がゲノムに組み込まれたｉＰＳ細胞であるｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞において行い、ＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトによりＣａｓ９の活性を評価した。ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞は、トランスフェクションの１７－２４時間前に、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに ５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。ＳｔｅｍＦｅｃｔ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔをプロトコルに従って使用し、ＡｃｒｌｌＡ４－ｍＲＮＡ（５ｎｇ）、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）、及びＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡＥＧＦＰを、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから３日後、フローサイトメトリー分析の前に細胞をＣｙｔｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりキャプチャーした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ、Ａｃｃｕｍａｘで、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下にて１０分間処理した。次いで、２００μＬのＰＢＳを添加し、剥離した細胞を懸濁した。細胞をフローサイトメーターにより測定した。フローサイトメーターの測定条件は、実験方法、ＥＧＦＰノックアウトアッセイに記載した。図５Ａは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いないコントロール実験の結果、得られた細胞の写真であり、左パネルはＡｃｒｌｌＡ４の添加なし、右パネルは標的遺伝子に認識されるｓｇＲＮＡＥＧＦＰの添加なしの結果を示す。図５Ｂもコントロール実験の結果、得られた細胞の写真であり、左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加、中パネルは不活性化したＡｃｒｌｌＡ４変異体を添加、右パネルは未処理）の結果である。図６はドットプロット結果を示し、図７は、各操作を行った細胞におけるＥＧＦＰ陰性細胞集団の割合（％）を示す。図５Ａ、Ｂ、図６、７の結果は、図２により得られた結果と概ね同様の傾向を示した。
先の（１）と同様の実験を、ＥＧＦＰ遺伝子がゲノムに組み込まれたｉＰＳ細胞であるｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞において行い、ＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトによりＣａｓ９の活性を評価した。ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞は、トランスフェクションの１７－２４時間前に、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに ５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。ＳｔｅｍＦｅｃｔ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔをプロトコルに従って使用し、ＡｃｒｌｌＡ４－ｍＲＮＡ（５ｎｇ）、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）、及びＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡＥＧＦＰを、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから３日後、フローサイトメトリー分析の前に細胞をＣｙｔｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりキャプチャーした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ、Ａｃｃｕｍａｘで、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下にて１０分間処理した。次いで、２００μＬのＰＢＳを添加し、剥離した細胞を懸濁した。細胞をフローサイトメーターにより測定した。フローサイトメーターの測定条件は、実験方法、ＥＧＦＰノックアウトアッセイに記載した。図５Ａは、ｍｉＲＮＡ応答性ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡを用いないコントロール実験の結果、得られた細胞の写真であり、左パネルはＡｃｒｌｌＡ４の添加なし、右パネルは標的遺伝子に認識されるｓｇＲＮＡＥＧＦＰの添加なしの結果を示す。図５Ｂもコントロール実験の結果、得られた細胞の写真であり、左パネルはＡｃｒｌｌＡ４を添加、中パネルは不活性化したＡｃｒｌｌＡ４変異体を添加、右パネルは未処理）の結果である。図６はドットプロット結果を示し、図７は、各操作を行った細胞におけるＥＧＦＰ陰性細胞集団の割合（％）を示す。図５Ａ、Ｂ、図６、７の結果は、図２により得られた結果と概ね同様の傾向を示した。
【0062】
次いで、（２）と同様の実験を、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞において行った。スイッチには、ｍｉＲ－３０２ａの相補配列を標的配列として１リピート、または４リピート有するＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチまたは４ｘＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチ（いずれも５ｎｇ）を用いた。細胞の播種並びにトランスフェクションは、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞へのＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡのトランスフェクションと同様にして行った。Ｔ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチ、４ｘＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチのトランスフェクションでは、いずれもスイッチに加え、Ｈ２Ｏ、ｍｉＲ－３０２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｍｉＲ－３０２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎ．Ｃ．を添加した。Ｃａｓ９の活性はＥＧＦＰ遺伝子のノックアウトにより評価した。図５Ｃは、Ｔ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチをトランスフェクションした結果、得られた細胞の写真であり、図５Ｄは、４ｘＴ３０２ａ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチをトランスフェクションした結果、得られた細胞の写真である。図６はドットプロット結果を示し、図７は、各操作を行った細胞におけるEGFP陰性細胞集団の割合（％）を示す。図５Ｃ、Ｄ、図６、７の結果は、図３により得られた結果と概ね同様の傾向を示した。
【0063】
（５）ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチ（１０ｎｇ）によるｍｉＲＮＡのセンシングとゲノム編集制御
ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡまたはｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチの添加量を１０ｎｇとした以外は、（４）と同様にして、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞へのトランスフェクションを行った。結果を図８Ａ～Ｄ、図９、及び図１０に示す。導入するｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチの量を変化させても、（４）の実験と同様の結果を示した。
ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡまたはｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチの添加量を１０ｎｇとした以外は、（４）と同様にして、ｉＰＳ－ＥＧＦＰ細胞へのトランスフェクションを行った。結果を図８Ａ～Ｄ、図９、及び図１０に示す。導入するｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチの量を変化させても、（４）の実験と同様の結果を示した。
【0064】
この研究では、Ｃａｓ９レギュレータとしてのｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチを構築し、活性が高いｍｉＲＮＡに応答して標的遺伝子を切断し、または活性化した。ｍＲＮＡとして送達されるＡｃｒｌｌＡ４はＣａｓ９活性を効率的に抑制したため（図２Ａ～Ｃ）、ｍｉＲＮＡによるＡｃｒｌｌＡ４の制御は細胞状態に応じたゲノムの編集及び活性化のための魅力的な手段となりうる。入力ｍｉＲＮＡが存在しない場合、ｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチはＡｃｒｌｌＡ４を発現してＣａｓ９またはｄＣａｓ９－ＶＰＲの活性を効率的に抑制し、ＯＦＦ状態とした。一方、標的ｍｉＲＮＡが存在すると、ＡｃｒｌｌＡ４の発現を抑制し、Ｃａｓ９または ｄＣａｓ９－ＶＰＲの活性を上方制御するＯＮ状態を形成した。Ｈｉｒｏｓａｗａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）に開示された従来のＣａｓ９－ＯＮスイッチシステムは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと、Ｃａｓ９の翻訳を抑制するＬ７Ａｅ ｍＲＮＡの二種類のｍＲＮＡを用いるものであった。この従来のシステムと比較して、本発明のｍｉＲ－ＡｃｒｌｌＡ４スイッチは、ＯＦＦ状態におけるＣａｓ９のリーク発現を減少させた。ＡｃｒｌｌＡ４とＣａｓ９の相互作用がＣａｓ９活性を効率的にブロックしたと考えられる。一方、従来のＬ７Ａｅを用いた制御システムでは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＬ７Ａｅ ｍＲＮＡの二種類のｍＲＮＡをコトランスフェクションしたため、Ｃａｓ９の翻訳を完全にはシャットダウンすることができなかったと考えられる。さらに、入力ＡｃｒｌｌＡ４の量及び安定性を変化させることによるＡｃｒｌｌＡ４の制御は、ＯＮ状態のパフォーマンスを向上させることができた。
【0065】
［実験方法］
［プラスミドの構築］
全ての ＰＣＲ 反応は、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて実施し、全てのＰＣＲ産物は、Ｍｉｎ Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ライゲーションには、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。全てのプラスミド ＤＮＡはＥ． ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＤＨ５α中で増殖し、Ｊｅｔｓｔａｒ ｐｌａｓｍｉｄｅ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）またはＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄｅ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造者の指示に従い精製した。プライマーとオリゴヌクレオチドの番号は、以下の表１に示す。
［プラスミドの構築］
全ての ＰＣＲ 反応は、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて実施し、全てのＰＣＲ産物は、Ｍｉｎ Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ライゲーションには、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。全てのプラスミド ＤＮＡはＥ． ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＤＨ５α中で増殖し、Ｊｅｔｓｔａｒ ｐｌａｓｍｉｄｅ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）またはＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄｅ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造者の指示に従い精製した。プライマーとオリゴヌクレオチドの番号は、以下の表１に示す。
【0066】
【表1】
【0067】
［ｐＵＣ１９－ＡｃｒｌｌＡ４］
ＡｃｒｌｌＡ４の合成は、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＩＤＴ）に委託した。このフラグメントは、制限酵素ＳｍａＩで消化することによりｐＵＣ１９ベクターに直接ライゲートした。
ＡｃｒｌｌＡ４の合成は、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＩＤＴ）に委託した。このフラグメントは、制限酵素ＳｍａＩで消化することによりｐＵＣ１９ベクターに直接ライゲートした。
【0068】
［ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ］
ＡｃｒｌｌＡ４ を含むＤＮＡフラグメントは、ｐＵＣ１９－ＡｃｒｌｌＡ４から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２を用いてＰＣＲにより増幅した。フラグメントは、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＳｐｈｃＣａｓ９－ｉＰ－Ａ（堀田秋津博士より提供を受けた）のＥｃｏＲＩサイトと、ＳａｌＩサイトの間に挿入し、ｐＨＬ－ＥＦα－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａを生成した。
ＡｃｒｌｌＡ４ を含むＤＮＡフラグメントは、ｐＵＣ１９－ＡｃｒｌｌＡ４から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２を用いてＰＣＲにより増幅した。フラグメントは、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＳｐｈｃＣａｓ９－ｉＰ－Ａ（堀田秋津博士より提供を受けた）のＥｃｏＲＩサイトと、ＳａｌＩサイトの間に挿入し、ｐＨＬ－ＥＦα－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａを生成した。
【0069】
［ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ－ｉＰ－Ａ］
ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ－ｉＰ－Ａは、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａから、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、製造者（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコルに従って構築した。変異を導入するために、ｉＰＣＲ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．３及びｉＰＣＲ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．４を用いた。
ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ－ｉＰ－Ａは、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａから、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、製造者（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコルに従って構築した。変異を導入するために、ｉＰＣＲ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．３及びｉＰＣＲ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．４を用いた。
【0070】
［ｐＨＬ－ＥＦ１α－ｍｉＲ＿ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ：ｍｉＲ＝Ｔ２１、Ｔ３０２ａ、４ｘＴ２１］
ｍｉＲＮＡ標的部位を含むそれぞれのＤＮＡフラグメントは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．５、 ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．６、及びｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｎｏｓ．７、８、９を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｎｏ．７はＴ２１、ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｎｏ．８はＴ３０２ａ、ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｎｏ．９は、４ｘＴ２１に対応する。
ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１０、及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１１を用いて、インバースＰＣＲにより線状化した。得られたインサートおよび線状化したベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従って融合した。
ｍｉＲＮＡ標的部位を含むそれぞれのＤＮＡフラグメントは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．５、 ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．６、及びｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｎｏｓ．７、８、９を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｎｏ．７はＴ２１、ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｎｏ．８はＴ３０２ａ、ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｎｏ．９は、４ｘＴ２１に対応する。
ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１０、及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１１を用いて、インバースＰＣＲにより線状化した。得られたインサートおよび線状化したベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従って融合した。
【0071】
［ｐＨＬ－ＥＦ１α－Ｍ９＿ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ 及び ｐＨＬ－ＥＦ１α－Ｔ２１＿Ｍ９＿ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ］
Ｍ９を含むＤＮＡフラグメントは、ｐＡｐｔａｍｅｒＣａｓｓｅｔｔｅ－ｔａｇＢＦＰ－Ｍ９（ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１２及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１３を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ及びｐＨＬ－ＥＦ１α－Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１４、及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１５を用いて、インバースＰＣＲにより線状化した。Ｍ９ ｆｒａｇｍｅｎｔおよび線状化したベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従って融合した。
Ｍ９を含むＤＮＡフラグメントは、ｐＡｐｔａｍｅｒＣａｓｓｅｔｔｅ－ｔａｇＢＦＰ－Ｍ９（ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１２及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１３を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａ及びｐＨＬ－ＥＦ１α－Ｔ２１＿ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１４、及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１５を用いて、インバースＰＣＲにより線状化した。Ｍ９ ｆｒａｇｍｅｎｔおよび線状化したベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従って融合した。
【0072】
［ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ］
標的遺伝子であるＥＧＦＰを含むＤＮＡフラグメントは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１６及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１８を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＤＭＤ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ（堀田秋津博士より提供を受けた）のＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトの間に挿入し、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨを生成した。
標的遺伝子であるＥＧＦＰを含むＤＮＡフラグメントは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１６及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１８を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＤＭＤ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ（堀田秋津博士より提供を受けた）のＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトの間に挿入し、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨを生成した。
【0073】
［ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＴＲＥ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ］
標的遺伝子であるＴＲＥを含むＤＮＡフラグメントは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１７及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１８を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨのＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトの間に挿入し、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＴＲＥ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨを生成した。
標的遺伝子であるＴＲＥを含むＤＮＡフラグメントは、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１７及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１８を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨのＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトの間に挿入し、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＴＲＥ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨを生成した。
【0074】
［ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［Ｔａｒｇｅｔ］－ｍＥＦ１α－ｉＲＦＰ６７０－ＲｉＨ：Ｔａｒｇｅｔ＝ＴＲＥ及びＥＧＦＰ］
ｉＲＦＰ６７０を含むＤＮＡフラグメントは、ｐｉＲＦＰ６７０－Ｎ１（Ａｄｄｇｅｎｅ， ｐｌａｓｍｉｄ ＃４５４５７，Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ ＤＭ，Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ ＶＶ．（２０１３）Ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：７５１－７５４）から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１９及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２０を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＴＲＥ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ 及び ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨのＥｃｏＲＶサイトとＡｖｒＩＩサイトの間に挿入し、ｉＲＦＰ６７０をｍＲＦＰに置き換えた。
ｉＲＦＰ６７０を含むＤＮＡフラグメントは、ｐｉＲＦＰ６７０－Ｎ１（Ａｄｄｇｅｎｅ， ｐｌａｓｍｉｄ ＃４５４５７，Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ ＤＭ，Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ ＶＶ．（２０１３）Ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：７５１－７５４）から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１９及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２０を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＴＲＥ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨ 及び ｐＨＬ－ｇＲＮＡ［ＥＧＦＰ］－ｍＥＦ１α－ｍＲＦＰ－ＲｉＨのＥｃｏＲＶサイトとＡｖｒＩＩサイトの間に挿入し、ｉＲＦＰ６７０をｍＲＦＰに置き換えた。
【0075】
［ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｈｍＡＧ１］
ｈｍＡＧ１を含むＤＮＡフラグメントは、ｐ５’ＲＴＭ－ｈｍＡＧ１（ｄｅｌｔａｐＡ）－ＡＢＨＤ１２Ｂｅｘｏｎ１３（ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２１及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２２を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩサイトとＥｃｏＲＶサイトの間に挿入し、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｈｍＡＧ１を生成した。
ｈｍＡＧ１を含むＤＮＡフラグメントは、ｐ５’ＲＴＭ－ｈｍＡＧ１（ｄｅｌｔａｐＡ）－ＡＢＨＤ１２Ｂｅｘｏｎ１３（ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２１及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２２を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩサイトとＥｃｏＲＶサイトの間に挿入し、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｈｍＡＧ１を生成した。
【0076】
［ＰＢ－ＴＲＥ＿ｈｍＡＧ１］
ＴＲＥ－ＡＧ１含むＤＮＡフラグメントは、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｈｍＡＧ１から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２３及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２４を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＢ－ＴＲＥ－ＩＲＥＳ－ＡＧ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２０１７） Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １２８：１２１－１３５．）は、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２５及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２６を用いて、インバースＰＣＲにより線状化した。得られたＤＮＡフラグメントおよび線状化したベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従って融合した。
ＴＲＥ－ＡＧ１含むＤＮＡフラグメントは、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｈｍＡＧ１から、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２３及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２４を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＢ－ＴＲＥ－ＩＲＥＳ－ＡＧ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２０１７） Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １２８：１２１－１３５．）は、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２５及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．２６を用いて、インバースＰＣＲにより線状化した。得られたＤＮＡフラグメントおよび線状化したベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従って融合した。
【0077】
［インヴィトロトランスフェクション（ＩＶＴ）のためのＤＮＡテンプレート］
ｍｉＲＮＡ標的部位を持たない５’－ＵＴＲ（コントロール５’－ＵＴＲ）及び３’－ＵＴＲは、合成オリゴＤＮＡをハイブリダイズすることにより伸長した。Ｃａｓ９蛋白質及びＡｃｒｌｌＡ４蛋白質コード領域は、それぞれ、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＳｐｈｃＣａｓ９－ｉＰ－Ａ（Ａｄｄｇｅｎｅ， ｐｌａｓｍｉｄ ＃６０５９９）及びｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａから、適切なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ蛋白質コード領域は、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ－ｉＰ－Ａから増幅した。プラスミドＤＮＡは、ＤｐｎＩにより除去した。５’－ＵＴＲ、蛋白質コード領域、及び３’－ＵＴＲを融合して、ＩＶＴのためのＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡのテンプレートをさらなるＰＣＲ反応により構築した。ｓｇＲＮＡテンプレートは、Ｈｉｒｏｓａｗａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）に記載の方法により構築した。全てのＰＣＲ反応は、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて実施し、全てのＰＣＲ産物は、Ｍｉｎ Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応のためのプライマーとテンプレートの組み合わせは、以下の表２、３に示す。
ｍｉＲＮＡ標的部位を持たない５’－ＵＴＲ（コントロール５’－ＵＴＲ）及び３’－ＵＴＲは、合成オリゴＤＮＡをハイブリダイズすることにより伸長した。Ｃａｓ９蛋白質及びＡｃｒｌｌＡ４蛋白質コード領域は、それぞれ、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＳｐｈｃＣａｓ９－ｉＰ－Ａ（Ａｄｄｇｅｎｅ， ｐｌａｓｍｉｄ ＃６０５９９）及びｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４－ｉＰ－Ａから、適切なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ蛋白質コード領域は、ｐＨＬ－ＥＦ１α－ＡｃｒｌｌＡ４＿Ｅ７０Ｒ－ｉＰ－Ａから増幅した。プラスミドＤＮＡは、ＤｐｎＩにより除去した。５’－ＵＴＲ、蛋白質コード領域、及び３’－ＵＴＲを融合して、ＩＶＴのためのＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡのテンプレートをさらなるＰＣＲ反応により構築した。ｓｇＲＮＡテンプレートは、Ｈｉｒｏｓａｗａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）に記載の方法により構築した。全てのＰＣＲ反応は、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて実施し、全てのＰＣＲ産物は、Ｍｉｎ Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応のためのプライマーとテンプレートの組み合わせは、以下の表２、３に示す。
【0078】
【表2A】
【表2B】
【0079】
【表3】
【0080】
［Ｃａｓ９－ｍＲＮＡ、ＡｃｒｌｌＡ４－ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの合成及び精製］
全てのｍＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて生成した。長いＲＮＡにより引き起こされるインターフェロン応答を減少するために、天然のウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に代えて、それぞれ、ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ－５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ－５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。グアノシン５’三リン酸は、ＩＶＴ反応の前に、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５倍希釈した。ｓｇＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて構築した。ｓｇＲＮＡの調整には天然の塩基、例えば、ｒＮＴＰ等を使用した。ＤＮＡテンプレートを除去するために、サンプルをＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、３７℃で３０分処理した。次いで、ＦａｖｏｒＰｒｅｐ Ｂｌｏｏｄ／Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｆａｖｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて生成し、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で３７℃で３０分インキュベートし、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて再び精製した。ｓｇＲＮＡは、さらに精製するために電気泳動し、８．３Ｍのウレアを含む１０％ポリアクリルアミドゲルから抽出し、エタノール沈殿した。
全てのｍＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて生成した。長いＲＮＡにより引き起こされるインターフェロン応答を減少するために、天然のウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に代えて、それぞれ、ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ－５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ－５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。グアノシン５’三リン酸は、ＩＶＴ反応の前に、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５倍希釈した。ｓｇＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて構築した。ｓｇＲＮＡの調整には天然の塩基、例えば、ｒＮＴＰ等を使用した。ＤＮＡテンプレートを除去するために、サンプルをＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、３７℃で３０分処理した。次いで、ＦａｖｏｒＰｒｅｐ Ｂｌｏｏｄ／Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｆａｖｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて生成し、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で３７℃で３０分インキュベートし、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて再び精製した。ｓｇＲＮＡは、さらに精製するために電気泳動し、８．３Ｍのウレアを含む１０％ポリアクリルアミドゲルから抽出し、エタノール沈殿した。
【0081】
［ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの配列］
使用したｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの配列の配列は以下表４のとおりである。表４中、オープンリーディングフレームはボールド体で表し、開始コドン及び終始コドンは四角で囲った。ｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的配列並びにｓｇＲＮＡ上の標的遺伝子に認識される配列は、下線を付した。
使用したｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの配列の配列は以下表４のとおりである。表４中、オープンリーディングフレームはボールド体で表し、開始コドン及び終始コドンは四角で囲った。ｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ標的配列並びにｓｇＲＮＡ上の標的遺伝子に認識される配列は、下線を付した。
【0082】
【表4A】
【表4B】
【表4C】
【0083】
［ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１細胞株の生成］
ＨｅＬａ ＣＣＬ２ 細胞（ＡＴＣＣ）は、２４ウェルプレートに播種した（２．５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。２５０ｎｇの ＰＢ－ＴＲＥ＿ｈｍＡＧ１（配列番号５６）及び２５０ｎｇのｐＣＡＧ－ＰＢａｓｅは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００トランスフェクション試薬を用い、製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のプロトコルに従って、細胞にコトランスフェクションした。細胞は６ウェルプレートで継代し、培養し、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）により選択した。
ＨｅＬａ ＣＣＬ２ 細胞（ＡＴＣＣ）は、２４ウェルプレートに播種した（２．５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。２５０ｎｇの ＰＢ－ＴＲＥ＿ｈｍＡＧ１（配列番号５６）及び２５０ｎｇのｐＣＡＧ－ＰＢａｓｅは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００トランスフェクション試薬を用い、製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のプロトコルに従って、細胞にコトランスフェクションした。細胞は６ウェルプレートで継代し、培養し、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）により選択した。
【0084】
［細胞培養］
ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞は、１０％ ＦＢＳ（ＪＢＳ）を添加したＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）で培養した。ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１細胞は、１０％ ＦＢＳ（ＪＢＳ）、０．１ｍＭ ＭＥＭ－ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）で培養した。ｉＰＳ＿ＥＧＦＰ（ＡＡＶＳ１－ＣＡＧ：：ＧＦＰ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ，Ｗｏｌｔｊｅｎ Ｌａｂ（ＣｉＲＡ， Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）はＳｔｅｍＦｉｔ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）培地を用いてラミニンコート｛ｌａｍｉｎｉｎ－５１１ Ｅ８（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ，ｎｉｐｐｉ）｝したプレートで培養した。全ての細胞株は、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した。
ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞は、１０％ ＦＢＳ（ＪＢＳ）を添加したＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）で培養した。ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１細胞は、１０％ ＦＢＳ（ＪＢＳ）、０．１ｍＭ ＭＥＭ－ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）で培養した。ｉＰＳ＿ＥＧＦＰ（ＡＡＶＳ１－ＣＡＧ：：ＧＦＰ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ，Ｗｏｌｔｊｅｎ Ｌａｂ（ＣｉＲＡ， Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）はＳｔｅｍＦｉｔ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）培地を用いてラミニンコート｛ｌａｍｉｎｉｎ－５１１ Ｅ８（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ，ｎｉｐｐｉ）｝したプレートで培養した。全ての細胞株は、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した。
【0085】
［Ｃａｓ９活性アッセイ（ＥＧＦＰノックアウトアッセイ）］
ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞は、２４ウェルプレートに播種した（５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ、ヒト ｍｉＲＮＡ－２１－５ｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ネガティブコントロール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， ｏｐｔｉｏｎａｌ）、及びヒトｍｉＲＮＡ－３０２ａ－５ｐ ｍｉｍｉｃ／ネガティブコントロール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ｏｐｔｉｏｎａｌ）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）トランスフェクション試薬を用い、 製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のプロトコルに従って、細胞にトランスフェクションした。フローサイトメトリー分析の前に細胞を、ＣＣＤカメラを備えたＩＸ ８１ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によりキャプチャーした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下にて５分間処理した。次いで、１００μＬの培地を添加し、剥離した細胞を懸濁した。サンプルはＡｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）フローサイトメーターで、ＦＬ－１（５３０／３０ｎｍ）フィルターを用いて分析した。ヒストグラム（ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ）またはドットプロット（ｉＰＳ－ＥＧＦＰ）から、ＥＧＦＰ陰性及び陽性細胞集団をゲーティングした。ＥＧＦＰ陰性細胞集団は、Ｃａｓ９によるＥＧＦ遺伝子ノックアウトが成功したものに対応し、ＥＧＦＰ陽性細胞集団は、Ｃａｓ９によるＥＧＦ遺伝子ノックアウトが失敗したものに対応する。
ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞は、２４ウェルプレートに播種した（５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＡｃｒｌｌＡ４ ｍＲＮＡ、ヒト ｍｉＲＮＡ－２１－５ｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ネガティブコントロール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， ｏｐｔｉｏｎａｌ）、及びヒトｍｉＲＮＡ－３０２ａ－５ｐ ｍｉｍｉｃ／ネガティブコントロール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ｏｐｔｉｏｎａｌ）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）トランスフェクション試薬を用い、 製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のプロトコルに従って、細胞にトランスフェクションした。フローサイトメトリー分析の前に細胞を、ＣＣＤカメラを備えたＩＸ ８１ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によりキャプチャーした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下にて５分間処理した。次いで、１００μＬの培地を添加し、剥離した細胞を懸濁した。サンプルはＡｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）フローサイトメーターで、ＦＬ－１（５３０／３０ｎｍ）フィルターを用いて分析した。ヒストグラム（ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ）またはドットプロット（ｉＰＳ－ＥＧＦＰ）から、ＥＧＦＰ陰性及び陽性細胞集団をゲーティングした。ＥＧＦＰ陰性細胞集団は、Ｃａｓ９によるＥＧＦ遺伝子ノックアウトが成功したものに対応し、ＥＧＦＰ陽性細胞集団は、Ｃａｓ９によるＥＧＦ遺伝子ノックアウトが失敗したものに対応する。
【0086】
［ｄＣａｓ９－ＶＰＲ活性化アッセイ（ｈｍＡＧ１活性化アッセイ）］
ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１細胞は、２４ウェルプレートに播種した（５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。ｄＣａｓ９－ＶＰＲ プラスミド、ｓｇＲＮＡ プラスミド、ＡｃｒｌｌＡ４プラスミド、ヒトｍｉＲ－２１－５ｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ネガティブコントロール（ｏｐｔｉｏｎａｌ）、及びヒトｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ ｍｉｍｉｃ／ネガティブコントロール（ｏｐｔｉｏｎａｌ）はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００ トランスフェクション試薬を用い、製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の指示に従って、細胞にトランスフェクションした。フローサイトメトリー分析の前に細胞をＣｙｔｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりキャプチャーした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下にて５分間処理した。次いで、１００μＬの培地を添加し、剥離した細胞を懸濁した。サンプルはＡｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６フローサイトメーターで、９９％ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎのＦＬ－１（５３０／３０ｎｍ）及びＦＬ－４（６７５／２５ ｎｍ）フィルターを用いて分析した。トランスフェクトされた細胞を決定するために、ｉＲＦＰ６７０陽性細胞集団をゲーティングした。次いで、ｈｍＡＧ１陽性及び陰性細胞集団をゲーティングした。ｈｍＡＧ１陽性細胞集団は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲによるｈｍＡＧ１遺伝子活性化が成功したものに対応し、ｈｍＡＧ１陰性細胞集団は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲによるｈｍＡＧ１遺伝子活性化が失敗したものに対応する。
ＨｅＬａ－ＴＲＥｈｍＡＧ１細胞は、２４ウェルプレートに播種した（５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。ｄＣａｓ９－ＶＰＲ プラスミド、ｓｇＲＮＡ プラスミド、ＡｃｒｌｌＡ４プラスミド、ヒトｍｉＲ－２１－５ｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ネガティブコントロール（ｏｐｔｉｏｎａｌ）、及びヒトｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ ｍｉｍｉｃ／ネガティブコントロール（ｏｐｔｉｏｎａｌ）はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００ トランスフェクション試薬を用い、製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の指示に従って、細胞にトランスフェクションした。フローサイトメトリー分析の前に細胞をＣｙｔｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりキャプチャーした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下にて５分間処理した。次いで、１００μＬの培地を添加し、剥離した細胞を懸濁した。サンプルはＡｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６フローサイトメーターで、９９％ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎのＦＬ－１（５３０／３０ｎｍ）及びＦＬ－４（６７５／２５ ｎｍ）フィルターを用いて分析した。トランスフェクトされた細胞を決定するために、ｉＲＦＰ６７０陽性細胞集団をゲーティングした。次いで、ｈｍＡＧ１陽性及び陰性細胞集団をゲーティングした。ｈｍＡＧ１陽性細胞集団は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲによるｈｍＡＧ１遺伝子活性化が成功したものに対応し、ｈｍＡＧ１陰性細胞集団は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲによるｈｍＡＧ１遺伝子活性化が失敗したものに対応する。
【0087】
［統計分析］
統計分析には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定及びＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ検定を用いた。有意性のレベルは、以下のように示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定及びＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ検定は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて実施した。
統計分析には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定及びＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ検定を用いた。有意性のレベルは、以下のように示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定及びＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ検定は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて実施した。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】