特開2022-113576マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法及び検査キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022113576
(43)【公開日】2022-08-04
(54)【発明の名称】マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法及び検査キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6895 20180101AFI20220728BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220728BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6895 Z
C12Q1/686 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021009899
(22)【出願日】2021-01-25
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(71)【出願人】
【識別番号】521037190
【氏名又は名称】村山 信雄
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(72)【発明者】
【氏名】加納 塁
(72)【発明者】
【氏名】村山 信雄
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA06
4B063QA18
4B063QQ07
4B063QQ44
4B063QQ61
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する感受性を、簡便、かつ、短時間で判定する方法を提供する。
【解決手段】マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、特定の塩基配列を有するプライマー対を用いて、核酸増幅反応を行い、ＥＲＧ１１遺伝子断片を得る工程（ａ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を解析する工程（ｂ）と、前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１の演繹アミノ酸配列が、特定の箇所に変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ）と、を含む、判定方法。
【選択図】なし
【解決手段】マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、特定の塩基配列を有するプライマー対を用いて、核酸増幅反応を行い、ＥＲＧ１１遺伝子断片を得る工程（ａ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を解析する工程（ｂ）と、前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１の演繹アミノ酸配列が、特定の箇所に変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ）と、を含む、判定方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、
対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応の増幅産物としてＥＲＧ１１遺伝子断片を得る工程（ａ）と、
前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を解析する工程（ｂ）と、
前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異及び／又はＡｌａ３０２Ｖａｌ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ）と、を含む、判定方法。
対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応の増幅産物としてＥＲＧ１１遺伝子断片を得る工程（ａ）と、
前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を解析する工程（ｂ）と、
前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異及び／又はＡｌａ３０２Ｖａｌ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ）と、を含む、判定方法。
【請求項2】
マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、
前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ’）、を含む、判定方法。
前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ’）、を含む、判定方法。
【請求項3】
配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー、を含む、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法及び検査キットに関する。
【背景技術】
【0002】
マラセチア感染症は、真菌の一種であるマラセチアが皮膚に感染することによって引き起こされる感染症である。マラセチア感染症の症状としては、皮膚炎及び外耳炎等が挙げられる。皮膚炎では、皮膚の痒みを伴う慢性の脂漏性皮膚炎、脱毛、フケ、臭気の発生等が認められ、外耳炎では、痒み、痛み、耳漏、臭気の発生等が認められる（例えば、非特許文献１を参照）。
【0003】
マラセチア感染症の予防方法及び治療方法として、主に、アゾール系抗真菌薬を含有するシャンプーを用いて皮膚を洗う、内服薬を投与する方法が採用されている（例えば、非特許文献１を参照）。アゾール系抗真菌薬を用いた予防や治療を継続すると、アゾール系抗真菌薬に対する耐性を有する耐性菌が出現する場合があることが報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。
【0004】
マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する感受性試験の方法としては、患部からマラセチアを分離し、培養した後、アゾール系抗真菌薬存在下でマラセチアを培養してアゾール系抗真菌薬に対する感受性を試験する方法が一般的に知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Bond R, Morris DO, Guillot J, Bensignor EJ, Robson D, Mason KV, Kano R, Hill PB. Biology, diagnosis and treatment of Malassezia dermatitis in dogs and cats Clinical Consensus Guidelines of the World Association for Veterinary Dermatology. Vet Dermatol. 2020; 31:27-e4. doi: 10.1111/vde.12809.
【非特許文献2】Kano R, Yokoi S, Kariya N, Oshimo K, Kamata H. Multi-Azole-Resistant strain of Malassezia pachydermatis isolated from a canine Malassezia dermatitis. Med. Mycol. 2019; 57, 346-350.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、上述のような従来のアゾール系抗真菌薬感受性試験の実施には、専門的な知識及び技術が必要である。また、感受性試験の結果を得るために３週間以上の時間を要していた。
そこで、本発明は、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を、簡便に、かつ、短時間で判定可能な、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法、及びマラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性の検査キットを提供することを目的とする。
そこで、本発明は、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を、簡便に、かつ、短時間で判定可能な、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法、及びマラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性の検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応の増幅産物としてＥＲＧ１１遺伝子断片を得る工程（ａ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を解析する工程（ｂ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異及び／又はＡｌａ３０２Ｖａｌ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ）と、を含む、判定方法。
［２］マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ’）、を含む、判定方法。
［３］配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー、を含む、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性の検査キット。
［１］マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応の増幅産物としてＥＲＧ１１遺伝子断片を得る工程（ａ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を解析する工程（ｂ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異及び／又はＡｌａ３０２Ｖａｌ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ）と、を含む、判定方法。
［２］マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ’）、を含む、判定方法。
［３］配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー、を含む、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性の検査キット。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を、簡便、かつ、短時間で判定可能な、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法、及びマラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性の検査キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】マラセチア感染症の患部の皮膚表面の拭い物及びマラセチア分離株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１からなるプライマー及び配列番号２からなるプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドを用いてゲルを染色した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
［判定方法］
一実施形態において、本発明は、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応の増幅産物としてＥＲＧ１１遺伝子断片を得る工程（ａ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を解析する工程（ｂ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異及び／又はＡｌａ３０２Ｖａｌ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ）と、を含む、判定方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応の増幅産物としてＥＲＧ１１遺伝子断片を得る工程（ａ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を解析する工程（ｂ）と、前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異及び／又はＡｌａ３０２Ｖａｌ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ）と、を含む、判定方法を提供する。
【0011】
＜アゾール系抗真菌薬＞
本実施形態の判定方法は、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法である。アゾール系抗真菌薬は、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０に作用して、エルゴステロール合成経路を阻害する。エルゴステロールは真菌細胞膜の重要な構成要素であり、アゾール系抗真菌薬によりエルゴステロール合成が阻害されると、マラセチアの増殖は抑制される。
本実施形態の方法によりマラセチアの耐性が判定されるアゾール系抗真菌薬としては、特に限定されず、例えば、イミダゾール系抗真菌薬、トリアゾール系抗真菌薬等が挙げられる。
イミダゾール系抗真菌薬としては、例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ラノコナゾール等が挙げられる。
トリアゾール系抗真菌薬としては、例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、ホスフルコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール等が挙げられる。
本実施形態の判定方法は、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法である。アゾール系抗真菌薬は、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０に作用して、エルゴステロール合成経路を阻害する。エルゴステロールは真菌細胞膜の重要な構成要素であり、アゾール系抗真菌薬によりエルゴステロール合成が阻害されると、マラセチアの増殖は抑制される。
本実施形態の方法によりマラセチアの耐性が判定されるアゾール系抗真菌薬としては、特に限定されず、例えば、イミダゾール系抗真菌薬、トリアゾール系抗真菌薬等が挙げられる。
イミダゾール系抗真菌薬としては、例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ラノコナゾール等が挙げられる。
トリアゾール系抗真菌薬としては、例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、ホスフルコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール等が挙げられる。
【0012】
（工程（ａ））
工程（ａ）では、対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応の増幅産物としてＥＲＧ１１遺伝子断片を得る。
工程（ａ）では、対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応の増幅産物としてＥＲＧ１１遺伝子断片を得る。
【0013】
＜マラセチア＞
本明細書において、マラセチアとは、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）の真菌を意味する。本実施形態の判定方法において、判定の対象となるマラセチアは、マラセチア感染症を発症させるマラセチア属の真菌であって、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーがアニール可能なＥＲＧ１１遺伝子座を有するマラセチア属真菌であればよい。
対象のマラセチアとしては、例えば、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ．ｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｍ．ｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍ．ｅｑｕｉｎａ、Ｍ．ｆｕｒｆｕｒ、Ｍ．ｇｌｏｂｏｓａ、Ｍ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｍ．ｎａｎａ、Ｍ．ｏｂｔｕｓａ、Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍ．ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｍ．ｒｅｓｔｒｉｃｔａ、Ｍ．ｓｌｏｏｆｆｉａｅ、Ｍ．ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ、Ｍ．ｙａｍａｔｏｅｎｓｉｓ等が挙げられる。
これらの中でも、対象となるマラセチアは、Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓであることが好ましい。
本明細書において、マラセチアとは、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）の真菌を意味する。本実施形態の判定方法において、判定の対象となるマラセチアは、マラセチア感染症を発症させるマラセチア属の真菌であって、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーがアニール可能なＥＲＧ１１遺伝子座を有するマラセチア属真菌であればよい。
対象のマラセチアとしては、例えば、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ．ｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｍ．ｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍ．ｅｑｕｉｎａ、Ｍ．ｆｕｒｆｕｒ、Ｍ．ｇｌｏｂｏｓａ、Ｍ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｍ．ｎａｎａ、Ｍ．ｏｂｔｕｓａ、Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍ．ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｍ．ｒｅｓｔｒｉｃｔａ、Ｍ．ｓｌｏｏｆｆｉａｅ、Ｍ．ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ、Ｍ．ｙａｍａｔｏｅｎｓｉｓ等が挙げられる。
これらの中でも、対象となるマラセチアは、Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓであることが好ましい。
【0014】
マラセチアは、例えば、動物個体に感染したマラセチアであってもよい。
マラセチアが感染する動物としては、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、フェレット、ラット、マウス、モルモット、ハムスター等のペット；ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、トリ等の家畜；及びヒト等が挙げられる。これらの中でも、イヌ、ネコが好ましい。
マラセチアは、マラセチア感染症に罹患した動物の病変部位から採取されたマラセチアであることが好ましい。病変部位としては、マラセチア皮膚炎を発症している皮膚、マラセチア外耳炎を発症している外耳等が挙げられる。
マラセチアが感染する動物としては、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、フェレット、ラット、マウス、モルモット、ハムスター等のペット；ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、トリ等の家畜；及びヒト等が挙げられる。これらの中でも、イヌ、ネコが好ましい。
マラセチアは、マラセチア感染症に罹患した動物の病変部位から採取されたマラセチアであることが好ましい。病変部位としては、マラセチア皮膚炎を発症している皮膚、マラセチア外耳炎を発症している外耳等が挙げられる。
【0015】
工程（ａ）において、核酸増幅反応の鋳型となるマラセチアのゲノムＤＮＡは、核酸増幅反応が可能であれば、精製されたものであってもよく、精製されていないものであってもよい。マラセチアのゲノムＤＮＡは、対象のマラセチアから予め調製したものであってもよい。ゲノムＤＮＡの調製方法は、当業者が適宜選択することができる。
例えば、マラセチア菌体を含む耳垢、落屑等を緩衝液等に浸漬した後、フェノール抽出により浸漬後の緩衝液からタンパク質を除去し、続いて、エタノール沈殿を行うことにより、マラセチアのゲノムＤＮＡを得てもよい。
マラセチアのゲノムＤＮＡは、市販されているＤＮＡ分離キット等を用いて、マラセチア菌体を含む耳垢、落屑等から得られたものであってもよい。
あるいは、遺伝子断片を増幅させる反応溶液中にマラセチアを直接入れて、反応溶液中で溶菌したマラセチアから溶出したゲノムＤＮＡを核酸増幅反応の鋳型として用いてもよい。
例えば、マラセチア菌体を含む耳垢、落屑等を緩衝液等に浸漬した後、フェノール抽出により浸漬後の緩衝液からタンパク質を除去し、続いて、エタノール沈殿を行うことにより、マラセチアのゲノムＤＮＡを得てもよい。
マラセチアのゲノムＤＮＡは、市販されているＤＮＡ分離キット等を用いて、マラセチア菌体を含む耳垢、落屑等から得られたものであってもよい。
あるいは、遺伝子断片を増幅させる反応溶液中にマラセチアを直接入れて、反応溶液中で溶菌したマラセチアから溶出したゲノムＤＮＡを核酸増幅反応の鋳型として用いてもよい。
【0016】
＜ＥＲＧ１１遺伝子＞
ＥＲＧ１１は、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０の一種であり、ラノステロールを脱メチル化して４，４’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｏｌｅｓｔａ－８，１４，２４－ｔｒｉｅｎｅ－３－ｂｅｔａ－ｏｌを生成する反応を触媒する活性を有する。真菌細胞においては、４，４’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｏｌｅｓｔａ－８，１４，２４－ｔｒｉｅｎｅ－３－ｂｅｔａ－ｏｌは、その後、チモステロールを経て、細胞膜の構成成分のひとつであるエルゴステロールに変換される。
ＥＲＧ１１は、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０の一種であり、ラノステロールを脱メチル化して４，４’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｏｌｅｓｔａ－８，１４，２４－ｔｒｉｅｎｅ－３－ｂｅｔａ－ｏｌを生成する反応を触媒する活性を有する。真菌細胞においては、４，４’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｏｌｅｓｔａ－８，１４，２４－ｔｒｉｅｎｅ－３－ｂｅｔａ－ｏｌは、その後、チモステロールを経て、細胞膜の構成成分のひとつであるエルゴステロールに変換される。
【0017】
例えば、Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示される配列である。配列番号３に示される配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ ＮＷ＿０１７２５３１４１．１の、５３９３６２－５４０９８４に対応する配列である。
ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１遺伝子は、イントロンを有さない。したがって、ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の塩基配列は、配列番号３に示される配列である。
ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１遺伝子は、イントロンを有さない。したがって、ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の塩基配列は、配列番号３に示される配列である。
【0018】
＜核酸増幅反応＞
対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応は、ＰＣＲによって行うことが好ましい。
ＰＣＲにおいては、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、「プライマー１」ともいう）及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、「プライマー２」ともいう）を用いる。プライマー１はフォワードプライマーであり、プライマー２はリバースプライマーである。それぞれの配列は以下の通りである。
配列番号１： ５’－ＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＣＧＧＡＣＣＡＣ－３’
配列番号２： ５’－ＴＧＴＡＣＡＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣ－３’
ＰＣＲの反応溶液は、当業者に公知の反応溶液であってもよい。ＰＣＲ反応溶液は、例えば、プライマー１、プライマー２及び鋳型ＤＮＡに加えて、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等）、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、及びマグネシウム塩（ＭｇＣｌ２等）等を含むことができる。
例えば、鋳型ＤＮＡがＭ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓのゲノムＤＮＡである場合、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、約２２０塩基対のＤＮＡ断片が増幅される。
対象のマラセチアのゲノムＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応は、ＰＣＲによって行うことが好ましい。
ＰＣＲにおいては、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、「プライマー１」ともいう）及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、「プライマー２」ともいう）を用いる。プライマー１はフォワードプライマーであり、プライマー２はリバースプライマーである。それぞれの配列は以下の通りである。
配列番号１： ５’－ＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＣＧＧＡＣＣＡＣ－３’
配列番号２： ５’－ＴＧＴＡＣＡＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣ－３’
ＰＣＲの反応溶液は、当業者に公知の反応溶液であってもよい。ＰＣＲ反応溶液は、例えば、プライマー１、プライマー２及び鋳型ＤＮＡに加えて、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等）、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、及びマグネシウム塩（ＭｇＣｌ２等）等を含むことができる。
例えば、鋳型ＤＮＡがＭ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓのゲノムＤＮＡである場合、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、約２２０塩基対のＤＮＡ断片が増幅される。
【0019】
ＰＣＲの条件は、ＥＲＧ１１遺伝子断片が増幅される条件である限り、特に限定されない。
ＰＣＲでは、通常、変性ステップ、アニーリングステップ、及びＤＮＡ伸長ステップをこの順で複数回行うことにより、ＤＮＡ断片を増幅する。
ＰＣＲのサイクル数は、配列解析に十分な量のＥＲＧ１１遺伝子断片を得る観点から、２０回以上が好ましく、２５回以上が好ましく、２８回以上がより好ましい。サイクル数は、標的のＥＲＧ１１遺伝子断片以外の領域が増幅することを抑制する観点から、４５回以下が好ましく、４０回以下がより好ましく、３５回以下が更に好ましい。
ＰＣＲでは、通常、変性ステップ、アニーリングステップ、及びＤＮＡ伸長ステップをこの順で複数回行うことにより、ＤＮＡ断片を増幅する。
ＰＣＲのサイクル数は、配列解析に十分な量のＥＲＧ１１遺伝子断片を得る観点から、２０回以上が好ましく、２５回以上が好ましく、２８回以上がより好ましい。サイクル数は、標的のＥＲＧ１１遺伝子断片以外の領域が増幅することを抑制する観点から、４５回以下が好ましく、４０回以下がより好ましく、３５回以下が更に好ましい。
【0020】
変性ステップでは、ＰＣＲの溶液中に含まれる２本鎖ＤＮＡが、変性して１本鎖ＤＮＡに解離する。
変性ステップの温度は、２本鎖ＤＮＡを十分に変性させる観点から、９０℃以上が好ましく、９２℃以上がより好ましく、９４℃以上が更に好ましい。
変性ステップの温度は、ＰＣＲ溶液中のＤＮＡポリメラーゼの不活化を抑制する観点から、９９℃以下が好ましく、９８℃以下がより好ましく、９６℃以下が更に好ましい。
変性ステップの時間は、２本鎖ＤＮＡを十分に変性させる観点から、５秒以上が好ましく、１０秒以上がより好ましく、２０秒以上が更に好ましい。
変性ステップの時間は、ＰＣＲ溶液中のＤＮＡポリメラーゼの不活化を抑制する観点から、６０秒以下が好ましく、４０秒以下がより好ましく、３０秒以下が更に好ましい。
変性ステップの温度は、２本鎖ＤＮＡを十分に変性させる観点から、９０℃以上が好ましく、９２℃以上がより好ましく、９４℃以上が更に好ましい。
変性ステップの温度は、ＰＣＲ溶液中のＤＮＡポリメラーゼの不活化を抑制する観点から、９９℃以下が好ましく、９８℃以下がより好ましく、９６℃以下が更に好ましい。
変性ステップの時間は、２本鎖ＤＮＡを十分に変性させる観点から、５秒以上が好ましく、１０秒以上がより好ましく、２０秒以上が更に好ましい。
変性ステップの時間は、ＰＣＲ溶液中のＤＮＡポリメラーゼの不活化を抑制する観点から、６０秒以下が好ましく、４０秒以下がより好ましく、３０秒以下が更に好ましい。
【0021】
アニーリングステップでは、プライマー１及びプライマー２が、１本鎖状のＤＮＡ（マラセチアのゲノムＤＮＡ又は増幅されたＥＲＧ１１遺伝子断片）にアニールする。
アニーリングステップの温度は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、適宜設定することができる。通常、アニーリングステップの温度は、プライマーのＴｍよりも１～５℃程度低い温度に設定する。アニーリングステップの温度が高すぎると、プライマーが鋳型ＤＮＡにアニールすることができない。一方、アニーリングステップの温度が低すぎると、標的領域以外の領域に非特異的にアニールする確率が高くなる。
プライマー１のＴｍは６３．４℃であり、プライマー２のＴｍは６２．８℃であることから、アニーリングステップの温度は、６３℃以下が好ましく、６１℃以下がより好ましい。
アニーリングステップステップの温度は、プライマー１及びプライマー２がＥＲＧ１１遺伝子以外の領域にアニールすることを抑制する観点から、５０℃以上が好ましく、５５℃以上がより好ましく、５８℃以上が更に好ましい。
アニーリングステップの時間は、通常、１０～１００秒とすることができ、２０～６０秒が好ましく、２５～４０秒がより好ましい。
アニーリングステップの温度は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、適宜設定することができる。通常、アニーリングステップの温度は、プライマーのＴｍよりも１～５℃程度低い温度に設定する。アニーリングステップの温度が高すぎると、プライマーが鋳型ＤＮＡにアニールすることができない。一方、アニーリングステップの温度が低すぎると、標的領域以外の領域に非特異的にアニールする確率が高くなる。
プライマー１のＴｍは６３．４℃であり、プライマー２のＴｍは６２．８℃であることから、アニーリングステップの温度は、６３℃以下が好ましく、６１℃以下がより好ましい。
アニーリングステップステップの温度は、プライマー１及びプライマー２がＥＲＧ１１遺伝子以外の領域にアニールすることを抑制する観点から、５０℃以上が好ましく、５５℃以上がより好ましく、５８℃以上が更に好ましい。
アニーリングステップの時間は、通常、１０～１００秒とすることができ、２０～６０秒が好ましく、２５～４０秒がより好ましい。
【0022】
ＤＮＡ伸長ステップでは、１本鎖状のＤＮＡ（マラセチアのゲノムＤＮＡ又は増幅されたＥＲＧ１１遺伝子断片）にアニールしたプライマーの３’端末端に連続的にｄＮＴＰが結合し、ＤＮＡが伸長する。
伸張ステップの温度及び時間は、ＰＣＲ溶液中のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの伸長が十分に進行する限り特に限定されず、ＰＣＲで用いるＤＮＡポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定することができる。
伸張ステップの温度は、ＤＮＡポリメラーゼの最適温度付近で行うことが好ましく、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼである場合、６５～７５℃が好ましく、６８～７３℃がより好ましく、７１～７３℃が更に好ましい。
伸張ステップの時間は、ＤＮＡの伸長を十分にする観点から、１０～１５０秒が好ましく、１５～１２０秒がより好ましく、２０～９０秒が更に好ましい。
伸張ステップの温度及び時間は、ＰＣＲ溶液中のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの伸長が十分に進行する限り特に限定されず、ＰＣＲで用いるＤＮＡポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定することができる。
伸張ステップの温度は、ＤＮＡポリメラーゼの最適温度付近で行うことが好ましく、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼである場合、６５～７５℃が好ましく、６８～７３℃がより好ましく、７１～７３℃が更に好ましい。
伸張ステップの時間は、ＤＮＡの伸長を十分にする観点から、１０～１５０秒が好ましく、１５～１２０秒がより好ましく、２０～９０秒が更に好ましい。
【0023】
工程（ａ）により、核酸増幅反応の増幅産物として、ＥＲＧ１１遺伝子断片を得ることができる。
【0024】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、ＥＲＧ１１遺伝子断片のＤＮＡ配列を解析する。ＤＮＡ配列の解析方法は特に限定されず、公知の方法で行うことができる。ＤＮＡ配列の解析は、ＤＮＡシーケンサーにより行うことができ、ＤＮＡシーケンサーとしては、例えば、サンガー法、ジデオキシ法等を適用したものであってもよい。より具体的には、ダイターミネーター法であってもよい。
工程（ｂ）により、工程（ａ）で得たＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を得ることができる。
工程（ｂ）では、ＥＲＧ１１遺伝子断片のＤＮＡ配列を解析する。ＤＮＡ配列の解析方法は特に限定されず、公知の方法で行うことができる。ＤＮＡ配列の解析は、ＤＮＡシーケンサーにより行うことができ、ＤＮＡシーケンサーとしては、例えば、サンガー法、ジデオキシ法等を適用したものであってもよい。より具体的には、ダイターミネーター法であってもよい。
工程（ｂ）により、工程（ａ）で得たＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を得ることができる。
【0025】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ｂ）のＤＮＡ配列の解析結果に基づいて、マラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有するか否かを判定する。
工程（ｃ）では、工程（ｂ）のＤＮＡ配列の解析結果に基づいて、マラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有するか否かを判定する。
【0026】
アゾール系抗真菌薬に耐性を有するマラセチアのＥＲＧ１１は、アゾール系抗真菌薬によるＥＲＧ１１活性の阻害を受けなくなるような変異を有すると考えられる。そのような変異としては、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ及びＡｌａ３０２Ｖａｌが挙げられる。そこで、工程（ｃ）では、前記工程（ｂ）で得られたＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列の演繹アミノ酸配列が、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ及び／又はＡｌａ３０２Ｖａｌの変異を有している場合に、対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する。
【0027】
工程（ｃ）において、基準となる野生型ＥＲＧ１１のアミノ酸配列としては、配列番号４に示されるアミノ酸配列を用いる。配列番号４に示されるアミノ酸配列は、Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１のアミノ酸配列である。
「ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有する」とは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列の演繹アミノ酸配列をアライメントしたときに、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第３０２番目のＡｌａに対応するアミノ酸が、前記演繹アミノ酸配列においてＴｈｒに置換されていることをいう。
「ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｖａｌ変異を有する」とは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列の演繹アミノ酸配列をアライメントしたときに、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第３０２番目のＡｌａに対応するアミノ酸が、前記演繹アミノ酸配列においてＶａｌに置換されていることをいう。
アライメントは、公知の方法で行うことができ、例えば、ｃｌｕｓｔａｌＷ等のアライメントプログラムを用いることができる。
「ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有する」とは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列の演繹アミノ酸配列をアライメントしたときに、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第３０２番目のＡｌａに対応するアミノ酸が、前記演繹アミノ酸配列においてＴｈｒに置換されていることをいう。
「ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列から求められる前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｖａｌ変異を有する」とは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列の演繹アミノ酸配列をアライメントしたときに、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第３０２番目のＡｌａに対応するアミノ酸が、前記演繹アミノ酸配列においてＶａｌに置換されていることをいう。
アライメントは、公知の方法で行うことができ、例えば、ｃｌｕｓｔａｌＷ等のアライメントプログラムを用いることができる。
【0028】
Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示される配列である。
配列番号３に示されるＥＲＧ１１遺伝子は、イントロンを有さない。ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の塩基配列は、配列番号３に示される配列である。
ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１の演繹アミノ酸配列は、配列番号４に示される配列である。これは、配列番号３に示される塩基配列から演繹されるアミノ酸配列であり、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ ＸＰ＿０１７９９１９７７．１に示される配列である。
配列番号３に示されるＥＲＧ１１遺伝子は、イントロンを有さない。ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の塩基配列は、配列番号３に示される配列である。
ＣＢＳ１８７９株のＥＲＧ１１の演繹アミノ酸配列は、配列番号４に示される配列である。これは、配列番号３に示される塩基配列から演繹されるアミノ酸配列であり、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ ＸＰ＿０１７９９１９７７．１に示される配列である。
【0029】
配列番号３に示される塩基配列の９０４番目のグアニンが、アデニンに変異したＭ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ変異株は、アゾール系抗真菌薬に耐性を有する。
この変異株においては、配列番号４に示されるＥＲＧ１１のアミノ酸配列の第３０２番目のアミノ酸であるアラニンが、スレオニンに変異している。
この変異株においては、配列番号４に示されるＥＲＧ１１のアミノ酸配列の第３０２番目のアミノ酸であるアラニンが、スレオニンに変異している。
【0030】
配列番号３に示される塩基配列の９０５番目のシトシンが、チミンに変異したＭ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ変異株は、アゾール系抗真菌薬に耐性を有する。
この変異株においては、配列番号４に示されるＥＲＧ１１のアミノ配列の第３０２番目のアミノ酸であるアラニンが、バリンに変異している。
この変異株においては、配列番号４に示されるＥＲＧ１１のアミノ配列の第３０２番目のアミノ酸であるアラニンが、バリンに変異している。
【0031】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得られた対象のマラセチアのＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を、配列番号３に示される塩基配列に対してアライメントし、配列番号３に示される塩基配列の第３０２番目のＡｌａをコードするコドン（９０４－９０６の「ＧＣＡ」）に対応するコドンの変異を確認することで、対象のマラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定してもよい。
【0032】
工程（ｂ）のＤＮＡ配列の解析結果から、対象マラセチアのＥＲＧ１１遺伝子において、配列番号３に示される塩基配列の９０４番目のグアニンに対応する塩基が、アデニンに変異していた場合、その対象マラセチアは、アゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定することができる。
対象マラセチアのＥＲＧ１１遺伝子において、配列番号３に示される塩基配列の９０５番目のシトシンに対応する塩基が、チミンに変異していた場合、その対象マラセチアは、アゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定することができる。
対象のマラセチアのＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列における、配列番号３に示される塩基配列の９０４番目、９０５番目の塩基に対応する塩基は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ等のアラインメントプログラムを用いて、対象塩基配列と、配列番号３の塩基配列をアラインメントすること等により特定することができる。
対象マラセチアのＥＲＧ１１遺伝子において、配列番号３に示される塩基配列の９０５番目のシトシンに対応する塩基が、チミンに変異していた場合、その対象マラセチアは、アゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定することができる。
対象のマラセチアのＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列における、配列番号３に示される塩基配列の９０４番目、９０５番目の塩基に対応する塩基は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ等のアラインメントプログラムを用いて、対象塩基配列と、配列番号３の塩基配列をアラインメントすること等により特定することができる。
【0033】
本実施形態の判定方法によれば、プライマー１及びプライマー２を用いて対象のマラセチアのＥＲＧ１１遺伝子断片を増幅し、塩基配列解析を行うことにより、対象のマラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定することができるため、マラセチアの分離、培養、及び感受性試験を行う必要がない。そのため、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する感受性を、簡便、かつ、短時間で判定することができる。また、プライマー１及びプライマー２を用いることにより、アゾール系抗真菌薬耐性に関与する変異を含む領域のみを特異的に増幅することができる。
薬剤を用いてマラセチア感染症を治療する前に、本実施形態の判定方法により、当該マラセチア感染症の病変に存在するマラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する感受性を判定することにより、より迅速、且つ、的確に、治療に用いる薬剤を選択することができる。
薬剤を用いてマラセチア感染症を治療する前に、本実施形態の判定方法により、当該マラセチア感染症の病変に存在するマラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する感受性を判定することにより、より迅速、且つ、的確に、治療に用いる薬剤を選択することができる。
【0034】
また、一実施形態において、本発明は、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法であって、前記対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する工程（ｃ’）と、を含む、判定方法を提供する。
アゾール系抗真菌薬としては、上述したものが挙げられる。
判定の対象となるマラセチアとしては、上述のマラセチア属の種が挙げられる。
アゾール系抗真菌薬としては、上述したものが挙げられる。
判定の対象となるマラセチアとしては、上述のマラセチア属の種が挙げられる。
【0035】
（工程（ｃ’））
工程（ｃ’）では、対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する。
工程（ｃ’）では、対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有している場合に、前記対象のマラセチアはアゾール系抗真菌薬に耐性を有すると判定する。
【0036】
対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有しているか否かを確認する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができる。
【0037】
例えば、対象のマラセチアにおいて、ＥＲＧ１１をコードする遺伝子又は当該遺伝子から転写されたｍＲＮＡの塩基配列を解析し、配列番号３に示される塩基配列の９０４番目のグアニンに対応する塩基が、アデニンに変異されていた場合、当該ＥＲＧ１１は配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有している、と判定することができる。
【0038】
解析対象を対象のマラセチアのゲノムＤＮＡとする場合、ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３に示される塩基配列の９０４番目に対応する塩基を含む領域（以下、「Ｇ９０４Ａ変異領域」ともいう）の核酸増幅反応を行ってＥＲＧ１１遺伝子断片を取得し、上記工程（ｂ）と同様の方法で前記ＥＲＧ１１遺伝子断片の塩基配列を解析することができる。ゲノムＤＮＡを鋳型とした核酸増幅反応は、Ｇ９０４Ａ変異領域に特異的なプライマーを用いて、公知の方法により行うことができる。公知の核酸増幅法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも、核酸増幅法としては、ＰＣＲ法が好ましい。
【0039】
Ｇ９０４Ａ変異領域に特異的なプライマーは、対象のマラセチアのＧ９０４Ａ変異領域を増幅可能なプライマーであれば、特に限定されず、公知の方法により設計することができる。プライマーは、例えば、１８～３０塩基程度の長さとすることができ、４０～６０％程度のＧＣ含量に設計することが好ましい。プライマーにより増幅されるＥＲＧ１１遺伝子断片のサイズは、特に限定されないが、塩基配列解析の効率の観点から、３０～２０００塩基であることが好ましく、５０～１０００塩基であることがより好ましく、１００～５００塩基であることが更に好ましい。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３等のプライマー設計用ソフトウェアを用いて設計してもよい。
【0040】
核酸増幅反応をＰＣＲにより行う場合、プライマーとしては、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを用いることが好ましい。この場合、上記工程（ａ）と同様に、核酸増幅反応を行うことができる。
【0041】
解析対象を対象のマラセチアのｍＲＮＡとする場合、対象のマラセチアからＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、当該ｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行うことができる。対象のマラセチアからのＲＮＡの抽出は、公知の方法で行うことができ、市販のＲＮＡ抽出試薬を用いてもよい。ｃＤＮＡを鋳型とした核酸増幅反応は、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とする場合と同様の方法で行うことができる。
【0042】
核酸増幅反応により取得したＧ９０４Ａ変異領域を含む核酸断片は、上記工程（ｂ）と同様の方法で、塩基配列の解析を行い、塩基配列を取得することができる。取得した塩基配列を、配列番号３の塩基配列に対してアライメントし、配列番号３で示される塩基配列の９０４番目のグアニンに対応する塩基がアデニンとなっている場合（以下、「Ｇ９０４Ａ変異」ともいう）に、対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有している、と判定することができる。
【0043】
本工程は、対象のマラセチアのＥＲＧ１１のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異を有しているか否かを判定することができれば、いかなる方法を用いてもよい。例えば、次世代シーケンサーを用いて、対象のマラセチアのゲノムＤＮＡの塩基配列解析を行い、Ｇ９０４Ａ変異領域の塩基配列を取得してもよい。次世代シーケンサーとは、数千から数百万のＤＮＡを同時並列的に配列決定するシーケンサーである。次世代シークエンサーは、イルミナ社等から市販されているものを公知のものを用いることができる。
【0044】
また、本工程では、Ｇ９０４Ａ変異領域に特異的にハイブリダイズするＴａｑｍａｎ（登録商標） ｐｒｏｂｅを設計し、リアルタイムＰＣＲを行ってもよい。Ｇ９０４Ａ変異が存在している場合には、その存在量に応じてシグナルが検出される。そのため、シグナルが検出された場合には、対象のマラセチアはＧ９０４Ａ変異（Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異）を有していると判定することができる。
あるいは、Ｇ９０４Ａ変異領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーション又はノーザンハイブリダイゼーション等を行うことにより、Ｇ９０４Ａ変異の有無を検出してもよい。
あるいは、Ｇ９０４Ａ変異領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーション又はノーザンハイブリダイゼーション等を行うことにより、Ｇ９０４Ａ変異の有無を検出してもよい。
【0045】
本実施形態の判定方法によれば、対象のマラセチアのＥＲＧ１１をコードする核酸の塩基配列を解析することにより、対象のマラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定することができるため、マラセチアの分離、培養、及び感受性試験を行う必要がない。そのため、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する感受性を、簡便、かつ、短時間で判定することができる。
薬剤を用いてマラセチアを治療する前に、本実施形態の判定方法により、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する感受性を判定することにより、より迅速、且つ、的確に、治療に用いる薬剤を選択することができる。
薬剤を用いてマラセチアを治療する前に、本実施形態の判定方法により、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する感受性を判定することにより、より迅速、且つ、的確に、治療に用いる薬剤を選択することができる。
【0046】
［検査キット］
一実施形態において、本発明は、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー（プライマー１）、及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー（プライマー２）、を含む、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性の検査キットを提供する。
一実施形態において、本発明は、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー（プライマー１）、及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー（プライマー２）、を含む、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性の検査キットを提供する。
【0047】
プライマー１及びプライマー２は、配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列に基づき、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成法により合成することができる。
本実施形態の検査キットは、プライマー１及びプライマー２に加えて、核酸増幅反応に必要な試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、マグネシウム塩）、塩基配列解析に必要な試薬（シーケンス用プライマー）、バッファー類等を含んでいてもよい。
本実施形態の検査キットは、プライマー１及びプライマー２に加えて、核酸増幅反応に必要な試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、マグネシウム塩）、塩基配列解析に必要な試薬（シーケンス用プライマー）、バッファー類等を含んでいてもよい。
【0048】
本実施形態の検査キットは、上記実施形態の判定方法に使用することができる。
【実施例0049】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0050】
［実験例１］
（プライマーの検討）
複数種類のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マラセチアのＥＲＧ１１遺伝子断片を増幅し、増幅産物の塩基配列解析を行って、適切なプライマーを検討した。
（プライマーの検討）
複数種類のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マラセチアのＥＲＧ１１遺伝子断片を増幅し、増幅産物の塩基配列解析を行って、適切なプライマーを検討した。
【0051】
まず、マラセチア株を、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ’ｓ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ培地に播種し、３２℃で７日間、培養した。培養により得られた１～２ｍｇの菌体を、溶菌緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ ＳＤＳ）に入れて、溶菌緩衝液を沸騰させて、溶菌させた。得られた溶菌液に対し、フェノール・クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿を行い、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解させた。
【0052】
続いて、１．５ Ｕｎｉｔ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ Ｒ００１Ｂ）、１００～２００ｎｇのマラセチアのゲノムＤＮＡを含み、最終濃度が、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．９）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）となるように、３０μＬのＰＣＲの反応溶液を調製した。
上記のように調製した反応溶液に、以下のようにプライマーを添加して、反応溶液１～４を準備した。下記プライマー１～２、５～１０は、アクセッション番号ＡＢ９７１８６４．１としてＧｅｎＢａｎｋに登録される「Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ ＥＲＧ１１ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ １４－ａｌｐｈａ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ， ｓｔｒａｉｎ： ＣＢＳ １８７９」の塩基配列情報から設計したプライマーである。各反応溶液に添加したプライマーセットは、配列番号３に示される塩基配列の９０４番目及び９０５番目の塩基を含む領域が増幅されるように設定した。
反応溶液中のプライマーの最終濃度は、それぞれ、１μＭとした。
上記のように調製した反応溶液に、以下のようにプライマーを添加して、反応溶液１～４を準備した。下記プライマー１～２、５～１０は、アクセッション番号ＡＢ９７１８６４．１としてＧｅｎＢａｎｋに登録される「Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ ＥＲＧ１１ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ １４－ａｌｐｈａ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ， ｓｔｒａｉｎ： ＣＢＳ １８７９」の塩基配列情報から設計したプライマーである。各反応溶液に添加したプライマーセットは、配列番号３に示される塩基配列の９０４番目及び９０５番目の塩基を含む領域が増幅されるように設定した。
反応溶液中のプライマーの最終濃度は、それぞれ、１μＭとした。
【0053】
反応液１：
配列番号１（プライマー１）：５’－ＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＣＧＧＡＣＣＡＣ－３’
配列番号２（プライマー２）：５’－ＴＧＴＡＣＡＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣ－３’
反応液２：
配列番号５（プライマー５）：５’－ＴＣＡＡＧＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＧＡＣＧ－３’
配列番号６（プライマー６）：５’－ＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＴＧＧＡ－３’
反応液３：
配列番号７（プライマー７）：５’－ＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＧＴＧＧＴＣ－３’
配列番号８（プライマー８）：５’－ＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＴＧＧ－３’
反応液４：
配列番号９（プライマー９）：５’－ＧＣＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧ－３’
配列番号１０（プライマー１０）：５’－ＧＧＴＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＧ－３’
配列番号１（プライマー１）：５’－ＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＣＧＧＡＣＣＡＣ－３’
配列番号２（プライマー２）：５’－ＴＧＴＡＣＡＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣ－３’
反応液２：
配列番号５（プライマー５）：５’－ＴＣＡＡＧＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＧＡＣＧ－３’
配列番号６（プライマー６）：５’－ＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＴＧＧＡ－３’
反応液３：
配列番号７（プライマー７）：５’－ＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＧＴＧＧＴＣ－３’
配列番号８（プライマー８）：５’－ＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＴＧＧ－３’
反応液４：
配列番号９（プライマー９）：５’－ＧＣＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧ－３’
配列番号１０（プライマー１０）：５’－ＧＧＴＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＧ－３’
【0054】
ＰＣＲは、９５℃で１分間加熱し、サイクル（９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒）を３０回繰り返した後、７２℃で２分間保持し、標的領域を増幅した。
【0055】
ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、ＰＣＲにより得られた増幅産物を精製した。
精製したＤＮＡを鋳型として、各プライマーを用いてシーケンシング反応を行った。シーケンシング反応では、反応溶液１の増幅産物についてはプライマー１又はプライマー２を用い、反応溶液２の増幅産物についてはプライマー５又はプライマー６を用い、反応溶液３の増幅産物についてはプライマー７又はプライマー８を用い、反応溶液４の増幅産物についてはプライマー９又はプライマー１０を用いた。
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）にて塩基配列を解析した。
精製したＤＮＡを鋳型として、各プライマーを用いてシーケンシング反応を行った。シーケンシング反応では、反応溶液１の増幅産物についてはプライマー１又はプライマー２を用い、反応溶液２の増幅産物についてはプライマー５又はプライマー６を用い、反応溶液３の増幅産物についてはプライマー７又はプライマー８を用い、反応溶液４の増幅産物についてはプライマー９又はプライマー１０を用いた。
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）にて塩基配列を解析した。
【0056】
反応溶液１～４のＰＣＲ反応により得られた増幅産物において、ダイレクトシーケンスにより塩基配列を決定することができたのは、反応溶液１の増幅産物のみであった。反応溶液１の増幅産物から決定された塩基配列は、プライマー１及びプライマー２による増幅産物として予測される塩基配列と一致していた。
反応溶液２～４の増幅産物の塩基配列の解析結果は、ノイズが多く、塩基配列を決定することはできなかった。これは、反応溶液２～４のＰＣＲ反応では、ＥＲＧ１１遺伝子断片以外の領域も増幅されてしまったためであると推測された。
以上の結果から、プライマー１及びプライマー２を、マラセチアのＥＲＧ１１遺伝子におけるＧ９０４Ａ変異（Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異）又はＣ９０５Ｔ変異（Ａｌａ３０２Ｖａｌ変異）を検出するためのプライマーセットとして選択した。
反応溶液２～４の増幅産物の塩基配列の解析結果は、ノイズが多く、塩基配列を決定することはできなかった。これは、反応溶液２～４のＰＣＲ反応では、ＥＲＧ１１遺伝子断片以外の領域も増幅されてしまったためであると推測された。
以上の結果から、プライマー１及びプライマー２を、マラセチアのＥＲＧ１１遺伝子におけるＧ９０４Ａ変異（Ａｌａ３０２Ｔｈｒ変異）又はＣ９０５Ｔ変異（Ａｌａ３０２Ｖａｌ変異）を検出するためのプライマーセットとして選択した。
【0057】
［実験例２］
マラセチア感染症を発症したイヌの皮膚表面の拭い物から得られた８株のマラセチア株（＃１～＃８）について、Ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ法により、イトラコナゾール、ミコナゾールに対する感受性を解析した。
マラセチア感染症を発症したイヌの皮膚表面の拭い物から得られた８株のマラセチア株（＃１～＃８）について、Ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ法により、イトラコナゾール、ミコナゾールに対する感受性を解析した。
【0058】
８株のマラセチアを、それぞれ、実験例１と同一の方法で培養した。得られた菌体を、濁度が１．０となるように、０．９％ ＮａＣｌの滅菌溶液に懸濁した。
感受性の解析は、１％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含有するＳａｂｏｕｒａｕｄ’ｓ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ培地を用いて、３２℃で７２時間培養したこと以外は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍ２７－Ａ２のプロトコールに従って行った。
感受性の解析は、１％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含有するＳａｂｏｕｒａｕｄ’ｓ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ培地を用いて、３２℃で７２時間培養したこと以外は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍ２７－Ａ２のプロトコールに従って行った。
【0059】
感受性解析の結果得られた各マラセチア株の最小発育阻止濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ＭＩＣ）を表１に示す。イトラコナゾールについてはＭＩＣが１ｍｇ／Ｌ以上である場合、ミコナゾールについてはＭＩＣが３２ｍｇ／Ｌ以上である場合に、耐性であると判定することができる（Peano A, Johnson E, Chiavassa E et al. J Fungi (Basel). 2020; 25:6(2):93.）。
表１に示すように、試験した７株はいずれも、イトラコナゾールのＭＩＣが１ｍｇ／Ｌ以上であり、且つミコナゾールのＭＩＣが３２ｍｇ／Ｌ以上であった。したがって、これらのマラセチア株は、両薬剤に耐性であると判定された。残り１株はトラコナゾールのＭＩＣが０．２５ｍｇ／Ｌであり、且つミコナゾールのＭＩＣが８ｍｇ／Ｌであった。したがって、このマラセチア株は、両薬剤に感受性であると判定された。
表１に示すように、試験した７株はいずれも、イトラコナゾールのＭＩＣが１ｍｇ／Ｌ以上であり、且つミコナゾールのＭＩＣが３２ｍｇ／Ｌ以上であった。したがって、これらのマラセチア株は、両薬剤に耐性であると判定された。残り１株はトラコナゾールのＭＩＣが０．２５ｍｇ／Ｌであり、且つミコナゾールのＭＩＣが８ｍｇ／Ｌであった。したがって、このマラセチア株は、両薬剤に感受性であると判定された。
【0060】
［実験例３］
実験例２で用いた８株のマラセチア株（＃１～＃８）について、プライマー１及びプライマー２を用いてＰＣＲを行い、ＥＲＧ１１遺伝子の配列を解析した。
実験例２で用いた８株のマラセチア株（＃１～＃８）について、プライマー１及びプライマー２を用いてＰＣＲを行い、ＥＲＧ１１遺伝子の配列を解析した。
【0061】
８株のマラセチア株を、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ’ｓ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ培地に播種し、３２℃で７日間、培養した。培養により得られた１～２ｍｇの菌体を、溶菌緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ ＳＤＳ）に入れて、溶菌緩衝液を沸騰させて、溶菌させた。得られた溶菌液に対し、フェノール・クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿を行い、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解させた。
【0062】
次に示す手順により、ＰＣＲによりＥＲＧ１１遺伝子断片を増幅し、増幅産物の塩基配列解析を行った。
まず、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ ｇｅｌａｔｉｎ、２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、１．０ Ｕｎｉｔ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）、１μＭプライマー１、１μＭのプライマー２を含む、８個の３０μＬの反応溶液を用意した。また、反応溶液には、それぞれ、各マラセチア株から得られた１００～２００ｎｇのＤＮＡを添加した。
まず、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ ｇｅｌａｔｉｎ、２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、１．０ Ｕｎｉｔ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）、１μＭプライマー１、１μＭのプライマー２を含む、８個の３０μＬの反応溶液を用意した。また、反応溶液には、それぞれ、各マラセチア株から得られた１００～２００ｎｇのＤＮＡを添加した。
【0063】
得られた８種類の増幅産物を、２％アガロースゲルを用いて電気泳動により展開し、エチジウムブロマイドを用いてゲルを染色した。結果を図１に示す。図１中、ＭはＤＮＡマーカーを示し、＃１～＃８は、８株のマラセチア株（＃１～＃８）のゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅産物を示す。
図１に示すように、いずれの単離株でも、約２２０塩基対の単一バンドが検出された。このＤＮＡ断片のサイズは、増幅断片の予測サイズと同じであった。この結果から、プライマー１及びプライマー２を用いることにより、臨床サンプルにおいても、ＥＲＧ１１遺伝子における標的領域のみを特異的に増幅できることが確認された。
図１に示すように、いずれの単離株でも、約２２０塩基対の単一バンドが検出された。このＤＮＡ断片のサイズは、増幅断片の予測サイズと同じであった。この結果から、プライマー１及びプライマー２を用いることにより、臨床サンプルにおいても、ＥＲＧ１１遺伝子における標的領域のみを特異的に増幅できることが確認された。
【0064】
ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、ＰＣＲにより得られた増幅産物を精製した。
精製したＤＮＡを鋳型として、プライマー１を用いてシーケンシング反応を行った後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）にて塩基配列を解析した。解析の結果得られた各塩基配列を、配列番号３に示される塩基配列と比較し、変異の有無を確認した。配列比較は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）により行った。結果を表１に示す。表１には、配列番号３に示される塩基配列に対して検出された変異を、「変異の種類」として記載した。「Ｇ９０４Ａ」は、配列番号３に示される塩基配列の９０４番目のグアニン（Ｇ）に対応する塩基がアデニン（Ａ）に置換している変異を示す。「Ｃ９０５Ｔ」は、配列番号３に示される塩基配列の９０５番目のシトシン（Ｃ）に対応する塩基がチミン（Ｔ）に置換している変異を示す。
精製したＤＮＡを鋳型として、プライマー１を用いてシーケンシング反応を行った後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）にて塩基配列を解析した。解析の結果得られた各塩基配列を、配列番号３に示される塩基配列と比較し、変異の有無を確認した。配列比較は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）により行った。結果を表１に示す。表１には、配列番号３に示される塩基配列に対して検出された変異を、「変異の種類」として記載した。「Ｇ９０４Ａ」は、配列番号３に示される塩基配列の９０４番目のグアニン（Ｇ）に対応する塩基がアデニン（Ａ）に置換している変異を示す。「Ｃ９０５Ｔ」は、配列番号３に示される塩基配列の９０５番目のシトシン（Ｃ）に対応する塩基がチミン（Ｔ）に置換している変異を示す。
【0065】
表１に示すように、試験した７株は、Ｇ９０４Ａ又はＣ９０５Ｔのいずれかの変異を有していた。これらの７株は、イトラコナゾール及びミコナゾールの両薬剤に耐性を示した（表１のＭＩＣ参照）。また残り1株(＃８)は両薬剤に感受性をしめし、変異を認めなかった。これらのことからＧ９０４Ａ又はＣ９０５Ｔの変異はこれらの薬剤耐性の指標となることが明らかとなった。
【0066】
【表1】
【産業上の利用可能性】
【0067】
本発明によれば、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を、簡便に、かつ、短時間で判定可能な、マラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性を判定する方法、及びマラセチアのアゾール系抗真菌薬に対する耐性の検査キットを提供が提供される。本発明の判定方法は、マラセチアの治療において、適切な薬剤の選択に利用可能である。
【図1】
【配列表】