知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特開2022-114583ターゲット計測用デバイスの製造方法、及びターゲット計測用キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022114583
(43)【公開日】2022-08-08
(54)【発明の名称】ターゲット計測用デバイスの製造方法、及びターゲット計測用キット
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20220801BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220801BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20220801BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 Z
C12N15/09 200
C12Q1/6876 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021010913
(22)【出願日】2021-01-27
(71)【出願人】
【識別番号】000006507
【氏名又は名称】横河電機株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100167553
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 久典
(74)【代理人】
【識別番号】100181124
【弁理士】
【氏名又は名称】沖田 壮男
(72)【発明者】
【氏名】宮内 祐樹
(72)【発明者】
【氏名】蓼沼 崇
(72)【発明者】
【氏名】田口 朋之
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029BB20
4B029CC03
4B029FA12
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR56
4B063QS28
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】計測精度が向上したターゲット計測用デバイスの製造方法及びターゲット計測用キットを提供する。
【解決手段】サンプルに含まれるターゲットを計測するターゲット計測用デバイスの製造方法であって、基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子の、前記基板結合部と基板の固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、を含む、ターゲット計測用デバイスの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】サンプルに含まれるターゲットを計測するターゲット計測用デバイスの製造方法であって、基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子の、前記基板結合部と基板の固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、を含む、ターゲット計測用デバイスの製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプルに含まれるターゲットを計測するターゲット計測用デバイスの製造方法であって、
基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子の、前記基板結合部と基板の固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、
捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、
を含む、ターゲット計測用デバイスの製造方法。
基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子の、前記基板結合部と基板の固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、
捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、
を含む、ターゲット計測用デバイスの製造方法。
【請求項2】
前記捕捉分子固定化工程と前記蛍光分子結合工程との間に、
前記基板の前記固相面の未反応の結合部を、ブロッキング液を用いてブロッキングするブロッキング工程を含む、請求項１に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
前記基板の前記固相面の未反応の結合部を、ブロッキング液を用いてブロッキングするブロッキング工程を含む、請求項１に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
【請求項3】
前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部が、前記捕捉分子の前記基板結合部とは異なる、請求項１又は２に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
【請求項4】
基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子の前記基板結合部を、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に前記蛍光分子が結合したときに、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように前記基板の前記固相面に結合させる捕捉分子結合分子固定化工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
【請求項5】
前記ターゲットが、特定の核酸配列を有する核酸であり、
前記捕捉分子が、前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブである、請求項１～４のいずれか１項に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
前記捕捉分子が、前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブである、請求項１～４のいずれか１項に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
【請求項6】
前記ターゲットが、特定の核酸配列を有する核酸であり、
前記捕捉分子が、前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブであり、
前記捕捉分子結合分子が、前記検出プローブが有する核酸配列と相補的な核酸配列を有する消光プローブである、請求項４に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
前記捕捉分子が、前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブであり、
前記捕捉分子結合分子が、前記検出プローブが有する核酸配列と相補的な核酸配列を有する消光プローブである、請求項４に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
【請求項7】
サンプルに含まれるターゲットを計測する際に用いられるターゲット計測用キットであって、
基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子と、
前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に結合する蛍光分子と、
前記捕捉分子の前記基板結合部が固定される固相面を有する基板と、
を含むターゲット計測用キット。
基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子と、
前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に結合する蛍光分子と、
前記捕捉分子の前記基板結合部が固定される固相面を有する基板と、
を含むターゲット計測用キット。
【請求項8】
前記捕捉分子は、前記捕捉分子の前記基板結合部で前記基板に結合されている、請求項７に記載のターゲット計測用キット。
【請求項9】
前記基板の固相面の未反応の結合部がブロッキングされている、請求項８に記載のターゲット計測用キット。
【請求項10】
基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載のターゲット計測用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ターゲット計測用デバイスの製造方法、及びターゲット計測用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する方法として、ＤＮＡマイクロアレイ（特定の核酸配列の相補配列を有する検出プローブが基板等の固相面に設けられたもの）を用いる方法が広く知られている。この方法は、ＤＮＡマイクロアレイに添加されたサンプルに含まれるターゲットが、ハイブリダイズ反応によりＤＮＡマイクロアレイの検出プローブに捕集される性質を利用してターゲットを計測する方法である。この方法では、ターゲットがサンプルに含まれるか否かに加えて、サンプルに含まれるターゲットの量を計測することができる。以下の特許文献１には、ＤＮＡマイクロアレイを用いてターゲットを計測する従来の計測方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２０１５－４３７０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ところで、上記特許文献１の核酸配列計測方法は、捕集されていないターゲットを除去するための洗浄操作を必要としないため、洗浄操作による計測精度の悪化は生じない。しかしながら、上記特許文献１の核酸配列計測方法では、作製したＤＮＡマイクロアレイから発せられるオフセット光がノイズとなって計測精度を悪化させてしまうことがあるという問題がある。
【0005】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、オフセット光を低減することによりサンプルに含まれるターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができる、ターゲット計測用デバイスの製造方法、及びターゲット計測用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］ サンプルに含まれるターゲットを計測するターゲット計測用デバイスの製造方法であって、
基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子の、前記基板結合部と基板の固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、
捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、
を含む、ターゲット計測用デバイスの製造方法。
［２］ 前記捕捉分子固定化工程と前記蛍光分子結合工程との間に、
前記基板の前記固相面の未反応の結合部を、ブロッキング液を用いてブロッキングするブロッキング工程を含む、［１］に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［３］ 前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部が、前記捕捉分子の前記基板結合部とは異なる、［１］又は［２］に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［４］ 基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子の前記基板結合部を、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に前記蛍光分子が結合したときに、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように前記基板の前記固相面に結合させる捕捉分子結合分子固定化工程を含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［５］ 前記ターゲットが、特定の核酸配列を有する核酸であり、
前記捕捉分子が、前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブである、［１］～［４］のいずれか１項に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［６］ 前記ターゲットが、特定の核酸配列を有する核酸であり、
前記捕捉分子が、前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブであり、
前記捕捉分子結合分子が、前記検出プローブが有する核酸配列と相補的な核酸配列を有する消光プローブである、［４］に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［７］ サンプルに含まれるターゲットを計測する際に用いられるターゲット計測用キットであって、
基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子と、
前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に結合する蛍光分子と、
前記捕捉分子の前記基板結合部が固定される固相面を有する基板と、
を含むターゲット計測用キット。
［８］ 前記捕捉分子は、前記捕捉分子の前記基板結合部で前記基板に結合されている、［７］に記載のターゲット計測用キット。
［９］ 前記基板の固相面の未反応の結合部がブロッキングされている、［８］に記載のターゲット計測用キット。
［１０］ 基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を含む、［７］～［９］のいずれか１項に記載のターゲット計測用キット。
［１］ サンプルに含まれるターゲットを計測するターゲット計測用デバイスの製造方法であって、
基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子の、前記基板結合部と基板の固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、
捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、
を含む、ターゲット計測用デバイスの製造方法。
［２］ 前記捕捉分子固定化工程と前記蛍光分子結合工程との間に、
前記基板の前記固相面の未反応の結合部を、ブロッキング液を用いてブロッキングするブロッキング工程を含む、［１］に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［３］ 前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部が、前記捕捉分子の前記基板結合部とは異なる、［１］又は［２］に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［４］ 基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子の前記基板結合部を、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に前記蛍光分子が結合したときに、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように前記基板の前記固相面に結合させる捕捉分子結合分子固定化工程を含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［５］ 前記ターゲットが、特定の核酸配列を有する核酸であり、
前記捕捉分子が、前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブである、［１］～［４］のいずれか１項に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［６］ 前記ターゲットが、特定の核酸配列を有する核酸であり、
前記捕捉分子が、前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブであり、
前記捕捉分子結合分子が、前記検出プローブが有する核酸配列と相補的な核酸配列を有する消光プローブである、［４］に記載のターゲット計測用デバイスの製造方法。
［７］ サンプルに含まれるターゲットを計測する際に用いられるターゲット計測用キットであって、
基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子と、
前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に結合する蛍光分子と、
前記捕捉分子の前記基板結合部が固定される固相面を有する基板と、
を含むターゲット計測用キット。
［８］ 前記捕捉分子は、前記捕捉分子の前記基板結合部で前記基板に結合されている、［７］に記載のターゲット計測用キット。
［９］ 前記基板の固相面の未反応の結合部がブロッキングされている、［８］に記載のターゲット計測用キット。
［１０］ 基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を含む、［７］～［９］のいずれか１項に記載のターゲット計測用キット。
【発明の効果】
【0007】
本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法、及びターゲット計測用キットによれば、オフセット光を低減させることができるため、サンプルに含まれるターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法の一例を示すフローチャートである。
【図2】本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法において、蛍光分子結合工程を示す図である。
【図3】蛍光分子で修飾したＤＮＡプローブ（ドナー蛍光プローブ）と、消光分子を有し、ＤＮＡプローブと特異的に結合する消光プローブを基板の固相面に固定化し、ターゲットをドナー蛍光プローブに結合させる方法を示す図である。
【図4】ターゲット計測用デバイスによるターゲット計測方法の一例を示す図である。
【図5】ターゲット計測装置の構成の一例を示す図である。
【図6】実施例１のブロッキングを行わない場合とブロッキングを行った場合とにおける、蛍光分子を滴下した基板が呈するスポット光量を測定したグラフである。
【図7】実施例２で製造したターゲット計測用デバイスに、ターゲットを含まない場合のスポット光量、ターゲットを含む溶液を反応させた場合のスポット光量、及び消光プローブを固定化しないターゲット計測用デバイスが呈するスポット光量を測定したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、図面を参照して本発明の実施形態によるターゲット計測用デバイスの製造方法、及びターゲット計測用キットについて詳細に説明する。以下では、まず本発明の実施形態の概要について説明し、続いて本発明の実施形態の詳細について説明する。
【0010】
〔概要〕
本発明の実施形態は、オフセット光を低減することによりサンプルに含まれるターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができるようにするものである。上述した特許文献１に開示された方法は、検出プローブとして、蛍光分子が付加された蛍光プローブと、蛍光分子の蛍光を消光する消光分子が付加された消光プローブとが設けられた核酸配列計測デバイス（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いてターゲットを計測するものである。この方法では、ターゲットに対する蛍光分子の付加、及びＤＮＡマイクロアレイの洗浄（捕集されていないターゲット等を除去するための洗浄）を行うことなくターゲットを計測することが可能である。
本発明の実施形態は、オフセット光を低減することによりサンプルに含まれるターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができるようにするものである。上述した特許文献１に開示された方法は、検出プローブとして、蛍光分子が付加された蛍光プローブと、蛍光分子の蛍光を消光する消光分子が付加された消光プローブとが設けられた核酸配列計測デバイス（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いてターゲットを計測するものである。この方法では、ターゲットに対する蛍光分子の付加、及びＤＮＡマイクロアレイの洗浄（捕集されていないターゲット等を除去するための洗浄）を行うことなくターゲットを計測することが可能である。
【0011】
この方法では、ＤＮＡマイクロアレイを用いて特定の核酸の有無や量を計測する核酸配列計測デバイスにおいて、ターゲットが存在しないときは、互いに独立したドナー蛍光プローブ及び消光プローブが、結合部を介して結合が維持されて消光分子により蛍光分子の蛍光が消光されている。ターゲットが供給された場合には、検出部にターゲットが結合して、結合部を介するドナー蛍光プローブと消光プローブとの結合が解消され、消光分子がドナー蛍光分子から離れることによりドナー蛍光分子が蛍光を呈する。この核酸配列計測デバイスを用いることにより、サンプルに含まれるターゲットを計測することができる。
【0012】
特許文献１に記載された核酸配列計測用デバイスの製造方法では、まず、蛍光分子がＤＮＡプローブに付加された蛍光プローブ液を調製し、蛍光プローブ液をＤＮＡマイクロアレイにスポッターを使用しスポッティングする。そしてスポッティングされた蛍光プローブ液を乾燥させてドナー蛍光プローブを基板固相面に固定化する。次に、核酸配列計測デバイスをブロッキング液に液浸し、未反応の固相表面の結合部を不活性化する。次に、核酸配列計測デバイス基板固相面を洗浄し、固定化されていない余剰の蛍光プローブを除去し洗浄液を除去する。
【0013】
上記の特許文献１に記載された核酸配列計測用デバイスの製造方法では、蛍光プローブが、その末端修飾結合部によってＤＮＡマイクロアレイの固相面に固定化されるとは限らず、蛍光分子を介して非特異的に、ＤＮＡマイクロアレイの固相面に固定化される場合がある。この場合、核酸配列計測デバイスの蛍光プローブとターゲットとのハイブリダイズ反応の際に、蛍光プローブと消光プローブとの乖離が阻害される可能性がある。また、核酸配列計測用デバイスを製造する際には、蛍光プローブと消光プローブがハイブリダイズ反応して１対１の状態でスポットを形成することが望ましいが、蛍光プローブが、その末端修飾結合部によって、ＤＮＡマイクロアレイの固相面に固定化されていないと、蛍光プローブが過多になり、スポットのオフセット光を高めて検出下限を低下させる可能性がある。また、蛍光プローブを、ＤＮＡマイクロアレイの固相面に固定化した後、固相面表面の洗浄の際に洗い流される余剰の蛍光プローブが、スポット周辺のＤＮＡマイクロアレイの固相面表面に非特異的に固定化され、バックグランド光を上昇させて検出下限を低下させる可能性がある。また、ＤＮＡマイクロアレイの固相表面上に蛍光プローブを固定化後、前記固相表面の洗浄の前に、ＤＮＡマイクロアレイの固相表面の結合部を失活させてブロッキングを行う場合も、同様に、余剰の蛍光プローブが、スポット周辺のＤＮＡマイクロアレイの固相表面に非特異的に固定化され、バックグランド光を上昇させて検出下限を低下させる可能性がある。また、ＤＮＡマイクロアレイの固相表面上に蛍光プローブを固定化後にＤＮＡマイクロアレイの固相表面の結合部を失活させてブロッキングを行うため、ブロッキングで使用するアルカリ液などの試薬によって、蛍光分子の蛍光シグナルが不安定になる可能性がある。
【0014】
〔実施形態〕
本実施形態のターゲット計測デバイスの製造方法は、サンプルに含まれるターゲットを計測するターゲット計測用デバイスの製造方法であって、基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子の、前記基板結合部と基板の固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、を含む。これにより、オフセット光を低減することができ、サンプルに含まれるターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができるターゲット計測用デバイスを製造することができる。また、基板の固相面のバックグランド光を低減させることができるターゲット計測用デバイスを製造することができる。また、ブロッキングでアルカリ液を使用することにより蛍光シグナルが不安定になることがないターゲット計測用デバイスを製造することができる。
本実施形態のターゲット計測デバイスの製造方法は、サンプルに含まれるターゲットを計測するターゲット計測用デバイスの製造方法であって、基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子の、前記基板結合部と基板の固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、を含む。これにより、オフセット光を低減することができ、サンプルに含まれるターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができるターゲット計測用デバイスを製造することができる。また、基板の固相面のバックグランド光を低減させることができるターゲット計測用デバイスを製造することができる。また、ブロッキングでアルカリ液を使用することにより蛍光シグナルが不安定になることがないターゲット計測用デバイスを製造することができる。
【0015】
以下、本実施形態のターゲット計測用デバイスの製造方法で製造されるターゲット計測用デバイスについて説明する。
本実施形態のターゲット計測用デバイスの製造方法で製造されるターゲット計測用デバイスは、基板結合部及び蛍光分子結合部を有する、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子と、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に結合する蛍光分子と、前記捕捉分子の前記基板結合部が固定される固相面を有する基板と、を備える。
本実施形態のターゲット計測用デバイスの製造方法で製造されるターゲット計測用デバイスは、基板結合部及び蛍光分子結合部を有する、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子と、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に結合する蛍光分子と、前記捕捉分子の前記基板結合部が固定される固相面を有する基板と、を備える。
【0016】
ターゲットしては、サンプル中の検出の対象となるものであれば、特に制限はないが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、ペプチド、タンパク質等が挙げられる。ターゲットに特異的に結合する捕捉分子としては、核酸とハイブリダイズする検出プローブ、ペプチド、タンパク質等の抗原と特異的に結合する抗体若しくは抗体フラグメント、核酸と特異的に結合するアプタマー等が挙げられる。前記抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、これらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質又は融合ペプチド等が挙げられる。また、ターゲットが抗体又は抗体フラグメントであって、捕捉分子が該抗体又は抗体フラグメントと特異的に結合するペプチド、タンパク質等の抗原であってもよい。
【0017】
ターゲットと前記ターゲットに特異的に結合する捕捉分子の組み合わせとしては、例えば、ターゲットが特定の核酸配列を有する核酸であって、捕捉分子が前記特定の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出プローブである組み合わせ、ターゲットが抗原であって、捕捉分子が前記抗原と特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである組み合わせ等が挙げられる。ターゲットが特定の核酸配列を有する核酸であって、捕捉分子が前記特定の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出プローブである場合、ターゲットである核酸は捕捉分子である検出プローブにハイブリダイズ反応により結合する。
【0018】
本実施形態のターゲット計測用デバイスの製造方法では、基板結合部及び蛍光分子結合部を有する、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子を使用する。捕捉分子の基板結合部は、捕捉分子が結合する基板の固相表面の、捕捉分子との結合部（以下、捕捉分子結合部とも称する）に結合できるものであれば、特に制限はなく、用いる捕捉分子の基板結合部の種類に応じて適宜選択される。基板の捕捉分子結合部としては、例えば、アミノシラン、エポキシシラン、３次元ポリマーやゲルなどが用いられる。表１に、捕捉分子の基板結合部と基板の捕捉分子結合部の組み合わせの一例を示す。捕捉分子の基板結合部と基板の捕捉分子結合部は、それぞれ逆になっていてもよい。
【0019】
【表1】
【0020】
捕捉分子の蛍光分子結合部は、捕捉分子の基板結合部と異なるものであることが好ましい。捕捉分子の蛍光分子結合部が、捕捉分子の基板結合部と異なっていることにより、捕捉分子の蛍光分子結合部が、基板の捕捉分子結合部と結合することを防止することができる。例えば、捕捉分子の基板結合部がアミノ基である場合には、捕捉分子の蛍光分子結合部としては、アミノ基と結合する基板の捕捉分子結合部と結合しないチオールやアルキン、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）等を選択することが好ましい。また逆に、捕捉分子の蛍光分子結合部が、アミノ基である場合には、捕捉分子の基板結合部としては、アミノ基と結合する蛍光分子が結合しないチオールやアルキン、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）等を選択することが好ましい。
【0021】
また、捕捉分子の蛍光分子結合部は、捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部とを結合させる際に、捕捉分子の蛍光分子結合部が、基板の捕捉分子結合部と結合しないように、保護することもできる。捕捉分子の蛍光分子結合部を保護した場合は、蛍光分子を捕捉分子の蛍光分子結合部に結合させる前に、脱保護する。
【0022】
捕捉分子の基板結合部及び蛍光分子結合部は、それぞれ基板、蛍光分子に結合するためのリンカーを含んでいてもよい。
【0023】
前記ターゲット計測用デバイスは、さらに、基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を備えていてもよい。消光分子は、捕捉分子結合分子の基板結合部を基板の固相面に結合させ、前記捕捉分子の蛍光分子結合部に蛍光分子が結合したときに、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように、捕捉分子結合分子に付加する。
【0024】
前記捕捉分子結合分子としては、例えば、ターゲットが、特定の核酸配列を有する核酸であり、前記捕捉分子が前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブである場合には、前記検出プローブが有する核酸配列と相補的な核酸配列を有する消光プローブ等が挙げられる。
【0025】
なお、本発明において相補的であるとは、一方の核酸配列が、他方の核酸配列と２本鎖状態を形成することのできる核酸配列を持つことを意味し、必ずしも完全に相補的である必要はなく、いくつかのミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。
【0026】
本発明で用いられる蛍光分子としては、特定の励起光で励起され蛍光を発生する分子であれば特に制限はないが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ、ＡＴＴＯシリーズ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔシリーズ、Ｃｈｒｏｍｅｏ（登録商標）シリーズ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎシリーズ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ色素シリーズ、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅシリーズ、Ｔｉｄｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ、ｉＦｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ、ＤＹ色素シリーズ、Ｑｄｏｔ（登録商標）シリーズ、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ等の公知の物質を使用できる。
【0027】
本発明で用いられる消光分子としては、特に制限はないが、例えば、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＱ１、ＴＱ２、ＴＱ３、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、Ｃｙ５Ｑ、Ｃｙ７Ｑ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標） ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標） ＲＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ７、ＱＳＹ２１、ＱＸＬ５７０、ＱＸＬ５７０、ＱＸＬ５７０等の公知の物質を使用できる。
【0028】
蛍光分子と消光分子の組み合わせについても特に制限はないが、例えば、ＥＤＡＮＳ、ＣｏｕｍａｒｉｎまたはＴＦ２とＤａｂｃｙｌまたはＴＱ１との組み合わせ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＴＥＴ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５３２、Ｃｙ２、Ｃｙ３、ＴＦ２またはＴＦ３とＴＱ２との組み合わせ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＦ２、ＴＦ３、ＴＦ４またはＴＥＴとＴＱ３との組み合わせ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５３２、ＴＦ２、Ｃｙ３、ＦＡＭまたはＨＥＸとＥｃｌｉｐｓｅ（登録商標）との組み合わせ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５３２、ＴＦ２、ＴＦ３、Ｃｙ３、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴまたはＣｙ３とＢＨＱ１との組み合わせ、ＴＦ３、ＴＦ４、Ｃｙ３、Ｃｙ５またはＨＥＸとＢＨＱ２との組み合わせ、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７、ＴＦ５とＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標） ＲＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ２１、ＴＱ４、ＴＱ５、ＢＨＱ２またはＢＨＱ３との組み合わせ、Ｃｙ３、ＴＦ３、ＴＦ４とＣｙ５Ｑ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標） ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標） ＲＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ７またはＱＸＬ５７０との組み合わせ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５３２とＣｙ５Ｑ、ＴＱ２、ＴＱ３、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標） ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標） ＲＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ７またはＱＸＬ５７０との組み合わせ、ＴＦ３とＢＨＱ１、ＢＨＱ２またはＣｙ５Ｑとの組み合わせ等が挙げられる。
【0029】
本発明で用いられる基板としては、平面視したときの形状が矩形形状に形成された板状の石英、ガラス、シリコン、フッ化カルシウム及びサファイア等の単結晶、セラミックス、及び樹脂材料等を用いることができる。樹脂材料としては、光学的特性、化学的及び熱的安定性に優れたＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、ＣＯＣ（環状オレフィンコポリマー）、ポリカーボネイト、アクリル系樹脂、ポリエチレン樹脂等が挙げられる。なお、基板を平面視したときの形状は任意の形状であってよい。
【0030】
捕捉分子の蛍光分子結合部は、捕捉分子の先端の位置に設けていなくてもよく、捕捉分子の途中の位置に設けてもよい。ただし、消光分子を有する捕捉分子結合分子を用いる場合は、消光作用が生じるように、捕捉分子の蛍光分子結合部に蛍光分子が結合したときに、捕捉分子及び捕捉分子結合分子がそれぞれ結合した状態において、消光分子が蛍光分子に接近するように互いに向き合う位置となるように設計することが望ましい。蛍光分子結合部もしくは消光分子をそれぞれ捕捉分子、捕捉分子結合分子の先端以外の位置に設ける場合には、捕捉分子及び捕捉分子結合分子の先端にはさらに別の修飾が可能となる利点がある。
【0031】
蛍光分子結合部は複数種類・複数個所に設けてもよい。蛍光分子結合部を複数個所に設ける場合は、捕捉分子結合分子に結合させる消光分子を、複数の蛍光分子結合部に対応して、捕捉分子結合分子の複数個所に付加させることができる。複数の消光分子を１つの捕捉分子結合分子に付加する場合、消光分子の種類を異なるものとしてもよい。１つの捕捉分子結合分子に複数の消光分子を結合させた場合、蛍光分子に対する消光分子の消光効果を高めることができるため、オフセット光をより低くすることができる。そのため、検出可能な最小光量を小さくすることができ、検出感度を向上させることができる。また、捕捉分子に複数の蛍光分子結合部位を設け、捕捉分子結合分子に複数の消光分子を付加した場合、ターゲットが結合した際の蛍光量が増加し、より高感度な検出が可能となる。また、消光分子の数を蛍光分子結合部の数より多くすることにより、ターゲットが存在しないときのオフセット光を低くすることができる。
【0032】
次に、本実施形態のターゲット計測用デバイスの製造方法について説明する。
本実施形態のターゲット計測用デバイスの製造方法は、前記ターゲット計測用デバイスの製造方法であって、前記捕捉分子の前記基板結合部と前記基板の前記固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、を含む。
本実施形態のターゲット計測用デバイスの製造方法は、前記ターゲット計測用デバイスの製造方法であって、前記捕捉分子の前記基板結合部と前記基板の前記固相面とを結合させる捕捉分子固定化工程と、捕捉分子固定化工程後に、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる蛍光分子結合工程と、を含む。
【0033】
前記捕捉分子固定化工程と前記蛍光分子結合工程の間には、前記基板の前記固相面の未反応の結合部を、ブロッキング液を用いてブロッキングするブロッキング工程を含むことが好ましい。ブロッキング工程を含むことにより、蛍光分子結合工程で、蛍光分子を捕捉分子の蛍光分子結合部に結合させる際に、基板の固相面の未反応の結合部に、蛍光分子が結合することを抑制することができる。ブロッキング工程で得られた基板の固相面は、洗浄し、基板に固定化されていない余剰の捕捉分子及びブロッキング液を除去することが好ましい。
ブロッキング液としては、基板の固相面の未反応の結合部を不活性化できれば、特に制限はなく、例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ホウ酸ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化リチウム、リン酸水素二ナトリウム等のアルカリ溶液等が挙げられる。ブロッキング液としては、前記アルカリ溶液の他に、前記基板の固相面の未反応の結合部と反応するダミーの分子含む溶液を用いてもよい。例えば、基板の固相面の未反応の結合部が、活性エステル基を有する高分子物質である場合、前記ダミーの分子としては、一級アミノ基を有する化合物等が挙げられる。前記一級アミノ基を有する化合物としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グリシン、エタノールアミン等が挙げられる。
ブロッキング液としては、基板の固相面の未反応の結合部を不活性化できれば、特に制限はなく、例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ホウ酸ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化リチウム、リン酸水素二ナトリウム等のアルカリ溶液等が挙げられる。ブロッキング液としては、前記アルカリ溶液の他に、前記基板の固相面の未反応の結合部と反応するダミーの分子含む溶液を用いてもよい。例えば、基板の固相面の未反応の結合部が、活性エステル基を有する高分子物質である場合、前記ダミーの分子としては、一級アミノ基を有する化合物等が挙げられる。前記一級アミノ基を有する化合物としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グリシン、エタノールアミン等が挙げられる。
【0034】
以下、本実施形態のターゲット計測用デバイスの製造方法について、前記ターゲットが、特定の核酸配列を有する核酸であり、前記捕捉分子が前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有する検出プローブである、核酸配列計測用デバイスの製造方法を例にして説明する。図１は、前記ターゲットが、特定の核酸配列を有するＤＮＡであり、前記捕捉分子が前記核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有するＤＮＡプローブである場合の核酸配列計測用デバイスの製造方法を示したフローチャートである。以下、各工程について説明する。
【0035】
（１）捕捉分子固定化工程（ステップＳ１１～Ｓ１３）
捕捉分子固定化工程は、前記捕捉分子の前記基板結合部と前記固相の前記固相面とを結合させる工程である。
（１－１）溶液調製
まず、ターゲットに特異的に結合する捕捉分子を含む溶液を調製し、捕捉分子の濃度を調整する。例えば、ターゲットが特定の核酸配列を有するＤＮＡであって、捕捉分子が、ターゲットの特定の核酸配列と相補的な検出配列を有するＤＮＡプローブである場合は、ＤＮＡプローブ溶液を調製し、ＤＮＡプローブ溶液の濃度を調整する（ステップＳ１１）。また、捕捉分子結合分子として、ＤＮＡプローブが有する塩基配列と相補的な核酸配列を有する消光プローブを用いる場合は、ＤＮＡプローブと消光プローブを混合したプローブ液を調製し、プローブ濃度を調整する。プローブ溶液を調製する際の、捕捉分子を溶解する溶媒としては、適宜捕捉分子の固相面への固定に適した溶媒を用いることができる。前記溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液などの緩衝液や界面活性剤、粘度調製用のエチレングリコールやグリセリンなどを含む溶液等が挙げられる。
捕捉分子固定化工程は、前記捕捉分子の前記基板結合部と前記固相の前記固相面とを結合させる工程である。
（１－１）溶液調製
まず、ターゲットに特異的に結合する捕捉分子を含む溶液を調製し、捕捉分子の濃度を調整する。例えば、ターゲットが特定の核酸配列を有するＤＮＡであって、捕捉分子が、ターゲットの特定の核酸配列と相補的な検出配列を有するＤＮＡプローブである場合は、ＤＮＡプローブ溶液を調製し、ＤＮＡプローブ溶液の濃度を調整する（ステップＳ１１）。また、捕捉分子結合分子として、ＤＮＡプローブが有する塩基配列と相補的な核酸配列を有する消光プローブを用いる場合は、ＤＮＡプローブと消光プローブを混合したプローブ液を調製し、プローブ濃度を調整する。プローブ溶液を調製する際の、捕捉分子を溶解する溶媒としては、適宜捕捉分子の固相面への固定に適した溶媒を用いることができる。前記溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液などの緩衝液や界面活性剤、粘度調製用のエチレングリコールやグリセリンなどを含む溶液等が挙げられる。
【0036】
（１－２）固相面への固定
捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部とを結合させ、捕捉分子を基板の固相面に固定化する。捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部との結合は、基板の捕捉分子結合部が有する結合部と、捕捉分子の基板結合部の結合部とを反応させることにより行うことができる。基板ターゲット計測用デバイスが、さらに、基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を備える場合には、捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部とを結合させ、捕捉分子を基板の固相面に固定化するとともに、前記捕捉分子結合分子の基板結合部を、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に前記蛍光分子が結合したときに、蛍光分子に接近した消光分子により蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように基板の固相面に結合させる。捕捉分子と捕捉分子結合分子とは、結合させた後に、各々の基板結合部を介して、基板の固相面に固定化してもよい。
捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部とを結合させ、捕捉分子を基板の固相面に固定化する。捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部との結合は、基板の捕捉分子結合部が有する結合部と、捕捉分子の基板結合部の結合部とを反応させることにより行うことができる。基板ターゲット計測用デバイスが、さらに、基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を備える場合には、捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部とを結合させ、捕捉分子を基板の固相面に固定化するとともに、前記捕捉分子結合分子の基板結合部を、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に前記蛍光分子が結合したときに、蛍光分子に接近した消光分子により蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように基板の固相面に結合させる。捕捉分子と捕捉分子結合分子とは、結合させた後に、各々の基板結合部を介して、基板の固相面に固定化してもよい。
【0037】
例えば、ＤＮＡプローブを基板の固相面に固定化する場合は、ＤＮＡプローブを基板の固相面にスポッター等を用いてスポットする（ステップＳ１２）。次に、基板を乾燥させることにより、ＤＮＡプローブを基板の固相面に固定化する（ステップＳ１３）。捕捉分子結合分子として、消光プローブを用いる場合は、上記（１－１）で得られたプローブ液を加熱後、急冷し、ＤＮＡプローブと消光プローブをカップリングさせた後、カップリングしたＤＮＡプローブと消光プローブとを、基板の固相面に固定させる。消光プローブは、ＤＮＡプローブが有する塩基配列と相補的な核酸配列を有するため、ＤＮＡプローブとカップリングする。例えば、プローブ液を９５℃に加熱後、５分間温度を保持し、その後、氷冷することで、ＤＮＡプローブと消光プローブとをカップリングさせる。カップリングしたＤＮＡプローブと消光プローブとは、それぞれが有する基板結合部を介して基板に固定化される。
【0038】
捕捉分子をスポットする固相面上の領域は、予め規定された数を単位としたブロック毎に区分けされていてもよい。ターゲット計測用デバイスに対するターゲット溶液の添加は、ブロック毎に行われる。また、ターゲット計測用デバイスの画像取得は、ブロック毎に行われることが多い。つまり、ブロックは、画像取得領域であるということができる。
【0039】
（２）ブロッキング工程
ブロッキング工程は、基板の固相面の未反応の結合部をブロッキングする工程である。ブロッキング工程では、（１）で得られた基板の固相面を、ブロッキング液に液浸し、未反応の結合部を不活性化する（ステップＳ１４）。
ブロッキング工程は、基板の固相面の未反応の結合部をブロッキングする工程である。ブロッキング工程では、（１）で得られた基板の固相面を、ブロッキング液に液浸し、未反応の結合部を不活性化する（ステップＳ１４）。
【0040】
（３）洗浄工程
洗浄工程は、（２）で得られた基板を洗浄する工程である。洗浄工程では、ブロッキング工程で得られた基板の固相面を洗浄液で洗浄し、固定化されていない余剰の捕捉分子及びブロッキング液を除去し、洗浄液も除去する（ステップＳ１５）。捕捉分子としてＤＮＡプローブを用いる場合は、基板に固定化されていない余剰のＤＮＡプローブ、及びブロッキング液を除去し、洗浄液も除去する。捕捉分子結合分子として、前記消光プローブを用いる場合は、基板に固定化されていない余剰の消光プローブも除去される。
洗浄工程は、（２）で得られた基板を洗浄する工程である。洗浄工程では、ブロッキング工程で得られた基板の固相面を洗浄液で洗浄し、固定化されていない余剰の捕捉分子及びブロッキング液を除去し、洗浄液も除去する（ステップＳ１５）。捕捉分子としてＤＮＡプローブを用いる場合は、基板に固定化されていない余剰のＤＮＡプローブ、及びブロッキング液を除去し、洗浄液も除去する。捕捉分子結合分子として、前記消光プローブを用いる場合は、基板に固定化されていない余剰の消光プローブも除去される。
【0041】
（４）蛍光分子結合工程
蛍光分子結合工程は、捕捉分子の蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる工程である。捕捉分子を基板の固相面に結合させた後に、捕捉分子の蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させることにより、余剰の蛍光プローブが、スポット周辺のＤＮＡマイクロアレイの固相面表面に非特異的に固定化されることが抑制される。これにより非特異的に吸着された蛍光プローブによりバックグランド光を上昇させて検出下限を低下させる可能性を少なくすることができる。また、蛍光分子結合工程を、前記ブロッキング工程の後に行うことにより、ブロッキングで使用するアルカリ液などの試薬によって、蛍光分子の蛍光シグナルが不安定になることを抑制することができる。捕捉分子がＤＮＡプローブである場合は、ＤＮＡプローブの蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる（ステップＳ１６）。捕捉分子と蛍光分子との結合は、捕捉分子が有する蛍光分子結合部と蛍光分子の捕捉分子結合部とを反応させることで行うことができる。捕捉分子への蛍光分子の結合方法としては、前記ブロッキング工程で得られた、固相表面がブロッキングされた基板の、捕捉分子がスポットとして固定化された面に対して蛍光分子を含む溶液を接液することで実施することができる。例えば、カバーガラスや専用の容器を使用することで蛍光分子を含む溶液と、表面がブロッキングされた基板とを接液した状態でインキュベートすることで、蛍光分子を捕捉分子の蛍光分子結合部に結合させることができる。捕捉分子の蛍光分子結合部を保護した場合は、蛍光分子を捕捉分子の蛍光分子結合部に結合させる前に、脱保護する。例えば、蛍光分子結合部が、チオールである捕捉分子に、蛍光分子を結合させる場合には、蛍光分子を結合させる前に、予めチオールの脱保護を基板表面で実施する。
蛍光分子結合工程は、捕捉分子の蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる工程である。捕捉分子を基板の固相面に結合させた後に、捕捉分子の蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させることにより、余剰の蛍光プローブが、スポット周辺のＤＮＡマイクロアレイの固相面表面に非特異的に固定化されることが抑制される。これにより非特異的に吸着された蛍光プローブによりバックグランド光を上昇させて検出下限を低下させる可能性を少なくすることができる。また、蛍光分子結合工程を、前記ブロッキング工程の後に行うことにより、ブロッキングで使用するアルカリ液などの試薬によって、蛍光分子の蛍光シグナルが不安定になることを抑制することができる。捕捉分子がＤＮＡプローブである場合は、ＤＮＡプローブの蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる（ステップＳ１６）。捕捉分子と蛍光分子との結合は、捕捉分子が有する蛍光分子結合部と蛍光分子の捕捉分子結合部とを反応させることで行うことができる。捕捉分子への蛍光分子の結合方法としては、前記ブロッキング工程で得られた、固相表面がブロッキングされた基板の、捕捉分子がスポットとして固定化された面に対して蛍光分子を含む溶液を接液することで実施することができる。例えば、カバーガラスや専用の容器を使用することで蛍光分子を含む溶液と、表面がブロッキングされた基板とを接液した状態でインキュベートすることで、蛍光分子を捕捉分子の蛍光分子結合部に結合させることができる。捕捉分子の蛍光分子結合部を保護した場合は、蛍光分子を捕捉分子の蛍光分子結合部に結合させる前に、脱保護する。例えば、蛍光分子結合部が、チオールである捕捉分子に、蛍光分子を結合させる場合には、蛍光分子を結合させる前に、予めチオールの脱保護を基板表面で実施する。
【0042】
蛍光分子を結合させた後は、製造されたターゲット計測用デバイスの基板の固相面を洗浄し、捕捉分子に結合されなかった余剰の蛍光分子を除去し、洗浄液を除去する（ステップＳ１７）。
以上の手順により製造された基板は、遮光、温度、湿度条件等、基板、基板に固定化した捕捉分子や捕捉分子結合分子等の性質に適した環境下で使用まで適宜保存される（ステップＳ１８）。
以上の手順により製造された基板は、遮光、温度、湿度条件等、基板、基板に固定化した捕捉分子や捕捉分子結合分子等の性質に適した環境下で使用まで適宜保存される（ステップＳ１８）。
【0043】
図２に、捕捉分子が、ターゲットの特定の核酸配列と相補的な検出配列を有するドナー蛍光プローブ２であって、捕捉分子結合分子が、前記ドナー蛍光プローブが有する塩基配列と相補的な核酸配列を有する消光プローブ３を用いる場合の、蛍光分子結合工程を示す。
【0044】
図２（ａ）に示すように、ドナー蛍光プローブ２と消光プローブ３とを、結合部２２を介してカップリングさせる。その後、ドナー蛍光プローブ２の基板結合部と、消光プローブ３の基板結合部とを、各々の基板結合部を介して、ＤＮＡマイクロアレイ８と結合させる。ドナー蛍光プローブ２及び消光プローブ３とＤＮＡマイクロアレイ８とは、リンカー２１を介して結合させてもよい。
【0045】
次に、ＤＮＡマイクロアレイ８を、ブロッキング液に液浸し、ＤＮＡマイクロアレイ８表面の未反応の結合部をブロッキングし、表面ブロッキングＤＮＡマイクロアレイ８とする。その後、蛍光分子４を含む溶液を、表面ブロッキングＤＮＡマイクロアレイ８に接液した状態でインキュベートする。これにより、図２（ｂ）に示したように、蛍光分子４は、ドナー蛍光プローブ２の蛍光分子結合部７に結合する。蛍光分子４が、ドナー蛍光プローブ２の蛍光分子結合部７に結合した後、ドナー蛍光プローブ２の蛍光分子結合部７に結合していない余剰の蛍光分子４を洗浄して除去する。
【0046】
次に、本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法により製造されたターゲット計測用デバイスによりターゲットを検出する原理について説明する。図３は、ターゲットが特定の核酸配列を有するＤＮＡであって、捕捉分子が、蛍光分子で修飾された、前記ターゲットの特定の核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列を有するドナー蛍光プローブである場合のターゲット検出原理を示している。以下、図３を用いてターゲット検出原理を説明する。
【0047】
図３に示したように、ドナー蛍光プローブ２は、基板であるＤＮＡマイクロアレイ１にリンカー２１を介して固定化されている。消光分子５で修飾されたドナー蛍光プローブ２の核酸配列と相補的な配列を有する消光プローブ３は、ドナー蛍光プローブ２と結合部２２でハイブリダイズするように、基板であるＤＮＡマイクロアレイ１に固定化されている。ターゲット６が存在しないときは、蛍光分子４が消光分子５によって消光された状態となっており、蛍光分子４を励起光で励起しても蛍光を呈さない。ターゲット６が存在する時は、ターゲット６が蛍光分子４で修飾されたドナー蛍光プローブ２の検出配列２３にハイブリダイズ反応により結合し、前記消光プローブ３がドナー蛍光プローブ２から離れる。これによって、蛍光分子４で修飾されたドナー蛍光プローブ２を修飾している蛍光分子４を励起光で励起することにより蛍光を呈する。
【0048】
次に、本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法により製造されたターゲット計測用デバイスによりターゲットを検出する操作手順について説明する。図４は、図３に示した核酸配列計測用デバイスを用いてターゲットを検出する手順を示すフローチャートである。
まず、ターゲット６を含むターゲット溶液を調製する（ステップＳ２１）。ターゲット溶液を調製する際に、特定の核酸配列を有するターゲット６の増幅を行ってもよい。サンプル中にターゲット６が存在するか否かを確認するタイミングとしては、増幅終了後に限定されず、増幅中であってもよい。なお、ターゲット６の存在を確認する方法としては、電気泳動、抗原抗体反応、質量分析、リアルタイムＰＣＲ等を適宜利用することができる。
まず、ターゲット６を含むターゲット溶液を調製する（ステップＳ２１）。ターゲット溶液を調製する際に、特定の核酸配列を有するターゲット６の増幅を行ってもよい。サンプル中にターゲット６が存在するか否かを確認するタイミングとしては、増幅終了後に限定されず、増幅中であってもよい。なお、ターゲット６の存在を確認する方法としては、電気泳動、抗原抗体反応、質量分析、リアルタイムＰＣＲ等を適宜利用することができる。
【0049】
調製したターゲット溶液を、蛍光分子４で修飾されたドナー蛍光プローブ２が固定化されたＤＮＡマイクロアレイ１に供給する（ステップＳ２２）。図３に示したように、ターゲット６が存在しないときは、ドナー蛍光プローブ２及び消光プローブ３は、結合部２２で結合することにより、蛍光分子４と消光分子５が接近した状態にある。この状態では励起光が照射されても消光分子５の影響により蛍光分子４は蛍光を呈さない。
次に、ターゲット６とドナー蛍光プローブ２とをハイブリダイズ反応させる（ステップＳ２３）。ターゲット６とドナー蛍光プローブ２とをハイブリダイズ反応させると、ターゲット６がドナー蛍光プローブ２の検出配列２３に結合し、結合部２２でのドナー蛍光プローブ２と消光プローブ３の結合が外れて、消光分子５と蛍光分子４の距離が離れる。これにより、蛍光分子４の消光状態が解かれ、励起光の照射により蛍光分子４が蛍光を呈するようになる。このＤＮＡマイクロアレイ１の固相面からの蛍光画像を、蛍光読取装置で取得する（ステップＳ２４）。次に、取得された蛍光画像から、蛍光量を算出する（ステップＳ２５）。このように、ドナー蛍光プローブ２が蛍光を呈するか否かでサンプル中の対象核酸（ターゲット６）の有無を確認することができる。また、蛍光光量を定量することにより、サンプル中のターゲット量を定量することができる。また、この時、溶液中に含まれる捕集されていないターゲット６は蛍光を呈さないために、洗浄する必要がない。したがって、ターゲット溶液存在下で、溶液を通して固相表面を観察することが可能である。このため、洗浄の影響を排した状態での光量が測定できるとともに、ハイブリダイズ反応中のリアルタイム測定も可能となる。
次に、ターゲット６とドナー蛍光プローブ２とをハイブリダイズ反応させる（ステップＳ２３）。ターゲット６とドナー蛍光プローブ２とをハイブリダイズ反応させると、ターゲット６がドナー蛍光プローブ２の検出配列２３に結合し、結合部２２でのドナー蛍光プローブ２と消光プローブ３の結合が外れて、消光分子５と蛍光分子４の距離が離れる。これにより、蛍光分子４の消光状態が解かれ、励起光の照射により蛍光分子４が蛍光を呈するようになる。このＤＮＡマイクロアレイ１の固相面からの蛍光画像を、蛍光読取装置で取得する（ステップＳ２４）。次に、取得された蛍光画像から、蛍光量を算出する（ステップＳ２５）。このように、ドナー蛍光プローブ２が蛍光を呈するか否かでサンプル中の対象核酸（ターゲット６）の有無を確認することができる。また、蛍光光量を定量することにより、サンプル中のターゲット量を定量することができる。また、この時、溶液中に含まれる捕集されていないターゲット６は蛍光を呈さないために、洗浄する必要がない。したがって、ターゲット溶液存在下で、溶液を通して固相表面を観察することが可能である。このため、洗浄の影響を排した状態での光量が測定できるとともに、ハイブリダイズ反応中のリアルタイム測定も可能となる。
【0050】
次に、ターゲット計測装置について説明する。
ターゲット計測装置としては、本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法により製造されたターゲット計測用デバイスと、前記ターゲット計測用デバイスからの、蛍光分子の蛍光量を測定する蛍光読取装置とを有するもの等が挙げられる。
図５はターゲット計測装置を示す構成図の一例である。図５に示したターゲット計測装置はターゲット計測用デバイス１０のターゲットと、捕捉分子とが結合する前後の画像を取得するため、結合前の画像を取得後、温調ステージによりターゲット計測用デバイス１０の固相面の温度を上昇させて結合反応を進行させ、再び常温に下げた状態で結合後の画像を取得する。例えば、基板の固相面にドナー蛍光プローブ２を固定化されている場合は、ターゲット６をドナー蛍光プローブ２とハイブリダイズ反応させ、ハイブリダイズ反応前後の画像を取得する。
ターゲット計測装置としては、本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法により製造されたターゲット計測用デバイスと、前記ターゲット計測用デバイスからの、蛍光分子の蛍光量を測定する蛍光読取装置とを有するもの等が挙げられる。
図５はターゲット計測装置を示す構成図の一例である。図５に示したターゲット計測装置はターゲット計測用デバイス１０のターゲットと、捕捉分子とが結合する前後の画像を取得するため、結合前の画像を取得後、温調ステージによりターゲット計測用デバイス１０の固相面の温度を上昇させて結合反応を進行させ、再び常温に下げた状態で結合後の画像を取得する。例えば、基板の固相面にドナー蛍光プローブ２を固定化されている場合は、ターゲット６をドナー蛍光プローブ２とハイブリダイズ反応させ、ハイブリダイズ反応前後の画像を取得する。
【0051】
温調ステージは、ターゲットと捕捉分子との結合を促進するために、ターゲットと捕捉分子との反応中に、振とうまたはターゲット計測用デバイスの回転、ボルテックスミキサー等による撹拌機能があることが好ましい。
【0052】
蛍光読取装置４０の光学系では、レーザー光源４１から出射されたレーザー光はミラー４５を介してダイクロイックミラー４４で反射されターゲット計測用デバイスの固相を照射する。照射された光がターゲット計測用デバイス１０の固相面上にある蛍光分子４に対する励起光３３となり、蛍光分子４が励起状態になって蛍光分子４が蛍光３４を放射する。
【0053】
ターゲット計測用デバイス１０の固相面から放出された蛍光は、ダイクロイックミラー４４を透過し結像光学系４３を介して、ＣＣＤカメラ４２の検出素子上に蛍光画像が結像し検出される。ここで蛍光３４中に励起光３３が漏れ入るのを防ぐ目的で、励起光３３側に励起光波長に合わせたバンドパスフィルタを設置してもよく、蛍光３４側に検出したい蛍光波長に合わせたバンドパスフィルタを設置してもよい。
【0054】
ターゲット計測装置により得られる蛍光画像は、同一スポットのターゲットと捕捉分子の結合前後の画像を取得することができる。そのため、固相間、スポット間の光量のばらつきの影響を受けない。また、結合反応前後の蛍光画像から蛍光変化量を演算し、結合反応した分子数を算出することができる。蛍光変化量の演算は、スポット全体の平均光量を使用してもよいし、スポット画像の各ピクセルの蛍光変化量を使用してもよい。
【0055】
ターゲット計測装置は、ＣＣＤカメラ４２をコントロールするコンピュータと、画像の光量を計算する演算装置、画像と光量等を保存する記録装置を備えていてもよい。
【0056】
ターゲット計測装置は、固相面上の検出スポットの固定化面と反対側の面から蛍光を検出するため、蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡、エバネッセント蛍光検出装置、薄膜斜光照明顕微鏡、シート照明顕微鏡、構造化照明顕微鏡、多光子励起顕微鏡などを使用することができる。ターゲット計測装置は以上の構成に限定されず、各機能に分割した装置によって実施されることでもよい。
【0057】
次に、本発明のターゲット計測用キットについて説明する。本発明のターゲット計測用キットは、本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法に用いることができる。
本発明のターゲット計測用キットは、サンプルに含まれるターゲットを計測する際に用いられるターゲット計測用キットであって、基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子と、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に結合する蛍光分子と、前記捕捉分子の前記基板結合部が固定される固相面を有する基板と、を含む。
本発明のターゲット計測用キットは、サンプルに含まれるターゲットを計測する際に用いられるターゲット計測用キットであって、基板結合部及び蛍光分子結合部を有し、前記ターゲットと特異的に結合する捕捉分子と、前記捕捉分子の前記蛍光分子結合部に結合する蛍光分子と、前記捕捉分子の前記基板結合部が固定される固相面を有する基板と、を含む。
【0058】
捕捉分子は、基板結合部で基板に結合されていてもよい。捕捉分子が、基板結合部で基板に結合されている場合は、捕捉分子が結合している基板の固相面の未反応の結合部は、ブロッキング液を用いてブロッキングされていることが好ましい。ブロッキング液としては、前述したブロッキング液が用いられる。
【0059】
本発明のターゲット計測用キットは、基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を含んでいてもよい。消光分子は、捕捉分子結合分子の基板結合部を基板の固相面に結合させ、前記捕捉分子の蛍光分子結合部に蛍光分子が結合したときに、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように、捕捉分子結合分子に付加する。
【0060】
ターゲット、捕捉分子、及び、捕捉分子結合分子としては、前述のターゲット、捕捉分子、及び、捕捉分子結合分子が挙げられる。本発明のターゲット計測用キットとしては、例えば、ターゲットが、特定の核酸配列を有するターゲットであり、捕捉分子として、前記特定の核酸配列と相補的な配列を有する検出プローブであるキット、ターゲットが、特定の核酸配列を有するターゲットであり、捕捉分子が、前記特定の核酸配列と相補的な配列を有する検出プローブであり、捕捉分子結合分子が、前記検出プローブと相補的な核酸配列を有する消光プローブであるキット等が挙げられる。
【0061】
本発明のターゲット計測用キットにおいて、基板、蛍光分子、及び、消光分子は前述したものが挙げられる。本発明のターゲット計測用キットは、さらに、ターゲットを定量するために必要な標準液、必要な緩衝液、製品説明書等を含んでいてもよい。
【0062】
次に、本発明のターゲット計測用キットの使用方法について説明する。
まず、捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部とを結合させ、捕捉分子を基板の固相面に固定化する。ただし、本発明のターゲット測定用キットが、既に、捕捉分子が、捕捉分子の基板結合部で、基板に結合されているキットである場合は、この固定化工程は行わなくてよい。ターゲット計測用デバイスが、さらに、基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を備える場合には、捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部とを結合させ、捕捉分子を基板の固相面に固定化するとともに、捕捉分子結合分子の基板結合部を、捕捉分子結合分子に蛍光分子が結合したときに、蛍光分子に接近した消光分子により蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように基板の固相面に結合させる。捕捉分子と捕捉分子結合分子とは、結合させた後に、各々の基板結合部を介して、基板の固相面に固定化してもよい。なお、本発明のターゲット測定用キットが、既に、基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を含むキットである場合は、この捕捉分子結合分子を基板の固相面に結合させる工程は行わなくてよい。
まず、捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部とを結合させ、捕捉分子を基板の固相面に固定化する。ただし、本発明のターゲット測定用キットが、既に、捕捉分子が、捕捉分子の基板結合部で、基板に結合されているキットである場合は、この固定化工程は行わなくてよい。ターゲット計測用デバイスが、さらに、基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、前記捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を備える場合には、捕捉分子の基板結合部と、基板の捕捉分子結合部とを結合させ、捕捉分子を基板の固相面に固定化するとともに、捕捉分子結合分子の基板結合部を、捕捉分子結合分子に蛍光分子が結合したときに、蛍光分子に接近した消光分子により蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように基板の固相面に結合させる。捕捉分子と捕捉分子結合分子とは、結合させた後に、各々の基板結合部を介して、基板の固相面に固定化してもよい。なお、本発明のターゲット測定用キットが、既に、基板結合部及び所定の位置に付加された消光分子を有し、捕捉分子に特異的に結合する捕捉分子結合分子を含むキットである場合は、この捕捉分子結合分子を基板の固相面に結合させる工程は行わなくてよい。
【0063】
例えば、ＤＮＡプローブを基板の固相面に固定化する場合は、ＤＮＡプローブを基板の固相面にスポッター等を用いてスポットする。次に、基板を乾燥させることにより、ＤＮＡプローブを基板の固相面に固定化する。捕捉分子結合分子として、消光プローブを用いる場合は、上記で得られたプローブ液を加熱後、急冷し、ＤＮＡプローブと消光プローブをカップリングさせた後、カップリングしたＤＮＡプローブと消光プローブとを、基板の固相面に固定させる。消光プローブは、ＤＮＡプローブが有する塩基配列と相補的な核酸配列を有するため、ＤＮＡプローブとカップリングする。例えば、プローブ液を９５℃に加熱後、５分間温度を保持し、その後、氷冷することで、ＤＮＡプローブと消光プローブをカップリングさせる。カップリングしたＤＮＡプローブと消光プローブとは、それぞれが有する基板結合部を介して基板に固定化される。
【0064】
捕捉分子をスポットする固相面上の領域は、予め規定された数を単位としたブロック毎に区分けされていてもよい。ターゲット計測用デバイスに対するターゲット溶液の添加は、ブロック毎に行われる。また、ターゲット計測用デバイスの画像取得は、ブロック毎に行われることが多い。つまり、ブロックは、画像取得領域であるということができる。
【0065】
次に、基板の固相面の未反応の結合部をブロッキングする。ブロッキングは、前記で乾燥させた基板の固相面を、ブロッキング液に液浸し、未反応の結合部を不活性化する。ブロッキング剤としては、前述したブロッキング剤が用いられる。なお、本発明のターゲット計測用キットにおいて、既に捕捉分子が、捕捉分子の基板結合部で基板に結合されており、基板の固相面の未反応の結合部がブロッキングされているキットを用いる場合は、このブロッキング工程は行わなくてよい。
【0066】
次に、表面をブロッキングした基板の固相面を洗浄する。洗浄は、表面をブロッキングした基板の固相面を洗浄液で洗浄し、固定化されていない余剰の捕捉分子及びブロッキング液を除去し、洗浄液も除去する。捕捉分子としてＤＮＡプローブを用いる場合は、基板に固定化されていない余剰のＤＮＡプローブ、及びブロッキング液を除去し、洗浄液も除去する。捕捉分子結合分子として、前記消光プローブを用いる場合は、基板に固定化されていない余剰の消光プローブも除去される。
【0067】
次に、捕捉分子の蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる。捕捉分子がＤＮＡプローブである場合は、ＤＮＡプローブの蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させる。捕捉分子と蛍光分子との結合は、捕捉分子が有する蛍光分子結合部と蛍光分子の捕捉分子結合部とを反応させることで行うことができる。捕捉分子への蛍光分子の結合方法としては、固相表面がブロッキングされた基板の、捕捉分子がスポットとして固定化された面に対して蛍光分子を含む溶液を接液することで実施することができる。例えば、カバーガラスや専用の容器を使用することで蛍光分子を含む溶液と、表面がブロッキングされた基板とを接液した状態でインキュベートすることで、蛍光分子を捕捉分子の蛍光分子結合部に結合させることができる。捕捉分子の蛍光分子結合部を保護した場合は、蛍光分子を捕捉分子の蛍光分子結合部に結合させる前に、脱保護する。例えば、蛍光分子結合部が、チオールである捕捉分子に、蛍光分子を結合させる場合には、蛍光分子を結合させる前に、予めチオールの脱保護を基板表面で実施する。
【0068】
捕捉分子の蛍光分子結合部に蛍光分子を結合させた後は、製造された核酸配列計測デバイスの基板の固相面を洗浄し、捕捉分子に結合されなかった余剰の蛍光分子を除去し、洗浄液を除去する。
以上の手順により製造されたキットは、遮光、温度、湿度条件等、基板、基板に固定化したターゲットや捕捉分子等の性質に適した環境下で使用まで適宜保存される。
以上の手順により製造されたキットは、遮光、温度、湿度条件等、基板、基板に固定化したターゲットや捕捉分子等の性質に適した環境下で使用まで適宜保存される。
【0069】
本発明のターゲット計測用キットを用いて製造されたターゲット計測用デバイスは、前記したターゲット計測方法に使用することができる。
【0070】
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、ターゲット計測用デバイスの製造方法、及びターゲット計測用キットに対し、広く適用することができる。
【0071】
本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法で製造されるターゲット計測用デバイス、及びターゲット計測用キットは、蛍光分子光量計測におけるドライ画像測定、バイオチップの蛍光分子光量の液中観察、及び連続反応におけるリアルタイム観察等に使用することができる。具体的には、例えば、遺伝子・高分子分析による菌種判別、がん遺伝子、動植物判別、腸内細菌の検査等に用いることができる。
【0072】
また、本発明のターゲット計測用デバイスの製造方法で製造されたターゲット計測用デバイス、及びターゲット計測用キットは、臨床検査等に使用される標識抗体法等のような固相法にも適用される。例えば、組織や細胞内の特定の染色体や遺伝子の発現を、蛍光物質を用いて蛍光測定するＦＩＳＨ法（蛍光 ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション）が一例として挙げられる。この他にも、ユーロピウム等の蛍光発光物質を標識として抗原抗体反応を測定するＦＩＡ法（蛍光免疫測定法）や、抗原となる病原体等に蛍光物質をラベルした血清（抗体）反応を測定するＩＦＡ法（間接蛍光抗体法）にも適用される。
【実施例0073】
以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【0074】
（実施例１）
基板表面の結合部として活性エステルを有する基板を、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に５分間浸漬することでブロッキング処理を行い、基板表面上の結合部を不活化させた。その後１００℃の蒸留水に２分間、０℃の蒸留水に２分間浸漬してエアブローで表面の水滴を除去することで洗浄を行った。
蛍光分子Ｃｙ３（ＧＥヘルスケア社製）およびＢ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＡｎａＴａｇ Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ：アナスペック社製）をそれぞれ終濃度１０μＭになるように０．７Ｍリン酸緩衝液に溶解し、蛍光分子溶液を調製した。
上記で得られたブロッキング処理済みの基板と、ブロッキング処理を行わない基板とを用意し、それぞれに蛍光分子溶液を１μＬ滴下して１２０分間、常温の湿潤チャンバでインキュベートした。その後、基板を常温の蒸留水に２分間浸漬してエアブローで表面の水滴を除去することで洗浄した。蛍光分子溶液の滴下スポットを励起波長５３２ｎｍ、蛍光検出波長５６３～６３３ｎｍの蛍光読取装置により蛍光画像を取得し、スポットの光量から基板の非特異的な蛍光分子の吸着を確認した。その結果を図６に示す。
基板表面の結合部として活性エステルを有する基板を、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に５分間浸漬することでブロッキング処理を行い、基板表面上の結合部を不活化させた。その後１００℃の蒸留水に２分間、０℃の蒸留水に２分間浸漬してエアブローで表面の水滴を除去することで洗浄を行った。
蛍光分子Ｃｙ３（ＧＥヘルスケア社製）およびＢ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＡｎａＴａｇ Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ：アナスペック社製）をそれぞれ終濃度１０μＭになるように０．７Ｍリン酸緩衝液に溶解し、蛍光分子溶液を調製した。
上記で得られたブロッキング処理済みの基板と、ブロッキング処理を行わない基板とを用意し、それぞれに蛍光分子溶液を１μＬ滴下して１２０分間、常温の湿潤チャンバでインキュベートした。その後、基板を常温の蒸留水に２分間浸漬してエアブローで表面の水滴を除去することで洗浄した。蛍光分子溶液の滴下スポットを励起波長５３２ｎｍ、蛍光検出波長５６３～６３３ｎｍの蛍光読取装置により蛍光画像を取得し、スポットの光量から基板の非特異的な蛍光分子の吸着を確認した。その結果を図６に示す。
【0075】
図６に示したように、分子量の小さい蛍光色素であるＣｙ３ではブロッキングによって１／１０以下に非特異的な吸着が減少した。Ｃｙ３に比較して分子構造が複雑で分子中に多種多数の結合部を含む蛍光タンパク質の一種であるＢ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎではブロッキングによって１／２以下に非特異的な吸着を減少させることができた。
【0076】
（実施例２）
５’末端にチオール基、３’末端にアミノ基が修飾された合成オリゴＤＮＡからなるプローブと、５’末端にアミノ基、３’末端に消光分子である、ＢＨＱ２が修飾された合成オリゴＤＮＡからなるプローブ（消光プローブ）をそれぞれ１０μＭになるように０．７Ｍリン酸バッファに溶解し、プローブ溶液を調製した。プローブ溶液を、基板に１μＬ滴下した。
基板を６０分間、８０℃に設定したヒートブロック上にプローブ溶液の滴下面を上にして設置し、遮光状態でインキュベートしてプローブを基板に固定化した。次に、得られたプローブが固定化された基板を０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に５分間浸漬することで、ブロッキング処理を行い、基板表面上の結合部を不活化させた。その後、１００℃の蒸留水に２分間、０℃の蒸留水に２分間浸漬してエアブローで表面の水滴を除去することで洗浄を行った。基板上に固定化されたプローブのチオール基の脱保護として、固定化面に０．１Ｍジチオトレイトール水溶液をギャップ付きカバーガラスで保持し、室温の湿潤チャンバで３０分間インキュベートした。その後、常温の蒸留水に基板を２分間浸漬しエアブローで表面の水滴を除去することで、基板の洗浄を行った。
５’末端にチオール基、３’末端にアミノ基が修飾された合成オリゴＤＮＡからなるプローブと、５’末端にアミノ基、３’末端に消光分子である、ＢＨＱ２が修飾された合成オリゴＤＮＡからなるプローブ（消光プローブ）をそれぞれ１０μＭになるように０．７Ｍリン酸バッファに溶解し、プローブ溶液を調製した。プローブ溶液を、基板に１μＬ滴下した。
基板を６０分間、８０℃に設定したヒートブロック上にプローブ溶液の滴下面を上にして設置し、遮光状態でインキュベートしてプローブを基板に固定化した。次に、得られたプローブが固定化された基板を０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に５分間浸漬することで、ブロッキング処理を行い、基板表面上の結合部を不活化させた。その後、１００℃の蒸留水に２分間、０℃の蒸留水に２分間浸漬してエアブローで表面の水滴を除去することで洗浄を行った。基板上に固定化されたプローブのチオール基の脱保護として、固定化面に０．１Ｍジチオトレイトール水溶液をギャップ付きカバーガラスで保持し、室温の湿潤チャンバで３０分間インキュベートした。その後、常温の蒸留水に基板を２分間浸漬しエアブローで表面の水滴を除去することで、基板の洗浄を行った。
【0077】
次に、基板のプローブ固定化面に対して蛍光分子である、Ｃｙ３ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）を１０μＭになるように０．７Ｍリン酸緩衝液に溶解した溶液をギャップ付きカバーガラスで保持し、室温の湿潤チャンバで、１２０分間常温でインキュベートし、Ｃｙｓ３とプローブとを反応させた。その後、１００℃の蒸留水に２分間、０℃の蒸留水に２分間浸漬してエアブローで表面の水滴を除去することで、基板の洗浄を行った。以上の方法により基板上にドナー蛍光プローブと消光プローブがカップリングしたプローブが固定化されたターゲット計測用デバイスを作製した。
【0078】
次に、５０ｎＭのターゲット合成オリゴＤＮＡの終濃度が５×ＳＳＣの溶液になるようにターゲット溶液を調製し、上記で作製したターゲット計測用デバイスのプローブ固定面に、チャンバでターゲット溶液を保持し、６０℃、５ｒｐｍ、３０分間インキュベートすることにより、プローブとターゲットとをハイブリダイズ反応させた。基板のプローブが固定化されたスポットが呈する蛍光画像を、励起波長５３２ｎｍ、蛍光検出波長５６３～６３３ｎｍの蛍光読取装置により取得し、スポットの光量を測定し、Ｓ／Ｎを評価した。その結果を図７に示す。
【0079】
図７に示したように、作製したターゲット計測用デバイスはターゲットを含まない状態では蛍光分子が消光された状態にあり、ターゲットとハイブリダイズすると光量が上昇し、Ｓ／Ｎが１０程度で検出可能であった。また、消光プローブを含まずドナー蛍光プローブとしてチオール基が修飾されたプローブだけ固定化した後に、蛍光分子を結合させた場合は、ドナー蛍光プローブをスポットした箇所において蛍光が観察され、その光量は、ターゲットがプローブにハイブリダイズ反応したときにおける光量とほぼ一致した。このことにより、ドナー蛍光プローブに蛍光分子が結合しており、作製したターゲット計測用デバイスにより、正確にターゲットを計測できることが確認された。
【符号の説明】
【0080】
１ ＤＮＡマイクロアレイ
２ ドナー蛍光プローブ
３ 消光プローブ
４ 蛍光分子
５ 消光分子
６ ターゲット
７ 蛍光分子結合部
８ 表面ブロッキングＤＮＡマイクロアレイ
２１ リンカー
２３ 検出配列
１０ ターゲット計測用デバイス
４０ 蛍光読取装置
４１ レーザー光源
４２ ＣＣＤカメラ
４３ 結像光学系
４４ ダイクロイックミラー
４５ ミラー
４６ ステージ
２ ドナー蛍光プローブ
３ 消光プローブ
４ 蛍光分子
５ 消光分子
６ ターゲット
７ 蛍光分子結合部
８ 表面ブロッキングＤＮＡマイクロアレイ
２１ リンカー
２３ 検出配列
１０ ターゲット計測用デバイス
４０ 蛍光読取装置
４１ レーザー光源
４２ ＣＣＤカメラ
４３ 結像光学系
４４ ダイクロイックミラー
４５ ミラー
４６ ステージ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】