特開 2022-11525 エンドトキシン検出方法及びエンドトキシン検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022011525

(43)【公開日】2022-01-17

(54)【発明の名称】エンドトキシン検出方法及びエンドトキシン検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/579 20060101AFI20220107BHJP

【ＦＩ】

G01N33/579

【審査請求】未請求

【請求項の数】16

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020112719

(22)【出願日】2020-06-30

(71)【出願人】

【識別番号】000245531

【氏名又は名称】野村マイクロ・サイエンス株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】502350504

【氏名又は名称】学校法人上智学院

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】特許業務法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】木本 洋

(72)【発明者】

【氏名】飯山 真充

(72)【発明者】

【氏名】橋本 剛

(72)【発明者】

【氏名】早下 隆士

(57)【要約】

【課題】リムルス試験によらず、また、電気化学的な方法によらずに、簡便かつ迅速に、低濃度でも定量可能なエンドトキシンの検出方法及びその検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法の提供。
【解決手段】蛍光部位と認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を用いて被験対象の試料からエンドトキシンを検出するエンドトキシン検出方法であって、前記認識部位はエンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛍光部位と認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を用いて被験対象の試料からエンドトキシンを検出するエンドトキシン検出方法であって、
前記認識部位はエンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する、エンドトキシン検出方法。

【請求項2】

前記蛍光物質における前記スペーサは炭素数１～１０で、前記蛍光部位から前記スペーサを経て前記認識部位までの間を直鎖として連結する化学結合は単結合のみである、請求項１に記載のエンドトキシン検出方法。

【請求項3】

前記蛍光物質は、前記認識部位として金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位されたジピコリルアミノ基を有し、前記蛍光部位として７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸を有し、かつ前記スペーサの炭素数が１である、下記式に示すｄｐａ－ＨＣＣであり、
前記特定部位はエンドトキシンのリン酸基である、請求項２に記載のエンドトキシン検出方法。

【化1】

【請求項4】

前記金属イオンは、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋）である、請求項３に記載のエンドトキシン検出方法。

【請求項5】

前記蛍光物質は、前記認識部位としてフェニルボロン酸を有し、前記蛍光部位としてピレンを有し、かつ前記スペーサがアミド結合を有する、下記式に示すＣ１－ＡＰＢであり、
前記特定部位はエンドトキシンの糖鎖部分である、請求項２に記載のエンドトキシン検出方法。

【化2】

【請求項6】

被験対象の試料が導入される試料導入部と、
蛍光部位と、エンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を前記試料に供給する供給部と、
前記試料と前記蛍光物質とが反応する反応部と、
前記反応を被った前記蛍光物質の発光又は発色を検出する検出部と、
を備える、エンドトキシン検出装置。

【請求項7】

前記蛍光物質における前記スペーサは炭素数１～１０で、前記蛍光部位から前記スペーサを経て前記認識部位までの間を直鎖として連結する化学結合は単結合のみである、請求項６に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項8】

前記蛍光物質は、前記認識部位として金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位されたジピコリルアミノ基を有し、前記蛍光部位として７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸を有し、かつ前記スペーサの炭素数が１である、下記式に示すｄｐａ－ＨＣＣであり、
前記特定部位はエンドトキシンのリン酸基である、請求項７に記載のエンドトキシン検出装置。

【化3】

【請求項9】

前記金属イオンは、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋）である、請求項８に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項10】

前記蛍光物質は、前記認識部位としてフェニルボロン酸を有し、前記蛍光部位としてピレンを有し、かつ前記スペーサがアミド結合を有する、下記式に示すＣ１－ＡＰＢであり、
前記特定部位はエンドトキシンの糖鎖部分である、請求項７に記載のエンドトキシン検出装置。

【化4】

【請求項11】

前記試料は、精製水製造設備で製造された精製水又は注射用水製造設備で製造された注射用水から採取される、請求項６から請求項１０までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項12】

原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、
前記精製水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、
請求項６から請求項１１までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出装置と、
を備える精製水製造設備。

【請求項13】

原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、
前記精製水をろ過する高分子膜ろ過装置又は前記精製水を蒸留する蒸留器により前記精製水から注射用水を得る注射用水製造部と、
前記注射用水を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンクと、
前記注射用水タンクに備えられている前記注射用水を所定の使用場所へ送出する送出ラインと、
前記注射用水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、
請求項６から請求項１１までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出装置と、
を備える注射用水製造設備。

【請求項14】

前記試料採取部は、前記注射用水製造部より下流側でかつ前記注射用水タンクより上流側において、前記注射用水タンクから直接、又は、前記送出ラインから、前記試料を採取する、請求項１３に記載の注射用水製造設備。

【請求項15】

原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得て、
前記精製水から採取された前記被験対象の試料を、請求項１から請求項５までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出方法に供することを特徴とする精製水製造方法。

【請求項16】

原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得て、
前記精製水の高分子膜ろ過によるろ過により、又は、前記精製水の蒸留により、前記精製水から注射用水を得て、
前記注射用水から採取された前記被験対象の試料を、請求項１から請求項５までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出方法に供することを特徴とする注射用水製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、被験対象の試料中のエンドトキシン検出方法及びエンドトキシン検出装置に関し、さらに精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

精製水とは、常水を蒸留、イオン交換樹脂塔又は電気式脱塩装置（ＥＤＩ）等によるイオン交換、逆浸透若しくは限外ろ過、紫外線照射装置（ＵＶ）又はそれらの組み合わせにより精製したもので、製剤の原料のみでなく、試薬の調製などにも使用される。この精製水を滅菌した滅菌精製水は、発熱性物質（エンドトキシン）の確認なしでは注射液の製造に用いられる注射用水（ＷＦＩ、Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の製造には使用できない。ＷＦＩは、精製水を滅菌したのち、所定のエンドトキシン試験に適合したものである。

【0003】

ＷＦＩ製造設備の一例として、下記特許文献１記載の技術が挙げられる。ＷＦＩの製造には、精製水製造設備で製造された精製水から、蒸留器又は高分子膜ろ過装置（好ましくは限外ろ過膜装置）のようなエンドトキシン除去設備によってエンドトキシンを高度に除去することが必須である。

【0004】

エンドトキシンとは、グラム陰性菌の細胞壁成分であるリポ多糖であり、生活環境に偏在する代表的な発熱物質である。エンドトキシンが血液中に入ると発熱、敗血症性ショック、多臓器不全、頻脈等などの作用が起こることから、医薬品や医療機器、特に生体内へ直接導入される液体や、製薬用水、注射器、人工臓器、透析膜などの医療機器の製造においては、厳重な管理が必要となる。たとえば、「日本薬局方（ＪＰ１７）品質適合試験」における注射用水の管理基準では、０．２５ＥＵ／ｍＬ未満と定められている。

【0005】

エンドトキシンの検出は、カブトガニの血球成分がエンドトキシンにより凝固することを利用したリムルス試験で行われている。リムルス試験では、カブトガニの血液から抽出されたライセート試薬を用いて行うのが現在では標準であるが、試験結果が出るのに１～２時間を要する。さらに、リムルス試験を用いたオンライン測定装置も考案されているが、実用的な定量下限を得ることが難しく、定量性や再現性が乏しい。たとえば、試薬自体が生物由来であるため、その性能は試薬のロットによっても異なる場合がある。このことから、より迅速に試験結果を得られ、かつオンライン測定を実用的な精度で行うことができる検出方法が望まれていた。また、ライセート試薬を得るためにはカブトガニという野生生物を捕獲して採血を行う必要があるため、動物愛護の観点からも、カブトガニの血液を使用しない代替手段の開発が望まれていた。

【0006】

たとえば、下記特許文献２及び特許文献３のように、電気化学的な方法によるエンドトキシンの検出も試みられてきた。しかし、電気化学的な方法によるエンドトキシンの検出は、特に実用的な定量下限を得るためには、検出に用いる電極の作製技術若しくは量産性、要求されるメンテナンス頻度、又は測定の精度や迅速性など課題が多く、実用化には至っていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０１９－０２５４５６号公報

【特許文献2】特開２０１６－１５１４８２号公報

【特許文献3】特開２００７－０９３３７８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

エンドトキシン除去設備において、エンドトキシン除去能力に異常が発生すると、容易にＷＦＩ中のエンドトキシン濃度が増大し、注射液の製造には不適となる。特に近年は、エネルギー消費量の削減のため、このような設備として従来の蒸留器に代えて高分子膜ろ過装置を採用する傾向が強まっている。しかし、高分子膜ろ過装置では高分子膜として樹脂材料が使われているため、たとえば、加熱殺菌を行うたびに樹脂材料が損傷を受けるなど、蒸留器と比較して異常が起きやすいという懸念がある。この懸念が、エンドトキシン除去設備に高分子膜ろ過装置を採用することを妨げる要因となっている。

【0009】

したがって、安定的に要求水質のＷＦＩを製造するためには、エンドトキシン除去設備において異常が発生した際には、高分子膜などの部品を直ちに交換又は修理するなどのメンテナンスを行う必要がある。しかし、エンドトキシン除去能力の異常を迅速に検出できる方法は、まだ実現できていない。

【0010】

本発明は、リムルス試験によらず、また、電気化学的な方法によらずに、簡便かつ迅速に、低濃度でも定量可能なエンドトキシンの検出方法及びその検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法の提供を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本開示のエンドトキシン検出方法は、蛍光部位と認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を用いて被験対象の試料からエンドトキシンを検出する方法であって、前記認識部位はエンドトキシンの分子構造の特定部位を認識するものである。

【0012】

ここで、前記蛍光物質における前記スペーサは炭素数１～１０で、前記蛍光部位から前記スペーサを経て前記認識部位までの間を直鎖として連結する化学結合は単結合のみであることが望ましい。この場合、直鎖の途中には窒素、酸素、硫黄など炭素以外の原子が介在してもよく、また、直鎖の途中からの分岐があってもよい。

【0013】

また、前記蛍光物質は、前記認識部位として金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位されたジピコリルアミノ基を有し、前記蛍光部位として７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸を有し、かつ前記スペーサの炭素数が１である、下記式（１）に示すｄｐａ－ＨＣＣであってもよく、この場合、前記特定部位はエンドトキシンのリン酸基である。

【0014】

【化1】

【0015】

なお、上記式（１）における金属イオンは、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋）であることが望ましく、これらのうちでは銅イオンが最も望ましい。

【0016】

さらに、前記蛍光物質は、前記認識部位としてフェニルボロン酸を有し、前記蛍光部位としてピレンを有し、かつ前記スペーサがアミド結合を有する、下記式（２）に示すＣ１－ＡＰＢであってもよく、この場合、前記特定部位はエンドトキシンの糖鎖部分である。

【0017】

【化2】

【0018】

本開示のエンドトキシン検出装置は、被験対象の試料が導入される試料導入部と、蛍光部位と、エンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を前記試料に供給する供給部と、前記試料と前記蛍光物質とが反応する反応部と、前記反応を被った前記蛍光物質の発光又は発色（これ以降、まとめて「発光」という）を検出する検出部と、を備える。

【0019】

ここで、前記蛍光物質における前記スペーサは炭素数１～１０で、前記蛍光部位から前記スペーサを経て前記認識部位までの間を直鎖として連結する化学結合は単結合のみであることが望ましい。この場合、直鎖の途中には窒素、酸素、硫黄など炭素以外の原子が介在してもよく、また、直鎖の途中からの側鎖があってもよい。

【0020】

また、前記蛍光物質は、前記認識部位として金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位されたジピコリルアミノ基を有し、前記蛍光部位として７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸を有し、かつ前記スペーサの炭素数が１である、前記式（１）に示すｄｐａ－ＨＣＣであってもよく、この場合、前記特定部位はエンドトキシンのリン酸基である。なお、前記式（１）における金属イオンは、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋）であることが望ましく、これらのうちでは銅イオンが最も望ましい。

【0021】

さらに、前記蛍光物質は、前記認識部位としてフェニルボロン酸を有し、前記蛍光部位としてピレンを有し、かつ前記スペーサがアミド結合を有する、前記式（２）に示すＣ１－ＡＰＢであってもよく、この場合、前記特定部位はエンドトキシンの糖鎖部分である。

【0022】

また、前記試料は、精製水製造設備で製造された精製水又は注射用水製造設備で製造された注射用水から採取されることとしてもよい。

【0023】

本開示の精製水製造設備は、原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、前記精製水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、前記エンドトキシン検出装置と、を備える。

【0024】

本開示の注射用水製造設備は、原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、前記精製水をろ過する高分子膜ろ過装置又は前記精製水を蒸留する蒸留器により前記精製水から注射用水を得る注射用水製造部と、前記注射用水を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンクと、前記注射用水タンクに備えられている前記注射用水を所定の使用場所へ送出する送出ラインと、前記注射用水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、前記エンドトキシン検出装置と、を備える。なお、前記試料採取部は、前記注射用水製造部より下流側でかつ前記注射用水タンクより上流側において、前記注射用水タンクから直接、又は、前記送出ラインから、前記試料を採取することが望ましい。

【0025】

本開示の精製水製造設備は、原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得て、前記精製水から採取された前記被験対象の試料を、前記エンドトキシン検出方法に供することを特徴とする。

【0026】

本開示の注射用水製造方法は、原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得て、前記精製水の高分子膜ろ過によるろ過により、又は、前記精製水の蒸留により、前記精製水から注射用水を得て、前記注射用水から採取された前記被験対象の試料を、前記エンドトキシン検出方法に供することを特徴とする。

【発明の効果】

【0027】

上述のとおり、本発明により、リムルス試験によらず、また、電気化学的な方法によらずに、簡便かつ迅速（たとえば、１回の検出につき３０分以内）に、かつ低濃度でも安定して定量可能なエンドトキシンの検出方法及びその検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法提供が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】エンドトキシン検出方法で用いられる蛍光物質の概略構成を模式図で示す。

【図2】エンドトキシン検出装置の構成を模式図で示す。

【図3】精製水製造設備の概略構成を模式図で示す。

【図4】注射用水製造設備の概略構成を模式図で示す。

【図5】ｄｐａ－ＨＣＣにエンドトキシンを加えたときの蛍光スペクトル変化をグラフで示す。

【図6】ｄｐａ－ＨＣＣによるエンドトキシンの定量性をグラフで示す。

【図7】ｄｐａ－ＨＣＣによるリピドＡの定量性をグラフで示す。

【図8】Ｃ１－ＡＰＢにエンドトキシンを加えたときの蛍光スペクトル変化をグラフで示す。

【図9】Ｃ１－ＡＰＢによるエンドトキシンの定量性をグラフで示す。

【図10】ＦＩＡを利用したエンドトキシン検出装置によるエンドトキシンの分析結果をグラフで示す。

【図11】ＦＩＡを利用したエンドトキシン検出装置によるエンドトキシンの定量性をグラフで示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下、実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。なお、図面は概略図又は模式図であり、実際の寸法比率とは必ずしも一致しない。

【0030】

＜エンドトキシン検出方法＞
本開示のエンドトキシン検出方法は、蛍光部位と認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を用いてエンドトキシンを検出する方法である。蛍光物質における認識部位は、エンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する。

【0031】

蛍光物質１０は、図１の模式図に示すような概略構成を有する。すなわち、エンドトキシン５０を認識する認識部位４０と、発光する蛍光部位２０とがスペーサ３０で連結されている。認識部位４０には化学構造に応じて金属イオンが配位される場合もある。

【0032】

エンドトキシン５０は、親水性の部位である糖鎖と、疎水性の部位であるアシル酸とが２分子のグルコサミンを介して結合した構造を有する。グルコサミンにはそれぞれリン酸が結合している（棚本憲一「エンドトキシンと医薬品の品質管理」Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ．，１２６，１９－３３（２００８））。エンドトキシン５０のうち、アシル酸が結合したグルコサミンが２個結合した部分はリピドＡと称され、エンドトキシン５０の生物活性の多くはこの部分に由来する。

【0033】

認識部位４０は、その分子構造に応じて、エンドトキシン５０の特定部位を認識する。換言すると、認識部位４０は、エンドトキシン５０の所定の部位又は官能基と物理的又は化学的に相互作用する官能基であり、より好ましくは、エンドトキシン５０の特定の部位と特異的に相互作用する官能基のうち、認識した場合にその情報（以下、「認識情報」とする。）を蛍光部位２０に伝達することができるものである。ここでいう認識情報とは、たとえば、認識部位４０の化学構造内部における電子の配位状態の変化である。

【0034】

また、認識部位４０が金属錯体を形成し得る化学構造の場合、認識部位４０を構成する官能基と、エンドトキシンの所定の部位又は官能基と物理的又は化学的に相互作用する錯体を形成し得る金属イオンを添加することが望ましい。後述する蛍光部位２０の発光及び消光の機構が光誘起電子移動（Ｐｈｏｔｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＰＥＴ）に依存する場合、この金属イオンとしてｄ軌道が閉殻でない遷移金属イオン(たとえば、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋））を認識部位４０に配位させることが望ましい。そうすることで、エンドトキシン５０が存在しない場合に蛍光部位が消光するため、Ｓ／Ｎ比とともに検出感度を高めることができる。

【0035】

また、錯体が配位すると蛍光部位２０の発光量が著しく増加するので、発光量の減少としてエンドトキシンを検出可能な場合もある。このような金属イオンとしては、たとえば、亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）、カドミウムイオン（Ｃｄ^２＋）がある。

【0036】

たとえば、下記式（３）に示すジピコリルアミノ基に金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位された化学構造が認識部位４０となる場合であって、この金属イオンが銅イオン、ニッケルイオン又はコバルトイオン、亜鉛イオン、カドミウムイオンであるとき、この認識部位４０は、エンドトキシン５０のグルコサミンに結合したリン酸を認識する。

【0037】

【化3】

【0038】

また、下記式（４）に示すフェニルボロン酸が認識部位４０となる場合、この認識部位４０は、エンドキシンの糖鎖を認識する。

【0039】

【化4】

【0040】

この他、認識部位４０となり得る化学構造は、たとえば、イミノ二酢酸及びグアニジノ基がある。

【0041】

認識部位４０は、特定部位を認識すると、化学構造内で電子の配位状態が変化する。この電子の配位状態の変化が、認識情報として後述する蛍光部位２０に伝達される。認識情報が伝達された蛍光部位２０では電子の配位状態が変化することで、蛍光部位２０の発光強度を変化（増大又は減衰）させ、これにより認識部位４０が特定部位を認識していることが可視化される。

【0042】

蛍光部位２０は、発光する性質の物質であって、認識部位４０における認識情報を受け取ることで発光特性が変化するものである。ここで、「発光」とは、蛍光又は燐光が発生することをいう。なお、大きい光量を得ることでエンドトキシンの検出感度をよくする観点からは、蛍光の発生がより好ましい。このような物質としては、共役多重結合を有するものが好ましく、構造の一部は環状であることが好ましい。なお、共役多重結合の部位には炭素原子以外の物質が含まれる複素化合物でもよい。たとえば、下記式（５）に示すクマリン、下記式（６）に示すビフェニル、下記式（７）に示すピレン、下記式（８）に示すスチルベン及び下記式（９）に示すアントラセン並びにこれらの誘導体、有機エレクトロルミネセンス用色素、並びに蛍光蛋白質が蛍光部位２０として利用可能である。

【0043】

【化5】

【0044】

【化6】

【0045】

【化7】

【0046】

【化8】

【0047】

【化9】

【0048】

蛍光部位２０として利用可能なクマリン誘導体としては、クマリン１、クマリン６、クマリン７、クマリン３０、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸及び８－（２，２’－ジピコリルアミノメチル）－７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸等が挙げられるが、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸が最も好ましい。

【0049】

蛍光部位２０として利用可能なビフェニル誘導体としては、４－ビフェニルカルボン酸、２－（４’－ｔ－ブチルフェニル）－５－（４’－ビフェニル）１，３，４－オキサジアゾール、２，５－ビス－（２－（４－ビフェニル）エテニル）ピラジン及び４，４’－ビス（２，２－ジフェニルビニル）ビフェニル等が挙げられるが、検出感度の面から、４－ビフェニルカルボン酸が最も好ましい。

【0050】

蛍光部位２０として利用可能なピレン誘導体としては、アルキニルピレンが挙げられるが、検出感度の面から、上記式（７）に示すピレンが最も好ましい。

【0051】

蛍光部位２０として利用可能なスチルベン誘導体としては、１，１，４，４－テトラフェニル－１，３－ブタジエン、４，４’－ビス（２，２－ジフェニルビニル）ビフェニル及びシアノスチルベン等が挙げられるが、検出感度の面から、上記式（８）に示すスチルベンが最も好ましい。

【0052】

蛍光部位２０として利用可能なアントラセン誘導体としては、１０－［２－（９アントラセニル）エチル］フェノキサジン、１０－［２－（９－アントラセニル）エチル］フェノチアジン及び２－（９－アントラセニル）エチルジフェニルアミン等が挙げられるが、検出感度の面から、上記式（９）に示すアントラセンが最も好ましい。

【0053】

蛍光部位２０として利用可能な蛍光蛋白質としては、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＹＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＰＡ－ＧＦＰ（Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられるが、ＧＦＰが最も好ましい。

【0054】

スペーサ３０とは、蛍光部位２０と認識部位４０との結合を仲介する物質である。より好ましくは、認識部位４０から蛍光部位２０への認識情報の受け渡しが効率的に行われる大きさ及び構造を有する物質である。具体的には、炭素数１～１０のアルキル直鎖若しくはこのようなアルキル直鎖の途中に炭素以外の原子（たとえば、酸素、窒素又は硫黄）が介在したもの、又はこれらに側鎖が結合した誘導体が望ましい。ただし、認識部位４０から蛍光部位２０までを連結する直鎖の化学結合は単結合のみであることが望ましい。

【0055】

蛍光部位２０は疎水性を示す場合が多く、認識部位４０は親水性を示す場合が多い。したがって、たとえば、スペーサ３０の種類を適切なものにして、蛍光物質１０に十分な親水性を持たせることにより蛍光物質１０が水溶性を持つこととなり、たとえば有機溶媒等に溶かして使用する等の必要がなく、検出精度を高くすることが可能である。スペーサ３０の種類を適切なものにする方法としては、たとえば、スペーサ３０の炭素数を調整したり、水溶性の側鎖を導入したり、窒素等の元素を導入する方法が考えられる。なお、同様の調整を、蛍光部位２０や認識部位４０に対して行うことも可能である。

【0056】

具体的な蛍光物質の例としては、前記式（３）に示す、金属イオンが配位されたジピコリルアミノ基と、前記式（５）に示すクマリンの誘導体である７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸とが、炭素数１のスペーサを介して結合された、前記式（１）に示すｄｐａ－ＨＣＣが挙げられる。

【0057】

ｄｐａ－ＨＣＣの蛍光部位２０である７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸は、単体では、たとえば３９６ｎｍの励起波長に対し、４４８ｎｍに蛍光強度のピークを示す。この７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸にスペーサ３０（－ＣＨ_２－）を介してジピコリルアミノ基が結合されたｄｐａ－ＨＣＣでは、ジピコリルアミノ基の分岐窒素原子の非共有電子対が電子供与部として蛍光部位へＰＥＴにより移動し、蛍光が一部抑制されている。さらにこのｄｐａ－ＨＣＣに、前記化学式３に示す金属イオンとして銅イオン、ニッケルイオン又はコバルトイオン（以下、「銅イオン等」とする。）が配位されると、蛍光部位２０である７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸から、銅イオン等の空いたｄ軌道へ電子が流れ込むＬＭＣＴ（Ｌｉｇａｎｄ ｔｏ Ｍｅｔａｌ Ｃｈａｒｇｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって蛍光が減衰した状態となる。

【0058】

ところが、エンドトキシン５０の存在下では、ｄｐａ－ＨＣＣは、減衰していた蛍光が復活する。つまり、ジピコリルアミノ基に配位している銅イオン等にエンドトキシン５０のリン酸基が配位すると、銅イオン等とｄｐａ－ＨＣＣとの化学結合が弱められることで、減衰していた７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸の蛍光が復活するものと考えられる。すなわち、蛍光物質１０としてのｄｐａ－ＨＣＣの認識部位４０が認識する特定部位は、エンドトキシン５０のリン酸基である。

【0059】

具体的な蛍光物質の別の例としては、前記式（４）に示すフェニルボロン酸と、前記式（７）に示すピレンとが、スペーサ３０としてのアミド結合で連結された、前記式（２）に示すＣ１－ＡＰＢが挙げられる。

【0060】

このＣ１－ＡＰＢは、エンドトキシン５０のない状態では、蛍光部位２０であるピレンから、フェニルボロン酸へ電子が流れ込むＰＥＴによって蛍光が減衰した状態となる。一方、エンドトキシン５０がある状態では、Ｃ１－ＡＰＢは蛍光を発する。つまり、フェニルボロン酸とエンドトキシン５０の糖鎖部分に存在するヒドロキシル基との相互作用によって、フェニルボロン酸の電子受容性が減少し、減衰していたピレンの蛍光が復活するものと考えられる。すなわち、蛍光物質１０としてのＣ１－ＡＰＢの認識部位４０が認識する特定部位は、エンドトキシン５０の糖鎖部分である。

【0061】

なお、本開示のエンドトキシン検出方法では、異なる特定部位を認識する認識部位４０を有する複数の蛍光物質１０を用いてもよい。これにより、エンドトキシンの多点認識が可能となり、より特異性及び検出感度が増す。たとえば、上述のｄｐａ－ＨＣＣとＣ１－ＡＰＢとを混合したものを蛍光試薬として試料に添加し、蛍光強度を２波長で検出することができる。さらに、複数の認識部位４０を持つ蛍光物質１０、もしくは、複数の蛍光部位２０を持つ蛍光物質１０を用いても、同様の効果が得られる。この場合、スペーサ３０として、側鎖を持ったものを用いたり、スペーサ３０を複数使用すればよい。

【0062】

＜エンドトキシン検出装置＞
図２は、本開示のエンドトキシン検出装置１００の一例を模式図で示すものである。本開示のエンドトキシン検出装置１００は、被験対象の試料９６０が導入される試料導入部２００と、上述の蛍光物質１０を前記試料に供給する供給部３００と、前記試料９６０と前記蛍光物質１０とが反応する反応部４００と、前記反応を被った前記蛍光物質１０の蛍光を検出する検出部５００と、を備える。本例のエンドトキシン検出装置１００はフローインジェクション分析法（ＦＩＡ、Ｆｌｏｗ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を利用して構成されている。

【0063】

試料導入部２００は、試料９６０を搬送する液体としてのキャリアを貯留するキャリア貯留槽２１０と、キャリアを送液するキャリア送液ポンプ２２０と、キャリアが流動するキャリア送液路２３０と、キャリア送液路２３０に試料９６０が導入される試料導入部２４０とを備えている。キャリアは、試料９６０を搬送することのできる液体であれば特に限定はなく、試料９６０及び蛍光物質１０の性状に応じて、たとえば純水又は各種緩衝液を適宜使用することができる。試料９６０は、エンドトキシン５０を含有しているかどうかが検証される被験対象の液体であり、たとえば、注射剤、輸液、透析液などの溶媒となる精製水又は注射用水等の液体製品や、血液、唾液、尿等の生体液又はその希釈液等が試料９６０となり得る。試料導入部２４０には、上記した液体製品の製造ライン（特に、精製水製造設備や注射用水製造設備）に設けられた試料採取部７００から採取された試料９６０が直接、連続的に導入されることが望ましいが、測定の都度、採取された試料９６０が試料導入部２４０から導入されることとしてもよい。

【0064】

供給部３００は、蛍光物質１０を含有する試薬溶液を貯留する試薬貯留槽３１０と、試薬を送液する試薬送液ポンプ３２０と、試薬が流動する試薬送液路３３０と、キャリア送液路２３０に合流する混合部３４０とを備えている。混合部３４０では、蛍光物質１０が試薬溶液として試料９６０に供給され、そして混合される。蛍光物質１０は、上述のように、蛍光部位２０と、エンドトキシン５０の分子構造の特定部位５１を認識する認識部位４０とがスペーサ３０で連結された構造を有している。蛍光部位２０、認識部位４０及びスペーサ３０の意義については上述したとおりである。

【0065】

反応部４００では、試料９６０にエンドトキシン５０が含有されている場合、試薬中の蛍光物質１０とエンドトキシン５０との反応が発生し、蛍光物質１０から発光が生ずる。反応部４００としては、一般の検出システムで採用される反応コイルが用いられるが、単純なキャピラリ管を反応部４００としてもよい。

【0066】

検出部５００では、上述の反応を被った蛍光物質１０の発光が光学的に検出される。検出部５００としては、一般の発光検出器を使用可能である。

【0067】

なお、本開示のエンドトキシン検出装置１００は、上述のＦＩＡを利用した構成に限定されず、たとえば、ＣＦＡ（連続流れ分析法）、ＳＩＡ（逐次注入分析法）、ｒ－ＦＩＡ（リバースフローインジェクション分析法）を含めたＦＣＡ（液体流れ分析法）を利用した構成でも実現可能である。

【0068】

本開示のエンドトキシン検出装置１００においては、そして、蛍光物質１０として、特定部位５１としてのリン酸基と反応するｄｐａ－ＨＣＣ（前記式（１））、又は、特定部位５１としての糖鎖部分と反応するＣ１－ＡＰＢ（前記式（２）））を用いることが望ましい。

【0069】

＜精製水製造設備＞
図３は、本開示の精製水製造設備６００の一例の概略構成を模式図で示すものである。本開示の精製水製造設備６００は、原水９００から精製水９２０を得る精製水製造部６１０と、精製水９２０から被験対象の試料９６０を採取する試料採取部７００と、前記のエンドトキシン検出装置１００と、を備える。

【0070】

精製水製造部６１０は、たとえば、原水９００を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により、原水９００から不純物を除去して、精製水９２０を製造する設備である。イオン交換装置には、たとえば、電気式脱塩装置や、混床式イオン交換樹脂装置を用いることができる。

【0071】

試料採取部７００は、精製水製造部６１０の下流側で、精製水９２０の搬送ラインの途中に設けられる。試料採取部７００により採取された精製水９２０は、被験対象の試料９６０として、前記した試料導入部２４０（図２参照）からエンドトキシン検出装置１００に導入される。エンドトキシン検出装置１００の詳細は上述のとおりである。これにより、精製水９２０から採取された被験対象の試料９６０が、上述のエンドトキシン検出方法に供されることになる。

【0072】

上記の構成により、本開示の精製水製造設備６００では、製造された精製水９２０から随時試料９６０を採取して、エンドトキシン検出装置１００によりリアルタイムでエンドトキシン５０を検出することが可能となる。そして、エンドトキシン５０の濃度が所定の基準値を超えた場合には、たとえば即時に精製水製造設備６００を停止して、部品交換又は修理等の適切な処置を講じることができる。

【0073】

＜注射用水製造設備＞
図４は、本開示の注射用水製造設備８００の一例の概略構成を模式図で示すものである。本開示の注射用水製造設備８００は、原水９００から精製水９２０を得る精製水製造部６１０と、精製水９２０から注射用水９４０を得る注射用水製造部８１０と、注射用水９４０を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンク８２０と、注射用水タンク８２０に備えられている注射用水９４０を所定の使用場所８５０へ送出する送出ライン８３０と、注射用水９４０から被験対象の試料９６０を採取する試料採取部７００と、前記のエンドトキシン検出装置１００と、を備える。

【0074】

精製水製造部６１０については、前記の精製水製造設備６００で説明したとおりである。

【0075】

注射用水製造部８１０では、高分子膜ろ過装置（好ましくは限外ろ過膜装置）により、精製水９２０をろ過することでエンドトキシン５０等の不純物を高度に除去して、注射用水９４０が製造される。なお、高分子膜ろ過装置の代わりに、蒸留器を用いてもよい。

【0076】

なお、この精製水製造部６１０にエンドトキシン検出装置１００が設けられており精製水９２０のエンドトキシン濃度が分かっている場合、それに合わせて注射用水製造部８１０の運転条件を調整してもよい。たとえば、精製水９２０のエンドトキシン濃度が十分に低いと分かっている場合は、そのぶんだけエンドトキシン除去能力を下げて高分子膜ろ過装置の透過水量を上げ、注射用水９４０の生産量を増やしてもよい。

【0077】

注射用水タンク８２０には、たとえば熱交換器のような加熱装置が装着され、注射用水９４０中の細菌等の増殖を防ぎ、清潔な状態を保つために、たとえば６０℃以上、望ましくは７０℃以上の温度状態が維持される。なお、この温度状態を維持しつつ、注射用水９４０の滞留を防ぐために、循環配管を用いてこの注射用水タンク８２０を構成することが望ましい。

【0078】

送出ライン８３０は、随時、又は必要に応じて、注射用水タンク８２０に貯留されている注射用水９４０を、所定の使用場所８５０へ送出する。ここでいう所定の使用場所８５０とは、たとえば、注射用水９４０の梱包設備、又は、注射液の製造設備等、注射用水９４０の用途に応じた様々な設備が想定される。

【0079】

試料採取部７００は、注射用水製造設備８００において、注射用水製造部８１０の下流側の所定の箇所に設けられる。試料採取部７００により採取された精製水９２０は、被験対象の試料９６０として、前記した試料導入部２４０（図２参照）からエンドトキシン検出装置１００に導入される。エンドトキシン検出装置１００の詳細は上述のとおりである。試料採取部７００が設けられる箇所としては、図４に示すように、注射用水製造部８１０より下流側でかつ注射用水タンク８２０より上流側か、注射用水タンク８２０に直接（たとえば、循環配管の途中）か、又は送出ライン８３０の途中かの、いずれに設けてもよい。いずれの場合も、注射用水９４０から採取された被験対象の試料９６０が、上述のエンドトキシン検出方法に供されることになる。

【0080】

試料採取部７００を注射用水製造部８１０より下流側でかつ注射用水タンク８２０より上流側に設ける場合、注射用水製造部８１０で製造された直後の注射用水９４０のエンドトキシン濃度が、たとえば日本薬局方に記載の基準（０．２５ＥＵ/ｍL）を満たしているかどうかを、実質的に常時確認することができる。そして、万一この基準を満たしていない場合は、すぐに下流への注射用水９４０の供給を止めることで、その時点で下流の注射用水タンク８２０に貯留されている基準を満たした状態の注射用水９４０へのコンタミネーションを防ぐことができる。なお、実質的に常時とは、たとえば、繰り返し測定時間を３０分以内、好ましくは１０分以内とする測定をいう。下流側の装置の保有水量及び装置の造水量を考慮すると、これらの頻度で測定を繰り返すことにより、トラブルによる水質悪化によるコンタミネーションにより、注射用水の製造を止めることなく運転できる。

【0081】

試料採取部７００を注射用水タンク８２０に直接設ける場合、循環貯留されている注射用水９４０が上記基準を満たしているかどうかを実質的に常時モニターすることができる。そして、たとえば上記基準を満たしていることが確認されているときのみ注射用水９４０を送出ライン８３０に供給し、万一上記基準を満たしていないときは図示していない返送ラインを用いて注射用水９４０を注射用水製造部８１０の上流側に戻し、注射用水製造部８１０で再処理するようにしてもよい。

【0082】

本発明のエンドトキシン検出装置１００は十分な測定精度があるため、実質的に常時モニターすることにより、前段の装置の不具合だけでなく、不具合の予兆も確認できる。たとえば、製造される注射用水９４０のエンドトキシン測定値が、エンドトキシンの基準値を満たすものの、わずかな上昇傾向を示した場合、これは前段の装置の性能悪化の予兆であることも多く、これをそのまま放置すると、製造される注射用水９４０がエンドトキシンの基準値を満たさなくなる場合もある。すなわち、注射用水製造装置の不具合を事前に検出する事で、トラブルを回避することが可能である。たとえば、前段の装置の運転条件を変更したり、メンテナンスを行うことにより対応可能である。

【0083】

試料採取部７００を送出ライン８３０に設ける場合、実際に使用される時点での注射用水９４０のエンドトキシン濃度を直接モニターすることができる。また、たとえば、使用場所８５０の直前にタンクを設置し、タンク内に注射用水を貯留して、これを使用場所８５０に供給し、タンクが空になったら再度注射用水を貯留するというバッチ式の使用も考えられる。そして、タンク内の注射用水のエンドトキシン濃度をエンドトキシン検出装置１００で各バッチ毎に確認することで、エンドトキシン濃度が管理基準を満たす注射用水の使用を保障することができる。

【0084】

以上述べた、３箇所はいずれも試料採取部７００を設置する利点がありいずれも好ましい設置箇所であるが、注射用水９４０のエンドトキシン５０汚染を最も早期に検出できる点で、注射用水製造部８１０より下流側でかつ注射用水タンク８２０より上流側に設けるのが最も好ましい。また、可能であれば３箇所のうち２箇所以上に試料採取部７００を設置することとしてもよい。

【0085】

上記の構成により、本開示の注射用水製造設備８００では、製造された注射用水９４０から随時試料９６０を採取して、エンドトキシン検出装置１００によりリアルタイムでエンドトキシン５０を検出することが可能となる。そして、エンドトキシン５０の濃度が所定の基準値を超えた場合には、即時に注射用水製造設備８００を停止して、部品交換又は修理等の適切な処置を講じることができる。これにより、要求水質の注射用水９４０を安定的に製造できるようになる。

【0086】

また、本開示の注射用水製造設備８００では、試料９６０となる注射用水９４０の不純物濃度は十分に小さくなっており、他の不純物による影響が最小限にすることができるため、特にエンドトキシン濃度を精度よく測定することができる。また、試料９６０となる注射用水９４０の粘性は十分に低いため、特にキャリア溶液等で希釈する必要がなく、エンドトキシン検出装置１００へ直接送液することができる。これにより、キャリア溶液が不要となり、試料９６０を不必要にキャリアで希釈することがなくなるという利点もある。

【0087】

なお、試料採取部７００を、注射用水タンク８２０に直接、又は、送出ライン８３０に設置する場合、試料９６０は加熱された状態で採取されることになる。このような高温の試料９６０は、エンドトキシン検出装置１００に供給される前に、熱交換器等で常温に冷却することが好ましい。

【実施例0088】

（１）ｄｐａ－ＨＣＣによるエンドトキシンの測定
ｄｐａ－ＨＣＣを用いてエンドトキシンの測定を試みた。実験方法は以下のとおりとした。

【0089】

測定サンプルとして、下記表１に示す組成のサンプル１及びサンプル２を、１０ｍＬメスフラスコで調製した。

【0090】

【表1】

【0091】

上記サンプル１及びサンプル２を、光路長１ｃｍの石英セルに取り、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルを測定した。測定条件は以下のとおりとした。
励起波長：３５８ｎｍ
開始波長：３８０ｎｍ
終了波長：６００ｎｍ

【0092】

本測定条件により、いずれのサンプルの測定も５分以内に終えることができた。

【0093】

上記サンプル１（実線）及びサンプル２（破線）の蛍光スペクトルは、図５に示すとおりである。図５の縦軸は蛍光強度を、横軸は波長（ｎｍ）をそれぞれ示す。サンプル１及びサンプル２はいずれも波長４４３ｎｍで蛍光強度のピークを示した。そして、エンドトキシン（図中ではＥＴと表す。以降の図でも同様。）が添加されたサンプル２(破線)では、エンドトキシンが添加されていないサンプル１(実線)の約１．６倍の蛍光強度を示した。以上により、エンドトキシンは、銅イオンが配位されたｄｐａ－ＨＣＣの蛍光を増強することが示された。なお、ｄｐａ－ＨＣＣの蛍光部位である、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸は、単体では、たとえば３９６ｎｍの励起波長に対し、４４８ｎｍに蛍光強度のピークを示すが、ｄｐａ－ＨＣＣを用いてエンドトキシンを測定する場合には、励起波長３５８ｎｍとして、波長４４３ｎｍのピークの強度を測定した方が定量性等が良好であった。

【0094】

図６は、上記サンプル２の組成において、エンドトキシン濃度を０．０１～１０ＥＵに変化させた各サンプルの測定結果を示すグラフである。サンプルの調製には、コントロールスタンダードエンドトキシン（富士フィルム和光純薬製２９３－１６５４１（Ｅ．Ｃｏｌｉ ＵＫＴＢ株由来））を用いた。図６の横軸はエンドトキシン濃度（ＥＵ／ｍＬ）の対数を示し、縦軸は蛍光スペクトル変化（エンドトキシンを添加したサンプルの波長４４３ｎｍの蛍光強度（Ｆ）から、エンドトキシンが添加されていないサンプル１の波長４４３ｎｍの蛍光強度（Ｆ_０）を差し引いた値）の対数を示す。このグラフから、波長４４３ｎｍの蛍光強度の対数は、エンドトキシン濃度の対数と強い正の相関関係があることが推認される。よって、銅イオンが配位されたｄｐａ－ＨＣＣによって、０．０１～１０ＥＵという低濃度のエンドトキシンが測定し得ると考えられた。

【0095】

なお、図７は、エンドトキシンに変えてリピドＡの濃度を０．０１～１０ＥＵに変化させた各サンプルの測定結果を示すグラフである。図７の横軸及び縦軸については図６と同様である。ここで、一般的に１０ｐＭのエンドトキシンの力価は１ＥＵ／ｍＬに相当するため、同様に１０ｐＭのリピドＡを１ＥＵ／ｍＬと換算している。このグラフから、波長４４３ｎｍの蛍光強度の対数は、リピドＡ濃度の対数と強い正の相関関係があることが推認される。以上、図６のエンドトキシンを測定したグラフが、エンドトキシンの生物活性の中心と考えられるリピドＡのグラフとほぼ同様の挙動を示したことから、図６のエンドトキシンの測定は、銅イオンが配位されたｄｐａ－ＨＣＣによってエンドトキシンのグルコサミンに結合するリン酸基の認識に依存していることが推察された。

【0096】

なお、上記と同様の手順で、エンドトキシンの代わりに各種リン酸アニオンを添加し、蛍光スペクトル変化を測定した結果を下記表２に示す。なお、エンドトキシン濃度は１．３ｎＭ、その他のリン酸アニオン濃度は１．０ｍＭとした。ここで、一般的に１００ｐｇのエンドトキシンの力価は１ＥＵに相当するため、１００ＥＵ／ｍＬを１ｎＭと換算している。

【0097】

【表2】

【0098】

以上の結果より、銅イオンが配位されたｄｐａ－ＨＣＣは、同じリン酸化合物でもエンドトキシンに対する選択性が最も高く、エンドトキシンの生物活性中心であるリピドＡを認識することが推測された。

【0099】

（２）Ｃ１－ＡＰＢによるエンドトキシンの測定
Ｃ１－ＡＰＢを用いてエンドトキシンの測定を試みた。実験方法は以下のとおりとした。

【0100】

測定サンプルとして、下記表３に示す組成のサンプル３及びサンプル４を、１０ｍＬメスフラスコで調製した。

【0101】

【表3】

【0102】

上記サンプル３及びサンプル４を、光路長１ｃｍの石英セルに取り、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルを測定した。測定条件は以下のとおりとした。
励起波長：３２８ｎｍ
開始波長：３５０ｎｍ
終了波長：５００ｎｍ

【0103】

本測定条件により、いずれのサンプルの測定も５分以内に終えることができた。

【0104】

上記サンプル３及びサンプル４の蛍光スペクトルは、図８に示すとおりである。図８の縦軸は蛍光強度を、横軸は波長（ｎｍ）をそれぞれ示す。サンプル３及びサンプル４はいずれも波長３７６ｎｍ及び３９６ｎｍで蛍光強度のピークを示した。そして、エンドトキシンが添加されたサンプル４(実線)では、エンドトキシンが添加されていないサンプル３（点線）の約３倍の蛍光強度を示した。以上により、エンドトキシンは、Ｃ１－ＡＰＢの蛍光を増強することが示された。

【0105】

図９は、上記サンプル４の組成において、エンドトキシン濃度を０．０１～１０ＥＵに変化させた各サンプルの測定結果を示すグラフである。図９の横軸はエンドトキシン濃度（ＥＵ／ｍＬ）の対数を示し、縦軸は蛍光スペクトル変化（エンドトキシンを添加したサンプルの波長３７６ｎｍの蛍光強度（Ｆ）から、エンドトキシンが添加されていないサンプル３の波長３７６ｎｍの蛍光強度（Ｆ_０）を差し引いた値）の対数を示す。このグラフから、波長３７６ｎｍの蛍光強度の対数は、エンドトキシン濃度の対数と強い正の相関関係があることが推認される。よって、Ｃ１－ＡＰＢによって、０．０１～１０ＥＵという低濃度のエンドトキシンが測定し得ると考えられた。

【0106】

Ｃ１－ＡＰＢがエンドトキシンの糖鎖を特異的に認識することを確かめるために、エンドトキシンの代わりに各種糖を添加し、蛍光スペクトル変化を測定した結果を下記表４に示す。なお、エンドトキシン濃度は１．３ｎＭ、その他の糖濃度は３０ｍＭとした。ここで、一般的に１００ｐｇのエンドトキシンの力価は１ＥＵに相当するため、１００ＥＵ／ｍＬを１ｎＭと換算している。

【0107】

【表4】

【0108】

以上より、Ｃ１－ＡＰＢは、同じ糖化合物でもエンドトキシンに対する選択性が最も高いことが推測された。

【0109】

（５）ＦＩＡによるエンドトキシンの定量性
前記図２に示すような、ＦＩＡを利用したエンドトキシン検出装置によるエンドトキシンの定量性を検証した。具体的な検証方法は以下のとおりである。

【0110】

キャリアには超純水を使用した。蛍光物質としてはｄｐａ－ＨＣＣを使用し、試薬は以下の組成で調製したのち、ｐＨを７．４に調整した。
ｄｐａ－ＨＣＣ：０．０２ｍＭ
ＮａＮＯ_３：２００ｍＭ
ＨＥＰＥＳ：１０ｍＭ
Ｃｕ（ＮＯ_３）_２：０．０２ｍＭ

【0111】

被験対象としてのエンドトキシンを含有する試料として、標準エンドトキシンを、０．２ＥＵ／ｍＬ、２ＥＵ／ｍＬ、２０ＥＵ／ｍＬ及び２００ＥＵ／ｍＬに希釈した水溶液を調整した。この試料を、試料導入部よりシリンジでキャリアへ添加した。

【0112】

測定条件は以下のとおりとした。
キャリア流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
試薬流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
励起波長：３５８ｎｍ
蛍光波長：４４３ｎｍ

【0113】

その測定結果を図１０に示す。図１０の縦軸は蛍光強度を、横軸は試料添加後の時間（ｓ）をそれぞれ示す。いずれのエンドトキシン濃度の試料でも、試料の添加から４０秒で蛍光強度がピークとなった。この結果から、ＦＩＡを利用したエンドトキシン検出装置によって、経時的なエンドトキシン濃度の測定が可能となることが推察される。

【0114】

また、図１０に示すこのピーク時において、エンドトキシン濃度と蛍光スペクトル変化との関係をプロットした図１１のグラフ（縦軸及び横軸については前記図６及び図７と同様）に示すように、エンドトキシン濃度の対数と、蛍光強度との間には強い正の相関関係があることが推認される。以上の結論として、ＦＩＡを利用したエンドトキシン検出装置によってエンドトキシンの経時的な定量的測定が可能となることが推察された。また、試料１サンプルを３分以内と迅速にオンラインで測ることが可能となった。すなわち、本実施例で用いたエンドトキシン濃度０．２ＥＵ／ｍＬ～２００ＥＵ／ｍＬの試料は、本実施例で選択した測定条件によって測定可能であることが確認できた。

【0115】

本開示のエンドトキシン検出方法によれば、試料等の性状に応じて、励起波長、蛍光波長、蛍光物質量、反応時間等の測定条件を適切に選択することで、注射用水のエンドトキシンの管理基準である０．２５ＥＵ／ｍＬ未満を予防的に管理するのに十分な濃度である０．０１ＥＵ／ｍＬ～１０ＥＵ／ｍＬを定量可能になる。また、０．０１ＥＵ／ｍＬ以上のエンドトキシン濃度を、５分以内、条件次第では３分以内で測定することが可能になる。

【0116】

また、エンドトキシン検出装置の試料導入部の直前に、たとえば試料濃縮装置を必要に応じて設置して、目的の倍率に濃縮させてから試料を導入させてもよい。こうすることで、エンドトキシンがより低濃度である試料を評価できるようになる。試料濃縮装置としては、たとえば、限外ろ過膜装置（ＵＦ）や逆浸透膜装置（ＲＯ）を用いることができる。

【符号の説明】

【0117】

１０ 蛍光物質 ２０ 蛍光部位 ３０ スペーサ
４０ 認識部位 ５０ エンドトキシン ５１ 特定部位
１００ エンドトキシン検出装置
２００ 試料導入部 ２１０ キャリア貯留槽 ２２０ キャリア送液ポンプ
２３０ キャリア送液路 ２４０ 試料導入部
３００ 供給部 ３１０ 試薬貯留槽 ３２０ 試薬送液ポンプ
３３０ 試薬送液路 ３４０ 混合部
４００ 反応部
５００ 検出部
６００ 精製水製造設備 ６１０ 精製水製造部
７００ 試料採取部
８００ 注射用水製造設備 ８１０ 注射用水製造部 ８２０ 注射用水タンク
８３０ 送出ライン ８５０ 使用場所
９００ 原水 ９２０ 精製水 ９４０ 注射用水
９６０ 試料

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】