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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022115853
(43)【公開日】2022-08-09
(54)【発明の名称】新しい連鎖球菌プロテアーゼ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/37 20060101AFI20220802BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20220802BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20220802BHJP
C12N 9/52 20060101ALN20220802BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/37 ZNA
G01N27/62 V
C07K16/00
C12N9/52
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022056522
(22)【出願日】2022-03-30
(62)【分割の表示】P 2018540841の分割
【原出願日】2017-02-03
(31)【優先権主張番号】1630021-2
(32)【優先日】2016-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(71)【出願人】
【識別番号】510069917
【氏名又は名称】ジェノビス エービー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100153693
【弁理士】
【氏名又は名称】岩田 耕一
(72)【発明者】
【氏名】ヴォン パウエル－ラミンゲン，ウルリッチ
(72)【発明者】
【氏名】スポエリー，クリスチャン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】連鎖球菌プロテアーゼを使用してＩｇＧを切断するインビトロの方法を提供する。
【解決手段】ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法であって、ＩｇＧを：（ａ）特定のアミノ酸配列；（ｂ）特定のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する、（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのそれらのフラグメントを含むポリペプチドと接触させることを含む方法、この方法を使用してＦｃおよびＦａｂフラグメントを生じさせること、ならびにこの方法を使用してＩｇＧを検出することにさらに関する。
【選択図】なし
【解決手段】ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法であって、ＩｇＧを：（ａ）特定のアミノ酸配列；（ｂ）特定のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する、（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのそれらのフラグメントを含むポリペプチドと接触させることを含む方法、この方法を使用してＦｃおよびＦａｂフラグメントを生じさせること、ならびにこの方法を使用してＩｇＧを検出することにさらに関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法であって、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％
の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する、（ａ）もしくは（ｂ）のいずれか
のそれらのフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む方法。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％
の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する、（ａ）もしくは（ｂ）のいずれか
のそれらのフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項2】
前記アミノ酸配列が配列番号３である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ポリペプチドを、ＩｇＧを含有する試料と、特異的システインプロテアーゼ活性が
生ずることを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、請求項１または２に記
載の方法。
生ずることを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、請求項１または２に記
載の方法。
【請求項4】
前記ＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記切断産物の同定および／または単離をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記
載の方法。
載の方法。
【請求項6】
前記同定および／または単離が、ゲル電気泳動または質量分析法による分析を含む、請
求項５に記載の方法。
求項５に記載の方法。
【請求項7】
ＦｃおよびＦａｂフラグメントを生じさせるために使用される、前記請求項のいずれか
一項に記載の方法。
一項に記載の方法。
【請求項8】
ＩｇＧを検出するために使用される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
（ｉ）試料を、請求項１に記載のポリペプチドと、前記ポリペプチドのＩｇＧ特異的シ
ステインプロテアーゼ活性を可能にする条件下で接触させること；および
（ｉｉ）ＩｇＧ特異的切断フラグメントの存在についてモニターすること
を含み、前記特異的切断フラグメントの存在が試料中のＩｇＧを示す、請求項８に記載の
方法。
ステインプロテアーゼ活性を可能にする条件下で接触させること；および
（ｉｉ）ＩｇＧ特異的切断フラグメントの存在についてモニターすること
を含み、前記特異的切断フラグメントの存在が試料中のＩｇＧを示す、請求項８に記載の
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を提示する新しい連鎖球菌プ
ロテアーゼに関する。本発明は、連鎖球菌感染の治療およびそれに対するワクチン接種、
病原性のＩｇＧ抗体により媒介される状態、例えば自己免疫性疾患などの治療、ならびに
バイオテクノロジーのための新しい手段の開発にさらに関する。
ロテアーゼに関する。本発明は、連鎖球菌感染の治療およびそれに対するワクチン接種、
病原性のＩｇＧ抗体により媒介される状態、例えば自己免疫性疾患などの治療、ならびに
バイオテクノロジーのための新しい手段の開発にさらに関する。
【背景技術】
【0002】
病原性細菌は、それらの宿主にコロニーをつくって侵略する種々の戦略を発達させてお
り、広範囲のビルレンス因子が、成長を促進して、宿主の免疫応答からの回避を媒介する
ために使用される。病原性細菌は、絶滅の明白なリスクを避けるために、両方の自然免疫
応答に対処するだけでなく、最も重要なことであるが、特異的免疫グロブリンにも対処し
なければならない。特異的Ｉｇは、補体に基づく、および／または食作用に基づく免疫応
答を開始することによる適応免疫系の中心である。Ｉｇは、可撓性ヒンジ領域を通してＦ
ｃエフェクター部分と連結している抗原を認識する可変性のＦａｂ領域からなる。Ｆｃ領
域は、食作用細胞の特異的受容体との接触を媒介するか、またはＣ１ｑと結合することに
より補体の古典的経路を開始させる。したがって、ヒンジ領域は、数種の微生物のプロテ
アーゼのための標的であり、例には、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）からのＩｄｅＳ（v
on Pawel-Rammingen et al. 2002. EMBO J. 21、1607-161）、ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Porphymonas ginivalis）からのギンギパインＫ（Gingipain K）（Vincents et
al. 2011. FASEB J. 10, 3741-3750）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
からのＳｓｐＡ（Prokesova et al. 1992. Immunol. Lett. 31. 259-265）が含まれる。
り、広範囲のビルレンス因子が、成長を促進して、宿主の免疫応答からの回避を媒介する
ために使用される。病原性細菌は、絶滅の明白なリスクを避けるために、両方の自然免疫
応答に対処するだけでなく、最も重要なことであるが、特異的免疫グロブリンにも対処し
なければならない。特異的Ｉｇは、補体に基づく、および／または食作用に基づく免疫応
答を開始することによる適応免疫系の中心である。Ｉｇは、可撓性ヒンジ領域を通してＦ
ｃエフェクター部分と連結している抗原を認識する可変性のＦａｂ領域からなる。Ｆｃ領
域は、食作用細胞の特異的受容体との接触を媒介するか、またはＣ１ｑと結合することに
より補体の古典的経路を開始させる。したがって、ヒンジ領域は、数種の微生物のプロテ
アーゼのための標的であり、例には、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）からのＩｄｅＳ（v
on Pawel-Rammingen et al. 2002. EMBO J. 21、1607-161）、ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Porphymonas ginivalis）からのギンギパインＫ（Gingipain K）（Vincents et
al. 2011. FASEB J. 10, 3741-3750）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
からのＳｓｐＡ（Prokesova et al. 1992. Immunol. Lett. 31. 259-265）が含まれる。
【0003】
連鎖球菌感染は、ヒトならびにブタ、ウマおよびウシのような家畜に共通する。連鎖球
菌感染は、比較的緩和な疾患から重症の生命を脅かす状態まで、重症度がさまざまである
。連鎖球菌感染の防御、予防および治療においてヒトおよび獣医学的ワクチンで使用する
ことができる連鎖球菌抗原の供給の必要性は大きい。
菌感染は、比較的緩和な疾患から重症の生命を脅かす状態まで、重症度がさまざまである
。連鎖球菌感染の防御、予防および治療においてヒトおよび獣医学的ワクチンで使用する
ことができる連鎖球菌抗原の供給の必要性は大きい。
【0004】
厳密な配列特異性を有するプロテアーゼは、バイオテクノロジー的手段として有用であ
る。免疫グロブリンを分解するプロテアーゼは、医学的に使用することができて、例えば
、ＩｇＧを特異的に分解するプロテアーゼは、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状
態の治療または予防のために使用することができる。
る。免疫グロブリンを分解するプロテアーゼは、医学的に使用することができて、例えば
、ＩｇＧを特異的に分解するプロテアーゼは、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状
態の治療または予防のために使用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは、連鎖球菌（streptoccoci）由来のＩｇＧを分解する酵素の新規なファミ
リーを同定し、精製して特徴付けた。この酵素のファミリーは、免疫グロブリンＧを分解
する酵素としてＩｇｄＥと命名され、以前に特徴付けられたＩｄｅＳファミリーの連鎖球
菌の免疫グロブリンを分解するプロテアーゼと区別されるシステインプロテアーゼであり
、ＩｇＧのヒンジ領域の効率的な切断を高度の特異性をもって媒介する。
リーを同定し、精製して特徴付けた。この酵素のファミリーは、免疫グロブリンＧを分解
する酵素としてＩｇｄＥと命名され、以前に特徴付けられたＩｄｅＳファミリーの連鎖球
菌の免疫グロブリンを分解するプロテアーゼと区別されるシステインプロテアーゼであり
、ＩｇＧのヒンジ領域の効率的な切断を高度の特異性をもって媒介する。
【0006】
該酵素は、Ｓ．スイス（S. suis）の株で同定されて、ＩｇｄＥｓｕｉｓと命名され；
Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）の株で同定されて、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａ
ｅと命名され；Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）の株で同定されてＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎ
ｕｓと命名され；Ｓ．エクイ（S. equi）の株で同定されて、ＩｇｄＥｅｑｕｉと命名さ
れ；Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の株で同定されて、ＩｇｄＥｐｓｅ
ｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓと命名された。
Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）の株で同定されて、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａ
ｅと命名され；Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）の株で同定されてＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎ
ｕｓと命名され；Ｓ．エクイ（S. equi）の株で同定されて、ＩｇｄＥｅｑｕｉと命名さ
れ；Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の株で同定されて、ＩｇｄＥｐｓｅ
ｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓと命名された。
【0007】
Ｓ．スイス（S. suis）からのＩｇｄＥは、ブタＩｇＧに対して高度に特異的であるこ
とが示されている。ＩｇＭを切断するプロテアーゼＩｄｅＳｓｕｉｓと同様に、１１２１
アミノ酸の大きいタンパク質は、該タンパク質のＮ末端部分にタンパク質分解活性ドメイ
ンを保有する。Ｎ末端の４７０アミノ酸からなる短縮型Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥ
タンパク質がＩｇＧ切断活性を保持するので、フルサイズのタンパク質は、インビトロで
はＩｇＧ切断のために必須ではない。
とが示されている。ＩｇＭを切断するプロテアーゼＩｄｅＳｓｕｉｓと同様に、１１２１
アミノ酸の大きいタンパク質は、該タンパク質のＮ末端部分にタンパク質分解活性ドメイ
ンを保有する。Ｎ末端の４７０アミノ酸からなる短縮型Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥ
タンパク質がＩｇＧ切断活性を保持するので、フルサイズのタンパク質は、インビトロで
はＩｇＧ切断のために必須ではない。
【0008】
Ｓ．スイス（S. suis）のＩｇｄＥによるブタＩｇＧの切断は、２つのＩｇＧ重鎖間で
共有結合のジスルフィド結合を形成しているように思われるヒンジ領域システイン残基の
ちょうどＮ末端で起こった。したがって、ＩｇＧ切断は、６４ｋＤａのＦｃフラグメント
および２つのＦａｂフラグメントの形成をもたらす。この切断パターンは、ＩｇＧをより
低いヒンジ領域で加水分解して、それにより１つのＦ（ａｂ’）２フラグメントおよび２
つの同一の１／２Ｆｃフラグメントを生じさせるＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）のＩｇ
ＧエンドペプチダーゼＩｄｅＳ（von Pawel-Rammingen ibid）およびＩｇＭのＣ末端を鎖
内ジスルフィド結合から切断して遊離の１／２Ｆｃフラグメントを生じさせるＩｄｅＳｓ
ｕｉｓ（Seele et al. 2015. J. Vet. Res. 46, 45）と区別される。
共有結合のジスルフィド結合を形成しているように思われるヒンジ領域システイン残基の
ちょうどＮ末端で起こった。したがって、ＩｇＧ切断は、６４ｋＤａのＦｃフラグメント
および２つのＦａｂフラグメントの形成をもたらす。この切断パターンは、ＩｇＧをより
低いヒンジ領域で加水分解して、それにより１つのＦ（ａｂ’）２フラグメントおよび２
つの同一の１／２Ｆｃフラグメントを生じさせるＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）のＩｇ
ＧエンドペプチダーゼＩｄｅＳ（von Pawel-Rammingen ibid）およびＩｇＭのＣ末端を鎖
内ジスルフィド結合から切断して遊離の１／２Ｆｃフラグメントを生じさせるＩｄｅＳｓ
ｕｉｓ（Seele et al. 2015. J. Vet. Res. 46, 45）と区別される。
【0009】
Ｓ．スイス（S. suis）は、例えば、ヒトおよびブタで髄膜炎を引き起こし得る。Ｓ．
アガラクチアエ（S. agalactiae）は、例えば、ヒトおよびウシで髄膜炎および敗血症を
引き起こし得る。Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）は、例えば、ブタで気道感染、ブタ腺
疫を起こし得る。Ｓ．エクイ（S. equi）は、例えば、ウマで気道感染、腺疫を起こし得
る。
アガラクチアエ（S. agalactiae）は、例えば、ヒトおよびウシで髄膜炎および敗血症を
引き起こし得る。Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）は、例えば、ブタで気道感染、ブタ腺
疫を起こし得る。Ｓ．エクイ（S. equi）は、例えば、ウマで気道感染、腺疫を起こし得
る。
【0010】
ＩｇｄＥファミリーのプロテアーゼは、連鎖球菌感染の予防および治療に、例えば、連
鎖球菌感染に対する免疫化のためのワクチンなどで使用される。ＩｇｄＥ抗体は、連鎖球
菌感染と関連する状態の受動免疫化および治療でさらに使用される。ＩｇｄＥプロテアー
ゼは、新しいバイオテクノロジー的手段を開発するためにも有用であり、さらにＩｇＧ抗
体により媒介される疾患または状態、例えば、自己免疫性疾患、移植拒絶、手術後の治療
および後天性血友病などを治療または予防するために使用される。
鎖球菌感染に対する免疫化のためのワクチンなどで使用される。ＩｇｄＥ抗体は、連鎖球
菌感染と関連する状態の受動免疫化および治療でさらに使用される。ＩｇｄＥプロテアー
ゼは、新しいバイオテクノロジー的手段を開発するためにも有用であり、さらにＩｇＧ抗
体により媒介される疾患または状態、例えば、自己免疫性疾患、移植拒絶、手術後の治療
および後天性血友病などを治療または予防するために使用される。
【課題を解決するための手段】
【0011】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象において免疫応答を生じさせること
に使用するための単離されたＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
に使用するための単離されたＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
【0012】
単離されたＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇａ
ｌａｃｔｉａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉ、またはＩｇｄＥｐｓｅ
ｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持し、か
つ／もしくは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を生じさせることができる、それら
のいずれかの変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポ
リペプチドであってもよい。細菌は、好ましくは、連鎖球菌である。
ｌａｃｔｉａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉ、またはＩｇｄＥｐｓｅ
ｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持し、か
つ／もしくは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を生じさせることができる、それら
のいずれかの変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポ
リペプチドであってもよい。細菌は、好ましくは、連鎖球菌である。
【0013】
第１の態様の一実施形態において、本発明は、対象において免疫応答を生じさせること
に使用するための：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列番号１のフラグメント、配列番号１の変異体、もしくは配
列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）対象において、連鎖球菌、好ましくは、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）
に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号３のフラグメント、配列番号３の変
異体、もしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）対象において、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさせる
ことができる配列番号５のフラグメント、配列番号５の変異体、もしくは配列番号５の変
異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列番号７のフラグメント、配列番号７の変異体、もしくは配
列番号７の変異体のフラグメント；または
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporci
nus）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号９のフラグメント、配列番号
９の変異体、もしくは配列番号９の変異体のフラグメント
を含み；好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である、ＩｇｄＥポリペプチドを提供する
。
に使用するための：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列番号１のフラグメント、配列番号１の変異体、もしくは配
列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）対象において、連鎖球菌、好ましくは、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）
に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号３のフラグメント、配列番号３の変
異体、もしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）対象において、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさせる
ことができる配列番号５のフラグメント、配列番号５の変異体、もしくは配列番号５の変
異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列番号７のフラグメント、配列番号７の変異体、もしくは配
列番号７の変異体のフラグメント；または
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporci
nus）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号９のフラグメント、配列番号
９の変異体、もしくは配列番号９の変異体のフラグメント
を含み；好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である、ＩｇｄＥポリペプチドを提供する
。
【0014】
好ましくは、免疫応答は、免疫化された対象において、感染性連鎖球菌のＩｇｄＥの、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる
。
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる
。
【0015】
第１の態様の別の実施形態において、本発明は、ＩｇｄＥポリペプチドを対象に投与す
ることを含む、前記対象において免疫応答を生じさせる方法を提供する。
ることを含む、前記対象において免疫応答を生じさせる方法を提供する。
【0016】
第２の態様において、本発明は、対象において免疫応答を生じさせることに使用するた
めのＩｇｄＥポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
めのＩｇｄＥポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0017】
ＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉ
ａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉまたはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒ
ｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持し、かつ／もしくは
対象において、連鎖球菌に対する免疫応答を生じさせることができる、それらの任意の変
異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペプチドであ
ってもよい。細菌は好ましくは連鎖球菌である。
ａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉまたはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒ
ｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持し、かつ／もしくは
対象において、連鎖球菌に対する免疫応答を生じさせることができる、それらの任意の変
異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペプチドであ
ってもよい。細菌は好ましくは連鎖球菌である。
【0018】
第２の態様の一実施形態において、本発明は、対象において、ポリヌクレオチド免疫応
答を生じさせることに使用するための：
（ａ）ポリペプチド配列番号１もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列；
（ｂ）ポリペプチド配列番号３もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列；
（ｃ）ポリペプチド配列番号５もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列；
（ｄ）ポリペプチド配列番号７もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列；または
（ｅ）ポリペプチド配列番号９もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列
を含む、ＩｇｄＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
答を生じさせることに使用するための：
（ａ）ポリペプチド配列番号１もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列；
（ｂ）ポリペプチド配列番号３もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列；
（ｃ）ポリペプチド配列番号５もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列；
（ｄ）ポリペプチド配列番号７もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列；または
（ｅ）ポリペプチド配列番号９もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグ
メントをコードする配列
を含む、ＩｇｄＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0019】
第２の態様の別の実施形態において、本発明は、対象において、免疫応答を生じさせる
ことに使用するための：
（ａ）配列番号２もしくはそれに相補的な配列；
（ｂ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｅ）ＩｇｄＥシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ／
もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のいずれかのフラ
グメント；
（ｆ）配列番号４もしくはそれに相補的な配列；
（ｇ）（ｆ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｈ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｉ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｊ）配列（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）のいずれかの、ＩｇＧを分解するシ
ステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくは
Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に対する免疫応答を生じさせることができるポリ
ペプチドをコードするフラグメント；
（ｋ）配列番号６もしくはそれに相補的な配列；
（ｌ）（ｋ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｍ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｎ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象にお
いて、連鎖球菌、好ましくはＳ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさ
せることができるポリペプチドをコードする、配列（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）もしくは（ｎ
）のいずれかのフラグメント；
（ｐ）配列番号８もしくはそれに相補的な配列；
（ｑ）（ｐ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｒ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｓ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；または
（ｔ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象にお
いて、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答を生じさせること
ができるポリペプチドをコードする配列（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）もしくは（ｓ）のいずれ
かのフラグメント；
（ｕ）配列番号１０もしくはそれに相補的な配列；
（ｖ）（ｕ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｗ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｘ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；または
（ｙ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象にお
いて、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）に対する免
疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードする、配列（ｕ）、（ｖ）、（ｗ
）もしくは（ｘ）のいずれかのフラグメント
を含むＩｇｄＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
ことに使用するための：
（ａ）配列番号２もしくはそれに相補的な配列；
（ｂ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｅ）ＩｇｄＥシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ／
もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のいずれかのフラ
グメント；
（ｆ）配列番号４もしくはそれに相補的な配列；
（ｇ）（ｆ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｈ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｉ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｊ）配列（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）のいずれかの、ＩｇＧを分解するシ
ステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくは
Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に対する免疫応答を生じさせることができるポリ
ペプチドをコードするフラグメント；
（ｋ）配列番号６もしくはそれに相補的な配列；
（ｌ）（ｋ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｍ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｎ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象にお
いて、連鎖球菌、好ましくはＳ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさ
せることができるポリペプチドをコードする、配列（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）もしくは（ｎ
）のいずれかのフラグメント；
（ｐ）配列番号８もしくはそれに相補的な配列；
（ｑ）（ｐ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｒ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｓ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；または
（ｔ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象にお
いて、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答を生じさせること
ができるポリペプチドをコードする配列（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）もしくは（ｓ）のいずれ
かのフラグメント；
（ｕ）配列番号１０もしくはそれに相補的な配列；
（ｖ）（ｕ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｗ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする配列；
（ｘ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；または
（ｙ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象にお
いて、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）に対する免
疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードする、配列（ｕ）、（ｖ）、（ｗ
）もしくは（ｘ）のいずれかのフラグメント
を含むＩｇｄＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0020】
好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である。
【0021】
好ましくは、免疫応答は、免疫化された対象において、感染性連鎖球菌のＩｇｄＥの、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる
。
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる
。
【0022】
第２の態様の別の実施形態において、本発明は、ＩｇｄＥポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを対象に投与することを含む、前記対象において免疫応答を生じさせる方
法を提供する。
リヌクレオチドを対象に投与することを含む、前記対象において免疫応答を生じさせる方
法を提供する。
【0023】
第３の態様において、本発明は、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療ま
たは予防に使用するための単離されたＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
たは予防に使用するための単離されたＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
【0024】
ＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉ
ａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉまたはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒ
ｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持するそれらのいずれ
かの変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペプチ
ドであってもよい。細菌は好ましくは連鎖球菌である。
ａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉまたはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒ
ｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持するそれらのいずれ
かの変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペプチ
ドであってもよい。細菌は好ましくは連鎖球菌である。
【0025】
第３の態様の一実施形態において、本発明は、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または
状態の治療または予防に使用するための：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメン
トもしくは配列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメン
トもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメン
トもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメン
トもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分
解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメ
ントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含むＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
状態の治療または予防に使用するための：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメン
トもしくは配列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメン
トもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメン
トもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメン
トもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分
解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメ
ントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含むＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
【0026】
好ましくは、ＩｇｄＥポリペプチドは：
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トまたは配列番号３の変異体のフラグメント；
を含む、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅポリペプチドであり得る。
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トまたは配列番号３の変異体のフラグメント；
を含む、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅポリペプチドであり得る。
【0027】
第３の態様の別の実施形態において、本発明は、治療的有効量のＩｇｄＥポリペプチド
を対象に投与することを含む、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療、防御
または予防のための方法を提供する。
を対象に投与することを含む、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療、防御
または予防のための方法を提供する。
【0028】
ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態は、自己免疫性疾患、移植拒絶、手術後の
治療および後天性血友病であり得る。
治療および後天性血友病であり得る。
【0029】
第４の態様において、本発明は、ＩｇＧを、システインプロテアーゼ活性を有するＩｇ
ｄＥポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法を提
供する。
ｄＥポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法を提
供する。
【0030】
ＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉ
ａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉ、またはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏ
ｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を保持
する、それらのいずれかの変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌から
のＩｇｄＥポリペプチドであってもよい。細菌は好ましくは連鎖球菌である。
ａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉ、またはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏ
ｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を保持
する、それらのいずれかの変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌から
のＩｇｄＥポリペプチドであってもよい。細菌は好ましくは連鎖球菌である。
【0031】
第４の態様の一実施形態において、本発明は、ＩｇＧを、ＩｇｄＥポリペプチドと接触
させることを含むＩｇＧの切断のためのインビトロの方法であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメン
トもしくは配列番号１の変異体のフラグメント。
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメン
トもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメン
トもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメン
トもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分
解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１
の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメ
ントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含む方法を提供する。
させることを含むＩｇＧの切断のためのインビトロの方法であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメン
トもしくは配列番号１の変異体のフラグメント。
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメン
トもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメン
トもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメン
トもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分
解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１
の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメ
ントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含む方法を提供する。
【0032】
好ましくは、ＩｇｄＥポリペプチドは：
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；または
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント
を含むＩｇｄＥａｇａｌａｃポリペプチドであり得る。
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；または
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント
を含むＩｇｄＥａｇａｌａｃポリペプチドであり得る。
【0033】
第４の態様の別の実施形態において、本発明は、ＩｇＧを、ＩｇＧを分解するシステイ
ンプロテアーゼ活性を有するＩｇｄＥポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧのＦ
ｃまたはＦａｂフラグメントを生じさせるためのインビトロの方法を提供する。
ンプロテアーゼ活性を有するＩｇｄＥポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧのＦ
ｃまたはＦａｂフラグメントを生じさせるためのインビトロの方法を提供する。
【0034】
第５の態様において、本発明は、ＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性
化するかまたは阻害する物質を同定する方法を提供する。該方法は；
ａ）ＩｇｄＥポリペプチドおよびＩｇＧを、候補物質と、該物質の不在下におけるＩｇ
Ｇのシステイン活性を可能にする条件下で接触させること、
ｂ）候補物質の存在下で消化されたＩｇＧの量を、前記物質の不在下における場合と比
較して決定すること、
ｃ）それにより、該物質が、ＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化す
るかまたは阻害するかを決定すること
を含むことができる。
化するかまたは阻害する物質を同定する方法を提供する。該方法は；
ａ）ＩｇｄＥポリペプチドおよびＩｇＧを、候補物質と、該物質の不在下におけるＩｇ
Ｇのシステイン活性を可能にする条件下で接触させること、
ｂ）候補物質の存在下で消化されたＩｇＧの量を、前記物質の不在下における場合と比
較して決定すること、
ｃ）それにより、該物質が、ＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化す
るかまたは阻害するかを決定すること
を含むことができる。
【0035】
ＩｇＧ分解の定量分析は、実施例１で説明されるように実施することができる。
【0036】
本発明による方法で試験され得る候補化合物は、「低分子」として一般的に知られる簡
単な有機分子、例えば、分子量が２０００ダルトン未満のものを含む。該方法は、化合物
ライブラリー、例えば、合成ペプチドライブラリーおよびペプチドファージライブラリー
を含むペプチドライブラリーなどをスクリーニングするために使用することもできる。他
の適当な分子は、ポリヌクレオチド配列、およびＩｇｄＥのＩｇＧを分解する活性を調整
する任意の他の分子を含む。
単な有機分子、例えば、分子量が２０００ダルトン未満のものを含む。該方法は、化合物
ライブラリー、例えば、合成ペプチドライブラリーおよびペプチドファージライブラリー
を含むペプチドライブラリーなどをスクリーニングするために使用することもできる。他
の適当な分子は、ポリヌクレオチド配列、およびＩｇｄＥのＩｇＧを分解する活性を調整
する任意の他の分子を含む。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1-1】Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清におけるＩｇＧ分解活性。 （Ａ）Ｓ．スイス（S. suis）株１０および１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓの濃縮された（２０×）培養上清を２％ブタ血漿と、３７℃で１６時間インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。約３２ｋＤａの分解産物（＊）が観察された。（Ｂ）硫酸アンモニウムにより分別沈殿されたＳ．スイス（S. suis）株１０の培養上清の抗ＩｇＧウェスタンブロット分析。２０～４０％および４０～６０％硫酸アンモニウム飽和分画と、３７℃で１６時間、１％ブタ血漿のインキュベーション後、ＩｇＧ分解産物（＊）が得られた。レーン１は、タンパク質のサイズ標準を示す化学発光シグナルの検出前の膜の写真の画像である。（Ｃ）全ての試験血清型のＳ．スイス（S. suis）株の培養上清がＩｇＧを切断させた。濃縮された（１０×）培養上清を１％ブタ血漿と３７℃で１６時間インキュベートして、抗ＩｇＧウェスタンブロットにより分析した。変化する強度の約３２ｋＤａにおけるＩｇＧ切断産物（＊）が全てのレーンで観察された。異なるウェスタンブロットの画像を１つの図に集めた。
【図2】Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの活性部位の同定。 （Ａ）ＩｇｄＥおよび潜在的な活性部位の残基を置換した異なるｒＩｇｄＥ構築物およびＣ末端短縮変異体の模式的例示。分泌シグナルペプチド（残基１～３７）は薄い灰色でマークし、トランスグルタミナーゼドメインはボックスで囲み、潜在的な活性部位の残基および置換を示した。（Ｂ）３．３μＭのブタＩｇＧを、３７℃で１６時間、大腸菌（E. coli）細胞が発現した異なるｒＩｇｄＥ構築物の可溶性分画とインキュベートした。反応を還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。ＩｇＧ切断（＊）は、ｒＩｇｄＥ、ｒＩｇｄＥＤ３４８ＡおよびｒＩｇｄＥΔＣとのインキュベーションで起こったが、ｒＩｇｄＥＣ３０２ＳまたはｒＩｇｄＥＨ３３３Ａとでは起こらなかった。３７ｋＤａの弱いタンパク質のバンドは、溶解物調製において存在する汚染物質であり、ＩｇｄＥ活性とは関係がない。
【図3】組換えＳ．スイス（S. suis）のＩｇｄＥの時間経過および阻害剤プロファイル。 切断（Ａ）の時間経過を連続サンプリングによりモニターした後、還元条件下でクーマシーフルオルオレンジ染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、続いて切断産物をデンシトメトリーで定量した。１．６７μＭのブタＩｇＧを０．２μＭの精製ｒＩｇｄＥΔＣとインキュベートした。終夜の切断（１６時間）を１００％相対切断と定めた。阻害剤のプロファイル（Ｂ）のために、２５０μＭおよび２．５μＭの各阻害剤の存在下で初期切断をモニターした。阻害されない対照の初期切断活性を１００％相対活性と定めた。ＤＭＳＯ対照は、２５０μＭのＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２と相関する。データは３回の実験の平均±ＳＥＭとして表す。阻害されない対照（＊）またはＤＭＳＯ対照（○）との差を、Ｄｕｎｎｅｔｔの複数の比較試験により、有意性を＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）および＜０．００１（＊＊＊または○○○）のＰ値に設定して分析した。
【図4】Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧの重鎖をヒンジ領域で切断する。 反応を、非還元（Ａ）および還元（Ｂ）クーマシーブルー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。３．３μＭのＩｇＧを、１０ｎＭの精製ｒＩｇｄＥと（＋）またはそれなしで（－）３７℃で１６時間インキュベートした。（Ｃ）観察された切断パターンおよび切断部位により、１つのＩｇＧ重鎖が最初にＩｇｄＥにより加水分解されて１つの遊離のＦａｂフラグメント（Ｆａｂ）および単一の切断されたＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）を生じ、第２ステップで他の重鎖が加水分解されて、１つのＦｃフラグメント（Ｆｃ）および２つのＦａｂフラグメントが生ずるモデルが提案される。
【図5-1】ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧに高度に特異的である。 （Ａ）２％ブタ血漿を１０ｎＭの精製ｒＩｇｄＥと（＋）またはそれなしで（－）インキュベートした。反応を、抗ブタＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロットにより還元条件下で分析した。ＩｇＧの切断のみが観察された（＊）。（Ｂ）０．５ｍｇ／ｍｌの異なる種のＩｇＧを、１０ｎＭ精製のｒＩｇｄＥと（＋）またはそれなしで（－）インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。ブタ（＊）以外のどの他の種から誘導されたＩｇＧの切断も観察されなかった。３７ｋＤａの弱いタンパク質バンドは、溶解物調製において存在する汚染物質であり（レーン２を参照されたい）、ＩｇｄＥ活性と関係がない。異なるゲルの画像を１つの図にまとめた。
【図6-1】内因性ＩｇＧのＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥによる分解。 Ｓ．スイス（S. suis）のＩｇｄＥは、健常ブタおよびそれぞれの病変を有するブタの全ての試験体液で、内因性ＩｇＧを分解する。（サイズを矢印で示した）。他の分解産物は観察できなかった。体液を１０ｎＭの精製ｒＩｇｄＥと（＋）またはそれなしで（－）、３７℃で１６時間インキュベートした。反応を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）および抗ＩｇＧウェスタンブロット（Ｂ）により還元条件下で分析した。タンパク質サイズ標準を示すレーンは、化学発光シグナルの検出前の膜の写真画像である。異なるゲルの画像を１つの図にまとめた。
【図7】ＩｇｄＥは、Ｓ．スイス（S. suis）によるＩｇＧ切断のために必要であり、ＩｇＧ切断はＩｄｅＳｓｕｉｓと独立である。 Ｓ．スイス（S. suis）株１０、１０ΔｉｇｄＥ、１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓおよび１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓΔｉｇｄＥの濃縮された（１０×）上清を、１％ブタ血漿と３７℃で１６時間インキュベートした。反応を抗ＩｇＧウェスタンブロット（Ａ）または抗ＩｇＭウェスタンブロット（Ｂ）により還元条件下で分析した。ＩｇＧ分解（＊）は、株１０および１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓの上清とインキュベートしたときにのみ観察され、それに対してＩｇＭ分解（＊）は、株１０および１０ΔｉｇｄＥの上清とのインキュベーションでのみ観察された。
【図8】Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清におけるＩｇＧ分解活性検出の阻害剤プロファイル。 Ｓ．スイス（S. suis）の株１０の濃縮された（１０×）培養上清を、クラス特異的プロテアーゼ阻害剤の存在下でブタ血漿とインキュベートした。反応を抗ＩｇＧウェスタンブロットにより還元条件下で分析した。ＩｇＧの切断産物は、０．１～１ｍＭのＡＥＢＳＦ、０．１～５ｍＭのＥＤＴＡ、５０μＭのＥ－６４、いかなる阻害剤もなし、および１／２００希釈完全阻害剤カクテル（星印でマークした）とインキュベートしたときに観察され、それに対して、５ｍＭのＡＥＢＳＦ、２５０μＭのＥ－６４、濃縮された上清なし（－Ｃ）、０．１～５ｍＭのＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２、０．１～５ｍＭのヨードアセトアミドおよび１／５０希釈完全阻害剤カクテルとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
【図9】ｒＩｇｄＥΔＣ精製の代表的なクーマシーブルー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによるモニタリング。 発現プラスミドを保有する大腸菌（E. coli）をＩＰＴＧで誘発して、その溶解物から、ｒＩｇｄＥΔＣを精製した。Ｈｉｓ－ＺＺタグ付きｒＩｇｄＥΔＣを含有するＮｉ２＋－親和性クロマトグラフィー精製の溶出物を、Ｔｅｖ－プロテアーゼとインキュベートして、Ｈｉｓ－ＺＺ－タグを除去した後、第２回のＮｉ２＋－親和性クロマトグラフィー精製を行なった。タグのないｒＩｇｄＥΔＣを含有するこの精製ステップの流通分画２および３を溜めて、緩衝液をＰＢＳと交換してさらなる実験に使用した。ｒＩｇｄＥΔＣの部分分解に基づいて、５０ｋＤａの周囲の２つの主要なバンドをこれらの分画で観察することができる。
【図10-1】ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒトＩｇＧ１を特異的に切断する。 （Ａ）ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅを、６種の異なる種のポリクローナルＩｇＧと３７℃で１８時間インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。分解産物を星印（＊）により示す。異なるゲルの画像を、図を作成するために使用した。（Ｂ）ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅを、ヒトまたはウシ血清と３７℃で１８時間インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。分解産物を星印（＊）により示す。（Ｃ）ヒトおよびブタ血清と３７℃で１８時間インキュベートしたｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅの粗抽出物を用いたウェスタンブロット。ヒトおよびブタのポリクローナルＩｇＧに対するそれぞれの抗体で膜を処理した。分解産物を星印（＊）により示す。（Ｄ）ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅを、ヒトＩｇＧのサブクラスならびにヒトＩｇＡおよびＩｇＭと３７℃で１８時間インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。分解産物を星印（＊）により示す。異なるゲルの画像を、図を作成するために使用した。
【図11】ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒト血清ＩｇＧ１を、単一の切断されたＩｇＧ１にまで完全に分解する。 ヒト血清およびモノクローナルヒトＩｇＧ１を、ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅの存在（＋）または不在（－）下で３７℃で１８時間インキュベートして、ヒトＩｇＧ１特異的抗体を用いて非還元条件下でウェスタンブロットにより分析した。
【図12-1】ｒＩｇｄＥｅｑｕｉは、ウマＩｇＧ７のみを切断する。 ０．６μＭの組換えウマＩｇＧサブタイプまたは血清ＩｇＧを、３７℃で１６時間、ｒＩｇｄＥｅｑ
ｕｉを発現する大腸菌（E. coli）細胞の可溶分画の存在（＋）または不在（－）下でインキュベートした。反応を還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。ＩｇＧ切断（＊）は、ＩｇＧ７および血清ＩｇＧとのインキュベーションで起こった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、クーマシーフルオルオレンジタンパク質ゲル染色（Ａ）で染色するかまたはウサギ抗ウマＩｇＧＨ＆Ｌ（ＨＲＰ）ａｂ６９２１を用いてウェスタンブロット（Ｂ）分析にかけるかのいずれかを行なった。
【発明を実施するための形態】
【0038】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配
列である。Ｓ．スイス（S. suis）からのＩｇｄＥの追加のアミノ酸配列は、例えばＧｅ
ｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＷＰ＿０１２０２７７２０．１、ＷＰ＿０４４６８７
７１７．１、ＷＰ＿０４５００２８９３．１、ＷＰ＿０４４９８１１６６．１、ＷＰ＿０
４４７７０４３２．１、ＷＰ＿０４３０４１５２７．１、ＷＰ＿０１４９１７３０７．１
、ＷＰ＿０４４９８１１４１．１、ＷＰ＿０４４７６６０３１．１、ＷＰ＿０４４７８０
６２８．１、ＷＰ＿０４４９８０４８１．１、ＷＰ＿０４４７６８３０４．１、ＷＰ＿０
４３０３３１７６．１、ＷＰ＿０４４７７２５７３．１、ＡＢＱ４２８８３．１、ＡＢＱ
４２８８２．１、ＡＢＱ４２８８４．１、ＡＢＱ４２８８５．１、ＷＰ＿０２４４０２６
０４．１、ＷＰ＿０４４６７１８０３．１、ＷＰ＿０１４６３９０００．１、ＷＰ＿０１
４６３６４９９．１、ＷＰ＿０４４４７５２７０．１、ＷＰ＿０４４６８３０４９．１、
ＷＰ＿０４４６８２６０３．１、ＷＰ＿０４４９８２６７４．１、ＷＰ＿０２４４０６２
１２．１、ＷＰ＿０２４４０２３７６．１、ＷＰ＿０２４３８２８６０．１、ＷＰ＿０４
４６８４００５．１、ＷＰ＿０４４６８８０５５．１、ＷＰ＿０４４７５４１５３．１、
ＷＰ＿０２４４１２９４１．１、ＷＰ＿０２９１７２８０５．１、ＡＥＲ１５９３２．１
、ＷＰ＿０２４４１４４９３．１、ＷＰ＿０４４７６２５６０．１、ＷＰ＿０２４４１７
７７１．１、ＷＰ＿０４４６７５２８１．１、ＷＰ＿０４４６６６８１９．１、ＷＰ＿０
４３０３２９８０．１、ＷＰ＿０４４６７１７５５．１、ＷＰ＿０２４４１６３６３．１
、ＡＢＬ８４３５４．１、ＡＢＬ８４４１３．１、ＷＰ＿０４４７５８８９９．１、ＷＰ
＿０２４３９３９１９．１、ＷＰ＿０１４７３６３２１．１、ＷＰ＿０２４３８３６２０
．１、ＷＰ＿０４４４７５４８８．１、ＷＰ＿０２４３８６７００．１、ＷＰ＿０２４３
８１９５１．１、ＷＰ＿０２４３９０５７９．１、ＷＰ＿０２３３７１４１９．１、ＷＰ
＿０４４７７２５７６．１、ＷＰ＿０４４７６６７７４．１、ＷＰ＿０４４６７２５９６
．１、ＷＰ＿０４３０２８７５２．１、ＷＰ＿０４４７７１５０８．１、ＷＰ＿０２４３
８３８５１．１、ＷＰ＿０２４３８８９５７．１、ＷＰ＿０２４３９４９５９．１、ＷＰ
＿０２９１７４６３２．１、ＷＰ＿０４４７５２１２０．１、ＷＰ＿０４４６７８０７７
．１、ＷＰ＿００２９３８２６２．１、ＷＰ＿０４４７６９９９１．１、ＷＰ＿０４４７
７０６８１．１、ＷＰ＿０４４７４９７３６．１、およびＷＰ＿０４４７７１３９２．１
として見出すことができる。
配列番号１は、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配
列である。Ｓ．スイス（S. suis）からのＩｇｄＥの追加のアミノ酸配列は、例えばＧｅ
ｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＷＰ＿０１２０２７７２０．１、ＷＰ＿０４４６８７
７１７．１、ＷＰ＿０４５００２８９３．１、ＷＰ＿０４４９８１１６６．１、ＷＰ＿０
４４７７０４３２．１、ＷＰ＿０４３０４１５２７．１、ＷＰ＿０１４９１７３０７．１
、ＷＰ＿０４４９８１１４１．１、ＷＰ＿０４４７６６０３１．１、ＷＰ＿０４４７８０
６２８．１、ＷＰ＿０４４９８０４８１．１、ＷＰ＿０４４７６８３０４．１、ＷＰ＿０
４３０３３１７６．１、ＷＰ＿０４４７７２５７３．１、ＡＢＱ４２８８３．１、ＡＢＱ
４２８８２．１、ＡＢＱ４２８８４．１、ＡＢＱ４２８８５．１、ＷＰ＿０２４４０２６
０４．１、ＷＰ＿０４４６７１８０３．１、ＷＰ＿０１４６３９０００．１、ＷＰ＿０１
４６３６４９９．１、ＷＰ＿０４４４７５２７０．１、ＷＰ＿０４４６８３０４９．１、
ＷＰ＿０４４６８２６０３．１、ＷＰ＿０４４９８２６７４．１、ＷＰ＿０２４４０６２
１２．１、ＷＰ＿０２４４０２３７６．１、ＷＰ＿０２４３８２８６０．１、ＷＰ＿０４
４６８４００５．１、ＷＰ＿０４４６８８０５５．１、ＷＰ＿０４４７５４１５３．１、
ＷＰ＿０２４４１２９４１．１、ＷＰ＿０２９１７２８０５．１、ＡＥＲ１５９３２．１
、ＷＰ＿０２４４１４４９３．１、ＷＰ＿０４４７６２５６０．１、ＷＰ＿０２４４１７
７７１．１、ＷＰ＿０４４６７５２８１．１、ＷＰ＿０４４６６６８１９．１、ＷＰ＿０
４３０３２９８０．１、ＷＰ＿０４４６７１７５５．１、ＷＰ＿０２４４１６３６３．１
、ＡＢＬ８４３５４．１、ＡＢＬ８４４１３．１、ＷＰ＿０４４７５８８９９．１、ＷＰ
＿０２４３９３９１９．１、ＷＰ＿０１４７３６３２１．１、ＷＰ＿０２４３８３６２０
．１、ＷＰ＿０４４４７５４８８．１、ＷＰ＿０２４３８６７００．１、ＷＰ＿０２４３
８１９５１．１、ＷＰ＿０２４３９０５７９．１、ＷＰ＿０２３３７１４１９．１、ＷＰ
＿０４４７７２５７６．１、ＷＰ＿０４４７６６７７４．１、ＷＰ＿０４４６７２５９６
．１、ＷＰ＿０４３０２８７５２．１、ＷＰ＿０４４７７１５０８．１、ＷＰ＿０２４３
８３８５１．１、ＷＰ＿０２４３８８９５７．１、ＷＰ＿０２４３９４９５９．１、ＷＰ
＿０２９１７４６３２．１、ＷＰ＿０４４７５２１２０．１、ＷＰ＿０４４６７８０７７
．１、ＷＰ＿００２９３８２６２．１、ＷＰ＿０４４７６９９９１．１、ＷＰ＿０４４７
７０６８１．１、ＷＰ＿０４４７４９７３６．１、およびＷＰ＿０４４７７１３９２．１
として見出すことができる。
【0039】
配列番号２は、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０から単離されたＩｇｄＥをコードする
核酸配列である。
核酸配列である。
【0040】
配列番号３は、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）の株ＣＣＵＧ４２０８から単離
されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）からのＩ
ｇｄＥの追加のアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＥＰＵ２
１３４２．１、ＥＦＶ９８１６１．１、ＣＡＤ４７５５４．１、ＥＰＵ２３９３９．１、
ＥＰＷ７１９７２．１、ＥＰＴ９９２６１．１、ＥＰＶ９０３２９．１、ＥＧＳ２６８２
５．１、ＥＰＶ８４８８８．１、ＣＦＱ５２８１１．１、ＥＰＴ８４７８０．１、ＥＰＴ
９９０７４．１、ＣＣＷ４２９３６．１、ＣＣＷ４０８４８．１、ＥＡＯ７０４５０．１
、ＥＰＵ７４８３８．１、ＥＰＴ５１２３６．１、ＥＰＵ７７７６１．１、ＥＰＴ３６２
８０．１、ＷＰ＿０１１０５８３８１．１、ＥＰＴ５９８６０．１、ＥＰＴ３９１７０．
１、ＥＰＴ３８７３４．１、ＣＦＱ２５５６８．１、ＥＰＵ４０８７７．１、ＷＰ＿０２
５１９３６１９．１、ＷＰ＿０００４４０３２９．１、ＷＰ＿０００４４０３３３．１、
ＷＰ＿０００４４０３３０．１、ＷＰ＿０００４４０３３１．１、ＷＰ＿０４７１９９１
５４．１、ＷＰ＿００１９０１２０６．１、ＷＰ＿０２５１９３２７３．１、ＷＰ＿０２
５１９４９２３．１、ＷＰ＿０００４４０３３４．１、ＷＰ＿０２５１９５５５９．１、
ＷＰ＿０４７２０００４３．１、ＷＰ＿０４１１６５７７３．１、ＥＰＵ３３３０７．１
、ＣＦＷ６６６２０．１、ＷＰ＿０４１９８１１９１．１、ＷＰ＿０００４４０３３２．
１、ＷＰ＿０４７２００２６１．１、ＷＰ＿０２９６９２０８３．１、ＷＰ＿０１７７７
０８７０．１、ＷＰ＿０２５１９７８８５．１、ＥＡＯ７５１５３．１、ＷＰ＿００１８
８４４７２．１、ＥＡＯ６２４５２．１、ＷＰ＿０２５１９５７７６．１、ＷＰ＿０４７
２００２８０．１、ＣＦＷ６６６１８．１、およびＥＡＯ７５１５５．１として見出すこ
とができる。
されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）からのＩ
ｇｄＥの追加のアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＥＰＵ２
１３４２．１、ＥＦＶ９８１６１．１、ＣＡＤ４７５５４．１、ＥＰＵ２３９３９．１、
ＥＰＷ７１９７２．１、ＥＰＴ９９２６１．１、ＥＰＶ９０３２９．１、ＥＧＳ２６８２
５．１、ＥＰＶ８４８８８．１、ＣＦＱ５２８１１．１、ＥＰＴ８４７８０．１、ＥＰＴ
９９０７４．１、ＣＣＷ４２９３６．１、ＣＣＷ４０８４８．１、ＥＡＯ７０４５０．１
、ＥＰＵ７４８３８．１、ＥＰＴ５１２３６．１、ＥＰＵ７７７６１．１、ＥＰＴ３６２
８０．１、ＷＰ＿０１１０５８３８１．１、ＥＰＴ５９８６０．１、ＥＰＴ３９１７０．
１、ＥＰＴ３８７３４．１、ＣＦＱ２５５６８．１、ＥＰＵ４０８７７．１、ＷＰ＿０２
５１９３６１９．１、ＷＰ＿０００４４０３２９．１、ＷＰ＿０００４４０３３３．１、
ＷＰ＿０００４４０３３０．１、ＷＰ＿０００４４０３３１．１、ＷＰ＿０４７１９９１
５４．１、ＷＰ＿００１９０１２０６．１、ＷＰ＿０２５１９３２７３．１、ＷＰ＿０２
５１９４９２３．１、ＷＰ＿０００４４０３３４．１、ＷＰ＿０２５１９５５５９．１、
ＷＰ＿０４７２０００４３．１、ＷＰ＿０４１１６５７７３．１、ＥＰＵ３３３０７．１
、ＣＦＷ６６６２０．１、ＷＰ＿０４１９８１１９１．１、ＷＰ＿０００４４０３３２．
１、ＷＰ＿０４７２００２６１．１、ＷＰ＿０２９６９２０８３．１、ＷＰ＿０１７７７
０８７０．１、ＷＰ＿０２５１９７８８５．１、ＥＡＯ７５１５３．１、ＷＰ＿００１８
８４４７２．１、ＥＡＯ６２４５２．１、ＷＰ＿０２５１９５７７６．１、ＷＰ＿０４７
２００２８０．１、ＣＦＷ６６６１８．１、およびＥＡＯ７５１５５．１として見出すこ
とができる。
【0041】
配列番号４は、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）の株ＣＣＵＧ４２０８から単離
されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
【0042】
配列番号５は、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）の株ＤＳＭ２０７２５から単離された
ＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）からのＩｇｄＥのアミ
ノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＷＰ＿００３０８５２６９．
１として見出すことができる。
ＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）からのＩｇｄＥのアミ
ノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＷＰ＿００３０８５２６９．
１として見出すことができる。
【0043】
配列番号６は、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）の株ＤＳＭ２０７２５から単離された
ＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
ＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
【0044】
配列番号７は、Ｓ．エクイ（S. equi）の株ｓｓｐズーエピデルミクス（zooepidemicus
）＃１から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．エクイ（S. equi）からのＩ
ｇｄＥの追加のアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＫＤＥ
０１９８０．１、ＫＩＳ０７６６８．１、ＫＩＳ０８７０７．１、ＫＩＳ１９９７１．１
、ＷＰ＿０４３０３８７９５．１、ＷＰ＿０４３０３６６０２．１、ＷＰ＿０３７５８４
０７６．１、ＫＩＳ２０８９６．１、ＡＩＡ６８８０４．１、ＷＰ＿０４３０２９５２２
．１、ＷＰ＿０１２６７８２５９．１、ＷＰ＿０４２６７０３２３．１、ＷＰ＿０４３０
４０３２４．１、およびＷＰ＿０１４６２２５４６．１として見出すことができる。
）＃１から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．エクイ（S. equi）からのＩ
ｇｄＥの追加のアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＫＤＥ
０１９８０．１、ＫＩＳ０７６６８．１、ＫＩＳ０８７０７．１、ＫＩＳ１９９７１．１
、ＷＰ＿０４３０３８７９５．１、ＷＰ＿０４３０３６６０２．１、ＷＰ＿０３７５８４
０７６．１、ＫＩＳ２０８９６．１、ＡＩＡ６８８０４．１、ＷＰ＿０４３０２９５２２
．１、ＷＰ＿０１２６７８２５９．１、ＷＰ＿０４２６７０３２３．１、ＷＰ＿０４３０
４０３２４．１、およびＷＰ＿０１４６２２５４６．１として見出すことができる。
【0045】
配列番号８は、Ｓ．エクイ（S. equi）株ｓｓｐズーエピデルミクス（zooepidemicus）
＃１から単離されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
＃１から単離されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
【0046】
配列番号９は、Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の株ＡＴＣＣ（登録商
標）ＢＡＡ－１３８１から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．シュードポル
シナス（S. pseudoporcinus）からのＩｇｄＥのアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ
で、アクセッション番号ＷＰ＿００７８９５６７６．１として見出すことができる。
標）ＢＡＡ－１３８１から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．シュードポル
シナス（S. pseudoporcinus）からのＩｇｄＥのアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ
で、アクセッション番号ＷＰ＿００７８９５６７６．１として見出すことができる。
【0047】
配列番号１０は、Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の株ＡＴＣＣＢＡＡ
－１３８１から単離されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
－１３８１から単離されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
【0048】
配列番号１１は、Ｓ．スイス（S. suis）から単離されたＩｇｄＥのＣ末端短縮型変異
体のアミノ酸配列である。
体のアミノ酸配列である。
【0049】
ＩｇｄＥポリペプチド
本発明によるＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇ
ａｌａｃｔｉａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉ、またはＩｇｄＥｐｓ
ｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持する
それらの任意の変異体もしくはフラグメントであり、かつ／または対象において連鎖球菌
に対する免疫応答を向上させることができる。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペ
プチドであってもよい。細菌は、好ましくは連鎖球菌である。
本発明によるＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇ
ａｌａｃｔｉａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉ、またはＩｇｄＥｐｓ
ｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持する
それらの任意の変異体もしくはフラグメントであり、かつ／または対象において連鎖球菌
に対する免疫応答を向上させることができる。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペ
プチドであってもよい。細菌は、好ましくは連鎖球菌である。
【0050】
ＩｇｄＥポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１のアミノ酸配列；または
配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１の任意のアミノ酸配列との少なくとも７０％
の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するそれらのいずれ
か１つの変異体；または配列番号１、３、５、７、９、１１のフラグメント；またはＩｇ
Ｇを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するそれらのいずれか１つの変異体を含む
ことができる。
配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１の任意のアミノ酸配列との少なくとも７０％
の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するそれらのいずれ
か１つの変異体；または配列番号１、３、５、７、９、１１のフラグメント；またはＩｇ
Ｇを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するそれらのいずれか１つの変異体を含む
ことができる。
【0051】
ＩｇｄＥポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１のアミノ酸配列；または
配列番号１、３、５、７、９、または１１の任意のアミノ酸配列との少なくとも７０％の
同一性を有し、対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるそれら
のいずれか１つの変異体；または配列番号１、３、５、７、９、１１のフラグメント；ま
たは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるそれらのいずれか
１つの変異体を含むことができる。
配列番号１、３、５、７、９、または１１の任意のアミノ酸配列との少なくとも７０％の
同一性を有し、対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるそれら
のいずれか１つの変異体；または配列番号１、３、５、７、９、１１のフラグメント；ま
たは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるそれらのいずれか
１つの変異体を含むことができる。
【0052】
連鎖球菌は、Ｓ．スイス（S. suis）、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）、Ｓ．ポ
ルシナス（S. porcinus）、Ｓ．エクイ（S. equi）、またはＳ．シュードポルシナス（S.
pseudoporcinus）であり得る。
ルシナス（S. porcinus）、Ｓ．エクイ（S. equi）、またはＳ．シュードポルシナス（S.
pseudoporcinus）であり得る。
【0053】
好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、または１１の配列のい
ずれかを含むかまたはそれらからなる。
ずれかを含むかまたはそれらからなる。
【0054】
該ポリペプチドは、それに加えて、シグナル配列またはＮ末端メチオニンを含むことが
できる。
できる。
【0055】
変異体ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、または１
１中のものからそれぞれ変化したものであるが、ＩｇｄＥと同じ必須の特性または基本的
機能性を保持する。それゆえ、変異体ポリペプチドは、ＩｇＧを分解するシステインプロ
テアーゼ活性を提示することができ、かつ／または対象において連鎖球菌に対する免疫応
答を向上させることができる。好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である。好ましくは
、免疫応答は、免疫化された対象において、感染性連鎖球菌のＩｇｄＥの、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる。注目に値す
ることとして、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を欠くＩｇｄＥ変異体は、それでも、
免疫化された対象において、免疫応答を向上させることができ、感染性連鎖球菌のＩｇｄ
ＥのＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる。その
ようなＩｇｄＥ変異体は、本発明によるＩｇｄＥ変異体に含まれる。
１中のものからそれぞれ変化したものであるが、ＩｇｄＥと同じ必須の特性または基本的
機能性を保持する。それゆえ、変異体ポリペプチドは、ＩｇＧを分解するシステインプロ
テアーゼ活性を提示することができ、かつ／または対象において連鎖球菌に対する免疫応
答を向上させることができる。好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である。好ましくは
、免疫応答は、免疫化された対象において、感染性連鎖球菌のＩｇｄＥの、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる。注目に値す
ることとして、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を欠くＩｇｄＥ変異体は、それでも、
免疫化された対象において、免疫応答を向上させることができ、感染性連鎖球菌のＩｇｄ
ＥのＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる。その
ようなＩｇｄＥ変異体は、本発明によるＩｇｄＥ変異体に含まれる。
【0056】
典型的には、約７０％を超える同一性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０
％および特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の
同一性を有し、配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドは、タンパク質の変異体と考えられる。そのような変異体は、該ペプチドが基本的
なＩｇｄＥの機能性を維持する限り、対立遺伝子の変異体およびタンパク質配列内におけ
る単一のアミノ酸またはアミノ酸群の欠失、改変または付加を含んでいてもよい。配列番
号１、３、５、７、９、または１１の変異体の同一性は、配列番号１、３、５、７、９、
または１１で示される配列、またはより好ましくは、配列番号１、３、５、７、９、また
は１１の全長にわたる少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも
１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００ま
たはそれを超える隣接アミノ酸の領域にわたって測定することができる。上で列挙した下
限の任意のものが、上で列挙した上限の任意のものと組み合わされて本発明のポリペプチ
ドの長さについての範囲を提供することができることは認識されるであろう。例えば、ポ
リペプチドは、５０から２５０アミノ酸の長さ、または１００から３００アミノ酸の長さ
であることもできる。ポリペプチドは、１００から５８６アミノ酸の長さ、１５０から５
００アミノ酸の長さまたは１００から４００アミノ酸の長さであることもできる。
％および特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の
同一性を有し、配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドは、タンパク質の変異体と考えられる。そのような変異体は、該ペプチドが基本的
なＩｇｄＥの機能性を維持する限り、対立遺伝子の変異体およびタンパク質配列内におけ
る単一のアミノ酸またはアミノ酸群の欠失、改変または付加を含んでいてもよい。配列番
号１、３、５、７、９、または１１の変異体の同一性は、配列番号１、３、５、７、９、
または１１で示される配列、またはより好ましくは、配列番号１、３、５、７、９、また
は１１の全長にわたる少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも
１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００ま
たはそれを超える隣接アミノ酸の領域にわたって測定することができる。上で列挙した下
限の任意のものが、上で列挙した上限の任意のものと組み合わされて本発明のポリペプチ
ドの長さについての範囲を提供することができることは認識されるであろう。例えば、ポ
リペプチドは、５０から２５０アミノ酸の長さ、または１００から３００アミノ酸の長さ
であることもできる。ポリペプチドは、１００から５８６アミノ酸の長さ、１５０から５
００アミノ酸の長さまたは１００から４００アミノ酸の長さであることもできる。
【0057】
アミノ酸の同一性は、任意の適当なアルゴリズムを使用して計算することもできる。例
えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦ
ＩＴプログラムを提供する（例えば、その初期設定で使用される）（Devereux et al. (1
984) Nucleic Acids Research 12, 387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリ
ズムは、相同性を計算するため、または配列を並べるために使用することができる（例え
ば、等価のまたは対応する配列を同定するなど（典型的には、それらの初期設定で）、例
えばAltschul S. F. (1993) J MoI Evol 36: 290-300; Altschul, S, F et al. (1990) J
MoI Biol 215: 403-10に記載されているように）。
えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦ
ＩＴプログラムを提供する（例えば、その初期設定で使用される）（Devereux et al. (1
984) Nucleic Acids Research 12, 387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリ
ズムは、相同性を計算するため、または配列を並べるために使用することができる（例え
ば、等価のまたは対応する配列を同定するなど（典型的には、それらの初期設定で）、例
えばAltschul S. F. (1993) J MoI Evol 36: 290-300; Altschul, S, F et al. (1990) J
MoI Biol 215: 403-10に記載されているように）。
【0058】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechn
ology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公に入手することができ
る。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードで整列されたときに、
若干正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たすかのいずれかの問題の配列中
の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列のペア（ＨＳＰ）を最初に
同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.、前出）
。これらの最初の隣接ワードのヒットはそれらを含有するＨＳＰを見出すための調査を開
始するための手がかりとして役立つ。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増
加され得る限り、各配列に沿って両方向に拡大される。各方向におけるワードヒットの拡
大は、累積アラインメントスコアがその最大の獲得値から量Ｘだけ低下したとき；１つも
しくは複数の負のスコアの残留アラインメントの蓄積に基づいて、累積スコアが、ゼロも
しくはそれ未満になるとき；またはいずれかの配列の端部に達したときに停止する。ＢＬ
ＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度
を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期値として、ワードの長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯ
ＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Aca
d. ScL USA 89: 10915-10919を参照されたい）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ
）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
ology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公に入手することができ
る。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードで整列されたときに、
若干正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たすかのいずれかの問題の配列中
の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列のペア（ＨＳＰ）を最初に
同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.、前出）
。これらの最初の隣接ワードのヒットはそれらを含有するＨＳＰを見出すための調査を開
始するための手がかりとして役立つ。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増
加され得る限り、各配列に沿って両方向に拡大される。各方向におけるワードヒットの拡
大は、累積アラインメントスコアがその最大の獲得値から量Ｘだけ低下したとき；１つも
しくは複数の負のスコアの残留アラインメントの蓄積に基づいて、累積スコアが、ゼロも
しくはそれ未満になるとき；またはいずれかの配列の端部に達したときに停止する。ＢＬ
ＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度
を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期値として、ワードの長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯ
ＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Aca
d. ScL USA 89: 10915-10919を参照されたい）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ
）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
【0059】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を実行する；例えば、Ka
rlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい
。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定は最小合計確率（Ｐ（Ｎ
））であり、それは、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こる
確率を示す。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比率の最小合計確率が、約１未満
、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０
．００１未満であるならば、ある配列は、別の配列と同様であると考えられる。
rlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい
。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定は最小合計確率（Ｐ（Ｎ
））であり、それは、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こる
確率を示す。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比率の最小合計確率が、約１未満
、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０
．００１未満であるならば、ある配列は、別の配列と同様であると考えられる。
【0060】
変異体の配列は、典型的には、少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、５０または
それを超えて、アミノ酸の位置が異なる（それは、おそらく、アミノ酸の置換、欠失また
は挿入による）。例えば、１から５０、２から３０、３から２０または５から１０個のア
ミノ酸の置換、欠失または挿入がなされ得る。置換は、好ましくは、例えば、以下の表１
による保存的置換である。アミノ酸は、第２の欄中の同じブロック中で、好ましくは、第
３の欄の同じ行中で、互いに置換されてもよい。
それを超えて、アミノ酸の位置が異なる（それは、おそらく、アミノ酸の置換、欠失また
は挿入による）。例えば、１から５０、２から３０、３から２０または５から１０個のア
ミノ酸の置換、欠失または挿入がなされ得る。置換は、好ましくは、例えば、以下の表１
による保存的置換である。アミノ酸は、第２の欄中の同じブロック中で、好ましくは、第
３の欄の同じ行中で、互いに置換されてもよい。
【0061】
【表1】
アミノ酸を、同様の化学構造、同様の化学的性質または同様な側鎖体積の他のアミノ酸で
置き換える。導入されたアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性
、疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有することができる。あるいは、保存的置換
は、予め存在する芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別の
アミノ酸を導入することもできる。保存的アミノ酸変化は当技術分野において周知であり
、下の表Ａ１で定義された２０種の主要なアミノ酸の性質に従って選択することができる
。アミノ酸が同様な極性を有する場合、これは、表Ａ２におけるアミノ酸側鎖についての
ヒドロパシースケールを参照して決定することができる。
【0062】
【表2】
【0063】
【表3】
ステインプロテアーゼで見出される間隔で含む。例えば、配列番号１では、これらの残基
は、位置３０２および位置３３３に見出される。触媒的三連構造を完成するアスパラギン
酸残基は、位置３４８に見出される。
【0064】
本発明で使用されるＩｇｄＥポリペプチドのフラグメントは、それがＩｇＧを分解する
ＩｇｄＥのシステインプロテアーゼ活性を保持し、かつ／または対象において連鎖球菌に
対する免疫応答を向上させることができる限り、典型的には少なくとも１０、例えば、少
なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０またはそれを超えるアミノ酸の長さ、１０
０、１５０、２００、２５０または３００アミノ酸までの長さである
ＩｇｄＥのシステインプロテアーゼ活性を保持し、かつ／または対象において連鎖球菌に
対する免疫応答を向上させることができる限り、典型的には少なくとも１０、例えば、少
なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０またはそれを超えるアミノ酸の長さ、１０
０、１５０、２００、２５０または３００アミノ酸までの長さである
【0065】
本発明で使用されるポリペプチドは、化学的に改変されていても、例えば、翻訳後に改
変されていてもよい。例えば、それらは、グリコシル化されていても、リン酸化されてい
ても、または改変されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。それらは、ヒスチジン残基の
付加により改変されて、それらの精製を容易にすることも、またはシグナル配列の添加に
より細胞膜中への挿入を促進することもできる。そのような改変されたポリペプチドは、
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」の範囲内に入る。
変されていてもよい。例えば、それらは、グリコシル化されていても、リン酸化されてい
ても、または改変されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。それらは、ヒスチジン残基の
付加により改変されて、それらの精製を容易にすることも、またはシグナル配列の添加に
より細胞膜中への挿入を促進することもできる。そのような改変されたポリペプチドは、
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」の範囲内に入る。
【0066】
典型的には、本発明により使用するためのポリペプチドは、免疫グロブリンシステイン
プロテアーゼ活性、特にＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を提示する。好ま
しくは、該ポリペプチドは、ＩｇＧを、ヒンジ領域で、より特定して重鎖のヒンジ領域で
切断する。好ましくは、切断は、ＩｇＧのＦｃおよびＦａｂフラグメントの産生をもたら
す。好ましくは該活性は、ＩｇＧに特異的である。ＩｇＧを分解するシステインプロテア
ーゼ活性は、適当なアッセイ手段により決定することができる。例えば、試験ポリペプチ
ドを、３７℃などの適当な温度でＩｇＧとインキュベートしてもよい。そのとき、出発原
料および反応産物を、所望のＩｇＧ切断産物が存在するかどうかを決定するために、ＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥにより分析することもできる。典型的には、この切断産物は３２ｋＤａのフ
ラグメントである。典型的には、この最初の切断の後、ＩｇＧのさらなる分解はない。切
断がＩｇＧのヒンジ領域で起こったことを検証するために、切断産物をＮ末端の配列決定
にかけることができる。
プロテアーゼ活性、特にＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を提示する。好ま
しくは、該ポリペプチドは、ＩｇＧを、ヒンジ領域で、より特定して重鎖のヒンジ領域で
切断する。好ましくは、切断は、ＩｇＧのＦｃおよびＦａｂフラグメントの産生をもたら
す。好ましくは該活性は、ＩｇＧに特異的である。ＩｇＧを分解するシステインプロテア
ーゼ活性は、適当なアッセイ手段により決定することができる。例えば、試験ポリペプチ
ドを、３７℃などの適当な温度でＩｇＧとインキュベートしてもよい。そのとき、出発原
料および反応産物を、所望のＩｇＧ切断産物が存在するかどうかを決定するために、ＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥにより分析することもできる。典型的には、この切断産物は３２ｋＤａのフ
ラグメントである。典型的には、この最初の切断の後、ＩｇＧのさらなる分解はない。切
断がＩｇＧのヒンジ領域で起こったことを検証するために、切断産物をＮ末端の配列決定
にかけることができる。
【0067】
ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は、阻害の研究により、さらに特徴付ける
ことができる。好ましくは、活性は、プロテアーゼ阻害剤であるペプチド誘導体Ｚ－ＬＶ
Ｇ－ＣＨＮ２により、および／またはヨード酢酸により阻害される。
ことができる。好ましくは、活性は、プロテアーゼ阻害剤であるペプチド誘導体Ｚ－ＬＶ
Ｇ－ＣＨＮ２により、および／またはヨード酢酸により阻害される。
【0068】
ポリペプチドのＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性は、該ポリペプチドは、
他のクラスのＩｇ、すなわちＩｇＭ、およびＩｇＡを、ＩｇＧの切断を可能にする条件下
で、これらの免疫グロブリンとインキュベートしたときに、分解することができないこと
において、一般的にＩｇＧ特異的である。Ｓ．スイス（S. suis）、Ｓ．ポルシナス（S.
porcinus）、およびＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）からのＩｇｄＥは、
ブタＩｇＧに特異的であることが見出された。Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）か
らのＩｇｄＥは、ヒトＩｇＧに、特にヒトＩｇＧ１に特異的であることが見出された。Ｓ
．エクイ（S. equi）からのＩｇｄＥは、ウマＩｇＧに、特にウマＩｇＧ７に特異的であ
ることが見出された。
他のクラスのＩｇ、すなわちＩｇＭ、およびＩｇＡを、ＩｇＧの切断を可能にする条件下
で、これらの免疫グロブリンとインキュベートしたときに、分解することができないこと
において、一般的にＩｇＧ特異的である。Ｓ．スイス（S. suis）、Ｓ．ポルシナス（S.
porcinus）、およびＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）からのＩｇｄＥは、
ブタＩｇＧに特異的であることが見出された。Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）か
らのＩｇｄＥは、ヒトＩｇＧに、特にヒトＩｇＧ１に特異的であることが見出された。Ｓ
．エクイ（S. equi）からのＩｇｄＥは、ウマＩｇＧに、特にウマＩｇＧ７に特異的であ
ることが見出された。
【0069】
本発明で使用するためのポリペプチドは、実質的に単離された形態であってもよい。該
ポリペプチドは、ポリペプチドの意図される目的に干渉しないと思われる担体または希釈
剤と混合されて、それでもなお実質的に単離されていると考えられ得ることが理解される
であろう。本発明で使用するためのポリペプチドは、実質的に精製された形態であっても
よく、その場合、実質的に精製された形態は、調製物中のポリペプチドの重量の５０％超
、例えば８０％、９０％、９５％または９９％超が、本発明のポリペプチドである調製物
中のポリペプチドを一般的に含むであろう。
ポリペプチドは、ポリペプチドの意図される目的に干渉しないと思われる担体または希釈
剤と混合されて、それでもなお実質的に単離されていると考えられ得ることが理解される
であろう。本発明で使用するためのポリペプチドは、実質的に精製された形態であっても
よく、その場合、実質的に精製された形態は、調製物中のポリペプチドの重量の５０％超
、例えば８０％、９０％、９５％または９９％超が、本発明のポリペプチドである調製物
中のポリペプチドを一般的に含むであろう。
【0070】
本発明で使用するためのポリペプチドは、ＩｇｄＥポリペプチドを発現する任意の適当
な生物体から単離することができる。典型的には、ＩｇｄＥポリペプチドは、適当なＩｇ
ｄＥを発現する連鎖球菌株から単離される。適当な生物体および株は、多くの技法により
同定され得る。例えば、連鎖球菌の株は、ｉｇｄＥ遺伝子の存在について、最初に試験す
ることができる。ポリヌクレオチドのプライマーまたはプローブは、例えば、配列番号２
、４、６、８、または１０に基づいて設計することができる。適当なプライマーの例は、
配列番号１２～２２で設計される。次に、ｉｇｄＥ遺伝子の存在を、プライマーを使用し
てＰＣＲにより、またはプローブの株のゲノムのＤＮＡとのハイブリダイゼーションによ
り検証することができる。
な生物体から単離することができる。典型的には、ＩｇｄＥポリペプチドは、適当なＩｇ
ｄＥを発現する連鎖球菌株から単離される。適当な生物体および株は、多くの技法により
同定され得る。例えば、連鎖球菌の株は、ｉｇｄＥ遺伝子の存在について、最初に試験す
ることができる。ポリヌクレオチドのプライマーまたはプローブは、例えば、配列番号２
、４、６、８、または１０に基づいて設計することができる。適当なプライマーの例は、
配列番号１２～２２で設計される。次に、ｉｇｄＥ遺伝子の存在を、プライマーを使用し
てＰＣＲにより、またはプローブの株のゲノムのＤＮＡとのハイブリダイゼーションによ
り検証することができる。
【0071】
ポリヌクレオチド
本発明によるポリヌクレオチドは：（ａ）配列番号４、５、６、８、もしくは１０のコ
ード配列；（ｂ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列
；（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有し、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ／
もしくは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができる配列；または
（ｄ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象におい
て連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるポリペプチドをコードする、（ａ
）、（ｂ）もしくは（ｃ）で定義された配列のいずれか１つのフラグメントを含むかまた
はそれらからなることができる。
本発明によるポリヌクレオチドは：（ａ）配列番号４、５、６、８、もしくは１０のコ
ード配列；（ｂ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列
；（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有し、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ／
もしくは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができる配列；または
（ｄ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象におい
て連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるポリペプチドをコードする、（ａ
）、（ｂ）もしくは（ｃ）で定義された配列のいずれか１つのフラグメントを含むかまた
はそれらからなることができる。
【0072】
典型的には、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。しかしながら、ポリヌクレオチドはＲ
ＮＡポリヌクレオチドであることもある。ポリヌクレオチドは、単鎖であることも二本鎖
であることもあり、そのうちに、合成されたまたは改変されたヌクレオチドを含むことも
ある。本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、配列番号２、４、６、８、または１０
のコード配列またはコード配列の相補体と、バックグラウンドを超えるレベルで有意にハ
イブリダイズすることができる。バックグラウンドのハイブリダイゼーションが起こるこ
ともあり、それは、例えば、ＤＮＡライブラリーに存在する他のＤＮＡのためである。本
発明のポリヌクレオチドと配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列またはコー
ド配列の相補体との間の相互作用により生ずるシグナルレベルは、他のポリヌクレオチド
と配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列の間の相互作用の、典型的には少な
くとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍強力である。相互作用の強度は、例えば、
プローブを例えば３２Ｐで放射性標識することにより測定することもできる。選択的ハイ
ブリダイゼーションは、培地の使用条件を高いストリンジェンシーにして典型的には達成
することができる。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは、当技術分野に
おいて知られた任意の適当な条件下で実施することができる（Sambrook et al., Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, 1989を参照されたい）。例えば、高いストリンジェ
ンシーが必要とされるならば、適当な条件は、６０℃から６５℃までにおいて０．１から
０．２×ＳＳＣを含む。より低いストリンジェンシーが必要とされるならば、適当な条件
は、６０℃で２×ＳＳＣを含む。
ＮＡポリヌクレオチドであることもある。ポリヌクレオチドは、単鎖であることも二本鎖
であることもあり、そのうちに、合成されたまたは改変されたヌクレオチドを含むことも
ある。本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、配列番号２、４、６、８、または１０
のコード配列またはコード配列の相補体と、バックグラウンドを超えるレベルで有意にハ
イブリダイズすることができる。バックグラウンドのハイブリダイゼーションが起こるこ
ともあり、それは、例えば、ＤＮＡライブラリーに存在する他のＤＮＡのためである。本
発明のポリヌクレオチドと配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列またはコー
ド配列の相補体との間の相互作用により生ずるシグナルレベルは、他のポリヌクレオチド
と配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列の間の相互作用の、典型的には少な
くとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍強力である。相互作用の強度は、例えば、
プローブを例えば３２Ｐで放射性標識することにより測定することもできる。選択的ハイ
ブリダイゼーションは、培地の使用条件を高いストリンジェンシーにして典型的には達成
することができる。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは、当技術分野に
おいて知られた任意の適当な条件下で実施することができる（Sambrook et al., Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, 1989を参照されたい）。例えば、高いストリンジェ
ンシーが必要とされるならば、適当な条件は、６０℃から６５℃までにおいて０．１から
０．２×ＳＳＣを含む。より低いストリンジェンシーが必要とされるならば、適当な条件
は、６０℃で２×ＳＳＣを含む。
【0073】
配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列は、ヌクレオチド置換、例えば１、
２または３から１０、２５、５０または１００箇所の置換により改変することもできる。
あるいはまたはそれに加えて、配列番号２、４、６、８、１０のポリヌクレオチドは、１
箇所もしくは複数の挿入および／もしくは欠失により、ならびに／またはいずれかもしく
は両方の端部における延長により改変することもできる。シグナル配列などの追加の配列
が含まれてもよい。改変されたポリヌクレオチドは、一般的に、ＩｇｄＥに特異的なシス
テインプロテアーゼ活性を有し、かつ／または対象において連鎖球菌に対する免疫応答を
向上させることができるポリペプチドをコードする。改変される配列が、例えば上の表１
で示されるように翻訳されるときに、変性した置換が行われることもあり、かつ／または
保存的アミノ酸置換を生ずる置換が行われることもある。
２または３から１０、２５、５０または１００箇所の置換により改変することもできる。
あるいはまたはそれに加えて、配列番号２、４、６、８、１０のポリヌクレオチドは、１
箇所もしくは複数の挿入および／もしくは欠失により、ならびに／またはいずれかもしく
は両方の端部における延長により改変することもできる。シグナル配列などの追加の配列
が含まれてもよい。改変されたポリヌクレオチドは、一般的に、ＩｇｄＥに特異的なシス
テインプロテアーゼ活性を有し、かつ／または対象において連鎖球菌に対する免疫応答を
向上させることができるポリペプチドをコードする。改変される配列が、例えば上の表１
で示されるように翻訳されるときに、変性した置換が行われることもあり、かつ／または
保存的アミノ酸置換を生ずる置換が行われることもある。
【0074】
配列番号２、４、６、８、または１０のＤＮＡコード配列の相補体に選択的にハイブリ
ダイズすることができるヌクレオチド配列は、一般的に、配列番号２、４、６、８、また
は１０のコード配列のそれぞれに、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば
少なくとも４０、少なくとも６０、より好ましくは少なくとも１００個の隣接ヌクレオチ
ドの領域にわたって、または最も好ましくは配列番号２、４、６、８、または１０の全長
にわたって、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するであろう。配列同一
性は、例えば上で記載された任意の適当な方法によって決定することができる。
ダイズすることができるヌクレオチド配列は、一般的に、配列番号２、４、６、８、また
は１０のコード配列のそれぞれに、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば
少なくとも４０、少なくとも６０、より好ましくは少なくとも１００個の隣接ヌクレオチ
ドの領域にわたって、または最も好ましくは配列番号２、４、６、８、または１０の全長
にわたって、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するであろう。配列同一
性は、例えば上で記載された任意の適当な方法によって決定することができる。
【0075】
配列同一性の上記の程度と最小サイズとの任意の組合せが、本発明のポリヌクレオチド
を定義するために使用され得るが、より厳密な組合せ（すなわち、より長い長さにわたる
より高い配列同一性）が好ましい。したがって、例えば、２０、好ましくは３０ヌクレオ
チドにわたる少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが本発明の一態様
を形成し、４０ヌクレオチドにわたる少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレ
オチドも同様である。ポリヌクレオチドのフラグメントは、好ましくは、少なくとも１０
、好ましくは少なくとも１５または少なくとも２０、例えば少なくとも２５、少なくとも
３０または少なくとも４０ヌクレオチドの長さであろう。それらは、典型的には、４０、
５０、６０、７０、１００または１５０までのヌクレオチド長さであろう。フラグメント
は、１５０ヌクレオチドより長い長さ、例えば２００、３００、４００、５００、６００
、７００、８００、９００もしくは１０００ヌクレオチドまでの長さ、またはさらに配列
番号２、４、６、８、または１０のコード配列のそれぞれ短い５、１０もしくは１５ヌク
レオチドなどの少数のヌクレオチドまでであり得る。
を定義するために使用され得るが、より厳密な組合せ（すなわち、より長い長さにわたる
より高い配列同一性）が好ましい。したがって、例えば、２０、好ましくは３０ヌクレオ
チドにわたる少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが本発明の一態様
を形成し、４０ヌクレオチドにわたる少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレ
オチドも同様である。ポリヌクレオチドのフラグメントは、好ましくは、少なくとも１０
、好ましくは少なくとも１５または少なくとも２０、例えば少なくとも２５、少なくとも
３０または少なくとも４０ヌクレオチドの長さであろう。それらは、典型的には、４０、
５０、６０、７０、１００または１５０までのヌクレオチド長さであろう。フラグメント
は、１５０ヌクレオチドより長い長さ、例えば２００、３００、４００、５００、６００
、７００、８００、９００もしくは１０００ヌクレオチドまでの長さ、またはさらに配列
番号２、４、６、８、または１０のコード配列のそれぞれ短い５、１０もしくは１５ヌク
レオチドなどの少数のヌクレオチドまでであり得る。
【0076】
本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、組換えで、合成で、または当業者にとっ
て利用可能な任意の手段によって産生することができる。それらは、標準的技法によりク
ローニングすることもできる。ポリヌクレオチドは、典型的には単離および／または精製
された形態で提供される。
て利用可能な任意の手段によって産生することができる。それらは、標準的技法によりク
ローニングすることもできる。ポリヌクレオチドは、典型的には単離および／または精製
された形態で提供される。
【0077】
一般的に、短いポリヌクレオチドは、所望の核酸配列の、一度に１つのヌクレオチドの
段階的製造を含む合成手段により産生されるであろう。自動化された技法を使用してこの
ことを達成するための技法は、当技術分野で容易に利用することができる。
段階的製造を含む合成手段により産生されるであろう。自動化された技法を使用してこの
ことを達成するための技法は、当技術分野で容易に利用することができる。
【0078】
より長いポリヌクレオチドは、一般的に、組換え手段を使用して、例えばＰＣＲ（ポリ
メラーゼ連鎖反応）クローニング技法を使用して産生されるであろう。このことは、クロ
ーニングすることが望まれるｉｇｄＥ遺伝子の領域に対する一対のプライマー（例えば、
約１５～３０ヌクレオチドの）を作製して、該プライマーを細菌細胞から得られたＤＮＡ
と接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応を、所望の領域の増幅を生じさせる条件下で実施し
、増幅されたフラグメントを単離して（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製する
ことにより）増幅されたＤＮＡを回収することを含むであろう。プライマーは、適当な制
限酵素認識部位を含有するように設計することができ、その結果、増幅されたＤＮＡは、
適当なクローニングベクター中にクローニングされ得る。適当なプライマーは、例えば、
配列番号１２～２２におけるものである。
メラーゼ連鎖反応）クローニング技法を使用して産生されるであろう。このことは、クロ
ーニングすることが望まれるｉｇｄＥ遺伝子の領域に対する一対のプライマー（例えば、
約１５～３０ヌクレオチドの）を作製して、該プライマーを細菌細胞から得られたＤＮＡ
と接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応を、所望の領域の増幅を生じさせる条件下で実施し
、増幅されたフラグメントを単離して（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製する
ことにより）増幅されたＤＮＡを回収することを含むであろう。プライマーは、適当な制
限酵素認識部位を含有するように設計することができ、その結果、増幅されたＤＮＡは、
適当なクローニングベクター中にクローニングされ得る。適当なプライマーは、例えば、
配列番号１２～２２におけるものである。
【0079】
そのような技法は、本明細書に記載されたｉｇｄＥ遺伝子配列の全てまたは一部を得る
ために使用することができる。一般的に本明細書で言及された技法は当技術分野において
周知であるが、特にSambrook et al. (1989)を引用することができる。本明細書に記載さ
れたＩｇｄＥポリヌクレオチドは、インビトロ、インビボまたはエックスビボで行われ得
る、本発明で使用するためのポリペプチドの産生において利用価値を有する。ポリヌクレ
オチドは、それら自体の価値で治療薬として使用されてもよく、または組換えタンパク質
合成に関与することもある。
ために使用することができる。一般的に本明細書で言及された技法は当技術分野において
周知であるが、特にSambrook et al. (1989)を引用することができる。本明細書に記載さ
れたＩｇｄＥポリヌクレオチドは、インビトロ、インビボまたはエックスビボで行われ得
る、本発明で使用するためのポリペプチドの産生において利用価値を有する。ポリヌクレ
オチドは、それら自体の価値で治療薬として使用されてもよく、または組換えタンパク質
合成に関与することもある。
【0080】
本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、典型的には、組換え複製可能なベクター
中に組み込まれる。該ベクターは、該核酸を適合性の宿主細胞中で複製するために使用す
ることができる。それゆえ、本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、ＩｇｄＥポリ
ヌクレオチドを、複製可能はベクター中に導入して、該ベクターを適合性宿主細胞に導入
し、該宿主細胞を、ベクターの複製を生じさせる条件下で成長させることにより作製する
ことができる。
中に組み込まれる。該ベクターは、該核酸を適合性の宿主細胞中で複製するために使用す
ることができる。それゆえ、本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、ＩｇｄＥポリ
ヌクレオチドを、複製可能はベクター中に導入して、該ベクターを適合性宿主細胞に導入
し、該宿主細胞を、ベクターの複製を生じさせる条件下で成長させることにより作製する
ことができる。
【0081】
好ましくは、ベクターは、ＩｇｄＥポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベク
ターである。そのような発現ベクターは、分子生物学の分野で日常的に構築されて、例え
ば、プラスミドＤＮＡおよび適当な開始剤、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレ
メント、例えば、タンパク質発現を可能にするために必要であり得て正しい配向で位置す
るポリアデニル化シグナルなどの使用を含むこともできる。他の適当なベクターは、当業
者には明らかであろう。これに関連するさらなる例として、本発明者らはSambrook et al
. (1989)を引用する。
ターである。そのような発現ベクターは、分子生物学の分野で日常的に構築されて、例え
ば、プラスミドＤＮＡおよび適当な開始剤、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレ
メント、例えば、タンパク質発現を可能にするために必要であり得て正しい配向で位置す
るポリアデニル化シグナルなどの使用を含むこともできる。他の適当なベクターは、当業
者には明らかであろう。これに関連するさらなる例として、本発明者らはSambrook et al
. (1989)を引用する。
【0082】
好ましくは、ベクター中の本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によ
りコード配列の発現を提供することができる制御配列に作動的に連結しており、すなわち
該ベクターは、発現ベクターである。用語「作動的に連結している」とは、記載された成
分がそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並列を指す。プロモ
ーターなどの調節配列は、コード配列に「作動的に連結して」、コード配列の発現が、調
節配列と適合性の条件下で達成されるように位置する。
りコード配列の発現を提供することができる制御配列に作動的に連結しており、すなわち
該ベクターは、発現ベクターである。用語「作動的に連結している」とは、記載された成
分がそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並列を指す。プロモ
ーターなどの調節配列は、コード配列に「作動的に連結して」、コード配列の発現が、調
節配列と適合性の条件下で達成されるように位置する。
【0083】
ベクターは、例えば、複製の起源、任意選択で前記ポリヌクレオチドの発現のためのプ
ロモーターおよび任意選択でプロモーターの調節因子を提供されたプラスミド、ウイルス
またはファージベクターであり得る。ベクターは、典型的にはインビボで使用されるよう
に適合されている。
ロモーターおよび任意選択でプロモーターの調節因子を提供されたプラスミド、ウイルス
またはファージベクターであり得る。ベクターは、典型的にはインビボで使用されるよう
に適合されている。
【0084】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が設計されている宿主細胞と適合性
となるように選択することができる。哺乳動物のプロモーター、例えば、βアクチンプロ
モーターなどが使用され得る。組織特異的プロモーターは、特に好ましい。ウイルスのプ
ロモーター、例えばマウスのモロニー白血病ウイルスの長い末端反復（MMLV LTR）、ラウ
ス肉腫ウイルス（RSV）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロ
ウイルス（CMV）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、ＨＳＶプロモーター（ＨＳＶ Ｉ
Ｅプロモーターなど）、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）
も使用することができる。ウイルスのプロモーターは、当技術分野で容易に入手すること
ができる。ベクターは、真核生物ゲノムの配列、好ましくは哺乳動物ゲノムの配列に相同
性の配列を含むポリヌクレオチドを生じさせるポリヌクレオチドの側にある配列をさらに
含むこともできる。このことは、相同性組換えにより、本発明のポリヌクレオチドの真核
生物細胞のゲノム中への導入を可能にするであろう。特に、ウイルスの配列が側面に位置
する発現カセットを含むプラスミドベクターは、本発明のポリヌクレオチドを、哺乳動物
細胞に送達するために適当なウイルスのベクターを調製するために使用することができる
。適当なウイルスのベクターの他の例には、単純ヘルペスウイルスベクターおよび、レン
チウイルスを含むレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびＨＰＶウ
イルスが含まれる。これらのウイルスを使用する遺伝子移転技法は、当業者に知られてい
る。レトロウイルスベクターは、例えば、ポリヌクレオチドを生じさせるポリヌクレオチ
ドを宿主ゲノム中に安定に統合するために使用することができる。複製に欠陥のあるアデ
ノウイルスベクターは、対照的に、エピソームにとどまり、それゆえ一過性発現を可能に
する。
となるように選択することができる。哺乳動物のプロモーター、例えば、βアクチンプロ
モーターなどが使用され得る。組織特異的プロモーターは、特に好ましい。ウイルスのプ
ロモーター、例えばマウスのモロニー白血病ウイルスの長い末端反復（MMLV LTR）、ラウ
ス肉腫ウイルス（RSV）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロ
ウイルス（CMV）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、ＨＳＶプロモーター（ＨＳＶ Ｉ
Ｅプロモーターなど）、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）
も使用することができる。ウイルスのプロモーターは、当技術分野で容易に入手すること
ができる。ベクターは、真核生物ゲノムの配列、好ましくは哺乳動物ゲノムの配列に相同
性の配列を含むポリヌクレオチドを生じさせるポリヌクレオチドの側にある配列をさらに
含むこともできる。このことは、相同性組換えにより、本発明のポリヌクレオチドの真核
生物細胞のゲノム中への導入を可能にするであろう。特に、ウイルスの配列が側面に位置
する発現カセットを含むプラスミドベクターは、本発明のポリヌクレオチドを、哺乳動物
細胞に送達するために適当なウイルスのベクターを調製するために使用することができる
。適当なウイルスのベクターの他の例には、単純ヘルペスウイルスベクターおよび、レン
チウイルスを含むレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびＨＰＶウ
イルスが含まれる。これらのウイルスを使用する遺伝子移転技法は、当業者に知られてい
る。レトロウイルスベクターは、例えば、ポリヌクレオチドを生じさせるポリヌクレオチ
ドを宿主ゲノム中に安定に統合するために使用することができる。複製に欠陥のあるアデ
ノウイルスベクターは、対照的に、エピソームにとどまり、それゆえ一過性発現を可能に
する。
【0085】
疾患および状態
ＩｇｄＥポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、病原性ＩｇＧ抗体により媒介される
疾患または状態を治療または予防するために使用することもできる。病原性のＩｇＧ抗体
が、多くの異なる疾患および状態の病原性に関与していることは、当技術分野において周
知である。その結果として、そのような疾患における病原性のＩｇＧ抗体の効果は、Ｉｇ
ｄＥポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して阻害することができる。
ＩｇｄＥポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、病原性ＩｇＧ抗体により媒介される
疾患または状態を治療または予防するために使用することもできる。病原性のＩｇＧ抗体
が、多くの異なる疾患および状態の病原性に関与していることは、当技術分野において周
知である。その結果として、そのような疾患における病原性のＩｇＧ抗体の効果は、Ｉｇ
ｄＥポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して阻害することができる。
【0086】
疾患または状態は、自己免疫疾患であり得る。そのような疾患には、アジソン病、円形
脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、再生不良性貧血、自己免疫性胃炎、自己免疫
性聴覚喪失、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性副甲状腺機能低下症、
自己免疫性脳下垂体炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群、自己免疫
性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、ベーチ
ェット病、水胞性類天疱瘡、心筋症、慢性炎症性脱髄多発神経障害、チャーグ－ストラウ
ス症候群、腹腔の疾患、クローン病、ＣＲＥＳＴ症候群、Ｄｅｇｏｓ疾患、後天性表皮水
疱症、原発性混合クリオグロブリン血症、巨細胞動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー
症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、突発性血小板減少性紫斑
病、炎症性腸疾患、川崎病、メニエル症候群、混合結合組織病、モーレン潰瘍、多発性硬
化症、重症筋無力症、葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、１型多
腺性自己免疫性症候群（ＰＡＳ－１）、２型多腺性自己免疫性症候群（ＰＡＳ－２）、３
型多腺性自己免疫性症候群（ＰＡＳ－３）、多発性筋炎／皮膚筋炎、原発胆汁性肝硬変、
乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシ
ス、強皮症、シェーグレン症候群、亜急性甲状腺炎、交感神経眼炎、全身性エリテマトー
デス、高安動脈炎、真性１型糖尿病、白斑、ホヒト・小柳・原田病またはウェゲネル肉芽
腫症が含まれる。好ましくは自己免疫性疾患は関節リウマチ（ＲＡ）である。
脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、再生不良性貧血、自己免疫性胃炎、自己免疫
性聴覚喪失、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性副甲状腺機能低下症、
自己免疫性脳下垂体炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群、自己免疫
性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、ベーチ
ェット病、水胞性類天疱瘡、心筋症、慢性炎症性脱髄多発神経障害、チャーグ－ストラウ
ス症候群、腹腔の疾患、クローン病、ＣＲＥＳＴ症候群、Ｄｅｇｏｓ疾患、後天性表皮水
疱症、原発性混合クリオグロブリン血症、巨細胞動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー
症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、突発性血小板減少性紫斑
病、炎症性腸疾患、川崎病、メニエル症候群、混合結合組織病、モーレン潰瘍、多発性硬
化症、重症筋無力症、葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、１型多
腺性自己免疫性症候群（ＰＡＳ－１）、２型多腺性自己免疫性症候群（ＰＡＳ－２）、３
型多腺性自己免疫性症候群（ＰＡＳ－３）、多発性筋炎／皮膚筋炎、原発胆汁性肝硬変、
乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシ
ス、強皮症、シェーグレン症候群、亜急性甲状腺炎、交感神経眼炎、全身性エリテマトー
デス、高安動脈炎、真性１型糖尿病、白斑、ホヒト・小柳・原田病またはウェゲネル肉芽
腫症が含まれる。好ましくは自己免疫性疾患は関節リウマチ（ＲＡ）である。
【0087】
疾患または状態は喘息であり得る。喘息は急性または慢性喘息であり得る。
【0088】
ＩｇＧは、補体系の古典的経路を活性化する。それゆえ、ＩｇｄＥポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドは、補体活性化が患者にとって有害な疾患および状態を治療するために
使用することができる。例えば、ＩｇｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、移植
に誘導された障害、例えば移植拒絶（同種移植および異種移植拒絶など）および移植片対
宿主病を治療するために使用することができる。移植誘導障害は患者における組織または
器官の移植に基づいて起こり得る。
ポリヌクレオチドは、補体活性化が患者にとって有害な疾患および状態を治療するために
使用することができる。例えば、ＩｇｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、移植
に誘導された障害、例えば移植拒絶（同種移植および異種移植拒絶など）および移植片対
宿主病を治療するために使用することができる。移植誘導障害は患者における組織または
器官の移植に基づいて起こり得る。
【0089】
ＩｇｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、手術後の治療に、例えば、心臓バイ
パス手術を受けた患者の治療にも使用される。
パス手術を受けた患者の治療にも使用される。
【0090】
さらに、ＩｇｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、後天性血友病の治療のため
に、すなわち、凝血因子に対する自己抗体を発生させた血友病患者でＩｇＧを除去するた
めに使用することができる。
に、すなわち、凝血因子に対する自己抗体を発生させた血友病患者でＩｇＧを除去するた
めに使用することができる。
【0091】
本明細書において使用する用語「対象」は、任意の哺乳動物の対象、例えば、ヒト、ブ
タ、ウマ、および任意のウシなどを含む。
タ、ウマ、および任意のウシなどを含む。
【0092】
インビトロの方法
本発明は、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％
の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかの
それらのフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法を
包含する。
本発明は、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％
の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかの
それらのフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法を
包含する。
【0093】
好ましい実施形態において、アミノ酸配列は配列番号３である。ＩｇＧの切断のための
インビトロの方法は、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧシステ
インプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントまたは配
列番号３の変異体のフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む。
インビトロの方法は、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧシステ
インプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントまたは配
列番号３の変異体のフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む。
【0094】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ヒトＩｇＧに、特にヒトＩｇＧ１に特異
的である。さらに、ポリペプチドは、軽鎖がカッパ型であるかまたはラムダ型であるかに
拘わらず、図４に示されるようにＩｇＧ１を切断する。
的である。さらに、ポリペプチドは、軽鎖がカッパ型であるかまたはラムダ型であるかに
拘わらず、図４に示されるようにＩｇＧ１を切断する。
【0095】
該ポリペプチドはＩｇＧシステインプロテアーゼであり、それは、典型的には、配列番
号１の位置２６５、２９６および３１１に対応する位置に、システイン残基、ヒスチジン
残基およびアスパラギン酸残基を含む触媒部位を備えることができる。例えば、配列番号
３には、システイン残基、ヒスチジン残基およびアスパラギン酸残基が、位置２６２、２
９３および３０８に見出される。ポリペプチドの変異体およびフラグメントは、典型的に
はこれらの残基を保持している。
号１の位置２６５、２９６および３１１に対応する位置に、システイン残基、ヒスチジン
残基およびアスパラギン酸残基を含む触媒部位を備えることができる。例えば、配列番号
３には、システイン残基、ヒスチジン残基およびアスパラギン酸残基が、位置２６２、２
９３および３０８に見出される。ポリペプチドの変異体およびフラグメントは、典型的に
はこれらの残基を保持している。
【0096】
本発明の方法は、該ポリペプチドを、ＩｇＧを含有する試料と、特異的システインプロ
テアーゼ活性が起こることを可能にする条件下でインキュベートすることを含む。該方法
は、切断産物の同定および／または単離をさらに含む。分析は、当技術分野において知ら
れた任意の適当な方法によることができる。幾つかの場合に、分析は、ゲル電気泳動（例
えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ）または質量分析法による。
テアーゼ活性が起こることを可能にする条件下でインキュベートすることを含む。該方法
は、切断産物の同定および／または単離をさらに含む。分析は、当技術分野において知ら
れた任意の適当な方法によることができる。幾つかの場合に、分析は、ゲル電気泳動（例
えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ）または質量分析法による。
【0097】
本発明の別の実施形態において、インビトロの方法は、ＩｇＧのＦｃまたはＦａｂフラ
グメントを生じさせるために使用される。該方法は、ＩｇＧを本発明のポリペプチドと接
触させることを含む。
グメントを生じさせるために使用される。該方法は、ＩｇＧを本発明のポリペプチドと接
触させることを含む。
【0098】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の方法は、ＩｇＧを検出するために使用さ
れる。これは、（ｉ）試料を、ポリペプチドと、ポリペプチドのＩｇＧ特異的システイン
プロテアーゼ活性を可能にする条件下で接触させること；および（ｉｉ）ＩｇＧ特異的切
断フラグメントの存在についてモニターすることを含むこともでき；ここで、特異的切断
フラグメントの存在は試料中のＩｇＧを示す。
れる。これは、（ｉ）試料を、ポリペプチドと、ポリペプチドのＩｇＧ特異的システイン
プロテアーゼ活性を可能にする条件下で接触させること；および（ｉｉ）ＩｇＧ特異的切
断フラグメントの存在についてモニターすることを含むこともでき；ここで、特異的切断
フラグメントの存在は試料中のＩｇＧを示す。
【実施例0099】
[実施例１]
Ｓ．スイス（S. suis）からのＩｇｄＥの同定
細菌株および成長条件
Ｓ．スイス（S. suis）の株１０は、突然変異生成およびブタの実験的感染のために幾
つかの研究で使用されたことのある毒性の血清型２の株である（Smith et al. 1999. Inf
ect. Immun. 67, 1750-1756）。株１０Ｍ７はＨｉｌｄｅ Ｓｍｉｔｈ（ＡＷＧ、Ｌｅｌ
ｙｓｔａｄ、オランダ）の好意により提供された（Smith et al. 1996. Infect. Immun.
64, 4409-4412）。連鎖球菌は、コロンビア寒天プレート上で６％のヒツジ血液を添加し
て、またはＢａｃｔｏＴｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔブロス（ＴＨＢ）中、嫌気性条件下にて３
７℃で成長させた。大腸菌（Eschrichia coli）株は、Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）中で培
養した。適当な場合に、抗生物質を、カナマイシンについては５０μｇ／ｍｌおよびゲン
タマイシンについては２０μｇ／ｍｌ添加した。
Ｓ．スイス（S. suis）からのＩｇｄＥの同定
細菌株および成長条件
Ｓ．スイス（S. suis）の株１０は、突然変異生成およびブタの実験的感染のために幾
つかの研究で使用されたことのある毒性の血清型２の株である（Smith et al. 1999. Inf
ect. Immun. 67, 1750-1756）。株１０Ｍ７はＨｉｌｄｅ Ｓｍｉｔｈ（ＡＷＧ、Ｌｅｌ
ｙｓｔａｄ、オランダ）の好意により提供された（Smith et al. 1996. Infect. Immun.
64, 4409-4412）。連鎖球菌は、コロンビア寒天プレート上で６％のヒツジ血液を添加し
て、またはＢａｃｔｏＴｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔブロス（ＴＨＢ）中、嫌気性条件下にて３
７℃で成長させた。大腸菌（Eschrichia coli）株は、Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）中で培
養した。適当な場合に、抗生物質を、カナマイシンについては５０μｇ／ｍｌおよびゲン
タマイシンについては２０μｇ／ｍｌ添加した。
【0100】
動物由来の材料
実験的に感染させたコブタからの試料を先行する研究中に取り出した。この動物実験の
ためのプロトコルは、ドイツのニーダーザクセン州動物実験委員会消費者保護および食物
安全局（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｌｏｗｅｒ Ｓａｘｏｎｉａｎ Ｓｔａｔｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｕ
ｍｅｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ）により承認された（
承認番号３３．９－４２５０２－０４－０７／１２４３）。殺菌アッセイのために従来の
コブタからの血液のコレクションを、ドイツのザクセン州地方事務所（ｒｅｇｉｏｎａｌ
ｏｆｆｉｃｅ ｉｎ Ｓａｘｏｎｉａ）でＮ１９／１４として登録した。動物試験は、
実験および他の科学的目的のために使用される脊椎動物保護のためのヨーロッパ協定（ｔ
ｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ａｎｉｍａｌｓ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ）（ヨーロ
ッパ条約シリーズｎｏ．１２３（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｔｒｅａｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ， ｎ
ｏ．１２３）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎｓ．ｃｏｅ．ｉｎｔ／Ｔｒ
ｅａｔｙ／ｅｎ／Ｔｒｅａｔｉｅｓ／Ｈｔｍｌ／１２３．ｈｔｍ）およびドイツの動物保
護法（Ｇｅｒｍａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｌａｗ）で概説された原則
および勧告に厳密に従って実施した。
実験的に感染させたコブタからの試料を先行する研究中に取り出した。この動物実験の
ためのプロトコルは、ドイツのニーダーザクセン州動物実験委員会消費者保護および食物
安全局（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｌｏｗｅｒ Ｓａｘｏｎｉａｎ Ｓｔａｔｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｕ
ｍｅｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ）により承認された（
承認番号３３．９－４２５０２－０４－０７／１２４３）。殺菌アッセイのために従来の
コブタからの血液のコレクションを、ドイツのザクセン州地方事務所（ｒｅｇｉｏｎａｌ
ｏｆｆｉｃｅ ｉｎ Ｓａｘｏｎｉａ）でＮ１９／１４として登録した。動物試験は、
実験および他の科学的目的のために使用される脊椎動物保護のためのヨーロッパ協定（ｔ
ｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ａｎｉｍａｌｓ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ）（ヨーロ
ッパ条約シリーズｎｏ．１２３（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｔｒｅａｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ， ｎ
ｏ．１２３）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎｓ．ｃｏｅ．ｉｎｔ／Ｔｒ
ｅａｔｙ／ｅｎ／Ｔｒｅａｔｉｅｓ／Ｈｔｍｌ／１２３．ｈｔｍ）およびドイツの動物保
護法（Ｇｅｒｍａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｌａｗ）で概説された原則
および勧告に厳密に従って実施した。
【0101】
ＩｇＧを分解する活性の同定
Ｓ．スイス（S. suis）の株１０Ｍ７の培養物を、ＯＤ６００約０．６で収穫して、培
養上清を０．２２μＭのＥｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜フィルター（ミリポア）を通して滅
菌濾過した後、培養上清を硫酸アンモニウムを用いて３０％飽和まで分画した。生じた沈
殿を廃棄して、硫酸アンモニウムを残存上清に添加し、最終の濃度を５０％飽和にした。
第２の沈殿を、２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）を添加して出発時の体積の１
／１００に再懸濁して、同じ緩衝液に対する緩衝液交換を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩
カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により実施した。この材料を、ＦＰＬＣによりＨ
ｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに分画した。タンパ
ク質を直線的ＮａＣｌグラジエントにより溶出させて、約０．２Ｍ ＮａＣｌで溶出した
分画が、ＩｇＧを分解する活性を含有することが見出された。活性分画をサイズ排除クロ
マトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ＨＲ、Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけて、そこでＩｇＧを分解する活性は、約３７ｍｌの溶
出体積で溶出した。活性分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析して、タンパク質バンドを質
量分析法の分析にかけた。
Ｓ．スイス（S. suis）の株１０Ｍ７の培養物を、ＯＤ６００約０．６で収穫して、培
養上清を０．２２μＭのＥｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜フィルター（ミリポア）を通して滅
菌濾過した後、培養上清を硫酸アンモニウムを用いて３０％飽和まで分画した。生じた沈
殿を廃棄して、硫酸アンモニウムを残存上清に添加し、最終の濃度を５０％飽和にした。
第２の沈殿を、２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）を添加して出発時の体積の１
／１００に再懸濁して、同じ緩衝液に対する緩衝液交換を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩
カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により実施した。この材料を、ＦＰＬＣによりＨ
ｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに分画した。タンパ
ク質を直線的ＮａＣｌグラジエントにより溶出させて、約０．２Ｍ ＮａＣｌで溶出した
分画が、ＩｇＧを分解する活性を含有することが見出された。活性分画をサイズ排除クロ
マトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ＨＲ、Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけて、そこでＩｇＧを分解する活性は、約３７ｍｌの溶
出体積で溶出した。活性分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析して、タンパク質バンドを質
量分析法の分析にかけた。
【0102】
質量分析法
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法は、Ｕｍｅａタンパク質分析施設（Ｕｍｅａ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ）によって実施された。ＭＳ分析のためのペプチドは、トリプシンを使用し
てゲル内消化により調製して（改変された配列決定規格、Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｅａｓｙ
ｎａｎｏ ＬＣシステム（Ｐｒｏｘｅｏｎ）に連結された、ＨＣＴ ｕｌｔｒａ ＥＴＤ
ＩＩ イオン捕捉装置（Ｂｒｕｋｅｒ）ＥＳＩを使用するＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析
した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのデータセットについての処理、デコンヴォルーションおよび化
合物検出は、ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（４．０ ＳＰ４、Ｂｒｕｋｅｒ）
を使用して実施した。処理されたデータセットのピークリストファイルを使用するデータ
ベース検索は、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、
ＮＣＢＩｎｒデータベースの細菌配列で実施した。検索パラメーターは、ＭＳおよびＭＳ
／ＭＳ両方の様式について、ならびに酸化によるメチオニンの、プロピオンアミド誘導お
よびＮ末端アセチル化によるシステインの可変改変について、０．３Ｄａの質量誤差を許
容した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法は、Ｕｍｅａタンパク質分析施設（Ｕｍｅａ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ）によって実施された。ＭＳ分析のためのペプチドは、トリプシンを使用し
てゲル内消化により調製して（改変された配列決定規格、Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｅａｓｙ
ｎａｎｏ ＬＣシステム（Ｐｒｏｘｅｏｎ）に連結された、ＨＣＴ ｕｌｔｒａ ＥＴＤ
ＩＩ イオン捕捉装置（Ｂｒｕｋｅｒ）ＥＳＩを使用するＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析
した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのデータセットについての処理、デコンヴォルーションおよび化
合物検出は、ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（４．０ ＳＰ４、Ｂｒｕｋｅｒ）
を使用して実施した。処理されたデータセットのピークリストファイルを使用するデータ
ベース検索は、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、
ＮＣＢＩｎｒデータベースの細菌配列で実施した。検索パラメーターは、ＭＳおよびＭＳ
／ＭＳ両方の様式について、ならびに酸化によるメチオニンの、プロピオンアミド誘導お
よびＮ末端アセチル化によるシステインの可変改変について、０．３Ｄａの質量誤差を許
容した。
【0103】
ＩｇＧを分解する能力についてのＳ．スイス（S. suis）株のスクリーニング
１５種の異なるＳ．スイス（S. suis）株（表２）の培養上清を、ＯＤ６００約０．６
で単離して、飽和した硫酸アンモニウム溶液の添加により５０％の最終の飽和に濃縮した
。Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム７Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
）によるＰＢＳに対する緩衝液交換に続いて、沈殿をＰＢＳ中で出発時の１／２０の体積
に再懸濁した。Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清の５０％硫酸アンモニウム沈殿分画を
、ＩｇＧ分解を分析するために使用した。
１５種の異なるＳ．スイス（S. suis）株（表２）の培養上清を、ＯＤ６００約０．６
で単離して、飽和した硫酸アンモニウム溶液の添加により５０％の最終の飽和に濃縮した
。Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム７Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
）によるＰＢＳに対する緩衝液交換に続いて、沈殿をＰＢＳ中で出発時の１／２０の体積
に再懸濁した。Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清の５０％硫酸アンモニウム沈殿分画を
、ＩｇＧ分解を分析するために使用した。
【0104】
【表4】
ｉｇｄＥのインフレーム欠失は、原理的にSeele et al., 2013（J. Bacteriol. 195, 9
30-940）におけるように、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０を用いて実行した。感熱性の
ベクターｐＳＥＴ５＿ΔｉｇｄＥを構築するために、６１８ｂｐの５’－ｉｇｄＥアンプ
リコンを、プライマーｐｒｅＰｒｏＩｇｄＥＰｓｔＩ（ＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧ
ＧＧＡＧＴＡＧＧ、配列番号１２）およびｐｏｓｔＳＳＩｇｄＥＢａｍＨＩ（ＡＴＧＧＡ
ＴＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＣ、配列番号１３）を用いて生じさせ、６１２ｂｐの
３’－ｉｇｄＥアンプリコンをプライマーｐｒｅＥｎｄＩｇｄＥＢａｍＨＩ（ＣＧＧＧＡ
ＴＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＴＣＣ、配列番号１４）およびｐｏｓｔＥｎｄＩｇ
ｄＥＥｃｏＲＩ（ＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＴＴＡＴＴＧＴＡＧＣＧ、配列番号１５）を
用いて生じさせた。これらのアンプリコンを、プライマーの名で指示された制限酵素を用
いてｐＳＥＴ５（１８）中にクローニングしてｐＳＥＴ５＿ΔｉｇｄＥを生じさせた。欠
失クローンを、選択的ＰＣＲ分析ならびにプライマーＩｇｄＥ－ｓｅｑ＿ｆｒｗ（ＡＴＴ
ＧＴＡＴＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧ、配列番号１６）およびＩｇｄＥ－ｓｅｑ＿ｒｅｖ（
ＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＣＣ、配列番号１７）を使用して、ゲノムのア
ンプリコンの配列決定により確認した。
【0105】
配列の分析
配列の分析を、ＳＩＢ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｏｒｔ
ａｌ Ｅｘｐａｓｙ（www.expasy.ch）を使用して実施した。ＳｉｇｎａｌＰ ４．０を
走らせて、推定上のシグナルペプチドおよびそれぞれの切断部位を同定した（www.cbs.dt
u.dk/services/SignalP/）。潜在的な活性部位の残基を同定するために、Ｓ．スイス（S.
suis）ＩｇｄＥのインシリコモデル化を、ＳＷＩＳＳ－モデル（http://swissmodel.exp
asy.org/）を使用して実施した。推定上の膜貫通領域を、コンセンサス予測ウェブサーバ
ーＴＯＰＣＯＮＳ（http://topcons.cbr.su.se/）の最終アクセッション２０１５－１１
－０６を使用して同定した。
配列の分析を、ＳＩＢ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｏｒｔ
ａｌ Ｅｘｐａｓｙ（www.expasy.ch）を使用して実施した。ＳｉｇｎａｌＰ ４．０を
走らせて、推定上のシグナルペプチドおよびそれぞれの切断部位を同定した（www.cbs.dt
u.dk/services/SignalP/）。潜在的な活性部位の残基を同定するために、Ｓ．スイス（S.
suis）ＩｇｄＥのインシリコモデル化を、ＳＷＩＳＳ－モデル（http://swissmodel.exp
asy.org/）を使用して実施した。推定上の膜貫通領域を、コンセンサス予測ウェブサーバ
ーＴＯＰＣＯＮＳ（http://topcons.cbr.su.se/）の最終アクセッション２０１５－１１
－０６を使用して同定した。
【0106】
ＤＮＡ技法およびプライマー配列
プライマーをゲノムＳ．スイス（S. suis）Ｐ１／７中の遺伝子ＳＳＵ＿ＲＳ０８１５
０に基づいて設計した。全てのＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＨＦ
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実行した。全ての得られたプラスミド
を制限分析、ＰＣＲおよび配列決定により確認した。
プライマーをゲノムＳ．スイス（S. suis）Ｐ１／７中の遺伝子ＳＳＵ＿ＲＳ０８１５
０に基づいて設計した。全てのＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＨＦ
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実行した。全ての得られたプラスミド
を制限分析、ＰＣＲおよび配列決定により確認した。
【0107】
Ｓ．スイス（S. suis）ｉｇｄＥのクローニングおよびＩｇｄＥ突然変異体の発生
シグナルペプチドのコード配列（アミノ酸３８～１１２１をコードする）を欠くＳ．ス
イス（S. suis）ｉｇｄＥ遺伝子を、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０の染色体ＤＮＡから
、プライマーＩｇｄＥ－ｆｒｗ＿ＮｃｏＩ（ＧＴＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＣＴＣ
ＡＣＡＴＴＴＡＣＡＡＴＣＧ、配列番号１８）およびＩｇｄＥ－ｒｅｖ＿ＮｏｔＩ（ＡＣ
ＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＣ、配列番号１９）を使用するテンプレ
ートとして増幅して、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
で消化した後、ｐＥＴ＿ＺＺ＿１ａ中にクローニングした。挿入された全体を配列決定し
て、Ｓ．スイス（S. suis）ｉｇｄＥのクローニングおよび配列を検証した。得られたＳ
．スイス（S. suis）の株１０ｉｇｄＥの配列は、Ｓ．スイス（S. suis）の０５ＺＹＨ３
３の配列のうちの１つと同じであり、３２個のアミノ酸の挿入を含有しており、Ｓ．スイ
ス（S. suis）Ｐ１／７のＳＳＵ＿ＲＳ０８１５０と比較した。
シグナルペプチドのコード配列（アミノ酸３８～１１２１をコードする）を欠くＳ．ス
イス（S. suis）ｉｇｄＥ遺伝子を、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０の染色体ＤＮＡから
、プライマーＩｇｄＥ－ｆｒｗ＿ＮｃｏＩ（ＧＴＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＣＴＣ
ＡＣＡＴＴＴＡＣＡＡＴＣＧ、配列番号１８）およびＩｇｄＥ－ｒｅｖ＿ＮｏｔＩ（ＡＣ
ＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＣ、配列番号１９）を使用するテンプレ
ートとして増幅して、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
で消化した後、ｐＥＴ＿ＺＺ＿１ａ中にクローニングした。挿入された全体を配列決定し
て、Ｓ．スイス（S. suis）ｉｇｄＥのクローニングおよび配列を検証した。得られたＳ
．スイス（S. suis）の株１０ｉｇｄＥの配列は、Ｓ．スイス（S. suis）の０５ＺＹＨ３
３の配列のうちの１つと同じであり、３２個のアミノ酸の挿入を含有しており、Ｓ．スイ
ス（S. suis）Ｐ１／７のＳＳＵ＿ＲＳ０８１５０と比較した。
【0108】
推定上の活性部位の残基Ｃ３０２からＳへ、Ｈ３３３からＡへ、およびＤ３４８からＡ
へという特異的突然変異生成を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌ
ｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびプライマーＩｇｄＥ－Ｃ３０２Ｓ（ＡＡＣＧＴＣＡＧ
ＡＡＡＧＣＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＣＴ、配列番号２０）、ＩｇｄＥ
－Ｈ３３３Ａ（ＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＣＧＴＧ、配列
番号２１）およびＩｇｄＥ－Ｄ３４８Ａ（ＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣ
ＣＧＧＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧ、配列番号２２）を用いて、メーカーの使用
説明に従って実施した。
へという特異的突然変異生成を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌ
ｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびプライマーＩｇｄＥ－Ｃ３０２Ｓ（ＡＡＣＧＴＣＡＧ
ＡＡＡＧＣＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＣＴ、配列番号２０）、ＩｇｄＥ
－Ｈ３３３Ａ（ＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＣＧＴＧ、配列
番号２１）およびＩｇｄＥ－Ｄ３４８Ａ（ＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣ
ＣＧＧＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧ、配列番号２２）を用いて、メーカーの使用
説明に従って実施した。
【0109】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのＮ末端４７０アミノ酸からなるＩｇｄＥΔＣは、制
限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｐＺ
Ｚ１ａ中の全長ｉｇｄＥを消化することにより創出した。消化されたプラスミドを精製し
て再連結し、大腸菌（E. coli）中に形質転換した。
限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｐＺ
Ｚ１ａ中の全長ｉｇｄＥを消化することにより創出した。消化されたプラスミドを精製し
て再連結し、大腸菌（E. coli）中に形質転換した。
【0110】
組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの発現および精製
ｐＥＴ＿ＺＺ＿１ａ ｉｇｄＥ、ｉｇｄＥＣ３０２Ｓ、ｉｇｄＥＨ３０２Ａ、ｉｇｄＥ
Ｄ３０２ＡまたはｉｇｄＥΔＣを保有する大腸菌（E. coli）ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓ
ｓ（ＤＥ３）＿ＲＩＬ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）単離物を、ＯＤ６
０００．６まで３０℃で成長させた。タンパク質の発現は、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて１
２℃で誘発し、インキュベーションをさらに２２時間継続した。
ｐＥＴ＿ＺＺ＿１ａ ｉｇｄＥ、ｉｇｄＥＣ３０２Ｓ、ｉｇｄＥＨ３０２Ａ、ｉｇｄＥ
Ｄ３０２ＡまたはｉｇｄＥΔＣを保有する大腸菌（E. coli）ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓ
ｓ（ＤＥ３）＿ＲＩＬ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）単離物を、ＯＤ６
０００．６まで３０℃で成長させた。タンパク質の発現は、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて１
２℃で誘発し、インキュベーションをさらに２２時間継続した。
【0111】
細胞をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）により溶解し
て粗抽出物を得、またはＳｔａｎｓｔｅｄ高圧細胞粉砕機（Ｓｔａｎｓｔｅｄ Ｆｌｕｉ
ｄ Ｐｏｗｅｒ）により５０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、
５％グリセリン、４０μＭイミダゾール中で精製した。Ｈｉｓ－ＺＺのタグが付いたタン
パク質を、ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で標準プロトコルを使
用して精製した。タグをＴｅｖ－プロテアーゼによる酵素的切断により５℃で２０時間除
去し、続いて第２回の精製をＨｉｓＴｒａｐＦＴで行なった。タグの付いていないｒＩｇ
ｄＥを含有するフロースルーを収集した。組換えＩｇｄＥΔＣを、上で記載されたように
高収率で精製して、純度を全長ｒＩｇｄＥと比較した。
て粗抽出物を得、またはＳｔａｎｓｔｅｄ高圧細胞粉砕機（Ｓｔａｎｓｔｅｄ Ｆｌｕｉ
ｄ Ｐｏｗｅｒ）により５０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、
５％グリセリン、４０μＭイミダゾール中で精製した。Ｈｉｓ－ＺＺのタグが付いたタン
パク質を、ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で標準プロトコルを使
用して精製した。タグをＴｅｖ－プロテアーゼによる酵素的切断により５℃で２０時間除
去し、続いて第２回の精製をＨｉｓＴｒａｐＦＴで行なった。タグの付いていないｒＩｇ
ｄＥを含有するフロースルーを収集した。組換えＩｇｄＥΔＣを、上で記載されたように
高収率で精製して、純度を全長ｒＩｇｄＥと比較した。
【0112】
ＩｇＧ分解の定性分析
濃縮されて分画された培養上清中におけるＩｇＧ切断活性をモニターするために、試料
を１％ブタ血漿とＰＢＳ中で３７℃で１６時間インキュベートした後、ウェスタンブロッ
ト分析した。
濃縮されて分画された培養上清中におけるＩｇＧ切断活性をモニターするために、試料
を１％ブタ血漿とＰＢＳ中で３７℃で１６時間インキュベートした後、ウェスタンブロッ
ト分析した。
【0113】
ＩｇＧプロテアーゼの触媒型を同定するために、ＩｇＧ分解反応を、０．１～５ｍＭの
ＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、０．１～５ｍＭのＥＤＴＡ、５０～２５０μＭのＥ６４（Ｓ
ｉｇｍａ）、０．１～５ｍＭのＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２（Ｂａｃｈｅｍ）、０．１～５ｍＭ
のヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）または１／２００から１／５０希釈の完全プロテア
ーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で実施した。
ＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、０．１～５ｍＭのＥＤＴＡ、５０～２５０μＭのＥ６４（Ｓ
ｉｇｍａ）、０．１～５ｍＭのＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２（Ｂａｃｈｅｍ）、０．１～５ｍＭ
のヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）または１／２００から１／５０希釈の完全プロテア
ーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で実施した。
【0114】
ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌのブタＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）または他の種（ヒト、ヤギ、ウ
シ、ウマおよびマウス；全てＳｉｇｍａ）のＩｇＧを、上記のＳ．スイス（S. suis）Ｉ
ｇｄＥ構築物を保有する誘発された大腸菌（E. coli）の粗抽出物または１０ｎＭの精製
ｒＩｇｄＥのいずれかと３７℃で１６時間インキュベートした後、還元または非還元いず
れかの条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。
シ、ウマおよびマウス；全てＳｉｇｍａ）のＩｇＧを、上記のＳ．スイス（S. suis）Ｉ
ｇｄＥ構築物を保有する誘発された大腸菌（E. coli）の粗抽出物または１０ｎＭの精製
ｒＩｇｄＥのいずれかと３７℃で１６時間インキュベートした後、還元または非還元いず
れかの条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。
【0115】
ブタ体液中における内因性ＩｇＧの分解を分析するために：心膜液、腹腔液および関節
液は１／１０；血清は１／５０希釈後に；脳脊髄液については無希釈で使用した。脳脊髄
液および関節液は、Ｓ．スイス（S. suis）感染により引き起こされた線維素化膿性髄膜
炎および滑膜炎を有するコブタからまたは病変のないコブタからのものである。そうでな
ければ、ＩｇＧ分解の分析は、上記のように精製ｒＩｇｄＥで実施して、ＳＤＳ－ＰＡＧ
Ｅおよびウェスタンブロット分析の両方によって分析した。実験は、少なくとも３回繰り
返して、代表的分析を示す。
液は１／１０；血清は１／５０希釈後に；脳脊髄液については無希釈で使用した。脳脊髄
液および関節液は、Ｓ．スイス（S. suis）感染により引き起こされた線維素化膿性髄膜
炎および滑膜炎を有するコブタからまたは病変のないコブタからのものである。そうでな
ければ、ＩｇＧ分解の分析は、上記のように精製ｒＩｇｄＥで実施して、ＳＤＳ－ＰＡＧ
Ｅおよびウェスタンブロット分析の両方によって分析した。実験は、少なくとも３回繰り
返して、代表的分析を示す。
【0116】
ＩｇＧ分解の定量分析
時間経過分析および阻害剤プロファイルのために、ＩｇＧ分解反応を、０．２５ｍｇ／
ｍｌのブタＩｇＧおよび２μＭの精製ＩｇｄＥΔＣを用いてＰＢＳ中３７℃で、阻害せず
に、または２．５μＭまたは２５０μＭのＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、ＥＤＴＡ、Ｅ－６
４（Ｓｉｇｍａ）、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）、またはＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２（
Ｂａｃｈｅｍ）の存在下で実施した。２５０μＭのＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２中のＤＭＳＯ含
有率に対応する０．２７５％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を溶媒対照として使用した。反応
液を連続的に試料として採取して、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。タンパク質
のバンドは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｆｌｕｏｒ（商標） Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる染色により検出した。ＩｇＧ分
解産物を、ＬＡＳ４０００撮像システム（冨士フィルム）を用いる撮像により濃度計で定
量化し、Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）ソフトウェアを用いて分析した。時間経過実験のために、阻害されない終
夜の切断を１００％相対切断として設定した。阻害剤プロファイルのために、初期切断速
度を切断産物の初期増大（０～２５％の相対切断）から計算して、阻害されない反応の初
期切断速度を１００％相対活性として設定した。実験は、少なくとも３連で実施した。統
計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０を使用して実施した
。
時間経過分析および阻害剤プロファイルのために、ＩｇＧ分解反応を、０．２５ｍｇ／
ｍｌのブタＩｇＧおよび２μＭの精製ＩｇｄＥΔＣを用いてＰＢＳ中３７℃で、阻害せず
に、または２．５μＭまたは２５０μＭのＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、ＥＤＴＡ、Ｅ－６
４（Ｓｉｇｍａ）、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）、またはＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２（
Ｂａｃｈｅｍ）の存在下で実施した。２５０μＭのＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２中のＤＭＳＯ含
有率に対応する０．２７５％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を溶媒対照として使用した。反応
液を連続的に試料として採取して、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。タンパク質
のバンドは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｆｌｕｏｒ（商標） Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる染色により検出した。ＩｇＧ分
解産物を、ＬＡＳ４０００撮像システム（冨士フィルム）を用いる撮像により濃度計で定
量化し、Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）ソフトウェアを用いて分析した。時間経過実験のために、阻害されない終
夜の切断を１００％相対切断として設定した。阻害剤プロファイルのために、初期切断速
度を切断産物の初期増大（０～２５％の相対切断）から計算して、阻害されない反応の初
期切断速度を１００％相対活性として設定した。実験は、少なくとも３連で実施した。統
計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０を使用して実施した
。
【0117】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥのための試料は、還元または非還元いずれかの試料緩衝液を用いて調
製し、９５℃に５分間加熱した。１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥをクーマシーブルー（Ｓｉｇ
ｍａ）、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｆｌｕｏｒ（商標） Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ
ｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかで染色して、またはウェスタンブ
ロット分析のためにＨｙｂｏｎｄ－Ｐ ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にブ
ロットした。０．１％ＰＢＳ－ツイーン中で、膜を５％乾燥粉乳でブロッキングし、続い
て西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体とインキュベートした。ヤギ抗ブタＩ
ｇＧ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびヤギ抗ブタＩｇＭ－ＨＲＰ
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：２５，０００に希釈して、ヤギ抗ブタＩ
ｇＡ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：１２，５００に希釈した。
膜を０．１％ＰＢＳ－ツイーンで徹底的に洗浄した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ選択ウ
ェスタンブロット検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてメーカーの使用説明
に従って現像し、ＬＡＳ４０００撮像システム（冨士フィルム）により写真撮影した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥのための試料は、還元または非還元いずれかの試料緩衝液を用いて調
製し、９５℃に５分間加熱した。１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥをクーマシーブルー（Ｓｉｇ
ｍａ）、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｆｌｕｏｒ（商標） Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ
ｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかで染色して、またはウェスタンブ
ロット分析のためにＨｙｂｏｎｄ－Ｐ ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にブ
ロットした。０．１％ＰＢＳ－ツイーン中で、膜を５％乾燥粉乳でブロッキングし、続い
て西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体とインキュベートした。ヤギ抗ブタＩ
ｇＧ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびヤギ抗ブタＩｇＭ－ＨＲＰ
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：２５，０００に希釈して、ヤギ抗ブタＩ
ｇＡ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：１２，５００に希釈した。
膜を０．１％ＰＢＳ－ツイーンで徹底的に洗浄した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ選択ウ
ェスタンブロット検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてメーカーの使用説明
に従って現像し、ＬＡＳ４０００撮像システム（冨士フィルム）により写真撮影した。
【0118】
Ｎ末端のエドマン配列決定
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥで処理されたブタＩｇＧを、前に説明したようにＳＤ
Ｓ－ＰＡＧＥにより分離して、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム／２０％ＭｅｔＯＨをブロッ
ト緩衝液として用いて、半乾燥ブロットによりＨｙｂｏｎｄ－Ｐ ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に移した。該膜をＰｏｎｃｅａｕ Ｓ（Ｓｉｇｍａ）で染色して
、乾燥後、約３２ｋＤａの分解産物を正確に切り出した。分解産物のＮ末端のエドマン配
列決定を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｆａｃｔｏｒｙ（ベルリン、ドイツ）により実施して、配
列Ｗ／Ｃ ＰＩＣＰＡＣＥを得た。最初の位置配列決定は、強いトリプトファンピークお
よびシステイン位置に弱いピークのみを生ずる汚染に多分基づいて複雑であった。しかし
ながら、ＢＬＡＳＴ相同性の検索で、配列を疑う余地のないスコアのブタＩｇＧヒンジ領
域配列が、システイン残基を対応する位置に含有した。システインは、プロピオンアミド
改変されたシステインのシグナルにより同定されたが、それにも拘わらずシステインは較
正標準の部分ではない。
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥで処理されたブタＩｇＧを、前に説明したようにＳＤ
Ｓ－ＰＡＧＥにより分離して、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム／２０％ＭｅｔＯＨをブロッ
ト緩衝液として用いて、半乾燥ブロットによりＨｙｂｏｎｄ－Ｐ ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に移した。該膜をＰｏｎｃｅａｕ Ｓ（Ｓｉｇｍａ）で染色して
、乾燥後、約３２ｋＤａの分解産物を正確に切り出した。分解産物のＮ末端のエドマン配
列決定を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｆａｃｔｏｒｙ（ベルリン、ドイツ）により実施して、配
列Ｗ／Ｃ ＰＩＣＰＡＣＥを得た。最初の位置配列決定は、強いトリプトファンピークお
よびシステイン位置に弱いピークのみを生ずる汚染に多分基づいて複雑であった。しかし
ながら、ＢＬＡＳＴ相同性の検索で、配列を疑う余地のないスコアのブタＩｇＧヒンジ領
域配列が、システイン残基を対応する位置に含有した。システインは、プロピオンアミド
改変されたシステインのシグナルにより同定されたが、それにも拘わらずシステインは較
正標準の部分ではない。
【0119】
ＥＬＩＳＡ
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥに対するＩｇＧ力価を検出するために、Ｍａｘｉｓｏ
ｒｂ（登録商標）プレート（Ｎｕｎｃ）を、炭酸塩緩衝液を使用して０．６μｇのｒＩｇ
ｄＥタンパク質でコートした。コーティング後、プレートを０．１％ツイーン２０（ＰＢ
ＳＴ）を加えたＰＢＳで３回洗浄して、ＰＢＳ中５％の粉乳で３７℃で２時間ブロッキン
グした。全ての試料および対照を、１：１００の希釈で出発して、ＰＢＳＴ中における４
回の２倍希釈の（陽性参照血清：６個）２連シリーズで測定した。Ｓ．スイス（S. suis
）ＩｇｄＥに特異的なＩｇＧ抗体を検出するために、プレートを、ヤギ抗ブタＩｇＧ－Ｈ
ＲＰ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ１００－１０５Ｐ）と、１：１００００の希釈で
３７℃で１時間インキュベートした。全てのインキュベーションステップは、３７℃で振
盪機上で実施して、各インキュベーションステップ後、プレートをＰＢＳＴで洗浄した。
プレートを、２，２－アジノ－ジ－［３－エチルベンジチアゾリンスルホネート］（ＡＢ
ＴＳ）および０．００３％Ｈ２Ｏ２を基質として用いて現像した。吸光度は、４０５ｎｍ
でマイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ ＧｍｂＨ）で測定した。光学密度を、バックグラウンドを差し引いた後対数の直
線的回帰分析により抗体濃度に変換した。各試料についてのＥＬＩＳＡユニットは、２つ
のシリーズの４回希釈の各々について計算されたユニットの平均として定義された。Ｓ．
スイス（S. suis）の株１０を用いた実験的感染後２０日に採取された血清試料から得ら
れたＥＬＩＳＡ値を、任意に１００ＥＬＩＳＡユニットに設定して、一方、初乳を奪われ
たコブタから誘導された血清試料からのＥＬＩＳＡ値を陰性対照として使用した。
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥに対するＩｇＧ力価を検出するために、Ｍａｘｉｓｏ
ｒｂ（登録商標）プレート（Ｎｕｎｃ）を、炭酸塩緩衝液を使用して０．６μｇのｒＩｇ
ｄＥタンパク質でコートした。コーティング後、プレートを０．１％ツイーン２０（ＰＢ
ＳＴ）を加えたＰＢＳで３回洗浄して、ＰＢＳ中５％の粉乳で３７℃で２時間ブロッキン
グした。全ての試料および対照を、１：１００の希釈で出発して、ＰＢＳＴ中における４
回の２倍希釈の（陽性参照血清：６個）２連シリーズで測定した。Ｓ．スイス（S. suis
）ＩｇｄＥに特異的なＩｇＧ抗体を検出するために、プレートを、ヤギ抗ブタＩｇＧ－Ｈ
ＲＰ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ１００－１０５Ｐ）と、１：１００００の希釈で
３７℃で１時間インキュベートした。全てのインキュベーションステップは、３７℃で振
盪機上で実施して、各インキュベーションステップ後、プレートをＰＢＳＴで洗浄した。
プレートを、２，２－アジノ－ジ－［３－エチルベンジチアゾリンスルホネート］（ＡＢ
ＴＳ）および０．００３％Ｈ２Ｏ２を基質として用いて現像した。吸光度は、４０５ｎｍ
でマイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ ＧｍｂＨ）で測定した。光学密度を、バックグラウンドを差し引いた後対数の直
線的回帰分析により抗体濃度に変換した。各試料についてのＥＬＩＳＡユニットは、２つ
のシリーズの４回希釈の各々について計算されたユニットの平均として定義された。Ｓ．
スイス（S. suis）の株１０を用いた実験的感染後２０日に採取された血清試料から得ら
れたＥＬＩＳＡ値を、任意に１００ＥＬＩＳＡユニットに設定して、一方、初乳を奪われ
たコブタから誘導された血清試料からのＥＬＩＳＡ値を陰性対照として使用した。
【0120】
結果
Ｓ．スイス（S. suis）はＩｇＧ切断酵素を分泌する。
Ｓ．スイス（S. suis）の細胞外酵素のタンパク質分解活性を、Ｓ．スイス（S. suis）
の株１０の濃縮された上清および同系遺伝子型のＩｇＭプロテアーゼ突然変異体１０Δｉ
ｄｅＳｓｕｉｓと、推定上の基質としての２％ブタ血漿とをインキュベートすることによ
り分析した。３時間のインキュベーションの後、反応混合物を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによ
り分析した。興味深いことに、野生株１０および同系遺伝子型のＩｇＭプロテアーゼ突然
変異体１０ΔＩｄｅＳｓｕｉｓの両方の細菌培養上清から得られた血漿タンパク質のバン
ドのパターンは、ブタ血漿対照にはなかった約３２ｋＤａの追加のタンパク質バンドを含
有した（図１Ａ）。３２ｋＤａバンドを切り出して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法にか
け、Ｓ．スイス（S. suis）におけるＩｇＧタンパク質分解活性の存在を示すＩｇＧ分解
産物と同定した。この発見を確認して、タンパク質分解活性はＳ．スイス（S. suis）の
分泌された酵素に基づくことを立証するために、細菌培養物の成長上清を、硫酸アンモニ
ウムの量を増大させて（０から８０％の飽和まで）添加することにより分画した。分画は
、ブタ血漿を用いてＩｇＧ切断活性について試験して、ＩｇＧの分解フラグメントを、特
異的ポリクローナル抗ブタＩｇＧ抗体を使用してウェスタンブロットにより検出した。２
０から６０％硫酸アンモニウムで飽和した沈殿は、ＩｇＧ切断活性を明確に示して、観察
されたＩｇＧタンパク質分解活性は、最近記載されたＩｇＭプロテアーゼＩｄｅＳｓｕｉ
ｓ（Seele、前出）と別物であり、Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清中の分泌されたタン
パク質に基づくことを示した（図１Ｂ）。
Ｓ．スイス（S. suis）はＩｇＧ切断酵素を分泌する。
Ｓ．スイス（S. suis）の細胞外酵素のタンパク質分解活性を、Ｓ．スイス（S. suis）
の株１０の濃縮された上清および同系遺伝子型のＩｇＭプロテアーゼ突然変異体１０Δｉ
ｄｅＳｓｕｉｓと、推定上の基質としての２％ブタ血漿とをインキュベートすることによ
り分析した。３時間のインキュベーションの後、反応混合物を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによ
り分析した。興味深いことに、野生株１０および同系遺伝子型のＩｇＭプロテアーゼ突然
変異体１０ΔＩｄｅＳｓｕｉｓの両方の細菌培養上清から得られた血漿タンパク質のバン
ドのパターンは、ブタ血漿対照にはなかった約３２ｋＤａの追加のタンパク質バンドを含
有した（図１Ａ）。３２ｋＤａバンドを切り出して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法にか
け、Ｓ．スイス（S. suis）におけるＩｇＧタンパク質分解活性の存在を示すＩｇＧ分解
産物と同定した。この発見を確認して、タンパク質分解活性はＳ．スイス（S. suis）の
分泌された酵素に基づくことを立証するために、細菌培養物の成長上清を、硫酸アンモニ
ウムの量を増大させて（０から８０％の飽和まで）添加することにより分画した。分画は
、ブタ血漿を用いてＩｇＧ切断活性について試験して、ＩｇＧの分解フラグメントを、特
異的ポリクローナル抗ブタＩｇＧ抗体を使用してウェスタンブロットにより検出した。２
０から６０％硫酸アンモニウムで飽和した沈殿は、ＩｇＧ切断活性を明確に示して、観察
されたＩｇＧタンパク質分解活性は、最近記載されたＩｇＭプロテアーゼＩｄｅＳｓｕｉ
ｓ（Seele、前出）と別物であり、Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清中の分泌されたタン
パク質に基づくことを示した（図１Ｂ）。
【0121】
臨床的に意味のある血清型２の数種の株を含む１５種の異なるＳ．スイス（S. suis）
の株の培養上清；血清型２の２つのヒト単離物、および追加の血清型を代表する一組の株
（表２）を、上記のようにウェスタンブロットにより分析した。全ての株について、約３
２ｋＤａのＩｇＧ切断産物をウェスタンブロット分析により検出することができて（図１
Ｃ）、ＩｇＧ分解活性は、異なるＳ．スイス（S. suis）の株の間でも保存されることが
示された。
の株の培養上清；血清型２の２つのヒト単離物、および追加の血清型を代表する一組の株
（表２）を、上記のようにウェスタンブロットにより分析した。全ての株について、約３
２ｋＤａのＩｇＧ切断産物をウェスタンブロット分析により検出することができて（図１
Ｃ）、ＩｇＧ分解活性は、異なるＳ．スイス（S. suis）の株の間でも保存されることが
示された。
【0122】
Ｓ．スイス（S. suis）の新規プロテアーゼであるＩｇｄＥの精製および配列の特徴
精製の試行に先立って、硫酸アンモニウムによるプロテアーゼが富化された沈殿を、ク
ラス特異的プロテアーゼ阻害剤の存在下でＩｇＧ切断活性について試験して、推定上のＩ
ｇＧプロテアーゼを予備的に分類した。メタロプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡはＩｇＧ切断
に影響しなかったが、それに対してセリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦはＩｇＧ切断に
中程度に干渉した。しかしながら、システインプロテアーゼ阻害剤Ｅ－６４、Ｚ－ＬＶＧ
－ＣＨＮ２およびヨードアセトアミドは、全てＩｇＧ分解活性を阻害するように思われた
（図８）。したがって、活性部位のシステイン残基は、ＡＥＢＳＦ（２４、２５）により
阻害され得るので、阻害剤全体のプロファイルは、ＩｇＧ切断プロテアーゼはシステイン
プロテアーゼのクラスに属するという仮定と最も一致する。精製するために、株１０の同
系遺伝子型の突然変異体である株Ｓ．スイス（S. suis）１０Ｍ７を、培養上清中の高度
に豊富なムラミニダーゼ放出タンパク質（ＭＲＰ）による低発現タンパク質の遮蔽を回避
するために、使用した。細菌培養上清を、硫酸アンモニウム沈殿により分画して、沈殿を
アニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にかけ
た。ＩｇＧ切断活性を示す試料を、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質の
バンドをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法およびｐＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するＮＣ
ＢＩデータベースに対する類似性検索により同定した。ＩｇＧタンパク質分解酵素の最初
の特徴付けが、該プロテアーゼが最も分泌されるシステインプロテアーゼらしいことを示
したので、同定されたタンパク質の配列を、ｉ）該タンパク質のコア内におけるシステイ
ン残基の存在、およびｉｉ）分泌シグナルペプチドの存在についてスクリーニングした。
ＩｇＭに特異的であることが以前に示されたＩｄｅＳｓｕｉｓの他に、２つの（１０のう
ちの）同定されたタンパク質が推定上の触媒的システイン残基を含有したが、唯１つだけ
がＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより予測されたシグナルペプチド配列およびコアシステ
イン残基の両方を含有した。このタンパク質は、Ｓ．スイス（S. suis）の血清型２株の
ゲノムの配列データベースにおける推定上のエクスポートされたタンパク質と注釈を付け
られ（www.sanger.ac.uk）、株Ｐ１／７中のＳＳＵ＿ＲＳ０８１５０と命名される。ＳＳ
Ｕ＿ＲＳ０８１５０は、該タンパク質内のアミノ酸１８８から２６５内のＮ末端半分に位
置する推定上のトランスグルタミナーゼのコア配列モチーフを有する１１２１アミノ酸の
タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０１２０２７７２０）をコードす
る。膜タンパク質形態のＴＯＰＣＯＮＳｃｏｎｓｅｎｓｕｓ予測は、アミノ酸１０５９～
１０８０の間付近のＣ末端で推定上の膜貫通ヘリックスを同定した。予測されたサイズの
１１８ｋＤａ（シグナル配列なし）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの後の最初に精製されたタンパ
ク質のバンドの推定されたサイズより若干小さく（データ掲載せず）、それはＳＤＳ－Ｐ
ＡＧＥ上における低ｐＩ（ｐＩ ４．６６）のタンパク質の僅かに遅い移動に基づく。全
長の推定上のタンパク質配列を、ＮＣＢＩデータベースに対するｐＢＬＡＳＴアルゴリズ
ムを使用する類似性検索で使用した。この検索により、全長タンパク質は、ＭＥＲＯＰＳ
ペプチダーゼデータベース（Rawlings et al. 2014. Nucleic Acids Res. 42, 503-509）
のいかなる知られたプロテアーゼに対しても類似性がなく；いかなる真核生物のタンパク
質に対しても類似性がないが、トランスグルタミナーゼコアモチーフを含有する該プロテ
アーゼのＮ端部の半分は、ストレプトコッカス・ポルシナス（Streptococcus porcinus）
およびストレプトコッカス・シュードポルシナス（Streptococcus pseudoporcinus）の仮
定上のタンパク質に対する若干の類似性（４８０～４９２アミノ酸残基の領域において５
４％の同一性）およびストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）の仮定上のタ
ンパク質に対する若干の類似性（２６４から４０６アミノ酸残基の領域における４０％ま
での同一性）があることが明らかになった。プロテアーゼのＮ末端部分は、ストレプトコ
ッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）およびストレプトコッカス・メリ
オニス（Streptococcus merionis）（約３２％同一性）の仮定上のタンパク質に対しても
若干の類似性を示す。該推定上のタンパク質は、幾つかのデータベースでリボヌクレアー
ゼまたはリボヌクレアーゼＧおよびＥとして表示されているが、実験的に確認された機能
の不在に基づいて、およびブタＩｇＧに対する酵素活性に基づいて、該タンパク質は、ス
トレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）の免疫グロブリンＧを分解する酵素に
対するＩｇｄＥと表示した。
精製の試行に先立って、硫酸アンモニウムによるプロテアーゼが富化された沈殿を、ク
ラス特異的プロテアーゼ阻害剤の存在下でＩｇＧ切断活性について試験して、推定上のＩ
ｇＧプロテアーゼを予備的に分類した。メタロプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡはＩｇＧ切断
に影響しなかったが、それに対してセリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦはＩｇＧ切断に
中程度に干渉した。しかしながら、システインプロテアーゼ阻害剤Ｅ－６４、Ｚ－ＬＶＧ
－ＣＨＮ２およびヨードアセトアミドは、全てＩｇＧ分解活性を阻害するように思われた
（図８）。したがって、活性部位のシステイン残基は、ＡＥＢＳＦ（２４、２５）により
阻害され得るので、阻害剤全体のプロファイルは、ＩｇＧ切断プロテアーゼはシステイン
プロテアーゼのクラスに属するという仮定と最も一致する。精製するために、株１０の同
系遺伝子型の突然変異体である株Ｓ．スイス（S. suis）１０Ｍ７を、培養上清中の高度
に豊富なムラミニダーゼ放出タンパク質（ＭＲＰ）による低発現タンパク質の遮蔽を回避
するために、使用した。細菌培養上清を、硫酸アンモニウム沈殿により分画して、沈殿を
アニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にかけ
た。ＩｇＧ切断活性を示す試料を、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質の
バンドをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法およびｐＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するＮＣ
ＢＩデータベースに対する類似性検索により同定した。ＩｇＧタンパク質分解酵素の最初
の特徴付けが、該プロテアーゼが最も分泌されるシステインプロテアーゼらしいことを示
したので、同定されたタンパク質の配列を、ｉ）該タンパク質のコア内におけるシステイ
ン残基の存在、およびｉｉ）分泌シグナルペプチドの存在についてスクリーニングした。
ＩｇＭに特異的であることが以前に示されたＩｄｅＳｓｕｉｓの他に、２つの（１０のう
ちの）同定されたタンパク質が推定上の触媒的システイン残基を含有したが、唯１つだけ
がＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより予測されたシグナルペプチド配列およびコアシステ
イン残基の両方を含有した。このタンパク質は、Ｓ．スイス（S. suis）の血清型２株の
ゲノムの配列データベースにおける推定上のエクスポートされたタンパク質と注釈を付け
られ（www.sanger.ac.uk）、株Ｐ１／７中のＳＳＵ＿ＲＳ０８１５０と命名される。ＳＳ
Ｕ＿ＲＳ０８１５０は、該タンパク質内のアミノ酸１８８から２６５内のＮ末端半分に位
置する推定上のトランスグルタミナーゼのコア配列モチーフを有する１１２１アミノ酸の
タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０１２０２７７２０）をコードす
る。膜タンパク質形態のＴＯＰＣＯＮＳｃｏｎｓｅｎｓｕｓ予測は、アミノ酸１０５９～
１０８０の間付近のＣ末端で推定上の膜貫通ヘリックスを同定した。予測されたサイズの
１１８ｋＤａ（シグナル配列なし）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの後の最初に精製されたタンパ
ク質のバンドの推定されたサイズより若干小さく（データ掲載せず）、それはＳＤＳ－Ｐ
ＡＧＥ上における低ｐＩ（ｐＩ ４．６６）のタンパク質の僅かに遅い移動に基づく。全
長の推定上のタンパク質配列を、ＮＣＢＩデータベースに対するｐＢＬＡＳＴアルゴリズ
ムを使用する類似性検索で使用した。この検索により、全長タンパク質は、ＭＥＲＯＰＳ
ペプチダーゼデータベース（Rawlings et al. 2014. Nucleic Acids Res. 42, 503-509）
のいかなる知られたプロテアーゼに対しても類似性がなく；いかなる真核生物のタンパク
質に対しても類似性がないが、トランスグルタミナーゼコアモチーフを含有する該プロテ
アーゼのＮ端部の半分は、ストレプトコッカス・ポルシナス（Streptococcus porcinus）
およびストレプトコッカス・シュードポルシナス（Streptococcus pseudoporcinus）の仮
定上のタンパク質に対する若干の類似性（４８０～４９２アミノ酸残基の領域において５
４％の同一性）およびストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）の仮定上のタ
ンパク質に対する若干の類似性（２６４から４０６アミノ酸残基の領域における４０％ま
での同一性）があることが明らかになった。プロテアーゼのＮ末端部分は、ストレプトコ
ッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）およびストレプトコッカス・メリ
オニス（Streptococcus merionis）（約３２％同一性）の仮定上のタンパク質に対しても
若干の類似性を示す。該推定上のタンパク質は、幾つかのデータベースでリボヌクレアー
ゼまたはリボヌクレアーゼＧおよびＥとして表示されているが、実験的に確認された機能
の不在に基づいて、およびブタＩｇＧに対する酵素活性に基づいて、該タンパク質は、ス
トレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）の免疫グロブリンＧを分解する酵素に
対するＩｇｄＥと表示した。
【0123】
ＩｇｄＥは新規なシステインプロテアーゼである
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの配列は、阻害剤プロファイルに基づいて、触媒部位
のシステインを表すと仮定される位置３０２における単一のシステイン残基の存在を明ら
かにする。知られたトランスグルタミナーゼドメイン構造をテンプレートとして使用した
、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのインシリコの３Ｄモデル化（http://swissmodel.exp
asy.org）は、システイン３０２、ヒスチジン３３３およびアスパラギン酸３４８からな
る潜在的な触媒的三連構造を含有するタンパク質のＮ末端部分における推定上の活性部位
の裂溝を示した。
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの配列は、阻害剤プロファイルに基づいて、触媒部位
のシステインを表すと仮定される位置３０２における単一のシステイン残基の存在を明ら
かにする。知られたトランスグルタミナーゼドメイン構造をテンプレートとして使用した
、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのインシリコの３Ｄモデル化（http://swissmodel.exp
asy.org）は、システイン３０２、ヒスチジン３３３およびアスパラギン酸３４８からな
る潜在的な触媒的三連構造を含有するタンパク質のＮ末端部分における推定上の活性部位
の裂溝を示した。
【0124】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの推定上のプロテアーゼドメインおよび触媒部位残基
を同定するために、数通りの組換えＩｇｄＥ構築物を創出した（図２Ａ）。３つの推定上
の触媒部位残基の全てを、突然変異体タンパク質、ＩｇｄＥＣ３０２Ｓ、ＩｇｄＥＨ３３
３ＡおよびＩｇｄＥＤ３４８Ａをそれぞれ生じさせる部位特異的突然変異生成により置き
換えた。それに加えて、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのＣ末端部分を欠く構築物を、
ＸｈｏＩ制限酵素のカットバックにより創出した。これらの構築物を発現する大腸菌（E.
coli）の粗可溶分画をブタＩｇＧとインキュベートして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析
した。組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの存在で、３２ｋＤａのＩｇＧ誘導バンド
が現れて、組換えタンパク質はＩｇＧタンパク質分解活性を含有することが示された（図
２Ｂ、レーン３）。アミノ酸４７１から１１２１を欠く組換えタンパク質がＩｇＧ切断活
性のために十分であるので（図２Ｂ、レーン７）、ＩｇＧ切断活性は、タンパク質のＮ末
端部分に帰属させることができた。突然変異体タンパク質とインキュベートしたブタＩｇ
ＧのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は（図２Ｂ、レーン４～６）、ｒＩｇｄＥＣ３０２ＳもｒＩｇ
ｄＥＨ３３３ＡもＩｇＧ切断活性を示さなかったが、それに対してｒＩｇｄＥＤ３４８Ａ
は、若干低下したＩｇＧ切断活性を示したことを明らかにした。全体的にみて、これらの
データは、これらの３種の残基がＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの触媒部位の一部であ
ることを強く示す。
を同定するために、数通りの組換えＩｇｄＥ構築物を創出した（図２Ａ）。３つの推定上
の触媒部位残基の全てを、突然変異体タンパク質、ＩｇｄＥＣ３０２Ｓ、ＩｇｄＥＨ３３
３ＡおよびＩｇｄＥＤ３４８Ａをそれぞれ生じさせる部位特異的突然変異生成により置き
換えた。それに加えて、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのＣ末端部分を欠く構築物を、
ＸｈｏＩ制限酵素のカットバックにより創出した。これらの構築物を発現する大腸菌（E.
coli）の粗可溶分画をブタＩｇＧとインキュベートして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析
した。組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの存在で、３２ｋＤａのＩｇＧ誘導バンド
が現れて、組換えタンパク質はＩｇＧタンパク質分解活性を含有することが示された（図
２Ｂ、レーン３）。アミノ酸４７１から１１２１を欠く組換えタンパク質がＩｇＧ切断活
性のために十分であるので（図２Ｂ、レーン７）、ＩｇＧ切断活性は、タンパク質のＮ末
端部分に帰属させることができた。突然変異体タンパク質とインキュベートしたブタＩｇ
ＧのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は（図２Ｂ、レーン４～６）、ｒＩｇｄＥＣ３０２ＳもｒＩｇ
ｄＥＨ３３３ＡもＩｇＧ切断活性を示さなかったが、それに対してｒＩｇｄＥＤ３４８Ａ
は、若干低下したＩｇＧ切断活性を示したことを明らかにした。全体的にみて、これらの
データは、これらの３種の残基がＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの触媒部位の一部であ
ることを強く示す。
【0125】
阻害剤のスクリーニングを、精製された組換えＩｇｄＥΔＣおよびクラス特異的プロテ
アーゼ阻害剤を用いて繰り返した。古典的トランスグルタミナーゼ酵素と対照的に、該プ
ロテアーゼはＥＤＴＡの存在下で完全に活性であるが、それに対して、ＩｇｄＥはカルシ
ウム依存性ではなく、システインクラスに特異的な阻害剤のヨードアセトアミドおよびＺ
－ＬＶＧ－ＣＨＮ２は、ＩｇＧタンパク質分解活性に効率的に干渉し、阻害剤の１２５倍
モル過剰で１８時間のインキュベーション後でさえ、切断産物は全然検出することができ
なかった（図３）。セリンプロテアーゼ阻害剤のＡＥＢＳＦは、ＩｇｄＥΔＣを、１２５
倍のモル過剰で中程度に阻害した。興味あることに、Ｅ－６４は、この実験の設定では精
製ＩｇｄＥΔＣを阻害しなかったので、それは、ＩｄｅＳおよびＩｄｅＳｓｕｉｓのよう
な他の連鎖球菌のＩｇプロテアーゼについて記載されたのと同様な狭い活性部位に基づく
と思われる。しかしながら、非常に高濃度では、Ｅ－６４は、Ｓ．スイス（S. suis）培
養上清のＩｇＧ切断活性に干渉した（図８）。Ｚ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２のシステインプロテ
アーゼに特異的な阻害剤は、構造的にシスタチンＣの阻害反応性部位に基づいて（Green
and Shaw. 1981. J. Biol. Chem. 256, 1923-1928）１２５倍モル過剰でＩｇｄＥΔＣを
完全に阻害した。ヨードアセトアミドおよびＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２を用いる酵素活性の阻
害ならびにＩｇｄＥＣ３０２ＳおよびＩｇｄＥＨ３３３Ａ突然変異体の酵素活性の欠損は
、ＩｇｄＥがシステインプロテアーゼファミリーの新規かつこれまでのところ独特のメン
バーであることを示唆する。
アーゼ阻害剤を用いて繰り返した。古典的トランスグルタミナーゼ酵素と対照的に、該プ
ロテアーゼはＥＤＴＡの存在下で完全に活性であるが、それに対して、ＩｇｄＥはカルシ
ウム依存性ではなく、システインクラスに特異的な阻害剤のヨードアセトアミドおよびＺ
－ＬＶＧ－ＣＨＮ２は、ＩｇＧタンパク質分解活性に効率的に干渉し、阻害剤の１２５倍
モル過剰で１８時間のインキュベーション後でさえ、切断産物は全然検出することができ
なかった（図３）。セリンプロテアーゼ阻害剤のＡＥＢＳＦは、ＩｇｄＥΔＣを、１２５
倍のモル過剰で中程度に阻害した。興味あることに、Ｅ－６４は、この実験の設定では精
製ＩｇｄＥΔＣを阻害しなかったので、それは、ＩｄｅＳおよびＩｄｅＳｓｕｉｓのよう
な他の連鎖球菌のＩｇプロテアーゼについて記載されたのと同様な狭い活性部位に基づく
と思われる。しかしながら、非常に高濃度では、Ｅ－６４は、Ｓ．スイス（S. suis）培
養上清のＩｇＧ切断活性に干渉した（図８）。Ｚ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２のシステインプロテ
アーゼに特異的な阻害剤は、構造的にシスタチンＣの阻害反応性部位に基づいて（Green
and Shaw. 1981. J. Biol. Chem. 256, 1923-1928）１２５倍モル過剰でＩｇｄＥΔＣを
完全に阻害した。ヨードアセトアミドおよびＺ－ＬＶＧ－ＣＨＮ２を用いる酵素活性の阻
害ならびにＩｇｄＥＣ３０２ＳおよびＩｇｄＥＨ３３３Ａ突然変異体の酵素活性の欠損は
、ＩｇｄＥがシステインプロテアーゼファミリーの新規かつこれまでのところ独特のメン
バーであることを示唆する。
【0126】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧを、高い特異性でヒンジ領域において切
断する
ブタＩｇＧの分解産物を、還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。非還元条件
下で観察されたバンドのパターンは、相互に接続するジスルフィド結合のちょうどＮ末端
で、重鎖のヒンジ領域に位置する切断部位と一致する（図４Ａ）。還元条件下で得られた
ＩｇＧ分解産物（図４Ｂ）をＮ末端のエドマン配列決定にかけて、得られた配列Ｃ＊ＰＩ
ＣＰＡＣＥは、ブタＩｇＧ２ａｂ、ＩｇＧ４ａｂ、およびＩｇＧ６ａｂサブタイプのヒン
ジ領域配列で見出された。共通のモチーフとしてＣＰＩＣＰＧＣＥを有する同様な配列が
、ＩｇＧ１ａｂおよびＩｇＧ５ａｂサブタイプのヒンジ領域に存在するが、それに対して
ＩｇＧ３はヒンジ領域中にＣＰｘｘｘｘＣ配列を示した（表３）。
断する
ブタＩｇＧの分解産物を、還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。非還元条件
下で観察されたバンドのパターンは、相互に接続するジスルフィド結合のちょうどＮ末端
で、重鎖のヒンジ領域に位置する切断部位と一致する（図４Ａ）。還元条件下で得られた
ＩｇＧ分解産物（図４Ｂ）をＮ末端のエドマン配列決定にかけて、得られた配列Ｃ＊ＰＩ
ＣＰＡＣＥは、ブタＩｇＧ２ａｂ、ＩｇＧ４ａｂ、およびＩｇＧ６ａｂサブタイプのヒン
ジ領域配列で見出された。共通のモチーフとしてＣＰＩＣＰＧＣＥを有する同様な配列が
、ＩｇＧ１ａｂおよびＩｇＧ５ａｂサブタイプのヒンジ領域に存在するが、それに対して
ＩｇＧ３はヒンジ領域中にＣＰｘｘｘｘＣ配列を示した（表３）。
【0127】
【表5】
に加えて、第２のステップの加水分解が第２の重鎖を切断する前に、１つのＩｇＧ重鎖が
ホモダイマーのジスルフィド結合のちょうどＮ末端で加水分解される切断反応と一致する
（図４Ｃ）。興味深いことに、ＩｇＧのヒンジ領域と同様な配列は、ブタのＩｇＡおよび
ＩｇＭの重鎖配列では見出すことができない。それゆえ、Ｓ．スイス（S. suis）Ｉｇｄ
Ｅ特異性を、ブタＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡに対する特異的抗体を使用して、さらに研
究した。組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥとインキュベートしたブタ血漿を、ウェ
スタンブロットにより分析して、ブタ血漿中のプロテアーゼはＩｇＧを標的とするが、Ｉ
ｇＡまたはＩｇＭを切断しないことが示された（図５Ａ）。
【0128】
プロテアーゼの宿主特異性を、精製Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥとヒト、ヤギ、ウ
シ、ウマおよびマウスのＩｇＧ製剤とのインキュベーションにより研究した（図５Ｂ）。
興味深いことに、ブタＩｇＧのみがこの新規ＩｇＧプロテアーゼに対する基質であること
が見出された。したがって、ＩｇｄＥは、際立った種特異性を示して、ブタＩｇＧのみを
標的とする。
シ、ウマおよびマウスのＩｇＧ製剤とのインキュベーションにより研究した（図５Ｂ）。
興味深いことに、ブタＩｇＧのみがこの新規ＩｇＧプロテアーゼに対する基質であること
が見出された。したがって、ＩｇｄＥは、際立った種特異性を示して、ブタＩｇＧのみを
標的とする。
【0129】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの特異性をエックスビボでさらに評価するために、健
常なまたは病気のコブタの体液を使用した。心膜液、腹腔、および関節からの体液、なら
びに脳脊髄液および血清を、組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥで処理して、ブタＩ
ｇＧ特異的抗体を使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図６Ａ）およびウェスタンブロットによ
り分析した（図６Ｂ）。タンパク質バンドのパターンにおけるはっきりした変化は、症状
を示すＩｇＧ切断産物の出現を除いて、心膜、腹腔および血清の試料中におけるｒＩｇｄ
Ｅの存在において観察することができなかった。ＩｇＧ、すなわち切断産物も、健常ブタ
の関節液および脳脊髄液中に存在しなかった。対照的に、臨床的徴候を有する、例えば髄
膜炎および滑膜炎を患うコブタから得られた全ての体液は、炎症性応答の結果としてＩｇ
Ｇを含有し、再び症状を示す単一の３２ｋＤａバンドを、ｒＩｇｄＥで処理された全ての
試料で観察することができた（図６）。Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの特異性は、ブ
タ体液とプロテアーゼとのインキュベーション後のＳＤＳ－ＰＡＧＥで、追加の分解産物
は同定することができなかった観察により強調される。したがって、追加の基質が存在す
ることは排除できないが、これらの結果は、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥが高度に特
異的なＩｇＧプロテアーゼであり、Ｓ．スイス（S. suis）の以前に記載されたＩｇＡお
よびＩｇＭを分解するプロテアーゼを補完することを示す（Seele前出; Zhang et al. 20
10. Vet. Microbiol. 140, 171-175）。
常なまたは病気のコブタの体液を使用した。心膜液、腹腔、および関節からの体液、なら
びに脳脊髄液および血清を、組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥで処理して、ブタＩ
ｇＧ特異的抗体を使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図６Ａ）およびウェスタンブロットによ
り分析した（図６Ｂ）。タンパク質バンドのパターンにおけるはっきりした変化は、症状
を示すＩｇＧ切断産物の出現を除いて、心膜、腹腔および血清の試料中におけるｒＩｇｄ
Ｅの存在において観察することができなかった。ＩｇＧ、すなわち切断産物も、健常ブタ
の関節液および脳脊髄液中に存在しなかった。対照的に、臨床的徴候を有する、例えば髄
膜炎および滑膜炎を患うコブタから得られた全ての体液は、炎症性応答の結果としてＩｇ
Ｇを含有し、再び症状を示す単一の３２ｋＤａバンドを、ｒＩｇｄＥで処理された全ての
試料で観察することができた（図６）。Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの特異性は、ブ
タ体液とプロテアーゼとのインキュベーション後のＳＤＳ－ＰＡＧＥで、追加の分解産物
は同定することができなかった観察により強調される。したがって、追加の基質が存在す
ることは排除できないが、これらの結果は、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥが高度に特
異的なＩｇＧプロテアーゼであり、Ｓ．スイス（S. suis）の以前に記載されたＩｇＡお
よびＩｇＭを分解するプロテアーゼを補完することを示す（Seele前出; Zhang et al. 20
10. Vet. Microbiol. 140, 171-175）。
【0130】
ＩｇｄＥは、Ｓ．スイス（S. suis）により発現される唯一のＩｇＧ切断酵素である
株１０および株１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓは、後者はＩｇＭ切断活性を欠くが、Ｓ．スイ
ス（S. suis）ｉｇｄＥのインフレーム欠失突然変異体を生じさせるために使用された。
野生株１０からの成長上清におけるＩｇＧおよびＩｇＭ切断活性を、特異的ポリクローナ
ル抗ブタＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を使用して、ウェスタンブロットにより決定した（図７
）。予想されたように、野生株１０は、ＩｇＧおよびＩｇＭ切断活性を示したが（図７Ａ
および図７Ｂ、レーン３）、それに対して、同系遺伝子型の突然変異体株１０ΔｉｇｄＥ
の上清のみが、ＩｇＭ切断活性を含有して、ＩｇＧまたはＩｇＭのいずれの分解も二重突
然変異体株１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓΔｉｇｄＥの上清で検出可能でなかった（図７Ａおよ
び図７Ｂ、レーン５）。したがって、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧを
切断するために必要かつ十分であり、他のＩｇＧ切断活性はこれらの実験条件下では放出
されないと思われる。
株１０および株１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓは、後者はＩｇＭ切断活性を欠くが、Ｓ．スイ
ス（S. suis）ｉｇｄＥのインフレーム欠失突然変異体を生じさせるために使用された。
野生株１０からの成長上清におけるＩｇＧおよびＩｇＭ切断活性を、特異的ポリクローナ
ル抗ブタＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を使用して、ウェスタンブロットにより決定した（図７
）。予想されたように、野生株１０は、ＩｇＧおよびＩｇＭ切断活性を示したが（図７Ａ
および図７Ｂ、レーン３）、それに対して、同系遺伝子型の突然変異体株１０ΔｉｇｄＥ
の上清のみが、ＩｇＭ切断活性を含有して、ＩｇＧまたはＩｇＭのいずれの分解も二重突
然変異体株１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓΔｉｇｄＥの上清で検出可能でなかった（図７Ａおよ
び図７Ｂ、レーン５）。したがって、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧを
切断するために必要かつ十分であり、他のＩｇＧ切断活性はこれらの実験条件下では放出
されないと思われる。
【0131】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのインビボにおける発現
離乳期のコブタは、初期には、初乳に由来する母の抗体により細菌感染から保護される
。母の抗体のレベルは経時的に減少して、活性ＩｇＧに媒介される免疫が２週間後の初め
に出現する。したがって、初乳由来のコブタの血清中のＩｇＧ抗体（ＳＣＤＰ）のレベル
は、ＥＬＩＳＡ測定におけるバックグラウンド値を超えない。ＥＬＩＳＡを、ｒＩｇｄＥ
を抗原として用いて実施し、コブタからの異なる血清試料を、このＩｇＧプロテアーゼに
向けられた抗体の存在について研究した。Ｓ．スイス（S. suis）の株１０を用いる実験
感染後２０日に採取された血清試料は、ｒＩｇｄＥに対して非常に高い力価を含有した（
１００ ＥＬＩＳＡユニットと定義した；材料および方法を参照されたい）。陰性対照と
して使用されたＳＣＤＰと対照的に、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥに対する特異的抗
体の有意の量が、９匹の５～６週齢の従来の離乳期コブタのうち７匹で検出可能であった
（３６から９２の範囲のＥＬＩＳＡユニット）。これらの結果は、Ｓ．スイス（S. suis
）ＩｇｄＥが、Ｓ．スイス（S. suis）によりインビボで発現された免疫原性抗原である
ことを示した。
離乳期のコブタは、初期には、初乳に由来する母の抗体により細菌感染から保護される
。母の抗体のレベルは経時的に減少して、活性ＩｇＧに媒介される免疫が２週間後の初め
に出現する。したがって、初乳由来のコブタの血清中のＩｇＧ抗体（ＳＣＤＰ）のレベル
は、ＥＬＩＳＡ測定におけるバックグラウンド値を超えない。ＥＬＩＳＡを、ｒＩｇｄＥ
を抗原として用いて実施し、コブタからの異なる血清試料を、このＩｇＧプロテアーゼに
向けられた抗体の存在について研究した。Ｓ．スイス（S. suis）の株１０を用いる実験
感染後２０日に採取された血清試料は、ｒＩｇｄＥに対して非常に高い力価を含有した（
１００ ＥＬＩＳＡユニットと定義した；材料および方法を参照されたい）。陰性対照と
して使用されたＳＣＤＰと対照的に、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥに対する特異的抗
体の有意の量が、９匹の５～６週齢の従来の離乳期コブタのうち７匹で検出可能であった
（３６から９２の範囲のＥＬＩＳＡユニット）。これらの結果は、Ｓ．スイス（S. suis
）ＩｇｄＥが、Ｓ．スイス（S. suis）によりインビボで発現された免疫原性抗原である
ことを示した。
【0132】
[実施例２]
他の連鎖球菌種からのＩｇｄＥの同定
全ての入手可能な連鎖球菌のゲノムのコード配列を、ＮＣＢＩ［ftp://ftp.ncbi.nlm.n
ih.gov/genomes/Bacteria/on Aug-21-2015]およびＰＡＴＲＩＣ[ftp://ftp.patricbrc.or
g/patric2/on Aug-25-2015］からダウンロードした。
他の連鎖球菌種からのＩｇｄＥの同定
全ての入手可能な連鎖球菌のゲノムのコード配列を、ＮＣＢＩ［ftp://ftp.ncbi.nlm.n
ih.gov/genomes/Bacteria/on Aug-21-2015]およびＰＡＴＲＩＣ[ftp://ftp.patricbrc.or
g/patric2/on Aug-25-2015］からダウンロードした。
【0133】
ＩｇｄＥのための参照配列として、本発明者らは、ＲｅｆＳｅｑ配列ＷＰ＿０１４６３
６４９９．１を使用した。Ｓ．スイス（S. suis）からの該配列のみに存在するＮ末端シ
グナルペプチドおよびＣ末端領域を除去して、この後「ＩｇｄＥ＿ドメイン」と称するア
ミノ酸３８～５２０を残した。
６４９９．１を使用した。Ｓ．スイス（S. suis）からの該配列のみに存在するＮ末端シ
グナルペプチドおよびＣ末端領域を除去して、この後「ＩｇｄＥ＿ドメイン」と称するア
ミノ酸３８～５２０を残した。
【0134】
ＩｇｄＥ＿ドメインを、ＮＣＢＩ配列ならびにＰＡＴＲＩＣ配列に対するｂｌａｓｔｐ
検索におけるクエリー配列として使用した（全ての可能なプロテアーゼを保つためのＥ値
カットオフ１）。得られたヒットを、今度は同じパラメーターを使用して同じデータベー
スに対するクエリー配列として使用した。合致した配列のリストから、本発明者らは、Ｉ
ｇｄＥがクエリーとして使用された場合に、第２回が第１回で合致した領域と重なる合致
があった配列を選んだ。触媒部位で「Ｃ」を含有しない配列は、さらなる検討から除外し
て、同一の配列の場合に唯一のコピーのみを保った。
検索におけるクエリー配列として使用した（全ての可能なプロテアーゼを保つためのＥ値
カットオフ１）。得られたヒットを、今度は同じパラメーターを使用して同じデータベー
スに対するクエリー配列として使用した。合致した配列のリストから、本発明者らは、Ｉ
ｇｄＥがクエリーとして使用された場合に、第２回が第１回で合致した領域と重なる合致
があった配列を選んだ。触媒部位で「Ｃ」を含有しない配列は、さらなる検討から除外し
て、同一の配列の場合に唯一のコピーのみを保った。
【0135】
見出された配列の多くは、Ｓ層タンパク質と、またはＳ層相同性ドメインＷを含有する
と注釈される。これらは、同じゲノム中にしばしば２つ以上のコピーで存在して、触媒部
位に元のＩｇｄＥ配列で見出されるＡｘＣモチーフに代わってＳｘＣまたはＧｘＣモチー
フを有する。Ｐｆａｍに対して全ての配列を検索する場合に、これらの配列は、Ｐｆａｍ
モデル「Ｔｒａｎｓｇｌｕｔ＿ｃｏｒｅ」にうまく適合する。ＩｇｄＥファミリーのメン
バーではないこれらの配列を除外するために、Ｅ値が最大で１ｅ－６のＴｒａｎｓｇｌｕ
ｔ＿ｃｏｒｅモデルに合致する全て配列を除外して、同様にＡｘＣモチーフを欠く配列も
除外した。残る配列は、両方の端部で切られてＩｇｄＥ＿ドメイン配列と合致する部分の
みを含有した。このことが同一の「ドメイン」配列を生じた場合に、唯１つのコピーのみ
が保たれた。
と注釈される。これらは、同じゲノム中にしばしば２つ以上のコピーで存在して、触媒部
位に元のＩｇｄＥ配列で見出されるＡｘＣモチーフに代わってＳｘＣまたはＧｘＣモチー
フを有する。Ｐｆａｍに対して全ての配列を検索する場合に、これらの配列は、Ｐｆａｍ
モデル「Ｔｒａｎｓｇｌｕｔ＿ｃｏｒｅ」にうまく適合する。ＩｇｄＥファミリーのメン
バーではないこれらの配列を除外するために、Ｅ値が最大で１ｅ－６のＴｒａｎｓｇｌｕ
ｔ＿ｃｏｒｅモデルに合致する全て配列を除外して、同様にＡｘＣモチーフを欠く配列も
除外した。残る配列は、両方の端部で切られてＩｇｄＥ＿ドメイン配列と合致する部分の
みを含有した。このことが同一の「ドメイン」配列を生じた場合に、唯１つのコピーのみ
が保たれた。
【0136】
ＩｇｄＥファミリーに属するプロテアーゼを、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）、Ｓ．
アガラクチアエ（S. agalactiae）、Ｓ．エクイ（S. equi）、およびＳ．シュードポルシ
ナス（S. pseudoporcinus）で同定した。該プロテアーゼをクローニングして発現させて
、特徴付けた。
アガラクチアエ（S. agalactiae）、Ｓ．エクイ（S. equi）、およびＳ．シュードポルシ
ナス（S. pseudoporcinus）で同定した。該プロテアーゼをクローニングして発現させて
、特徴付けた。
【0137】
[実施例３]
Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）から単離されたＩｇｄＥの性質
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓは、精製されたポリクローナルブタＩｇＧを切断して
、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出される３２ｋＤａの分解産物を生じた。
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓをウシ、ウマ、ヒト、ヤギまたはマウスからの精製ポ
リクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓはブタ血清中のＩｇＧを切断したが、抗ＩｇＧ、Ｉｇ
ＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析によりＩｇＭまたはＩｇＡは検出されなかった。
・ブタＩｇＧの３２ｋＤａ分解産物のＮ末端配列は、ＣＰＩＣＰＡＣＥであることがＮ末
端のエドマン配列決定により示されて、このタンパク質が、ブタＩｇＧ内のＳ．スイス（
S. suis）からのＩｇｄＥと同じ切断部位を有することが示された。
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓは、容易に過剰発現されて高純度に精製された。
・全ての試験したＳ．ポルシナス（S. porcinus）の株は、それらの成長培養上清で、組
換えタンパク質と同じブタＩｇＧ切断表現型を示した。
Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）から単離されたＩｇｄＥの性質
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓは、精製されたポリクローナルブタＩｇＧを切断して
、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出される３２ｋＤａの分解産物を生じた。
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓをウシ、ウマ、ヒト、ヤギまたはマウスからの精製ポ
リクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓはブタ血清中のＩｇＧを切断したが、抗ＩｇＧ、Ｉｇ
ＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析によりＩｇＭまたはＩｇＡは検出されなかった。
・ブタＩｇＧの３２ｋＤａ分解産物のＮ末端配列は、ＣＰＩＣＰＡＣＥであることがＮ末
端のエドマン配列決定により示されて、このタンパク質が、ブタＩｇＧ内のＳ．スイス（
S. suis）からのＩｇｄＥと同じ切断部位を有することが示された。
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓは、容易に過剰発現されて高純度に精製された。
・全ての試験したＳ．ポルシナス（S. porcinus）の株は、それらの成長培養上清で、組
換えタンパク質と同じブタＩｇＧ切断表現型を示した。
【0138】
[実施例４]
Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）から単離されたＩｇｄＥの性質
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、精製ポリクローナルヒトＩｇＧを切断して、
還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出される３２ｋＤａの分解産物を生じさせた（図１０）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、精製モノクローナルヒトＩｇＧ１カッパおよ
びＩｇＧ１ラムダを切断して、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出される３２ｋＤａの分解
産物を生じさせた（図１０Ｄ）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅをモノクローナルヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３または
ＩｇＧ４とインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった（図１０Ｄ）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅをウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびマウスからの精
製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった（図
１０Ａ）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒト血清中のＩｇＧを切断したが、ＩｇＭま
たはＩｇＡは、抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析により検出されな
かった。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒト血清ＩｇＧ１を完全に分解して単一の切
断されたＩｇＧ１にする（図１１）。
・ヒトＩｇＧの３２ｋＤａの分解産物のＮ末端配列は、Ｈ（またはＧまたはＳ）ＴＣＰＰ
ＣＰＡＰＥであることがＮ末端のエドマン配列決定により示されて、このタンパク質はＩ
ｇＧ１でヒンジ領域にパパインと同じ切断部位を有することを示し、システイン残基のＮ
末端が重鎖間のＨ－Ｈ共有結合に関与すると考えられる。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは容易に過剰発現されて精製される。
Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）から単離されたＩｇｄＥの性質
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、精製ポリクローナルヒトＩｇＧを切断して、
還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出される３２ｋＤａの分解産物を生じさせた（図１０）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、精製モノクローナルヒトＩｇＧ１カッパおよ
びＩｇＧ１ラムダを切断して、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出される３２ｋＤａの分解
産物を生じさせた（図１０Ｄ）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅをモノクローナルヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３または
ＩｇＧ４とインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった（図１０Ｄ）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅをウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびマウスからの精
製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった（図
１０Ａ）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒト血清中のＩｇＧを切断したが、ＩｇＭま
たはＩｇＡは、抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析により検出されな
かった。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒト血清ＩｇＧ１を完全に分解して単一の切
断されたＩｇＧ１にする（図１１）。
・ヒトＩｇＧの３２ｋＤａの分解産物のＮ末端配列は、Ｈ（またはＧまたはＳ）ＴＣＰＰ
ＣＰＡＰＥであることがＮ末端のエドマン配列決定により示されて、このタンパク質はＩ
ｇＧ１でヒンジ領域にパパインと同じ切断部位を有することを示し、システイン残基のＮ
末端が重鎖間のＨ－Ｈ共有結合に関与すると考えられる。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは容易に過剰発現されて精製される。
【0139】
[実施例５]
Ｓ．エクイ（S. equi）から単離されたＩｇｄＥの性質
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉを発現する大腸菌（E. coli）の溶解物は、精製ポリクローナ
ルウマＩｇＧを切断して、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出された、３２ｋＤａの分解産
物を生じさせる。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉをウシ、ヒト、ブタ、ヤギ、ラット、ウサギおよびマウスから
の精製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった
。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉはウマ血清中のＩｇＧを切断したが、ＩｇＭまたはＩｇＡは、
抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析により検出されなかった。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉは、精製モノクローナル組換えウマＩｇＧ７を切断して、３２
ｋＤａの分解産物を生じさせ、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出された（図１２）。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉを、組換えモノクローナルウマＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３
、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５またはＩｇＧ６とインキュベートしたときに、分解産物は観察され
なかった。
・ウマＩｇＧの３２ｋＤａの分解産物のＮ末端のエドマン配列決定により示されたＮ末端
配列は、（Ｇ）ＰＴＣＰＥＣＸＧＶである。この配列はウマＩｇＧ７のヒンジ領域に見出
される。
Ｓ．エクイ（S. equi）から単離されたＩｇｄＥの性質
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉを発現する大腸菌（E. coli）の溶解物は、精製ポリクローナ
ルウマＩｇＧを切断して、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出された、３２ｋＤａの分解産
物を生じさせる。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉをウシ、ヒト、ブタ、ヤギ、ラット、ウサギおよびマウスから
の精製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった
。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉはウマ血清中のＩｇＧを切断したが、ＩｇＭまたはＩｇＡは、
抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析により検出されなかった。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉは、精製モノクローナル組換えウマＩｇＧ７を切断して、３２
ｋＤａの分解産物を生じさせ、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出された（図１２）。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉを、組換えモノクローナルウマＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３
、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５またはＩｇＧ６とインキュベートしたときに、分解産物は観察され
なかった。
・ウマＩｇＧの３２ｋＤａの分解産物のＮ末端のエドマン配列決定により示されたＮ末端
配列は、（Ｇ）ＰＴＣＰＥＣＸＧＶである。この配列はウマＩｇＧ７のヒンジ領域に見出
される。
【0140】
[実施例６]
Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）から単離されたＩｇｄＥの性質
・Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の培養上清は、ブタＩｇＧの切断表現
型を有したが、ヒトＩｇＧの切断表現型は有しなかった。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓは、精製ポリクローナルヒトおよびブタ
ＩｇＧを切断して、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出されるように、３２ｋＤａの分解産
物を生じさせた。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓを、ウシ、ウマ、ヤギ、マウス、または
ラットからの精製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察さ
れなかった。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓは、ヒトおよびブタ血清中のＩｇＧを切
断したが、ブタ血清中のＩｇＭまたはＩｇＡは切断しないことが、抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよ
びＩｇＡウェスタンブロット分析によりわかった。
・ブタＩｇＧの３２ｋＤａの分解産物のＮ末端配列は、Ｎ末端のエドマン配列決定により
示されるようにＣＰＩＣＰＡＣＥであり、このタンパク質は、ブタＩｇＧ内のＩｇｄＥと
同じ切断部位を有することが示される。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓは、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１ｐＬｙ
ｓＳで容易に過剰発現された。
Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）から単離されたＩｇｄＥの性質
・Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の培養上清は、ブタＩｇＧの切断表現
型を有したが、ヒトＩｇＧの切断表現型は有しなかった。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓは、精製ポリクローナルヒトおよびブタ
ＩｇＧを切断して、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出されるように、３２ｋＤａの分解産
物を生じさせた。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓを、ウシ、ウマ、ヤギ、マウス、または
ラットからの精製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察さ
れなかった。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓは、ヒトおよびブタ血清中のＩｇＧを切
断したが、ブタ血清中のＩｇＭまたはＩｇＡは切断しないことが、抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよ
びＩｇＡウェスタンブロット分析によりわかった。
・ブタＩｇＧの３２ｋＤａの分解産物のＮ末端配列は、Ｎ末端のエドマン配列決定により
示されるようにＣＰＩＣＰＡＣＥであり、このタンパク質は、ブタＩｇＧ内のＩｇｄＥと
同じ切断部位を有することが示される。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓは、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１ｐＬｙ
ｓＳで容易に過剰発現された。
【0141】
本明細書に記載された本発明は、以下の態様にも関する。
１． 対象において免疫応答を生じさせることに使用するためのポリペプチドであって
：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列番号１のフラグメント、配列番号１の変異体、または配列
番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に
対する免疫応答を生じさせることができる配列番号３のフラグメント、配列番号３の変異
体、または配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．ポルシナス（S. porcinus）に対する
免疫応答を生じさせることができる配列番号５のフラグメント、配列番号５の変異体、ま
たは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列番号７のフラグメント、配列番号７の変異体、または配列
番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporci
nus）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号９のフラグメント、配列番号
９の変異体、または配列番号９の変異体のフラグメント；
を含むポリペプチド。
１． 対象において免疫応答を生じさせることに使用するためのポリペプチドであって
：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列番号１のフラグメント、配列番号１の変異体、または配列
番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に
対する免疫応答を生じさせることができる配列番号３のフラグメント、配列番号３の変異
体、または配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．ポルシナス（S. porcinus）に対する
免疫応答を生じさせることができる配列番号５のフラグメント、配列番号５の変異体、ま
たは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答
を生じさせることができる配列番号７のフラグメント、配列番号７の変異体、または配列
番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporci
nus）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号９のフラグメント、配列番号
９の変異体、または配列番号９の変異体のフラグメント；
を含むポリペプチド。
【0142】
２． 対象において免疫応答を生じさせることに使用するための態様１によるポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド。
チドをコードするポリヌクレオチド。
【0143】
３． 対象において免疫応答を生じさせることに使用するためのポリヌクレオチドであ
って：
（ａ）配列番号２もしくはそれに相補的な配列；
（ｂ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｅ）配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答を生じさせることができる
ポリペプチドをコードするフラグメント。
（ｆ）配列番号４もしくはそれに相補的な配列；
（ｇ）（ｆ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｈ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｉ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｊ）配列（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に対する免疫応答を生じさせ
ることができるポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｋ）配列番号６もしくはそれに相補的な配列；
（ｌ）（ｋ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｍ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｎ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｏ）配列（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）もしくは（ｎ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさせること
ができるポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｐ）配列番号８もしくはそれに相補的な配列；
（ｑ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｒ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｓ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｔ）配列（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）もしくは（ｓ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答を生じさせることができる
ポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｕ）配列番号１０もしくはそれに相補的な配列；
（ｖ）（ｕ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｗ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｘ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；または
（ｙ）配列（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）もしくは（ｘ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）に対する免疫応答を
生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント
を含むポリヌクレオチド。
って：
（ａ）配列番号２もしくはそれに相補的な配列；
（ｂ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｅ）配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答を生じさせることができる
ポリペプチドをコードするフラグメント。
（ｆ）配列番号４もしくはそれに相補的な配列；
（ｇ）（ｆ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｈ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｉ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｊ）配列（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に対する免疫応答を生じさせ
ることができるポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｋ）配列番号６もしくはそれに相補的な配列；
（ｌ）（ｋ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｍ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｎ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｏ）配列（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）もしくは（ｎ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさせること
ができるポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｐ）配列番号８もしくはそれに相補的な配列；
（ｑ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｒ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｓ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；
（ｔ）配列（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）もしくは（ｓ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答を生じさせることができる
ポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｕ）配列番号１０もしくはそれに相補的な配列；
（ｖ）（ｕ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｗ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする配列；
（ｘ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する
配列；または
（ｙ）配列（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）もしくは（ｘ）のいずれかのフラグメントであり、
ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連
鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）に対する免疫応答を
生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント
を含むポリヌクレオチド。
【0144】
４． ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療または予防に使用するための
ポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメン
トもしくは配列番号１の変異体のフラグメント。
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメン
トもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；または
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメン
トもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；または
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメン
トもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分
解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメ
ントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含むポリペプチド。
ポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメン
トもしくは配列番号１の変異体のフラグメント。
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメン
トもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；または
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメン
トもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；または
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメン
トもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分
解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメ
ントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含むポリペプチド。
【0145】
５． ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療または予防に使用するための
態様４によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
態様４によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【0146】
６． ＩｇＧを：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメン
トもしくは配列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメン
トもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメン
トもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメン
トもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列１；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分
解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメ
ントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧを切断するためのインビトロの方法
。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメン
トもしくは配列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメン
トもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメン
トもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメン
トもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解
するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメン
トもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列１；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分
解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメ
ントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧを切断するためのインビトロの方法
。
【0147】
７．ＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化するかまたは阻害する物質
を同定する方法であって；
ａ）ＩｇｄＥポリペプチドおよびＩｇＧを候補物質と、該物質の不在下でＩｇＧシステ
イン活性を可能にする条件下で接触させるステップ、
ｂ）該候補物質の存在下で消化されたＩｇＧの量を、前記物質の不在下における場合と
比較して決定するステップ、
ｃ）ｂ）で得られた結果に基づいて、該物質がＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイ
ン活性を活性化するかまたは阻害するかを決定するステップ
を含む方法。
を同定する方法であって；
ａ）ＩｇｄＥポリペプチドおよびＩｇＧを候補物質と、該物質の不在下でＩｇＧシステ
イン活性を可能にする条件下で接触させるステップ、
ｂ）該候補物質の存在下で消化されたＩｇＧの量を、前記物質の不在下における場合と
比較して決定するステップ、
ｃ）ｂ）で得られた結果に基づいて、該物質がＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイ
ン活性を活性化するかまたは阻害するかを決定するステップ
を含む方法。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0147】
７．ＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化するかまたは阻害する物質を同定する方法であって；
ａ）ＩｇｄＥポリペプチドおよびＩｇＧを候補物質と、該物質の不在下でＩｇＧシステイン活性を可能にする条件下で接触させるステップ、
ｂ）該候補物質の存在下で消化されたＩｇＧの量を、前記物質の不在下における場合と比較して決定するステップ、
ｃ）ｂ）で得られた結果に基づいて、該物質がＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化するかまたは阻害するかを決定するステップ
を含む方法。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法であって、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する、（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのそれらのフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む方法。
［発明２］
前記アミノ酸配列が配列番号３である、発明１に記載の方法。
［発明３］
前記ポリペプチドを、ＩｇＧを含有する試料と、特異的システインプロテアーゼ活性が生ずることを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、発明１または２に記載の方法。
［発明４］
前記ＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、発明２に記載の方法。
［発明５］
前記切断産物の同定および／または単離をさらに含む、前記発明のいずれか一つに記載の方法。
［発明６］
前記同定および／または単離が、ゲル電気泳動または質量分析法による分析を含む、発明５に記載の方法。
［発明７］
ＦｃおよびＦａｂフラグメントを生じさせるために使用される、前記発明のいずれか一つに記載の方法。
［発明８］
ＩｇＧを検出するために使用される、発明１から７のいずれか一つに記載の方法。
［発明９］
（ｉ）試料を、発明１に記載のポリペプチドと、前記ポリペプチドのＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ活性を可能にする条件下で接触させること；および
（ｉｉ）ＩｇＧ特異的切断フラグメントの存在についてモニターすること
を含み、前記特異的切断フラグメントの存在が試料中のＩｇＧを示す、発明８に記載の方法。
ａ）ＩｇｄＥポリペプチドおよびＩｇＧを候補物質と、該物質の不在下でＩｇＧシステイン活性を可能にする条件下で接触させるステップ、
ｂ）該候補物質の存在下で消化されたＩｇＧの量を、前記物質の不在下における場合と比較して決定するステップ、
ｃ）ｂ）で得られた結果に基づいて、該物質がＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化するかまたは阻害するかを決定するステップ
を含む方法。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法であって、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する、（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのそれらのフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む方法。
［発明２］
前記アミノ酸配列が配列番号３である、発明１に記載の方法。
［発明３］
前記ポリペプチドを、ＩｇＧを含有する試料と、特異的システインプロテアーゼ活性が生ずることを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、発明１または２に記載の方法。
［発明４］
前記ＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、発明２に記載の方法。
［発明５］
前記切断産物の同定および／または単離をさらに含む、前記発明のいずれか一つに記載の方法。
［発明６］
前記同定および／または単離が、ゲル電気泳動または質量分析法による分析を含む、発明５に記載の方法。
［発明７］
ＦｃおよびＦａｂフラグメントを生じさせるために使用される、前記発明のいずれか一つに記載の方法。
［発明８］
ＩｇＧを検出するために使用される、発明１から７のいずれか一つに記載の方法。
［発明９］
（ｉ）試料を、発明１に記載のポリペプチドと、前記ポリペプチドのＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ活性を可能にする条件下で接触させること；および
（ｉｉ）ＩｇＧ特異的切断フラグメントの存在についてモニターすること
を含み、前記特異的切断フラグメントの存在が試料中のＩｇＧを示す、発明８に記載の方法。
【外国語明細書】