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▶ ユーシービー バイオファルマ エスピーアールエルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022115961
(43)【公開日】2022-08-09
(54)【発明の名称】親和性を操作した血清タンパク質担体結合ドメイン
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20220802BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220802BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220802BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
A61K39/395 D
A61K39/395 N
C12N15/13
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022075986
(22)【出願日】2022-05-02
(62)【分割の表示】P 2019508294の分割
【原出願日】2017-04-28
(31)【優先権主張番号】1607636.6
(32)【優先日】2016-05-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1607828.9
(32)【優先日】2016-05-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(71)【出願人】
【識別番号】514232085
【氏名又は名称】ユーシービー バイオファルマ エスアールエル
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アダムズ、ラルフ
(72)【発明者】
【氏名】ヘイウッド、サム フィリップ
(57)【要約】
【課題】
親和性を操作した血清タンパク質担体結合ドメインを提供すること。
【解決手段】
本開示は、配列を変異させることによって血清担体タンパク質に特異的な結合ドメインの半減期をモジュレートする方法、及び血清担体タンパク質に特異的なモジュレートされた結合ドメインに関する。
【選択図】なし
親和性を操作した血清タンパク質担体結合ドメインを提供すること。
【解決手段】
本開示は、配列を変異させることによって血清担体タンパク質に特異的な結合ドメインの半減期をモジュレートする方法、及び血清担体タンパク質に特異的なモジュレートされた結合ドメインに関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血清担体タンパク質に特異的なＶＨ及びＶＬを含む結合ドメインであって、該結合ドメインが、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）における１個又は２個のアミノ酸置換、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）における１個又は２個の変異、及びそれらの組合せから選択される改変によって変異しており、該変異した結合ドメインが、変異していない結合ドメインの半減期よりも長い又は短い半減期を有するが、但し、該変異は、配列番号１のＩ５０Ａ、Ｔ５６Ａ、Ｔ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｐ９７Ａ、Ｇ９８Ａ、Ｙ９９Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｔ１００Ａａ、Ｙ１００Ｃａ、Ｉ５０Ａ及びＴ９５Ａ、Ｉ５０Ａ及びＧ９８Ａ、Ｉ５０Ａ及びＹ９９Ａ、Ｔ５６Ａ及びＴ９５Ａ、Ｔ５６Ａ及びＧ９８Ａ、並びにＴ５６Ａ及びＹ９９Ａからなる変異以外である、上記結合ドメイン。
【請求項2】
血清担体タンパク質がチロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１－酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン及びアルブミン、又はそれらのいずれかの断片から選択される、請求項１に記載の結合ドメイン。
【請求項3】
血清担体タンパク質がアルブミン、例えばヒト血清アルブミンである、請求項２に記載の結合ドメイン。
【請求項4】
アルブミンのドメインＩＩに結合する、請求項３に記載の結合ドメイン。
【請求項5】
変異がＶＬにおける少なくとも１つの置換である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項6】
変異がＶＬにおける１個のアミノ酸の置換である、請求項５に記載の結合ドメイン。
【請求項7】
変異がＶＬにおける２個のアミノ酸の置換である、請求項５に記載の結合ドメイン。
【請求項8】
変異がＬ１、Ｌ２、Ｌ３及びそれらの組合せから選択されるＣＤＲにある、請求項５から７までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項9】
ＣＤＲがＬ１である、請求項８に記載の結合ドメイン。
【請求項10】
変異したアミノ酸（単数又は複数）が２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４及び３５位から独立して選択される、請求項９に記載の結合ドメイン。
【請求項11】
位置が３０位である、請求項１０に記載の結合ドメイン。
【請求項12】
関連する位置（単数又は複数）のアミノ酸が、例えば、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びグリシンから選択される疎水性残基、例えばアラニンによって置き換えられている、請求項１０又は１１に記載の結合ドメイン。
【請求項13】
変異がＶＬに対する改変からなる、請求項５から１１までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項14】
変異がＶＨドメインにある、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項15】
変異がＶＨにおける１個のアミノ酸の置換である、請求項１４に記載の結合ドメイン。
【請求項16】
変異がＶＨにおける２個のアミノ酸の置換である、請求項１４に記載の結合ドメイン。
【請求項17】
変異がＨ１、Ｈ２、Ｈ３及びそれらの組合せから選択されるＣＤＲにある、請求項１５又は１６に記載の結合ドメイン。
【請求項18】
ＣＤＲがＨ２及び／又はＨ３である、請求項１７に記載の結合ドメイン。
【請求項19】
ＣＤＲがＨ２である、請求項１８に記載の結合ドメイン。
【請求項20】
変異したアミノ酸（単数又は複数）が５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４又は６５位から独立して選択される、請求項１４から１９までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項21】
関連する位置（単数又は複数）のアミノ酸が、例えば、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びグリシンから選択される疎水性残基、例えばアラニンによって置き換えられている、請求項２０に記載の結合ドメイン。
【請求項22】
ＣＤＲがＨ３である、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項23】
変異したアミノ酸（単数又は複数）が９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６又は１０７位から独立して選択される、請求項２２に記載の結合ドメイン。
【請求項24】
残基１０１が変異している、請求項２３に記載の結合ドメイン。
【請求項25】
関連する位置（単数又は複数）のアミノ酸が、例えば、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びグリシンから選択される疎水性残基、例えばアラニンによって置き換えられている、請求項２３又は２４に記載の結合ドメイン。
【請求項26】
１つ又は複数のアミノ酸置換が非保存的アミノ酸置換である、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項27】
非保存的アミノ酸が天然アミノ酸のアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸から選択される、請求項２６に記載の結合ドメイン。
【請求項28】
ＣＤＲグラフト化可変ドメインを含む、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項29】
ヒト化されている、請求項２８に記載の結合ドメイン。
【請求項30】
ヒト化結合ドメインがＶＨ及び／又はＶＬにおけるヒトフレームワークを含む、請求項２９に記載の結合ドメイン。
【請求項31】
ＶＨフレームワークが、例えば１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸置換、例えばドナー残基であるアミノ酸を含む、ヒト（例えばＶＨ３ １－３ ３－２３などのＶＨ３）である、請求項３０に記載の結合ドメイン。
【請求項32】
ＶＨが配列番号２、３、４、５若しくは６（特に５若しくは６）に示した配列、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれか１つの変異体、例えば配列番号２、３、４、５若しくは６（特に５若しくは６）に示した配列を有する、請求項３１に記載の結合ドメイン。
【請求項33】
ＶＬフレームワークが、例えば１、２又は３個のアミノ酸置換、例えばドナー残基であるアミノ酸を含む、ヒト（例えば２－１－（１）Ｌ５などのＶκ１）である、請求項３０から３１までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項34】
ＶＬドメインが配列番号６、７、８及び９から選択される配列、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれか１つの変異体、例えば配列番号６、７、８及び９（特に８若しくは９）から選択される配列を含む、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
【請求項35】
ＶＨ及びＶＬ配列が配列番号２及び６、２及び７、２及び８、２及び９、３及び６、３及び７、３及び８、３及び９、４及び６、４及び７、４及び８、４及び９、５及び６、５及び７、５及び８、並びに５及び９の組合せ、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれか１つの変異体若しくは複数の変異体から選択される、請求項３６に記載の結合ドメイン。
【請求項36】
ＶＬ及びＶＨ配列がそれぞれ配列番号９及び配列番号３である、請求項３５に記載の結合ドメイン。
【請求項37】
ＶＬ及びＶＨ配列がそれぞれ配列番号８及び配列番号４である、請求項３５に記載の結合ドメイン。
【請求項38】
ＶＬ及びＶＨ配列がそれぞれ配列番号９及び配列番号５である、請求項３５に記載の結合ドメイン。
【請求項39】
ＶＬ及びＶＨ配列がそれぞれ配列番号９及び配列番号４である、請求項３５に記載の結合ドメイン。
【請求項40】
請求項１から３９までのいずれか一項に記載の結合ドメインを含む抗体分子。
【請求項41】
請求項１から３９までのいずれか一項に記載の結合ドメイン又は請求項４０に記載の抗体分子を含む医薬組成物。
【請求項42】
請求項１から３９までのいずれか一項に記載の結合ドメイン、請求項４０に記載の抗体分子、又は請求項４１に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、患者を処置する方法。
【請求項43】
処置で使用するための、請求項１から３９までのいずれか一項に記載の結合ドメイン、請求項４０に記載の抗体分子、又は請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項44】
処置で、特に、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、感染に関連する内毒素性ショック、関節炎、例えば関節リウマチ、喘息、例えば重度の喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、中枢神経系及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、狼瘡（例えば全身性エリテマトーデス）及びギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵臓炎、外傷（外科）、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心臓病、例えば心筋梗塞並びにアテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症、並びに、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵臓がん、食道がん、頭頚部がん、腎臓がん、特に腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん及び甲状腺がん、並びにその転移形態を含むがんからなる群から選択される処置で使用するための、請求項１から４０までのいずれか一項に記載の結合ドメイン、請求項４０に記載の抗体分子、又は請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項45】
例えば、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、感染に関連する内毒素性ショック、関節炎、例えば関節リウマチ、喘息、例えば重度の喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、中枢神経系及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、狼瘡（例えば全身性エリテマトーデス）及びギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵臓炎、外傷（外科）、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心臓病、例えば心筋梗塞並びにアテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症、並びに、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵臓がん、食道がん、頭頚部がん、腎臓がん、特に腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん及び甲状腺がん、並びにその転移形態を含むがんからなる群から選択される処置のための医薬の製造における、請求項１から３９までのいずれか一項に記載の結合ドメイン、請求項４０に記載の抗体分子、又は請求項４１に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、配列を変異させることによって血清担体タンパク質に特異的な結合ドメインの半減期をモジュレートする方法、及び血清担体タンパク質に特異的なモジュレートされた結合ドメインに関する。
【背景技術】
【0002】
血清タンパク質担体、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を標的とすることによる生物学的薬物の血清半減期の増大が現在確立されている（１、２）。ＨＳＡは、その半減期が１９日であることから利用されている。ＨＳＡは血清中で最も豊富なタンパク質であり（３４～５４ｇ／Ｌ）、組織に広範囲で分布している（３）。したがって、ＨＳＡは容易に入手可能で、結合にとって安全な標的であり、特にそのため、全アルブミンのわずかなパーセントがこのアプローチにおいて利用されている。
【0003】
血清タンパク質のうち、ＩｇＧだけが同様に長い半減期を有する（２１日）。ＨＳＡ及びＩｇＧの長い血清半減期は、主として、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）による細胞内リソソーム分解からの保護に起因している（４、５）。ＦｃＲｎは、血管空間に並ぶ内皮細胞及び造血細胞による小胞への血漿の非特異的なピノサイトーシスの後に、ＨＳＡ及びＩｇＧを細胞表面に戻すように再循環する。ピノサイトーシス小胞は初期エンドソームとの融合によって酸性化され、ＨＳＡ及びＩｇＧをｐＨ依存的方法でＦｃＲｎに結合させることができる。ＦｃＲｎを含む膜受容体を有する小胞、並びに結合されたＨＳＡ及びＩｇＧは、細胞表面に戻って再循環されるが、残りの非結合の物質は、分解のためにリソソームに運ばれる。ＨＳＡ及びＩｇＧは、中性ｐＨではＦｃＲｎに弱く結合するため、再循環された小胞が血液の中性ｐＨに暴露されると循環中に放出される（２）。
【0004】
ＨＳＡは、２つの方法のいずれかで利用され得る。アプローチの１つは、遺伝学的又は化学的ないずれかで、治療用タンパク質をＨＳＡに直接的にカップリングさせることである（６、７）。第２のアプローチは、アルブミン結合ドメインを使用することである。これまでに使用されている結合ドメインの例としては、脂肪酸（ミリスチン酸）８、有機分子（Ａｌｂｕｔａｇ）９、合成ペプチド１０、１１、細菌アルブミン結合ドメイン（Ａｌｂｕｍｏｄ（商標））１２、１３、単一ドメイン抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）、ＡｌｂｕｄＡｂ（商標））１４～１７、並びにＦａｂ１８が挙げられる。
【0005】
Ｎｇｕｙｅｎら、２００６年は、Ｃ末端アルブミン結合ペプチドに連結されているＦａｂ断片の半減期を調べた。Ｎｇｕｙｅｎは、アルブミンに対する親和性の低下は、半減期の低減及びより高いクリアランス速度と相関するとの結論を出した。図３は、その中で、その関係がほぼ直線的であることを示している。またこの論文は、ｉｎ ｖｉｖｏで結合していない抗体の画分における非常に小さな差異が、クリアランス速度に大きく影響することも述べている。
【0006】
本発明者らは、血清タンパク質担体に特異的なＶＨ及びＶＬを含む結合ドメインの親和性とそれらのｉｎ ｖｉｖｏ半減期との間の相関について調べた。本発明者らは、結合ドメインの半減期の持続時間が、アルブミン結合ペプチドに対する応答よりも複雑であることを確証し、観察された親和性における大幅な低減は、多くの場合、半減期の中程度の低減を意味し、場合によっては、親和性の低減が半減期の増加につながる可能性があり、これは直感に反したものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
したがって、血清担体タンパク質に特異的なＶＨ及びＶＬを含む結合ドメインであって、ドメインが軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及びそれらの組合せにおける改変によって変異しており、変異した結合ドメインが、変異していない結合ドメインの半減期よりも長い又は短い半減期を有するが、例えば、但し、変異は、配列番号１のＩ５０Ａ、Ｔ５６Ａ、Ｔ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｐ９７Ａ、Ｇ９８Ａ、Ｙ９９Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｔ１００Ａａ、Ｙ１００Ｃａ、Ｉ５０Ａ及びＴ９５Ａ、Ｉ５０Ａ及びＧ９８Ａ、Ｉ５０Ａ及びＹ９９Ａ、Ｔ５６Ａ及びＴ９５Ａ、Ｔ５６Ａ及びＧ９８Ａ、並びにＴ５６Ａ及びＹ９９Ａからなる変異以外である、上記結合ドメインを提供する。
【0008】
したがって、血清担体タンパク質に特異的なＶＨ及びＶＬを含む結合ドメインであって、結合ドメインが、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）における１個又は２個のアミノ酸置換、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）における１個又は２個の変異、及びそれらの組合せから選択される改変によって変異しており、変異した結合ドメインが、変異していない結合ドメインの半減期よりも長い又は短い半減期を有するが、例えば、但し、変異は、配列番号１のＩ５０Ａ、Ｔ５６Ａ、Ｔ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｐ９７Ａ、Ｇ９８Ａ、Ｙ９９Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｔ１００Ａａ、Ｙ１００Ｃａ、Ｉ５０Ａ及びＴ９５Ａ、Ｉ５０Ａ及びＧ９８Ａ、Ｉ５０Ａ及びＹ９９Ａ、Ｔ５６Ａ及びＴ９５Ａ、Ｔ５６Ａ及びＧ９８Ａ、並びにＴ５６Ａ及びＹ９９Ａからなる変異以外である、上記結合ドメインを提供する。
【0009】
一実施形態において、血清担体タンパク質は、例えば、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１－酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン及びアルブミン、又はそれらのいずれかの断片から選択され、例えばアルブミン、特にヒト血清アルブミンである。
【0010】
一実施形態において、結合ドメインはアルブミンのドメインＩＩに特異的である。
【0011】
一実施形態において、変異はＶＬにおける改変であって、例えば、変異はＶＬにおける１個又は２個のアミノ酸の置換、例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びそれらの組合せから選択されるＣＤＲにおける改変／置換であり、特にＣＤＲはＬ１である。
【0012】
一実施形態において、ＣＤＲ Ｌ１における変異したアミノ酸（単数又は複数）は２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４及び３５位から独立して選択され、例えば３０位である。
【0013】
一実施形態において、ＶＬにおける関連する位置（単数又は複数）のアミノ酸（単数又は複数）は、例えば、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びグリシンから選択される疎水性残基、例えばアラニンによって置き換えられている。
【0014】
一実施形態において、変異はＶＬに対する改変からなる。驚いたことに、本発明者らは、結合ドメインのＫｄを増大させ、結合ドメインの親和性を低減するが、分子の半減期は増大させるＶＬにおける改変を行うことができることを確証した。
【0015】
一実施形態において、変異（単数又は複数）はＶＨにおけるものであり、例えば、変異はＶＨにおける１個又は２個のアミノ酸の置換、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びそれらの組合せから選択されるＣＤＲにおける変異であり、特にＣＤＲはＨ２及び／又はＨ３であり、より詳しくはＣＤＲはＨ２である。
【0016】
一実施形態において、ＣＤＲ Ｈ２における変異したアミノ酸（単数又は複数）は５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５位及びそれらの組合せから独立して選択され、例えば、それはアラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びグリシンから特に独立して選択される疎水性残基、例えばアラニンによって置き換えられている。
【0017】
一実施形態において、変異したアミノ酸（単数又は複数）は、Ｈ３であるＣＤＲにあり、特に、変異したアミノ酸（単数又は複数）は９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６又は１０７位から独立して選択され、より詳しくは、残基１０１が変異している。
【0018】
一実施形態において、ＣＤＲ Ｈ３における関連する位置（単数又は複数）のアミノ酸は、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びグリシンから独立して選択される疎水性残基、例えばアラニンによって置き換えられている。
【0019】
一つ又は複数の実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換（単数又は複数）は非保存的アミノ酸置換であり、例えば、非保存的アミノ酸は、天然アミノ酸のアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸から選択される。
【0020】
一実施形態において、結合ドメインはＣＤＲグラフト化可変ドメインを含む。
【0021】
一実施形態において、結合ドメインはヒト化されており、例えば、結合ドメインはＶＨ及び／又はＶＬにおけるヒトフレームワークを含む。
【0022】
一実施形態において、ＶＨフレームワークは、ヒト（例えばＶ３ １－３ ３－２３などのＶＨ３）であり、１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸置換、例えばドナー残基であるアミノ酸を含む。
【0023】
一実施形態において、ＶＨは、配列番号２、３、４及び５から選択される配列、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性若しくは同一性を有するそれらのいずれか１つの変異体、例えば配列番号２、３、４、５若しくは６（特に５若しくは６）に示した配列を含む。
【0024】
一実施形態において、ＶＬフレームワークは、例えば１、２又は３個のアミノ酸置換、例えばドナー残基であるアミノ酸を含む、ヒト（例えば２－１－（１）Ｌ５などのＶκ１）である。
【0025】
一実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号６、７、８及び９から選択される配列、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性若しくは同一性を有するそれらのいずれか１つの変異体を含む。
【0026】
一実施形態において、ＶＨ及びＶＬ配列は、配列番号２及び６、２及び７、２及び８、２及び９、３及び６、３及び７、３及び８、３及び９、４及び６、４及び７、４及び８、４及び９、５及び６、５及び７、５及び８、並びに５及び９の組合せ、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性若しくは同一性を有するそれらのいずれか１つの変異体若しくは複数の変異体から選択され、特に、ＶＬ及びＶＨ配列は、それぞれ配列番号９及び配列番号３であり、又はＶＬ及びＶＨ配列は、それぞれ配列番号８及び配列番号４であり、又はＶＬ及びＶＨ配列は、それぞれ配列番号９及び配列番号５であり、又はＶＬ及びＶＨ配列は、配列番号９及び配列番号４である。
【0027】
一実施形態において、結合ドメインはヒトである。
【0028】
一実施形態において、結合パートナーの親和性は高く、５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０若しくは１０ｐＭ又はそれよりも強い。
【0029】
一実施形態において、本開示による結合ドメインを含む抗体分子、特に多特異性抗体分子、例えば二重特異性抗体分子を提供する。
【0030】
一実施形態において、本開示による結合ドメイン又は本明細書に記載の抗体分子を含む医薬組成物を提供する。
【0031】
さらなる態様において、本開示による結合ドメイン、本明細書に記載の抗体分子、又はそれらのいずれか１つを含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、患者を処置する方法を提供する。
【0032】
また、処置で使用するための、本開示による結合ドメイン、本明細書に記載の抗体分子、又はそれらのいずれか１つを含む医薬組成物も提供する。
【0033】
一実施形態において、処置で、特に、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、感染に関連する内毒素性ショック、関節炎、例えば関節リウマチ、喘息、例えば重度の喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、中枢神経系及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、狼瘡（例えば全身性エリテマトーデス）及びギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵臓炎、外傷（外科）、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心臓病、例えば心筋梗塞並びにアテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症、並びに、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵臓がん、食道がん、頭頚部がん、腎臓がん、特に腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん及び甲状腺がんのがん、並びにその転移形態を含むがんからなる群から選択される処置で使用するための、本開示による結合ドメイン、本明細書に記載の抗体分子、又はそれらのいずれか１つを含む医薬組成物も提供する。
【0034】
例えば、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、感染に関連する内毒素性ショック、関節炎、例えば関節リウマチ、喘息、例えば重度の喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、中枢神経系及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、狼瘡（例えば全身性エリテマトーデス）及びギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵臓炎、外傷（外科）、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心臓病、例えば心筋梗塞並びにアテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症、並びに、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵臓がん、食道がん、頭頚部がん、腎臓がん、特に腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん及び甲状腺がんのがん、並びにその転移形態を含むがんからなる群から選択される処置のための医薬の製造における、本開示による結合ドメイン、本明細書に記載の抗体分子、又はそれらを含む医薬組成物の使用。
【0035】
独立した態様において、仕立てられた半減期を提供するための血清タンパク質担体結合ドメインを選択する方法であって、前記血清タンパク質担体に特異的なＶＨ／ＶＬ対のパネルを提供するステップと、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの半減期を分析するステップと、ヒト対象においてドメインを含む生物学的分子に要求される半減期に最も厳密に一致するドメインを選択するステップを含む、上記方法を提供する。
【0036】
一実施形態において、血清担体タンパク質は、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１－酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン及びアルブミン、又はそれらのいずれかの断片から選択され、例えばアルブミン、例えばヒト血清アルブミンである。
【0037】
一態様において、ＶＨ／ＶＬ対のパネルは、親抗体における可変ドメインを変異させることによって調製される。
【0038】
一実施形態において、変異はＶＬに対する少なくとも１つの改変であり、例えば、ＶＬ改変は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）における１個又は２個のアミノ酸置換から選択され、変異した結合ドメインは、変異していない結合ドメインの半減期よりも長い又は短い半減期を有する。
【0039】
一実施形態において、ＶＬにおける変異は、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及び／又はＣＤＲ Ｌ３、特にＣＤＲ Ｌ２又はＣＤＲ Ｌ３における変異である。
【0040】
一実施形態において、結合ドメインにおける変異（単数又は複数）は、ＶＬドメインに対する１つの改変又は複数の改変からなる。
【0041】
一実施形態において、変異はＶＨに対する少なくとも１つの改変である。
【0042】
一実施形態において、変異は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）における１つ又は２つの変異であり、変異した結合ドメインは、変異していない結合ドメイン（本明細書においては親抗体とも呼ばれる）の半減期よりも長い又は短い半減期を有する。
【0043】
一実施形態において、変異（単数又は複数）はＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及び／又はＣＤＲ Ｈ３にあり、特にＣＤＲ Ｈ２又はＣＤＲ Ｈ３にある。
【0044】
一実施形態において、本開示による方法は、ＶＨ及び／又はＶＬ（パネル由来の又はパネルに関する）におけるヒスチジン残基を代替のアミノ酸残基と置き換えるステップをさらに含む。
【0045】
一実施形態において、この方法は、２つ以上の生物学的に関連するｐＨ、例えば約ｐＨ５及びｐＨ７において、１つ又は複数の結合ドメインの特性を評価するステップをさらに含む。
【0046】
一実施形態において、変異は、Ｋｄの数値を増大させる。
【0047】
一実施形態において、親和性を増大させる方法を提供する。
【0048】
一実施形態において、親和性を低減させる方法を提供する。
【0049】
一実施形態において、抗体、例えば親抗体を含む血清担体タンパク質の結晶構造は、どの残基を改変／変異させるかを決定する際に用いられる。
【0050】
独立した一態様において、本開示は、以下のパラグラフに記載の方法を提供する：
【0051】
１． 仕立てられた半減期を提供するための血清タンパク質担体結合ドメインを選択する方法であって、前記血清タンパク質担体に特異的なＶＨ／ＶＬ対のパネルを提供するステップと、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの半減期を分析するステップと、ヒト対象においてドメインを含む生物学的分子に要求される半減期に最も厳密に一致するドメインを選択するステップを含む、上記方法。
【0052】
２． 血清担体タンパク質がチロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１－酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン及びアルブミン、又はそれらのいずれかの断片から選択される、パラグラフ１に記載の方法。
【0053】
３． 血清タンパク質担体がアルブミンである、パラグラフ２に記載の方法。
【0054】
４． アルブミンがヒト血清アルブミンである、パラグラフ３に記載の方法。
【0055】
５． ＶＨ／ＶＬ対のパネルが、親抗体における可変ドメインを変異させることによって調製される、パラグラフ１から４までのいずれか１つに記載の方法。
【0056】
６． 変異がＶＬに対する少なくとも１つの改変である、パラグラフ５に記載の方法。
【0057】
７． ＶＬ改変が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）における１個又は２個のアミノ酸置換から選択され、変異した結合ドメインの半減期が、変異していない結合ドメインの半減期よりも長い又は短い、パラグラフ６に記載の方法。
【0058】
８． 変異がＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及び／又はＣＤＲ Ｌ３、特にＣＤＲ Ｌ２又はＣＤＲ Ｌ３にある、パラグラフ５から７までのいずれか１つに記載の方法。
【0059】
９． 変異がＶＬドメインに対する１つの改変又は複数の改変からなる、パラグラフ５から８までのいずれか１つに記載の方法。
【0060】
１０． 変異がＶＨに対する少なくとも１つの改変である、パラグラフ１から８までのいずれか１つに記載の方法。
【0061】
１１． 変異が重鎖可変ドメイン（ＶＨ）における１つ又は２つの変異及びその組合せであり、変異した結合ドメインの半減期が、変異していない結合ドメインの半減期よりも長い又は短い、パラグラフ９に記載の方法。
【0062】
１２． 変異（単数又は複数）がＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３、特にＣＤＲ Ｈ２又はＣＤＲ Ｈ３にある、パラグラフ１０又は１１に記載の方法。
【0063】
１３． パネルに用いられるＶＨ及び／又はＶＬのヒスチジン残基を代替のアミノ酸残基と置き換えるステップをさらに含む、パラグラフ１から１２までのいずれか１つに記載の方法。
【0064】
１４． ２つ以上の生物学的に関連するｐＨ、例えば約ｐＨ５及びｐＨ７において、１つ又は複数の結合ドメインの特性を評価するステップをさらに含む、パラグラフ１から１３までのいずれか１つに記載の方法。
【0065】
１５． 変異（単数又は複数）がＫｄの数値を増大させる、パラグラフ１から１４までのいずれか１つに記載の方法。
【0066】
１６． 親和性が増大される、パラグラフ１から１５までのいずれか１つに記載の方法。
【0067】
１７． 親和性が低減される、パラグラフ１から１５までのいずれか１つに記載の方法。
【0068】
詳細な説明
驚いたことに、本発明者らは、ＶＨ及びＶＬの配列を変異させることができること、また、対応する半減期が必ずしも結合ドメインの親和性に対応しないことを見出した。特に、親和性が保持又は低減され、半減期が長くなるＶＬに改変することができる。
驚いたことに、本発明者らは、ＶＨ及びＶＬの配列を変異させることができること、また、対応する半減期が必ずしも結合ドメインの親和性に対応しないことを見出した。特に、親和性が保持又は低減され、半減期が長くなるＶＬに改変することができる。
【0069】
これにより、分子が治療指示に関連する半減期を提供するように半減期を設計しコントロールすることができる。いくつかの実施形態において、長い半減期が望まれ得る。いくつかの実施形態において、中位／中程度の半減期が適切であり得る。他の実施形態において、比較的短い半減期が適切であり得る。
【0070】
本明細書において使用されている仕立てられた半減期は、結合ドメインを改変することにより結合ドメインに特異的に設計された半減期である。
【0071】
本明細書で使用されている「結合ドメイン又は部位」は、抗原と接触する抗体の部分である。一実施形態において、結合ドメインは、少なくとも１つの可変ドメイン又はそれらの誘導体、例えば可変ドメイン又はそれらの誘導体の対、例えば可変ドメイン又はそれらの誘導体の同族対を含有する。
【0072】
一実施形態において、結合ドメインは６つのＣＤＲと１つのフレームワークを含み、これらのエレメントは一緒になって、抗体又は結合断片の結合相互作用の特異性に寄与する。
【0073】
可変領域（また本明細書においては可変ドメインとも呼ばれる）は、一般に、３つのＣＤＲと１つの適切なフレームワークを含む。
【0074】
本明細書において使用されている用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置している、少なくとも１つの抗原認識部位（また本明細書においては結合部位とも呼ばれる）を介して、標的抗原、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチドなどに対して特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を意味する。
【0075】
本明細書において使用される場合の「抗体分子」は、抗体及びそれらの結合断片を包含する。またこの用語は、それらのいずれか１つを含む抗体フォーマットにも及ぶ。
【0076】
本明細書において使用されている親抗体は、半減期を変化させる変異前の出発抗体を意味する。親抗体はヒト化されていてもよく（これはいわゆるドナー残基を含有する逆変異の取り込みを含み得る）、又は例えばＣＤＲ等からリシン残基を除去するように変異させることができる。しかし、親抗体に存在する改変は、半減期を変化／改変する目的のためのものでない。本明細書において使用されている親抗体は、抗体結合断片を包含する。
【0077】
本明細書において使用されている「抗体断片」は、限定するものではないが、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、２価、３価又は４価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む、抗体結合断片を意味する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２３（９）：１１２６～１１３６；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９～２１７を参照されたい）。これらの抗体断片を作製及び製造する方法は、当技術分野においては周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６：１６５～１８１を参照されたい）。本開示で使用するための他の抗体断片は、国際特許出願ＷＯ０５／００３１６９、ＷＯ０５／００３１７０、及びＷＯ０５／００３１７１に記載されているＦａｂ断片及びＦａｂ’断片を包含する。多価抗体は、多重特異性、例えば二重特異性を含むことができ、又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１０／０３５０１２、ＷＯ２０１５／１９７７７２を参照されたい）。
【0078】
本明細書において使用されている「結合断片」は、断片がペプチド又は抗原に特異的なものとして特徴づけるのに十分な親和性で、標的ペプチド又は抗原に結合することができる断片を意味する。
【0079】
本明細書において使用されている特異性（又は特異的）は、相互作用におけるパートナーが互いだけを認識するか、又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性を有し、例えば、結合のバックグラウンドレベルよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍高い親和性を有することを意味する。
【0080】
本明細書において使用されているパートナーは、抗原と抗体の結合又はリガンドと受容体タイプの結合関係を意味する。
【0081】
本明細書において使用されている少なくとも１つの改変は、例えば、配列の特性を変化させる、例えば疎水性等を変化させるための、アミノ酸の置換、付加又は欠失を意味する。
【0082】
抗体可変ドメインにおける残基は、Ｋａｂａｔら、１９８７年により考案されたシステムによって慣例的にナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（これ以降「Ｋａｂａｔら（上掲）」という）に記載されている。別段の指示のない限り、本明細書においてこのナンバリングシステムを使用する。
【0083】
Ｋａｂａｔ残基の明示は、アミノ酸残基の直鎖のナンバリングと必ずしも直接的に対応するものではない。実際の直鎖状アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであっても相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても、構成成分の短縮又は構成成分への挿入に対応する、厳密なＫａｂａｔナンバリングにおける場合よりも少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含み得る。残基の正確なＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基を「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列と配列比較することによって、所定の抗体について決定することができる。
【0084】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、残基３１～３５（ＣＤＲ－Ｈ１）、残基５０～６５（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び残基９５～１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）に位置している。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１～９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ－Ｈ１に等価なループは残基２６から残基３２まで拡大している。したがって、特段の指示のない限り、本明細書において使用されている「ＣＤＲ－Ｈ１」は、ＫａｂａｔナンバリングシステムとＣｈｏｔｈｉａの形態的ループ定義との組合せによって記載されているように、残基２６から３５までを意味するものとする。
【0085】
本明細書において使用されている用語「Ｆａｂ断片」は、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン及び軽鎖（ＣＬ）の定常ドメインを含む軽鎖断片、並びに重鎖のＶＨ（可変重鎖）ドメイン及び第１定常ドメイン（ＣＨＩ）を含む抗体断片である。
【0086】
本明細書において使用されているＦａｂ’断片は、ヒンジ領域をさらに含むＦＡｂ断片を意味する。
【0087】
本明細書において使用されている用語「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」と略記される用語は、（例えばペプチドリンカーによって）連結されているＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含みポリペプチド単鎖を形成する、抗体断片を意味する。重鎖及び軽鎖の定常領域は、このフォーマットでは省略されている。本明細書において使用されている単鎖Ｆｖは、ペプチドリンカーに加えてジスルフィド結合が可変領域間に存在する、ジスルフィド安定化バージョンを包含する。
【0088】
ジスルフィド安定化ｓｃＦｖは、可変領域が分離し、再度一緒になることに関係する、いくつかの可変領域の動力学的ブレス傾向を排除すことができる。
【0089】
本明細書において使用されている「単一ドメイン抗体」は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体の例としては、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが挙げられる。
【0090】
定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提唱される機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能に関して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療上の使用について意図され、抗体のエフェクター機能が必要とされる場合、特にＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。或いは、抗体分子が治療上の目的について意図され、抗体のエフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２アイソタイプ及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列変異体も使用することができることは理解されよう。例えば、Ａｎｇａｌら、１９９３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０：１０５～１０８に記載されているような、２４１位のセリンがプロリンに変化されたＩｇＧ４分子を使用してもよい。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態において、抗体は変異Ｓ２４１Ｐを含み得る。
【0091】
一実施形態において、抗体結合断片はＦｃ領域を含まない。本明細書において使用されている「Ｆｃ領域を含まない」とは、例えばＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４などの、より低い定常ドメインが存在しないことを意味する。しかし、ＣＨ１、Ｃカッパ／Ｃラムダなどの定数ドメインは存在していてもよい。
【0092】
当業者には、抗体が多様な翻訳後修飾を受け得ることは理解されよう。これらの修飾のタイプ及び程度は、多くの場合、抗体の発現に使用される宿主細胞系、並びに培養条件に依存する。このような修飾としては、グリコシル化における変化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化、及びアスパラギン脱アミドが挙げられる。よくある修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（例えば、リシン又はアルギニン）の欠失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、７０５：１２９～１３４、１９９５に記載されている）。したがって、抗体重鎖のＣ末端のリシンは非存在であり得る。
【0093】
一実施形態において、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダいずれかのＣＬドメインを含む。
【0094】
一実施形態において、抗体重鎖はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダいずれかのＣＬドメインを含む。
【0095】
本明細書において用いられている「多重特異性分子」は、少なくとも２つの個別の抗原、例えば異なる抗原に特異的に結合する能力を有する分子を意味する。一実施形態において、多重特異性分子は、二重特異性、三重特異性又は四重特異性分子であり、特に二重特異性分子である。
【0096】
適切な多重特異性分子の例は、当技術分野では公知である。
【0097】
一実施形態において、多重特異性フォーマットは、当技術分野において公知のもの及び本明細書に記載のものを包含し、例えば、この分子フォーマットは、ダイアボディ、ｓｃダイアボディ、トリアボディ、トリボディ、テトラボディ、タンデムｓｃＦｖ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、タンデムＳｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、Ｉｇ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｉｇ、Ｖ－Ｉｇ、Ｉｇ－Ｖ、Ｄｕｏｂｏｄｙ及びＤＶＤＩｇを含む群又はこれらからなる群から選択されるが、これらについては以下でより詳細に論じる。
【0098】
本明細書において用いられている分子は、有機物の、特にタンパク質性の塊を形成する原子群を示すために生化学的な意味で使用され、これは、複合体が形成されたならば、適切な条件下において単一実体として取り扱うのに好適な複合体を包含する。
【0099】
分子及び構築物は、文脈上他を意味しない限り、本明細書において互換的に使用される。しかし、構築物はポリヌクレオチド分子を意味するように使用されることがより多く、分子はアミノ酸配列を主として含む実体を意味するように使用されることがより多い。
【0100】
また、本開示の抗体分子における結合ドメインによって標的とされ得る目的の抗原は、任意の医学的に関連するタンパク質、例えば疾患又は感染の間にアップレギュレートされるそれらのタンパク質、例えば受容体及び／又はそれらの対応するリガンドなどであり得る。細胞表面タンパク質の特定の例としては、接着分子、インテグリン、例えばβ１インテグリン（例えばＶＬＡ－４）、Ｅ－セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ－セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ｄｕｄｕｌｉｎ２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦと、適切な場合にはそれらの受容体が挙げられる。
【0101】
可溶性抗原としては、インターロイキン、例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６又はＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えばＩｇＥ、インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγ、腫瘍壊死因子－α、腫瘍壊死因子－β、コロニー刺激因子、例えばＧ－ＣＳＦ又はＧＭ－ＣＳＦ、並びに血小板由来成長因子、例えばＰＤＧＦ－α及びＰＤＧＦ－βと、適切な場合にはそれらの受容体が挙げられる。他の抗原としては、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、ウイルス、例えばインフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣ、バイオテロ剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモ毒液及び毒素が挙げられる。
【0102】
本明細書の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」として解釈されたい。
【0103】
また特定の要素を含む本発明の態様は、関連要素「からなる」又は「から本質的になる」代替の実施形態を網羅するものとする。
【0104】
本開示の実施形態及び説明は、技術的に適切な場合には、組み合わせることができる。
【0105】
本明細書に記載されている任意の肯定的な実施形態又はその組合せは、否定的な除外の根拠、すなわち免責事項となり得る。
【図面の簡単な説明】
【0106】
【図1】抗体ＣＡ６４５のヒト化及び親和性の低減を示す図である。抗体ＣＡ６４５の重鎖配列及び軽鎖配列を、ヒト生殖系列アクセプターフレームワーク配列のＶＨ３ １－３ ３－２３／ＪＨ４及びＶκ１ ２－１－（１）（Ｌ５）／Ｊκ４と配列比較する。ウサギ残基は赤色、ヒト残基は黒色、ＣＤＲは青色である（Ｊ領域ＣＤＲ残基は示されているが、アクセプターＶ領域ＣＤＲは示されていない）。グラフト化ＶＨ（ｇＨ）配列及びＶＬ（ｇＬ）配列は、それらの対応するヒトアクセプター生殖細胞系フレームワークの下に示している。ウサギとヒトのフレームワーク配列の間のフレームワーク配列の相違を星印で示している。ヒト化グラフトに保持されているウサギフレームワーク残基は太字で強調表示している。
【図2】ＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの存在下又は非存在下におけるＦｃＲｎのＨＳＡ及びＭＳＡへの結合を示す図である。Ｆａｂの非存在下におけるＨＳＡへの結合（赤色丸形）、Ｆａｂの存在下におけるＨＳＡへの結合（赤色三角形）、Ｆａｂの非存在下におけるＭＳＡへの結合（青色四角形）、Ｆａｂの存在下におけるＭＳＡへの結合（青色三角形）。
【図3】図３（Ａ）は、ＨＳＡとの複合体におけるＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの結晶構造を示す図である。図３（Ｂ）は、ＦｃＲｎ－ＨＳＡ複合体、ＰＤＢコード４Ｎ０Ｆの結晶構造を有するＣＡ６４５ Ｆａｂ－ＨＳＡの重ね合わせを示す図である。ＦｃＲｎは、緑色で示した重鎖とオレンジ色で示した一般的なβ２－マイクログロブリン（β２Ｍ）から構成される。図３（Ｃ）は、赤色で示した、ミリスチン酸との複合体のＰＤＢコード１ＢＪ５、青色で示した、イブプロフェンとの複合体のＰＤＢコード２ＢＸＧ、及び赤紫色で示した、ワルファリンとの複合体のＰＤＢコード２ＢＸＤにおけるＣＡ６４５ Ｆａｂ－ＨＳＡとＨＳＡの結晶構造との重ね合わせを示す図である。アルブミンにおける７つの脂肪酸（ＦＡ）結合部位も標識されている。
【図4】ＣＡ６４５－ＨＳＡのＲｂＳＡとの重ね合わせを示す図である。図４（Ａ）は３６４位、図４（Ｂ）は３２０位、及び図４（Ｃ）は３５８位のアルブミン残基の周囲領域をクローズアップした投影図を示す図である。青色で示したＣＡ６４５重鎖；銀色で示したＣＡ６４５軽鎖；コムギ色で示したＨＳＡ；ピンク色で示したＲｂＳＡ。クラッシュは、互いに２Å以内にある異なる残基からの２個の重原子として定義され、黒丸によって示してある。
【図5】薬物動態を示す図である。ＣＡ６４５ Ｆａｂグラフトを１０ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内注射し、Ｆａｂの血清濃度を様々な時点でＥＬＩＳＡにより測定した。データは、最初の時点における最大濃度を考慮して正規化した。
【図6】血液中の遊離ＣＡ６４５ Ｆａｂ対ＭＳＡに対する親和性のパーセンテージを示す図である。質量作用二次方程式の解を使用して１～１０６ｎＭのＫＤ範囲について算出した遊離Ｆａｂの％（青色菱形）。４５それぞれ２．２ｎＭ、３１６ｎＭ、１１４６ｎＭ及び６２４００ｎＭのＭＳＡに対して親和性を有するグラフトｇＬ４ｇＨ５、ｇＬ５ｇＨ５、ｇＬ４ｇＨ３７及びｇＬ５ｇＨ４７の遊離Ｆａｂの％を赤色四角形で示している。
【図7】本開示の配列を示す図である。
【0107】
表１。抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）抗体の活性プロファイルを示す表である。２５μＭのアルブミン結合化合物（ワルファリン、イブプロフェン、ミリスチン酸、及び塩化銅）の存在下又は非存在下における１００ｎｇ／ｍｌのＨＳＡへの結合、及び１００ｎｇ／ｍｌのラット血清アルブミン（ＲＳＡ）への結合に関するＢ細胞上清中の分泌抗ＨＳＡ抗体の蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）スクリーニング。ＦＬ＝蛍光強度。ヒト及びマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に対する抗ＨＳＡウサギＦａｂ断片の平衡結合定数（ＫＤ）、並びに表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されたＨＳＡ、ＭＳＡ及びＲＳＡに対する等価ヒト化ＩｇＧ抗体の平衡結合定数。
【0108】
表２。異なる種由来の血清アルブミンに対するＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの親和性を示す表である。ＳＰＲによって決定された会合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度定数、並びに平衡結合定数（ＫＤ）。
【0109】
表３。Ｘ線データ収集及び精密化統計を示す表である。カッコ内の数値は、最高分解能シェルの値である。
【0110】
表４。ＣＡ６４５ Ｆａｂグラフトの結合動態及び薬物動態を示す表である。ＳＰＲによって決定された会合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度定数、並びに平衡結合定数（ＫＤ）。３匹のマウス（Ｍ１～３）／群に、１０ｍｇ／ｋｇで各ＣＡ６４５グラフトを静脈内投与した。各群の平均及び標準偏差（ＳＤ）を示した。＊は定常状態で測定された。
【0111】
表５。様々なグラフトに対する親和性を示す表である。
【0112】
表６。ｐＨ範囲５．０～７．０におけるＨＳＡに対するＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの親和性を示す表である。
【0113】
表７。（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）はＣＡ６４５ Ｆａｂグラフトの結合動態を示す表である。ＳＰＲによって決定された会合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度定数、並びに平衡結合定数（ＫＤ）。
【実施例0114】
抗体の発見
２匹のハーフロップウサギを、２００μｇのＨＳＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で皮下免疫した。完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を最初の用量で同時投与し、その後の用量は不完全フロイントアジュバントを含んでいた。Ｂ細胞をウサギ血清から採取し、７日間培養し、クローン増殖及び抗体分泌を誘導した。蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）を使用してＨＳＡへの結合について上清をスクリーニングした（２０～２２）。上清を、ビオチン化ヤギ抗ウサギＦｃ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅヒトアルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）と混合した。プレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ８２００細胞検出システムで読み取った。蛍光強度（ＦＬ）シグナルが最も高い４８ウェルをシングルマスタープレートに移し、２回の追加スクリーニング以外は前と同様にスクリーニングを繰り返した。あるスクリーニングにおいて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅヒトアルブミンは、２５μＭ溶液のアルブミン結合剤；ワルファリン、イブプロフェン、ミリスチン酸、及び塩化銅（すべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから個別に供給されたもの）と１時間プレインキュベートした。第２のスクリーニングでは、ＨＳＡを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）モノクローナル抗体標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用し、標識したラット血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で置き換えた。
２匹のハーフロップウサギを、２００μｇのＨＳＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で皮下免疫した。完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を最初の用量で同時投与し、その後の用量は不完全フロイントアジュバントを含んでいた。Ｂ細胞をウサギ血清から採取し、７日間培養し、クローン増殖及び抗体分泌を誘導した。蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）を使用してＨＳＡへの結合について上清をスクリーニングした（２０～２２）。上清を、ビオチン化ヤギ抗ウサギＦｃ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅヒトアルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）と混合した。プレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ８２００細胞検出システムで読み取った。蛍光強度（ＦＬ）シグナルが最も高い４８ウェルをシングルマスタープレートに移し、２回の追加スクリーニング以外は前と同様にスクリーニングを繰り返した。あるスクリーニングにおいて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅヒトアルブミンは、２５μＭ溶液のアルブミン結合剤；ワルファリン、イブプロフェン、ミリスチン酸、及び塩化銅（すべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから個別に供給されたもの）と１時間プレインキュベートした。第２のスクリーニングでは、ＨＳＡを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）モノクローナル抗体標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用し、標識したラット血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で置き換えた。
【0115】
個々のＨＳＡ特異的Ｂ細胞を蛍光フォーカス法により単離した（２０～２２）。陽性ウェルからのＢ細胞を、ビオチン化ＨＳＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）及びヤギ抗ウサギＦｃ断片フルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）と混合した。３７℃で１時間インキュベーションした後、抗原特異的Ｂ細胞を、そのＢ細胞を取り囲む蛍光ハローの存在によって同定することができた。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０顕微鏡及びエッペンドルフマイクロマニピュレーターを使用して個々のＢ細胞を同定し、ＰＣＲチューブに移した。単一細胞の重鎖及び軽鎖免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子をＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ウサギ重鎖ＣＨ１及びウサギ軽鎖Ｃκ領域をそれぞれ含有するＵＣＢ哺乳動物発現ベクターにクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現の後、抗ＨＳＡ組換えＦａｂを、ＨＳＡ及びＭＳＡに対するＳＰＲ結合アッセイにおいてさらにスクリーニングした。
【0116】
ヒト化
抗体Ｖ領域由来のＣＤＲをＶκ１及びＶＨ３ヒト生殖系列抗体Ｖ領域フレームワークにグラフトすることによって、アルブミン特異的抗体をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでヒト化した。ドナーからアクセプター配列にグラフト化されたＣＤＲは、Ｋａｂａｔら３２によって定義された通りであったが、Ｋａｂａｔらのループ構造の組み合わされた定義を使用したＣＤＲ－Ｈ１（残基２６～３５）は除く（２３）。抗原結合の保持にとって重要であると考えられる位置においてフレームワーク残基がドナーウサギ配列と受容体ヒト配列との間で異なる場合、そのとき、ドナー残基は最初の保存的グラフトに含まれていた（２１）。保存的グラフト遺伝子は、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ、ＧｍｂＨによって化学的に合成された。重鎖グラフト遺伝子（ｇＨ１）は、１つはヒトγ１ＣＨ１ドメインを含有し、もう１つは完全ヒトγ１定常領域を含有する２つのＵＣＢ発現ベクターにクローニングした。軽鎖グラフト遺伝子（ｇＬ１）は、ヒトカッパ定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）を含有するＵＣＢ発現ベクターにクローニングした。続いて、これらの構築物をオリゴヌクレオチド指向性変異誘発によって改変し、重鎖グラフト及び軽鎖グラフトの両方の多数の異なる変異体を作製した。重鎖ベクター及び軽鎖ベクターをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトし、ＳＰＲ結合アッセイを使用して組換えＦａｂ又はＩｇＧ分子をスクリーニングし、ＨＳＡ、ＭＳＡ、ＲＳＡ、ＣＳＡ、ＲｂＳＡ及びＢＳＡに対する親和性を測定した。
抗体Ｖ領域由来のＣＤＲをＶκ１及びＶＨ３ヒト生殖系列抗体Ｖ領域フレームワークにグラフトすることによって、アルブミン特異的抗体をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでヒト化した。ドナーからアクセプター配列にグラフト化されたＣＤＲは、Ｋａｂａｔら３２によって定義された通りであったが、Ｋａｂａｔらのループ構造の組み合わされた定義を使用したＣＤＲ－Ｈ１（残基２６～３５）は除く（２３）。抗原結合の保持にとって重要であると考えられる位置においてフレームワーク残基がドナーウサギ配列と受容体ヒト配列との間で異なる場合、そのとき、ドナー残基は最初の保存的グラフトに含まれていた（２１）。保存的グラフト遺伝子は、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ、ＧｍｂＨによって化学的に合成された。重鎖グラフト遺伝子（ｇＨ１）は、１つはヒトγ１ＣＨ１ドメインを含有し、もう１つは完全ヒトγ１定常領域を含有する２つのＵＣＢ発現ベクターにクローニングした。軽鎖グラフト遺伝子（ｇＬ１）は、ヒトカッパ定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）を含有するＵＣＢ発現ベクターにクローニングした。続いて、これらの構築物をオリゴヌクレオチド指向性変異誘発によって改変し、重鎖グラフト及び軽鎖グラフトの両方の多数の異なる変異体を作製した。重鎖ベクター及び軽鎖ベクターをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトし、ＳＰＲ結合アッセイを使用して組換えＦａｂ又はＩｇＧ分子をスクリーニングし、ＨＳＡ、ＭＳＡ、ＲＳＡ、ＣＳＡ、ＲｂＳＡ及びＢＳＡに対する親和性を測定した。
【0117】
抗体発現
抗体は、２９３Ｆｅｃｔｉｎ脂質トランスフェクション（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２３４７－０１９、製造業者の指示書による）を使用するＨＥＫ－２９３細胞、又はエレクトロポレーションを使用するＣＨＯ－Ｓ ＸＥ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１由来細胞系３３）のいずれかで一時的に発現させた。ＨＥＫ－２９３細胞を小規模発現（＜１００ｍｌ）に使用してＳＰＲ分析用の抗体を調製した。ＣＨＯ－Ｓ ＸＥ細胞は大規模発現（１リットル）に使用し、結晶学用及びｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態学的研究用の抗体を調製した。
抗体は、２９３Ｆｅｃｔｉｎ脂質トランスフェクション（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２３４７－０１９、製造業者の指示書による）を使用するＨＥＫ－２９３細胞、又はエレクトロポレーションを使用するＣＨＯ－Ｓ ＸＥ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１由来細胞系３３）のいずれかで一時的に発現させた。ＨＥＫ－２９３細胞を小規模発現（＜１００ｍｌ）に使用してＳＰＲ分析用の抗体を調製した。ＣＨＯ－Ｓ ＸＥ細胞は大規模発現（１リットル）に使用し、結晶学用及びｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態学的研究用の抗体を調製した。
【0118】
タンパク質精製
アフィニティークロマトグラフィーを使用し、培養上清からＦａｂタンパク質を精製した。上清をＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、カラム接触時間が２５分間となる流速で通過させた。ＰＢＳ ｐＨ７．４での洗浄工程の後、結合した物質を０．１ＭのグリシンｐＨ２．７で溶出し、２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中和した。Ｆａｂを含有する画分をプールし、２８０ｎｍの吸光度により定量し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。単量体の画分を単離するため、ｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用した。単量体Ｆａｂを含有する画分をプールし、定量し、濃縮し、４℃で保存した。
アフィニティークロマトグラフィーを使用し、培養上清からＦａｂタンパク質を精製した。上清をＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、カラム接触時間が２５分間となる流速で通過させた。ＰＢＳ ｐＨ７．４での洗浄工程の後、結合した物質を０．１ＭのグリシンｐＨ２．７で溶出し、２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中和した。Ｆａｂを含有する画分をプールし、２８０ｎｍの吸光度により定量し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。単量体の画分を単離するため、ｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用した。単量体Ｆａｂを含有する画分をプールし、定量し、濃縮し、４℃で保存した。
【0119】
表面プラズモン共鳴
抗体の相互作用に対する結合親和性及び動態パラメーターは、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）及びＨＢＳ－ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｐ２０、ｐＨ７．４）ランニングバッファーを使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００又はＢｉａｃｏｒｅ ３０００のいずれかで行った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。ｐＨ７．０、６．０、５．５及び５．０で分析するため、４０ｍＭのクエン酸、８０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｐ２０のランニングバッファーを使用した。必要なｐＨは、クエン酸のリン酸ナトリウムに対する比を変更することにより達成した。すべての実験は２５℃で実施した。抗体試料は、ヒトＦ（ａｂ’）２特異的又はヒトＦｃ特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のいずれかを使用し、センサーチップ表面に捕捉させた。捕捉抗体の共有結合固定化は、６０００～７０００応答単位（ＲＵ）のレベルまで、標準的なアミンカップリング化学によって達成された。
抗体の相互作用に対する結合親和性及び動態パラメーターは、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）及びＨＢＳ－ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｐ２０、ｐＨ７．４）ランニングバッファーを使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００又はＢｉａｃｏｒｅ ３０００のいずれかで行った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。ｐＨ７．０、６．０、５．５及び５．０で分析するため、４０ｍＭのクエン酸、８０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｐ２０のランニングバッファーを使用した。必要なｐＨは、クエン酸のリン酸ナトリウムに対する比を変更することにより達成した。すべての実験は２５℃で実施した。抗体試料は、ヒトＦ（ａｂ’）２特異的又はヒトＦｃ特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のいずれかを使用し、センサーチップ表面に捕捉させた。捕捉抗体の共有結合固定化は、６０００～７０００応答単位（ＲＵ）のレベルまで、標準的なアミンカップリング化学によって達成された。
【0120】
ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号００９－０００－０５１）、マウス（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ３５５９）、ラット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ６４１４）、ウサギ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ０７６４）、ウシ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号０５４７０）及びカニクイザル（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ、番号ＣＭＳＡ－００５０）アルブミンを捕捉抗体上で、５０ｎＭ～５００μＭの各種濃度で滴定した。各アッセイサイクルは、アルブミンの３分間注入からなる会合相の前に、１分間注入を使用して抗体試料を最初に捕捉することからなり、その後、その解離がモニターされた。各サイクルの後、捕捉表面を、４０ｍＭのＨＣｌによる１分間の注入２回、続いて５ｍＭのＮａＯＨの３０秒間の注入で再生した。使用した流速は、捕捉については１０μｌ／分、会合及び解離相の両方については３０μｌ／分、並びに再生については１０μｌ／分であった。ブランクのフローセルを基準減算のために使用し、バッファーブランク注入を機器のノイズ及びドリフトの減算のために含めた。キネティックパラメータは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ２．０．１及びＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ４．１．１を使用し、定常状態親和性モデルを使用してプリズムでフィッティングしたＣＡ６４５ ｇＬ５ｇＨ４７を除き、標準的な１：１結合モデルに対して結果として得たセンサーグラムを同時にグローバルフィッティングすることによって決定した。
【0121】
ＳＰＲによるＦｃＲｎのアルブミンへの結合能力に対するＣＡ６４５ Ｆａｂの効果を測定するため、２７０ＲＵ及び２４７ＲＵのそれぞれのレベルまで個別のフローセル上にＨＳＡ及びＭＳＡを固定化することによって調製したＣＭ５チップを用いてＢｉａｃｏｒｅ３０００機器を使用した。ＦｃＲｎ試料は、ランニングバッファー（１００ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ Ｐ２０、ｐＨ５．５）中５０ｎＭ～５０μＭの範囲で調製し、またそれらの試料は、ゼロ又は１００ｎＭのＣＡ６４５ Ｆａｂのいずれかを含有していた。各アッセイサイクルは１０μｌ／分の流速で行い、固定化アルブミンを予め飽和させるための１００ｎＭ ＣＡ６４５ Ｆａｂの５分間注入とそれに続くＣＡ６４５ Ｆａｂの存在下で調製した上記ＦｃＲｎ溶液の１つを５分間注入、又はランニングバッファーの５分間注入とそれに続くＣＡ６４５ Ｆａｂの非存在下での上記ＦｃＲｎ溶液の１つを５分間注入からなっていた。いずれの場合においても、３回目の５分間注入は、それぞれ、バッファー又は１００ｎＭのＣＡ６４５ Ｆａｂを含む、「同時注入」モードを使用し、２回目の注入の直後に続けて行った。ブランクのフローセルを基準減算のために使用し、ＦｃＲｎをバッファーで置き換えたブランクサイクルをドリフト及びノイズの減算のために含めた。サイクル再生は上記の通りであった。ＦｃＲｎのブランク補正プラトー結合レベルをＰｒｉｓｍにプロットし、定常状態モデルに適合させた。
【0122】
またｐＨ５．５での野生型及び変異体ＣＡ６４５ Ｆａｂの結合動態は、固定化アルブミンチップを使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００で逆フォーマットにて調べた。この場合、５～５０００ｎＭの範囲のＦａｂ溶液が５分間会合相及び解離相で注入されるサイクルを実施した。バッファーブランクサイクルもドリフトの補正に含まれていた。
【0123】
結晶学
複合体を調製するため、精製したＣＡ６４５ Ｆａｂ及び脂肪酸非含有ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ３７８２）を１：１のモル比で混合し、４℃で一晩インキュベートした。５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％（ｖ／ｖ）グリセロールで平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＣＡ６４５ Ｆａｂと複合体の両方を精製した。ＣＡ６４５ Ｆａｂ又は複合体のいずれかを含有する画分をプールし、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ及び７０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。結晶成長に好適な条件は、市販の結晶化スクリーン（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するシッティングドロップ蒸気拡散法によって同定した。
複合体を調製するため、精製したＣＡ６４５ Ｆａｂ及び脂肪酸非含有ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ３７８２）を１：１のモル比で混合し、４℃で一晩インキュベートした。５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％（ｖ／ｖ）グリセロールで平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＣＡ６４５ Ｆａｂと複合体の両方を精製した。ＣＡ６４５ Ｆａｂ又は複合体のいずれかを含有する画分をプールし、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ及び７０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。結晶成長に好適な条件は、市販の結晶化スクリーン（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するシッティングドロップ蒸気拡散法によって同定した。
【0124】
回折品質の結晶を生成するため、１μｌのタンパク質溶液を１μｌのリザーバー溶液と混合した、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使用した。ＣＡ６４５ Ｆａｂについては、リザーバーは５００μＬの２Ｍ ＤＬ－リンゴ酸を含有していた。結晶を採取し、液体窒素中で凍結保護剤を追加することなく急速凍結させた。２．６８Åへの回折データは、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫで、単結晶からＩ０４ビームラインで収集し、ＭＯＳＦＬＭ及びＳＣＡＬＡを使用して処理した（３４～３６）。ＣＡ６４５ Ｆａｂの構造は、サーチモデルとして組織内のＦａｂ構造の座標を使用し、Ｐｈａｓｅｒによる分子置換によって解明した。（３７）複合体に関しては、リザーバーは、５００μＬの０．１Ｍクエン酸 ｐＨ４．４、０．１Ｍのリン酸水素ナトリウム、３８％ｖ／ｖエタノール及び５％ｖ／ｖポリエチレングリコール１０００（ＰＥＧ１０００）を含有していた。この結晶を、２５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ１０００を含有する１μｌのリザーバーバッファーの液滴に、液滴中のＰＥＧ１０００の濃度が２０％に達するまで、複数回添加することによって凍結保護した。結晶応力を最小にするため、各添加は少なくとも１時間の間隔をおいた。結晶を採取し、液体窒素中で急速凍結した。３．５８Åへの回折データは、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫで、単結晶からＩ０２ビームラインで収集し、ＸＤＳを使用して処理した（３８）。複合体の構造は、ＣＡ６４５ Ｆａｂ構造の座標及びサーチモデルとしてのＨＳＡ（ＰＤＢコード４Ｇ０３）３９を使用し、Ｐｈａｓｅｒによる分子置換によって解明した。
【0125】
両方の初期構造は、ＣＮＳ４０、４１及びＣＯＯＴ４２を使用し、シミュレーテッドアニーリング、エネルギー最小化及びマニュアル再構築の反復サイクルで精密化した。複合体の分解能がかなり低いため、モデルは、精密化中、ＣＮＳのＤＥＮ機能を使用することにより抑制した。モデル形状は、Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ４３を使用して確認した。分子の可視化は、Ｐｙｍｏｌ４４で行った。データ収集及び精密化統計値を表３に要約する。
【0126】
受託コード
ＣＡ６４５ Ｆａｂ及びＣＡ６４５ Ｆａｂ－ＨＳＡ複合体の座標及び構造因子は、それぞれ受託コードＸ及びＹでＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に寄託されている。
ＣＡ６４５ Ｆａｂ及びＣＡ６４５ Ｆａｂ－ＨＳＡ複合体の座標及び構造因子は、それぞれ受託コードＸ及びＹでＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に寄託されている。
【0127】
マウスの薬物動態
３匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０ｍｇ／ｋｇで抗体を静脈内投与した。一連の血液試料を、投与後１００時間までの複数の時点で、尾静脈穿刺により収集した。血清を得るため、血液試料を室温で１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡにより抗体濃度について分析した。Ｆａｂ抗原及び抗ヒトカッパ鎖－西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｔｒａｔｅｃｈ）に対する抗体を、それぞれ捕捉抗体及び二次抗体として使用した。Ｆａｂ抗原の精製試料を標準として使用した。ＴＭＢペルオキシダーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してプレートを展開し、４５０ｎｍで読み取った（基準６３０ｎｍ）。薬物動態パラメーターは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．２ソフトウェアを使用し、最終データセットから算出した。
３匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０ｍｇ／ｋｇで抗体を静脈内投与した。一連の血液試料を、投与後１００時間までの複数の時点で、尾静脈穿刺により収集した。血清を得るため、血液試料を室温で１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡにより抗体濃度について分析した。Ｆａｂ抗原及び抗ヒトカッパ鎖－西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｔｒａｔｅｃｈ）に対する抗体を、それぞれ捕捉抗体及び二次抗体として使用した。Ｆａｂ抗原の精製試料を標準として使用した。ＴＭＢペルオキシダーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してプレートを展開し、４５０ｎｍで読み取った（基準６３０ｎｍ）。薬物動態パラメーターは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．２ソフトウェアを使用し、最終データセットから算出した。
【0128】
遊離ＣＡ６４５ Ｆａｂの算出
２０ｇマウスの血液２ｍｌ中の未結合Ｆａｂ（分子量＝４７９０７Ｄａ）の濃度を決定するため、１０ｍｇ／ｋｇでの投与後、以下の式を使用した：（３１）
遊離Ｆａｂ濃度ｘ＝（－ｂ＋ＳＱＲＴ（ｂ２－４ａｃ））／２ａ
式中、
ｂ＝（－（ＫＡ ＊［Ｔａｂ］）＋１＋（ＫＡ ＊［Ｔａｇ］））
ａ＝ＫＡ＝１／ＫＤ
ｃ＝（－［Ｔａｂ］）
ＫＤ＝Ｆａｂの親和性
ＫＡ＝結合の平衡定数
［Ｔａｂ］＝Ｆａｂの濃度（２０８７ｎＭ）
［Ｔａｇ］＝アルブミンの濃度（６００μＭ）
遊離Ｆａｂのパーセントを計算するには、遊離Ｆａｂ（％）＝（［遊離Ｆａｂ］／［Ｔａｂ］）＊１００
２０ｇマウスの血液２ｍｌ中の未結合Ｆａｂ（分子量＝４７９０７Ｄａ）の濃度を決定するため、１０ｍｇ／ｋｇでの投与後、以下の式を使用した：（３１）
遊離Ｆａｂ濃度ｘ＝（－ｂ＋ＳＱＲＴ（ｂ２－４ａｃ））／２ａ
式中、
ｂ＝（－（ＫＡ ＊［Ｔａｂ］）＋１＋（ＫＡ ＊［Ｔａｇ］））
ａ＝ＫＡ＝１／ＫＤ
ｃ＝（－［Ｔａｂ］）
ＫＤ＝Ｆａｂの親和性
ＫＡ＝結合の平衡定数
［Ｔａｂ］＝Ｆａｂの濃度（２０８７ｎＭ）
［Ｔａｇ］＝アルブミンの濃度（６００μＭ）
遊離Ｆａｂのパーセントを計算するには、遊離Ｆａｂ（％）＝（［遊離Ｆａｂ］／［Ｔａｂ］）＊１００
【0129】
結果
種の間の血清アルブミンに対するｍＡｂの生成及び特性決定
異種間の反応性を有する抗ＨＳＡ抗体のパネルを作製するため、２匹のウサギをＨＳＡで免疫化した。Ｂ細胞を血清から採取し、培養し、刺激してＩｇＧを分泌させ、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）を使用してスクリーニングし、抗原特異的ウェルを同定した（２０～２２）。さらなるＦＭＡＴスクリーニングは、公知のアルブミン結合化合物；ワルファリン、イブプロフェン、ミリスチン酸及び塩化銅の存在下又は非存在下において、ＲＳＡへの結合及びＨＳＡへの結合を評価した。５つの上位ランクの抗体に関するデータを表１に示す。ＨＳＡへの結合についての蛍光強度シグナルは、ＣＡ６４５で最も低かった。しかし、ＣＡ６４５は化合物の存在下において８０％の結合活性を保持したが、ＣＡ６４６、ＣＡ６４７、ＣＡ６４８及びＣＡ６４９は４０％しか保持しなかった。ＨＳＡ及びＲＳＡへの結合のレベルは、ＣＡ６４５及びＣＡ６４６において最も一致し、５倍以内であった。反対に、ＣＡ６４７、ＣＡ６４８及びＣＡ６４９によるＲＳＡへの結合のレベルは、ＨＳＡに関するものよりも９～１８倍低かった。
種の間の血清アルブミンに対するｍＡｂの生成及び特性決定
異種間の反応性を有する抗ＨＳＡ抗体のパネルを作製するため、２匹のウサギをＨＳＡで免疫化した。Ｂ細胞を血清から採取し、培養し、刺激してＩｇＧを分泌させ、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）を使用してスクリーニングし、抗原特異的ウェルを同定した（２０～２２）。さらなるＦＭＡＴスクリーニングは、公知のアルブミン結合化合物；ワルファリン、イブプロフェン、ミリスチン酸及び塩化銅の存在下又は非存在下において、ＲＳＡへの結合及びＨＳＡへの結合を評価した。５つの上位ランクの抗体に関するデータを表１に示す。ＨＳＡへの結合についての蛍光強度シグナルは、ＣＡ６４５で最も低かった。しかし、ＣＡ６４５は化合物の存在下において８０％の結合活性を保持したが、ＣＡ６４６、ＣＡ６４７、ＣＡ６４８及びＣＡ６４９は４０％しか保持しなかった。ＨＳＡ及びＲＳＡへの結合のレベルは、ＣＡ６４５及びＣＡ６４６において最も一致し、５倍以内であった。反対に、ＣＡ６４７、ＣＡ６４８及びＣＡ６４９によるＲＳＡへの結合のレベルは、ＨＳＡに関するものよりも９～１８倍低かった。
【0130】
５つの抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を回収するため、蛍光フォーカス法を使用して単一のＢ細胞を単離し、次いでＲＴ－ＰＣＲを実施した。可変領域を、ウサギ重鎖ＣＨ１及び軽鎖定常領域を含む発現ベクターにクローニングし、次いでＤＮＡを配列決定した。これにより、同一の重鎖配列を有するＣＡ６４５及びＣＡ６４６を除き、抗体配列が特有であることが明らかになった。ＣＡ６４５及びＣＡ６４６が重鎖を介して同一エピトープに結合しなければならないことを考慮すると、ＣＡ６４６結合がなぜリガンドの存在によってより影響を受けたのかは不明である。また、配列決定からは、抗体のすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒスチジン残基を欠失していることがわかった。これは、ヒスチジン残基が酸性ｐＨでプロトン化し、これが抗原結合を潜在的に破壊する可能性があることから、これらの抗体のさらなる展開にとって重要であった。
【0131】
ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション後、組換えＦａｂ分子を、ＨＳＡ及びマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に対する親和性について表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析した。ＣＡ６４５及びＣＡ６４６の両方が、ＨＳＡについては０．３１ｎＭ及び０．１４ｎＭで、ＭＳＡについては２．６ｎＭ及び１．６ｎＭで、それぞれ最も強い親和性を示した（表１）。さらに、ＨＳＡ及びＭＳＡに対するそれらの親和性は、すべての抗体と最も厳密に一致した。これは、ＨＳＡ及びＲＳＡに対するＢ細胞上清スクリーニングのデータと一致していた。
【0132】
リード候補のヒト化及び選択
５つのすべての抗体は、ＣＤＲをヒトＶκ１及びＶＨ３フレームワーク上にグラフト化し、結合活性の保持に重要であると考えられる位置にフレームワーク残基を逆変異させることによってヒト化した（２３）。ＣＡ６４５のヒト化のスキームを図１に示す。ウサギドナー重鎖のフレームワーク３領域（残基６６～９４）がヒトアクセプターフレームワーク配列のものよりも短いことに注目されたい。ＣＡ６４７及びＣＡ６４９は１残基だけ短いが、ＣＡ６４５及びＣＡ６４６（同一配列）及びＣＡ６４８は２残基だけ短い。すべての場合において、ギャップは最初の保存的ｇＬ１ｇＨ１グラフトに保持された。
５つのすべての抗体は、ＣＤＲをヒトＶκ１及びＶＨ３フレームワーク上にグラフト化し、結合活性の保持に重要であると考えられる位置にフレームワーク残基を逆変異させることによってヒト化した（２３）。ＣＡ６４５のヒト化のスキームを図１に示す。ウサギドナー重鎖のフレームワーク３領域（残基６６～９４）がヒトアクセプターフレームワーク配列のものよりも短いことに注目されたい。ＣＡ６４７及びＣＡ６４９は１残基だけ短いが、ＣＡ６４５及びＣＡ６４６（同一配列）及びＣＡ６４８は２残基だけ短い。すべての場合において、ギャップは最初の保存的ｇＬ１ｇＨ１グラフトに保持された。
【0133】
保存的グラフトはヒトＩｇＧ１抗体として発現させ、ＨＳＡ、ＭＳＡ及びＲＳＡへの結合についてＳＰＲにより分析した。ヒト化ＩｇＧは、組換え親ウサギＦａｂで観察されたものと同様にＨＳＡ及びＭＳＡへの結合傾向を示した（表１）。ＣＡ６４７、ＣＡ６４８及びＣＡ６４９のＨＳＡに対する親和性は、ＣＡ６４５及びＣＡ６４６のものと類似していたが、ＭＳＡに対する親和性は比較により６倍から１０倍の低減を示した。またＣＡ６４８及びＣＡ６４９のＲＳＡに対する親和性も、ＣＡ６４５及びＣＡ６４６との比較において５倍から１０倍の低減を示した。ＣＡ６４６は、ＣＡ６４５よりもＨＳＡ、ＭＳＡ及びＲＳＡに対してわずかに強い親和性を示したが、一過性発現収率は、１６１ｍｇ／ｍｌとの比較において３５ｍｇ／ｍｌで４倍低かった（表１）。公知のアルブミン結合剤の存在下におけるＨＳＡへの結合の最大近くの保持、複数の種にわたるアルブミンの一貫した結合活性及び一過性発現における良好な収率に基づいて、ＣＡ６４５をさらなる展開のリード候補として選択した。ＣＡ６４５ ｇＬ１ｇＨ１のさらなるグラフト変異体は、ウサギドナー残基をヒトアクセプター残基と置き換え、等価ヒト残基を有する重鎖のフレームワーク３のギャップを充填することによって作製した。グラフト変異体を、ＨＳＡに対する親和性及び一過性収量発現について評価した（データは示さず）。選択した最終的なグラフト対合はｇＬ４及びｇＨ５であった（図１）。
【0134】
ＨＳＡ、ＭＳＡ、ＲＳＡ及びウサギ血清アルブミン（ＲｂＳＡ）に対するＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの親和性は、それぞれ、４．６ｎＭ、７．１ｎＭ、５４ｎＭ及び１６２ｎＭであることが示された（表２）。重要なことには、カニクイザルの毒性研究及び疾患モデルにおけるＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの有用性について、カニクイザル血清アルブミン（ＣＳＡ）に対する親和性は、３．３ｎＭでのＨＳＡの親和性と極めて類似していた。さらに、ＣＡ６４５ Ｆａｂは、ウシ血清アルブミンに結合することができなかった。
【0135】
ＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂが初期エンドソームの酸性環境においてアルブミンに結合されたままであるか、細胞表面に再循環されるか否かを判定するために、親和性をｐＨ５．０～７．０で測定した（表Ｓ１）。ＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ ＦａｂのｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０及びｐＨ７．０でのＨＳＡに対する親和性は、７．１ｎＭ、１０．７ｎＭ、１２．５ｎＭ及び１３．３ｎＭであり、このことは、この生理学的に関連するｐＨの範囲内で結合がほとんど影響を受けないことを示唆している。
【0136】
ＨＳＡがＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの存在下においてＦｃＲｎに結合し得るか否かを決定するため、ＳＰＲを使用した。動態アッセイは、ＦｃＲｎによるアルブミンへの最適な結合が確実であるようにｐＨ５．５で行った。ＨＳＡ又はＭＳＡをセンサーチップに直接結合させ、次いでＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ ＦａｂをＣＡ６４５アルブミン結合部位に飽和させるか、又はランニングバッファーをフローセルに注入した。これに続き、ＦｃＲｎ＋ＣＡ６４５ Ｆａｂの注入、又はＦｃＲｎ単独の注入を行った。ＣＡ６４５結合部位の飽和を維持するため、ＣＡ６４５ ＦａｂをＦｃＲｎとの同時注入に含めた。図２は、ＣＡ６４５に関するシグナルを減算した後のＨＳＡ及びＭＳＡの両方に結合するＦｃＲｎのレベルを示す。両アルブミンに対するＦｃＲｎによる結合は、ＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの存在によって影響を受けなかった。
【0137】
結晶学
ＣＡ６４５がＨＳＡに結合する場所を同定するため、ＣＡ６４５ Ｆａｂ－ＨＳＡ複合体の結晶構造を決定した。ＣＡ６４５ Ｆａｂ－ＨＳＡ複合体タンパク質調製物を７０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し（２４）、沈殿剤としてエタノール及びＰＥＧ１０００を使用して結晶化させた。分子置換のある複合体についての構造の解明を促進するため、本発明者らはまた、非結合ＣＡ６４５ Ｆａｂの構造も決定した。本発明者らは、Ｆａｂ及びＦａｂ－ＨＳＡ複合体の両方の単一コピーを、それぞれの結晶の非対称単位で観察した（表３）。遊離Ｆａｂの構造は２．６８Åまで精密化され、最終Ｒｗｏｒｋ値は２１．１４％であり、Ｒｆｒｅｅ値は２５．１３％であった。複合体の構造は３．６Åまで精密化され、最終Ｒｗｏｒｋ値は２１．３８％であり、Ｒｆｒｅｅ値は２５．２３％であった。
ＣＡ６４５がＨＳＡに結合する場所を同定するため、ＣＡ６４５ Ｆａｂ－ＨＳＡ複合体の結晶構造を決定した。ＣＡ６４５ Ｆａｂ－ＨＳＡ複合体タンパク質調製物を７０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し（２４）、沈殿剤としてエタノール及びＰＥＧ１０００を使用して結晶化させた。分子置換のある複合体についての構造の解明を促進するため、本発明者らはまた、非結合ＣＡ６４５ Ｆａｂの構造も決定した。本発明者らは、Ｆａｂ及びＦａｂ－ＨＳＡ複合体の両方の単一コピーを、それぞれの結晶の非対称単位で観察した（表３）。遊離Ｆａｂの構造は２．６８Åまで精密化され、最終Ｒｗｏｒｋ値は２１．１４％であり、Ｒｆｒｅｅ値は２５．１３％であった。複合体の構造は３．６Åまで精密化され、最終Ｒｗｏｒｋ値は２１．３８％であり、Ｒｆｒｅｅ値は２５．２３％であった。
【0138】
ＣＡ６４５ Ｆａｂ－ＨＳＡ複合体の結晶構造は、ＣＡ６４５がＨＳＡのドメインＩＩに結合することを示した（図３Ａ）。ＨＳＡ（ＰＤＢコード４Ｎ０Ｆ）２５との複合体におけるＦｃＲｎの結晶構造の重ね合わせは、ＣＡ６４５がＨＳＡのＦｃＲｎへの結合を阻止しないことを示した（図３Ｂ）。ＨＳＡは、７つの脂肪酸（ＦＡ）結合部位を含む。部位ＦＡ７及びＦＡ３／ＦＡ４は、２つの主要な薬物結合部位である（２６）。また薬物は、より低い親和性で、部位ＦＡ１、ＦＡ５及びＦＡ６でも結合する。金属イオン結合部位は、ドメインＩ及びドメインＩＩの間並びにＮ末端の部位に位置している（２７）。ワルファリン（ＰＤＢコード２ＢＸＤ）２８、イブプロフェン（ＰＤＢコード２ＢＸＧ）２８、及びミリスチン酸（ＰＤＢコード１ＢＪ５）２９との複合体におけるＨＳＡの結晶構造との複合体の重ね合わせは、ＣＡ６４５が部位ＦＡ６の近くに結合し、主薬（ＦＡ７及びＦＡ３／ＦＡ４）、脂肪酸又は金属イオンの結合部位を閉ざさないことを示した（図３Ｃ）。
【0139】
ＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ ＦａｂのＨＳＡへの結合動態は、ＭＳＡ、ＣＳＡ、ＲＳＡ及びＲｂＳＡ（表２）のものと比較して、結晶構造を目視検査することによって説明することができる。ＨＳＡ上のエピトープは、残基Ｆ２０６、Ｇ２０７、Ｒ２０９、Ｃ３１６、Ｋ３１７、ＡＥＡＫＤ ３２０～３２４、Ｋ３５１、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ｃ３６１、Ａ３６２及びＡ３６４によって形成されている。ＣＳＡ（３．３ｎＭ）及びＭＳＡ（７．１ｎＭ）に対するＣＡ６４５の親和性は、ＨＳＡに対する親和性（４．６ｎＭ）と非常に似ている。これは、ＨＳＡにおいてエピトープを形成するのと同じ残基のＣＳＡ及びＭＳＡにおける存在によるものと思われる。ＲＳＡは、グリシンである３６４位を除き、これらの残基のすべてを共有する。３６４位は、２つのα－ヘリックス（３６６～３９８位及び３４２～３６１位）を一緒に連結する短いループ（３６２～３６５位）の先端に位置している（図４Ａ）。この短いループは、ＣＡ６４５重鎖のＣＤＲの１及び２によって結合されている。ＲＳＡに対するＣＡ６４５の親和性は、ＨＳＡに対する親和性よりも約１０倍低い。アラニン側鎖の非存在により、ＨＳＡと比較してループの柔軟性が増大し、結合動態が変化する可能性がある。
【0140】
ＲｂＳＡは、３２０、３５８及び３６４位を除いたすべてのＨＳＡエピトープ残基を共有する。ＲｂＳＡ（ＰＤＢコード３Ｖ０９）３０の結晶構造の重ね合わせは、３２０及び３５８位でＣＡ６４５ Ｆａｂと明らかなクラッシュを示し、３６４位で潜在的なクラッシュを示した。ＲｂＳＡにおいて、３６４位はアスパラギン酸であり、明らかなクラッシュはなく、この位置は接触残基であり、したがってＣＡ６４５による結合に影響すると思われる。ＨＳＡにおいて、３２０位はアラニンであり、ＣＤＲＨ２のＦ５８と疎水的相互作用を形成する（図４Ｂ）。ＲｂＳＡにおいて、３２０位はグルタミン酸であり、ＣＤＲＨ２残基Ｗ５２及びＦ５８とクラッシュしている。ＨＳＡ中における残基Ｅ３５８は、ＣＤＲＨ３のＳ１００及びＴ１００ａと水素結合ネットワークを形成する（図４Ｃ）。ＲｂＳＡにおける３５８位はリシンであり、ＣＤＲＨ３のＹ９９とクラッシュしている。ＲｂＳＡに対するＣＡ６４５のＨＳＡと比べて弱い親和性は、会合速度の低減が１８倍であることに完全に起因する（表２）。これは、３２０及び３５８位、並びに場合によっては３６４位のより大きな側鎖のＲｂＳＡにおける存在によって起こると思われる。
【0141】
親和性が低減した変異体の薬物動態学
ＣＡ６４５の半減期とアルブミンに対するその親和性との間の相関関係を調べるため、本発明者らは、広範囲の低減した親和性を有するＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの変異体のパネルを作製し、マウスにおける薬物動態特性を分析した。変異体は、ガイドとしてＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂ－ＨＳＡ複合体の結晶構造を使用して設計した。オリゴヌクレオチド指向性変異誘発を使用し、重鎖の６残基位置にわたる２０の変異体と軽鎖の６残基位置にわたる２７の変異体を作製した（表４、Ｓ２Ａ、Ｓ２Ｂ及びＳ２Ｃ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０ｍｇ／ｋｇで、ＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂと、Ｆａｂ変異体の４つのサブセット、ｇＬ５ｇＨ５、ｇＬ４ｇＨ３７、ｇＬ５ｇＨ３７及びｇＬ５ｇＨ４７を用いて単回静脈内注射により投与した。血液血清を１０３時間にわたってサンプリングし、ＦａｂのレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。
ＣＡ６４５の半減期とアルブミンに対するその親和性との間の相関関係を調べるため、本発明者らは、広範囲の低減した親和性を有するＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂの変異体のパネルを作製し、マウスにおける薬物動態特性を分析した。変異体は、ガイドとしてＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂ－ＨＳＡ複合体の結晶構造を使用して設計した。オリゴヌクレオチド指向性変異誘発を使用し、重鎖の６残基位置にわたる２０の変異体と軽鎖の６残基位置にわたる２７の変異体を作製した（表４、Ｓ２Ａ、Ｓ２Ｂ及びＳ２Ｃ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０ｍｇ／ｋｇで、ＣＡ６４５ ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂと、Ｆａｂ変異体の４つのサブセット、ｇＬ５ｇＨ５、ｇＬ４ｇＨ３７、ｇＬ５ｇＨ３７及びｇＬ５ｇＨ４７を用いて単回静脈内注射により投与した。血液血清を１０３時間にわたってサンプリングし、ＦａｂのレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。
【0142】
ＣＡ６４５ ｇＬ５ｇＨ３７は、ＳＰＲによるＨＳＡに対する検出可能な結合は示さず、わずか０．４８±０．０６時間の血清半減期で急速に消失した（表４）。これは、ラットで観察された抗ＴＮＦ Ｆａｂの短い半減期（０．７時間）と一致する（１９）。反対に、ｇＬ４ｇＨ５は、８４±４．６時間の有意に延長された半減期を示した。ｇＬ４ｇＨ５との薬物動態プロフィールに差がなかった親和性が最も弱い変異体は、ｇＬ５ｇＨ５であった（図５）。ｇＬ５ｇＨ５は、軽鎖に単一の変異のＷ３０Ａを含み、その親和性は４５３ｎＭであった。この親和性はｇＬ４ｇＨ５の親和性（１．２３ｎＭ）よりも３６８倍弱かったが、その半減期（９６．７±２０．４時間）はｇＬ４ｇＨ５の半減期と同等であった。ｇＬ４ｇＨ３７に関する薬物動態プロファイルでの変化が観察された。これは、重鎖において単一の変異であるＦ５８Ｅを有し、その親和性は９５５ｎＭであった。この親和性はｇＬ４ｇＨ５よりも７７６倍低かったが、半減期は６１±１６．８時間にまで延長していた。ｇＬ５ｇＨ４７は、軽鎖に１つの変異Ｗ３０Ａを含有し、重鎖に１つの変異Ｔ１００ａＳを含有しており、定常状態ＳＰＲによって測定した場合、５２μＭの親和性を有していた。この親和性はｇＬ４ｇＨ５の親和性より４２，２７６倍弱かったが、薬物動態プロファイルはｇＬ４ｇＨ３７と著しく異なることなく、半減期は２６．３±３．１時間に増加した。
【0143】
変異体は、ＨＳＡに対する親和性に基づき設計及び選択されたが、薬物動態モデルはマウスであった。したがって、ＨＳＡの変異体の親和性がマウスにおけるアルブミンに対する親和性を反映することを確認するため、ＳＰＲを繰り返した（表５）。ｇＬ４ｇＨ５及びｇＬ５ｇＨ５の親和性は、ＨＳＡに関しては１．８ｎＭ及び２５４ｎＭであり、同様にＭＳＡに関しては２．２ｎＭ及び３１６ｎＭであった。これらのデータは、それぞれ１．２３ｎＭ及び４５３ｎＭである、ＨＳＡに関するｇＬ４ｇＨ５及びｇＬ５ｇＨ５の以前に決定された親和性と一致していた。
【0144】
質量作用二次方程式の解を使用し、本発明者らは、各変異体についての血液中の遊離Ｆａｂの割合を推定することができる（３１）。ＭＳＡ（６５．９ｋＤａ）の濃度が４４ｇ／Ｌであり、２０ｇマウスの血液量が２ｍｌであると仮定した場合、１０ｍｇ／ｋｇの用量では、ＣＡ６４５ Ｆａｂ（４７．９ｋＤａ）の濃度は２０８７ｎＭである。図６は、１～１０６ｎＭの範囲における遊離Ｆａｂのアルブミンに対する親和性の割合のグラフを示す。２．２ｎＭのＭＳＡに対する親和性で、ｇＬ４ｇＨ５ Ｆａｂのちょうど０．０００３％が血液中で未結合であると予測される。ｇＬ５ｇＨ５ ＦａｂのＭＳＡに対する親和性は、３１６ｎＭである。これは、ｇＬ４ｇＨ５のものと一致する薬物動態プロファイル及び半減期を有し、０．０５％で同様に低いレベルの遊離Ｆａｂを有していると算出される。本発明者らは、ＭＳＡに対するｇＬ４ｇＨ３７及びｇＬ５ｇＨ４７ Ｆａｂの親和性を測定することはできなかった。しかし、ｇＬ４ｇＨ５及びｇＬ５ｇＨ５の親和性が両方ともＨＳＡよりもＭＳＡに対して１．２倍弱かったので（表５）、ｇＬ４ｇＨ３７及びｇＬ５ｇＨ４７の親和性は比例して１．２倍弱いと予測するのが適当である。したがって、１１４６ｎＭ及び６２．４μＭのＭＳＡに対する予測親和性では、ｇＬ４ｇＨ３７の０．１７％及びｇＬ５ｇＨ４７の８．５７％がそれぞれ潜在的に血液中に遊離していると算出される。
【0145】
【表1】
【0146】
【表2】
【0147】
【表3】
【0148】
【表4】
【0149】
【表5】
【0150】
【表6】
【0151】
【表7】
【0152】
【表8】
【0153】
【表9】
【0154】
（参考文献）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-05-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血清担体タンパク質に特異的なＶＨ及びＶＬを含む結合ドメインであって、該結合ドメインが、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）における１個又は２個のアミノ酸置換、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）における１個又は２個の変異、及びそれらの組合せからなる群から選択される改変によって変異しており、該変異した結合ドメインが、変異していない結合ドメインの半減期よりも長い又は短い半減期を有するが、但し、該変異は、配列番号１のＩ５０Ａ、Ｔ５６Ａ、Ｔ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｐ９７Ａ、Ｇ９８Ａ、Ｙ９９Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｔ１００Ａａ、Ｙ１００Ｃａ、Ｉ５０Ａ及びＴ９５Ａ、Ｉ５０Ａ及びＧ９８Ａ、Ｉ５０Ａ及びＹ９９Ａ、Ｔ５６Ａ及びＴ９５Ａ、Ｔ５６Ａ及びＧ９８Ａ、並びにＴ５６Ａ及びＹ９９Ａからなる群から選択される変異以外である、上記結合ドメイン、
上記結合ドメインを含む抗体分子、或いは
上記結合ドメイン又は上記抗体分子を含む医薬組成物。
上記結合ドメインを含む抗体分子、或いは
上記結合ドメイン又は上記抗体分子を含む医薬組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0153】
【表9】
本発明の態様には以下の好ましい態様が含まれる。
（１）
血清担体タンパク質に特異的なＶＨ及びＶＬを含む結合ドメインであって、該結合ドメインが、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）における１個又は２個のアミノ酸置換、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）における１個又は２個の変異、及びそれらの組合せから選択される改変によって変異しており、該変異した結合ドメインが、変異していない結合ドメインの半減期よりも長い又は短い半減期を有するが、但し、該変異は、配列番号１のＩ５０Ａ、Ｔ５６Ａ、Ｔ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｐ９７Ａ、Ｇ９８Ａ、Ｙ９９Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｔ１００Ａａ、Ｙ１００Ｃａ、Ｉ５０Ａ及びＴ９５Ａ、Ｉ５０Ａ及びＧ９８Ａ、Ｉ５０Ａ及びＹ９９Ａ、Ｔ５６Ａ及びＴ９５Ａ、Ｔ５６Ａ及びＧ９８Ａ、並びにＴ５６Ａ及びＹ９９Ａからなる変異以外である、上記結合ドメイン。
（２）
血清担体タンパク質がチロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１－酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン及びアルブミン、又はそれらのいずれかの断片から選択される、（１）に記載の結合ドメイン。
（３）
血清担体タンパク質がアルブミン、例えばヒト血清アルブミンである、（２）に記載の結合ドメイン。
（４）
アルブミンのドメインＩＩに結合する、（３）に記載の結合ドメイン。
（５）
変異がＶＬにおける少なくとも１つの置換である、（１）から（４）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（６）
変異がＶＬにおける１個のアミノ酸の置換である、（５）に記載の結合ドメイン。
（７）
変異がＶＬにおける２個のアミノ酸の置換である、（５）に記載の結合ドメイン。
（８）
変異がＬ１、Ｌ２、Ｌ３及びそれらの組合せから選択されるＣＤＲにある、（５）から（７）
までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（９）
ＣＤＲがＬ１である、（８）に記載の結合ドメイン。
（１０）
変異したアミノ酸（単数又は複数）が２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４及び３５位から独立して選択される、（９）に記載の結合ドメイン。
（１１）
位置が３０位である、（１０）に記載の結合ドメイン。
（１２）
関連する位置（単数又は複数）のアミノ酸が、例えば、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びグリシンから選択される疎水性残基、例えばアラニンによって置き換えられている、（１０）又は（１１）に記載の結合ドメイン。
（１３）
変異がＶＬに対する改変からなる、（５）から（１１）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（１４）
変異がＶＨドメインにある、（１）から（１２）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（１５）
変異がＶＨにおける１個のアミノ酸の置換である、（１４）に記載の結合ドメイン。
（１６）
変異がＶＨにおける２個のアミノ酸の置換である、（１４）に記載の結合ドメイン。
（１７）
変異がＨ１、Ｈ２、Ｈ３及びそれらの組合せから選択されるＣＤＲにある、（１５）又は（１６）に記載の結合ドメイン。
（１８）
ＣＤＲがＨ２及び／又はＨ３である、（１７）に記載の結合ドメイン。
（１９）
ＣＤＲがＨ２である、（１８）に記載の結合ドメイン。
（２０）
変異したアミノ酸（単数又は複数）が５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４又は６５位から独立して選択される、（１４）から（１９）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（２１）
関連する位置（単数又は複数）のアミノ酸が、例えば、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びグリシンから選択される疎水性残基、例えばアラニンによって置き換えられている、（２０）に記載の結合ドメイン。
（２２）
ＣＤＲがＨ３である、（１８）から（２１）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（２３）
変異したアミノ酸（単数又は複数）が９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６又は１０７位から独立して選択される、（２２）に記載の結合ドメイン。
（２４）
残基１０１が変異している、（２３）に記載の結合ドメイン。
（２５）
関連する位置（単数又は複数）のアミノ酸が、例えば、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びグリシンから選択される疎水性残基、例えばアラニンによって置き換えられている、（２３）又は（２４）に記載の結合ドメイン。
（２６）
１つ又は複数のアミノ酸置換が非保存的アミノ酸置換である、（１）から（２５）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（２７）
非保存的アミノ酸が天然アミノ酸のアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸から選択される、（２６）に記載の結合ドメイン。
（２８）
ＣＤＲグラフト化可変ドメインを含む、（１）から（２７）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（２９）
ヒト化されている、（２８）に記載の結合ドメイン。
（３０）
ヒト化結合ドメインがＶＨ及び／又はＶＬにおけるヒトフレームワークを含む、（２９）に記載の結合ドメイン。
（３１）
ＶＨフレームワークが、例えば１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸置換、例えばドナー残基であるアミノ酸を含む、ヒト（例えばＶＨ３ １－３ ３－２３などのＶＨ３）である、（３０）に記載の結合ドメイン。
（３２）
ＶＨが配列番号２、３、４、５若しくは６（特に５若しくは６）に示した配列、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれか１つの変異体、例えば配列番号２、３、４、５若しくは６（特に５若しくは６）に示した配列を有する、（３１）に記載の結合ドメイン。
（３３）
ＶＬフレームワークが、例えば１、２又は３個のアミノ酸置換、例えばドナー残基であるアミノ酸を含む、ヒト（例えば２－１－（１）Ｌ５などのＶκ１）である、（３０）から（３１）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（３４）
ＶＬドメインが配列番号６、７、８及び９から選択される配列、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれか１つの変異体、例えば配列番号６、７、８及び９（特に８若しくは９）から選択される配列を含む、（１）から（３３）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン。
（３５）
ＶＨ及びＶＬ配列が配列番号２及び６、２及び７、２及び８、２及び９、３及び６、３及び７、３及び８、３及び９、４及び６、４及び７、４及び８、４及び９、５及び６、５及び７、５及び８、並びに５及び９の組合せ、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれか１つの変異体若しくは複数の変異体から選択される、（３６）に記載の結合ドメイン。
（３６）
ＶＬ及びＶＨ配列がそれぞれ配列番号９及び配列番号３である、（３５）に記載の結合ドメイン。
（３７）
ＶＬ及びＶＨ配列がそれぞれ配列番号８及び配列番号４である、（３５）に記載の結合ドメイン。
（３８）
ＶＬ及びＶＨ配列がそれぞれ配列番号９及び配列番号５である、（３５）に記載の結合ドメイン。
（３９）
ＶＬ及びＶＨ配列がそれぞれ配列番号９及び配列番号４である、（３５）に記載の結合ドメイン。
（４０）
（１）から（３９）までのいずれか一項に記載の結合ドメインを含む抗体分子。
（４１）
（１）から（３９）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン又は（４０）に記載の抗体分子を含む医薬組成物。
（４２）
（１）から（３９）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン、（４０）に記載の抗体分子、又は（４１）に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、患者を処置する方法。
（４３）
処置で使用するための、（１）から（３９）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン、（４０）に記載の抗体分子、又は（４１）に記載の医薬組成物。
（４４）
処置で、特に、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、感染に関連する内毒素性ショック、関節炎、例えば関節リウマチ、喘息、例えば重度の喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、中枢神経系及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、狼瘡（例えば全身性エリテマトーデス）及びギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵臓炎、外傷（外科）、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心臓病、例えば心筋梗塞並びにアテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症、並びに、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵臓がん、食道がん、頭頚部がん、腎臓がん、特に腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん及び甲状腺がん、並びにその転移形態を含むがんからなる群から選択される処置で使用するための、（１）から（３９）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン、（４０）に記載の抗体分子、又は（４１）に記載の医薬組成物。
（４５）
例えば、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、感染に関連する内毒素性ショック、関節炎、例えば関節リウマチ、喘息、例えば重度の喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、中枢神経系及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、狼瘡（例えば全身性エリテマトーデス）及びギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵臓炎、外傷（外科）、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心臓病、例えば心筋梗塞並びにアテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症、並びに、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵臓がん、食道がん、頭頚部がん、腎臓がん、特に腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん及び甲状腺がん、並びにその転移形態を含むがんからなる群から選択される処置のための医薬の製造における、（１）から（３９）までのいずれか一項に記載の結合ドメイン、（４０）に記載の抗体分子、又は（４１）に記載の医薬組成物の使用。
【外国語明細書】