(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022116169
(43)【公開日】2022-08-09
(54)【発明の名称】抗マラリアワクチンとしてのバイオ融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220802BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220802BHJP
C12N 15/30 20060101ALI20220802BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220802BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220802BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220802BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220802BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220802BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220802BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220802BHJP
C07K 14/445 20060101ALI20220802BHJP
C07K 14/21 20060101ALI20220802BHJP
C07K 14/33 20060101ALI20220802BHJP
C07K 14/285 20060101ALI20220802BHJP
C07K 14/22 20060101ALI20220802BHJP
C07K 14/34 20060101ALI20220802BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220802BHJP
A61P 33/06 20060101ALI20220802BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220802BHJP
A61K 39/015 20060101ALI20220802BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20220802BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20220802BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/31
C12N15/30
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
C07K19/00
C07K14/445
C07K14/21
C07K14/33
C07K14/285
C07K14/22
C07K14/34
A61P37/04
A61P33/06
A61K48/00
A61K39/015
A61K47/64
A61K47/65
【審査請求】有
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022085159
(22)【出願日】2022-05-25
(62)【分割の表示】P 2019524114の分割
【原出願日】2017-07-21
(31)【優先権主張番号】16180544.5
(32)【優先日】2016-07-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】519022171
【氏名又は名称】ヴァック４オール・ピーティーイー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＣ４ＡＬＬ ＰＴＥ． ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ドリュイル，ピエール
(57)【要約】 （修正有）
【課題】抗マラリアワクチンとしての融合タンパク質を提供する。
【解決手段】担体異種タンパク質配列のＮ末端、及び／又は、Ｃ末端に融合された少なくとも１つの抗原性アミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、該抗原性配列がPlasmodiumタンパク質のエピトープ配列を含み、該担体異種タンパク質配列がヒトにおいて免疫原性の配列である、融合タンパク質を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】担体異種タンパク質配列のＮ末端、及び／又は、Ｃ末端に融合された少なくとも１つの抗原性アミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、該抗原性配列がPlasmodiumタンパク質のエピトープ配列を含み、該担体異種タンパク質配列がヒトにおいて免疫原性の配列である、融合タンパク質を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
担体異種タンパク質配列のＮ末端及び／又はＣ末端に融合された少なくとも１つの抗原性アミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、該抗原性配列がPlasmodiumタンパク質のエピトープ配列を含み、該担体異種タンパク質配列がヒトにおいて免疫原性の配列である、融合タンパク質。
【請求項2】
担体異種タンパク質配列が、ジフテリアトキソイドの交差反応物質（ＣＲＭ）、ジフテリアトキソイド（Ｄ）、非毒性突然変異体リコンビナントPseudomonas aeruginosaエキソプロテインＡ（ｒｅｐＡ）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、H. influenzaプロテインＤ（ｈｉＤ）及びそれらの免疫原性フラグメントからなる群より選択され、担体異種タンパク質配列が、好ましくは、ＣＲＭ１９７又はその免疫原性フラグメントであり、このフラグメントが、好ましくは、フラグメントＡ、膜貫通ドメインＴ、ＣＲＭ１９７のレセプター結合ドメインＲ、ＣＲＭ１９７のアミノ酸配列１～１９０及びＣＲＭ１９７のアミノ酸配列１～３８９からなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
抗原性配列が、赤血球期においてPlasmodiumによって発現される抗原性タンパク質又はそのエピトープフラグメントである、請求項１又は２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項4】
抗原性配列が、ＭＳＰ３、ＬＳＡ５（ＰＥＢＳ又は１１－１のサブ領域とも称される）、Ｇｌｕｒｐ Ｒ０及びＲ２、ＳＥＲＰ、Ｐ２７及びＰ２７Ａ、Ｐ４５、Ｐ９０及びＰ７７、Ｐ１４、Ｐ１８１、ＭＳＰ１－Ｂｌｏｃｋ ２、ＭＳＰ２、ＧＢＰ１３０、タンパク質３３２、タンパク質１１－１、ＭＳＰ４又はそれらの任意のエピトープフラグメントからなる群より選択され、抗原性配列が、好ましくは、ＭＳＰ３又はそのエピトープフラグメントであり、このフラグメントが、好ましくは、ＭＳＰ３－１、ＭＳＰ３－２、ＭＳＰ３－３、ＭＳＰ３－４、ＭＳＰ３－７及びＭＳＰ３－８の中から選択されるPlasmodium ＭＳＰ３タンパク質、好ましくはＭＳＰ３－１のＣ末端領域のモチーフａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及び／又はｆを包含する、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
抗原性配列が、前赤血球期においてPlasmodiumによって発現される抗原性タンパク質又はそのエピトープフラグメントである、請求項１又は２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項6】
抗原性配列が、ＬＳＡ３、ＬＳＡ５（ＰＥＢＳ又は１１－１のサブ領域と称される）、ＣＳ、Ｔｒａｐ及びＳａｌｓａ並びにそれらの任意のエピトープフラグメントからなる群より選択される、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
抗原性配列が、Ｐｆ２５、Ｐｆ４５／４８、Ｒｈ５、ＡＭＡ１、ＭＳＰ１－１９、ＭＳＰ１－４２、ＭＳＰ２、ＭＳＰ４－５、Ｖａｒ ＣＳＡ及びそれらの任意のエピトープフラグメントからなる群より選択される、請求項１又は２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項8】
担体配列としてのＣＲＭ１９７又はその免疫原性フラグメントに融合されたＭＳＰ３、好ましくはＭＳＰ３－１、ＬＳＡ３、ＬＳＡ５又はそのエピトープフラグメントを抗原性配列として含む、請求項１～６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項9】
担体タンパク質配列のＣ末端及びＮ末端にそれぞれ位置するか、又は同じ末端に両方とも位置する２つの抗原性配列を含む、請求項１～８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項10】
少なくとも１つのアミノ酸配列が、ペプチドリンカーによって担体異種タンパク質配列のＮ末端及び／又はＣ末端に連結されており、該ペプチドリンカーが、好ましくは、１～３５アミノ酸、好ましくは５～２０アミノ酸の配列である、請求項１～８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項11】
ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１～４、好ましくは１～３である）である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれかで定義される融合タンパク質をコードする、核酸構築物。
【請求項13】
発現カセットにおいて請求項１２に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項14】
請求項１３に記載のベクターが挿入されている、宿主細胞。
【請求項15】
請求項１～１１のいずれかで定義される融合タンパク質を調製するためのin vitro方法であって、請求項１２で定義される核酸構築物の発現を誘導する条件下で請求項１４に記載の宿主細胞の複製を可能にすること、及びこのようにして発現された該融合タンパク質を収集することを含む、in vitro方法。
【請求項16】
ワクチンであって、生理学的に許容し得るビヒクルと共に、請求項１～１１のいずれかで定義される融合タンパク質、又は少なくとも２つの異なる抗原性アミノ酸配列をそれぞれ含む少なくとも２つの請求項１～１１のいずれかで定義される融合タンパク質の組み合わせ、又は請求項１２で定義される前記融合タンパク質をコードする核酸構築物を含む、ワクチン。
【請求項17】
マラリアに対するヒト被験体のワクチン接種において使用するための、請求項１６に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マラリアに対する保護、より具体的には融合タンパク質を含むマラリアワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
ヒトにおけるマラリアの原因となる寄生虫（特に、Plasmodium falciparumを含む）は、ヒト宿主において異なる形態を示し、感染宿主の生物におけるそれらの局在に応じて異なる抗原を発現する。ヒトにおけるそれらの生活環におけるこれらの寄生虫の形態的及び抗原的な差異により、少なくとも４つの区別可能な発達段階が可能になる。ヒトにおける寄生虫の非常に初期の発達段階は、寄生虫の昆虫ベクターの咬傷によって宿主の血中に導入されるスポロゾイト形態に対応する。第２の段階は、肝臓への寄生虫の通過及び肝細胞の感染に対応し、この段階では、寄生虫は発達して肝臓シゾントを形成し、これらは成熟すると（例えば、P. falciparumの場合にはスポロゾイトの浸透後６日目に）、破裂によって肝臓メロゾイトを放出する。第３の段階は、無性形態（血液期シゾント）の寄生虫が赤血球に感染し、それらが成熟すると、遊離メロゾイトが放出されることを特徴とする；この赤血球期の発達は、疾患の病原相に対応する。第４の段階は、生殖能力を有する形態（又は生殖母体）の形成に対応し、これは、蚊における細胞外生殖形態又は配偶子になるであろう。
ヒトにおけるマラリアの原因となる寄生虫（特に、Plasmodium falciparumを含む）は、ヒト宿主において異なる形態を示し、感染宿主の生物におけるそれらの局在に応じて異なる抗原を発現する。ヒトにおけるそれらの生活環におけるこれらの寄生虫の形態的及び抗原的な差異により、少なくとも４つの区別可能な発達段階が可能になる。ヒトにおける寄生虫の非常に初期の発達段階は、寄生虫の昆虫ベクターの咬傷によって宿主の血中に導入されるスポロゾイト形態に対応する。第２の段階は、肝臓への寄生虫の通過及び肝細胞の感染に対応し、この段階では、寄生虫は発達して肝臓シゾントを形成し、これらは成熟すると（例えば、P. falciparumの場合にはスポロゾイトの浸透後６日目に）、破裂によって肝臓メロゾイトを放出する。第３の段階は、無性形態（血液期シゾント）の寄生虫が赤血球に感染し、それらが成熟すると、遊離メロゾイトが放出されることを特徴とする；この赤血球期の発達は、疾患の病原相に対応する。第４の段階は、生殖能力を有する形態（又は生殖母体）の形成に対応し、これは、蚊における細胞外生殖形態又は配偶子になるであろう。
【0003】
臨床診療に導入された実用的又は有効なワクチンはない。
【0004】
これまで、マラリアサブユニットワクチンは、免疫原性の大規模な欠如を示している。観察される免疫応答は、低力価で短期間のものである。この欠如に対処するために、アジュバントの選択、複合ベクター、例えばウイルス様粒子（ＶＬＰ）、アデノウイルスベクターにおける発現、及び複合プライムブーストプロトコールの設定を含む様々なアプローチが検証されている。ＡＳＯ１などの高性能アジュバントと共に、Plasmodium falciparumマラリア原虫の前赤血球スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）の反復及びＴ細胞エピトープ並びにＢ型肝炎ウイルスのウイルスエンベロープタンパク質（ＨＢｓＡｇ）由来の遺伝子を使用して操作されたＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０１ワクチン（Mosquirix（登録商標））でさえ、マラリア特異的免疫応答が非常に短期間であるという問題を抱えている（Ｂ型肝炎応答は長期にわたり高い）。
【0005】
担体タンパク質へのPlasmodium抗原の化学的コンジュゲーションも開示されている。例えば、解毒化形態のPseudomonas aeruginosaエキソプロテインＡ（ｒｅｐＡ）にコンジュゲートされたPlasmodiumタンパク質Ｐｆｓ２５Ｈを含むワクチンが評価中である。
【0006】
しかしながら、化学的コンジュゲーションは、いくつかの欠点を有する。それは、技術的な要求が厳しく、ほとんど再現性がなく、極めて高価である。
【0007】
再現容易かつ廉価でありながら、優れた免疫原性及びマラリアに対する保護を示すワクチン製品に対する大きな必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、ＣＲＭ１９７などの担体タンパク質と融合されたPlasmodiumポリペプチドからなる新規構築物によって、改善された免疫原性の利点を提供する。Plasmodium分子を担体タンパク質に化学的にカップリングするのではなく、本発明者らは、融合タンパク質として寄生虫タンパク質を担体タンパク質と一緒にコードして、例えばE.coliにおいてリコンビナントに生産可能な「バイオコンジュゲート融合産物」（本明細書では「バイオ融合分子」ともさらに表記される）を作製する新規アプローチを開発した。
【0009】
より具体的には、本発明は、担体異種タンパク質配列のＮ末端及び／又はＣ末端に融合された少なくとも１つの抗原性アミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、該抗原性配列がPlasmodiumタンパク質のエピトープ配列を含み、該担体異種タンパク質配列がヒトにおいて免疫原性の配列である融合タンパク質を提供する。
【0010】
抗原性配列は、赤血球期においてPlasmodiumによって発現される抗原性タンパク質又はそのエピトープフラグメントであり得る。
【0011】
あるいは、抗原性配列は、前赤血球期においてPlasmodiumによって発現される抗原性タンパク質又はそのエピトープフラグメントであり得る。
【0012】
本発明のさらなる目的は、本明細書で定義される融合タンパク質をコードする核酸構築物である。
【0013】
発現カセットにおいて核酸構築物を含むベクター、及びベクターが挿入されている宿主細胞も提供される。
【0014】
融合タンパク質を調製するためのin vitro方法であって、核酸構築物の発現を誘導する条件下で宿主細胞の複製を可能にすること、及びこのようにして発現された該融合タンパク質を収集することを含むin vitro方法がさらに記載される。
【0015】
本発明によれば、ワクチンであって、生理学的に許容し得るビヒクルと共に、前記融合タンパク質、又は少なくとも２つの異なる抗原性アミノ酸配列をそれぞれ含む少なくとも２つの融合タンパク質の組み合わせ、又は前記融合タンパク質をコードする核酸構築物を含むワクチンが提供される。
【0016】
このようなワクチンは、マラリアに対するヒト被験体のワクチン接種において有用である。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図3】ＩＭＡＣによって精製したリコンビナントタンパク質ＰＰ２１。（Ａ）変性条件下における電気泳動及びクマシーブルー染色による分析。（Ｂ）１：１０００希釈のマウス抗ＭＳＰ３免疫血清を用いたウエスタンブロッティングによって評価した抗原性。観察された上のバンドは、８４kDaの全長ＰＰ２１の理論分子量と一致する。抗ＭＳＰ３免疫血清によってあまり認識されなかった３７kDaの別のバンドは、ＰＰ２１の分解フラグメントに対応し得る。
【図4】１：１０００希釈の抗ＭＳＰ３－１ ｍＡｂ ＲＡＭ１を用いたウエスタンブロッティングによって評価した、異なる保存温度におけるＰＰ２１安定性のタイムスケール。
【図5】ポジティブコントロールＭＳＰ３－ＬＳＰと比較した、ＰＰ２１の抗原含有量の決定。ヒトリコンビナント抗体を含むヒト及び動物抗ＭＳＰ３血清の大規模パネルとの反応性によって、前臨床ＰＰ２１の抗原性を決定した。抗原含有量は、反応性エピトープの量のより正確な測定を提供する。抗原の系列希釈によってそれを実施し、Ｅｌｉｓａアッセイにおいてコーティングに使用し、十分に定義されたポジティブコントロール（ここでは、ＭＳＰ３のＣ末端領域によって免疫化したラットのプール）によって明らかにする。ＰＰ２１の反応性は、ＭＳＰ３合成及びリコンビナント構築物のものと同一であった
【図6】現行ＭＳＰ３－１－ＬＳＰと比較した、バイオ融合ＭＳＰ３－１コンジュゲートによる２回の免疫化後のマウスにおいて誘導された特異的抗体応答の有意な改善。０日目、１４日目及び２８日目に、Montanide ISA720中バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgのみ又はＭＳＰ３－１ ＬＳＰ １０μgのいずれかを使用して、マウス ５匹（ＢＡＬＢ／ｃ）又は４匹（Ｃ５７ＢＬ／６）の群を免疫化した。２回目の注射の１週間後（２１日目）（Ａ）及び３回目の免疫化の１週間後（３５日目）に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価を決定した。各マウス（１～５）の結果は、別個に示されている（ここでは、２回のみの免疫化後）。
【図7】現行ＭＳＰ３－１－ＬＳＰと比較した、バイオ融合ＭＳＰ３－１による２回対３回の免疫化後のマウスにおいて誘導された抗体応答の比較。３回目の注射は抗体応答を増強し、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス及びＢａｌｂ／ｃマウスにおけるバイオ融合ＭＳＰ３－１のより優れた免疫原性を裏付けた。バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgの３回の注射によって誘導されたＭＳＰ３－１－ＬＳＰ特異的抗体の平均力価は、それぞれＣ５７Ｂｌ／６及びＢａｌｂ／ｃにおいて３×１０５及び２×１０５に到達したのに対して、ＭＳＰ３－１－ＬＳＰ １０μgの３回の注射は、それぞれＣ５７Ｂｌ／６及びＢａｌｂ／ｃマウスにおいて最大で平均力価 １０５及び２．５×１０４を誘導した。
【図8-1】現行ＭＳＰ３－１－ＬＳＰと比較した、バイオ融合ＭＳＰ３－１によってマウスにおいて誘導されたＭＳＰ３－１特異的抗体の持続期間の大きな改善。Ａ及びＢ：バイオ融合ＭＳＰ３－ＣＲＭとＭＳＰ３－１－ＬＳＰとの比較：０日目、１４日目及び２８日目に、Montanide ISA720中バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgのみ又はＭＳＰ３－１ ＬＳＰ １０μgのいずれかを使用して、ＢＡＬＢ／ｃ（Ａ－左上パネル）及びＣ５７ＢＬ／６（Ｂ－右上パネル）マウスを免疫化した。経過観察全体の異なる日に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価を決定した。示されている結果は、異なる日に各群のマウスにおいて得られた抗ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価の幾何平均に対応する。１６０日間の経過観察後、バイオ融合ＭＳＰ３－１コンジュゲート免疫化マウスにおける平均抗体力価は、それぞれＣ５７ｂｌ／６及びＢａｌｂ／ｃにおいて１．５×１０５及び１０５であったが、これは、初回免疫化後１６０日目に測定した、ＭＳＰ３－１－ＬＳＰによって誘導された抗体の平均力価よりも少なくとも１０倍高い。Ｃ及びＤ：ＭＳＰ３－ＣＲＭによって誘発された免疫応答の長期持続：０日目、１４日目及び１０３日目に、Montanide ISA 720アジュバント（v/v）をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－ＣＲＭ １μgの皮下注射によって、Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７Ｂｌ６マウスの群（マウス ４～５匹／群）を免疫化した。異なる日に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３抗体力価を決定した。結果は、２回の免疫化後に力価が顕著に増加し、４９日目に最大に到達するのに対して、１０３日目に実施した３回目の抗原注射は、抗体応答の規模に関するいかなる検出可能な増加も誘導しなかったことを示している。これらの特異的抗体は、時間と共にごくわずかに減少したが、免疫化の５４０日後においてさえ、高い力価で依然として検出可能であった。Ｅ：２回のみの免疫化後にＭＳＰ３－ＣＲＭによって誘発された免疫応答の長期持続。２回のみの免疫化後に観察された十分な応答を考慮して、Montanide ISA 720アジュバント（v/v）をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－ＣＲＭ ２μgを使用して０日目及び１４日目のみに皮下注射によって免疫化したさらなるＢａｌｂ／ｃマウス １７匹において、この免疫化スキームを分析した。異なる日に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１－ＬＳＰ抗体力価を決定した。結果は、２回の抗原注射後にＭＳＰ３抗体力価が増加し、全てのマウスにおいて４２～７２日目に最大に到達することを示しており、実験の３８０日間の経過観察全体で、免疫応答がごくわずかに減少したことを示している。
【図8-2】現行ＭＳＰ３－１－ＬＳＰと比較した、バイオ融合ＭＳＰ３－１によってマウスにおいて誘導されたＭＳＰ３－１特異的抗体の持続期間の大きな改善。Ａ及びＢ：バイオ融合ＭＳＰ３－ＣＲＭとＭＳＰ３－１－ＬＳＰとの比較：０日目、１４日目及び２８日目に、Montanide ISA720中バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgのみ又はＭＳＰ３－１ ＬＳＰ １０μgのいずれかを使用して、ＢＡＬＢ／ｃ（Ａ－左上パネル）及びＣ５７ＢＬ／６（Ｂ－右上パネル）マウスを免疫化した。経過観察全体の異なる日に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価を決定した。示されている結果は、異なる日に各群のマウスにおいて得られた抗ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価の幾何平均に対応する。１６０日間の経過観察後、バイオ融合ＭＳＰ３－１コンジュゲート免疫化マウスにおける平均抗体力価は、それぞれＣ５７ｂｌ／６及びＢａｌｂ／ｃにおいて１．５×１０５及び１０５であったが、これは、初回免疫化後１６０日目に測定した、ＭＳＰ３－１－ＬＳＰによって誘導された抗体の平均力価よりも少なくとも１０倍高い。Ｃ及びＤ：ＭＳＰ３－ＣＲＭによって誘発された免疫応答の長期持続：０日目、１４日目及び１０３日目に、Montanide ISA 720アジュバント（v/v）をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－ＣＲＭ １μgの皮下注射によって、Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７Ｂｌ６マウスの群（マウス ４～５匹／群）を免疫化した。異なる日に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３抗体力価を決定した。結果は、２回の免疫化後に力価が顕著に増加し、４９日目に最大に到達するのに対して、１０３日目に実施した３回目の抗原注射は、抗体応答の規模に関するいかなる検出可能な増加も誘導しなかったことを示している。これらの特異的抗体は、時間と共にごくわずかに減少したが、免疫化の５４０日後においてさえ、高い力価で依然として検出可能であった。Ｅ：２回のみの免疫化後にＭＳＰ３－ＣＲＭによって誘発された免疫応答の長期持続。２回のみの免疫化後に観察された十分な応答を考慮して、Montanide ISA 720アジュバント（v/v）をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－ＣＲＭ ２μgを使用して０日目及び１４日目のみに皮下注射によって免疫化したさらなるＢａｌｂ／ｃマウス １７匹において、この免疫化スキームを分析した。異なる日に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１－ＬＳＰ抗体力価を決定した。結果は、２回の抗原注射後にＭＳＰ３抗体力価が増加し、全てのマウスにおいて４２～７２日目に最大に到達することを示しており、実験の３８０日間の経過観察全体で、免疫応答がごくわずかに減少したことを示している。
【図8-3】現行ＭＳＰ３－１－ＬＳＰと比較した、バイオ融合ＭＳＰ３－１によってマウスにおいて誘導されたＭＳＰ３－１特異的抗体の持続期間の大きな改善。Ａ及びＢ：バイオ融合ＭＳＰ３－ＣＲＭとＭＳＰ３－１－ＬＳＰとの比較：０日目、１４日目及び２８日目に、Montanide ISA720中バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgのみ又はＭＳＰ３－１ ＬＳＰ １０μgのいずれかを使用して、ＢＡＬＢ／ｃ（Ａ－左上パネル）及びＣ５７ＢＬ／６（Ｂ－右上パネル）マウスを免疫化した。経過観察全体の異なる日に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価を決定した。示されている結果は、異なる日に各群のマウスにおいて得られた抗ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価の幾何平均に対応する。１６０日間の経過観察後、バイオ融合ＭＳＰ３－１コンジュゲート免疫化マウスにおける平均抗体力価は、それぞれＣ５７ｂｌ／６及びＢａｌｂ／ｃにおいて１．５×１０５及び１０５であったが、これは、初回免疫化後１６０日目に測定した、ＭＳＰ３－１－ＬＳＰによって誘導された抗体の平均力価よりも少なくとも１０倍高い。Ｃ及びＤ：ＭＳＰ３－ＣＲＭによって誘発された免疫応答の長期持続：０日目、１４日目及び１０３日目に、Montanide ISA 720アジュバント（v/v）をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－ＣＲＭ １μgの皮下注射によって、Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７Ｂｌ６マウスの群（マウス ４～５匹／群）を免疫化した。異なる日に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３抗体力価を決定した。結果は、２回の免疫化後に力価が顕著に増加し、４９日目に最大に到達するのに対して、１０３日目に実施した３回目の抗原注射は、抗体応答の規模に関するいかなる検出可能な増加も誘導しなかったことを示している。これらの特異的抗体は、時間と共にごくわずかに減少したが、免疫化の５４０日後においてさえ、高い力価で依然として検出可能であった。Ｅ：２回のみの免疫化後にＭＳＰ３－ＣＲＭによって誘発された免疫応答の長期持続。２回のみの免疫化後に観察された十分な応答を考慮して、Montanide ISA 720アジュバント（v/v）をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－ＣＲＭ ２μgを使用して０日目及び１４日目のみに皮下注射によって免疫化したさらなるＢａｌｂ／ｃマウス １７匹において、この免疫化スキームを分析した。異なる日に、血液サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１－ＬＳＰ抗体力価を決定した。結果は、２回の抗原注射後にＭＳＰ３抗体力価が増加し、全てのマウスにおいて４２～７２日目に最大に到達することを示しており、実験の３８０日間の経過観察全体で、免疫応答がごくわずかに減少したことを示している。
【図9】ＭＳＰ３－１－ＬＳＰと比較した、バイオ融合ＭＳＰ３－１で免疫化したマウスにおいて誘導された抗体によるＭＳＰ３－１ ＡＤＣＩ（Ａｂ依存性細胞阻害）ターゲットエピトープの認識の改善。ＭＳＰ３－１－ＬＳＰでは、ペプチド「ｂ」、「ｃ」及び「ｄ」は、抗ＭＳＰ３－１抗体の保護効果と相関するＡＤＣＩアッセイにおいて有効な抗体によってターゲティングされる区別可能なＢ細胞エピトープを規定する。バイオ融合ＭＳＰ３－１がこれらのエピトープに対する抗体を誘導する能力を評価するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡによって、血清中のペプチドａ、ｂ、ｃ及びｄに対する抗体の力価を決定した。したがって、新規製剤によって認識されるＡＤＣＩターゲットの数はかなり広範であり、力価はより高い。０日目、１４日目及び２８日目に、Montanide ISA720中バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgのみ又はＭＳＰ３－１ ＬＳＰ １０μgのいずれかを使用して、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。３回目の免疫化の１週間後（３５日目）に、血液サンプルを収集した。マウス血清を１／４００希釈し、ＥＬＩＳＡによって、異なるＭＳＰ３－１ペプチド（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）の特異的抗体の力価を決定した。示されている結果は、試験した各マウスの血清を用いて得られた光学濃度に対応する。
【図10】バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μg、現行ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ １０μg又はＭＳＰ３－１ Ｃ末端リコンビナントタンパク質 １０μgのいずれかで免疫化したＨＩＭＭモデル（ヒト免疫原性マウスモデル）におけるヒト抗体応答。１μg/ml 抗原を用いてin vitroで刺激した又は刺激していないヒト脾臓細胞をＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ－ＩＬ２ｒｇｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに移植した（マウス ４匹／群）。各ＮＳＧマウスに、抗原プライミング又は非プライミング脾臓細胞 ３０×１０６個の腹腔内注射（ｉｐ）を投与した。７日目及び２１日目に、バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μg又はＭＳＰ３－１－ＬＳＰ １０μg又はＭＳＰ３－１ Ｃ末端リコンビナントタンパク質 １０μgで再構成マウスを追加免疫化した。Montanide ISA 720（v/v）を全ての抗原にアジュバント添加し、腹腔内注射（ｉｐ）した。非プライミング脾臓細胞で再構成したマウスにアジュバントのみを投与した。各免疫化の１週間後に、血液サンプルを収集した。全ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ及び特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって、特異的抗体を分析した。以下の式：（抗原特異的抗体力価／全ヒトＩｇＧ濃度）×１０を使用して、調整特異的抗体力価を計算した（１０mg/mlを平均ヒト全ＩｇＧ濃度とみなす）。ＥＬＩＳＡ力価の幾何平均値（９５％ＣＩ）が表されている。
【図11】バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μg、現行ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ １０μg又はＭＳＰ３－１ Ｃ末端リコンビナントタンパク質 １０μgのいずれかで免疫化したＨＩＭＭモデル（ＨｕリンパＮＳＧマウス）におけるヒトＩＦＮ－γ細胞応答。上記と同じ免疫化条件。ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴによって、細胞応答を評価した。２８日目に、各群のマウスの脾臓細胞を回収し、プールし、抗原刺激ありで又は抗原刺激なしでin vitro培養した。示されている結果は、各群のマウスを用いて得られた特定のスポット形成細胞（ＳＦＣ）に対応する。
【図12】ＨＩＭＭにおけるＴ細胞応答：バイオコンジュゲートＰＰ２１ １μg又はＭＳＰ３－ＬＳＰ １０μgのいずれかによって免疫化したマウスに移植したヒトリンパ球におけるＣＤ４－Ｔｈ１応答の顕著な改善。
【図13】バイオ融合ＭＳＰ３－１で免疫化したＨＩＭＭモデルにおいて誘発されたヒト抗体による寄生虫ネイティブタンパク質の認識の改善。ヒト脾臓細胞をＮＳＧマウスに移植し、（図６に記載されているように）バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μg、現行ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ １０μg又はＭＳＰ３－１ Ｃ末端リコンビナントタンパク質 １０μgのいずれかで免疫化した。３Ｄ７ Plasmodium falciparum（Ｐｆ）感染赤血球に対する免疫蛍光抗体検査（ＩＦＡＴ）によって、２８日目のマウス血清中のヒト抗体と寄生虫タンパク質との反応性（これは、マラリア発作中にＡＤＣＩ防御機構を活性化するための重要な特徴である）を評価した。示されている結果は、各群のマウスを用いて得られた力価の範囲に対応する。
【図14】バイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgで免疫化したＨＩＭＭモデルにおいて誘発されたヒト抗体応答は、ワクチン調製に使用したアジュバントに依存しない。（Ａ）（図６に記載されているように）Montanide ISA 720をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgで刺激した又は刺激していない２人の異なるドナー由来のヒト脾臓細胞をＮＳＧマウスに移植した（マウス ４匹／群／ドナー）。（Ｂ）（区別可能なドナー由来のヒトリンパ球である以外は図６に記載されているように）Montanide ISA 720に代えてMF59をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgで刺激した（マウス ９匹）又は刺激していない（マウス ８匹）ヒト脾臓細胞をＮＳＧマウスに移植した。両方の場合において、２８日目に、ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価を決定した。示されている結果は、各群のマウスを用いて得られたＥＬＩＳＡ力価の平均±ＳＤに対応する。
【図15】Montanide ISA 720をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－１で免疫化したＨＩＭＭモデルにおけるヒトリンパ球において誘発されたヒトＩｇＧ抗体の抗体サブクラス。（図１０に記載されているように）ＭＳＰ３バイオ融合物 １μgで刺激した又は刺激していないヒト脾臓細胞をＮＳＧマウスに移植した。２８日目に収集したマウス血清を１／２０希釈した。サブクラスＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価を決定した。示されている結果は、免疫化及び非免疫化マウスを用いて得られた光学密度の平均±ＳＤに対応する。
【図16】MF59をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－１で免疫化したＨＩＭＭモデルにおいて誘発されたヒトＩｇＧ抗体のサブクラス。（図１４に記載されているように）MF59をアジュバント添加したバイオ融合ＭＳＰ３－１ １μgで刺激した又は刺激していないヒト脾臓細胞をＮＳＧマウスに移植した。２８日目に収集したマウス血清を１／２０希釈した。応答マウスの血清においてサブクラスＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって、特異的ＭＳＰ３－１ ＬＳＰ抗体力価を決定した。示されている結果は、免疫化及び非免疫化マウスを用いて得られた光学密度の平均±ＳＤに対応する。両アジュバントは、細胞親和性サブクラスＩｇＧ１の優位を確立させた。
【図17】ＢａｌｂｃマウスにおけるＰＰ２１／ＰＰ２１－montanide ０．２若しくは１μg（左上及び右上パネル）又はＣ５７ｂｌマウスにおける同じ用量（左下及び右下パネル）の免疫原性。図６～８のように決定した抗ＭＳＰ３－１－ＬＳＰ抗体力価の推移。
【図18】他のＭＳＰ３ファミリーメンバータンパク質を用いてＰＰ２１によって誘発された抗ＭＳＰ３－１抗体の交差反応性（ＥｌｉｓａによるＯＤ値）。Ｃ５７Ｂｌ／６（Ｃ）及びＢａｌｂ／ｃ（Ｂ）マウスに、ＰＰ２１ ４μgの２回の注射（Ｊ０、Ｊ１４）を投与した。６３日目に、サンプルを収集した。
【図19】Ｃ５７ＢＬ（Ｃ）及びＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂ）における、水酸化ミョウバンをアジュバント添加したＰＰ２１の免疫原性（用量 １μg／免疫化）。２回の免疫化又は３回の免疫化後に、Ｃ５７ＢＬ（Ｃ）及びＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｂ）においてＥｌｉｓａによって決定した抗体力価が示されている。２５：６００よりも高い希釈度は試験しなかった。対照的に、ミョウバンＯＨ（これは、ヒトでは強力なアジュバントであり、高いＴｈ１応答をもたらす）は、通常、齧歯類では不十分なアジュバントであるが、ＰＰ２１による強い応答を依然として誘導したことに留意すべきである。
【図20】南米Saimiri sciureusサルにおけるバイオ融合コンジュゲートＰＰ２１の高い免疫原性。０日目、２８日目及び１１２日目に、Primate Center of Belem, Brasilの動物舎において飼育下で生まれたSaimiri sciureus南米サルを、Montanide Isa 720をアジュバント添加したＰＰ２１ １μgの皮下投与によって免疫化した（Montanideのみを投与したコントロール（平線）と比較した点線）。ＭＳＰ３－ＬＳＰ抗原に対するＥｌｉｓａによって、並びにＩＦＡＴ及びＷＢによって、抗体を決定した（示さず）。免疫化 １回当たり抗原 ０．１μgのみを使用した場合であっても、免疫応答は約５倍低かった（すなわち、依然として非常に有意であった）（示さず）。
【図21】Montanide ISA720中ＰＰ２５ １μg又はMontanide ISA720中ＬＳＡ３－７２９ １０μgのいずれかを投与したＢａｌｂ／ＣマウスにおいてＬＳＡ３－ＣＲＭ（ＰＰ２５）対ＬＳＡ３－７２９によって誘発された抗体応答。０日目、７日目、２８日目に免疫化し、４５日目に血清収集した。
【図22】ＤＧ７２９によってin vitroでチャレンジしたＬＳＡ３－ＣＲＭ（ＰＰ２５）対ＬＳＡ３－７２９免疫化Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて誘発されたＩＦＮγ（ＥＬＩＳＰＯＴ）。
【図23】ＨＩＭＭにおける抗ＬＳＡ３－７２９ヒト抗体応答及び結果の改善の再現性：２人のヒトドナー≪Ａ≫及び≪Ｂ≫由来のリンパ球を使用した、ＨＩＭＭにおけるＬＳＡ３－ＣＲＭ構築物ＰＰ２５に対する抗ＬＳＡ３－７２９ヒト抗体応答
【図24】ＰＰ２５によって誘発された免疫応答の持続期間の改善。
【図25】ＨｕＨ７．５におけるP. falciparum肝臓期発達のための新規宿主細胞を開発し、ヒト初代肝細胞（ＨＰＨ）と比較した。図は、マウスポリクローナル抗ＰｆＨｓｐ－７０で免疫染色した、スポロゾイト感染の４日後、５日後及び７日後における肝臓シゾントの代表的なサンプルを示す。倍率 ４００倍、スケールバー １０μm。７日目に、ＨＰＨにおいて十分なＬＳを見出すことは困難であった。その後、機能的アッセイにおいてこのヘパトーマモデルを用いて、肝細胞へのスポロゾイトの侵入を阻害することができる抗体を測定した。
【図26】抗ＰｆＬＳＡ３抗体による、Ｈｕ７．５ヘパトーマ細胞（ＩＬＳＤＡ）におけるスポロゾイト侵入の阻害。ネイティブなタンパク質に対する抗ＬＳＡ３反応性（ＩＦＡＴアッセイによる）と、肝臓期発達阻害アッセイ（ＩＬＳＤＡ）における機能的阻害効果との間の相関が示されている。より小さなグラフは、抗スポロゾイト周囲ｍＡｂ ２Ａ１０を使用した同じアッセイを示す。
【図27】ＨＩＭＭモデルに移植したヒトリンパ球では、構築物ＰＰ２３（ＭＳＰ３－２－ＣＲＭＰ９７－ＭＳＰ３－３）によって、強いＢ細胞応答及びＴ細胞応答が誘発された。上パネル（Ａ）は抗体応答を示し、中央パネル（Ｂ）はアイソタイプ分布（これは、ＡＤＣＩ機構において単球と協調して作用することができる主要な細胞親和性クラスであるＩｇＧ１クラスが優位である）を示す。下パネル（Ｃ）は、ＭＳＰ３－２又はＭＳＰ３－３のいずれかによってin vitroで再刺激したＩＦＮ－γ分泌によって評価したＴ細胞応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
発明の詳細な説明
定義
「ワクチン」は、疾患の予防及び／又は治療のために免疫を発生させるための組成物を意味すると理解すべきである。したがって、ワクチンは、抗原を含む医薬であり、ワクチン接種によって特定の防御及び保護物質を生成するために、ヒト又は動物において使用されることを目的とする。本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、マラリアに対する部分的又は完全な保護を誘発することができる免疫原性組成物を意味する。ワクチンは、感染に対して予防的であり得、及び／又は感染個体において治療的であり得る。
定義
「ワクチン」は、疾患の予防及び／又は治療のために免疫を発生させるための組成物を意味すると理解すべきである。したがって、ワクチンは、抗原を含む医薬であり、ワクチン接種によって特定の防御及び保護物質を生成するために、ヒト又は動物において使用されることを目的とする。本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、マラリアに対する部分的又は完全な保護を誘発することができる免疫原性組成物を意味する。ワクチンは、感染に対して予防的であり得、及び／又は感染個体において治療的であり得る。
【0019】
「免疫原性」という用語は、それが指す組成物又はタンパク質が、投与により免疫応答を誘導することができることを意味する。被験体における「免疫応答」は、抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答、又は体液性及び細胞性免疫応答を含む、適応免疫応答及び／又は先天性免疫応答の発生を指す。「体液性免疫応答」は、抗体によって媒介されるものを指す。
【0020】
この文書で使用される場合、「保護」又は「予防」という用語は、Plasmodium寄生虫との接触後における疾患の症候の非存在又は軽減した症候の存在を指す。特に、「マラリアの予防」という用語は、マラリアの原因となるPlasmodiumとの接触後の処置被験体における症候の非存在又は軽減した症候の存在を指す。
【0021】
「患者」又は「被験体」は、典型的には、哺乳動物被験体、好ましくはヒト被験体である。被験体は、男性又は女性、子供又は成人であり得る。被験体は、マラリアを有すると以前に診断又は同定されているものであり得る。あるいは、被験体はまた、マラリアを有すると以前に診断されていないが、例えば感染により、又はマラリア流行地域内への旅行により、このような症状を発症するリスクがあるものであり得る。例えば、被験体は、マラリアの１つ以上の症候を示すものであり得る。
【0022】
例えば、被験体は、Plasmodium falciparum又はPlasmodium vivaxに感染し得る。
【0023】
元のポリペプチドと「相同な」又は「実質的に相同な」配列は、典型的には、元のポリペプチド又は元のポリペプチドの免疫原性若しくはエピトープフラグメントの配列と少なくとも約８０パーセントの同一性を有するものであって、元のポリペプチドの目的のターゲットに対する所望の効果を実質的に保持する（すなわち、免疫原性応答を誘発するか、又は抗体によって認識される）ものである。一層好ましい実施態様では、相同配列は、元のポリペプチド又はその免疫原性若しくはエピトープフラグメントの配列と少なくとも約８５パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９７パーセント又は９９パーセントの同一性を有する。
【0024】
「免疫原性フラグメント」は、一般に、少なくとも５アミノ酸の長さを有する。一層好ましくは、免疫原性フラグメントの長さは、少なくとも７、９、１１、１３、１５、１７及び１９アミノ酸である。「エピトープ」は、一般に、少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも７～１４アミノ酸の長さを有する。「エピトープフラグメント」はこのようなエピトープを含むので、より長いものであり得る。
【0025】
本発明との関連では、「融合又はバイオ融合」という用語は、リコンビナントタンパク質において、担体タンパク質が抗原性Plasmodium配列に直接連結されているか、又はペプチドリンカーによって抗原性Plasmodium配列に連結されていることを意味する。ペプチドリンカーは、１～３５アミノ酸、好ましくは５～２０アミノ酸、さらに好ましくは５～１０アミノ酸の配列であり得る。好ましい実施態様では、リンカーペプチドは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１～４、好ましくは１～３である）である。いずれの実施態様でも、単一ポリペプチドが形成される。
【0026】
担体タンパク質
担体異種タンパク質配列は、有利には、ジフテリアトキソイドの交差反応物質（ＣＲＭ）、ジフテリアトキソイド（Ｄ）、非毒性突然変異体リコンビナントPseudomonas aeruginosaエキソプロテインＡ（ｒｅｐＡ）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、H. influenzaプロテインＤ（ｈｉＤ）及びそれらの免疫原性フラグメントからなる群より選択され得る。
担体異種タンパク質配列は、有利には、ジフテリアトキソイドの交差反応物質（ＣＲＭ）、ジフテリアトキソイド（Ｄ）、非毒性突然変異体リコンビナントPseudomonas aeruginosaエキソプロテインＡ（ｒｅｐＡ）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、H. influenzaプロテインＤ（ｈｉＤ）及びそれらの免疫原性フラグメントからなる群より選択され得る。
【0027】
好ましい実施態様では、担体異種タンパク質配列は、ＣＲＭ１９７又はその免疫原性フラグメントであり得、このフラグメントは、好ましくは、フラグメントＡ、膜貫通ドメインＴ、ＣＲＭ１９７のレセプター結合ドメインＲ、ＣＲＭ１９７のアミノ酸配列１～１９０及びＣＲＭ１９７のアミノ酸配列１～３８９からなる群より選択される。
【0028】
ジフテリン毒素のフラグメントＡは、アミノ酸１～２０１に及ぶ。ＣＲＭ１９７は、酵素的に不活性なフラグメントＡを有し、グルタミン酸によるグリシン５２の置換を示す。
【0029】
ジフテリン毒素のフラグメントＢは、アミノ酸２０２～５３５に及ぶ。
【0030】
【表1】
【0031】
実質的に相同な配列も使用され得る。
【0032】
抗原性Plasmodium配列
本発明の融合タンパク質構築物は、Plasmodiumタンパク質のエピトープ配列を含む少なくとも１つの抗原性配列を含む。
本発明の融合タンパク質構築物は、Plasmodiumタンパク質のエピトープ配列を含む少なくとも１つの抗原性配列を含む。
【0033】
前記抗原性配列は、任意のPlasmodium種由来の任意のPlasmodium抗原のものであり得る。
【0034】
ヒトに感染する寄生虫の「Plasmodium」属としては、限定されないが、P. falciparum、P. vivax、P. knowles、P. ovale及びP. malariaeが挙げられる。以下に列挙されている抗原は、主にP. falciparum由来の抗原である。しかしながら、他のPlasmodium種におけるオルソログも同様に包含される。特に、P. vivax抗原は、P. falciparum抗原と同じ低い免疫原性を示した。
【0035】
前記抗原は、赤血球期（「血液期」とも表記される）又は前赤血球期（スポロゾイト及び肝臓期）において発現され得る。
【0036】
使用され得る抗原性配列の例は、以下の表２に列挙されている。実質的に相同な配列も使用され得る。
【0037】
赤血球期において発現される抗原であって、Ａｂ依存性細胞阻害（ＡＤＣＩ）防御機構のターゲットである抗原としては、ＭＳＰ３（例えば、ＭＳＰ３－１、ＭＳＰ３－２、ＭＳＰ３－３、ＭＳＰ３－４、ＭＳＰ３－７、ＭＳＰ３－８）、１１－１のＰＥＢＳサブ領域（ＬＳＡ５とも称される）、Ｇｌｕｒｐ Ｒ０及びＲ２、ＳＥＲＰ、Ｐ２７及びＰ２７Ａ、Ｐ４５、Ｐ９０及びＰ７７、Ｐ１４、Ｐ１８１（これはＰ７７の組み合わせである）、ＭＳＰ１－Ｂｌｏｃｋ ２、ＭＳＰ２（２つの３Ｄ７及びＦＣ２７アレル、二形性領域及び定常領域の両方）、ＧＢＰ １３０（特に、Ｎ部分及びＣ部分の両方）、タンパク質３３２、タンパク質１１－１、ＭＳＰ４又はそれらの任意のエピトープフラグメントが挙げられる。
【0038】
好ましくは、融合タンパク質における抗原性配列は、ＭＳＰ３又はそのエピトープフラグメントである。
【0039】
別の好ましい実施態様では、融合タンパク質における抗原性配列は、ＬＳＡ５又はそのエピトープフラグメントである。
【0040】
Plasmodium falciparumメロゾイト表面タンパク質３（ＭＳＰ－３）は、公知の無性血液期マラリアワクチン候補抗原である(Sirima et al, N Engl J Med 2011, 365(11):1062-1064; Demanga et al, Infect Immun 2010, 78(1):486-494; Daher et al, Infect Immun 2010, 78(1):477-485; Rousillon et al, Roussilhon, et al, PLoS Medicine, November 2007, 4, Issue 11, e320)。
【0041】
特に、６つのＭＳＰ３タンパク質のいずれか、好ましくはＭＳＰ３－１が使用され得るが、ペプチドａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ（リコンビナントＣ末端）だけではなく、タンパク質の全長及びＮ末端も使用され得る。好ましい実施態様では、抗原性配列は、ＭＳＰ３又はそのエピトープフラグメントであり、このフラグメントは、ＭＳＰ３－１、ＭＳＰ３－２、ＭＳＰ３－３、ＭＳＰ３－４、ＭＳＰ３－７、ＭＳＰ３－８の中から選択されるPlasmodium ＭＳＰ３タンパク質のＣ末端領域のモチーフａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及び／又はｆを包含する。
【0042】
メロゾイト表面由来の他の抗原、特に、緩く付着又は切断されるのでメロゾイト表面から放出され得るものが包含される。
【0043】
前赤血球期において発現される抗原としては、ＬＳＡ３、ＰＥＢＳ、ＣＳ、Ｔｒａｐ及びＳａｌｓａ並びにそれらの任意のエピトープフラグメントが挙げられる。P. falciparumでは、肝臓期抗原－３（ＬＳＡ－３）は、前赤血球期において発現される抗原である(Toure-Balde et al: Infect Immun 2009, 77(3):1189-1196; Daubersies et al: Nat Med 2000, 6(11):1258-1263)。
【0044】
他の段階又は他の機構に関与する抗原も包含される。それらとしては、有性期に関与する抗原、例えばＰｆ２５若しくはＰｆ４５／４８、及び赤血球におけるメロゾイト侵入阻害のＧＩＡ機構に関与する血液期の抗原、例えばＲｈ５、ＡＭＡ１、ＭＳＰ１－１９、ＭＳＰ１－４２、ＭＳＰ２若しくはＭＳＰ４－５、又は細胞接着に関与する抗原、例えばＶａｒ ＣＳＡが挙げられる。
【表2】
【0045】
融合構築物
特定の実施態様では、融合タンパク質は、担体配列としてのＣＲＭ１９７又はその免疫原性フラグメントに融合されたＭＳＰ３（好ましくは、ＭＳＰ３－１）、ＬＳＡ３、ＬＳＡ５（ＰＥＢＳとも称される）又はそのエピトープフラグメントを抗原性配列として含むか、又はそれからなる。
特定の実施態様では、融合タンパク質は、担体配列としてのＣＲＭ１９７又はその免疫原性フラグメントに融合されたＭＳＰ３（好ましくは、ＭＳＰ３－１）、ＬＳＡ３、ＬＳＡ５（ＰＥＢＳとも称される）又はそのエピトープフラグメントを抗原性配列として含むか、又はそれからなる。
【0046】
好ましい態様では、融合タンパク質は、担体タンパク質配列のＣ末端及びＮ末端にそれぞれ位置するか、又は同じ末端に両方とも位置する２つの抗原性配列を含み、２つの抗原性配列は、同じものであるか、又は互いに異なるものである。
【0047】
好ましい実施態様では、抗原性配列と担体配列との間の融合は、直接融合である。
【0048】
別の実施態様では、少なくとも１つのアミノ酸配列は、ペプチドリンカーによって担体異種タンパク質配列のＮ末端及び／又はＣ末端に連結され得、ペプチドリンカーは、好ましくは、１～３５アミノ酸、好ましくは５～２０アミノ酸の配列である。好ましい態様では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１～４、好ましくは１～３である）である。
【0049】
核酸、ベクター及び宿主細胞
本発明の融合タンパク質は、任意のリコンビナント技術によって作製され得る。したがって、本発明の別の態様は、前記融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
本発明の融合タンパク質は、任意のリコンビナント技術によって作製され得る。したがって、本発明の別の態様は、前記融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
【0050】
本発明において使用される発現ベクターは、in vitro及び／又はin vivoにおける（例えば、適切な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系における）発現を提供し得る。それらは、典型的には、上記で定義されるポリヌクレオチド配列と、宿主細胞又は生物におけるタンパク質産物の発現（例えば、転写及び翻訳）を可能にする調節配列（例えば、適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）とを含む。
【0051】
本発明のベクターは、ベクターの形態、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾンなどであり得る。
【0052】
好ましいが非限定的な態様では、本発明のベクターは、ｉｉ）１つ以上の調節エレメント、例えばプロモーター及び場合により適切なターミネーター；並びに場合によりさらにｉｉｉ）遺伝子構築物の１つ以上のさらなるエレメント、例えば３’－若しくは５’－ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又はトランスフォーメーション若しくは統合（の効率）を促進し若しくは増加させ得るエレメントに作動可能に接続されたｉ）少なくとも１つの上記核酸を含む。
【0053】
好ましい宿主細胞は、E.coliである。しかしながら、細菌、酵母、糸状菌、昆虫、植物細胞及び哺乳動物細胞などの任意の原核生物又は真核生物発現系が使用され得る。
【0054】
好ましいベクター、プロモーター及び宿主細胞は、グリコシル化又は非グリコシル化リコンビナントタンパク質を発現させることができる全てのベクター、プロモーター及び宿主細胞、例えば原核生物発現用のｐＥＴ２６ａ（Ｔ７プロモーターを含む）若しくはｐＴｒｃＨｉｓ２（ｔｒｐ ｌａｃプロモーターを含む）プラスミド、移入用のｐＵＣ１９、ｐＵＣ ５７若しくはｐＣＲ４ ＴＯＰＯプラスミド及びタンパク質発現用のE. coli BL21（ＤＥ３）若しくはE coli NiCo21宿主細胞、又はプラスミド増幅専用のE coli Top 10である。
【0055】
ワクチン製剤
融合タンパク質は、場合によりアジュバントと組み合わせて、生理学的に許容し得るビヒクルと併せて医薬組成物に製剤化される。
融合タンパク質は、場合によりアジュバントと組み合わせて、生理学的に許容し得るビヒクルと併せて医薬組成物に製剤化される。
【0056】
したがって、ワクチンであって、生理学的に許容し得るビヒクルと共に、融合タンパク質、又は少なくとも２つの異なる抗原性アミノ酸配列をそれぞれ含む少なくとも２つの融合タンパク質の組み合わせを含むワクチンが提供される。
【0057】
別の実施態様では、前記融合タンパク質をコードする核酸構築物を含むワクチン組成物が提供される。
【0058】
いくつかの実施態様では、ワクチンは、１つ以上の薬学的に許容し得るビヒクル又は賦形剤を含み得る。賦形剤は、それ自体が抗体の産生を誘導しない任意の成分であって、組成物を投与される被験体にとって有害ではない任意の成分を含む。適切な賦形剤は、典型的には、大きな徐々に代謝される大型高分子、例えば糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース、トレハロース、ラクトース及び脂質凝集物（例えば、油滴又はリポソーム）である。適切な薬学的ビヒクルは当業者に周知であり、限定されないが、希釈剤、例えば水、生理食塩水などが挙げられる。適切には、滅菌パイロジェンフリーリン酸緩衝生理食塩水が、薬学的ビヒクルである。加えて、添加剤、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが存在し得る。
【0059】
医薬組成物、免疫原性組成物又はワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。「アジュバント」は、組成物の有効性を増強するために使用され、限定されないが、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、リン酸アルミニウム、水中油型又は油中水型エマルジョン、Ｔｏｌｌ様レセプターのアゴニスト、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｅ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、ＰＥＩ；ＡＳ０１又はＡＳ０２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＬＡ－ＳＥ（ＩＤＲＩ）及び類似製剤；並びに当技術分野で公知の同様のアジュバントが挙げられる。ISA 51及び720を含むMontanide（登録商標）アジュバント（これは、高精製マンニドモノオレートで乳化された精製スクアレン及びスクアランをベースとする）も同様に使用され得る。MF59（登録商標）はアジュバントの別の例であり、スクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Tween（登録商標）80）及びソルビタントリオレートの水中油型エマルジョンである。
【0060】
ワクチンは、それを投与すべき被験体に適切な投与量に製剤化される。投与される投与量は、個体の症状、性別、体重及び年齢；投与経路；並びに使用されるアジュバントによって変動し得る。ワクチンは、懸濁液又は液体溶液などの剤形で使用され得る。ワクチンは、上記薬学的に許容し得るビヒクルと共に製剤化され得る。適切な投与量としては、限定されないが、本明細書に記載される融合タンパク質 約０．１～約１００マイクログラム、好ましくは約１～約５０マイクログラム、さらに好ましくは１～２０、１～１５又はさらに１～１０マイクログラムが挙げられる。
【0061】
ワクチン接種
免疫原性組成物又はワクチンは、多成分／多抗原免疫原性組成物又はワクチンであり得る。
免疫原性組成物又はワクチンは、多成分／多抗原免疫原性組成物又はワクチンであり得る。
【0062】
免疫原性組成物又はワクチンが、複数回投与レジーム、例えばプライムブーストレジームを目的とする場合、プライム組成物は、ブースト組成物と同じ又は異なる組成物を含み得る。しかしながら、本発明との関連では、プライムブーストレジームは全く必須ではない。
【0063】
免疫原性組成物又はワクチンは、任意の好都合な経路によって、好ましくは非経口、筋肉内、皮内、皮下、粘膜又は静脈内で投与され得る。
【0064】
ＤＮＡワクチン接種のために、エレクトロポレーション、ニードルフリーアプローチ、例えば粒子衝突及び高圧送達、皮膚パッチ、微粒子又はリポソーム中へのＤＮＡワクチンの製剤化などの様々な技術が利用可能である。
【0065】
被験体において免疫応答を惹起するための方法であって、有効量の本発明のワクチンを投与する工程を含む方法が記載される。ワクチンは、予防的に（すなわち、感染を予防するために）、又は保護を提供するために投与され得、好ましくは、抗体及び／又はＴ細胞免疫の誘導を伴う。前記方法は、一次免疫応答、二次免疫応答、ブースター応答又は免疫応答の組み合わせを惹起し得る。
【0066】
ワクチンは、前赤血球期、例えば肝臓期及び／又は有性若しくは無性血液期を含む任意の段階において、マラリアから被験体を保護することを意味する。
【0067】
本発明によれば、Plasmodium抗原に対する免疫応答の規模及び／又は記憶が増加する。
【0068】
特に、本発明のＭＳＰ３融合構築物は、抗ＭＳＰ３細胞親和性抗体、例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体の産生をトリガーする。保護のレベルは、前記抗体の力価を測定することによって決定され得る。
【0069】
図面及び実施例は本発明を例証するものであり、その範囲を限定しない。
【実施例0070】
以前の研究では、頻繁なマラリア曝露は、成人の免疫の発達をもたらし、これが疾患を予防又は緩和することが示されている。この免疫は、マラリア免疫成人由来の免疫グロブリン（ＩｇＧ）を投与することによって受動伝達され得る。
【0071】
抗体依存性細胞性阻害（ＡＤＣＩ）と称される寄生虫殺傷機構が同定された。ＡＤＣＩによるゲノムワイドＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、メロゾイト表面タンパク質３（ＭＳＰ３）が同定され、その後、ＰＥＢＳを含む他のいくつかの抗原が同定された。
【0072】
細胞親和性抗体は、保護代用物として同定された：ＡＤＣＩを媒介する細胞親和性（白血球結合）抗ＭＳＰ３抗体ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、多くの異なる状況の疫学的研究においてマラリアのリスクの減少に一貫して関連することが見出された。これらの抗体はまた、感染動物におけるP.falciparumに対する保護を媒介する。
【0073】
これらの研究は、効率的な免疫応答が有する特徴を示しており、改善されたワクチン製剤の開発につながる。
【0074】
これに基づいて、今回、本発明者らは、融合タンパク質ＣＲＭ９７－ＭＳＰ３が、ＭＳＰ３－ＬＳＰ（ＭＳＰ３－１の１８６～２７１領域をカバーする長い合成ペプチド）と比較して、Ｂ細胞レベル及びＴ細胞レベルで免疫原性を２０～１００倍増加させることを示した。実施例１を参照のこと。１０倍少ない免疫化用量を使用したところ、ヒト、マウス及びリスザル由来のリンパ球に対する免疫原性が大きく改善し、抗体の持続期間が大きく改善した。
【0075】
前赤血球期において、以前の研究では、ＬＳＡ３によってチンパンジーにおいて、大規模なスポロゾイトチャレンジに対する保護効果を誘発することができるが、この効果は、ＬＳ発達を阻害する可能性があるＩＦＮ－γと、スポロゾイト侵入を防止する抗体とに依存することがさらに示されている。
【0076】
実施例２では、本発明者らは、バイオ融合ＣＲＭ－ＬＳＡ３構築物がＴ細胞応答及びＢ細胞応答を強く増加させることを示した。
【0077】
実施例１及び２において得られた結果は、ＣＲＭを有する構築物において、赤血球期由来の他の抗原、例えばＭＳＰ３－２及びＭＳＰ３－３を使用して再現可能であることを証明した（実施例３を参照のこと）。
【0078】
実施例４は、ＬＳＡ５－ＣＲＭ構築物を用いた結果を提供する。
【0079】
材料及び方法
発現構築物の生成及びEscherichia coliにおけるバイオ融合タンパク質の産生
そのＮ末端及びＣ末端の両方においてマラリアペプチド抗原に共有結合的に連結された解毒化ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７から構成されるキメラ免疫原をコードする遺伝子配列（図１）を化学合成し(GenScript)、E. coliにおける産生のためにコドン最適化した。発現プラスミドｐＥＴ－２６ａ(Novagen)におけるクローニングのために、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩの制限部位を５’末端及び３’末端にそれぞれ付加した。配列決定によってシャトルプラスミドｐＵＣ５７に挿入された配列をチェックし、迅速に凍結乾燥した（４μg）。
発現構築物の生成及びEscherichia coliにおけるバイオ融合タンパク質の産生
そのＮ末端及びＣ末端の両方においてマラリアペプチド抗原に共有結合的に連結された解毒化ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７から構成されるキメラ免疫原をコードする遺伝子配列（図１）を化学合成し(GenScript)、E. coliにおける産生のためにコドン最適化した。発現プラスミドｐＥＴ－２６ａ(Novagen)におけるクローニングのために、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩの制限部位を５’末端及び３’末端にそれぞれ付加した。配列決定によってシャトルプラスミドｐＵＣ５７に挿入された配列をチェックし、迅速に凍結乾燥した（４μg）。
【0080】
ＰＰ２１におけるＭＳＰ３－１ペプチド（ｐｌａｓｍｏｄＢ ａｃｃ．Ｎｂｒ ＰＦ３Ｄ７＿１０３５４００）は、ＭＳＰ３－１におけるアミノ酸（ＡＡ）１５５～２４９に対応する。
【0081】
他のハイブリッド免疫原（表３）は、ＣＲＭ１９７周囲に設計されている。ＰＰ２２では、ＭＳＰ３－２ペプチド（ＭＳＰ３－２のＡＡ １７８～２５７、ＰｌａｓｍｏｄＢ ａｃｃ．Ｎｂｒ ＰＦ３Ｄ７＿１０３５５００）でＭＳＰ３－１ペプチドを置き換えた。ＰＰ２３では、ＭＳＰ３－３ペプチド（ＭＳＰ３－３のＡＡ ２４６～３０７、ＰｌａｓｍｏｄＢ ａｃｃ．Ｎｂｒ ＰＦ３Ｄ７＿１０３５６００）でＣ末端のＭＳＰ３－２ペプチドを置き換えた。ＰＰ２５は、両方のＣＲＭ１９７末端に同じＬＳＡ３ペプチド（ＡＡ １７６～３２５、ＰｌａｓｍｏｄＢ ａｃｃ．Ｎｂｒ ＰＦ３Ｄ７＿０２２００００）を含有する。
【表3】
【0082】
クローニング分子手順及びプラスミド増殖のために、E. coli transfer strain Top 10 (Invitrogen)［Ｆ－ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ］をを使用した。
【0083】
株ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ－ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ－ｍＢ）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）］（ＮＥＢ）において、リコンビナントの発現を実施した。
【0084】
ハイブリッド配列を含有するシャトルプラスミドｐＵＣ５７(Genscript)及び発現プラスミドｐＥＴ２６ａをＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化した。電気泳動後、ゲル抽出(QIAGEN)によって、インサート及び線状化ｐＥＴ２６ａのバンドを回収した。インサート対プラスミド比 ３で、ゲル精製インサートをｐＥＴ２６ａ内にライゲーションした。ライゲーション反応を使用して、化学的にコンピテントなE. coli Top 10をトランスフォーメーションし、ペトリ皿中、５０μg/mL カナマイシンを含むＬＢ寒天培地上にプレーティングした。
【0085】
シリカカラム(QIAGEN)のプラスミドミニプレパレーションのために、カナマイシンを含む液体培地中で、細菌コロニー ６個をピッキングした。インフォマティブな制限酵素による消化によって、ｐＥＴ２６ａへのインサートの正しい挿入をチェックした（図２）。
【0086】
正しい制限プロファイルを有するプラスミドを選択して、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌をトランスフォーメーションした。
【0087】
上記のように制限酵素消化によって分析したＢＬ２１（ＤＥ３）クローン ６個において、正しいプラスミドによるトランスフォーメーションを確認した。
【0088】
小容量細菌培養におけるリコンビナントタンパク質産生の最適化
三角フラスコ中、小規模培養スケール（１Ｌ）で、リコンビナントタンパク質産生の持続期間、インデューサー（ＩＰＴＧ）の濃度及び温度などのパラメータを分析した。定常状態一晩培養物 ５mlを１Ｌ（１：２００）で希釈し、６００nmの光学密度 ０，７～０，８まで３０℃でさらに培養した。２つのＩＰＴＧインデューサー濃度 ０．１及び１mMを用いて、３つの温度 ２２、３０及び３７℃で、リコンビナントタンパク質発現の誘導をアッセイした。２２℃で一晩培養し、０．１mM ＩＰＴＧによって誘導した後、最良のリコンビナント収量が得られた。
三角フラスコ中、小規模培養スケール（１Ｌ）で、リコンビナントタンパク質産生の持続期間、インデューサー（ＩＰＴＧ）の濃度及び温度などのパラメータを分析した。定常状態一晩培養物 ５mlを１Ｌ（１：２００）で希釈し、６００nmの光学密度 ０，７～０，８まで３０℃でさらに培養した。２つのＩＰＴＧインデューサー濃度 ０．１及び１mMを用いて、３つの温度 ２２、３０及び３７℃で、リコンビナントタンパク質発現の誘導をアッセイした。２２℃で一晩培養し、０．１mM ＩＰＴＧによって誘導した後、最良のリコンビナント収量が得られた。
【0089】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製後、細菌培養液 １リットル当たりリコンビナント産物 １～２mgの収量が得られた。
【0090】
ＰＰ２１の生産及び精製
実験室スケール（１～２リットル）の生産を行って、マウス及び霊長類モデルにおいて前臨床免疫原性研究を行うために十分なＰＰ２１リコンビナントタンパク質を得た。
実験室スケール（１～２リットル）の生産を行って、マウス及び霊長類モデルにおいて前臨床免疫原性研究を行うために十分なＰＰ２１リコンビナントタンパク質を得た。
【0091】
細菌培養及びリコンビナントタンパク質生産のためのプロトコールは、小規模培養で以前に確立されている。
【0092】
Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂(QIAGEN)によるアフィニティーによって、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ付リコンビナントタンパク質ＰＰ２１を精製した。
【0093】
ネイティブ条件下又は変性条件下で、２つの精製手順を調査した。
【0094】
実際、ネイティブ条件下では、細菌溶解物不溶性画分においてリコンビナントタンパク質は見られなかったが、変性条件下における精製もアッセイして、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂上の固定化Ｎｉ２＋金属について、ヒスチジンタグのアベイラビリティに対するＰＰ２１の三次元構造の推定コンフォメーション効果の影響を評価した。
【0095】
ネイティブ条件下における精製
－遠心分離（４０００ｇ、３０分間、４℃）によって、細菌細胞を回収した。
－細菌ペレットをバイオマス １グラム当たり溶解バッファー（５０mM ＮａＨ２ＰＯ４、３００mM ＮａＣｌ、１０mM イミダゾール、ｐＨ８．０） ５mLに懸濁した。
－溶解物を１mg/mL リゾチームと共に氷上で３０分間振盪した。
－冷却間隔を３０秒間とし、１５０Ｗ、５３０秒間のバーストによって、細菌を溶解した。
－一式のプロテアーゼ阻害剤(Roche)を加えた５μg/mL ＤＮＡｓｅ Ｉ及び１０μg/mL ＲＮＡｓｅ Ａと共に、溶解物を氷上で３０分間振盪した。
－１００００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって、溶解物を清澄化した。
－溶解物を０，２２μm篩でろ過し、４℃のロッキングトレイ上、容量 ２０mLで、ＮｉＮＴＡ樹脂 ２００μLと共に一晩インキュベーションした。
－溶解バッファー 容量４０mLで樹脂を十分に５回洗浄した。分析のために、第１段階の上清（樹脂インキュベーション後の溶解物）のアリコートを保存した。遠心分離工程は、２００ｇで５分間以下であった。
－２５０mM イミダゾールを５倍含有する溶解バッファー ５００μL中で樹脂をインキュベーションすることによって、リコンビナントタンパク質を回収した。
－溶出画分をプールし、３０kDa篩による限外ろ過によってＰＢＳ ｐＨ７．３に対して透析した。
－遠心分離（４０００ｇ、３０分間、４℃）によって、細菌細胞を回収した。
－細菌ペレットをバイオマス １グラム当たり溶解バッファー（５０mM ＮａＨ２ＰＯ４、３００mM ＮａＣｌ、１０mM イミダゾール、ｐＨ８．０） ５mLに懸濁した。
－溶解物を１mg/mL リゾチームと共に氷上で３０分間振盪した。
－冷却間隔を３０秒間とし、１５０Ｗ、５３０秒間のバーストによって、細菌を溶解した。
－一式のプロテアーゼ阻害剤(Roche)を加えた５μg/mL ＤＮＡｓｅ Ｉ及び１０μg/mL ＲＮＡｓｅ Ａと共に、溶解物を氷上で３０分間振盪した。
－１００００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって、溶解物を清澄化した。
－溶解物を０，２２μm篩でろ過し、４℃のロッキングトレイ上、容量 ２０mLで、ＮｉＮＴＡ樹脂 ２００μLと共に一晩インキュベーションした。
－溶解バッファー 容量４０mLで樹脂を十分に５回洗浄した。分析のために、第１段階の上清（樹脂インキュベーション後の溶解物）のアリコートを保存した。遠心分離工程は、２００ｇで５分間以下であった。
－２５０mM イミダゾールを５倍含有する溶解バッファー ５００μL中で樹脂をインキュベーションすることによって、リコンビナントタンパク質を回収した。
－溶出画分をプールし、３０kDa篩による限外ろ過によってＰＢＳ ｐＨ７．３に対して透析した。
【0096】
２８０nMで分光光度法によってタンパク質濃度を測定し、ＰＰ２１について図３に示されているように、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ１０％）及びイムノブロッティングによってさらに特性評価した。
【0097】
変性条件下における精製
遠心分離（４０００ｇ、３０分間、４℃）によって、細菌細胞を回収した。
細菌ペレットをバイオマス １グラム当たり変性溶解バッファー（１００mM ＮａＨ２ＰＯ４、１０mM トリス－Ｃｌ、８M 尿素、ＮａＯＨ ｐＨ８．０） ５mLに懸濁した。
溶解物を氷上で３０分間振盪した。
冷却間隔を３０秒間とし、１５０Ｗ、５３０秒間のバーストによって、細菌をさらに溶解した。
１００００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって、溶解物を清澄化した。
溶解物を０，２２μm篩でろ過し、４℃のロッキングトレイ上、容量 ２０mLで、ＮｉＮＴＡ樹脂 ２００μLと共に一晩インキュベーションした。
変性溶解バッファー 容量４０mLで樹脂を十分に５回洗浄した。分析のために、第１段階の上清（樹脂インキュベーション後の溶解物）のアリコートを保存した。遠心分離工程は、２００ｇで５分間以下であった。
２５０mM イミダゾールを５倍含有する溶解バッファー ５００μL中で樹脂をインキュベーションすることによって、リコンビナントタンパク質を回収した。
溶出画分をプールし、３０kDa篩による限外ろ過によってＰＢＳ ｐＨ７．３に対して透析した。
遠心分離（４０００ｇ、３０分間、４℃）によって、細菌細胞を回収した。
細菌ペレットをバイオマス １グラム当たり変性溶解バッファー（１００mM ＮａＨ２ＰＯ４、１０mM トリス－Ｃｌ、８M 尿素、ＮａＯＨ ｐＨ８．０） ５mLに懸濁した。
溶解物を氷上で３０分間振盪した。
冷却間隔を３０秒間とし、１５０Ｗ、５３０秒間のバーストによって、細菌をさらに溶解した。
１００００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって、溶解物を清澄化した。
溶解物を０，２２μm篩でろ過し、４℃のロッキングトレイ上、容量 ２０mLで、ＮｉＮＴＡ樹脂 ２００μLと共に一晩インキュベーションした。
変性溶解バッファー 容量４０mLで樹脂を十分に５回洗浄した。分析のために、第１段階の上清（樹脂インキュベーション後の溶解物）のアリコートを保存した。遠心分離工程は、２００ｇで５分間以下であった。
２５０mM イミダゾールを５倍含有する溶解バッファー ５００μL中で樹脂をインキュベーションすることによって、リコンビナントタンパク質を回収した。
溶出画分をプールし、３０kDa篩による限外ろ過によってＰＢＳ ｐＨ７．３に対して透析した。
【0098】
２つの方法による精製収量は同様であったが、これは、ネイティブ形態のＰＰ２１において、アフィニティーヒスチジンタグが機能的であることを示唆している。
【0099】
三角フラスコ中、１リットルスケールの１０回を超える生産／精製試験において、細菌培養液 １リットル当たりリコンビナントタンパク質ＰＰ２１ ０，７～１mgの精製収量が再現性よく得られた。
【0100】
図３は、ＩＭＡＣによって精製したリコンビナントタンパク質ＰＰ２１を示す。
【0101】
ＰＰ２１の温度安定性
ウエスタンブロッティングによって評価した貯蔵温度に応じたＰＰ２１の安定性は、図４に示されている。温度 ６℃の冷蔵庫における２１日間の貯蔵期間後、分解の兆候は観察されなかった。室温では、ＰＰ２１は、同じ期間で分解の兆候を示し始めたのに対して、３７℃では８日後に完全に分解された。しかしながら、それはＧＭＰ製造製品ではなく、微量のプロテアーゼを含有し得るので、この不安定性は推定内因性分子の不安定性に帰することはできない。
ウエスタンブロッティングによって評価した貯蔵温度に応じたＰＰ２１の安定性は、図４に示されている。温度 ６℃の冷蔵庫における２１日間の貯蔵期間後、分解の兆候は観察されなかった。室温では、ＰＰ２１は、同じ期間で分解の兆候を示し始めたのに対して、３７℃では８日後に完全に分解された。しかしながら、それはＧＭＰ製造製品ではなく、微量のプロテアーゼを含有し得るので、この不安定性は推定内因性分子の不安定性に帰することはできない。
【0102】
ｐＥＴ２６ａによってE. coliにおいて発現されたリコンビナントタンパク質のアミノ酸配列は、以下に示されている。括弧内の配列は発現プラスミドに由来するものであり、太字はＣＲＭ１９７ジフテリア毒素に由来するものである。
【0103】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製に使用したＣ末端のヘキサヒスチジンタグは、下線が付されている。
【0104】
ＰＰ２１ ＭＳＰ３－１の配列（斜体下線）（ＰｌａｓｍｏｄＢ ＩＤ：ＰＦ３Ｄ７＿１０３５４００）、残基１５５～２４９（９５ａａ）
ＰＰ２２；ＭＳＰ３－２の配列（斜体下線）（ＰｌａｓｍｏｄＢ ＩＤ：ＰＦ３Ｄ７＿１０３５５００）、残基１７８～２５７（７９ａａ）
ＰＰ２３；ＭＳＰ３－２の配列（ＣＲＭ１９７の前の斜体下線）（ＰｌａｓｍｏｄＢ ＩＤ：ＰＦ３Ｄ７＿１０３５５００）、残基１７８～２５７（７９ａａ）及びＭＳＰ３－３（ＣＲＭ１９７の後の斜体）（ＰｌａｓｍｏｄＢ ａｃｃ．Ｎｂｒ ＰＦ３Ｄ７＿１０３５６００）、残基２４６～３０７（６１ａａ）
ＰＰ２５；ＬＳＡ－３の配列（斜体下線）（ＰｌａｓｍｏｄＢ ＩＤ：ＰＦ３Ｄ７＿０２２００００）、残基１７６～３２５（１５０ａａ）
ＬＳＡ５－ＣＲＭタンパク質配列（配列番号：８９）
【化1】
ＰＰ２２；ＭＳＰ３－２の配列（斜体下線）（ＰｌａｓｍｏｄＢ ＩＤ：ＰＦ３Ｄ７＿１０３５５００）、残基１７８～２５７（７９ａａ）
【化2】
ＰＰ２３；ＭＳＰ３－２の配列（ＣＲＭ１９７の前の斜体下線）（ＰｌａｓｍｏｄＢ ＩＤ：ＰＦ３Ｄ７＿１０３５５００）、残基１７８～２５７（７９ａａ）及びＭＳＰ３－３（ＣＲＭ１９７の後の斜体）（ＰｌａｓｍｏｄＢ ａｃｃ．Ｎｂｒ ＰＦ３Ｄ７＿１０３５６００）、残基２４６～３０７（６１ａａ）
【化3】
ＰＰ２５；ＬＳＡ－３の配列（斜体下線）（ＰｌａｓｍｏｄＢ ＩＤ：ＰＦ３Ｄ７＿０２２００００）、残基１７６～３２５（１５０ａａ）
【化4】
ＬＳＡ５－ＣＲＭタンパク質配列（配列番号：８９）
【化5】
【0105】
ヒト免疫原性マウスモデル（ＨＩＭＭ）：このモデルは、免疫不全ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ－２ｒγヌル（ＮＳＧ）マウスへのヒト脾臓リンパ球の移植（Ｈｕ－ＳＰＬ－ＮＳＧ）に基づくものであり、通常の実験用マウス、例えばＢａｌｂ／Ｃ及びＣ５７ＢＬを使用して得られた情報を補完する。
【0106】
Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７Ｂｌ／６マウスの免疫化及び血液サンプリング
Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７Ｂｌ／６マウス ４～５匹の群は、リン酸緩衝生理食塩液ｐＨ７．２（ＰＢＳ） １００μlで希釈してアジュバントMontanide ISA 720 １００μlで乳化したＭＳＰ３－１－ＬＳＰ １０μg又はＰＰ２１ １μgの２回又は３回の注射を受けた。皮下注射によって免疫化を実施し、１５日間おいて１回又は２回反復した。２回目の注射の２週間後から開始して尾を出血させることによって、血液収集を実施し、初回抗原注射の１６０日後まで１５日間隔で反復した。血清を分離し、使用まで－２０℃で貯蔵した。並行して同時に処理した他の群は、ＰＰ２１ １μg又は０．２μgのいずれかを投与した。
Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７Ｂｌ／６マウス ４～５匹の群は、リン酸緩衝生理食塩液ｐＨ７．２（ＰＢＳ） １００μlで希釈してアジュバントMontanide ISA 720 １００μlで乳化したＭＳＰ３－１－ＬＳＰ １０μg又はＰＰ２１ １μgの２回又は３回の注射を受けた。皮下注射によって免疫化を実施し、１５日間おいて１回又は２回反復した。２回目の注射の２週間後から開始して尾を出血させることによって、血液収集を実施し、初回抗原注射の１６０日後まで１５日間隔で反復した。血清を分離し、使用まで－２０℃で貯蔵した。並行して同時に処理した他の群は、ＰＰ２１ １μg又は０．２μgのいずれかを投与した。
【0107】
マウス血清中の抗ＭＳＰ３－ＬＳＰ抗体力価の決定
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、マウス血清中のＭＳＰ３－ＬＳＰ特異的抗体力価を決定した。ＰＢＳで希釈した２μg/ml ＭＳＰ３－１－ＬＳＰ又はＭＳＰ３－１－ＬＳＰペプチドａ、ｂ、ｃ若しくはｄの１つで平底マイクロタイトレーションプレート(Nunc-Thermo Scientific, USA)を４℃で一晩コーティングした。洗浄（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）及び飽和（ＰＢＳ、３％脱脂乳）後、（ＰＢＳ、３％脱脂乳、０．０５％Tween20で希釈した）試験血清の系列希釈物を追加し、１時間インキュベーションした。ネガティブコントロールは、免疫前マウス血清からなる。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Invitrogen, USA)を１時間追加し、続いて、ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジン(Amresco, USA)を追加することによって、特異的抗体を明らかにした。特異的抗体力価は、最後の陽性希釈の逆数に対応する。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、マウス血清中のＭＳＰ３－ＬＳＰ特異的抗体力価を決定した。ＰＢＳで希釈した２μg/ml ＭＳＰ３－１－ＬＳＰ又はＭＳＰ３－１－ＬＳＰペプチドａ、ｂ、ｃ若しくはｄの１つで平底マイクロタイトレーションプレート(Nunc-Thermo Scientific, USA)を４℃で一晩コーティングした。洗浄（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）及び飽和（ＰＢＳ、３％脱脂乳）後、（ＰＢＳ、３％脱脂乳、０．０５％Tween20で希釈した）試験血清の系列希釈物を追加し、１時間インキュベーションした。ネガティブコントロールは、免疫前マウス血清からなる。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Invitrogen, USA)を１時間追加し、続いて、ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジン(Amresco, USA)を追加することによって、特異的抗体を明らかにした。特異的抗体力価は、最後の陽性希釈の逆数に対応する。
【0108】
ヒト脾臓提供及び倫理規定
ヒト脾臓は、レバノンのNational Organization for Organ & Tissues Donation & Transplantation (NOOTDT)との倫理的合意にしたがって、死亡した臓器移植ドナーから入手した。存命中に患者自身が、又はその死亡後に患者の両親が、移植又は科学研究のための臓器提供に関するインフォームドコンセントに署名した。
ヒト脾臓は、レバノンのNational Organization for Organ & Tissues Donation & Transplantation (NOOTDT)との倫理的合意にしたがって、死亡した臓器移植ドナーから入手した。存命中に患者自身が、又はその死亡後に患者の両親が、移植又は科学研究のための臓器提供に関するインフォームドコンセントに署名した。
【0109】
ヒト脾臓細胞調製
以前に記載されているように(Brams P, 1998)、外科的切除後２４時間以内に、ヒト脾臓を加工した。簡潔に言えば、脾臓組織を解剖し、細胞懸濁液を調製した。ゲイ溶液を使用して、赤血球を２５℃で５～１０分間溶解した。洗浄後、３７％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）(Sigma,USA)、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）(Sigma,USA)及び５３％ＲＰＭＩ１６４０(Sigma,USA)からなる培地に白血球を再懸濁し、次いで、使用まで液体窒素中で凍結保存した。各脾臓ドナーから単離した細胞の平均数は、１００±４０億個であった。
以前に記載されているように(Brams P, 1998)、外科的切除後２４時間以内に、ヒト脾臓を加工した。簡潔に言えば、脾臓組織を解剖し、細胞懸濁液を調製した。ゲイ溶液を使用して、赤血球を２５℃で５～１０分間溶解した。洗浄後、３７％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）(Sigma,USA)、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）(Sigma,USA)及び５３％ＲＰＭＩ１６４０(Sigma,USA)からなる培地に白血球を再懸濁し、次いで、使用まで液体窒素中で凍結保存した。各脾臓ドナーから単離した細胞の平均数は、１００±４０億個であった。
【0110】
ＮＳＧマウスにおけるヒト脾臓細胞の移植及び免疫化
ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ－ＩＬ２ｒγｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスは、The Jackson Laboratories (USA)から入手し、無菌マイクロアイソレーター中で飼育した。食物、水、ケージ及び寝具は全て、使用前にオートクレーブ処理した。６～８週齢のＮＳＧマウスを実験に入れた。
ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ－ＩＬ２ｒγｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスは、The Jackson Laboratories (USA)から入手し、無菌マイクロアイソレーター中で飼育した。食物、水、ケージ及び寝具は全て、使用前にオートクレーブ処理した。６～８週齢のＮＳＧマウスを実験に入れた。
【0111】
０日目に、１０％ウシ胎仔血清、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ １００ｘ）、２mM グルタミン、２mM ピルビン酸ナトリウム及び５０μg/ml ゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地）中で、１μg/ml 抗原と共に又は抗原なしで、ヒト脾臓細胞を細胞 ４×１０６個／mlで培養した。培養試薬は全て、Sigma, USAから購入した。１日目に、リコンビナントヒトＩＬ－２(Gibco Invitrogen)を２５IU/mlで追加した。３日目に、脾臓細胞を回収し、洗浄し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁した。各ＮＳＧマウスは、抗原プライミング又は非プライミング脾臓細胞 ３０×１０６個の腹腔内注射（ｉｐ）を受けた。７日目及び２１日目に、ＨＢＳＳ－Montanide ISA 720又はMF59アジュバント（v/v） ２００μl中の抗原 １０μgの腹腔内注射（ｉｐ）によって、再構成マウス（Ｈｕ－ＳＰＬ－ＮＳＧ）を追加免疫化した。非プライミング脾臓細胞で再構成したマウスは、アジュバントのみを投与した。各追加免疫化の１週間後に、血液サンプルを収集した。
【0112】
Ｈｕ－ＳＰＬ－ＮＳＧマウス血清中のヒトＭＳＰ３－１－ＬＳＰ特異的抗体の決定
ＥＬＩＳＡによって、これらの決定を実施した。簡潔に言えば、マウス血清中の総ヒトＩｇＧの検出のために、０．１Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．５中の２．５μg/ml精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Invitrogen, USA)で平底マイクロタイトレーションプレート(Nunc-Thermo Scientific, USA)を４℃で一晩コーティングした。洗浄（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）及び飽和（ＰＢＳ、３％脱脂乳）後、（ＰＢＳ、３％脱脂乳、０．０５％Tween20で希釈した）試験血清を追加し、１時間インキュベーションした。ネガティブコントロールは、同じ動物の免疫前マウス血清からなっていた。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Invitrogen, USA)を１時間追加し、続いて、ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジン(Amresco, USA)を追加することによって、ヒトＩｇＧを明らかにした。標準的なヒトＩｇＧ溶液(Zymed, USA)と比較して、Ｈｕ－ＳＰＬ－ＮＳＧマウス血清中の総ヒトＩｇＧ濃度を計算した。ＰＢＳ中２．５μg/ml ＭＳＰ３－１－ＬＳＰでプレートをコーティングしたことを除いて、抗原特異的抗体の検出について同じ試験を実施した。この場合、ネガティブコントロールは、Plasmodiumに感染したことがない個体の血清からなっており、ポジティブコントロールは、過免疫アフリカ人成人由来の血清のプールからなっていた。両方の場合において、抗体力価を決定するために、各血清の系列希釈物を試験した。特異的抗体力価決定のために、カットオフ（ネガティブコントロールＯＤ×２）を超える吸光度が得られた場合、試験を陽性とみなした。ヒトＩｇＧサブクラスに特異的な二次マウスモノクローナル抗体（それぞれ最終希釈 １／４，０００、１／１０，０００、１／１０，０００及び１／６０，０００でクローンＮＬ１６［ＩｇＧ１；Skybio, UK］、ＨＰ６００２［ＩｇＧ２；Sigma-Aldrich, Germany］並びにＺｇ４及びＧＢ７Ｂ［それぞれＩｇＧ３及びＩｇＧ４；Skybio, UK）を使用した）、続いて、ＰＢＳで１／４０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ(Invitrogen)を使用して、ＩｇＧサブクラスの検出を実施した。
ＥＬＩＳＡによって、これらの決定を実施した。簡潔に言えば、マウス血清中の総ヒトＩｇＧの検出のために、０．１Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．５中の２．５μg/ml精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Invitrogen, USA)で平底マイクロタイトレーションプレート(Nunc-Thermo Scientific, USA)を４℃で一晩コーティングした。洗浄（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）及び飽和（ＰＢＳ、３％脱脂乳）後、（ＰＢＳ、３％脱脂乳、０．０５％Tween20で希釈した）試験血清を追加し、１時間インキュベーションした。ネガティブコントロールは、同じ動物の免疫前マウス血清からなっていた。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Invitrogen, USA)を１時間追加し、続いて、ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジン(Amresco, USA)を追加することによって、ヒトＩｇＧを明らかにした。標準的なヒトＩｇＧ溶液(Zymed, USA)と比較して、Ｈｕ－ＳＰＬ－ＮＳＧマウス血清中の総ヒトＩｇＧ濃度を計算した。ＰＢＳ中２．５μg/ml ＭＳＰ３－１－ＬＳＰでプレートをコーティングしたことを除いて、抗原特異的抗体の検出について同じ試験を実施した。この場合、ネガティブコントロールは、Plasmodiumに感染したことがない個体の血清からなっており、ポジティブコントロールは、過免疫アフリカ人成人由来の血清のプールからなっていた。両方の場合において、抗体力価を決定するために、各血清の系列希釈物を試験した。特異的抗体力価決定のために、カットオフ（ネガティブコントロールＯＤ×２）を超える吸光度が得られた場合、試験を陽性とみなした。ヒトＩｇＧサブクラスに特異的な二次マウスモノクローナル抗体（それぞれ最終希釈 １／４，０００、１／１０，０００、１／１０，０００及び１／６０，０００でクローンＮＬ１６［ＩｇＧ１；Skybio, UK］、ＨＰ６００２［ＩｇＧ２；Sigma-Aldrich, Germany］並びにＺｇ４及びＧＢ７Ｂ［それぞれＩｇＧ３及びＩｇＧ４；Skybio, UK）を使用した）、続いて、ＰＢＳで１／４０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ(Invitrogen)を使用して、ＩｇＧサブクラスの検出を実施した。
【0113】
リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴｑＰＣＲ）による異なるサイトカイン、ケモカイン及び転写因子の遺伝子発現の定量
完全ＲＰＭＩ１６４０培地中、免疫化抗原での刺激あり又はなしで、免疫化及び非免疫化マウスの脾臓細胞を細胞 ２×１０６個／mlで培養した。２４時間の培養後、RNeasy Mini Kit (Quiagen, Germany)を使用して、全細胞ＲＮＡを抽出した。反応混合物 ２０μl中で、RevertAid M-MuLV enzyme (RevertAid kit First Strand Synthesis kit, Thermo Scientific Fermentas)を使用して、逆転写を行った。簡潔に言えば、オリゴｄＴ１８プライマー １μlを全ＲＮＡ 約４００ngに追加し、混合し、６５℃で５分間インキュベーションした。製造業者が推奨するように、チューブを氷上に数分間置き、短時間遠心分離してから、５×反応バッファー、Ｒｉｂｏｌｏｃｋ Ｒｎａｓｅ阻害剤（２０u/μl）、ｄＮＴＰ（１０mM）及び逆転写酵素（２００u/μl）を追加した。反応混合物を４２℃で６０分間インキュベーションした。７０℃で５分間加熱することによって、酵素を不活性化した。定量的ＰＣＲを使用して、Ｔｈ１又はＴｒｅｇ細胞に特徴的であると考えられる異なるヒトサイトカイン、ケモカイン及び転写因子の相対的発現を測定した。製造業者が推奨するように、LightCycler 480 SYBR Green Master, La Rocheを使用して、ＰＣＲ混合を実施した。ＰＣＲ増幅をLightCycler 480 machine (La Roche)において９５℃で５分間（１サイクル）実施し、続いて、９５℃で１０秒間及び５５～５７℃で１０秒間のインキュベーションを４５サイクル行った。各サンプルを３回反復でランした。内部標準として使用したハウスキーピング遺伝子は、ベータアクチン（βアクチン）及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）(geNorm analysis)であった。作成したＰＣＲ曲線に基づいて、サイクル閾値（Ｃｔ）を計算した。２ΔΔＣｔ法によって、相対的発現量を計算した。
完全ＲＰＭＩ１６４０培地中、免疫化抗原での刺激あり又はなしで、免疫化及び非免疫化マウスの脾臓細胞を細胞 ２×１０６個／mlで培養した。２４時間の培養後、RNeasy Mini Kit (Quiagen, Germany)を使用して、全細胞ＲＮＡを抽出した。反応混合物 ２０μl中で、RevertAid M-MuLV enzyme (RevertAid kit First Strand Synthesis kit, Thermo Scientific Fermentas)を使用して、逆転写を行った。簡潔に言えば、オリゴｄＴ１８プライマー １μlを全ＲＮＡ 約４００ngに追加し、混合し、６５℃で５分間インキュベーションした。製造業者が推奨するように、チューブを氷上に数分間置き、短時間遠心分離してから、５×反応バッファー、Ｒｉｂｏｌｏｃｋ Ｒｎａｓｅ阻害剤（２０u/μl）、ｄＮＴＰ（１０mM）及び逆転写酵素（２００u/μl）を追加した。反応混合物を４２℃で６０分間インキュベーションした。７０℃で５分間加熱することによって、酵素を不活性化した。定量的ＰＣＲを使用して、Ｔｈ１又はＴｒｅｇ細胞に特徴的であると考えられる異なるヒトサイトカイン、ケモカイン及び転写因子の相対的発現を測定した。製造業者が推奨するように、LightCycler 480 SYBR Green Master, La Rocheを使用して、ＰＣＲ混合を実施した。ＰＣＲ増幅をLightCycler 480 machine (La Roche)において９５℃で５分間（１サイクル）実施し、続いて、９５℃で１０秒間及び５５～５７℃で１０秒間のインキュベーションを４５サイクル行った。各サンプルを３回反復でランした。内部標準として使用したハウスキーピング遺伝子は、ベータアクチン（βアクチン）及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）(geNorm analysis)であった。作成したＰＣＲ曲線に基づいて、サイクル閾値（Ｃｔ）を計算した。２ΔΔＣｔ法によって、相対的発現量を計算した。
【0114】
免疫蛍光アッセイ。
主にP. falciparum（３Ｄ７）の成熟シゾントを含有する赤血球培養物由来の風乾したアセトン固定薄層塗抹標本を使用して、免疫蛍光アッセイを実施した。ＰＢＳ－１％ウシ血清アルブミンで希釈したＨｕ－ＳＰＬ－ＮＳＧ血清を加湿チャンバー中、３７℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、エバンスブルー対比染色（１／２００）と共にＰＢＳで１／４００希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ(Molecular Probes及びInvitrogen)を使用することによって、抗体を検出した。
主にP. falciparum（３Ｄ７）の成熟シゾントを含有する赤血球培養物由来の風乾したアセトン固定薄層塗抹標本を使用して、免疫蛍光アッセイを実施した。ＰＢＳ－１％ウシ血清アルブミンで希釈したＨｕ－ＳＰＬ－ＮＳＧ血清を加湿チャンバー中、３７℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、エバンスブルー対比染色（１／２００）と共にＰＢＳで１／４００希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ(Molecular Probes及びInvitrogen)を使用することによって、抗体を検出した。
【0115】
結果
実施例１：ＰＰ２１（ＣＲＭＰ９７－ＭＳ３融合構築物）の免疫原性
以下の動物モデル：
・ＢＡＬＢ－Ｃマウス
・Ｃ５７ＢＬマウス
・Saimiri sciureusサル
・ヒト免疫原性マウスモデル（ＨＩＭＭ）
において、ＰＰ２１によって誘導された免疫応答を評価した（免疫不全ＮＳＧマウスに移植したヒト脾臓組織由来の細胞をin vivoで免疫化し、免疫化動物由来の血清及び細胞を免疫アッセイに使用する）。
実施例１：ＰＰ２１（ＣＲＭＰ９７－ＭＳ３融合構築物）の免疫原性
以下の動物モデル：
・ＢＡＬＢ－Ｃマウス
・Ｃ５７ＢＬマウス
・Saimiri sciureusサル
・ヒト免疫原性マウスモデル（ＨＩＭＭ）
において、ＰＰ２１によって誘導された免疫応答を評価した（免疫不全ＮＳＧマウスに移植したヒト脾臓組織由来の細胞をin vivoで免疫化し、免疫化動物由来の血清及び細胞を免疫アッセイに使用する）。
【0116】
通常、実験用マウスはミョウバンに対して応答不良であり、ＨＩＭＭへの注射経路ではミョウバンが使用不可能であるので、そして何よりも、本発明者らは、ヒトでは、ＭＳＰ３ ＬＳＰとしての（髄膜炎菌又は肺炎球菌ワクチン中の）ミョウバンアジュバント添加したＣＲＭが非常に良好な応答を提供することを知っており、アジュバントではなく構築物の比較を目的としていたので、Montanide ISA 720を使用して、臨床実験において使用されたベンチマーク抗原ＭＳＰ３－ＬＳＰ（ＭＳＰ３－１の１８６～２７１領域をカバーする長い合成ペプチド）と比較して、全ての実験を実施した。
【0117】
それでもなお、実験用マウスにおいて、ミョウバンによる良好な免疫化も実施したところ、Ｂａｌｂ／Ｃでは２回の免疫化後であっても＞２５６００の力価が得られ、Ｃ５７ｂｌでは３２００～２５６００の力価が得られた（図１９）。
【0118】
マウスにおいて本発明のＰＰ２１バイオ融合ＭＳＰ３－１構築物を使用した場合、ＭＳＰ３－ＬＳＰと比較して、免疫原性の大きな改善が観察された。
使用した全てのモデルにおいて、ＰＰ２１は、ベンチマーク抗原ＭＳＰ３－ＬＳＰよりも高い血清学的応答のターゲット細胞親和性サブクラスを誘導する。
使用した全てのモデルにおいて、ＰＰ２１は、ベンチマーク抗原ＭＳＰ３－ＬＳＰよりも高い血清学的応答のターゲット細胞親和性サブクラスを誘導する。
【0119】
１．低用量は非常に効率的である：他のＣＲＭコンジュゲートワクチンのように、免疫原性の大きな増加が得られたが、これは、融合手順により、化学的コンジュゲーションと同じくらい効率的に生成物が生産されたことを示している。本発明者らは、極めて低い投与量をすぐに用いて、ＰＰ２１ １μgのみと参照ＭＳＰ３－ＬＳＰ １０μgとを比較した（過去、実験用マウスでは、１０μGは、臨床において用いられる１５μGと有意差がないことが見出された）。異なる手段によって、これらの差異を決定した。図６～９を参照のこと。結果は、４つ群のＢａｌｂ／Ｃ及びＣ５７ｂｌマウスにおいて、４つの区別可能なバッチのＰＰ２１で再現可能であった。さらに、マウス及びリスザルにおいて、１μgと比較して低い投与量、例えば０．２μgに着目したＰＰ２１用量設定を検討した。免疫原性が高いので、本発明者らはまた、３回の免疫化と比較した２回のみの免疫化を検討した。
【0120】
２．ＡＤＣＩターゲットのより広範囲の認識：ワクチン構築物に含まれるペプチド「ｂ」、「ｃ」及び「ｄ」は、ＡＤＣＩにおいて有効な抗体によってターゲティングされる区別可能なＢ細胞エピトープを規定する。図９に示されているように、ＰＰ２１（右側パネル）をワクチン接種したマウスの血清では、現行ＭＳＰ３－１－ＬＳＰ（左側パネル）と比較して、それぞれ１及び１０μgにおいてこれらのペプチドとの反応性が高かったが、これは、ＰＰ２１では、ＡＤＣＩターゲットの認識の規模及び範囲がより高度かつより広範であることを示唆している。この知見と一致して、ＰＰ２１では、主にペプチ≪ｂ≫及び≪ｃ－ｄ≫を介して交差反応性を示すＭＳＰ３ファミリーのメンバー ６個の認識パターンがより広範であった。これはまた、ＰＰ２１によって誘発された抗体が、１個だけではなくメロゾイト表面上のタンパク質 ６個への抗体架橋によるトリガーを介してＡＤＣＩをトリガーすることを意味する。
【0121】
３．ヒトリンパ球における非常に高度なＢ細胞応答：より重要なことに、ＨＩＭＭモデルにおいて評価したヒトＢ細胞応答は、同様の大きな改善を示し、免疫原性が４０～１００倍増加した（図１０）。並行実験では、９６アミノ酸の現行ＭＳＰ３－ＬＳＰと対比してＰＰ２１を使用したところ、抗体力価は、ＰＰ２１ １μgでは、ＭＳＰ３－ＬＳＰ １０μgよりも２０～１００倍高かった。結果は、３つのＨＬＡクラスに属する動物 ５匹の３つの群において再現可能であった。
【0122】
４．アジュバントとしてMontanide ISA720又はMF59のいずれかを使用した場合にも、結果は再現可能である（図１４）。
【0123】
５．寄生虫成分ＭＳＰ３－ＬＳＰでヒトリンパ球をin vitroでチャレンジしたところ、高いＩＦＮ－γ分泌が得られた（図１１）。この重要な結果は、ＣＲＭ Ｔｈエピトープが、plasmodium特異的ＭＳＲ３ Ｔ細胞エピトープを無効化しなかったので、寄生虫によるチャレンジの際にワクチン接種個体からＴ細胞ヘルプを期待することができ、必要な場合には迅速な既往抗体上昇の可能性が高くなることを示している。
【0124】
サイトカインプロファイルの詳細な分析は、応答細胞はＴヘルパー１型タイプが優位であることを示している（図１２は、ＣＸＣＬ１０及びＴｂｅｔを用いて得られた結果の例を示す）。
【0125】
６．細胞親和性ＩｇＧ１の優位：アイソタイプの研究により、強いＴｈ１応答では予想どおり、ほぼ全てがＩｇＧ１から構成される細胞親和性アイソタイプ（これは、ＭＳＰ３－ＬＳＰ免疫化個体においても優位なアイソタイプである）が非常に優位であることが明らかになった。これは、アジュバントとしてMontanide又はMF59のいずれかを使用した場合に当てはまった（図１５及び１６）。これらの結果は、ヒトモデルにおいて得られたが、それらは、志願者において誘発され得る将来の応答を非常によく表すものである。
【0126】
７．ネイティブな寄生虫タンパク質との反応性：ＩＦＡＴ（図１３）及びウエスタンブロットにおいて、ＰＰ２１ワクチン接種によって誘発された抗体は、寄生虫ネイティブタンパク質と反応した。合成抗原だけではなく、何よりも寄生虫タンパク質との抗体の反応性が、マラリア発作中にＡＤＣＩ保護機構を活性化するために、及び天然寄生虫チャレンジによる抗体応答の適切な増強のために重要な特徴である。
【0127】
８．非常に低い免疫化用量は効率的である：ＭＳＰ３－ＬＳＰについて、免疫化 １回当たり０．２μg及び１μgを１０μgと比較して評価した（図１７）。ＰＰ２１用量 １μgでは、２回目の免疫化後にプラトーに到達したのに対して、用量 ０．２μgでは、ほぼ同じ高レベルの抗体に到達するために、３回目の免疫化が必要であり、動物 １匹は応答しなかった。それでもなお、１μgプロファイルは、２回の免疫化が十分であり得るので、検証に値し得ることを示している。
【0128】
９．南米Saimiri sciureusサルでは、同様の高い免疫原性が観察される（図２０）：Montanide 720をアジュバント添加したＰＰ２１ １μg及び０．２μgを使用して、免疫化に対して通常は応答不良の南米霊長類を免疫化した。１μgでは、マウスにおいて見られた力価に近い高い応答が達成され（図１８を参照のこと）、０．２μgでは、力価は約５倍低かった（示さず）。本発明者らのブラジル人の同僚は、同じ実験における力価の比較をまだ実施していないが、このモデルにおいて用いた場合、ＭＳＰ３ ＬＳＰは非常に低免疫原性であった。
【0129】
１０．免疫応答の持続時間は、顕著に改善する（図８上パネル及び下パネル）：長期分析により、必須成分の顕著な改善が示された；抗体応答の持続期間：ＰＰ２１又はＬＳＰで免疫化したマウスを免疫後６カ月間経過観察した。６カ月の時点において、残存力価は、ＭＳＰ３－ＬＳＰを使用して得られたピークよりも高いように、力価の低下は漸進的であるが遅い。力価は、現行ＭＳＰ３－ＬＳＰでは約１／５００００の範囲であったのと比較して、ＰＰ２１では、６カ月間超にわたって依然として１／２０００００～１／３０００００の範囲内であった。
【0130】
実施例２：ＰＰ２５（ＣＲＭＰ９７－ＬＳＡ３融合構築物）の免疫原性
ＬＳＡ３は、多くの魅力的な特徴を有する前赤血球期抗原であり、保護志願者と非保護志願者のディファレンシャルな応答の対比によって発見され、系統間で保存されており、高等霊長類及びチンパンジーを含む広範囲の動物において非常に抗原性かつ免疫原性であり、後者の場合には、スポロゾイト期のヒト寄生虫Plasmodium falciparumによる大規模チャレンジに対して保護的な免疫応答を誘導する。保護は、抗原特異的インターフェロンガンマ応答に関連する。コンジュゲートもいかなる融合も伴わないＬＳＡ３（ＤＧ７２９）を使用したコントロール構築物とＰＰ２５の免疫原性を比較した。免疫化及び免疫分析の条件は、ＰＰ２１に関する上記のものと同一である。
ＬＳＡ３は、多くの魅力的な特徴を有する前赤血球期抗原であり、保護志願者と非保護志願者のディファレンシャルな応答の対比によって発見され、系統間で保存されており、高等霊長類及びチンパンジーを含む広範囲の動物において非常に抗原性かつ免疫原性であり、後者の場合には、スポロゾイト期のヒト寄生虫Plasmodium falciparumによる大規模チャレンジに対して保護的な免疫応答を誘導する。保護は、抗原特異的インターフェロンガンマ応答に関連する。コンジュゲートもいかなる融合も伴わないＬＳＡ３（ＤＧ７２９）を使用したコントロール構築物とＰＰ２５の免疫原性を比較した。免疫化及び免疫分析の条件は、ＰＰ２１に関する上記のものと同一である。
【0131】
低用量で抗原を使用した場合であっても、ＰＰ２１におけるＭＳＰ３の場合と同様に、ＬＳＡ３－ＣＲＭ９７バイオ融合物でも同様の抗体応答の大きな増加が観察された。担体を有しないＬＳＡ３（ＤＧ７２９）は既に、ＩＦＮ－ｇ応答の非常に優れたインデューサーあるので、ＩＦＮ－γ応答の増加も見られたがあまり顕著ではなかった。
【0132】
ｂａｌｂ／Ｃ及びＣ５７ｂｌマウスにおいて記録された増加は、ヒト免疫原性モデルにおいても確認された。
【0133】
本発明者らはさらに、抗ＬＳＡ３抗体力価と、スポロゾイト期のP. falciparum寄生虫の阻害との間の非常に強い相関を示した。
【0134】
図２１～２６に示されている結果を参照のこと。
【0135】
実施例３：ＰＰ２３（ＭＳＰ３－２－ＣＲＭＰ９７－ＭＳＰ３－３融合構築物）の免疫原性
ＭＳＰ３－１とＣＲＭ及びＬＳＡ３との融合に依拠するＰＰ２１を用いて得られた結果は、ＣＲＭを有する構築物（ＰＰ２３と称される）において、赤血球期由来の他の抗原、例えばＭＳＰ３－２及びＭＳＰ３－３を使用して再現可能であることが証明された。実際、ＨＩＭＭモデルに移植したヒトリンパ球では、構築物ＰＰ２３（ＭＳＰ３－２－ＣＲＭＰ９７－ＭＳＰ３－３）によって、強いＢ細胞応答及びＴ細胞応答が誘発され（図２７）、力価は、Montanide中ＭＳＰ３－２ ＣＴのみで免疫化したマウスよりも平均１０倍高い。抗体サブクラスは、ＡＤＣＩ機構において単球と協調して作用することができる主要な細胞親和性クラスであるＩｇＧ１クラスが優位であった。ＭＳＰ３－２又はＭＳＰ３－３のいずれかによってin vitroで再刺激したＰＰ２３免疫化ヒトリンパ球によるＩＦＮ－γ分泌によって測定したところ同様に強いＴ細胞応答が誘導された。
ＭＳＰ３－１とＣＲＭ及びＬＳＡ３との融合に依拠するＰＰ２１を用いて得られた結果は、ＣＲＭを有する構築物（ＰＰ２３と称される）において、赤血球期由来の他の抗原、例えばＭＳＰ３－２及びＭＳＰ３－３を使用して再現可能であることが証明された。実際、ＨＩＭＭモデルに移植したヒトリンパ球では、構築物ＰＰ２３（ＭＳＰ３－２－ＣＲＭＰ９７－ＭＳＰ３－３）によって、強いＢ細胞応答及びＴ細胞応答が誘発され（図２７）、力価は、Montanide中ＭＳＰ３－２ ＣＴのみで免疫化したマウスよりも平均１０倍高い。抗体サブクラスは、ＡＤＣＩ機構において単球と協調して作用することができる主要な細胞親和性クラスであるＩｇＧ１クラスが優位であった。ＭＳＰ３－２又はＭＳＰ３－３のいずれかによってin vitroで再刺激したＰＰ２３免疫化ヒトリンパ球によるＩＦＮ－γ分泌によって測定したところ同様に強いＴ細胞応答が誘導された。
【0136】
実施例４：ＬＳＡ５－ＣＲＭ
ＰＥＢＳ（前赤血球期及び血液期抗原）としても公知の肝臓期抗原－５（ＬＳＡ－５）又はＳＲ １１．１（１１．１ P.falciparum遺伝子のサブ領域）は、単一分子中にＭＳＰ３及びＬＳＡ３の両方の特徴を併せ持つ。それは、メガ遺伝子Ｐｆ １１．１の残りとそれとを区別するユニークな配列を含有し、系統間で完全に保存されている。それは、前赤血球期及び無性血液期の両方に対する保護を誘導するので、放射線弱毒化スポロゾイトで免疫化した志願者由来の血清によってそれが認識されたことはユニークである。それは、前赤血球期及び血液期の両方において発現される。前赤血球期に対するＬＳＡ５の保護的役割は、収束in vitro侵入阻害研究、抗ＬＳＡ５抗体の受動伝達によるin vivo保護によって、及びリコンビナントＬＳＡ５のワクチン接種によるチャレンジから保護された霊長類における概念実証研究によって裏付けられている。血液期に対して、天然に存在するヒト抗Ｐｆ ＬＳＡ５抗体及び人工的に誘導された動物抗Ｐｆ ＬＳＡ５抗体は両方とも、寄生虫殺傷ＡＤＣＩ媒介性効果を発揮する。流行地域の個体では、抗原性が高く、相関免疫（すなわち、曝露によって誘導される保護）を有する個体では、ＩｇＧ３抗体が優位である。多数の疫学的研究により、臨床的マラリア発作に対する保護と、薬物処置脳マラリアの予後の改善との強い関連性が見出された。最後に、ＬＳＡ５は高度に免疫原性であり、マウスにおいて顕著に高い力価を達成し、ＭＳＰ３免疫化マウス由来の血清よりも高いＡＤＣＩ活性を達成する。
ＰＥＢＳ（前赤血球期及び血液期抗原）としても公知の肝臓期抗原－５（ＬＳＡ－５）又はＳＲ １１．１（１１．１ P.falciparum遺伝子のサブ領域）は、単一分子中にＭＳＰ３及びＬＳＡ３の両方の特徴を併せ持つ。それは、メガ遺伝子Ｐｆ １１．１の残りとそれとを区別するユニークな配列を含有し、系統間で完全に保存されている。それは、前赤血球期及び無性血液期の両方に対する保護を誘導するので、放射線弱毒化スポロゾイトで免疫化した志願者由来の血清によってそれが認識されたことはユニークである。それは、前赤血球期及び血液期の両方において発現される。前赤血球期に対するＬＳＡ５の保護的役割は、収束in vitro侵入阻害研究、抗ＬＳＡ５抗体の受動伝達によるin vivo保護によって、及びリコンビナントＬＳＡ５のワクチン接種によるチャレンジから保護された霊長類における概念実証研究によって裏付けられている。血液期に対して、天然に存在するヒト抗Ｐｆ ＬＳＡ５抗体及び人工的に誘導された動物抗Ｐｆ ＬＳＡ５抗体は両方とも、寄生虫殺傷ＡＤＣＩ媒介性効果を発揮する。流行地域の個体では、抗原性が高く、相関免疫（すなわち、曝露によって誘導される保護）を有する個体では、ＩｇＧ３抗体が優位である。多数の疫学的研究により、臨床的マラリア発作に対する保護と、薬物処置脳マラリアの予後の改善との強い関連性が見出された。最後に、ＬＳＡ５は高度に免疫原性であり、マウスにおいて顕著に高い力価を達成し、ＭＳＰ３免疫化マウス由来の血清よりも高いＡＤＣＩ活性を達成する。
【0137】
E. coliにおいて、ＬＳＡ５とＣＲＭ１９７とのバイオ融合物（その原理は先の３つの実施例と同様である）を発現させ、その抗原性を確認し、予備的免疫原性研究を行った。ＣＲＭとの融合物を使用した場合、ＬＳＡ５免疫原性は非常に高かった（図２８）；ＢＡＬｂ／ｃマウス（ｎ＝５）において、バイオ融合ＬＳＡ５－ＣＲＭ／Montanide ISA720 用量１０μgと１μgの免疫原性を、比較した。実験条件は、図８に記載されているＭＳＰ３を用いたものと同様であった。０日目、１４日目及び２８日目に、バイオ融合ＬＳＡ５－ＣＲＭ／Montanide ISA 720による免疫化を実施した（矢印）。０日目、７日目、２１日目、４２日目に収集した血清を使用して、抗原としてのＬＳＡ５－ＬＳＰに対するＥＬＩＳＡ力価測定によって、血清抗体検出を実施した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】
【外国語明細書】