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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022117411
(43)【公開日】2022-08-10
(54)【発明の名称】齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有する齧歯類
(51)【国際特許分類】
A01K 67/027 20060101AFI20220803BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220803BHJP
【ＦＩ】
A01K67/027 ZNA
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021162653
(22)【出願日】2021-10-01
(31)【優先権主張番号】P 2021013282
(32)【優先日】2021-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
(71)【出願人】
【識別番号】504013775
【氏名又は名称】学校法人 埼玉医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】片桐 岳信
(72)【発明者】
【氏名】塚本 翔
(72)【発明者】
【氏名】倉谷 麻衣
(57)【要約】
【課題】ヒトなどの霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映した動物モデルとして利用可能な齧歯類の提供。
【解決手段】ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有し、前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を含む齧歯類である。
【選択図】なし
【解決手段】ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有し、前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を含む齧歯類である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有し、
前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を含むことを特徴とする齧歯類。
前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を含むことを特徴とする齧歯類。
【請求項2】
霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映したモデルである請求項１に記載の齧歯類。
【請求項3】
マウス及びラットのいずれかである請求項１から２のいずれかに記載の齧歯類。
【請求項4】
異所性骨化が抑制される請求項１から３のいずれかに記載の齧歯類。
【請求項5】
肝においてリンパ球が浸潤している請求項１から４のいずれかに記載の齧歯類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有する齧歯類に関する。
【背景技術】
【0002】
骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）は、トランスフォーミング増殖因子β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β、ＴＧＦ－β）ファミリーに分類される成長因子の一群である。ＢＭＰはＢＭＰ１５までが同定されており、それらがホモ又はヘテロ二量体として、骨や軟骨、筋肉などの運動器の発生や維持、肝臓における鉄代謝など、多彩な生理活性を発揮する。
【0003】
ＢＭＰを含むＴＧＦ－βファミリーの活性は、標的細胞が細胞膜上に発現するアクチビン様キナーゼ（Ａｃｔｉｖｉｎ Ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ、ＡＬＫ）１～ＡＬＫ７と呼ばれる７種類のＩ型に分類される膜貫通型セリン・スレオニンキナーゼ受容体によって伝達される。しかし、ＴＧＦ－βファミリーの活性は、別の膜貫通型セリン・スレオニンキナーゼであるＩＩ型受容体や、さまざまな因子によって修飾されており、生体内での生理作用には未だ不明な点が多い。
【0004】
ＡＬＫ２は、ＢＭＰの骨誘導活性を伝達する膜貫通型セリン・スレオニンキナーゼ受容体である。ＡＬＫ２は、遺伝子変異で発症する難病との関連が報告されている。前記遺伝子変異で発症する疾患としては、例えば、全身で異所性骨化が起こる進行性骨化性線維異形成症（Ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ、ＦＯＰ）、腱や靭帯が骨化するびまん性特発性骨増殖症（Ｄｉｆｆｕｓｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｈｙｐｅｒｏｓｔｏｓｉｓ、ＤＩＳＨ）、小児の脳腫瘍であるびまん性橋膠腫（Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｐｏｎｔｉｎｅ Ｇｌｉｏｍａ、ＤＩＰＧ）、先天性心疾患（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＣＨＤｓ）などがある。
【0005】
ＢＭＰやＴＧＦ－βファミリーの活性の生理的役割や、関連疾患の発症機序、治療薬の開発などは、主にマウスをモデルとして研究されている。しかし、ＦＯＰ症例の変異をマウスＡＬＫ２に導入しても、マウスは出生直後に死亡してしまい、ラインとして病態モデルを樹立できないのが現状である（例えば、非特許文献１参照）。
【0006】
したがって、ヒトのＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映できるマウスモデルの確立が強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ ＳＡ， Ｚｈａｎｇ Ｄ， Ｃｕｌｂｅｒｔ ＡＬ， Ｃｏｎｖｅｎｔｅ ＭＲ， Ｃａｒｏｎ ＲＪ， Ｗｒｉｇｈｔ ＡＣ， Ｍａｉｄｍｅｎｔ ＡＤ， Ｋａｐｌａｎ ＦＳ， Ｓｈｏｒｅ ＥＭ． Ａｎ Ａｃｖｒ１ Ｒ２０６Ｈ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｈａｓ ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ． Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ． ２０１２ Ａｕｇ；２７（８）：１７４６－５６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ヒトなどの霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映した動物モデルとして利用可能な齧歯類を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、ＡＬＫ１～ＡＬＫ７と呼ばれる７種類のＩ型に分類される膜貫通型セリン・スレオニンキナーゼ受容体の中で、ＡＬＫ２だけは、マウスとヒトで活性に差があること、マウスＡＬＫ２はヒトＡＬＫ２よりも活性が高いこと、この主たる原因は細胞内のキナーゼ領域に位置する３３０番の１アミノ酸残基の違いによることを知見した。
【0010】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有し、
前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を含むことを特徴とする齧歯類である。
＜１＞ ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有し、
前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を含むことを特徴とする齧歯類である。
【発明の効果】
【0011】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、ヒトなどの霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映した動物モデルとして利用可能な齧歯類を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
（齧歯類）
本発明の齧歯類（以下、「ＡＬＫ２ Ｓ３３０置換齧歯類」、「ＡＬＫ２ Ｓ３３０変異齧歯類」、「ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ齧歯類」、「ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ変異齧歯類」と称することがある。）は、ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有し、前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の変異を含む。
本発明の齧歯類（以下、「ＡＬＫ２ Ｓ３３０置換齧歯類」、「ＡＬＫ２ Ｓ３３０変異齧歯類」、「ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ齧歯類」、「ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ変異齧歯類」と称することがある。）は、ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有し、前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の変異を含む。
【0014】
＜ＡＬＫ２＞
前記ＡＬＫ２は、ＢＭＰの骨誘導活性を伝達する膜貫通型セリン・スレオニンキナーゼ受容体である。前記ＡＬＫ２は、ＦＯＰ、ＤＩＳＨ、ＤＩＰＧ、ＣＨＤｓなどの遺伝子変異で発症する難病との関連が報告されている。
前記ＡＬＫ２は、ＢＭＰの骨誘導活性を伝達する膜貫通型セリン・スレオニンキナーゼ受容体である。前記ＡＬＫ２は、ＦＯＰ、ＤＩＳＨ、ＤＩＰＧ、ＣＨＤｓなどの遺伝子変異で発症する難病との関連が報告されている。
【0015】
前記ＡＬＫ２のアミノ酸配列情報は、公知のデータベースから入手することができる。
例えば、データベース「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）」では、ヒトＡＬＫ２はＮＰ＿００１０９６、サルＡＬＫ２はＮＰ＿００１２４７６９０．１、マウスＡＬＫ２はＮＰ＿００１１０３６７５．１、ラットＡＬＫ２はＮＰ＿０７７８１２．１のアクセッション番号で入手することができる。
例えば、データベース「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）」では、ヒトＡＬＫ２はＮＰ＿００１０９６、サルＡＬＫ２はＮＰ＿００１２４７６９０．１、マウスＡＬＫ２はＮＰ＿００１１０３６７５．１、ラットＡＬＫ２はＮＰ＿０７７８１２．１のアクセッション番号で入手することができる。
【0016】
前記ＡＬＫ２のアミノ酸配列における３３０番目のアミノ酸は、齧歯類ではセリンであるのに対し、霊長類ではプロリンであり、両者は異なっている。
後述する〔実施例〕の項目に示したように、７種のＩ型受容体の中で、ＡＬＫ２は霊長類のヒトより齧歯類のマウスの方が、活性が高い。
後述する〔実施例〕の項目に示したように、７種のＩ型受容体の中で、ＡＬＫ２は霊長類のヒトより齧歯類のマウスの方が、活性が高い。
【0017】
本発明の齧歯類は、ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有する。
前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を少なくとも含む。
前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を少なくとも含む。
【0018】
上記したように、ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目に位置するアミノ酸は、齧歯類と霊長類とで異なっている。
また、後述する〔実施例〕の項目に示したように、霊長類のヒトのＡＬＫ２における３３０番目のプロリンを齧歯類のマウス型のセリンに変えるとＢＭＰ活性が上昇し、齧歯類のマウスのＡＬＫ２における３３０番目のセリンを霊長類のヒト型のプロリンや、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンに変えるとＢＭＰ活性が低下する。そのため、ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目に位置するアミノ酸が、活性を制御していると考えられる。
本発明の齧歯類では、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を有することで、霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映することができる。前記変異の中でも、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンをプロリンとする変異が好ましい。
また、後述する〔実施例〕の項目に示したように、霊長類のヒトのＡＬＫ２における３３０番目のプロリンを齧歯類のマウス型のセリンに変えるとＢＭＰ活性が上昇し、齧歯類のマウスのＡＬＫ２における３３０番目のセリンを霊長類のヒト型のプロリンや、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンに変えるとＢＭＰ活性が低下する。そのため、ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目に位置するアミノ酸が、活性を制御していると考えられる。
本発明の齧歯類では、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を有することで、霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映することができる。前記変異の中でも、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンをプロリンとする変異が好ましい。
【0019】
前記齧歯類は、前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子のヘテロ接合型であってもよいし、ホモ接合型であってもよいが、ホモ接合型であることが好ましい。
【0020】
前記齧歯類は、霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映したモデルとして好適に用いることができる。霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映するとは、齧歯類において、霊長類におけるＡＬＫ２と、そのリガンドであるＢＭＰとの作用を反映することをいう。
前記ＢＭＰの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ＢＭＰの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0021】
前記齧歯類の種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウス、ラット、スナネズミ、オキナワハツカネズミ、シッキムハツカネズミ、チャイニーズハムスター、などが挙げられる。これらの中でも、実験動物として有用である点で、マウス及びラットのいずれかが好ましい。
【0022】
前記霊長類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サルなどが挙げられる。これらの中でも、ヒトが好ましい。
【0023】
本発明の齧歯類は、後述する〔実施例〕の項目に示したように、野生型ＡＬＫ２遺伝子を有する齧歯類と比べて、異所性骨化が抑制される。また、野生型ＡＬＫ２遺伝子を有する齧歯類と異なり、肝においてリンパ球の浸潤が認められる。
【0024】
前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子におけるその他の変異としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＯＰ、ＤＩＳＨ、ＤＩＰＧ、ＣＨＤｓなどの遺伝子変異で発症する疾患における遺伝子変異などが挙げられる。
本発明の齧歯類は、ヒトなどの霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映できるため、ヒトなどの霊長類の遺伝性疾患の変異を更に導入することで、前記遺伝性疾患を反映したモデルとすることができる。
本発明の齧歯類は、ヒトなどの霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映できるため、ヒトなどの霊長類の遺伝性疾患の変異を更に導入することで、前記遺伝性疾患を反映したモデルとすることができる。
【0025】
本発明の齧歯類は、ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸を霊長類型にしているため、齧歯類野生型ＡＬＫ２よりも活性が低くなり、霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映できる。そのため、従来マウスで樹立することができなかった遺伝性疾患の病態モデルを樹立し得る。
【0026】
本発明の齧歯類の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク、ガイドＲＮＡ（齧歯類ＡＬＫ２遺伝子内配列）及び、ドナーオリゴＤＮＡ（齧歯類ＡＬＫ２遺伝子配列由来）を用いたゲノム編集技術による変異導入により製造する方法などが挙げられる。
【0027】
例えば、前記齧歯類としてマウスを用いる場合は、前記ガイドＲＮＡとして、例えば、配列番号１で表される配列を標的配列とするものを用い、前記ドナーオリゴＤＮＡとして、配列番号２で表される配列のものを用いる方法などが挙げられる。この例の場合、ｃｈｒ２： ５８，４６２，９５１－５８，４６２，９５９の座位（ＡＬＫ２遺伝子の第８エクソン上）に合計４塩基の変異が導入される。なお、３３１番目及び３３２番目のアミノ酸配列は同義置換のためＡｌａ－Ｉｌｅのままであり、３３０番目のＳｅｒがＰｒｏに置換される。
＜ガイドＲＮＡの標的配列＞
５’－ＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧｃｇｇ－３’（配列番号１：ｃｈｒ２： ５８，４６２，９３６－５８，４６２，９５８）
配列番号１中の小文字部分（ｃｇｇ）はＰＡＭ配列を示す。
＜ドナーオリゴＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）＞
５’－ＧＧＴＴＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＣＡＴＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡ－３’（配列番号２）
配列番号２中の下線部は、変異箇所を示す。
＜ガイドＲＮＡの標的配列＞
５’－ＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧｃｇｇ－３’（配列番号１：ｃｈｒ２： ５８，４６２，９３６－５８，４６２，９５８）
配列番号１中の小文字部分（ｃｇｇ）はＰＡＭ配列を示す。
＜ドナーオリゴＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）＞
５’－ＧＧＴＴＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＣＡＴＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡ－３’（配列番号２）
配列番号２中の下線部は、変異箇所を示す。
【0028】
本発明の齧歯類は、霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達の運動器や肝臓などにおける生理的役割を齧歯類で解析することを可能にすると共に、ＡＬＫ２の遺伝子変異で起こるさまざまな疾患の発症機序の解明や、前記疾患や骨折などの治療薬・予防薬等の開発に応用が期待できる。また、ＡＬＫ２の遺伝的変異に起因するＦＯＰ、ＤＩＳＨ等による異所性骨化やＤＩＰＧの病態モデルや、ＡＬＫ２のシグナルを解析するための実験用動物としても利用可能である。
【実施例0029】
以下に本発明の試験例を説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【0030】
（試験例１：７種のＩ型受容体の中でＡＬＫ２はヒトよりマウスの活性が高い）
ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて、７種のＩ型受容体を介した細胞内シグナルの活性を測定した。
具体的には、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナー社製）に播種し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ１（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ１」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ２」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ３（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ３」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ４（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ４」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ５（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ５」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ６（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ６」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ７（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ７」と称することがある。）、又はｐｃＤＥＦ３（プラスミドのトータル量を一定量に合わせるために使用。「モック」と称することがある。）と、ｐＧＬ４．２６／ＩｄｌＷＴ４Ｆ－ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，７，９４９ （２００２）； Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ４０７， ２１３ （２０１１））と、ｐｈＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。２．５時間後、それぞれ、０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「Ｂ９」と称することがある。）、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、「Ｂ７」と称することがある。）、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２（Ｃｏｒｅｆｒｏｎｔ社製、「Ｂ２」と称することがある。）、１０ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「ＡｃｔＡ」と称することがある。）、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「Ｔｂ１」と称することがある。）、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「ＧＤＦ５」と称することがある。）、又は１０ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ Ｂ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「ＡｃｔＢ」と称することがある。）を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ファイアフライ（Ｆｉｒｅｆｌｙ）及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ活性をプレートリーダー ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて、７種のＩ型受容体を介した細胞内シグナルの活性を測定した。
具体的には、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナー社製）に播種し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ１（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ１」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ２」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ３（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ３」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ４（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ４」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ５（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ５」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ６（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ６」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ７（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ＡＬＫ７」と称することがある。）、又はｐｃＤＥＦ３（プラスミドのトータル量を一定量に合わせるために使用。「モック」と称することがある。）と、ｐＧＬ４．２６／ＩｄｌＷＴ４Ｆ－ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，７，９４９ （２００２）； Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ４０７， ２１３ （２０１１））と、ｐｈＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。２．５時間後、それぞれ、０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「Ｂ９」と称することがある。）、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、「Ｂ７」と称することがある。）、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２（Ｃｏｒｅｆｒｏｎｔ社製、「Ｂ２」と称することがある。）、１０ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「ＡｃｔＡ」と称することがある。）、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「Ｔｂ１」と称することがある。）、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「ＧＤＦ５」と称することがある。）、又は１０ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ Ｂ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、「ＡｃｔＢ」と称することがある。）を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ファイアフライ（Ｆｉｒｅｆｌｙ）及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ活性をプレートリーダー ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
【0031】
骨誘導性シグナル（Ｓｍａｄ１／５／９）の活性を測定した結果を図１Ａに、非骨誘導性シグナル（Ｓｍａｄ２／３）の活性を測定した結果を図１Ｂに示す。図１Ａ及び１Ｂ中の横軸の項目はモック又は各Ｉ型受容体を表し、各項目における棒グラフは左から順にモック、ヒト、マウスの場合の結果を表す。
図１Ａ及び１Ｂに示したように、骨誘導性シグナルの伝達に関与するＡＬＫ２では、ヒトよりもマウスの方が、活性が数倍高いことが確認された。
図１Ａ及び１Ｂに示したように、骨誘導性シグナルの伝達に関与するＡＬＫ２では、ヒトよりもマウスの方が、活性が数倍高いことが確認された。
【0032】
（試験例２：ＡＬＫ２の３３０番アミノ酸が活性を制御する）
ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて、ＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの活性を測定した。
具体的には、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナー社製）に播種し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ヒト」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（Ｐ３３０Ｓ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型における３３０番目のプロリンをセリンに置換し、マウス型に改変、「ｈＰ３３０Ｓ」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／マウスＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（マウス野生型、「マウス」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／マウスＡＬＫ２（Ｓ３３０Ｐ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（マウス野生型における３３０番目のセリンをプロリンに置換し、ヒト型に改変、「ｍＳ３３０Ｐ」と称することがある。）、又はｐｃＤＥＦ３（プラスミドのトータル量を一定量に合わせるために使用。「モック」と称することがある。）と、ｐＧＬ４．２６／ＩｄｌＷＴ４Ｆ－ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，７，９４９ （２００２）； Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ４０７， ２１３ （２０１１））と、ｐｈＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。２．５時間後、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）若しくは、０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ファイアフライ（Ｆｉｒｅｆｌｙ）及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ活性をプレートリーダー ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて、ＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの活性を測定した。
具体的には、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナー社製）に播種し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ヒト」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（Ｐ３３０Ｓ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型における３３０番目のプロリンをセリンに置換し、マウス型に改変、「ｈＰ３３０Ｓ」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／マウスＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（マウス野生型、「マウス」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／マウスＡＬＫ２（Ｓ３３０Ｐ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（マウス野生型における３３０番目のセリンをプロリンに置換し、ヒト型に改変、「ｍＳ３３０Ｐ」と称することがある。）、又はｐｃＤＥＦ３（プラスミドのトータル量を一定量に合わせるために使用。「モック」と称することがある。）と、ｐＧＬ４．２６／ＩｄｌＷＴ４Ｆ－ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，７，９４９ （２００２）； Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ４０７， ２１３ （２０１１））と、ｐｈＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。２．５時間後、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）若しくは、０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ファイアフライ（Ｆｉｒｅｆｌｙ）及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ活性をプレートリーダー ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
【0033】
ＢＭＰ７を用いた場合の結果を図２Ａに、ＢＭＰ９を用いた場合の結果を図２Ｂに示す。図２Ａ及び２Ｂ中、横軸の項目は使用した発現ベクターを表し、各項目における棒グラフは左側から順に、コントロール、ＢＭＰ７又はＢＭＰ９を用いた場合の結果を示す。
図２Ａ及び２Ｂに示したように、ヒトのＡＬＫ２における３３０番目のプロリンをマウス型のセリンに変えるとＢＭＰ活性が上昇し、マウスのＡＬＫ２における３３０番目のセリンをヒト型のプロリンに変えるとＢＭＰ活性が低下することが確認された。
図２Ａ及び２Ｂに示したように、ヒトのＡＬＫ２における３３０番目のプロリンをマウス型のセリンに変えるとＢＭＰ活性が上昇し、マウスのＡＬＫ２における３３０番目のセリンをヒト型のプロリンに変えるとＢＭＰ活性が低下することが確認された。
【0034】
（試験例３：ＡＬＫ２ ３３０番アミノ酸がリガンド依存的活性を制御する）
ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて、ＡＬＫ２を介したリガンド依存的活性を測定した。
具体的には、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナー社製）に播種し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ Ｃ０２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ｈＡ２ＷＴ」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（Ｐ３３０Ｓ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型における３３０番目のプロリンをセリンに置換し、マウス型に改変、「ｈＡ２（Ｐ３３０Ｓ）」と称することがある。）、又はｐｃＤＥＦ３（プラスミドのトータル量を一定量に合わせるために使用。「モック」と称することがある。）と、ｐＧＬ４．２６／ＩｄｌＷＴ４Ｆ－ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，７，９４９ （２００２）； Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ４０７， ２１３ （２０１１））と、ｐｈＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。２．５時間後、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２（Ｃｏｒｅｆｒｏｎｔ社製）、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）、ＢＭＰ５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ７（Ｍｉ１ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、ＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ１０（Ｍｉ１ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、ＧＤＦ５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、又はＡｃｔｉｖｉｎ Ｂ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ファイアフライ（Ｆｉｒｅｆｌｙ）及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ活性をプレートリーダー ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて、ＡＬＫ２を介したリガンド依存的活性を測定した。
具体的には、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナー社製）に播種し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ Ｃ０２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型、「ｈＡ２ＷＴ」と称することがある。）、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（Ｐ３３０Ｓ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（ヒト野生型における３３０番目のプロリンをセリンに置換し、マウス型に改変、「ｈＡ２（Ｐ３３０Ｓ）」と称することがある。）、又はｐｃＤＥＦ３（プラスミドのトータル量を一定量に合わせるために使用。「モック」と称することがある。）と、ｐＧＬ４．２６／ＩｄｌＷＴ４Ｆ－ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，７，９４９ （２００２）； Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ４０７， ２１３ （２０１１））と、ｐｈＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。２．５時間後、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２（Ｃｏｒｅｆｒｏｎｔ社製）、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）、ＢＭＰ５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ７（Ｍｉ１ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、ＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ１０（Ｍｉ１ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、ＧＤＦ５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、又はＡｃｔｉｖｉｎ Ｂ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ファイアフライ（Ｆｉｒｅｆｌｙ）及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ活性をプレートリーダー ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
【0035】
結果を図３に示す。図３中、横軸の項目は使用した各種ＢＭＰ、ＧＤＦ５、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ（Ａｃｔ Ｂ）を表し、各項目中の「１、１０、１００」は各種ＢＭＰ、ＧＤＦ５、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ（Ａｃｔ Ｂ）の使用量を表し、各使用量における棒グラフは左側から順に、モック、ｈＡ２ＷＴ、ｈＡ２（Ｐ３３０Ｓ）を用いた場合の結果を示す。
図３に示したように、ＢＭＰ２、４、及び１０では、野生型（ｈＡ２ＷＴ）も変異型（ｈＡ２（Ｐ３３０Ｓ））も発現させると活性が低下した。一方、ＢＭＰ５、６、７、及び９では、変異型にすると活性が上がった。Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂは、野生型は反応しないが、変異型にすると反応していた。
これらの結果から、マウスＡＬＫ２は、ヒトＡＬＫ２の活性を正確に反映しないと考えられる。そのため、従来のヒト遺伝性疾患の変異を導入したマウスのモデルは、おそらくヒトの遺伝性疾患を反映したモデルにはなっていないと考えられる。
図３に示したように、ＢＭＰ２、４、及び１０では、野生型（ｈＡ２ＷＴ）も変異型（ｈＡ２（Ｐ３３０Ｓ））も発現させると活性が低下した。一方、ＢＭＰ５、６、７、及び９では、変異型にすると活性が上がった。Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂは、野生型は反応しないが、変異型にすると反応していた。
これらの結果から、マウスＡＬＫ２は、ヒトＡＬＫ２の活性を正確に反映しないと考えられる。そのため、従来のヒト遺伝性疾患の変異を導入したマウスのモデルは、おそらくヒトの遺伝性疾患を反映したモデルにはなっていないと考えられる。
【0036】
骨誘導因子として発見され、臨床応用の開発が進められたＢＭＰ７は、ＡＬＫ２を受容体として生物活性を発揮するＢＭＰの１つと考えられる。以前から、ＢＭＰは齧歯類では強力な骨誘導活性を示すのに対し、ヒトを含む霊長類では骨誘導活性が弱いことが知られてきたが、その機序は解明されていない。上記の結果から、ＡＬＫ２の３３０番残基の違いが、ＢＭＰ７などのＢＭＰの骨誘導活性に影響している可能性が考えられた。
【0037】
（試験例４：遺伝子改変によるＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐマウスの樹立）
Ｃａｓ９タンパク、ガイドＲＮＡ（マウスＡＬＫ２遺伝子内配列）及び、ドナーオリゴＤＮＡ（マウスＡＬＫ２遺伝子配列由来）を用いたゲノム編集技術（ＣＲＩＳＰＡＲ／Ｃａｓ９）による変異導入により、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ変異マウス（マウスＡＬＫ２における３３０番目のＳｅｒをヒト型のＰｒｏに変えたマウス）を樹立した。ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐマウスでは、ｃｈｒ２： ５８，４６２，９５１－５８，４６２，９５９の座位（ＡＬＫ２遺伝子の第８エクソン上）に合計４塩基の変異を導入した。その結果ＡＬＫ２タンパクの３３０番目のＳｅｒがＰｒｏに置換された（３３１番目及び３３２番目のアミノ酸配列は同義置換のためＡｌａ－Ｉｌｅのまま）。
樹立したマウスは、肉眼的な異常を認めず、通常の交配維持が可能であった。
＜ガイドＲＮＡの標的配列＞
５’－ＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧｃｇｇ－３’（配列番号１：ｃｈｒ２： ５８，４６２，９３６－５８，４６２，９５８）
配列番号１中の小文字部分（ｃｇｇ）はＰＡＭ配列を示す。
＜ドナーオリゴＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）＞
５’－ＧＧＴＴＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＣＡＴＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡ－３’（配列番号２）
配列番号２中の下線部は、変異箇所を示す。
Ｃａｓ９タンパク、ガイドＲＮＡ（マウスＡＬＫ２遺伝子内配列）及び、ドナーオリゴＤＮＡ（マウスＡＬＫ２遺伝子配列由来）を用いたゲノム編集技術（ＣＲＩＳＰＡＲ／Ｃａｓ９）による変異導入により、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ変異マウス（マウスＡＬＫ２における３３０番目のＳｅｒをヒト型のＰｒｏに変えたマウス）を樹立した。ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐマウスでは、ｃｈｒ２： ５８，４６２，９５１－５８，４６２，９５９の座位（ＡＬＫ２遺伝子の第８エクソン上）に合計４塩基の変異を導入した。その結果ＡＬＫ２タンパクの３３０番目のＳｅｒがＰｒｏに置換された（３３１番目及び３３２番目のアミノ酸配列は同義置換のためＡｌａ－Ｉｌｅのまま）。
樹立したマウスは、肉眼的な異常を認めず、通常の交配維持が可能であった。
＜ガイドＲＮＡの標的配列＞
５’－ＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧｃｇｇ－３’（配列番号１：ｃｈｒ２： ５８，４６２，９３６－５８，４６２，９５８）
配列番号１中の小文字部分（ｃｇｇ）はＰＡＭ配列を示す。
＜ドナーオリゴＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）＞
５’－ＧＧＴＴＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＣＡＴＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡ－３’（配列番号２）
配列番号２中の下線部は、変異箇所を示す。
【0038】
（試験例５：ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐマウスでは異所性骨化が抑制される）
ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐの異所性骨化に対する影響をＢＭＰ移植による異所性骨化モデルにて解析した。直径４ｍｍの円形状に切り取り取ったＣｏｌｌａＴａｐｅ（Ｚｉｍｍｅｒ Ｄｅｎｔａｌ社製）に、２．５μｇのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ社製）を染み込ませ凍結乾燥し、ＢＭＰ７ペレットを作製した。ＡＬＫ２ ＷＴ／ＷＴマウス（野生型）、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ／ＷＴマウス（ヘテロ接合体）、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ／Ｓ３３０Ｐマウス（ホモ接合体）を、２％イソフルラン吸引麻酔下で、大腿を切開し、ＢＭＰ７ペレットを骨格筋内に移植した。移植３週間後に、マイクロＣＴ（ＣｏｓｍｏＳｃａｎＧＸ社製）にて異所性骨を解析した。
ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐの異所性骨化に対する影響をＢＭＰ移植による異所性骨化モデルにて解析した。直径４ｍｍの円形状に切り取り取ったＣｏｌｌａＴａｐｅ（Ｚｉｍｍｅｒ Ｄｅｎｔａｌ社製）に、２．５μｇのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ社製）を染み込ませ凍結乾燥し、ＢＭＰ７ペレットを作製した。ＡＬＫ２ ＷＴ／ＷＴマウス（野生型）、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ／ＷＴマウス（ヘテロ接合体）、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ／Ｓ３３０Ｐマウス（ホモ接合体）を、２％イソフルラン吸引麻酔下で、大腿を切開し、ＢＭＰ７ペレットを骨格筋内に移植した。移植３週間後に、マイクロＣＴ（ＣｏｓｍｏＳｃａｎＧＸ社製）にて異所性骨を解析した。
【0039】
結果を図４に示す。図４中、上段（ＷＴ／ＷＴ）は野生型の３個体の結果を示し、中段（Ｓ３３０Ｐ／ＷＴ）はヘテロ接合体の３個体の結果を示し、下段はホモ接合体の３個体の結果を示す。図４中、白抜きの矢印は、異所性骨を示す。
図４に示したように、ヘテロ接合体及びホモ接合体では、野生型と比べて、異所性骨の大きさが小さいことが確認された。この結果は、上記したインビトロで見られた、マウスＡＬＫ２における３３０番目のセリンをプロリンとした際に活性が低くなることを反映した結果であると考えられる。
図４に示したように、ヘテロ接合体及びホモ接合体では、野生型と比べて、異所性骨の大きさが小さいことが確認された。この結果は、上記したインビトロで見られた、マウスＡＬＫ２における３３０番目のセリンをプロリンとした際に活性が低くなることを反映した結果であると考えられる。
【0040】
（試験例６：ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐマウスの肝における表現形質）
ＡＬＫ２ ＷＴ／ＷＴマウス（野生型）、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ／ＷＴマウス（ヘテロ接合体）、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ／Ｓ３３０Ｐマウス（ホモ接合体）から、採取した肝臓を４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で２日間固定後、エタノール脱水後に、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて、パラフィン切片を作製した後、定法に従い、ヘマトキシリン・エオジン染色を施し、カバーガラスで封入し組織標本を作製した。組織標本は、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）により観察した。
ＡＬＫ２ ＷＴ／ＷＴマウス（野生型）、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ／ＷＴマウス（ヘテロ接合体）、ＡＬＫ２ Ｓ３３０Ｐ／Ｓ３３０Ｐマウス（ホモ接合体）から、採取した肝臓を４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で２日間固定後、エタノール脱水後に、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて、パラフィン切片を作製した後、定法に従い、ヘマトキシリン・エオジン染色を施し、カバーガラスで封入し組織標本を作製した。組織標本は、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）により観察した。
【0041】
結果を図５に示す。図５中、上段（ＷＴ／ＷＴ）は野生型の３個体の結果を示し、中段（Ｓ３３０Ｐ／ＷＴ）はヘテロ接合体の３個体の結果を示し、下段はホモ接合体の３個体の結果を示す。
図５に示したように、ヘテロ接合体及びホモ接合体では、肝にリンパ球の浸潤が認められた。
図５に示したように、ヘテロ接合体及びホモ接合体では、肝にリンパ球の浸潤が認められた。
【0042】
試験例５及び６の結果は、ＡＬＫ２がＢＭＰ７による骨誘導活性に重要な受容体であることを示唆すると共に、肝などの組織でＡＬＫ２が未知の生理作用を持つ可能性を示唆する。
【0043】
（試験例７：マウスＡＬＫ２の３３０番アミノ酸の置換）
マウス野生型ＡＬＫ２における３３０番目アミノ酸（セリン）を下記のアミノ酸に置換し、試験例２と同様にして、ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて、ＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの活性を測定した。また、マウス野生型ＡＬＫ２における３３０番目アミノ酸を置換していない場合についても、同様にして試験した。
＜置換したアミノ酸＞
（１） Ｐｒｏ
（２） Ａｌａ
（３） Ａｒｇ
（４） Ａｓｎ
（５） Ａｓｐ
（６） Ｃｙｓ
（７） Ｇｌｎ
（８） Ｇｌｕ
（９） Ｇｌｙ
（１０） Ｈｉｓ
（１１） Ｉｌｅ
（１２） Ｌｅｕ
（１３） Ｌｙｓ
（１４） Ｍｅｔ
（１５） Ｐｈｅ
（１６） Ｔｈｒ
（１７） Ｔｒｐ
（１８） Ｔｙｒ
（１９） Ｖａｌ
マウス野生型ＡＬＫ２における３３０番目アミノ酸（セリン）を下記のアミノ酸に置換し、試験例２と同様にして、ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて、ＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの活性を測定した。また、マウス野生型ＡＬＫ２における３３０番目アミノ酸を置換していない場合についても、同様にして試験した。
＜置換したアミノ酸＞
（１） Ｐｒｏ
（２） Ａｌａ
（３） Ａｒｇ
（４） Ａｓｎ
（５） Ａｓｐ
（６） Ｃｙｓ
（７） Ｇｌｎ
（８） Ｇｌｕ
（９） Ｇｌｙ
（１０） Ｈｉｓ
（１１） Ｉｌｅ
（１２） Ｌｅｕ
（１３） Ｌｙｓ
（１４） Ｍｅｔ
（１５） Ｐｈｅ
（１６） Ｔｈｒ
（１７） Ｔｒｐ
（１８） Ｔｙｒ
（１９） Ｖａｌ
【0044】
具体的には、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナー社製）に播種し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／マウスＡＬＫ２（Ｓ３３０置換）－Ｖ５－Ｈｉｓ（マウス野生型における３３０番目のセリンを上記したアミノ酸に置換したもの）、ｐｃＤＥＦ３／マウスＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ（マウス野生型、３３０番目がセリン）、又はｐｃＤＥＦ３（プラスミドのトータル量を一定量に合わせるために使用。「モック」と称することがある。）と、ｐＧＬ４．２６／ＩｄｌＷＴ４Ｆ－ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，７，９４９ （２００２）； Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ４０７， ２１３ （２０１１））と、ｐｈＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。２．５時間後、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ファイアフライ（Ｆｉｒｅｆｌｙ）及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ活性をプレートリーダー ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
【0045】
結果を図６に示す。図６中、横軸の項目は使用した発現ベクターを表す。なお、モック以外はマウスＡＬＫ２における３３０番目のアミノ酸で表した。
図６に示したように、マウスのＡＬＫ２における３３０番目のセリンを、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンに変えるとＢＭＰ活性が低下することが確認された。
図６に示したように、マウスのＡＬＫ２における３３０番目のセリンを、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンに変えるとＢＭＰ活性が低下することが確認された。
【0046】
以上の結果から、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を含む本発明の齧歯類は、ＢＭＰ活性の弱い霊長類ＡＬＫ２を反映したｉｎ ｖｉｖｏモデルとして利用できる可能性が示された。ヒトなどの霊長類におけるＢＭＰシグナルを反映する齧歯類モデルは、霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナルの運動器や肝臓などにおける生理的役割を齧歯類で解析することを可能にすると共に、ＡＬＫ２の遺伝子変異で起こるさまざまな疾患の発症機序の解明や、前記疾患や骨折などの治療薬・予防薬等の開発に応用が期待できる。
【0047】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有し、
前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を含むことを特徴とする齧歯類である。
＜２＞ 霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映したモデルである前記＜１＞に記載の齧歯類である。
＜３＞ マウス及びラットのいずれかである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の齧歯類である。
＜４＞ 異所性骨化が抑制される前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の齧歯類である。
＜５＞ 肝においてリンパ球が浸潤している前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の齧歯類である。
＜１＞ ＡＬＫ２タンパク質の３３０番目のアミノ酸をコードする位置に変異を有する齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子を有し、
前記齧歯類変異型ＡＬＫ２遺伝子は、齧歯類野生型ＡＬＫ２タンパク質における３３０番目のセリンが、プロリン、アスパラギン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸となる変異を含むことを特徴とする齧歯類である。
＜２＞ 霊長類におけるＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を反映したモデルである前記＜１＞に記載の齧歯類である。
＜３＞ マウス及びラットのいずれかである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の齧歯類である。
＜４＞ 異所性骨化が抑制される前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の齧歯類である。
＜５＞ 肝においてリンパ球が浸潤している前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の齧歯類である。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】