特開2022-117439インビトロパッケージングを用いた多断片ＤＮＡの連結および細胞内導入方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022117439
(43)【公開日】2022-08-10
(54)【発明の名称】インビトロパッケージングを用いた多断片ＤＮＡの連結および細胞内導入方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20220803BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220803BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20220803BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20220803BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20220803BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z ZNA
C12N15/09 Z
C12N1/20 A
C12N9/16 Z
C12N7/01
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021208460
(22)【出願日】2021-12-22
(31)【優先権主張番号】P 2021012661
(32)【優先日】2021-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】300071579
【氏名又は名称】学校法人立教学院
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100187540
【弁理士】
【氏名又は名称】國枝 由紀子
(72)【発明者】
【氏名】野▲崎▼ 晋五
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050DD02
4B050LL01
4B050LL03
4B050LL05
4B065AA26X
4B065AA98X
(57)【要約】
【課題】効率よく迅速に複数のＤＮＡ断片を試験管内で連結して長鎖ＤＮＡを調製し、細胞内に導入することができる方法を提供することを目的とする。
【解決手段】シームレスアセンブリーによって連結した長鎖ＤＮＡを、ファージのインビトロパッケージングを利用して細胞内に導入する。
【選択図】なし
【解決手段】シームレスアセンブリーによって連結した長鎖ＤＮＡを、ファージのインビトロパッケージングを利用して細胞内に導入する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結して、ウイルス粒子にインビトロパッケージングする方法であって、以下：
（１）２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をシームレスアセンブリーによって連結して、１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを形成する工程；
（２）工程（１）において形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結して、１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位を形成する工程；
（３Ａ）該ＤＮＡ構築物単位が１つである場合は、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得る工程；
（３Ｂ）該ＤＮＡ構築物単位が複数である場合は、これらをシームレスアセンブリーによって連結して１つのＤＮＡ構築物を得る工程；および
（４）工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）において得たＤＮＡ構築物をウイルス粒子にインビトロパッケージングする工程
を含む、方法。
（１）２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をシームレスアセンブリーによって連結して、１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを形成する工程；
（２）工程（１）において形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結して、１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位を形成する工程；
（３Ａ）該ＤＮＡ構築物単位が１つである場合は、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得る工程；
（３Ｂ）該ＤＮＡ構築物単位が複数である場合は、これらをシームレスアセンブリーによって連結して１つのＤＮＡ構築物を得る工程；および
（４）工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）において得たＤＮＡ構築物をウイルス粒子にインビトロパッケージングする工程
を含む、方法。
【請求項2】
該ＤＮＡ構築物が、両端にウイルスパッケージング開始部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程（１）および工程（２）を同時に行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
工程（１）および工程（２）において制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片および前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、連結に際して隣接する領域において、それぞれの末端に相同な塩基配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記相同な塩基配列の長さが、１０塩基対以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片、前記直鎖状二本鎖連結ＤＮＡ、および前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、それぞれの両端部分に一本鎖突出端領域を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記一本鎖突出端領域が、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって形成される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、宿主のゲノムＤＮＡと相同な塩基配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記連結ＤＮＡの長さが３８ｋｂ以上である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法を含む、前記ＤＮＡ構築物の細胞内導入方法。
【請求項12】
細胞内に導入したＤＮＡ構築物が環状化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記工程（２）において複数のＤＮＡ構築物単位を形成する、請求項１２に記載の細胞内導入方法。
【請求項14】
細胞としてｒｅｃＡ＋大腸菌を用いる、請求項１３に記載の細胞内導入方法。
【請求項15】
細胞としてΔｒｅｃＡ大腸菌を用いる、請求項１３に記載の細胞内導入方法。
【請求項16】
請求項１４に記載の細胞内導入方法によってＤＮＡ構築物が導入された細胞から、単量体のＤＮＡ構築物単位を回収する工程を含む、ＤＮＡ構築物単位の製造方法。
【請求項17】
請求項１５に記載の細胞内導入方法によってＤＮＡ構築物が導入された細胞から、複数のＤＮＡ構築物単位が連結された多量体ＤＮＡ構築物を回収する工程を含む、多量体ＤＮＡ構築物の製造方法。
【請求項18】
２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングによるクローニングを行うためのキットであって、
直鎖状二本鎖ファージベクターＤＮＡ；
一本鎖突出端生成酵素；
インビトロパッケージング反応溶液；および
大腸菌
を含む、前記キット。
直鎖状二本鎖ファージベクターＤＮＡ；
一本鎖突出端生成酵素；
インビトロパッケージング反応溶液；および
大腸菌
を含む、前記キット。
【請求項19】
前記一本鎖突出端生成酵素が、３’→５’エキソヌクレアーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ、および制限酵素からなる群より選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項20】
１組以上のプライマーセットをさらに含む、請求項１８または１９に記載のキットであって、ここで該プライマーセットは、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片および前記直鎖状二本鎖ファージベクターＤＮＡのそれぞれの末端に、連結に際して隣接する領域において相同な塩基配列を付加するための塩基配列を有するものである、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、２以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡの連結および細胞内導入方法に関する。より詳細には、シームレスアセンブリーとインビトロパッケージングを組み合わせて、２以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡを連結し、細胞内に導入することができる方法に関する。
【背景技術】
【0002】
１０ｋｂ程度のＤＮＡ断片を複数連結させて長鎖ＤＮＡを得る方法としては、現在、酵母の細胞内連結システムを用いる方法が主流であり（特許文献１）、近年では、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の約３０ｋｂのゲノムの合成にも、この酵母の細胞内連結システムが用いられている（非特許文献１）。しかし、酵母は生育が比較的遅いという問題が存在する。
【0003】
酵母に比べて生育の早い大腸菌を用いてＤＮＡをクローニングする方法としては、目的のＤＮＡを環状のプラスミドＤＮＡに組み込む方法が一般的である。酵母に比べて大腸菌は生育が非常に速く、大量のプラスミドを迅速かつ簡便に調製することが可能なためである。しかし、複数のＤＮＡ断片を連結させて、長鎖で環状のプラスミドを作製しようとした場合、反応混合物におけるＤＮＡ断片の濃度が高すぎると、末端同士の結合頻度が低下し、コンカテマーを形成してしまうという問題がある。だからといって、反応混合物におけるＤＮＡ断片の濃度を低下させると、そもそもの連結の効率が低下するというジレンマが存在する。
【0004】
大腸菌を用いた長鎖ＤＮＡのクローニング技術としては、バクテリオファージ（以後、単にファージという）のインビトロパッケージング技術がある（非特許文献２）。インビトロパッケージング技術により、２０－４０ｋｂ程度の長さのＤＮＡのクローニングが可能になった。現在使用されているインビトロパッケージング方法では、制限酵素等によってＤＮＡを切断した後に、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応によって連結されたＤＮＡを使う必要がある（非特許文献３、４）。制限酵素によって露出させた一本鎖ＤＮＡは４塩基程度と短いため、複数のＤＮＡ断片を同時に連結する目的のためには不向きである。したがって、インビトロパッケージング技術はこれまで、すでに存在する長いＤＮＡ、たとえばｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを用いたライブラリー構築のために用いられてきた。また、ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション反応は、一晩程度の長い時間を必要とするという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第９５９３３２９号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Thao et al., Nature 582, 2020, 561-565
【非特許文献2】Hohn et al., Journal of Supramolecular Structure 2, 1974, 302-317
【非特許文献3】Gigapack III Gold Packaging Extract, Gigapack III Plus Packaging Extract, and Gigapack III XL Packaging Extract INSTRUCTION MANUAL、アジレント・テクノロジー株式会社（https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/200201.pdf）
【非特許文献4】Manual MaxPlax Lambda Packaging Extracts, BIOSEARCH TECHNOLOGIES（https://www.lucigen.com/docs/manuals/MA065E-MaxPlax-Packing-Extracts.pdf）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、効率よく迅速に複数のＤＮＡ断片を試験管内で連結して長鎖ＤＮＡを調製し、細胞内に導入することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シームレスアセンブリーによって連結した長鎖ＤＮＡを、ファージのインビトロパッケージングを利用して細胞内に導入することができることを見出した。
【0009】
すなわち、これに限定されるものではないが、本発明は以下の態様の発明を包含する。
［１］
２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結して、ウイルス粒子にインビトロパッケージングする方法であって、以下：
（１）２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をシームレスアセンブリーによって連結して、１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを形成する工程；
（２）工程（１）において形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結して、１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位を形成する工程；
（３Ａ）該ＤＮＡ構築物単位が１つである場合は、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得る工程；
（３Ｂ）該ＤＮＡ構築物単位が複数である場合は、これらをシームレスアセンブリーによって連結して１つのＤＮＡ構築物を得る工程；および
（４）工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）において得たＤＮＡ構築物をウイルス粒子にインビトロパッケージングする工程
を含む、方法。
［２］
該ＤＮＡ構築物が、両端にウイルスパッケージング開始部位を含む、［１］に記載の方法。
［３］
工程（１）、工程（２）、および工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）を同時に行う、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
工程（１）、工程（２）、および工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）において制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いない、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片および前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、連結に際して隣接する領域において、それぞれの末端に相同な塩基配列を含む、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
前記相同な塩基配列の長さが、１０塩基対以上である、［５］に記載の方法。
［７］
前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片、前記直鎖状二本鎖連結ＤＮＡ、および前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、それぞれの両端部分に一本鎖突出端領域を有する、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
前記一本鎖突出端領域が、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって形成される、［７］に記載の方法。
［９］
前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、宿主のゲノムＤＮＡと相同な塩基配列をさらに含む、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
前記連結ＤＮＡの長さが３８ｋｂ以上である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法を含む、前記ＤＮＡ構築物の細胞内導入方法。
［１２］
細胞内に導入されたＤＮＡ構築物が環状化される、［１１］に記載の細胞内導入方法。
［１３］
前記工程（２）において複数のＤＮＡ構築物単位を形成する、［１２］に記載の細胞内導入方法。
［１４］
細胞としてｒｅｃＡ＋大腸菌を用いる、［１３］に記載の細胞内導入方法。
［１５］
細胞としてΔｒｅｃＡ大腸菌を用いる、［１３］に記載の細胞内導入法。
［１６］
［１４］に記載の細胞内導入方法によってＤＮＡ構築物が導入された細胞から、単量体のＤＮＡ構築物単位を回収する工程を含む、ＤＮＡ構築物単位の製造方法。
［１７］
［１５］に記載の細胞内導入方法によってＤＮＡ構築物が導入された細胞から、複数のＤＮＡ構築物単位が連結された多量体ＤＮＡ構築物を回収する工程を含む、多量体ＤＮＡ構築物の製造方法。
［１８］
２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングによるクローニングを行うためのキットであって、
直鎖状二本鎖ファージベクターＤＮＡ；
一本鎖突出端生成酵素；
インビトロパッケージング反応溶液；および
大腸菌
を含む、前記キット。
［１９］
前記一本鎖突出端生成酵素が、３’→５’エキソヌクレアーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ、および制限酵素からなる群より選択される、［１８］に記載のキット。
［２０］
１組以上のプライマーセットをさらに含む、［１８］または［１９］に記載のキットであって、ここで該プライマーセットは、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片および前記直鎖状二本鎖ファージベクターＤＮＡのそれぞれの末端に、連結に際して隣接する領域において相同な塩基配列を付加するための塩基配列を有するものである、前記キット。
［１］
２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結して、ウイルス粒子にインビトロパッケージングする方法であって、以下：
（１）２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をシームレスアセンブリーによって連結して、１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを形成する工程；
（２）工程（１）において形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結して、１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位を形成する工程；
（３Ａ）該ＤＮＡ構築物単位が１つである場合は、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得る工程；
（３Ｂ）該ＤＮＡ構築物単位が複数である場合は、これらをシームレスアセンブリーによって連結して１つのＤＮＡ構築物を得る工程；および
（４）工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）において得たＤＮＡ構築物をウイルス粒子にインビトロパッケージングする工程
を含む、方法。
［２］
該ＤＮＡ構築物が、両端にウイルスパッケージング開始部位を含む、［１］に記載の方法。
［３］
工程（１）、工程（２）、および工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）を同時に行う、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
工程（１）、工程（２）、および工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）において制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いない、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片および前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、連結に際して隣接する領域において、それぞれの末端に相同な塩基配列を含む、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
前記相同な塩基配列の長さが、１０塩基対以上である、［５］に記載の方法。
［７］
前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片、前記直鎖状二本鎖連結ＤＮＡ、および前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、それぞれの両端部分に一本鎖突出端領域を有する、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
前記一本鎖突出端領域が、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって形成される、［７］に記載の方法。
［９］
前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、宿主のゲノムＤＮＡと相同な塩基配列をさらに含む、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
前記連結ＤＮＡの長さが３８ｋｂ以上である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法を含む、前記ＤＮＡ構築物の細胞内導入方法。
［１２］
細胞内に導入されたＤＮＡ構築物が環状化される、［１１］に記載の細胞内導入方法。
［１３］
前記工程（２）において複数のＤＮＡ構築物単位を形成する、［１２］に記載の細胞内導入方法。
［１４］
細胞としてｒｅｃＡ＋大腸菌を用いる、［１３］に記載の細胞内導入方法。
［１５］
細胞としてΔｒｅｃＡ大腸菌を用いる、［１３］に記載の細胞内導入法。
［１６］
［１４］に記載の細胞内導入方法によってＤＮＡ構築物が導入された細胞から、単量体のＤＮＡ構築物単位を回収する工程を含む、ＤＮＡ構築物単位の製造方法。
［１７］
［１５］に記載の細胞内導入方法によってＤＮＡ構築物が導入された細胞から、複数のＤＮＡ構築物単位が連結された多量体ＤＮＡ構築物を回収する工程を含む、多量体ＤＮＡ構築物の製造方法。
［１８］
２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングによるクローニングを行うためのキットであって、
直鎖状二本鎖ファージベクターＤＮＡ；
一本鎖突出端生成酵素；
インビトロパッケージング反応溶液；および
大腸菌
を含む、前記キット。
［１９］
前記一本鎖突出端生成酵素が、３’→５’エキソヌクレアーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ、および制限酵素からなる群より選択される、［１８］に記載のキット。
［２０］
１組以上のプライマーセットをさらに含む、［１８］または［１９］に記載のキットであって、ここで該プライマーセットは、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片および前記直鎖状二本鎖ファージベクターＤＮＡのそれぞれの末端に、連結に際して隣接する領域において相同な塩基配列を付加するための塩基配列を有するものである、前記キット。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、効率よく迅速に複数のＤＮＡ断片を試験管内で連結して長鎖ＤＮＡを調製し、ベクターＤＮＡと連結して形成したＤＮＡ構築物として、外来ＤＮＡを細胞内に導入することが可能となる。本発明はインビトロパッケージングを用いることにより、ＤＮＡ構築物を最初から環状化した状態で形成する必要がなく、直鎖状のコンカテマーとして形成することができるため、高濃度のＤＮＡ断片やベクターＤＮＡを用いて効率的な反応を行うことができる。ベクターＤＮＡとしてコスミドベクターＤＮＡやフォスミドベクターＤＮＡ等を用いれば、形成したＤＮＡ構築物を細胞内に導入した後に環状化させることも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
＜２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングする方法＞
本発明は、２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングする方法に関する。
本発明は、２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングする方法に関する。
【0013】
本発明の方法は、
（１）２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をシームレスアセンブリーによって連結して、１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを形成する工程；
（２）工程（１）において形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結して、１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位を形成する工程；
（３Ａ）該ＤＮＡ構築物単位が１つである場合は、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得る工程；
（３Ｂ）該ＤＮＡ構築物単位が複数である場合は、これらをシームレスアセンブリーによって連結して１つのＤＮＡ構築物を得る工程；および
（４）工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）において得たＤＮＡ構築物をウイルス粒子にインビトロパッケージングする工程
を含む。
（１）２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をシームレスアセンブリーによって連結して、１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを形成する工程；
（２）工程（１）において形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結して、１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位を形成する工程；
（３Ａ）該ＤＮＡ構築物単位が１つである場合は、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得る工程；
（３Ｂ）該ＤＮＡ構築物単位が複数である場合は、これらをシームレスアセンブリーによって連結して１つのＤＮＡ構築物を得る工程；および
（４）工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）において得たＤＮＡ構築物をウイルス粒子にインビトロパッケージングする工程
を含む。
【0014】
＜（１）２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片をシームレスアセンブリーによって連結して、１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを形成する工程＞
本発明の方法で用いる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片は、どのような長さのものであってもよく、１００塩基対（ｂｐ）以上、２００ｂｐ以上、３００ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、６００ｂｐ以上、７００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、９００ｂｐ以上、１ｋｂ以上、２ｋｂ以上、３ｋｂ以上、４ｋｂ以上、５ｋｂ以上、６ｋｂ以上、７ｋｂ以上、８ｋｂ以上、９ｋｂ以上、１０ｋｂ以上、２０ｋｂ以上、３０ｋｂ以上、４０ｋｂ以上、または５０ｋｂ以上のものとすることができる。本発明の方法で用いる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の長さに上限はないが、たとえば１００ｋｂ以下、５０ｋｂ以下、４０ｋｂ以下、３０ｋｂ以下、または２０ｋｂ以下のものとすることができる。本発明の方法で用いる２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片は、後述するシームレスアセンブリーを行うことができる構造を有すれば、どのような塩基配列のものであってもよい。
本発明の方法で用いる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片は、どのような長さのものであってもよく、１００塩基対（ｂｐ）以上、２００ｂｐ以上、３００ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、６００ｂｐ以上、７００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、９００ｂｐ以上、１ｋｂ以上、２ｋｂ以上、３ｋｂ以上、４ｋｂ以上、５ｋｂ以上、６ｋｂ以上、７ｋｂ以上、８ｋｂ以上、９ｋｂ以上、１０ｋｂ以上、２０ｋｂ以上、３０ｋｂ以上、４０ｋｂ以上、または５０ｋｂ以上のものとすることができる。本発明の方法で用いる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の長さに上限はないが、たとえば１００ｋｂ以下、５０ｋｂ以下、４０ｋｂ以下、３０ｋｂ以下、または２０ｋｂ以下のものとすることができる。本発明の方法で用いる２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片は、後述するシームレスアセンブリーを行うことができる構造を有すれば、どのような塩基配列のものであってもよい。
【0015】
本発明の方法において１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを形成する手段としては、シームレスアセンブリーを用いる。シームレスアセンブリーは、ＤＮＡ断片に内在する制限酵素認識配列に依存することなく、ＤＮＡ断片を連結する手段をいう。代表的なシームレスアセンブリーには、ゴールデンゲート（Golden Gate）法（Engler et al., PLoS ONE 4, e25553等）等のＴｙｐｅ ＩＩＳ制限酵素を使用する方法、ギブソン・アセンブリー法（Gibson et al., 2009, Nature Methods 6, 343、特許第６１６５７８９号公報等）、Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ法（米国特許第７，５７５，８６０号公報等）等があるが、これらに限られない。本発明の方法では、制限酵素および／またはＤＮＡリガーゼを用いないシームレスアセンブリーを好適に使用することができる。
【0016】
本発明の方法で用いる２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片は、連結に際して隣接する領域において、それぞれの末端に相同な塩基配列（以後、相同領域と呼ぶことがある）を含むものであることが好ましい。また、工程（１）において直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結して形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡは、後述する直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡとの連結に際して隣接する領域において、その末端に相同な塩基配列を含む。ここで「塩基配列が相同である」とは「塩基配列が同一である」ことを意味する。相同領域に制限酵素または３’→５’エキソヌクレアーゼもしくは５’→３’エキソヌクレアーゼ等の二本鎖特異的エキソヌクレアーゼ等の酵素を作用させることにより、一本鎖突出端領域を露出させることができる。上記の酵素は、市販されているものを用いてもよいし、微生物等から抽出し、必要に応じて精製したものを用いてもよい。微生物からの酵素の抽出および精製は、当業者に利用可能な手法を用いて適宜実施することができる。酵素反応条件は当業者が適宜設定することができる。互いに相補的な一本鎖突出端領域をアニーリングさせることにより、２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を、塩基配列が相同である領域同士で互いに連結して、１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを形成することができる。制限酵素またはエキソヌクレアーゼによる一本鎖突出端領域の露出と、露出した一本鎖突出端領域のアニーリングは、別の反応混合物中で行ってもよいし、同一の反応混合物中で同時に行うこともできる。アニーリング反応混合物は、任意選択で、ＤＮＡリガーゼやリコンビナーゼ等のアニーリング反応を補助する追加の成分を含んでもよいし、含まないものであってもよい。
【0017】
相同領域の塩基配列は、連結させるすべての直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片において同一の塩基配列としてもよいし、ＤＮＡ断片ごとにそれぞれ異なる塩基配列としてもよい。ＤＮＡ断片ごとに異なる塩基配列の相同領域を有するものとすることで、ＤＮＡ断片を所望の順番に従って連結させることができる。たとえば、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂ、ＤＮＡ断片Ｃを、５’末端からＡ→Ｂ→Ｃの順番で連結させる場合、ＤＮＡ断片Ａの３’末端およびＤＮＡ断片Ｂの５’末端にそれぞれ相同領域ａを設け、ＤＮＡ断片Ｂの３’末端およびＤＮＡ断片Ｃの５’末端にそれぞれ相同領域ｂを設ければ、ＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｂとが相同領域ａで連結し、ＤＮＡ断片ＢとＤＮＡ断片Ｃとが相同領域ｂで連結した１つの直鎖状二本鎖連結ＤＮＡ「ＡＢＣ」を形成することができる。
【0018】
相同領域は、ＤＮＡ断片の塩基配列に応じて適宜設計したプライマーを用いたＰＣＲによって、ＤＮＡ断片に付加することができる。
相同領域の長さは、アニーリング反応混合物中で一本鎖同士が特異的にハイブリダイズすることができる長さであればよく、当業者はそれを適宜決定することができる。制限酵素処理によって相同領域における一本鎖ＤＮＡ露出反応を行う場合、相同領域の長さは、少なくとも制限酵素認識配列を含む長さであればよい。エキソヌクレアーゼ処理によって相同領域における一本鎖ＤＮＡ露出反応を行い、ＤＮＡリガーゼ等のアニーリング反応を補助する追加の成分を用いずにアニーリング反応を行う場合、相同領域の長さは、１０塩基対（ｂｐ）以上であることが好ましく、１５ｂｐ以上であることがより好ましく、２０ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、相同領域の最大長は５００ｂｐであることが好ましく、３００ｂｐであることがより好ましく、２００ｂｐであることがさらに好ましい。同様に、相同領域の融解温度（Ｔｍ）を決定するためのＧＣ含量等も、当業者は適宜決定することができる。
相同領域の長さは、アニーリング反応混合物中で一本鎖同士が特異的にハイブリダイズすることができる長さであればよく、当業者はそれを適宜決定することができる。制限酵素処理によって相同領域における一本鎖ＤＮＡ露出反応を行う場合、相同領域の長さは、少なくとも制限酵素認識配列を含む長さであればよい。エキソヌクレアーゼ処理によって相同領域における一本鎖ＤＮＡ露出反応を行い、ＤＮＡリガーゼ等のアニーリング反応を補助する追加の成分を用いずにアニーリング反応を行う場合、相同領域の長さは、１０塩基対（ｂｐ）以上であることが好ましく、１５ｂｐ以上であることがより好ましく、２０ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、相同領域の最大長は５００ｂｐであることが好ましく、３００ｂｐであることがより好ましく、２００ｂｐであることがさらに好ましい。同様に、相同領域の融解温度（Ｔｍ）を決定するためのＧＣ含量等も、当業者は適宜決定することができる。
【0019】
このようにして形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡの長さは、１０ｋｂ以上、２０ｋｂ以上、３０ｋｂ以上、３８ｋｂ以上、４０ｋｂ以上、４５ｋｂ以上、５０ｋｂ以上、または１００ｋｂ以上とすることができる。
【0020】
＜（２）工程（１）において形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結して、１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位を形成する工程＞
本発明の、２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングする方法は、前記工程（１）において形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結して、１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位を形成する工程（２）を含む。工程（１）および工程（２）は同一反応混合物中で同時に行うこともできる。
本発明の、２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングする方法は、前記工程（１）において形成した直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結して、１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位を形成する工程（２）を含む。工程（１）および工程（２）は同一反応混合物中で同時に行うこともできる。
【0021】
本発明の方法で用いる直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡは、シームレスアセンブリーを行うことができる構造を有すれば、どのようなものであってもよい。本発明の方法で用いる直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡは、直鎖状二本鎖連結ＤＮＡとの連結によって形成された１つのＤＮＡ構築物がその両端にウイルスパッケージング開始部位を含むものとなる構造を有するものであってよく、そのような直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡの例としては、たとえば、ｃｏｓ配列を含むベクターＤＮＡやｐａｃ配列を含むベクターＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の方法で用いる直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡは、直鎖状二本鎖連結ＤＮＡとの連結によって形成された１つのＤＮＡ構築物がその両端にウイルスパッケージング開始部位を含まないものであってもよく、そのような直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡの例としては、たとえばＴ４ファージのパッケージングシステム等で用いられるようなバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡのような長鎖ＤＮＡを保持可能なベクターＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、本発明の方法で用いる直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡの例としては、λファージ染色体ＤＮＡ、Ｐ２２ファージ染色体ＤＮＡ、Ｐ１ファージ染色体ＤＮＡ、Ｔ４ファージ染色体ＤＮＡ、Ｔ７ファージ染色体ＤＮＡ、コスミドベクターＤＮＡ、フォスミドベクターＤＮＡ、Ｐ１ファージ由来人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡ、およびバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ、またはこれらの変異体を挙げることができる。変異体とは、オリジナルのウイルスが有するパッケージング機能および感染機能が保存されるように、オリジナルのウイルスゲノムの塩基配列において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列を有するＤＮＡをいう。好ましくは、変異体は、オリジナルのウイルスゲノムの塩基配列と、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有するＤＮＡである。オリジナルのウイルスが有するパッケージング機能および感染機能が保存されていれば、変異体は、種々の所望の形質（薬剤遺伝子等のマーカー遺伝子やレポーター遺伝子等）が導入されたものであってよい。本発明の方法で用いる直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡは、ベクターウイルスの宿主のゲノムＤＮＡと相同な塩基配列をさらに含むものであってよい。直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、宿主のゲノムＤＮＡと相同な塩基配列を含むものを用いることにより、本発明の方法を、ベクターウイルス宿主のゲノム編集にも応用することができる。
【0022】
工程（２）において、前記直鎖状二本鎖連結ＤＮＡを直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結する手段としては、上述したシームレスアセンブリーを用いる。ここで、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片および前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡが、連結に際して隣接する領域において、それぞれの末端に相同な塩基配列を含むものである場合、工程（１）と工程（２）のシームレスアセンブリーを同時に行うことが可能となる。前記直鎖状二本鎖連結ＤＮＡは、２つの直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡの間に連結されてもよいし、１つの直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡの５’末端または３’末端に連結されてもよい。
【0023】
工程（２）において形成される１つまたは複数のＤＮＡ構築物単位は、その両端にウイルスパッケージング開始部位を含むものであってよい。ウイルスパッケージング開始部位は、２つともあらかじめ直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡに存在していてもよいし、１つは直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡに存在し１つは直鎖状二本鎖連結ＤＮＡに存在していてもよい。ウイルスパッケージング開始部位とは、ウイルスＤＮＡがウイルス粒子に取り込まれる際に認識されるための塩基配列をいい、たとえばｃｏｓ型バクテリオファージのｃｏｓ部位、ｐａｃ型バクテリオファージのｐａｃ部位等が挙げられ、それらの塩基配列および機能は当業者が熟知している。
【0024】
ＤＮＡ構築物単位の長さに制限はないが、５ｋｂ～５０ｋｂ、１０ｋｂ～４０ｋｂ、または１０ｋｂ～３０ｋｂとすることができる。
【0025】
＜（３Ａ）ＤＮＡ構築物単位が１つである場合は、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得る工程＞
工程（２）で形成したＤＮＡ構築物単位が１つである場合は、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得て、後述する工程（４）で使用することができる。この１つのＤＮＡ構築物は、その両端に上記ウイルスパッケージング開始部位を含むものであってよい。
工程（２）で形成したＤＮＡ構築物単位が１つである場合は、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得て、後述する工程（４）で使用することができる。この１つのＤＮＡ構築物は、その両端に上記ウイルスパッケージング開始部位を含むものであってよい。
【0026】
＜（３Ｂ）ＤＮＡ構築物単位が複数である場合は、これらをシームレスアセンブリーによって連結して１つのＤＮＡ構築物を得る工程＞
工程（２）で形成したＤＮＡ構築物単位が複数である場合は、これらをシームレスアセンブリーによって連結して１つのＤＮＡ構築物を得る。複数のＤＮＡ構築物単位を連結して得た１つのＤＮＡ構築物は、同じ種類のＤＮＡ構築物単位を複数連結した同種多量体であってもよく、異なる種類のＤＮＡ構築物単位を複数連結した異種多量体であってもよい。この１つのＤＮＡ構築物は、その両端に上記ウイルスパッケージング開始部位を含むものであってよい。
工程（２）で形成したＤＮＡ構築物単位が複数である場合は、これらをシームレスアセンブリーによって連結して１つのＤＮＡ構築物を得る。複数のＤＮＡ構築物単位を連結して得た１つのＤＮＡ構築物は、同じ種類のＤＮＡ構築物単位を複数連結した同種多量体であってもよく、異なる種類のＤＮＡ構築物単位を複数連結した異種多量体であってもよい。この１つのＤＮＡ構築物は、その両端に上記ウイルスパッケージング開始部位を含むものであってよい。
【0027】
工程（１）、工程（２）、および工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）は同時に行うことができる。
工程（１）、工程（２）、および工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）は制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いないで行うことができる。
工程（１）、工程（２）、および工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）は制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いないで行うことができる。
【0028】
＜（４）工程（３Ａ）または工程（３Ｂ）において得たＤＮＡ構築物をウイルス粒子にインビトロパッケージングする工程＞
本発明の方法は、上記工程（２）において形成したＤＮＡ構築物をウイルス粒子にインビトロパッケージングする工程（３）を含む。
本発明の方法は、上記工程（２）において形成したＤＮＡ構築物をウイルス粒子にインビトロパッケージングする工程（３）を含む。
【0029】
インビトロパッケージングとは、試験管内で、ウイルスＤＮＡをウイルス粒子内に詰め込むことをいう。具体的には、上記ＤＮＡ構築物を、ウイルスの外殻タンパク質およびターミナーゼ等の必要な酵素等と混合して、ＤＮＡ構築物をウイルスの外殻タンパク質内に詰め込み、ウイルス粒子を形成する。たとえばλ系ファージやＴ系ファージ、Ｐ系ファージ、アデノウイルス等の種々のウイルスベクターについて確立されているインビトロパッケージング技術を、適宜本発明において使用してもよい。
【0030】
＜ＤＮＡ構築物の細胞内導入方法＞
本発明は、上記２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結して、ウイルス粒子にインビトロパッケージングする方法を含む、ＤＮＡ構築物の細胞内導入方法にも関する。
本発明は、上記２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結して、ウイルス粒子にインビトロパッケージングする方法を含む、ＤＮＡ構築物の細胞内導入方法にも関する。
【0031】
上述したようにＤＮＡ構築物をインビトロパッケージングさせたウイルス粒子を、ウイルスの宿主細胞に感染させることにより、ＤＮＡ構築物を細胞内に導入することができる。たとえばインビトロパッケージング反応を行った溶液をそのまま、宿主細胞の懸濁液に混合して培養することで、ウイルス粒子を宿主細胞に感染させて、ＤＮＡ構築物を細胞内に導入することができる。ＤＮＡ構築物中にマーカー遺伝子を導入しておけば、目的のＤＮＡ構築物が細胞内に導入されたかどうかを確認することができる。
【0032】
ＤＮＡ構築物は、直鎖状二本鎖ＤＮＡの形態のまま、宿主細胞内において複製、溶原化、粒子形成等の機能を発現させてもよい。また、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞内に導入した後に環状化させてもよい。たとえばλファージＤＮＡを直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡとして使用してＤＮＡ構築物を形成すれば、宿主細胞内に導入した後に環状化することができる。また、コスミドベクターＤＮＡやＰＡＣ ＤＮＡ等を直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡとして使用してＤＮＡ構築物を形成すれば、大腸菌等の宿主細胞内に導入した後に環状化させて、プラスミドの形態として複製することができる。
【0033】
従来技術において、たとえばλファージを用いたインビトロパッケージングでは、クローニング可能なＤＮＡの長さは概ね３８～５２ｋｂ程度と比較的限定されていた。しかし、本発明によれば、直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結したＤＮＡ構築物単位を複数連結して得た１つのＤＮＡ構築物を、ＲｅｃＡのような相同組換えタンパク質を発現する細胞（たとえばｒｅｃＡ＋大腸菌）内に導入することにより、連結前の長さを有するＤＮＡ構築物単位を細胞から回収することができる。つまり、従来技術においてクローニング可能とされてきたＤＮＡよりも短い、３８ｋｂ未満または１０ｋｂ～３０ｋｂのＤＮＡのクローニングが本発明によって可能となる。本発明によれば、２５ｋｂ以下、２０ｋｂ以下、または１０ｋｂ以下のＤＮＡのクローニングも可能となる。
【0034】
また、従来のクローニング技術では、二量体以上の多量体プラスミドは、副産物として得られることはあっても、それらだけを狙って作製することは非常に困難だった。しかし、本発明によれば、直鎖状二本鎖連結ＤＮＡをシームレスアセンブリーによって直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡと連結したＤＮＡ構築物単位を複数連結して得た１つのＤＮＡ構築物を、ＲｅｃＡのような相同組換えタンパク質を欠損した細胞（たとえばΔｒｅｃＡ大腸菌）内に導入することにより、目的の数だけＤＮＡ構築物単位が連結した多量体プラスミドを細胞から回収することができる。このようにして得られた多量体プラスミドを細胞に導入することで、複数の単量体プラスミドを１つの細胞に導入する方法と比べてより安定的かつ効率的に、多コピーの遺伝子や多種類の遺伝子を１つの細胞で発現させることができる。
【0035】
＜２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングによるクローニングを行うためのキット＞
本発明は、２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングによるクローニングを行うためのキットにも関する。
本発明は、２つ以上の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を連結してインビトロパッケージングによるクローニングを行うためのキットにも関する。
【0036】
本発明のキットは、
直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡ；
一本鎖突出端生成酵素；
インビトロパッケージング反応溶液；および
宿主細胞
を含む。
直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡ；
一本鎖突出端生成酵素；
インビトロパッケージング反応溶液；および
宿主細胞
を含む。
【0037】
本発明のキットは、
直鎖状二本鎖ファージベクターＤＮＡ；
一本鎖突出端生成酵素；
インビトロパッケージング反応溶液；および
大腸菌
を含むものであってもよい。
直鎖状二本鎖ファージベクターＤＮＡ；
一本鎖突出端生成酵素；
インビトロパッケージング反応溶液；および
大腸菌
を含むものであってもよい。
【0038】
本発明のキットに含まれる直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡは、上記のとおりの構造を有する。
本発明のキットに含まれる一本鎖突出端生成酵素としては、３’→５’エキソヌクレアーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ等の二本鎖特異的エキソヌクレアーゼ、および制限酵素等の酵素を好適に使用することができる。
本発明のキットに含まれる一本鎖突出端生成酵素としては、３’→５’エキソヌクレアーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ等の二本鎖特異的エキソヌクレアーゼ、および制限酵素等の酵素を好適に使用することができる。
【0039】
本発明のキットは、制限酵素および／またはＤＮＡリガーゼを含まないものであってよい。
本発明のインビトロパッケージング反応溶液は、直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡに応じたウイルスの外殻タンパク質および必要な酵素を含む。
本発明のインビトロパッケージング反応溶液は、直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡに応じたウイルスの外殻タンパク質および必要な酵素を含む。
【0040】
本発明のキットは、１組以上のプライマーセットをさらに含むものであってよい。この１組以上のプライマーセットは、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片および前記直鎖状二本鎖ベクターＤＮＡのそれぞれの末端に、連結に際して隣接する領域において相同な塩基配列を付加するための塩基配列を有する。
【0041】
本発明のキットは、目的に応じて、反応バッファーの濃縮物あるいは反応バッファー等の追加の構成品を含むものであってよい。
本発明のキットは、１０ｋｂ～３０ｋｂの長さを有するＤＮＡ構築物単位をクローニングするためのキットとすることもできる。その場合、キットに含まれる大腸菌は、ｒｅｃＡ＋大腸菌とすることが好ましい。
本発明のキットは、１０ｋｂ～３０ｋｂの長さを有するＤＮＡ構築物単位をクローニングするためのキットとすることもできる。その場合、キットに含まれる大腸菌は、ｒｅｃＡ＋大腸菌とすることが好ましい。
【0042】
また、本発明のキットは、複数のＤＮＡ構築物単位が連結されたＤＮＡ構築物をクローニングするためのキットとすることもできる。その場合、キットに含まれる大腸菌は、ΔｒｅｃＡ大腸菌とすることが好ましい。
【実施例0043】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。なお、本発明は、下記実施例に記載の範囲に限定されるものではない。
【0044】
＜１．直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の作成＞
λファージ（λcI857）のゲノムＤＮＡ等を鋳型としてＰＣＲを行い、種々の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を作製した。
ＰＣＲはＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。プライマーとして使用したオリゴＤＮＡの配列を表１に示す。
λファージ（λcI857）のゲノムＤＮＡ等を鋳型としてＰＣＲを行い、種々の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を作製した。
ＰＣＲはＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。プライマーとして使用したオリゴＤＮＡの配列を表１に示す。
【0045】
【表1-1】
【0046】
【表1-2】
【0047】
【表1-3】
【0048】
また、ＰＣＲ産物である直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の長さ及び用いたプライマーのセット、鋳型ＤＮＡについて表２に示す。
【0049】
【表2-1】
【0050】
【表2-2】
【0051】
ＰＣＲ産物はアセンブリーの際に隣り合うＤＮＡと５０ ｂｐのオーバーラップを持つように作製した。ＰＣＲ後のＤＮＡ断片はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（タカラバイオ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物について、０．７％アガロースゲル電気泳動を行った結果を図１に示す。
【0052】
これらのＰＣＲ断片は５～７つを組み合わせることでλファージのゲノムを構築できる。直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の組み合わせを表３に示す。
【0053】
【表3】
【0054】
ｃｏｎｔｒｏｌλはλｃＩ８５７のゲノムが、それ以外の組み合わせでは変異の入ったλファージゲノムが構築された。導入された変異は下記の通りである。
λΔ177: cos配列上流の1877 bpが欠失
λΔea47: ea47遺伝子領域の1690 bpが欠失
λΔea31-59: ea31, ea59遺伝子領域の2938 bpが欠失
λΔea22: ea22遺伝子領域の1843 bpが欠失
λΔgba: gam, bet, exo遺伝子領域の2278 bpが欠失
λΔex63: exo遺伝子領域の1063 bpが欠失
λΔbet: bet遺伝子領域の750 bpが欠失
λΔea47::mCherry: ea47遺伝子領域にmCherry遺伝子が挿入。
λΔ177: cos配列上流の1877 bpが欠失
λΔea47: ea47遺伝子領域の1690 bpが欠失
λΔea31-59: ea31, ea59遺伝子領域の2938 bpが欠失
λΔea22: ea22遺伝子領域の1843 bpが欠失
λΔgba: gam, bet, exo遺伝子領域の2278 bpが欠失
λΔex63: exo遺伝子領域の1063 bpが欠失
λΔbet: bet遺伝子領域の750 bpが欠失
λΔea47::mCherry: ea47遺伝子領域にmCherry遺伝子が挿入。
【0055】
＜２．直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片のシームレスアセンブリー＞
上記作製した直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片のシームレスアセンブリーを行い、ＤＮＡ構築物を作製した。
アセンブリー反応液の組成は下記のとおりである。
10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5% PEG8,000, 1 mM Dithiothreitol, 0.6 mU Exonuclease III (タカラバイオ)
５ μＬ反応液中に、各２．４ ｎＭになるように表３に示す組み合わせで直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を加えて、７５℃で５分間処理後、氷上に置いた。
上記作製した直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片のシームレスアセンブリーを行い、ＤＮＡ構築物を作製した。
アセンブリー反応液の組成は下記のとおりである。
10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5% PEG8,000, 1 mM Dithiothreitol, 0.6 mU Exonuclease III (タカラバイオ)
５ μＬ反応液中に、各２．４ ｎＭになるように表３に示す組み合わせで直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を加えて、７５℃で５分間処理後、氷上に置いた。
【0056】
＜３．ＤＮＡ構築物のインビトロパッケージング＞
インビトロパッケージングは、LAMDA INN in vitro packaging kit (ニッポンジーン)を用いて行った。
４ μＬ のｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔに０．５ μＬのアセンブリー後のＤＮＡ構築物溶液を加えて、２５℃で６０分間静置し、パッケージングを行った。
インビトロパッケージングは、LAMDA INN in vitro packaging kit (ニッポンジーン)を用いて行った。
４ μＬ のｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔに０．５ μＬのアセンブリー後のＤＮＡ構築物溶液を加えて、２５℃で６０分間静置し、パッケージングを行った。
【0057】
＜４．大腸菌へのＤＮＡ構築物の導入＞
大腸菌株はＳＮ１１７１株（MG1655 ΔhsdR ΔendA）を用いた (Nozaki and Niki, J. Bacteriol., 2019 DOI: 10.1128/JB.00660-18)。
０．７％ マルトースを含むＬＢ培地（ナカライテスク）で、３７℃で一晩培養した大腸菌培養液１ ｍＬを５，０００ ｇ １分間遠心により沈殿させ、上清を除いた。沈殿した細胞は５００ μＬの１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液に懸濁した。１００ μＬの細胞懸濁液に１ μＬ のパッケージング産物を加えて２５℃で１５分静置した。これを３ ｍＬの溶けた状態の０．７％の軟寒天培地と混合し、ＬＢ寒天培地上に流して固めた後、３７℃で一晩培養した。
大腸菌株はＳＮ１１７１株（MG1655 ΔhsdR ΔendA）を用いた (Nozaki and Niki, J. Bacteriol., 2019 DOI: 10.1128/JB.00660-18)。
０．７％ マルトースを含むＬＢ培地（ナカライテスク）で、３７℃で一晩培養した大腸菌培養液１ ｍＬを５，０００ ｇ １分間遠心により沈殿させ、上清を除いた。沈殿した細胞は５００ μＬの１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液に懸濁した。１００ μＬの細胞懸濁液に１ μＬ のパッケージング産物を加えて２５℃で１５分静置した。これを３ ｍＬの溶けた状態の０．７％の軟寒天培地と混合し、ＬＢ寒天培地上に流して固めた後、３７℃で一晩培養した。
【0058】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片: La1, La2, La3, La4, La5を用いて、アセンブリーを行っていないものと行ったものについてインビトロパッケージングを行い、大腸菌へと導入した結果を図２に示す。アセンブリーを行ったときのみ、ファージによる溶菌で生じる虫食い状のプラークが得られた。λファージとして機能するためにはLa1～5までの全ての断片が細胞内に導入され、環状化する必要がある。ここでプラークが得られたということは、5つのＰＣＲ断片からλファージの環状ゲノムが構築されたことを意味する。
【0059】
その他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の組み合わせによるプラーク形成結果を図３に示す。control λ以外の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の組み合わせにより、欠失変異や挿入変異を持ったλファージの構築が可能であった。このことは外来ＤＮＡとしてＤＮＡ構築物中に導入するＤＮＡ配列が変更可能であることを意味する。
【0060】
＜５．変異λファージのＰＣＲによる確認＞
上記作製した変異ラムダファージの溶菌液をテンプレートとしてＰＣＲを行った。コントロールとして野生型のラムダファージ溶菌液を用いた。ＰＣＲはＴａｋａｒａ社のＥＸ ｔａｑを用いた。変異部位の確認のためのＰＣＲに用いたプライマーセット及び、それらのプライマーセットを用いて野生株及び変異株についてＰＣＲを行った際に出現するＤＮＡの長さをそれぞれ表４に示す。
上記作製した変異ラムダファージの溶菌液をテンプレートとしてＰＣＲを行った。コントロールとして野生型のラムダファージ溶菌液を用いた。ＰＣＲはＴａｋａｒａ社のＥＸ ｔａｑを用いた。変異部位の確認のためのＰＣＲに用いたプライマーセット及び、それらのプライマーセットを用いて野生株及び変異株についてＰＣＲを行った際に出現するＤＮＡの長さをそれぞれ表４に示す。
【0061】
【表4】
【0062】
増幅後のＰＣＲ産物は０．７％アガロースゲル電気泳動により解析した。結果を図４に示す。いずれの変異株においても正しく変異が導入された位置にバンドが出現した。
【0063】
＜５．mCherryの発現＞
１００ μＬのＳＮ１１７１株の一晩培養液を加えた３ ｍＬのＬＢ培地に、λΔea47::mCherryの導入により出現したプラークから白金耳を用いて採取したファージを導入した。
３７℃で６時間培養後に顕微鏡観察により赤色蛍光タンパク質mCherryの発現を確認した。顕微鏡観察はmCherry観察用のフィルターセット 63 HE (Zeiss) を装備した倒立顕微鏡AxioObserver (Zeiss) を用いて行った。結果を図５に示す。control λを導入した大腸菌細胞からはmCherryの蛍光は検出されなかったが、λΔea47::mCherryを導入した大腸菌細胞ではmCherryの蛍光が検出された（白矢印）。このことは、ＤＮＡ構築物を細胞内に導入した後に、大腸菌内で外来遺伝子の発現が可能であることを意味する。
１００ μＬのＳＮ１１７１株の一晩培養液を加えた３ ｍＬのＬＢ培地に、λΔea47::mCherryの導入により出現したプラークから白金耳を用いて採取したファージを導入した。
３７℃で６時間培養後に顕微鏡観察により赤色蛍光タンパク質mCherryの発現を確認した。顕微鏡観察はmCherry観察用のフィルターセット 63 HE (Zeiss) を装備した倒立顕微鏡AxioObserver (Zeiss) を用いて行った。結果を図５に示す。control λを導入した大腸菌細胞からはmCherryの蛍光は検出されなかったが、λΔea47::mCherryを導入した大腸菌細胞ではmCherryの蛍光が検出された（白矢印）。このことは、ＤＮＡ構築物を細胞内に導入した後に、大腸菌内で外来遺伝子の発現が可能であることを意味する。
【0064】
＜６．プラスミドの構築＞
pCCcos-λ14(Δnu1-A Δgba)の作製についても、λファージの作製と同様に行った。ただし、大腸菌株への導入後には、５０ μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。得られたコロニー１０個についてキアゲン社のＱｉａｐｒｅｐ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてプラスミドＤＮＡの調製を行った。プラスミドＤＮＡは０．７％アガロースゲル電気泳動により確認した。結果を図６に示す。すべてのコロニーで、４４ｋｂの正しい長さのプラスミドが構築できていた。
pCCcos-λ14(Δnu1-A Δgba)の作製についても、λファージの作製と同様に行った。ただし、大腸菌株への導入後には、５０ μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。得られたコロニー１０個についてキアゲン社のＱｉａｐｒｅｐ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてプラスミドＤＮＡの調製を行った。プラスミドＤＮＡは０．７％アガロースゲル電気泳動により確認した。結果を図６に示す。すべてのコロニーで、４４ｋｂの正しい長さのプラスミドが構築できていた。
【0065】
＜７．多断片のＤＮＡを連結した高精度なプラスミドの構築＞
本発明の方法を用いて、６断片のＰＣＲ産物から、４８ｋｂのプラスミド（pBRcos-P1j）の構築を行った。
表５に示すプライマーを、表６に示す鋳型ＤＮＡとセットにしてＰＣＲを行い、直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を調製した。
本発明の方法を用いて、６断片のＰＣＲ産物から、４８ｋｂのプラスミド（pBRcos-P1j）の構築を行った。
表５に示すプライマーを、表６に示す鋳型ＤＮＡとセットにしてＰＣＲを行い、直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を調製した。
【0066】
【表5】
【0067】
【表6】
【0068】
鋳型DNAとして用いたpBR322-cosの配列は下記の通りである。
ttctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgctcgcggctcttaccagcctaacttcgatcattggaccgctgatcgtcacggcgatttatgccgcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctataccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaagccggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattcttgcggagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgccatctccagcagccgcacgcggcgcatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaCCATtgttcattccacggacaaaaacagagaaaggaaacgacagaggccaaaaagctcgctttcagcacctgtcgtttcctttcttttcagagggtattttaaataaaaacattaagttatgacgaagaagaacggaaacgccttaaaccggaaaattttcataaatagcgaaaacccgcgaggtcgccgccccgtaacctgtcggatcaccggaaaggacccgtaaagtgataatgattatcatctacatatcacaacgtgcgtggggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaa
ＰＣＲはKOD One（TOYOBO）を用いて行った。ＰＣＲ後の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-upキット(タカラバイオ)を用いて精製し、0.7% アガロースゲルにより確認した。プラスミドの設計とＰＣＲ後の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の精製結果を図７に示す。
ttctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgctcgcggctcttaccagcctaacttcgatcattggaccgctgatcgtcacggcgatttatgccgcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctataccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaagccggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattcttgcggagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgccatctccagcagccgcacgcggcgcatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaCCATtgttcattccacggacaaaaacagagaaaggaaacgacagaggccaaaaagctcgctttcagcacctgtcgtttcctttcttttcagagggtattttaaataaaaacattaagttatgacgaagaagaacggaaacgccttaaaccggaaaattttcataaatagcgaaaacccgcgaggtcgccgccccgtaacctgtcggatcaccggaaaggacccgtaaagtgataatgattatcatctacatatcacaacgtgcgtggggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaa
ＰＣＲはKOD One（TOYOBO）を用いて行った。ＰＣＲ後の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-upキット(タカラバイオ)を用いて精製し、0.7% アガロースゲルにより確認した。プラスミドの設計とＰＣＲ後の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片の精製結果を図７に示す。
【0069】
得られた直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を用いてシームレスアセンブリー反応を行った。アセンブリー反応液の組成は下記のとおりである。
10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5% PEG8,000, 1 mM Dithiothreitol, 0.6 mU Exonuclease III (タカラバイオ)。
10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5% PEG8,000, 1 mM Dithiothreitol, 0.6 mU Exonuclease III (タカラバイオ)。
【0070】
上記反応液5 μL中に氷上で各2.4 nMになるように直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を加えて、75℃で1分間処理後、25℃に5分間置いてシームレスアセンブリー反応を行い、１つのＤＮＡ構築物単位を形成し、これをそのまま１つのＤＮＡ構築物として得た。シームレスアセンブリー反応後のＤＮＡ溶液0.5 μLを4 μLのpackaging extract (ニッポンジーン)に加えて、25℃で二時間静置し、パッケージングを行った。ＤＮＡを導入する大腸菌株にはDH5α株 (F－, Φ80d lacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rK- mK+), phoA, supE44, λ－, thi-1, gyrA96, relA1)を用いた。LB培地（ナカライテスク）で、37℃で一晩培養した大腸菌培養液1 mLを5,000 g で1分間遠心により沈殿させ、上清を除いた。沈殿した細胞は500 μLの10 mM MgSO4溶液に懸濁した。100 μLの細胞懸濁液に4.5 μL のパッケージング産物を加えて25℃で15分静置した。これを75 μg/mL アンピシリンを含むLB寒天培地上塗布して、37℃で一晩培養したところ、約1,800個のコロニーを得た。出現したコロニーのうちランダムに選んだ20個から、キアゲン社のQiaprep mini spin miniprepキットを用いてプラスミドDNAの調製を行った。プラスミドDNAは0.7%アガロースゲル電気泳動により確認した。また、得られたプラスミドDNAを制限酵素NdeI(New England Biolabs)を用いて切断し、0.7%アガロースゲル電気泳動により構造確認を行った。結果を図８に示す。多断片のＤＮＡを連結して、４８ｋｂのプラスミドをきわめて高精度（１００％正確）に構築することができた。
【0071】
＜８．単量体プラスミドおよび多量体プラスミドの構築＞
本発明の方法を用いて、それぞれ15 kb及び 20 kb, 25 kbのプラスミド、pBRcos15k, pBRcos20k, pBRcos25kの構築を行った。
表７に示すプライマーを用いて、表８の鋳型DNAのセットでPCRを行い、上記＜７＞における48 kbのプラスミド構築と同様の方法で、直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を調製した。
本発明の方法を用いて、それぞれ15 kb及び 20 kb, 25 kbのプラスミド、pBRcos15k, pBRcos20k, pBRcos25kの構築を行った。
表７に示すプライマーを用いて、表８の鋳型DNAのセットでPCRを行い、上記＜７＞における48 kbのプラスミド構築と同様の方法で、直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を調製した。
【0072】
【表7】
【0073】
【表8】
【0074】
【表9】
【0075】
調製した直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を、表９に示す組み合わせでシームレスアセンブリー反応によって連結して、３種類のＤＮＡ構築物（pBRcos15k、pBRcos20k、pBRcos25k）を調製した。次いでこれらのＤＮＡ構築物のパッケージングを行い大腸菌株へ導入した。シームレスアセンブリー反応及びパッケージング反応については、上記＜７＞における48 kbのプラスミド構築と同様の方法で行った。大腸菌株への導入については、用いた大腸菌株をSN1187株（MG1655 ΔhsdR ΔendA ΔrecA）、SN1171株(MG1655 ΔhsdR ΔendA)へと変更したことを除いて、上記＜７＞における48 kb のプラスミド構築と同様に行った。各大腸菌株にＤＮＡ構築物を導入した後、75 μg/mLアンピシリンを含むLB培地上に大腸菌を塗布した。37℃で一晩培養して得られたコロニーのうちランダムに選んだ3個ずつから、キアゲン社のQiaprep mini spin miniprepキットを用いてＤＮＡ構築物を回収した。回収したＤＮＡ構築物を0.7%アガロースゲル電気泳動により確認した。結果を図９に示す。
【0076】
recA+の菌株であるSN1171を用いて調製したものでは、それぞれ15 kb, 20 kb, 25 kbの単量体のＤＮＡ構築物単位であるプラスミドが得られた。また、得られたＤＮＡ構築物単位であるプラスミドを制限酵素Afl II (New England Biolabs)を用いて切断し、0.7%アガロースゲル電気泳動により構造確認を行ったところ設計通りに構築できていた。すなわち、本発明の方法により、３８ｋｂ未満のＤＮＡ構築物単位を連結して多量体としたＤＮＡ構築物を、組換えタンパク質を発現する細胞に導入することで、３８ｋｂ未満の長さを有するＤＮＡ構築物単位であるプラスミドを構築することができることがわかった。
【0077】
さらに、ΔrecAの菌株を用いて調製したものでは、15 kbのＤＮＡ構築物単位を３つ連結した三量体（45 kb）のプラスミド、20 kbのＤＮＡ構築物単位を２つ連結した二量体（40 kb）のプラスミド、および25 kbのＤＮＡ構築物単位を２つ連結した二量体（50 kb）のプラスミドのみを正確に構築し、回収することができた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】