特開 2022-118611 コラーゲン含有組成物の製造方法及びコラーゲン単離物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022118611

(43)【公開日】2022-08-15

(54)【発明の名称】コラーゲン含有組成物の製造方法及びコラーゲン単離物

(51)【国際特許分類】

   A23J 1/04 20060101AFI20220805BHJP

   A61K 35/60 20060101ALI20220805BHJP

   A61K 38/39 20060101ALI20220805BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220805BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220805BHJP

   A23J 3/34 20060101ALI20220805BHJP

【ＦＩ】

A23J1/04

A61K35/60

A61K38/39

A61P19/02

A61P29/00 101

A23J3/34

【審査請求】有

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021015258

(22)【出願日】2021-02-02

(71)【出願人】

【識別番号】511075988

【氏名又は名称】株式会社リナイス

(71)【出願人】

【識別番号】507157045

【氏名又は名称】公立大学法人福井県立大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】特許業務法人創成国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】中野 英春

(72)【発明者】

【氏名】鳴海 正樹

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 裕幸

(72)【発明者】

【氏名】水田 尚志

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA06

4C084BA44

4C084CA45

4C084DA40

4C084MA52

4C084NA14

4C084ZA961

4C084ZB151

4C087AA01

4C087AA05

4C087BB29

4C087CA06

4C087CA16

4C087MA52

4C087NA14

4C087ZA96

4C087ZB15

(57)【要約】

【課題】軟骨由来のコラーゲンのうちＸＩ型コラーゲンについて、産業上、有効に活用し得る素材として工業的に生産できるようにした、コラーゲン含有組成物の製造方法、並びにこれにより得られるコラーゲン単離物を提供する。
【解決手段】このコラーゲン含有組成物の製造方法においては、魚類軟骨を抽出原料とし、アルカリ性溶媒で洗浄処理を行って抽出原料から糖質系細胞外マトリックス物質を除去する。また、アルカリ洗浄後の洗浄処理物に対して、希薄酸性溶媒中で酸性プロテアーゼによる酵素処理を行ってコラーゲンを可溶化させる。次いで、その酵素処理物を固液分離して該コラーゲンを含む液部を回収し、回収した液部のｐＨを中和調整する。そして、中和後の中和処理物を塩析して、その塩析沈殿物としてＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含む該コラーゲンを得る。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

魚類軟骨を抽出原料とし、アルカリ性溶媒で洗浄処理を行って前記抽出原料から糖質系細胞外マトリックス物質を除去するアルカリ洗浄工程と、前記アルカリ洗浄工程後の処理物に対して希薄酸性溶媒中で酸性プロテアーゼによる酵素処理を行ってコラーゲンを可溶化させる酵素処理工程と、前記酵素処理工程後の処理物を固液分離して該コラーゲンを含む液部を回収するコラーゲン含有液部回収工程と、前記液部のｐＨを中和調整するコラーゲン含有液部中和工程と、前記コラーゲン含有液部中和工程後の処理物を塩析して、その塩析沈殿物としてＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含む該コラーゲンを得る塩析処理工程を含むことを特徴とするコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項2】

前記酸性プロテアーゼによる酵素処理が、真菌由来の非動物性ペプシンによる処理である、請求項１記載のコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項3】

前記塩析沈殿物を得るための塩析処理を４Ｍ以上の塩濃度で行う、請求項１又は２記載のコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項4】

前記コラーゲン含有組成物としてコラーゲン含有量が６０質量％以上であるものを得る、請求項１～３のいずれか１項に記載のコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載のコラーゲン含有組成物の製造方法により得られたコラーゲン含有組成物を分画又は精製し、ＸＩ型コラーゲンを富化した組成物を得ることを特徴とするＸＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項6】

前記分画又は精製の処理は、硫安沈殿による処理である、請求項５記載のＸＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項7】

請求項１～４のいずれか１項に記載のコラーゲン含有組成物の製造方法により得られたコラーゲン含有組成物を分画又は精製し、ＩＩ型コラーゲンを富化した組成物を得ることを特徴とするＩＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項8】

前記分画又は精製の処理は、硫安沈殿による処理である、請求項７記載のＩＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項9】

魚類軟骨由来のＸＩ型コラーゲンの脱塩単離物。

【請求項10】

コラーゲン含有量が８０質量％以上である、請求項９記載の脱塩単離物。

【請求項11】

魚類軟骨由来のＩＩ型コラーゲンの脱塩単離物。

【請求項12】

コラーゲン含有量が７０質量％以上である、請求項１１記載の脱塩単離物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、魚類軟骨由来のコラーゲン素材に関する。

【背景技術】

【0002】

コラーゲンは、哺乳類、鳥類、魚類等の動物一般に広く分布し、その細胞外マトリックスの主要構成成分として機能しているタンパク質である。ヒトでは総タンパク質量のうちおよそ２５～３０％を占めているといわれており、その分子構造としては、分子量１０万程度のペプチド鎖が３本集まって水素結合により３重らせん構造を形成している。また、その３重らせん構造単位のものが、コラーゲン分子の端部を占めるテロペプチド領域で架橋して、繊維状構造や網目状構造等のさらなる高次構造を形成している。コラーゲンの種類は、ヒトで現在２８種類ほど確認されており、また、機能によって分類されている。例えば、骨、真皮、腱などの主要タンパク質であるＩ型コラーゲンは、α１鎖２本とα２鎖１本とが３重らせん構造を形成しており、線維状の構造が引っぱり強度にすぐれ、体や臓器の形態を維持させている構造タンパク質として機能している。また、ＩＩ型コラーゲンは、α１鎖３本が３重らせん構造を形成しており、軟骨等に局在してＩ型と同様な構造タンパク質としての機能を有している。一方、ＩＩＩ型、Ｖ型コラーゲンは皮膚等においてＩ型と共存し、ＸＩ型コラーゲンは軟骨等においてＩＩ型と共存し、それぞれの組織に適合したコラーゲン線維の形成に補助的に関与していると考えられている（非特許文献１、２参照）。また、ＸＩ型コラーゲンの主たる分子種構成としては、α１鎖、α２鎖、α３鎖の３種類で３重らせん構造を形成していると考えられている（非特許文献３）。

【0003】

コラーゲン素材の利用については、動物組織のコラーゲンの最も多くを占めるＩ型コラーゲンが化粧品や健康食品、医薬品等の原料として広く利用されている。また、近年には、軟骨に局在するＩＩ型コラーゲン素材の利用も高まりつつあり、例えば、非特許文献３には、リウマチ性関節炎の患者の血中にはＩＩ型コラーゲンに対する抗体価が上昇しており、非変性ＩＩ型コラーゲンの経口投与による免疫寛容により、リウマチ性関節炎の予防・治療効果が期待できるという報告がある（非特許文献４）。

【0004】

一般に、コラーゲンを動物組織から可溶化して抽出する方法としては、加熱変性処理、酸・アルカリによる可溶化処理、酵素処理による可溶化などの方法があるが、加熱変性処理では３重鎖がほどけてランダム状に変性してしまう。また、酸可溶化やアルカリ可溶化では、通常の非変性条件では、ごく少量しか溶出しないので生産性が悪い。一方、消化酵素であるペプシン等により、架橋構造の部分のみを部分的に分解して、３重らせん構造単位のものを効率的に抽出することができるものと考えられている。

【0005】

ＩＩ型コラーゲン素材の調製方法に関連して、例えば、特許文献１には、ウシ肩甲軟骨を原料にして、高圧水流を用いた所定の前処理により原料の不純物を除去して、その後の脱灰とペプシン可溶化の処理により、リウマチ患者の血清と抗原抗体反応性を有するＩＩ型コラーゲンを調製したことが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】服部俊治著、「動物由来線維分子コラーゲンの性質と応用」、繊維と工業、ｖоｌ．６５、Ｎо．１２（２００９）ｐｐ４５３－４６１．

【非特許文献2】服部俊治著、「コラーゲン－分子集合とその応用－」、高分子、４７巻、６月号（１９９８）ｐｐ３９４－３９７．

【非特許文献3】吉岡秀克著、「ＸＩ型コラーゲンα１鎖遺伝子：α１鎖の一次構造，その遺伝子発現及び調節機構」、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ、２９（１９９７）ｐｐ３９－４７．

【非特許文献4】Ｄａｖｉｄ Ｅ．Ｔｒｅｎｔｈａｍら著、「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｏｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１（１９９３）ｐｐ１７２７－１７３０．

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２００１－１１２４１９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、従来、軟骨由来のコラーゲンのうちメジャーに存在しているＩＩ型コラーゲンについては非変性に抽出する各種の調製方法が開発されてきたものの、軟骨コラーゲンのうちマイナーにしか存在していないＸＩ型コラーゲンについては、実験や研究用に少量を調製して利用することがあるだけで、ＩＩ型コラーゲンほどには有効に利用されていないのが現状であった。

【0009】

本発明の目的は、ＸＩ型コラーゲンについて、産業上、有効に活用し得る素材として工業的に生産できるようにした、コラーゲン含有組成物の製造方法、並びにこれにより得られるコラーゲン単離物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、魚類軟骨を抽出原料にして酸性プロテアーゼ処理によりコラーゲンを可溶化して液部に溶出させたうえ、その液部を十分に塩析処理することで、ＩＩ型コラーゲンとともにＸＩ型コラーゲンが効率よく回収できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち、本発明は、第１の観点としては、魚類軟骨を抽出原料とし、アルカリ性溶媒で洗浄処理を行って前記抽出原料から糖質系細胞外マトリックス物質を除去するアルカリ洗浄工程と、前記アルカリ洗浄工程後の処理物に対して希薄酸性溶媒中で酸性プロテアーゼによる酵素処理を行ってコラーゲンを可溶化させる酵素処理工程と、前記酵素処理工程後の処理物を固液分離して該コラーゲンを含む液部を回収するコラーゲン含有液部回収工程と、前記液部のｐＨを中和調整するコラーゲン含有液部中和工程と、前記コラーゲン含有液部中和工程後の処理物を塩析して、その塩析沈殿物としてＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含む該コラーゲンを得る塩析処理工程を含むことを特徴とするコラーゲン含有組成物の製造方法を提供するものである。

【0012】

上記第１の観点の製造方法によれば、アルカリ洗浄処理により魚類軟骨原料からプロテオグリカン等の夾雑物を除去することができる。また、酸性プロテアーゼ処理により魚類軟骨原料のコラーゲンを可溶化して液部に溶出させることができる。更に、原料から可溶化させたコラーゲン含む液部のｐＨを十分に中和調整した後に塩析することにより、その塩析沈殿物としてＩＩ型コラーゲンとともにＸＩ型コラーゲンを回収することができる。よって、この方法により、食品、サプリメント、医薬品、医療用材料等として利用可能なコラーゲン素材を生産性よく製造することができる。特に、軟骨コラーゲンとしてマイナー型であるＸＩ型コラーゲンを効率よく生産することができる。

【0013】

上記第１の観点の製造方法においては、前記酸性プロテアーゼによる酵素処理が、真菌由来の非動物性ペプシンによる処理であることが好ましい。これによれば、狂牛病や口蹄疫などの疾病のイメージのある動物由来の素材を使用する必要がない。

【0014】

上記第１の観点の製造方法においては、前記塩析沈殿物を得るための塩析処理を４Ｍ以上の塩濃度で行うことが好ましい。これによれば、魚類軟骨原料から酵素処理により可溶化させたコラーゲンを含有するコラーゲン含有液部中から、ＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含む該コラーゲンをより効率よく回収することができる。

【0015】

上記第１の観点の製造方法においては、前記コラーゲン含有組成物としてコラーゲン含有量が固形分あたり６０質量％以上であるものを得ることが好ましい。

【0016】

本発明は、第２の観点としては、上記の製造方法により得られたコラーゲン含有組成物を分画又は精製し、ＸＩ型コラーゲンを富化した組成物を得ることを特徴とするＸＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法を提供するものである。

【0017】

上記第２の観点の製造方法によれば、同じ軟骨由来のコラーゲンであるＩＩ型コラーゲンの含有量が減じられる一方、純度の高いＸＩ型コラーゲンを得ることができる。

【0018】

上記第２の観点の製造方法においては、前記分画又は精製の処理は、硫安沈殿による処理であることが好ましい。これによれば、安価で簡便な方法により、純度の高いＸＩ型コラーゲンを得ることができる。

【0019】

本発明は、第３の観点としては、上記の製造方法により得られたコラーゲン含有組成物を分画又は精製し、ＩＩ型コラーゲンを富化した組成物を得ることを特徴とするＩＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法を提供するものである。

【0020】

上記第３の観点の製造方法によれば、同じ軟骨由来のコラーゲンであるＸＩ型コラーゲンの含有量は減じられ、純度の高いＩＩ型コラーゲンを得ることができる。

【0021】

上記第３の観点の製造方法においては、前記分画又は精製の処理は、硫安沈殿による処理であることが好ましい。これによれば、安価で簡便な方法により、純度の高いＩＩ型コラーゲンを得ることができる。

【0022】

本発明は、第４の観点としては、魚類軟骨由来のＸＩ型コラーゲンの脱塩単離物を提供するものである。

【0023】

上記第４の観点の脱塩単離物によれば、食品、サプリメント、医薬品、医療用材料等に含有せしめて用いる素材としてだけでなく、実験や研究用の標準品として利用可能なＸＩ型コラーゲン素材を提供することができる。

【0024】

上記第４の観点の脱塩単離物においては、コラーゲン含有量が固形分あたり８０質量％以上であることが好ましい。

【0025】

本発明は、第５の観点としては、魚類軟骨由来のＩＩ型コラーゲンの脱塩単離物を提供するものである。

【0026】

上記第５の観点の脱塩単離物によれば、食品、サプリメント、医薬品、医療用材料等に含有せしめて用いる素材としてだけでなく、実験や研究用の標準品としても利用可能なＩＩ型コラーゲン素材を提供することができる。

【0027】

上記第５の観点の脱塩単離物においては、コラーゲン含有量が固形分あたり７０質量％以上であることが好ましい。

【発明の効果】

【0028】

本発明によれば、食品、サプリメント、医薬品、医療用素材などに利用可能な、高品質のコラーゲン素材が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】本発明にかかる製造方法の一実施形態を示す工程図である。

【図2】本発明にかかる製造方法の他の実施形態を示す工程図である。

【図3】本発明にかかる製造方法の別の実施形態を示す工程図である。

【図4】製造例１において行った製造フロー図である。

【図5】試験例１においてリゾパソペプシンを用いた酵素処理により鮭鼻軟骨原料からコラーゲンを溶出させたときの可溶化率を調べた結果を示す図表であり、図５（ａ）は検体番号１～３の各試料について軟骨重量、コラーゲン含量、可溶化分量、可溶化率、可溶率の平均、及びその標準偏差の値をまとめた図表であり、図５（ｂ）は可溶化率の経時変化を表す図表であり、図５（ｃ）はそのグラフのもとになる数値をまとめた図表である。

【図6】試験例２において製造例１で得られた塩析沈殿物の一部をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけたときのゲルの写真を示す図表である。

【図7】試験例３において製造例１で得られた塩析沈殿物の一部をイオンクロマトグラフィー分析にかけたときの結果を示す図表であり、図７（ａ）はイオンクロマトグラフィーによる分画フラクションごとにＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動分析にかけたときのゲルの写真を示す図表であり、図７（ｂ）はそのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動のゲルのフラクション番号３７及びフラクション番号４１の部分の拡大写真を示す図表であり、図７（ｃ）はイオンクロマトグラフの分析チャートを示す図表である。

【図8】試験例４において製造例１で得られた塩析沈殿物、１１％硫安沈殿物、及び２０％硫安沈殿物を解析した結果を示す図表であり、図８（ａ）は２０％硫安沈殿物及び塩析沈殿物の一部をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけたときのゲルの写真を示す図表であり、図８（ｂ）は塩析沈殿物、１１％硫安沈殿物、及び２０％硫安沈殿物のヒドロキシプロリン含量をジメチルベンズアルデヒド比色法により測定しコラーゲン含量への換算係数を乗じてコラーゲン含量を求めた結果を示す図表である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本発明においては、魚類軟骨がコラーゲンの基原として用いられる。魚類の種類やその軟骨組織の部位等に特に制限はなく、例えばサケの鼻軟骨（氷頭）、サメの軟骨、エイの軟骨、イカの軟骨等が挙げられる。特にサケの鼻軟骨（氷頭）は、コラーゲン含量が高いうえ、水産加工の分野で通常廃棄される部位として安価に入手可能であるのでより好ましい。例えば、サケのイクラ加工やフィレ加工では水揚げされたサケから頭部は大量に廃棄処分されるので、これを入手し、その頭部から鼻軟骨を摘出して用いることができる。

【0031】

図１には、本発明にかかる製造方法の一実施形態が示される。この実施形態にあっては、魚類軟骨を抽出原料として、軟骨由来のコラーゲンであるＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含むコラーゲン含有組成物が得られる。すなわち、このコラーゲン含有組成物の製造方法においては、アルカリ性溶媒で原料の洗浄処理を行う工程と（図１中では「Ｓ１」で示される。以下「アルカリ洗浄工程」ともいう。）、アルカリ洗浄後の洗浄処理物に対して希薄酸性溶媒中で酸性プロテアーゼによる酵素処理を行う工程と（図１中では「Ｓ２」で示される。以下「酵素処理工程」ともいう。）、酵素処理後の酵素処理物を固液分離してコラーゲンを含む液部を回収する工程と（図１中では「Ｓ３」で示される。以下「コラーゲン含有液部回収工程」ともいう。）、固液分離により回収したコラーゲンを含む液部のｐＨを中和調整する工程と（図１中では「Ｓ４」で示される。以下「コラーゲン含有液部中和工程」ともいう。）、コラーゲンを含む液部のｐＨを中和調整した後の中和処理物を塩析する工程（図１中では「Ｓ５」で示される。以下「塩析処理工程」ともいう。）を経るようにしている。

【0032】

本発明にかかる製造方法においては、特に限定されないが、上記抽出原料として、例えば魚類軟骨を破砕し、粒径を揃えたものを用いることが好ましい。軟骨原料の粒径の均一化は、所定孔径のプレート（例えば孔径１．８～１０ｍｍ程度）を使用したミートチョッパーや、あるいはホモジナイザー、マスコローダー等を使用して細分化処理することなどにより行うことができる。粒径を揃えることにより、アルカリ洗浄やコラーゲンの溶出をより効率よく行うことができる。軟骨原料の粒径としては、典型的に例えば０．１ｍｍ～１０ｍｍの範囲であってよく、０．５ｍｍ～５ｍｍの範囲であってよく、１ｍｍ～３ｍｍの範囲であってもよい。

【0033】

本発明にかかる製造方法においては、上記アルカリ洗浄工程において、抽出原料である魚類軟骨に対してアルカリ性溶媒で洗浄処理を行って、その抽出原料からプロテオグリカン、ヒアルロン酸等の糖質系細胞外マトリックス物質を除去するようにしている。使用するアルカリ性溶媒は、特に限定されないが、０．０１Ｍ～１Ｍの濃度範囲のＮａＯＨ水溶液であってよく、０．０５Ｍ～０．５Ｍの濃度範囲のＮａＯＨ水溶液であってよく、０．１Ｍ～０．４Ｍの濃度範囲のＮａＯＨ水溶液であってもよい。

【0034】

上記アルカリ洗浄処理は、魚類軟骨原料をアルカリ性溶媒中で所定時間攪拌した後に固液分離することにより行うことが好ましい。これによれば、魚類軟骨原料から糖質系細胞外マトリックス物質等の夾雑物をより効果的に除去することができる。このようなアルカリ洗浄のための攪拌の際の温度条件としては、特に制限はないが、低温で温度管理することが好ましい。例えば、０℃~１２℃の範囲であってよく、２℃～１０℃の範囲であってよく、４℃～８℃の範囲であってもよい。また、アルカリ洗浄のための攪拌の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば３０分間～４８時間の範囲であってよく、１時間～３６時間の範囲であってよく、３時間～２４時間の範囲であってもよい。なお、固液分離には、例えば、６０~１００メッシュ程度のザルや濾布、遠心分離を使用すればよい。

【0035】

本発明の限定されない任意の態様においては、上記アルカリ洗浄工程におけるアルカリ性溶媒による魚類軟骨原料のアルカリ洗浄処理は、所定時間攪拌後のアルカリ性溶媒を固液分離して除いた後、あらたなアルカリ溶媒を加えて洗浄を繰り返すようにして、複数回（例えば２～４回）行ってもよい。これによれば、魚類軟骨原料から糖質系細胞外マトリックス物質等の夾雑物を更により効果的に除去することができる。また、アルカリ洗浄後には、水を加えて所定時間攪拌後に固液分離することにより、水洗浄処理を行ってもよい。この水洗浄処理についても、複数回（例えば２～４回）繰り返してもよい。また、その洗浄液のｐＨが中性付近になるまで水洗浄処理を繰り返すことが好ましい。これによれば、用いたアルカリが後の処理に影響を及ぼすことを防ぐことができる。

【0036】

本発明にかかる製造方法においては、上記酵素処理工程において、アルカリ洗浄工程後の洗浄処理物に対して希薄酸性溶媒中で酸性プロテアーゼによる酵素処理を行ってコラーゲンを可溶化させるようにしている。使用する酸性プロテアーゼとしては、特に限定されないが、例えばペプシン等が挙げられる、また、特に真菌由来の非動物性ペプシンであれば、狂牛病や口蹄疫などの疾病のイメージのある動物由来の素材を使用する必要がないので好ましい。真菌由来の非動物性ペプシンとしては、例えば、カビの一種であるＲｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓが産生する酸性プロテアーゼであるリゾパスペプシン等が挙げられる。また、使用する希薄酸性溶媒は、特に限定されないが、例えば１０ｍＭ～５００ｍＭの濃度範囲の酢酸水溶液であってよく、２５０ｍＭ～５００ｍＭの濃度範囲の酢酸水溶液であってよく、４００ｍＭ～５００ｍＭの濃度範囲の酢酸水溶液であってもよい。また、例えば１０ｍＭ～５００ｍＭの濃度範囲のクエン酸水溶液であってよく、２５０ｍＭ～５００ｍＭの濃度範囲のクエン酸水溶液であってよく、４００ｍＭ～５００ｍＭの濃度範囲のクエン酸水溶液であってもよい。たたし、酸性プロテアーゼの好適条件のためにはｐＨを酸性側に調製する必要がある。

【0037】

上記酵素処理において、ｐＨ条件は、使用する酵素の種類によっても好適条件は異なり一概ではないが、例えばｐＨ１～６の範囲であってよく、ｐＨ２～５の範囲であってよく、ｐＨ２．５～３．５の範囲であってもよい。酵素処理の際の温度条件としては、使用する酵素の種類によっても好適条件は異なり一概ではないが、コラーゲンが変性しない範囲内とすることが好ましく、例えば０℃～１２℃の範囲であってよく、２℃～１０℃の範囲であってよく、４℃～８℃の範囲であってもよい。酵素処理の際の処理時間としては、特に制限はないが、例えば３０分間～４８時間の範囲であってよく、１時間～３６時間の範囲であってよく、３時間～２４時間の範囲であってもよい。なお、酸性プロテアーゼとして上記リゾパスペプシンを用いる場合、その酵素の添加量としては、投入した魚類軟骨原料の固形分（乾燥重量）に対して１／１００～１／５量、場合によっては１／５０～１／１０量、更に場合によっては１／２５～１／１５量のリゾパスペプシン製剤を添加することなどが典型的であり、稀薄酸性溶媒中に含有せしめるリゾパスペプシン製剤の濃度としては０．００１～１質量％、場合によっては０．００５～０．１質量％、更に場合によっては０．０１～０．０５質量％になるようにすることなどが典型的である。

【0038】

本発明の限定されない任意の態様においては、上記酵素処理工程におけるｐＨは、酸性プロテアーゼを添加する前に、魚類軟骨原料に希薄酸性溶媒を添加して所定時間処理することにより予め酸性側に調整してもよい。これによれば、酸性プロテアーゼによる処理の際、ｐＨがアルカリ側にシフトして、コラーゲン可溶化の効率が悪くなるのを防ぐことができる。これに限定されないが、例えば、軟骨原料に対して１～５０倍量、場合によっては３～２０倍量、更に場合によっては５～１０倍量の希薄酸性溶媒を添加し、所定時間攪拌処理することにより、そのｐＨを酸性側に調整することができる。このような酸性側へのｐＨ調整の際の温度条件としては、特に制限はないが、低温で温度管理することが好ましい。例えば、０℃~１２℃の範囲であってよく、２℃～１０℃の範囲であってよく、４℃～８℃の範囲であってもよい。また、酸性側へのｐＨ調整の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば３０分間～４８時間の範囲であってよく、１時間～３６時間の範囲であってよく、３時間～２４時間の範囲であってもよい。

【0039】

本発明にかかる製造方法においては、上記コラーゲン含有液部回収工程において、酵素処理工程後の酵素処理物を固液分離して、魚類軟骨原料から溶出させたコラーゲンを含む液部を回収するようにしている。固液分離には、例えば、遠心分離機を使用すればよい。そして、上記コラーゲン含有液部中和工程において、回収した液部のｐＨを中性付近に中和調整するようにしている。この中和調整により、つづく塩析処理によって、軟骨由来のコラーゲンとしてメジャーに存在するＩＩ型コラーゲンだけでなく、マイナー型であるＸＩ型コラーゲンを有効に回収やすくなる。中和調整は、これに限定されないが、回収したコラーゲン含有液部に対して、例えば０．１Ｍ～１ＭのＨＣＬ水溶液や０．１Ｍ～１ＭのＮａＯＨ水溶液を用いて、適宜、これらの酸・アルカリを、ｐＨ測定を行いながら添加することになどにより行うことができる。ｐＨは例えば、ｐＨ７．５～８．５の範囲に調整することが好ましく、特に好ましくはｐＨ８付近である。

【0040】

本発明にかかる製造方法においては、上記塩析処理工程において、コラーゲン含有液部中和工程後の中和処理物を塩析して、その塩析沈殿物としてＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを回収するようにしている。塩析は、通常の方法で行えばよく、具体的には、固形状ないし塩析に適した形状の塩化ナトリウム等の塩を添加し、その後所定時間攪拌後、固液分離することにより行うことができる。塩の終濃度としては、例えば２Ｍ～５Ｍの範囲であってよく、２．５Ｍ～４．５Ｍの範囲であってよく、３Ｍ～４Ｍの範囲であってもよい。特に好ましくは４Ｍ以上であり、特には４．４Ｍ付近である。このような塩析の際の温度条件としては、特に制限はないが、低温で温度管理することが好ましい。例えば、０℃~１２℃の範囲であってよく、２℃～１０℃の範囲であってよく、４℃～８℃の範囲であってもよい。また、塩析の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば３０分間～４８時間の範囲であってよく、１時間～３６時間の範囲であってよく、３時間～２４時間の範囲であってもよい。塩析沈殿物の回収は、上記と同じく固液分離によればよく、例えば、遠心分離機を使用すればよい。

【0041】

以上のようにして得られた塩析沈殿物は、限外濾過、透析等により塩を除去することができる。また、これを真空凍結乾燥して乾燥物に調製してもよい。塩析沈殿物からの塩の除去には、中空糸モジュール、セラミックフィルター、平膜型フィルター等を用いた限外濾過による方法や、透析チューブに充填して水中に浸漬して脱塩する方法等が挙げられる。

【0042】

以上のようにして得られたＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含有するコラーゲン含有組成物は、そのコラーゲン含有量が固形分あたり６０質量％以上であることが好ましく、６５質量％以上であることがより好ましい。また、ＩＩ型コラーゲンとＸＩ型コラーゲンの含有量の質量比としては、１０：１～１：１０の範囲であってよく、８：２～２：８の範囲であってよく、７：３～３：７の範囲であってもよい。なお、コラーゲン含量は、コラーゲンの酸加水分解処理後、ヒドロキシプロリン量をアミノ酸組成分析やジメチルベンズアルデヒド比色法等により分析し、所定のコラーゲン量への換算係数を乗じることなどにより求めることができる。例えば、サケコラーゲンの場合、アミノ酸１０００残基中のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）は５４．３残基で、含有率は７．９２％であり、Ｈｙｐ量からコラーゲン量への換算係数は１２．６３である。

【0043】

図２には、本発明にかかる製造方法の他の実施形態が示される。この実施形態にあっては、上記に説明したＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含有する塩析処理物を０．５Ｍ酢酸に溶解する工程と（図２中では「Ｓ６」で示す。）、所定の終濃度の硫安で硫安処理する工程と（図２中では「Ｓ７」で示す。）を経るようにしている。これにより、その硫安沈殿物としてＩＩ型コラーゲンが富化されたＩＩ型コラーゲン含有組成物が得られる。溶解処理（Ｓ６）における酸溶媒としては、図中では０．５Ｍ酢酸が例示されるが、例えば０．４～０．６Ｍ酢酸又は０．４～０．６Ｍクエン酸などにより、溶液ｐＨとしてはｐＨ２．６～２．８の範囲になるよう、濃度を適切に設定すればよい。また、硫安処理は、通常の方法で行えばよく、具体的には、固形状ないし塩析に適した形状の硫酸アンモニウムを添加し、その後所定時間攪拌後、固液分離することにより行うことができる。硫安処理（Ｓ７）における硫安の終濃度としては、図中では１１ｗ／ｖ％が例示されるが、例えば１０ｗ／ｖ％～１３ｗ／ｖ％の範囲であってよく、１０．５ｗ／ｖ％～１２．５ｗ／ｖ％の範囲であってもよい。特に好ましくは１１ｗ／ｖ％付近である。このような硫安処理の際の温度条件としては、特に制限はないが、例えば０℃～１２℃の範囲であってよく、２℃~１０℃の範囲であってよく、４～８℃の範囲であってもよい。また、硫安処理の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば３０分間～４８時間の範囲であってよく、１時間～３６時間の範囲であってよく、３時間～２４時間の範囲であってもよい。硫安沈殿物の回収は、上記と同じく固液分離によればよく、例えば、遠心分離機を使用すればよい。

【0044】

以上のようにして得られた硫安沈殿物は、限外濾過による透析等により塩を除去することができる。また、これを真空凍結乾燥して乾燥物に調製してもよい。硫安沈殿物からの塩の除去には、中空糸モジュール、セラミックフィルター、平膜型フィルター等を用いた限外濾過による物理的な脱塩や、透析チューブに充填して水中に浸漬して脱塩する方法等が挙げられる。

【0045】

以上のようにして得られたＩＩ型コラーゲンを富化してなるコラーゲン含有組成物は、そのコラーゲン含有量が固形分あたり７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましい。

【0046】

図３には、本発明にかかる製造方法の別の実施形態が示される。この実施形態にあっては、上記に説明したＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含有する塩析処理物を０．５Ｍ酢酸に溶解する工程と（図３中では「Ｓ６」で示す。）、所定の第１の終濃度の硫安で硫安処理する工程と（図３中では「Ｓ７」で示す。）、その硫安処理後の上清を回収する工程と（図３中では「Ｓ８」で示す。）、所定の第２の終濃度の硫安で硫安処理する工程と（図３中では「Ｓ９」で示す。）を経るようにしている。これにより、その硫安沈殿物としてＸＩ型コラーゲンが富化されたＸＩ型コラーゲン含有組成物が得られる。上述したように、溶解処理（Ｓ６）における酸溶媒としては、図中では０．５Ｍ酢酸が例示されるが、例えば０．４～０．６Ｍ酢酸又は０．４～０．６Ｍクエン酸などにより、溶液ｐＨとしてはｐＨ２．６～２．８の範囲になるよう、濃度を適切に設定すればよい。また、硫安処理は、通常の方法で行えばよく、具体的には、固形状ないし塩析に適した形状の硫酸アンモニウムを添加し、その後所定時間攪拌後、固液分離することにより行うことができる。硫安処理（Ｓ７）における硫安の上記第１の終濃度としては、例えば１０ｗ／ｖ％～１３ｗ／ｖ％の範囲であってよく、１０．５ｗ／ｖ％～１２．５ｗ／ｖ％の範囲であってもよい。特に好ましくは１１ｗ／ｖ％付近である。また、硫安処理の硫安の上記第２の終濃度としては、例えば１８ｗ／ｖ％～２２ｗ／ｖ％の範囲であってよく、１９ｗ／ｖ％～２１ｗ／ｖ％の範囲であってもよい。特に好ましくは２０ｗ／ｖ％付近である。このような硫安処理の際の温度条件としては、特に制限はないが、例えば０℃～２０℃の範囲であってよく、２℃～１５℃の範囲であってよく、４℃～１０℃の範囲であってもよい。また、硫安処理の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば３０分間～４８時間の範囲であってよく、１時間～３６時間の範囲であってよく、３時間～２４時間の範囲であってもよい。なお、硫安処理後の上清や沈殿物の回収は、上記と同じく固液分離によればよく、例えば、遠心分離機を使用すればよい。

【0047】

以上のようにして得られた硫安沈殿物は、限外濾過による透析等により塩を除去することができる。また、これを真空凍結乾燥して乾燥物に調製してもよい。硫安沈殿物からの塩の除去には、中空糸モジュール、セラミックフィルター、平膜型フィルター等を用いた限外濾過による物理的な脱塩や、透析チューブに充填して水中に浸漬して脱塩する方法等が挙げられる。

【0048】

以上のようにして得られたＸＩ型コラーゲンを富化してなるコラーゲン含有組成物は、そのコラーゲン含有量が固形分あたり８０質量％以上であることが好ましく、９０質量％以上であることがより好ましい。

【0049】

以上に説明した本発明の製造方法により得られる、上記ＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含有する塩析沈殿物、上記ＩＩ型コラーゲンを含有する１１％硫安沈殿物、上記ＸＩ型コラーゲンを含有する２０％硫安沈殿物は、通常当業者に周知の減圧乾燥機、噴霧乾燥機等の手段により乾燥してもよく、その乾燥物を更に解砕、粉砕等して乾燥ともに粉末化してもよい。乾燥物の形態であれば、上記した凍結乾燥後の乾燥物と同様に、水分が除かれているので、腐敗等が防がれて、保存安定性に優れている。乾燥に際しては、製剤的にテキストリン等の賦形剤や結晶セルロース、シリカ等を添加してもよい。

【0050】

粉末化のためには、通常当業者に周知の粉砕機、ミル、マスコローダー等の手段を利用することができる。粉末化後の粒度としては、全体のおよそ９０質量％以上が３０メッシュパス（目開き：５００μｍ）となる程度に粉末化することが好ましく、全体のおよそ９０質量％以上が６０メッシュパス（目開き：２５０μｍ）となる程度に粉末化することがより好ましい。あるいは、全体のおよそ９０質量％以上が０．３ｍｍ経以上０．７５ｍｍ径以下のスクリーンをパスするように粉末化することが好ましい。

【0051】

本発明により得られるコラーゲン含有組成物には、上記ＩＩ型コラーゲン及び／又はＸＩ型コラーゲンに加え、更にビタミンＣ、イミダゾールペプチド、コラーゲンペプチド、鮭卵巣外皮ペプチド、β－ヒドロキシ－β－メチル酪酸（ＨＭＢ）等を添加してもよい。

【0052】

本発明により得られるコラーゲン含有組成物は、例えば、化粧品、健康食品やサプリメント、医薬品、医薬部外品等に向けた利用が可能であり、特にその原料素材として好適に利用され得る。また、ヒトだけでなくペット動物等の動物に向けた利用も可能である。

【実施例0053】

以下、製造例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの製造例及び試験例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。

【0054】

［製造例１］
水産加工工場から排出されるサケの頭部を入手し、その頭部から鼻軟骨を摘出して、２００ｇの生軟骨を採取した（サケ８匹相当）。採取した生軟骨は２．８mm孔径のプレートを取り付けたミートチョッパーを使用し細分化処理を行い抽出用出発原料とした。
上記に調製した抽出原料からコラーゲンを抽出した。

【0055】

図４には、本製造例において行った製造フロー図を示す。具体的には、以下のようにして調製した。

【0056】

・抽出原料２００ｇに対して０．１ＭＮａＯＨ水溶液を２４００ｍＬ添加し、４℃下で２４時間攪拌した後、遠心分離装置により１０，０００ｇ×２０分間の処理を行って固液分離し、その固部を回収した。
・水２４００ｍＬを添加し、４℃下で攪拌した後、遠心分離装置により１０，０００ｇ×２０分間の処理を行って固液分離し、その固部を回収し、更に同様の操作をもう一度繰り返した。２回目の上清のｐＨを測定したところｐＨ１１．９２であった。更に同様の水洗を繰り返し、最終水洗時のｐＨは９．４７であった。
・１０ｍＭクエン酸水溶液を２０００ｍＬ添加し、４℃下で２４時間攪拌し、上清のｐＨを測定したところｐＨ３．０であった。
・リゾパスペプシン（商品名「ニューラーゼＦ３Ｇ」、天野エンザイム株式会社社製）を添加し、４℃下で４８時間攪拌した。その処理後のｐＨを測定したところｐＨ３．０であった。
・遠心分離装置により１０，０００ｇ×２０分間の処理を行って固液分離し、その液部を回収した。
・リン酸水素二ナトリウムを終濃度２０ｍＭとなる量で添加し、４℃下で１時間攪拌した。
・６ＭＨＣｌ水溶液または６ＭＮａＯＨ水溶液の滴下による微調整によりｐＨ８．０に調整した。
・粉体ＮａＣｌを終濃度４．４Ｍとなる量で添加し、４℃下で２４時間攪拌した。
・遠心分離装置により１０，０００ｇ×２０分間の処理を行って固液分離し、その固部を塩析沈殿物として回収した。
・０．５Ｍ酢酸水溶液１２００ｍＬを添加し、塩析沈殿物を溶解させた。
・粉体硫酸アンモニウムを終濃度１１Ｗ／Ｖ％となる量で添加し、４℃下で２４時間攪拌した。
・遠心分離装置により１０，０００ｇ×２０分間の処理を行って固液分離し、その固部を１１％硫安沈殿物として回収した。また、その液部を上清として回収した。
・上記上清に粉体硫酸アンモニウムを終濃度２０Ｗ／Ｖ％となる量で添加し、４℃下で２４時間攪拌した。
・遠心分離装置により１０，０００ｇ×２０分間の処理を行って固液分離し、その固部を２０％硫安沈殿物として回収した。
・透析による脱塩した。具体的には、分画分子量１２，０００～１６，０００の透析チューブ（エーディア株式会社のセルロースチューブ ３６/３２）に充填して水中に浸漬して脱塩した。
・真空凍結乾燥機により乾燥した。

【0057】

＜試験例１＞
製造例１の製造フローにおいて、リゾパスペプシンによる酵素処理によるコラーゲンの可溶化率について検討した。

【0058】

まず、抽出原料に用いたサケ鼻軟骨に含まれるコラーゲン量を測定した。具体的には、３０ｍｇの凍結乾燥軟骨に６Ｍ-ＨＣｌ（０．０４％メルカプトエタノール含有）を５ｍＬ添加して分解処理し、凍結処理後に封管後、１１０℃で２４時間、加水分解処理した後に試料をナス型フラスコに移し、エバポレーターでＨＣｌを除去した。ナス型フラスコ底部に残った試料に５ｍＬの超純水を加え分析用試料とし、アミノ酸自動分析装置でコラーゲンに特有のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を定量した。

【0059】

また、製造例１の酵素処理した後の上清について、これを経時的に採取してコラーゲン量を測定した。具体的には、採取した酵素処理上清の１ｍＬを試験管に分注し、１２Ｍ-ＨＣｌを１ｍL加えて密封し、１３０℃のホットブロックバスで３時間加熱しながら加水分解した。試料をナス型フラスコに移し、エバポレーターで塩酸を除去した。ナス型フラスコ底部に残った試料に５ｍＬの超純水を加え分析用試料とした後、常法に従い、ジメチルベンズアルデヒドを用いた比色定量法（J. F. Woesnner Jr, Archives of Biochemistry and Biophysics, 93, 440-447, 1961）により、コラーゲンに特有のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の含有量を測定した。

【0060】

ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の含有量（ｇ）は、係数１２．６３を乗じることにより、コラーゲン含量（ｇ）に換算した。

【0061】

その結果、図５（ａ）に示されるように、３回測定したところ、いずれの算定値も９０％以上の高い可溶化率で安定していた。また。図５（ｂ）（ｃ）に示されるように、可溶化率を経時的にみたところ、酵素処理開始から２４時間後には、９０％以上の可溶化率に達していた。

【0062】

＜試験例２＞
図６には、製造例１で得られた塩析沈殿物の一部をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけたときのゲルの写真を示す。

【0063】

図６に示されるように、サケ皮膚由来のコラーゲンサンプルの電気泳動像にくらべて、サケ軟骨由来の塩析沈殿物中には、軟骨由来のコラーゲンであるＩＩ型コラーゲンのα１（３重らせん鎖）に特徴的な分子量１１６ｋＤａ付近のバンドがみられた。加えて、分子量１３０ｋＤａ～１６０ｋＤａ付近にはα１、α２、α３の３重らせん構造を持つＸＩ型ラーゲンに特徴的なα１、α２の２種と考えられるバンドがみられた。

【0064】

＜試験例３＞
図７には、製造例１で得られた塩析沈殿物の一部をイオンクロマトグラフィー分析にかけたときの結果を示す。

【0065】

具体的には、製造例１で得られた塩析沈殿物の一部を、２Ｍ尿素を含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）に溶解させ、陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムには、カルボキシメチル基をリガンドとして有する充填剤を詰めたイオン交換カラム（昭和電工株式会社、ＣＭ－８２５）を用い、流速１．０ｍｌ/ｍｉｎで、４０分間にわたる０～０．４ＭまでのＮａＣｌグラジエント（濃度勾配）によって吸着タンパク質を溶出させた。カラムからの溶出液について波長２３０ｎｍにおける吸光度を連続的に測定することにより溶出タンパク質を検出し、１画分１ｍＬとしてフラクションコレクターを用いて溶出液を回収した。カラムの温度は１８℃に保持した。得られたピーク画分についてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけたた。

【0066】

図７（ａ）に示されるように、図７（ｃ）のイオンクロマトグラフィーによる分画フラクションごとの２３０ｎｍ波長の吸光度による出現ピークのうち、フラクション番号３１～フラクション番号４２にかけてタンパク質染色剤であるクマジーブリリアントブルーＲ－２５０に染まる成分が出現し、いずれも分子量１１６～１６０ｋＤａ付近にバンドがみられた。また、図７（ｂ）に示されるように、そのイオンクロマトグラフィーによるフラクション番号３７には、ＩＩ型コラーゲンに相当するα１の３重鎖によると考えられるバンドが出現し、一方でフラクション番号４１にはＸＩ型コラーゲンに相当するα１～α３の３重鎖によると考えられるバンドが出現した。

【0067】

＜試験例４＞
図８には、製造例１で得られた塩析沈殿物、１１％硫安沈殿物、及び２０％硫安沈殿物を、解析した結果を示す。

【0068】

図８（ａ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果に示されるように、製造例１で得られた２０％硫安沈殿物中には、試験例３のイオンクロマトグラフィー分析で分画されたフラクション番号４１に出現したＸＩ型コラーゲンが含まれており、製造例１で得られた塩析沈殿物中には、試験例３のイオンクロマトグラフィー分析で分画されたフラクション番号３７に出現したＩＩ型コラーゲン及びフラクション番号４１に出現したＸＩ型コラーゲンが含まれていた。

【0069】

図８（ｂ）のコラーゲン量の測定の結果に示されるように、製造例１で得られた塩析沈殿物のコラーゲン含有量は６７．８質量％であり、１１％硫安沈殿物のコラーゲン含有量は８２．８質量％であり、２０％硫安沈殿物のコラーゲン含有量は９５．２質量％であった。

【0070】

また、別途、製造例１で得られた塩析沈殿物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけて、タンパク質染色してその電気泳動像を解析し、ＸＩ型コラーゲンの分子量が大きいほうからα１鎖及びα２鎖として帰属させるとともに残りのα３鎖がともに１：１：１の質量部で含まれ、そのα３鎖がＩＩ型コラーゲンのα１鎖と重なっているとの仮定のもとに、およそ９５％純度を有するＸＩ型コラーゲンのα１鎖及びα２鎖に相当するバンドの染色強度を指標にして、そのバンドの染色強度をコラーゲン量に換算するための換算係数を求めたうえ、これを他のバンドについても量論的にあてはめておよその定量測定を行ったところ、製造例１で得られた塩析沈殿物中に含まれるコラーゲンのうち、ＩＩ型が６０質量％であり、ＸＩ型が４０質量％を占めると推定された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【手続補正書】

【提出日】2022-03-03

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

魚類軟骨を抽出原料とし、アルカリ性溶媒で洗浄処理を行って前記抽出原料から糖質系細胞外マトリックス物質を除去するアルカリ洗浄工程と、前記アルカリ洗浄工程後の処理物に対して希薄酸性溶媒中で酸性プロテアーゼによる酵素処理を行ってコラーゲンを可溶化させる酵素処理工程と、前記酵素処理工程後の処理物を固液分離して該コラーゲンを含む液部を回収するコラーゲン含有液部回収工程と、前記液部のｐＨを中和調整するコラーゲン含有液部中和工程と、前記コラーゲン含有液部中和工程後の処理物を塩析して、その塩析沈殿物としてＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含む該コラーゲンを得る塩析処理工程を含むことを特徴とするコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項2】

前記酸性プロテアーゼによる酵素処理が、真菌由来の非動物性ペプシンによる処理である、請求項１記載のコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項3】

前記塩析沈殿物を得るための塩析処理を４Ｍ以上の塩濃度で行う、請求項１又は２記載のコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項4】

前記コラーゲン含有組成物としてコラーゲン含有量が６０質量％以上であるものを得る、請求項１～３のいずれか１項に記載のコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載のコラーゲン含有組成物の製造方法によりコラーゲン含有組成物を得、得られたコラーゲン含有組成物を分画又は精製し、ＸＩ型コラーゲンを富化した組成物を得ることを特徴とするＸＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項6】

前記分画又は精製の処理は、硫安沈殿による処理である、請求項５記載のＸＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項7】

請求項１～４のいずれか１項に記載のコラーゲン含有組成物の製造方法によりコラーゲン含有組成物を得、得られたコラーゲン含有組成物を分画又は精製し、ＩＩ型コラーゲンを富化した組成物を得ることを特徴とするＩＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項8】

前記分画又は精製の処理は、硫安沈殿による処理である、請求項７記載のＩＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項9】

魚類軟骨由来抽出物であって、ＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含有し、前記ＩＩ型コラーゲンと前記ＸＩ型コラーゲンの含有量の質量比が１０：１～１：１０であり、固形分あたりのコラーゲン含有量が６０質量％以上であるよう脱塩されてなるものである該魚類軟骨由来抽出物を含む、コラーゲン含有組成物。

【手続補正書】

【提出日】2022-07-15

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

魚類軟骨を抽出原料とし、アルカリ性溶媒で洗浄処理を行って前記抽出原料から糖質系細胞外マトリックス物質を除去するアルカリ洗浄工程と、前記アルカリ洗浄工程後の処理物に対して希薄酸性溶媒中で酸性プロテアーゼによる酵素処理を行ってコラーゲンを可溶化させる酵素処理工程と、前記酵素処理工程後の処理物を固液分離して該コラーゲンを含む液部を回収するコラーゲン含有液部回収工程と、前記液部のｐＨを中和調整するコラーゲン含有液部中和工程と、前記コラーゲン含有液部中和工程後の処理物を塩析して、その塩析沈殿物としてＩＩ型コラーゲン及びＸＩ型コラーゲンを含む該コラーゲンを得る塩析処理工程を含むことを特徴とするコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項2】

前記酸性プロテアーゼによる酵素処理が、真菌由来の非動物性ペプシンによる処理である、請求項１記載のコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項3】

前記塩析沈殿物を得るための塩析処理を４Ｍ以上の塩濃度で行う、請求項１又は２記載のコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項4】

前記コラーゲン含有組成物としてコラーゲン含有量が６０質量％以上であるものを得る、請求項１～３のいずれか１項に記載のコラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載のコラーゲン含有組成物の製造方法によりコラーゲン含有組成物を得、得られたコラーゲン含有組成物を分画又は精製し、ＸＩ型コラーゲンを富化した組成物を得ることを特徴とするＸＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項6】

前記分画又は精製の処理は、硫安沈殿による処理である、請求項５記載のＸＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項7】

請求項１～４のいずれか１項に記載のコラーゲン含有組成物の製造方法によりコラーゲン含有組成物を得、得られたコラーゲン含有組成物を分画又は精製し、ＩＩ型コラーゲンを富化した組成物を得ることを特徴とするＩＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。

【請求項8】

前記分画又は精製の処理は、硫安沈殿による処理である、請求項７記載のＩＩ型コラーゲン含有組成物の製造方法。