特開 2022-119543 １４－デヒドロエルゴステロールの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022119543

(43)【公開日】2022-08-17

(54)【発明の名称】１４－デヒドロエルゴステロールの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 15/00 20060101AFI20220809BHJP

   C12N 1/14 20060101ALN20220809BHJP

【ＦＩ】

C12P15/00

C12N1/14

【審査請求】有

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021016753

(22)【出願日】2021-02-04

(11)【特許番号】

(45)【特許公報発行日】2022-04-12

(71)【出願人】

【識別番号】000253503

【氏名又は名称】キリンホールディングス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100107342

【弁理士】

【氏名又は名称】横田 修孝

(74)【代理人】

【識別番号】100155631

【弁理士】

【氏名又は名称】榎 保孝

(74)【代理人】

【識別番号】100137497

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 未知子

(74)【代理人】

【識別番号】100217294

【弁理士】

【氏名又は名称】内山 尚和

(72)【発明者】

【氏名】杉原 圭彦

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AC14

4B064CA05

4B064CD09

4B064CD21

4B064CD22

4B064CE08

4B064CE10

4B064DA01

4B065AA60X

4B065AC14

4B065BB15

4B065BB16

4B065BB23

4B065BB26

4B065BB29

4B065CA05

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】１４－デヒドロエルゴステロールの製造方法の提供。
【解決手段】本発明によれば、１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよびタンパク酵素消化物を含んでなるものである、１４－ＤＨＥの製造方法が提供される。本発明によればまた、１４－ＤＨＥの製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなり、かつ、前記糖類の培地中の濃度が１０ｇ／Ｌ以上である、１４－ＤＨＥの製造方法が提供される。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよびタンパク酵素消化物を含んでなるものである、方法。

【請求項2】

タンパク酵素消化物がペプトンである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ペプトンの培地中の濃度が４．５ｇ／Ｌ以上である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなるものであり、前記糖類の培地中の濃度が１０ｇ／Ｌ以上である、方法。

【請求項5】

糖類がマルトースおよび／またはデキストロースを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

培養期間が３～５日間である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

麦芽エキス、酵母エキス、タンパク酵素消化物および糖類の培地中の合計濃度が１８ｇ／Ｌ以上である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

微生物がアスペルギルス・カワチである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前培養の工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

微生物培養による１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよびタンパク酵素消化物を含んでなるものである、方法。

【請求項11】

微生物培養による１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなるものであり、かつ、前記糖類の培地中の濃度が１０ｇ／Ｌ以上である、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１４－デヒドロエルゴステロールの製造方法に関する。本発明はまた、微生物培養による１４－デヒドロエルゴステロールの製造方法において１４－デヒドロエルゴステロールの産生を増強する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、１４－デヒドロエルゴステロール（以下、単に「１４－ＤＨＥ」ということがある）は、免疫抑制や脂質代謝改善に関連する生理活性を有する物質として注目されている（特許文献１）。１４－ＤＨＥの製造方法に関しては麹菌などの微生物発酵を利用した方法がある（特許文献２および特許文献３）。しかしながら、これらの従来法では十分な量の１４－ＤＨＥを得るには培養期間を６日間程度とする必要があり、より効率的な１４－ＤＨＥの製造方法が望まれていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１６－２０４３４２号公報

【特許文献2】特開２０１３－１３８６１７号公報

【特許文献3】特開２０１５－１２３０１３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、１４－ＤＨＥの新規な製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、微生物培養による１４－ＤＨＥの製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する新規な方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、アスペルギルス属に属する微生物の培養において、前記微生物の培地中の初期胞子濃度や培地成分を特定の条件とすることで、従来法よりも短い培養期間で１４－ＤＨＥの産生量が同等またはそれ以上となることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。

【0006】

本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよびタンパク酵素消化物を含んでなるものである、方法。
［２］タンパク酵素消化物がペプトンである、上記［１］に記載の方法。
［３］ペプトンの培地中の濃度が４．５ｇ／Ｌ以上である、上記［２］に記載の方法。
［４］１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなるものであり、前記糖類の培地中の濃度が１０ｇ／Ｌ以上である、方法。
［５］糖類がマルトースおよび／またはデキストロースを含む、上記［４］に記載の方法。
［６］培養期間が３～５日間である、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］麦芽エキス、酵母エキス、タンパク酵素消化物および糖類の培地中の合計濃度が１８ｇ／Ｌ以上である、上記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］微生物がアスペルギルス・カワチである、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前培養の工程をさらに含む、上記［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］微生物培養による１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよびタンパク酵素消化物を含んでなるものである、方法。
［１１］微生物培養による１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなるものであり、かつ、前記糖類の培地中の濃度が１０ｇ／Ｌ以上である、方法。

【0007】

上記［１］の製造方法と上記［４］の製造方法を合わせて本明細書において「本発明の製造方法」ということがある。

【0008】

本発明の方法によれば、従来法よりも短い培養期間で従来法と同等またはそれ以上の産出量の１４－ＤＨＥを得ることができるため、より効率的に生理活性物質である１４－ＤＨＥを製造することができる点で有利である。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、例１に示された条件１～６の培養で得られたアスペルギルス・カワチの湿菌体重量を示す。

【図2】図２は、例１に示された条件１～６におけるアスペルギルス・カワチの湿菌体単位重量あたりの１４－ＤＨＥ産生量（１４－ＤＨＥ産生量／湿菌体単位重量）を示す。

【図3】図３は、例１に示された条件１～６における培養バッチあたりの１４－ＤＨＥ産生量（総１４－ＤＨＥ産生量）を示す。

【図4】図４は、例１に示された条件４と条件６において培養期間を４～６日間とした場合におけるアスペルギルス・カワチの湿菌体単位重量あたりの１４－ＤＨＥ産生量（１４－ＤＨＥ産生量／湿菌体単位重量）を条件４’および条件６’としてそれぞれ示す。

【発明の具体的説明】

【0010】

本発明の製造方法により得られる１４－ＤＨＥは、下記の構造式で表される化合物であり、下記の物理化学的特性を有する。

【0011】

（構造式）

【化1】

【0012】

（物理化学的特性）
（１）分子量：394.63
（２）分子式：C28H42O(高分解能APCI-Orbitrap法による観測値:m/z 395.33057(M+H)⁺、理論値:395.33139)
（３）溶剤に対する溶解性：水に不溶、エタノールに難溶、クロロホルムに易溶
（４）紫外吸収スペクトル(MeCN)：391nm
（５）¹H-NMR(CD₃OD)： 6.15 (1H, m), 5.75 (1H, m), 5.65 (1H, dd, J = 2.2, 5.9Hz), 5.27 (1H, dd, J = 7.0, 15.1 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 7.9, 15.1 Hz), 3.64 (1H, m), 2.51 (1H, ddd, J = 2.2, 5.1, 10.6 Hz), 2.30 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.20 (1H, dd, J = 3.2, 7.8 Hz), 2.06 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.94 (1H, m), 1.90 (1H, m),1.87 (2H, m), 1.87 (1H, ddd, J = 3.2, 7.0, 7.3 Hz), 1.71 (1H, m), 1.59 (1H, m),1.57 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.45 (1H, ddd, J = 3.2, 6.3, 6.5 Hz), 1.30 (1H, m),1.05 (3H, d, J = 6.8 Hz ), 0.93 (3H, d, J = 7.3 Hz), 0.92 (3H, s,), 0.89 (3H, s), 0.85 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.83 (3H, d, J = 6.3 Hz).
（６）¹³C-NMR(CD₃OD)：149.2 (s), 143.0 (s), 135.4 (s), 132.2 (s), 132.0 (s),120.5 (s), 120.4 (s), 117.4 (s), 70.4 (s), 58.1 (s), 46.3 (s), 45.4 (s), 42.8 (s), 41.0 (s), 39.0 (s), 38.9 (s), 37.8 (s), 37.0 (s), 36.0 (s), 33.1 (s), 32.0 (s), 21.1 (s), 19.9 (s), 19.7 (s), 19.6 (s), 17.6 (s), 16.8 (s), 14.5 (s).

【0013】

本発明で用いるアスペルギルス属に属する微生物は、１４－ＤＨＥを産生することができるものであれば特に限定されないが、例えば、黒麹菌（アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー）、黄麹菌（アスペルギルス・オリゼー）、醤油用麹菌（アスペルギルス・ソーヤ）、白麹菌（アスペルギルス・カワチ）などが挙げられる。このうち、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリが好ましく、特に、アスペルギルス・カワチ（亜種を含む）は１４－ＤＨＥ高産生であるため好ましい。これらの麹菌の種麹は、秋田今野社、樋口もやし社、日本醸造工業社などから入手することができる。

【0014】

本発明の製造方法の第一の態様によれば、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなる、１４－ＤＨＥの製造方法であって、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよびタンパク酵素消化物を含んでなることを特徴とする製造方法が提供される。

【0015】

本発明の製造方法の第一の態様において、アスペルギルス属に属する微生物の培養にあたって最初に培地に添加する該微生物の初発の胞子数、すなわち、前記微生物の培地中の初期胞子濃度の下限値（以上または超える）は、培地１ｍＬあたり５．０×１０^３個、７．５×１０^３個、１．０×１０^４個、１．２５×１０^４個、１．５×１０^４個、１．７５×１０^４個、２．０×１０^４個とすることができ、その上限値（以下または下回る）は、培地１ｍＬあたり１．０×１０^５個、２．０×１０^４個、３．０×１０^４個、４．０×１０^４個、５．０×１０^４個とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、上記初期胞子濃度の範囲は、例えば、培地１ｍＬあたり５．０×１０^３個～５．０×１０^４個、７．５×１０^３個～４．０×１０^４個とすることができる。培地に添加するアスペルギルス属に属する微生物の培地中の初期胞子濃度を上記のように設定することにより、１４－ＤＨＥを産生するフェーズの微生物の数を十分確保することができるとともに、溶菌に至らない１４－ＤＨＥを産生するフェーズの微生物を十分に存在させることができる。

【0016】

本発明の製造方法の第一の態様において、培地は少なくとも麦芽エキスおよびタンパク酵素消化物を含む。

【0017】

麦芽エキスは、麦、特に大麦の種子を発芽させ、場合により焙煎した後、それを水などの溶媒により抽出して得られる抽出物であり、マルトース、グルコース、フルクトースなどの還元糖を多く含み、その他ペプチド、アミノ酸、プリン、ビタミンなどを含むことが知られている。麦芽エキスの形態は、粉末などの固体状のもの、ペースト状のものなどが知られているところ、本発明で使用する麦芽エキスの形態は特に限定されず、ハンドリングの観点から粉末状のものを好ましく用いることができる。

【0018】

麦芽エキスの培地中の濃度（固形分濃度）の下限値（以上または超える）は、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌとすることができ、その上限値（以下または下回る）は、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌとすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、上記麦芽エキスの培地中の濃度の範囲は、例えば、１０～４０ｇ／Ｌ、１５～３５ｇ／Ｌ、１８～３０ｇ／Ｌ、２１～３０ｇ／Ｌとすることができる。麦芽エキスの培地中の濃度を上記のように設定することにより、微生物の十分な増殖および生育に必要な栄養分を供給することができるとともに、想定する培養期間経過時に培地中の栄養分が過剰に残らないようにすることにより多くの微生物が二次代謝（１４－ＤＨＥは微生物の二次代謝で産生すると考えられる）のフェーズになっているようにすることができる。なお、本発明では粉末など固体状の成分以外にペースト状など水を含んだ形態の麦芽エキスを使用することができ、その場合には、その濃度から固形分濃度に換算した上で必要量を使用すればよいことはいうまでもない（以下、他の成分も同様）。

【0019】

タンパク酵素消化物としては、ペプトンが挙げられる。ペプトンの由来は特に限定されず、肉由来や酵母由来、ミルクカゼイン由来、大豆由来、血球成分由来のものであってもよい。また、酵素の由来や種類は特に限定されず、たとえば、ペプシン、パパイン、パンクレアチン、トリプシン、細菌由来のプロテイナーゼなどが挙げられる。

【0020】

タンパク酵素消化物の培地中の濃度（固形分濃度）の下限値（以上または超える）は、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌとすることができ、その上限値（以下または下回る）は、７ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌとすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、上記タンパク酵素消化物の培地中の濃度の範囲は、例えば、２～１１ｇ／Ｌ、３～９ｇ／Ｌ、３～ｇ／Ｌとすることができる。タンパク酵素消化物の培地中の濃度を上記のように設定することにより、微生物の十分な増殖・生育に必要な栄養分（特に適度に小分子化された窒素源）を供給することができるとともに、想定する培養期間経過時に培地中の栄養分（特に適度に小分子化された窒素源）が過剰に残らないようにすることにより多くの微生物が二次代謝のフェーズになっているようにすることができる。なお、１４－ＤＨＥは微生物の二次代謝で産生すると考えられる。

【0021】

本発明の製造方法の第一の態様において、培地には、上記以外の成分（例えば、酵母エキスや糖類）が含まれていてもよいが、これらの成分が実質的に含まれないようにすることもできる。なお、培地に糖類が実質的に含まれない場合であっても麦芽エキス由来の糖類が培地に含まれることは許容されるものとする。

【0022】

本発明の製造方法の第二の態様によれば、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなる、１４－ＤＨＥの製造方法であって、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．５×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスを含んでなることを特徴とする製造方法が提供される。

【0023】

本発明の製造方法の第二の態様において、アスペルギルス属に属する微生物の培地中の初期胞子濃度の下限値（以上または超える）は、培地１ｍＬあたり５．０×１０^３個、７．５×１０^３個、１．０×１０^４個、１．２５×１０^４個、１．５×１０^４個、１．７５×１０^４個、２．０×１０^４個、２．２５×１０^４個、２．５×１０^４個とすることができ、その上限値（以下または下回る）は、１．０×１０^５個、２．０×１０^４個、３．０×１０^４個、４．０×１０^４個、５．０×１０^４個とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、上記初期胞子濃度の範囲は、例えば、５．０×１０^４個～５．０×１０^４個、７．５×１０^３個～４．０×１０^４個とすることができる。培地に添加するアスペルギルス属に属する微生物の培地中の初期胞子濃度を上記のように設定することにより、１４－ＤＨＥを産生するフェーズの微生物の数を十分確保することができるとともに、溶菌に至らない１４－ＤＨＥを産生するフェーズの微生物を十分に存在させることができる。

【0024】

本発明の製造方法の第二の態様において、培地は少なくとも麦芽エキスを含む。該麦芽エキスの培地中の濃度（固形分濃度）の下限値（以上または超える）は、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２．０ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌとすることができ、その上限値（以下または下回る）は、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌとすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、上記麦芽エキスの培地中の濃度の範囲は、例えば、９～３０ｇ／Ｌ、１０～２５ｇ／Ｌ、１０～２０ｇ／Ｌ、１０～１５ｇ／Ｌとすることができる。麦芽エキスの培地中の濃度を上記のように設定することにより、微生物の十分な増殖および生育に必要な栄養分を供給することができるとともに、想定する培養期間経過時に培地中の栄養分が過剰に残らないようにすることにより多くの微生物が二次代謝のフェーズになっているようにすることができる。

【0025】

本発明の製造方法の第二の態様において、培地には上記成分以外に酵母エキス、糖類を含んでもよい。

【0026】

酵母エキスの培地中の濃度（固形分濃度）の下限値（以上または超える）は、１．２ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌとすることができ、その上限値（以下または下回る）は、２．２ｇ／Ｌ、２．８ｇ／Ｌ、３．４ｇ／Ｌとすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、上記糖類の培地中の濃度の範囲は、例えば、１．２～３．４ｇ／Ｌ、１．８～２．８ｇ／Ｌとすることができる。酵母エキスの培地中の濃度を上記のように設定することにより、微生物の増殖および生育に必要な栄養分（特に糖分、ビタミン、無機質）を供給することができるとともに、想定する培養期間経過時に培地中の栄養分が過剰に残らないようにすることにより多くの微生物が二次代謝のフェーズになっているようにすることができる。

【0027】

糖類には、例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、乳糖、デキストロースが挙げられるが、好ましくはマルトース、デキストロースである。糖類の培地中の濃度の下限値（以上または超える）は、７．８ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１５．６ｇ／Ｌとすることができ、その上限値（以下または下回る）は１６ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌとすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、上記糖類の培地中の濃度の範囲は、例えば１０～２５ｇ／Ｌ、１３～２０ｇ／Ｌ、１３～１８ｇ／Ｌとすることができる。

【0028】

本発明の製造方法において、麦芽エキス、酵母エキス、タンパク酵素消化物および糖類の各成分の培地中の濃度（固形分濃度）の合計は１８ｇ／Ｌ以上（好ましくは２０ｇ／Ｌ以上、２５ｇ／Ｌ以上）とすることができる。なお、麦芽エキス、酵母エキス、タンパク酵素消化物および糖類の合計濃度は、培地中の各成分の添加濃度を足し合わせて算出することができる。

【0029】

本発明の製造方法において、培養期間は３～５日間とすることができ、１４－ＤＨＥの産生量を最大化する観点からは好ましくは３．５～４．５日間であり、より好ましくは４日間以下または約４日間である。

【0030】

本発明の製造方法において、培養温度の下限値（以上または超える）は２０℃、２５℃とすることができ、その上限値（以下または下回る）は４０℃、３５℃とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、培養温度の範囲は、例えば、２０～４０℃、２０～３５℃、２５～３５℃、３０～３５℃、最も好ましくは約３０℃とすることができる。

【0031】

本発明の製造方法において微生物培養は液体培養にて行うことができる。液体培養は、条件制御可能な発酵槽を用いて、例えば攪拌培養、通気培養、振とう培養などを挙げることができる。培養は、好気的条件で行われる。攪拌速度や通気量は、微生物菌体の種類や培養条件に応じて適宜選択される。

【0032】

振とう培養の場合、振とう条件は特に限定されないが、振とうの方向は１次元方向（往復振とう）や２次元方向（旋廻振とう）とすることができ、あるいは３次元方向とすることができる。例えば、培養容器として５Ｌのジャーファーメンターを使用するときは旋廻振とうで、撹拌速度は１００～１０００ｒｐｍとすることができ、好ましくは２００～８００ｒｐｍまたは４００～６００ｒｐｍである。通気条件下で培養する場合には、通気量を例えば０．４～０．６ｖｖｍとすることができる。比較的大スケールの培養でも、適切な振とう条件とすることで、培地全体への送気が確保されるとともに、微生物の増殖などによる培地中の栄養分や増殖等を阻害する物質の偏りが防止され、１４－ＤＨＥの効率的な産生が確保される。

【0033】

本発明の製造方法は、既に述べた培養工程の前に前培養の工程をさらに含むことができる（本明細書では、既に述べた培養工程を「前培養」と区別するために「本培養」ということがある）。前培養は、微生物の培養にあたって初発の胞子数をあらかじめ所望の数および生育フェーズに調整する観点から行うものであり、例えば、以下のように実施することができる。

【0034】

本発明の製造方法において、前培養の培養期間は特に限定されないが、例えば８～１４４時間、１０～８０時間、１５～４０時間、１５～３０時間とすることができ、最も好ましくは２４時間である。本発明の製造方法において、前培養の培養温度、振とう条件および通気量は本培養の培養温度、振とう条件および通気量と同様の条件とすることができる。ここで、前培養はフラスコ等で比較的小スケールで行うところ、振とう培養器を使用する場合に、振とうの態様は、培養容器の形状に合わせて選択することができる。例えば、培養容器として坂口フラスコを使用するときは振幅を１次元方向（往復振とう）で行い、三角フラスコを使用するときは振幅を２次元方向（旋廻振とう）で行う。攪拌速度として、例えば、培養容器の容量が５００ｍＬのときの振幅数（ｓｐｍ）または回転数（ｒｐｍ）は、１０～５００、５０～３００、７０～２００、さらに好ましくは約１２０であり、最も好ましくは坂口フラスコを使用した場合の約１２０ｓｐｍである。

【0035】

本発明の製造方法は、本培養の工程の後に、本培養により得られた菌体を含む発酵産物を適切な溶媒を用い、一般的な手法により抽出する工程をさらに含むことができる。また、上記発酵産物を抽出する工程には、超音波処理による菌体破壊工程や後記浸漬工程を組合わせたものとすることができる。

【0036】

溶媒抽出に用いる有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、酢酸メチル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタンなどが挙げられる。中でもエタノール、メタノール、酢酸エチル、およびヘキサンが好ましい。これらの溶媒は２種類以上を混合して用いてもよく、また２種類以上の有機溶媒を用いて２段階以上の溶媒抽出工程を行なってもよい。あるいは、そのような有機溶媒に代えて、またはそれらと組み合わせて、食用油脂を抽出溶媒として用いることができる。食用油脂は、ラードまたはヘットなどの動物性油脂であってもよいが、好ましくは植物性油脂であり、例えば大豆油、ナタネ油、オリーブ油、パーム油、ゴマ油、コーン油、サフラワー油、綿実油、ピーナッツオイル、グレープシードオイル、えごま油、つばき油、亜麻仁油などが挙げられる。

【0037】

上記発酵産物を抽出する工程は、例えば、抽出工程は、菌体を含む発酵産物をエタノールと水を含む浸漬液に浸漬する工程と、浸漬工程後に得られた菌体を含む混合物に有機溶媒および／または食用油脂を加えて抽出する工程とすることができる。なお、食用油脂による抽出工程においては、前記浸漬工程は必須のものとなる。前記浸漬工程において、培養により得られた菌体を含む発酵産物を浸漬するエタノールと水を含む浸漬液中のエタノールの濃度は２０（ｗ／ｗ）％以上、特に３０（ｗ／ｗ）％以上、とりわけ４０（ｗ／ｗ）％以上であることが好ましく、かつ９５（ｗ／ｗ）％以下、特に９０（ｗ／ｗ）％以下、とりわけ８０（ｗ／ｗ）％以下であることが好ましい。浸漬液は、水とエタノールとからなるエタノール水溶液であってもよい。エタノールと水を含む浸漬液は、発酵産物に含まれる菌体の細胞膜または細胞壁を弱め、菌体内部に蓄えられた１４－ＤＨＥが抽出されやすくする効果を奏すると考えられる。浸漬は、１時間以上、特に６時間以上、とりわけ１２時間以上、さらには２４時間以上の時間をかけて行うことが好ましい。

【0038】

エタノールと水を含む浸漬液に浸漬した発酵産物は、次いで有機溶媒および／または食用油脂を用いた抽出工程に供される。食用油脂は、培養産物１ｇに対して１０ｍＬ以下、特に８ｍＬ以下、とりわけ６ｍＬ以下の量で用いると、得られる麹菌発酵エキス中の１４－ＤＨＥ濃度が高くなるため好ましい。なお、この浸漬工程を経た抽出工程においては、菌体を破壊するための超音波処理などは特に必要ない。エタノールと水を含む浸漬液に浸漬したことにより、菌体の細胞膜または細胞壁は十分弱まっており、単に食用油脂を加えて攪拌するだけで菌体に蓄えられた１４－ＤＨＥを抽出することができる。より効率的に１４－ＤＨＥが抽出できるよう、抽出工程は必要に応じて複数回繰り返してもよい。

【0039】

本発明によれば、微生物培養による１４－ＤＨＥの製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を液体培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよびタンパク酵素消化物を含んでなることを特徴とする方法が提供される。本発明の上記増強方法は、初期胞子濃度およびタンパク酵素消化物については本発明の製造方法の第一の態様に関する記載に従って実施することができ、それ以外は本発明の製造方法に関する記載に従って実施することができる。

【0040】

本発明によればまた、微生物培養による１４－ＤＨＥの製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を液体培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、かつ、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなることを特徴とする方法が提供される。本発明の上記増強方法は、初期胞子濃度については本発明の製造方法の第二の態様に関する記載に従って実施することができ、それ以外は本発明の製造方法に関する記載に従って実施することができる。

【実施例0041】

以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

【0042】

例１：１４－ＤＨＥの発酵生産に関する培養条件の検討（１）
例１では、１４－ＤＨＥの発酵生産に関する培養条件として本培養の培地中の初期胞子濃度（添加胞子数）と培地組成に着目して検討した。

【0043】

（１）方法
ア 前培養
１４－ＤＨＥを産生する菌体としてアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）ＮＢＲＣ４３０８株（独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲）を使用した。前培養の培地は、麦芽エキスとしてＭａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂａｃｔｏ Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２１８６３０）６．０ｇ／Ｌ、マルトース（富士フイルム和光純薬社）１．８ｇ／Ｌ、デキストロース（富士フイルム和光純薬社）６．０ｇ／Ｌ、酵母エキスとしてＹｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社）１．２ｇ／Ｌとなるように培地１５０ｍＬを容量５００ｍＬの坂口フラスコにおいて調製した。そして、この培地に胞子濃度が１．０×１０^５個／ｍＬとなるようにＮＢＲＣ４３０８株を播種して３０℃、１２０ｓｐｍの条件で２４時間培養を行った。

【0044】

イ 本培養
本培養の培地は、表１に示す組成・分量にて容量５Ｌのジャファーメンター（丸菱バイオエンジ社）において３Ｌで調製した。そして、上記アの前培養液を表１の条件にて移植した後、３０℃、４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて９６時間培養（４日間）（条件１）または１４４時間培養（６日間）（条件２～６）を行った。培地成分には、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）を使用し、麦芽エキス、酵母エキス、マルトースおよびデキストロースは前培養と同様のものを使用した。なお、使用したペプトンは牛由来タンパク質を酵素消化したタンパク酵素消化物である。

【0045】

【表1】

【0046】

ウ １４－ＤＨＥの抽出および定量
上記イにおいて培養した菌体を回収するために、培養液（液体麹）を、濾紙を用いて吸引濾過を行い、菌体を水で洗浄した。その後、再び吸引ろ過を行い、水分を極力除去した。回収した湿菌体２ｇにエタノールを６ｍＬ添加し１晩静置し、水３ｍＬ、ヘキサン６ｍＬを加え、２分間激しく攪拌した後、超音波処理を３０分間行った。その後、１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清（ヘキサン層）のみを回収した。回収したヘキサン層を乾固し、ヘキサン層以外の残渣（懸濁した水層）にヘキサン６ｍＬを加え、攪拌、超音波処理および遠心分離を再度実施し、上清のヘキサン層を回収し、乾固した。この抽出操作を湿菌体２ｇにつき２回行った。得られたヘキサン乾固物にエタノール２ｍＬを添加し、２－プロパノールで４０倍希釈したのち液体クロマトグラグラフィー（ＨＰＬＣ）に２０μＬ供した。ＨＰＬＣの条件は表２の通りである。この条件では１４－ＤＨＥは１２．５分前後に溶出される。１４－ＤＨＥ産生量は１４－ＤＨＥ標品（発酵産生・精製で作製）を使用した検量線法により算出した。

【0047】

【表2】

【0048】

（２）結果
結果は、図１～３に示す通りであった。従来法と同等の培養条件（条件１）では、麦芽エキスを含むエキス分が一定濃度以上である培地で６日間培養した場合、湿菌体重量は約９０ｇ、湿菌体単位重量あたりの１４－ＤＨＥ産生量は約６８０μｇ、総１４－ＤＨＥ産生量は約６０ｍｇ／３Ｌであった。

【0049】

ア 初期胞子濃度
初期胞子濃度（本培養における添加胞子数）を条件１の８倍にした場合は、４日間培養（条件２）の条件下でも６日間培養（条件１）と同等以上の湿菌体重量（図１）、湿菌体単位重量あたりの１４－ＤＨＥ産生量（図２）および総１４－ＤＨＥ産生量（図３）を達成できることが確認された。

【0050】

イ 培地組成
ｉ）培地成分
＜麦芽エキス＋ペプトン＞
初期胞子濃度を８倍まで高めた上で、培地組成を麦芽エキスとペプトンの２成分の構成に変更し、培地成分の合計濃度を条件１および条件２（いずれも１８ｇ／Ｌ）の２倍程度（条件４：培地成分の合計濃度３０ｇ／Ｌ）まで上げた場合は（条件４）、条件１（６日間培養）および条件２と比較して、４日間培養で湿菌体重量と湿菌体重量あたりの１４－ＤＨＥ量が増加し（図１、２）、総１４－ＤＨＥ量は６日間培養（条件１）の約３倍となることが確認された（図３）。

【0051】

＜麦芽エキス＋酵母エキス＞
一方で、培地成分としてペプトンの代わりに酵母エキスを添加した場合は（条件５）、湿菌体重量が明らかに増える一方で湿菌体重量あたりの１４－ＤＨＥ量および総１４－ＤＨＥ量が減少することが確認された。

【0052】

ｉｉ）培地濃度
条件１（６日間培養）および条件２とは培地成分を変えずに培地成分の合計濃度を２倍程度にした場合（条件３および６：培地成分合計３０ｇ／Ｌ）、添加胞子数を８倍に高めたときは（条件３）湿菌体重量のみが顕著に増え、湿菌体単位重量あたりの１４－ＤＨＥ量および総１４－ＤＨＥ量は明らかに減少することが確認された。一方で、初期胞子濃度を１２倍まで高めた場合は（条件６）、４日間で湿菌体重量、湿菌体重量あたりの１４－ＤＨＥ量が６日間培養（条件１）よりも１．５倍程度高くなり、総１４－ＤＨＥ量として条件１（６日間培養）の約３倍となることが確認された（図３）。

【0053】

これらの結果から、同じ培地組成で初期胞子濃度を８倍とした場合は、本培養４日目時点で１４－ＤＨＥがほとんど産生されなかったが、初期胞子濃度をさらに高めた場合（例えば、１２倍まで高めた場合）は、菌体の生育フェーズから二次代謝フェーズへの切り替わりが早期に起こり、菌体二次代謝物である１４－ＤＨＥの産生が早まった可能性が考えられる。

【0054】

例２：１４－ＤＨＥの発酵生産に関する培養条件の検討（２）
例１の結果から、１４－ＤＨＥの発酵生産に関する培養条件のうち初期胞子濃度や培地組成の培養条件を変更することで、培養期間が４日間の場合でも、６日間の場合（例１の条件１）と同等以上の１４－ＤＨＥ産生量を得られることが確認された（特に例１の条件４と条件６）。そこで、例２では、例１の条件４および６と同様の初期胞子濃度および培地組成の培養条件下で、培養期間を４日間から延ばした場合に１４－ＤＨＥ産生量にどのような影響を及ぼすかを検討した。

【0055】

（１）方法
培養期間を５日間および６日間としたこと以外は、例１の条件４と条件６と同じ条件で行った。

【0056】

（２）結果
結果は、図４に示す通りであった。具体的には、培地組成が例１の条件４（●）の場合は、培養期間が４日間と５日間で菌体あたりの１４－ＤＨＥ産生量はほとんど変化せず、６日目では減少した（図４の条件４’）。また、６日目には菌体量も減少しており溶菌した可能性が考えられる。一方、培地組成が例１の条件６（▲）の場合は、培養期間が５日間で４日間よりも菌体単位重量あたりの１４－ＤＨＥ産生量が減少した（図４の条件６’）。

【0057】

例３：１４－ＤＨＥの発酵生産に関する培養条件の検討（３）
例１の条件４において、培地成分として肉由来のペプトンを添加した場合に１４－ＤＨＥ産生量の増大が確認された。この結果は、窒素源としてのタンパク酵素消化物の使用が、アスペルギルス属に属する微生物による１４－ＤＨＥの産生量の増大に寄与するためと考えられた。そこで、例３では、ペプトンの由来（種類）を代えた場合の１４－ＤＨＥ産生量に及ぼす影響について検討した。

【0058】

（１）方法
ペプトンとして酵母由来ペプトン（オリエンタル酵母工業社）を使用したこと以外は、例１の条件４と同じ条件で行った。

【0059】

（２）結果
酵母由来ペプトンを使用した場合、バッチあたりの産生量はペプトン非含有培地（例１の条件１）に対して約１．７５倍であった（データ示さず）。この結果から、タンパク酵素消化物としてペプトンの種類（由来）によらず１４－ＤＨＥ産生量が増加することが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【手続補正書】

【提出日】2021-10-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0024】

本発明の製造方法の第二の態様において、培地は少なくとも麦芽エキスを含む。該麦芽エキスの培地中の濃度（固形分濃度）の下限値（以上または超える）は、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２．０ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌとすることができ、その上限値（以下または下回る）は、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌとすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、上記麦芽エキスの培地中の濃度の範囲は、例えば、９～３０ｇ／Ｌ、１０～２５ｇ／Ｌ、１０～２０ｇ／Ｌ、１０～１５ｇ／Ｌとすることができる。麦芽エキスの培地中の濃度を上記のように設定することにより、微生物の十分な増殖および生育に必要な栄養分を供給することができるとともに、想定する培養期間経過時に培地中の栄養分が過剰に残らないようにすることにより多くの微生物が二次代謝のフェーズになっているようにすることができる。

【手続補正2】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよびペプトンを含んでなり、かつ、前記ペプトンの培地中の濃度が２～１１ｇ／Ｌである、方法。

【請求項2】

前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０ ^５ 個／ｍＬ未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ペプトンの培地中の濃度が４．５ｇ／Ｌ以上である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．５×１０ ^４ 個／ｍＬ以上１．０×１０ ^５ 個／ｍＬ未満であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなるものであり、前記麦芽エキスの培地中の濃度が９ｇ／Ｌ以上であり、かつ、前記糖類の培地中の濃度が１０ｇ／Ｌ以上である、方法。

【請求項5】

糖類がマルトースおよび／またはデキストロースを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

培養期間が３～５日間である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

麦芽エキス、酵母エキス、タンパク酵素消化物および糖類の培地中の合計濃度が１８ｇ／Ｌ以上である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

微生物がアスペルギルス・カワチである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前培養の工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

微生物培養による１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよびペプトンを含んでなり、かつ、前記ペプトンの培地中の濃度が２～１１ｇ／Ｌである、方法。

【請求項11】

微生物培養による１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．５×１０ ^４ 個／ｍＬ以上１．０×１０ ^５ 個／ｍＬ未満であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなるものであり、前記麦芽エキスの培地中の濃度が９ｇ／Ｌ以上であり、かつ、前記糖類の培地中の濃度が１０ｇ／Ｌ以上である、方法。

【手続補正書】

【提出日】2022-02-15

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよびペプトンを含んでなり（ただし、前記培地は酵母エキスを含まない）、かつ、前記ペプトンの培地中の濃度が２～１１ｇ／Ｌである、方法。

【請求項2】

前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^５個／ｍＬ未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ペプトンの培地中の濃度が４．５ｇ／Ｌ以上である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．５×１０^４個／ｍＬ以上２．０×１０ ^４ 個以下であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなるものであり、前記麦芽エキスの培地中の濃度が９ｇ／Ｌ以上であり、かつ、前記糖類の培地中の濃度が１０ｇ／Ｌ以上である、方法。

【請求項5】

糖類がマルトースおよび／またはデキストロースを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

培養期間が３～５日間である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

麦芽エキス、酵母エキス、タンパク酵素消化物および糖類の培地中の合計濃度が１８ｇ／Ｌ以上である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

微生物がアスペルギルス・カワチである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前培養の工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

微生物培養による１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．０×１０^４個／ｍＬ以上であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよびペプトンを含んでなり（ただし、前記培地は酵母エキスを含まない）、かつ、前記ペプトンの培地中の濃度が２～１１ｇ／Ｌである、方法。

【請求項11】

微生物培養による１４－デヒドロエルゴステロール（１４－ＤＨＥ）の製造方法において１４－ＤＨＥの産生を増強する方法であって、アスペルギルス属に属する微生物を培養して１４－ＤＨＥを産生させる工程を含んでなり、前記微生物の培地中の初期胞子濃度が１．５×１０^４個／ｍＬ以上２．０×１０ ^４ 個／ｍＬ以下であり、培地が少なくとも麦芽エキスおよび糖類を含んでなるものであり、前記麦芽エキスの培地中の濃度が９ｇ／Ｌ以上であり、かつ、前記糖類の培地中の濃度が１０ｇ／Ｌ以上である、方法。