特開 2022-122926 改善された凝乳特性を有するキモシンの変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022122926

(43)【公開日】2022-08-23

(54)【発明の名称】改善された凝乳特性を有するキモシンの変異体

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/64 20060101AFI20220816BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220816BHJP

   C12N 15/59 20060101ALI20220816BHJP

   A23C 19/04 20060101ALI20220816BHJP

   A23C 9/12 20060101ALI20220816BHJP

   A23L 11/40 20210101ALI20220816BHJP

【ＦＩ】

C12N9/64 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/59

A23C19/04

A23C9/12

A23L11/40

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022085229

(22)【出願日】2022-05-25

(62)【分割の表示】P 2020038155の分割

【原出願日】2015-02-26

(31)【優先権主張番号】14156707.3

(32)【優先日】2014-02-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】14176664.2

(32)【優先日】2014-07-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】503260310

【氏名又は名称】セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】ヨハネス マルデン ファン デン ブレンク

(72)【発明者】

【氏名】イェスパ ラングホルム イェンスン

(72)【発明者】

【氏名】ヨーナス ヤコプスン

(72)【発明者】

【氏名】マーティン ロン

(72)【発明者】

【氏名】イーベン イェベスン

(72)【発明者】

【氏名】クレスチャン イェーッケル

(57)【要約】

【課題】本発明は、改善された凝乳特性を有するキモシンの変異体に関する。
【解決手段】本発明者は、それらの位置の１又は２以上の位置で変異体を製造することにより、改善されたキモシン変異体を得ることができることで、本明細書において重要である多くの追加アミノ酸位置を同定した。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離されたキモシンポリペプチド変異体の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１つ以上の位置で変更を行い、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103 ; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261 ; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含んでおり；及び
（ｂ）工程（ａ）の変更されたポリペプチドを生成し、そして単離し、そしてそれにより、単離されたキモシンポリペプチドを得る
ことを含み、ここで前記変異体は、キモシン活性を有し；そしてここで、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとのアライメントにより決定され、すなわち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおける対応するアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ｉｉ）前記親ペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号１の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有し；
そして但し、前記単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択される特定の変異体ではない、方法。

【請求項2】

前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、以下：
－配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比と比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性；及び
－配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのＣ／Ｐ比と比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性
を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記変更が、少なくとも１つのアミノ酸位置での置換を包含し、そして前記置換が、L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361L; V367I;又はK379Pである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記置換が、Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q又はK336Qである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記変更が、少なくとも１つのアミノ酸位置での置換を含み、そして前記置換が、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I 154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項１～４のいずれか１項記に載の方法。

【請求項6】

前記親ポリペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記親ポリペプチドが、配列番号２（ラクダキモシン）のアミノ酸位置５９～３８１である、配列番号２の成熟ポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

請求項１～７の何れか１項に記載の方法により得られる、単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【請求項9】

単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、以下：
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１つ以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含む
を含み；そして
（ｂ）前記変異体が、キモシン活性を有し；そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとのアライメントにより決定され、すなわち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおける対応するアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ii）前記親ペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号１の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し；そして
（iii）前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有し；そして
但し、前記単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではなく；そして
前記単離された変異体が、配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比と比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性を有する、
単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【請求項10】

前記親ポリペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性を有し；そして
前記単離されたウシキモシン変異体が、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して、１０個未満のアミノ酸の変更（例えば、置換）を含む、請求項９に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【請求項11】

前記変更が、少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含み、そして前記置換が、L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; N108D; D117N; F114Y; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; D156V; L163E; S212A; S222G; M223E; L224V; D325Q; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; L280I; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; G309D,W; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361 L; V367I;又はK379Pである、請求項９又は１０に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【請求項12】

前記変更が、少なくとも１つのアミノ酸位置での置換を含み、そして前記置換が、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項９～１０のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【請求項13】

単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、以下：
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１つ以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含む
を含み；そして
（ｂ）前記変異体が、キモシン活性を有し；そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとのアライメントにより決定され、すなわち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおける対応するアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ｉｉ）前記親ペプチドが、配列番号２（ラクダキモシン）のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号２の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し；そして
（ｉｉｉ）前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有し；そして
但し、前記単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択される特定の変異体ではなく；そして
前記単離された変異体が、配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのＣ／Ｐ比と比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性を有する
単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【請求項14】

前記変更が、少なくとも１つのアミノ酸位置での置換を含み、そして前記置換が、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H 134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項１３に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【請求項15】

食品又は飼料製品の製造方法であって、請求項８～１４の何れか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分に添加し、さらなる製造工程を実施して、前記食品又は飼料製品を得ることを含み、そして
ここで前記製品が、乳ベースの製品であり、そして前記方法が、請求項８～１４の何れか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、乳に添加し、そしてさらなる製造工程を実施して、乳ベースの製品を得ることを含み、そして
前記乳が、豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、水牛乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳、又は牛乳であり；そして
前記乳ベースの製品が、発酵乳製品、クオーク、又はチーズである、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、改善された凝乳特性を有するキモシンの変異体に関する。

【背景技術】

【0002】

凝乳酵素、例えば、キモシン及びペプシンによる乳の酵素的凝固は、チーズ製造における最も重要な工程の１つである。酵素的乳凝固は、次の二相工程である：タンパク質分解酵素、キモシン又はペプシンが、κ－カゼインを攻撃し、カゼインミセル構造の準安定状態をもたらす第１相、及び続いて、乳が凝固し、そして凝固物を形成する第２相。

【0003】

キモシン（ＥＣ３．４．２３．４）及び、ペプシン（ＥＣ３．４．２３．１）、すなわち哺乳類の胃の凝乳酵素は、広範囲の種類のペプチダーゼに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。

【0004】

胃粘膜細胞において生成される場合、キモシン及びペプシンは、それぞれ、酵素的に不活性なプレ－プロキモシン及びプレ－ペプシノーゲンとして生じる。キモシンが排泄される場合、Ｎ末端ペプチドフラグメント、すなわちプレ－フラグメント（シグナルペプチド）が切断され、プロ－フラグメントを含むキモシンが得られる。プロキモシンは、実質的に、酵素の不活性形であるが、しかしながら、プロ－フラグメントの自己触媒除去により、酸性条件下で、活性キモシンに活性化されるようになる。この活性化は、適切なｐＨ条件下で胃管腔においてインビボで、又は酸性条件下で、インビトロで発生する。

【0005】

ウシ、すなわちボス・タウラス（Bos taurus）プレ－プロキモシン、プロキモシン及びキモシンの構造及び機能特性は、広く研究されて来た。ウシプレ－プロキモシン分子のプレ－部分は、１６個のａａ残基を含み、そして対応するプロキモシンのプロ－部分は、４４個の長さのａａ残基を有する。３２３個のａａを含む活性ウシキモシンは、２種の形、すなわちＡ及びＢの混合物であり、それらの両者は、活性である。

【0006】

キモシンは、哺乳類、例えばウシ、ラクダ、ヤギ、水牛、ヒツジ、ブタ、ヒト、サル及びラットにおいて、天然において生成される。

【0007】

ウシキモシンは、長年、酪農業界に市販されて来た。

【0008】

国際公開第０２／３６７５２Ａ２号（Chr. hansen）は、ラクダキモシンの組換え生成を記載している。

【0009】

国際公開第２０１３／１７４８４０Ａ１号（Chr. hansen）は、ウシ及びラクダキモシンの突然変異体／変異体を記載している。

【0010】

国際公開第２０１３／１６４４７９Ａ２号（ＤＳＭ）は、ウシキモシンの突然変異体を記載している。

【0011】

下記に列挙される引用文献は、キモシンの突然変異を記載する参考文献として本明細書において見られる：
－Suzuki et al : Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
－Suzuki et al : Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
－van den Brink et al : Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
－Pitts et al : Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
－M .G. Williams et al : Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
－Strop et al : Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val l l lphe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871 ;
－Supannee et al : Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
－Zhang et al : Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286。

【0012】

上記に言及される先行技術文献の何れも、下記本明細書に記載され／請求されるキモシン突然変異体／変異体の何れも、直接的且つ明確に記載していない。

【発明の概要】

【0013】

本発明により解決されるべき課題は、改善された凝乳性質を有するキモシンの変異体を提供することである。

【0014】

本明細書における実施例において論じられるように－本発明者は、多くの改善されたラクダ（本明細書における実施例６を参照のこと）及びウシ／ラクダ（本明細書における実施例７を参照のこと）キモシン変異体を同定した。

【0015】

ラクダ及びウシ変異体の比較分析に基づいて－本発明者は、それらの位置の１又は２以上の位置で変異体を製造することにより、改善されたキモシン変異体を得ることができることで、本明細書において重要である多くの追加アミノ酸位置を同定した。

【0016】

当該技術分野において知られているように－異なった哺乳類種（例えば、ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ又はラット）から得られる異なった天然の野生型キモシンポリペプチド配列は、比較的高い配列類似性／同一性を有する。本明細書における図１において、これは、本明細書における関連する異なった配列の整列により例示されている。

【0017】

この比較的近い配列関係の観点から－異なった天然の野生型キモシンの３Ｄ構造がまた、比較的類似すると思われる。

【0018】

本発明においては－天然に得られる野生型キモシン（例えば、ウシキモシン又はラクダキモシン）は、本明細書において、親ポリペプチド、すなわち本発明の変異体キモシンポリペプチドを生成するために、変更が行われる親ポリペプチドの例であり得る。

【0019】

理論的に制限されるものではないが－本明細書において論じられるキモシン関連アミノ酸配置は、何れかの本明細書における目的の関連キモシン酵素（例えば、ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ラットなどのキモシン）において、すなわち、それらの位置の１又は２以上の位置で変異体を製造することにより、一般的に、改善されたキモシン変異体（例えば、改善されたウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ又はラットキモシン変異体）を得ることができることにおいて、一般的に重要であると思われる。

【0020】

本明細書において論じられるように－目的（例えば、ラクダ、ヒツジ、ウシ、等）の親キモシンポリペプチドのアミノ酸位置を決定するための参照配列として、公知のウシキモシンＢ前プロキモシン配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ００７９４－本明細書において配列番組１として論じられる）が、本明細書において使用される。

【0021】

配列番号１のウシキモシンＢプレプロキモシンは、ウシ（Bos bovis）キモシンＢ又は単に、ウシキモシンと、本明細書において、呼ばれる。その配列はまた、本明細書の図１に示されている。

【0022】

本明細書における別の関連キモシン配列は、公知の配列番号２のヒトコブラクダ（Camelius dromedarius）キモシン配列である。それは、他方では、ラクダキモシンと呼ばれる。その配列はまた、本明細書の図１に示される。

【0023】

本明細書においては、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有する親キモシンポリペプチド（例えば、ヒツジ又はラット由来の）は、本明細書に記載されるようなアミノ酸位置の何れかで変異体を製造することにより改善されるよう、例えば、ウシ又はラクダキモシンに関連する十分な構造体として、本明細書において見られると思われる。

【0024】

従って、本発明の第１の態様は、単離されたキモシンポリペプチド変異体の製造方法に関し、ここで前記方法は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置で変更を行う工程、ここで前記変更が、下記位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281 ; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含んでおり；及び
（ｂ）工程（ａ）の変更されたポリペプチドを生成し、そして単離し、そしてそれにより、単離されたキモシンポリペプチドを得る工程を含んで成り、ここで前記変異体はキモシン活性を有し；そして
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ii）前記親ペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有し；
そして但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択される特定の変異体ではない。

【0025】

上記「但し」とは、この文書において、それらの特定の変異体が明白に記載されているので、上記で論じられた国際公開第２０１３／１７４８４０Ａ１号（Chr．Hansen）に関連するものとして見られ得る。本明細書において当業者により理解されるように、「但し」とは、単に、特定の言及された変異体に関する。例えば、Ｑ２４６Ｅ置換（すなわち、Ｇ３０９Ｄ、Ｓ３２９Ｐ及び／又はＤ３３７Ｅではない）を含む変異体のみは、「但し」内のそのような特定の変異体ではなく、すなわちそれは本明細書において否認されていない。

【0026】

当該技術分野において知られているように、当業者は、彼らの共通する一般的な知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体を、日常的に生成し、そして精製することができる。他の言葉で言えば、当業者は、目的（例えば、ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ又はラット由来の）のキモシン活性を有する、本明細書における関連する親ポリペプチドを有すると、当業者は、目的のそのような親キモシンの変異体を製造することは日常的な作業である。

【0027】

本発明の第２の態様は、第１の態様の方法、又は何れかの本明細書において関連するその実施態様により得られる、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。

【0028】

上記第２の態様に関連しての用語「得られる（obtained）」とは、単離されたキモシンポリペプチド変異体が、第１の態様の方法又は何れかの本明細書において関連するその実施態様により得られたとして理解されるべきである。従って、第２の態様に関連しての用語「得られる」とは、得ることができるとしては理解されるべきではない。

【0029】

本明細書において論じられるように－本明細書における実施例においては、親ポリペプチドとして配列番号１（ウシ）のポリペプチドを用いて、変異体を製造し－そのような変異体は、本明細書において、ウシキモシン変異体と呼ばれ得る。

【0030】

従って、本発明の第３の態様は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで、前記変異体は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り；そして
（ｂ）前記変異体がキモシン活性を有し；
そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ｉｉ）前記親ペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し；そして
（iii）前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有し；そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。

【0031】

本明細書において論じられるように－本明細書における実施例においては、親ポリペプチドとして配列番号２（ラクダキモシン）のポリペプチドを用いて、変異体を製造し－そのような変異体は、本明細書において、ラクダキモシン変異体と呼ばれ得る。

【0032】

従って、本明細書の第４の態様は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変異体は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り；そして
（ｂ）前記変異体がキモシン活性を有し；
そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応アルアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ii）前記親ペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し；そして
（iii）前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有し；そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。

【0033】

本明細書に記載されるような単離されたキモシンポリペプチド変異体は、例えば目的の食品又は飼料製品（例えば、チーズ製品であり得る、目的の乳ベースの製品）を製造するために、技術に従って使用され得る。

【0034】

従って、本発明の第５の態様は、食品又は飼料製品の製造方法に関し、ここで前記方法は、有効量の本明細書に記載されるような単離されたキモシンポリペプチド変異体を、食品又は飼料成分に添加し、そして食品又は飼料製品を得るために、本発明のさらなる製造工程を実施することを含んで成る。

【0035】

本発明の実施態様が、例のみにより、下記に記載される。

【0036】

定義：
本明細書における関連する用語のすべての定義は、本明細書における関連する技術的内容に関連して、当業者により理解されるであろうことに従う。

【0037】

用語「キモシン（chymosin）」とは、ＥＣ３．４．２３．４クラスの酵素に関する。キモシンは、高い特異性を有し、そしてそれは、カゼインのκ－鎖における単一の１０５－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－|－Ｍｅｔ－Ａｌａ－１０８結合の切断により、乳を凝固する。当該技術分野において使用される他の名称は、レンニンである。

【0038】

用語「キモシン活性（chymosin activity）」とは、当業者により理解されるようなキモシン酵素のキモシン活性に関する。当業者は、本明細書における関連するキモシン活性をいかにして決定するか知っている。本明細書における実施例４において、特定のキモシン活性（他方では、凝固活性又は凝乳活性と呼ばれる）を決定する標準方法の例が提供される。本明細書における実施例５において、タンパク質分解活性を決定する標準方法の例が提供される。当該技術分野において知られているように－本明細書において関連する、いわゆるＣ／Ｐ比は、タンパク質分解活性（Ｐ）により、特定の凝固活性（Ｃ）を割ることにより決定される。当業界において知られているように－より高いＣ／Ｐ比は、非特異的タンパク質分解により、チーズ製造の間、タンパク質の損失が低められ、すなわちチーズの収量が改善され、そして製造の間、チーズへの苦い味の進行が低められることを一般的に意味する。

【0039】

用語「単離された変異体（isolated variant）」とは、人工的に変更された変異体を意味する。１つの態様によれば、変異体は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより測定される場合、少なくとも１％純粋、例えば、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、及び少なくとも９０％純粋である。

【0040】

用語「成熟ポリペプチド（mature polypeptide）」とは、翻訳及び何れかの後翻訳修飾、例えば、Ｎ末端プロセッシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化、等に続く、その最終形でのペプチドを意味する。本明細書においては、本明細書における関連する成熟キモシンポリペプチドは、活性キモシンポリペプチド配列として、すなわち、プレ－部分及び／又はプロ－部分配列を有さない配列として見られ得る。成熟ポリペプチドの本明細書における関連する例は、例えば、配列番号１のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号１（ウキキモシン）の成熟ポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドである。

【0041】

用語「親（parent）」又は「キモシン活性を有する親ポリペプチド（parent polypeptide having chymosin activity）」とは、変更が、本発明の酵素変異体を生成するために行われるポリペプチドを意味する。親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。

【0042】

用語「配列同一性（Sequence Identity）」とは、２つのアミノ酸配列間、又は２つのヌクレオチド配列間の関連性に関する。本発明のためには、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS : The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al._r 2000, Trends Genet. 16 : 276-277）のNeedleプログラムに実装されるようなNeedleman-Wunchアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48 : 443-453）、好ましくはバージョン3.0.0又はそれ以降のバージョンを用いて決定される。使用される任意のパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティー、０．５のギャップ伸長ペナルティー、及びEBLOSUM62 (BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。Needle標識「最長同一性」（－nobrief オプションを用いて得られた）の出力が、％同一性として使用され、そして次の通りに計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）

【0043】

本発明のためには、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS : The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al._r 2000, 上記）のNeedleプログラムに実装されるようなNeedleman-Wunchアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, 上記）、好ましくはバージョン3.0.0又はそれ以降のバージョンを用いて決定される。使用される任意のパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティー、０．５のギャップ伸長ペナルティー、及びEBLOSUM62 (NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。Needle標識「最長同一性」（－nobrief オプションを用いて得られた）の出力が、％同一性として使用され、そして次の通りに計算される：
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。

【0044】

用語「変異体（variant）」とは、１又は２以上の（いくつかの）位置で、変更、すなわち置換、挿入及び／又は欠失を含む、キモシン活性を有するペプチドを意味する。置換は、異なったアミノ酸による、１つの位置を支配するアミノ酸の置換を意味し；欠失は、１つの位置を支配するアミノ酸の除去を意味し；そして挿入は、１つの位置を支配するアミノ酸に、隣接する１－３個のアミノ酸の付加を意味する。アミノ酸は、天然又は非天然のアミノ酸であり得、例えば、Ｄ－アラニンの、特にＤ－異性体（又はＤ形）による置換が理論的に可能である。

【0045】

用語「野生型（wild-type）」キモシンペプチドとは、天然に存在する生物、例えば、天然において見出される哺乳類（例えば、ラクダ又はウシ）により発現されるキモシンを意味する。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】図１は、本明細書に関連する異なったキモシン配列のアラインメントを示す。示される「Bos_bovis_chymosin_B」は本明細書における配列番号１のウシキモシンであり、そして示される「Camelus_dromedarius」は、本明細書における配列番号２のラクダキモシンである。本明細書に記載されるような参照配列としての配列番号１のウシキモシンを用いれば、ウシキモシンは位置１０で「Ｖ」を有し、そしてラクダキモシンは、同じ位置１０で「Ａ」を有することが見られ得る。Bovine/ratは位置３５２で［Ｑ］を有し、そしてラクダ／フタコブラクダ（Camel/C._bactrianus）は同じ位置３５２で「Ｅ」を有する。図１に示されるキモシン配列に関連して－ヒツジはウシ配列番号１と９４．５％の配列同一性を有し；フタコブラクダ（Ｃ．－bactrianus）は、ウシ配列番号１と８３．２％の配列同一性を有し；ヒトコブラクダ（Camelus-dromedarius）（配列番号２のラクダキモシン）は、ウシ配列番号１と８４％の配列同一性を有し；ブタはウシ配列番号１と８０．３％の配列同一性を有し、そしてラットはウシ配列番号１と７１．９％の配列同一性を有する。本明細書において当業者により理解されるように、配列番号１（ウシキモシン、すなわち、配列番号１のアミノ酸位置５９～３８１）の成熟ポリペプチドとの、例えば、ヒツジ、フタコブラクダ（Ｃ._bactrianus）、ラクダ、ブタ又はラットキモシンの成熟ポリペプチド配列の本明細書に関連する％配列同一性は、上述の％配列同一性に比較的類似する。

【図2】図２は、ウシキモシンの３Ｄ構造を示し－この３Ｄ構造は公的に入手できる。アミノ酸位置２９６及び２９４がウシキモシンに存在する場所が例として示されている。

【図3】図３は、多くのキモシン変異体のＲＥＭＣＡＴ及びタンパク質分解値のグラフ表示を示す。

【図4】図４は、個々の置換の効果のＰＣＡプロットを示す。すべての位置番号は、テキストに使用される番号よりも１５少ない。

【発明を実施するための形態】

【0047】

目的のキモシンのアミノ酸位置の決定
上記で論じられたように－目的（例えば、ラクダ、ヒツジ、ウシ、等）の本明細書における関連するキモシンポリペプチドのアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書において配列番号１として開示される公知のウシキモシン配列が本明細書において使用される。

【0048】

本発明のために、配列番号１（ウシキモシン）で開示されるポリペプチドを用いて、別のキモシンポリペプチドにおける、その対応するアミノ酸残基を決定する。別のキモシンポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１で開示されるポリペプチドと整列され、そしてそのアラインメントに基づいて、配列番号１で開示されるポリペプチドにおける任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、本明細書の実施例に記載されるようなClustalWアルゴニズムを用いて決定される。

【0049】

別のキモシンポリペプチドにおける、その対応するアミノ酸残基の同定は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS : The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al._r 2000, Trends Genet. 16 : 276-277）のNeedleプログラムに実装されるようなNeedleman-Wunchアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48 : 443-453）、好ましくはバージョン3.0.0又はそれ以降のバージョンを用いることにより、確認され得る。

【0050】

上記の良く知られているコンピュータープログラムに基づいて－目的（例えば、ラクダ、ヒツジ、ウシ、等）の本明細書に関連するキモシンポリペプチドのアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常の作業である。

【0051】

本明細書における図１に、アラインメントの例が示されている。ほんの一例を挙げると－図１において、本明細書に使用されるウシ参照配列番号１が、位置５０で「Ｇ」を有し、そして「Camelus_dromedarius」（本明細書における配列番号２）が、位置５０で「Ａ」を有することが見られ得る。

【0052】

変異体の命名法
本発明の変異体の記載においては、下記命名法が、参照を容易にするために適合される。許容されるＩＵＰＡＣ一文字又は三文字アミノ酸略語が使用される。この下記「命名法」セクションにおいて論じられる特定の変異体は、本発明の関連する変異体ではなく、すなわち、この「命名法」セクションは、本明細書において関連する使用される命名法を説明しているに過ぎない。

【0053】

置換
アミノ酸置換のために、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、置換されるアミノ酸。従って、位置２２６でのアラニンによるスレオニンの理論的置換は、「Ｔｈｒ226 Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」として指定される。複数の突然変異は、追加の印「＋」により分離され、例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４４１Ｆ」は、それぞれ、位置２０５及び４１１でのアルギニン（Ｒ）によるグリシン（Ｇ）の、及びフェニルアラニン（Ｆ）によるセリン（Ｓ）の置換を表す。置換、例えば、指定される「２２６Ａ」は、位置２２６でのアラニンによる親アミノ酸（例えば、Ｔ、Ｑ、Ｓ又は別の親アミノ酸）の置換を意味する。

【0054】

欠失
アミノ酸欠失に関しては、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、置換、^*。従って、位置１９５でのグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５^*」又は「Ｇ１９５^*」として指定される。複数の欠失は、追加の印「＋」により分離され、例えば「Ｇｌｙ１９５^*＋Ｓｅｒ４４１^*」又は「Ｇ１９５^*＋Ｓ４１１^*」が示される。

【0055】

挿入
アミノ酸挿入に関しては、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されるアミノ酸。従って、位置１９５でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」として指定される。複数のアミノ酸の挿入は次のように指定される「元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されるアミノ酸＃１、挿入されるアミノ酸＃２、等」。例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」として示される。そのような場合、挿入されるアミノ酸残基は、挿入されるアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字の付加により番号付けされる。従って、上記においては、配列は次の通りである：

【0056】

【表1】

【0057】

複数の変更
複数の変更を含む変異体は、追加の印「＋」により分離され、例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、位置１７０及び１９５でのアルギニン及びグリシンによるチロシン及びグルタミン酸の置換を表す。

【0058】

異なった置換
異なった置換が、１つの位置で挿入され得る場合、その異なった置換は、コンマにより分離され、例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ，Ｅ」とは、位置１７０でのチロシン又はグルタミン酸によるアルギニンの置換を表す。従って、「Ｔｙｒｌ６７Ｇｌｙ，Ａｌａ ＋ Ａｒｇｌ７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」又は「ｙ１６７Ｇ，Ａ ＋ Ｒ１７０Ｇ，Ａ」は、次の変異体を指定する：「Ｔｙｒｌ６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇｌ７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒｌ６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇｌ７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒｌ６７Ａｌａ＋Ａｒｇｌ７０Ｇｌｙ」及び「Ｔｙｒｌ６７Ａｌａ＋Ａｒｇｌ７０Ａｌａ」。

【0059】

単離されたキモシンポリペプチド変異体の製造方法
上記で論じられたように－当業界おいて知られているように、当業者は、彼らの共通する一般的知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体を、日常的に生成し、そして精製することができる。

【0060】

他の言葉で言えば、当業者が目的（例えば、ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ又はラット由来の）のキモシン活性を有する、本明細書における関連する親ポリペプチドを有すると、当業者がそのような目的の親キモシンの変異体を製造することは日常の作業である。

【0061】

キモシン（変異体又は親）を生成し、そして単離する適切な方法の例は、例えば、国際公開第０２／３６７５２Ａ２号（Chr．Hansen）に記載されるような、良く知られている菌類組換え発現／生成に基づく技法によってであり得る。

【0062】

当業者が、キモシン活性を有する親ポリペプチドにおける１又は２以上の位置で変更を行うことはまた、日常的作業であり、ここで前記変更は、少なくとも１つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含む。

【0063】

当業者に知られているように－これは、例えば、いわゆる部位特異的突然変異誘発、及び組換え発現／生成に基づく技法により行われ得る。

【0064】

当業者が、本明細書における関連親ポリペプチド（例えば、ラクダ又はウシ野生型キモシン）及び／又は本明細書における関連変異体がキモシン活性を有するか、否かを決定することはまた、日常的作業である。

【0065】

当業界において知られているように－キモシン活性は、いわゆるＣ／Ｐ比に決定され得、この比はタンパク質分解活性（Ｐ）により特定の凝固活性（Ｃ）を割ることにより決定される。

【0066】

当業界において知られているように－より高いＣ／Ｐ比は、非特異的タンパク質のために、例えばチーズ製造の間、タンパク質の損失が低められ、すなわち、チーズの収量が改善され、そして製造の間、チーズにおける苦味の進行が低められることを一般的に暗示する。

【0067】

本明細書における実施例４において、特異的凝固活性（Ｃ）を決定するための適切な方法が記載されており、そして本明細書における実施例５においては、タンパク質分解活性（Ｐ）を決定するための適切な方法が記載されている。

【0068】

好ましくは、本明細書に記載されるような、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書における配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性を有する変異体である。

【0069】

好ましくは、本明細書に記載されるような、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書における配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性を有する変異体である。

【0070】

より好ましくは、本明細書に記載されるような、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、
－本明細書における配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性；及び
－本明細書における配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性、を有する変異体である。

【0071】

上記で論じられたように－目的（例えば、ラクダ、ヒツジ、ウシ、等）の本明細書における関連キモシンポリペプチドのアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書において配列番号１として開示される公知のウシキモシン配列が、本明細書において使用される。

【0072】

上記で論じられたように－本明細書において論じられたコンピューター配列アラインメントプログラムに基づいて、目的（例えば、ラクダ、ヒツジ、ウシ、等）の本明細書における関連キモシンポリペプチドの本明細書におけるアミノ酸位置を決定することは、当業者の日常的作業である。

【0073】

本明細書における第１の態様の方法の用語「親ポリペプチドが配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有する」とは、本明細書における関連するその変異体を製造するために使用される親キモシンポリペプチドの配列に基づく制限に関連するものとして見られ得る。

【0074】

他の言葉で言えば－成熟ウシキモシンと少なくとも６５％の配列同一性を有する成熟親キモシンポリペプチド（例えば、ヒツジ又はブタ）は、本明細書において関連するためには、例えば、ウシ又はラクダキモシンに対して十分な構造的に同一であると思われ－すなわち、本明細書においては、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有する成熟親キモシンポリペプチド（例えば、ヒツジ又はラット由来の）は、本明細書に記載されるようなアミノ酸位置の何れかで変異体を製造することにより改善されるよう、例えば、ウシ又はラクダキモシンに関連する十分な構造体として、本明細書において見られると思われる。

【0075】

配列番号２のラクダキモシンポリペプチドは、配列番号１（すなわち、プレ及びプロ配列を含む、位置１～３８１の完全配列番号１）のウシポリペプチドと８４％の配列同一性を有する。

【0076】

当業者により理解されるように－キモシン活性を有する、本明細書における関連親ポリペプチドは、すでに、例えば対応する野生型キモシンの変異体であり得る。

【0077】

例えば、配列番号２の野生型ラクダキモシンポリペプチドに比較して、例えば、５～１０の変更（例えば、置換）を有するラクダキモシン変異体は、例えば、本明細書における第１の態様において必要とされるような、配列番号１（ウシ）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。

【0078】

他の言葉で言うと、本明細書における関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、例えば、本明細書における第１の態様の位置よりも他の位置で変更（例えば、置換）を含むことができる。

【0079】

本明細書における図１に示されるキモシン配列に関して－ヒツジはウシ配列番号１と９４．５％の配列同一性を有し；フタコブラクダ（C._bactrianus）はウシ配列番号１と８３．２％の配列同一性を有し；ブタはウシ配列番号１と８０．３％の配列同一性を有し；そしてラットはウシ配列番号と７１．９％の配列同一性を有する。

【0080】

当業者により理解されるように－配列番号１（ウシキモシン、すなわち、配列番号１のアミノ酸位置５９－３８１）の成熟ポリペプチドとの、例えば、成熟ヒツジ、フタコブラクダ（C._bactrianus）、ラクダ、ブタ又はラットキモシンの本明細書における関連する％配列同一性は、上記に言及された％配列同一性に比較的類似する。

【0081】

好ましい変異体：
上記で論じられたように－例えば、前記第１の態様は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変更は、下記位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置で、置換、欠失又は挿入を包含する。

【0082】

好ましい実施態様は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変更は、例えば本明細書における第１の態様の位置の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含む。

【0083】

少なくとも１つの変更が置換であることが好ましく－すなわち、本明細書における関連する好ましい実施態様は、単離されたポリペプチド変異体に関し、ここで前記変更は、例えば本明細書における第１の態様の位置の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置で置換を含んでいる。

【0084】

好ましくは、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変更は、下記位置の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置で置換を含んでいる：L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361 L; V367I;又はK379P。

【0085】

好ましくは、前記置換は、Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F又はK336D,E,S,T,N,Qであり、そして好ましくは、K336置換はK336Qである。

【0086】

本明細書において当業者により理解されるように－親キモシンポリペプチド位置１５６で、例えば、「Ｖ」をすでに有する場合、この特定の親キモシンポリペプチドについての置換１５６Ｖの製造について話す意味はない。本明細書における図１に見られ得るように－ラット野生型キモシンは、位置１５６で「Ｖ」を有し－前記置換１５６Ｖは、図１の特定のラットキモシンポリペプチド配列について、本明細書において無関係なものとして見られ得る。

【0087】

本明細書において当業者により理解されるように－親キモシンポリペプチドが位置１５６で、例えば、「Ｄ」を有さない場合、この特定の親キモシンポリペプチドについての置換Ｄ１５６Ｖの製造について話す意味はない。本明細書における図１に見られ得るように－ラット野生型キモシンは位置１５６で「Ｖ」を有し－従って、前記置換Ｄ１５６Ｖは、図１の特定のラットキモシンポリペプチド配列について、本明細書において無関係なものとして見られ得る。

【0088】

好ましい実施態様によれば、置換は、下記の通りである：
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H 134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D 156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H 134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261A。

【0089】

より好ましい実施態様によれば、置換は、下記の通りである：
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 又は
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q。

【0090】

キモシン活性を有する好ましい親ポリペプチド：
好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有する。

【0091】

ほんの一列を挙げると－本明細書における適切な関連親ポリペプチドは、例えば、ウシキモシンＡであり得－当業界において知られているように、ウシキモシンは、本明細書における配列番号１のウシキモシンＢに比較して、１つのアミノ酸差異のみを有することができる。

【0092】

上記で論じられたように－本明細書における実施例において、親ポリペプチドとして配列番号１（ウシ）のポリペプチドを用いて、変異体を製造し－そのような変異体は、本明細書において、ウシキモシン変異体と呼ばれ得る。

【0093】

従って、好ましい実施態様によれば、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、そしてさらにより好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９７％の配列同一性を有する。好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドである。

【0094】

本明細書において当業者により理解されるように－キモシン活性を有する、本明細書の関連親ポリペプチドはすでに、例えば、対応する野生型キモシンの変異体であり得る。

【0095】

例えば、配列番号１の野生型成熟ウシキモシンポリペプチドに比較して、例えば５～１０の変更（例えば、置換）を有するウシキモシン変異体は、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。

【0096】

配列番号１（ウシ）の成熟ポリペプチドは、３２３個のアミノ酸の長さであり、従って、配列番号１の野生型成熟ウシキモシンポリペプチドに比較して、例えば２５個のアミノ酸の置換を有するウシキモシン変異体は、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一性を有する親ポリペプチドではないであろう。

【0097】

他の言葉で言うと及び一般的には－本明細書の関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、例えば、本明細書における第１の態様の位置以外の位置で変更（例えば、置換）を含むことができる。

【0098】

上記で論じられたように－本明細書における実施例において、親ポリペプチドとして配列番号２（ラクダ）のポリペプチドを用いて、変異体を製造し－そのような変異体は、本明細書において、ウシキモシン変異体と呼ばれ得る。

【0099】

従って、好ましい実施態様によれば、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、そしてさらにより好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９７％の配列同一性を有する。好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドである。

【0100】

本明細書において当業者により理解されるように－配列番号２（ラクダ）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９０％の配列同一性を有する親ポリペプチドは、本明細書における第１の態様の（ii）の配列同一性の要件に基づいて、配列番号１（ウシ）内にまだ存在し－すなわち、それは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも６５％の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。

【0101】

ウシキモシンの単離された変異体：
上記で論じられたように－本明細書における実施例において、親ポリペプチドとして配列番号１（ウシ）のポリペプチドを用いて、変異体を製造し－そのような変異体は、本明細書において、ウシキモシン変異体と呼ばれ得る。

【0102】

上記で論じられたように－従って、第３の態様は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変異体は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り；そして
（ｂ）前記変異体がキモシン活性を有し；
そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ii）前記親ペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し；そして
（iii）前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有し；そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。

【0103】

上記定義及び好ましい実施態様はまた、この態様に関連している。

【0104】

好ましくは、本明細書に記載されるような、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書における配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性を有する変異体である。

【0105】

好ましい実施態様によれば、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９２％の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、そしてさらにより好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９７％の配列同一性を有する。好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドである。

【0106】

本明細書において当業界により理解されるように－単離されたキモシン変異体は、上記で与えられる以外の他のアミノ酸位置における変更（例えば、置換）を含むことができる。

【0107】

例えば、配列番号１の野生型成熟ウシキモシンポリペプチドに比較して、例えば５～１０の変更（例えば、置換）を有するウシキモシン変異体は、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。

【0108】

単離されたウシキモシン変異体は、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、３０個未満のアミノ酸変更（例えば、置換）を含むことが好ましく、又は単離されたウシキモシン変異体は、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、２０個未満のアミノ酸変更（例えば、置換）を含むことが好ましく、又は単離されたウシキモシン変異体は、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、１０個未満のアミノ酸変更（例えば、置換）を含むことが好ましく、又は単離されたウシキモシン変異体は、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、５個未満のアミノ酸変更（例えば、置換）を含むことが好ましい。

【0109】

本明細書において当業者により理解されるように－上記（iii）の用語、「単離された変異体ポリペプチドは配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、１００％未満の配列同一性を有する」とは、もちろん、本明細書に記載される単離されたウシキモシン変異体が、配列番号１の公知の野生型ウシキモシン配列に対して１００％同一であるポリペプチド配列を有さないであろうことを意味する。

【0110】

好ましい実施態様は、単離されたウシキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変更は、第３の態様の位置の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸配列での置換、欠失又は挿入を含む。

【0111】

少なくとも１つの変更が置換であることが好ましく－すなわち、本明細書に関連する好ましい実施態様は単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変更は、第３の態様の位置の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置での置換を含む。

【0112】

好ましくは、置換は、L70M ; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361L; V367I;又はK379Pである。

【0113】

好ましくは、置換は、Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F 又は K336D,E,S,T,N,Q,であり、ここで好ましいK336置換はK336Qである。

【0114】

好ましい実施態様によれば、置換は、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H 134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D 156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H 134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである。

【0115】

より好ましい実施態様によれば、置換は、
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 又は
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Qである。

【0116】

ラクダキモシンの単離された変異体：
上記で論じられたように－本明細書における実施例において、親ポリペプチドとして配列番号２（ラクダ）のポリペプチドを用いて、変異体を製造し－そのような変異体は、本明細書において、ラクダキモシン変異体と呼ばれ得る。

【0117】

上記で論じられたように－従って、第４の態様は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変異体は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り；そして
（ｂ）前記変異体がキモシン活性を有し；
そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ii）前記親ペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し；そして
（iii）前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有し；そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。

【0118】

上記定義及び好ましい実施態様はまた、この態様に関連している。

【0119】

好ましくは、本明細書に記載されるような、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書における配列番号２の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性を有する変異体である。

【0120】

好ましい実施態様によれば、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９２％の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、そしてさらにより好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９７％の配列同一性を有する。好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドである。

【0121】

本明細書において当該技術分野により理解されるように－単離されたキモシン変異体は、上記で与えられる以外の他のアミノ酸位置における変更（例えば、置換）を含むことができる。

【0122】

例えば、配列番号２の野生型成熟ウシキモシンポリペプチドに比較して、例えば５～１０の変更（例えば、置換）を有するウシキモシン変異体は、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。

【0123】

単離されたラクダキモシン変異体は、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、３０個未満のアミノ酸変更（例えば、置換）を含むことが好ましく、又は単離されたラクダキモシン変異体は、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、２０個未満のアミノ酸変更（例えば、置換）を含むことが好ましく、又は単離されたラクダキモシン変異体は、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、１０個未満のアミノ酸変更（例えば、置換）を含むことが好ましく、又は単離されたラクダキモシン変異体は、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、５個未満のアミノ酸変更（例えば、置換）を含むことが好ましい。

【0124】

本明細書において当業者により理解されるように－上記（iii）の用語、「単離された変異体ポリペプチドは配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと、１００％未満の配列同一性を有する」とは、もちろん、本明細書に記載される単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号２の公知の野生型ラクダキモシン配列に対して１００％同一であるポリペプチド配列を有さないであろうことを意味する。

【0125】

好ましい実施態様は、単離されたウシキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変更は、第４の態様の位置の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸配列での置換、欠失又は挿入を含む。

【0126】

少なくとも１つの変更が置換であることが好ましく－すなわち、本明細書に関連する好ましい実施態様は単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変更は、第４の態様の位置の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置での置換を含む。

【0127】

好ましくは、置換は、L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361L; V367I;又はK379Pである。

【0128】

好ましくは、置換は、Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F 又はK336D,E,S,T,N,Q,であり、ここで好ましいK336置換はK336Qである。

【0129】

好ましい実施態様によれば、置換は、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである。

【0130】

より好ましい実施態様によれば、置換は、
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;又は
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Qである。

【0131】

乳ベースの製品の製造方法：
上記で論じられたように－本明細書に記載されるような、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、例えば、目的の乳ベースの製品（例えば、チーズ製品）を製造するために、技術に従って使用され得る。

【0132】

上記で論じられたように－本発明の態様は、食品又は飼料製品の製造方法に関し、ここで有効量の本明細書に記載されるような単離されたキモシンポリペプチド変異体を、食品又は飼料成分に添加し、そして食品又は飼料製品を得るために、本発明のさらなる製造工程を実施することを含んで成る。

【0133】

好ましくは、前記食品又は飼料製品は、乳ベースの製品であり、そして前記方法が、有効量の本明細書に記載されるような単離されたキモシンポリペプチド変異体を、乳に添加し、そして乳ベースの製品を得るために、本発明のさらなる製造工程を実施することを含んで成る。

【0134】

前記乳が、例えば豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、水牛乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳又は牛乳である。

【0135】

前記乳ベースの製品が発酵乳製品、クオーク又はチーズである。

【0136】

本明細書における態様／実施態様－クレーム形式での提供
本明細書に記載される本発明の態様及び好ましい実施態様は、いわゆるクレーム形式で提供され／記載され得－これは以下に行われる。

【0137】

１．単離されたキモシンポリペプチド変異体の製造方法であって、前記方法は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置で変更を行う工程、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281 ; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでおり；及び
（ｂ）工程（ａ）の変更されたポリペプチドを生成し、そして単離し、そしてそれにより、単離されたキモシンポリペプチドを得る工程を含んで成り、ここで前記変異体はキモシン活性を有し；そして
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ii）前記親ペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有し；
そして但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。

【0138】

２．前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、
－配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性；及び
－配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性を有する、請求項１に記載の方法。

【0139】

３．前記変更が、請求項１に記載の位置の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置に、置換、欠失又は挿入を包含する、請求項１又は２に記載の方法。

【0140】

４．前記変更が、請求項１に記載の位置の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を包含する、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。

【0141】

５．前記置換が、L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I 103V; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361L; V367I;又はK379Pである、請求項４に記載の方法。

【0142】

６．前記置換が、Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q又はK336Qである、請求項５に記載の方法。

【0143】

７．前記置換がK336Qである、請求項６に記載の方法。

【0144】

８．前記置換が、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D 156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H 134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項４に載の方法。

【0145】

９．前記置換が、
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 又は
N 158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Qである、請求項４に載の方法。

【0146】

１０．前記親ポリペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【0147】

１１．前記親ポリペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【0148】

１２．前記親ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９～３８１である、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【0149】

１３．請求項１～１２の何れか１項に記載の方法により得られる、単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0150】

１４．単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、前記変異体が、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281 ; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W;G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り；そして
（ｂ）前記変異体がキモシン活性を有し；
そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ii）前記親ペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し；そして
（iii）前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有し；そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。

【0151】

１５．前記単離された変異体が、配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性を有する、請求項１４に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0152】

１６．前記親ポリペプチドが、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性を有する、請求項１４又は１５に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0153】

１７．前記単離されたウシキモシン変異体が、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、１０個未満のアミノ酸の変更（例えば、置換）を含む、請求項１４～１６の何れか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0154】

１８．前記変更が、請求項１４に記載の位置の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置に置換、欠失又は挿入を含む、請求項１４～１７の何れか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0155】

１９．前記変更が、請求項１４に記載の位置の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含む、請求項１６～１８の何れか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0156】

２０．前記置換が、L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; K120Q; F124Y; H 134Q; I154L; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361L; V367I;又はK379Pである、請求項１９項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0157】

２１．前記置換が、Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F又はK336D,E,S,T,N,Qである、請求項２０に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0158】

２２．前記置換が、K336Qである、請求項２１に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0159】

２３．前記置換が、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H 134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項１９に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0160】

２４．前記置換が、
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 又は
N 158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q、である、請求項１９に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0161】

２５．単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、前記変異体が、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置の何れかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでおり：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281 ; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W;G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361 ; 367及び 379、を含んで成り；そして
（ｂ）前記変異体がキモシン活性を有し；
そして、
（ｉ）前記ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１（ウシキモシン）のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応アルアミノ酸配列を決定するために使用され；そして
（ii）前記親ペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し；そして
（iii）前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有し；そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記：
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。

【0162】

２６．前記単離された変異体が、配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのＣ／Ｐ比に比較して、より高いＣ／Ｐ比を付与するキモシン活性を有する、請求項２５に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0163】

２７．前記親ポリペプチドが、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性を有する、請求項２５又は２６に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0164】

２８．前記単離されたウシキモシン変異体が、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドに比較して、１０個未満のアミノ酸の変更（例えば、置換）を含む、請求項２５又は２６に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0165】

２９．前記変更が、請求項２３に記載の位置の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置に置換、欠失又は挿入を含む、請求項２５～２８の何れか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0166】

３０．前記変更が、請求項２３に記載の位置の何れかに対応する、少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含む、請求項２５～２９の何れか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0167】

３１．前記置換が、L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I 103V; K120Q; F124Y; H 134Q; I154L; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361L; V367I;又はK379Pである、請求項３０項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0168】

３２．前記置換が、Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F 又はK336D,E,S,T,N,Qである、請求項３１に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0169】

３３．前記置換が、K336Qである、請求項３２に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0170】

３４．前記置換が、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D 156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N 158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項３０に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0171】

３５．前記置換が、
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;又は
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q、である、請求項３０に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。

【0172】

３６．食品又は飼料製品の製造方法であって、有効量の請求項１４～３５の何れか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を、食品又は飼料成分に添加し、そして食品又は飼料製品を得るために、本発明のさらなる製造工程を実施することを含んで成る、方法。

【0173】

３７．前記製品が乳ベースの製品であり、そして前記方法が、有効量の請求項１４～３６の何れか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を、乳に添加し、そして乳ベースの製品を得るために、本発明のさらなる製造工程を実施することを含んで成る、請求項３５に記載の方法。

【0174】

３８．前記乳が豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、水牛乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳又は牛乳である、請求項３７に記載の方法。

【0175】

３９．前記乳ベースの製品が発酵乳製品、クオーク又はチーズである、請求項３６～３８のいずれか１項記載の方法。

【実施例0176】

実施例１：キモシンタンパク質配列及び変異体配列のアラインメント及び番号付け
キモシンタンパク質配列を、ＥＢＩ（EBI, ツール, 多重配列アラインメント, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）により提供されるような、及びLarkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bio-informatics 23(21), 2947-2948に記載されるようなClustalWアルゴリズムを用いて、整列した。

【0177】

複数の配列アラインメントについてのClustalW2設定は、タンパク質重量マトリックス＝ ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン＝ １０、ギャップ伸長＝ ０．０５、ギャップ距離＝ ８、末端ギャップなし、ＩＴＥＲＡＴＩＯＮ ＝ なし、ＮＵＭＩＴＥＲ ＝ １、クラスタリング＝ ＮＪであった。

【0178】

参照配列として、ウシキモシンＢプレプロキモシンを使用し（Genbank受託番号Ｐ００７９４－配列番号１として本明細書において開示される）、ここでＮ－末端メチオニンが番号１（ＭＲＣＬ......）を有し、そしてＣ－末端イソロイシン（タンパク質配列においては.....ＬＡＫＡＩ）は、番号３８１に有する。変異体を、ウシＢプレ－プロ－キモシンに対して整列し、そして残基を、対応するウシキモシン残基に従って番号付けした。

【0179】

実施例２：キモシン変異体の設計
キモシン変異体を、異なった方法を用いて設計した。

【0180】

ラクダキモシンに言及される場合、本明細書における配列番号２のポリペプチドを含むラクダキモシンに言及される。配列番号２のラクダキモシンは、そのラクダキモシン変異体を製造するために使用されるキモシン活性を有する、本明細書における関連する親ポリペプチドとして見られ得る。

【0181】

ウシキモシンに言及される場合、本明細書における配列番号１のポリペプチドを含むウシキモシンに言及される。配列番号１のウシキモシンは、そのウシキモシン変異体を製造するために使用されるキモシン活性を有する、本明細書における関連する親ポリペプチドとして見られ得る。

【0182】

ラクダキモシンの変異体は、ウシキモシンＢに比較して、２５％又はそれ以上の同一性を有する、多くの組の公知アスパラギン酸プロテアーゼ配列のアラインメントに基づいて設計された。

【0183】

変動は一般的に、超可変領域に導入され、ところが保存された領域は変更されなかった。複数の変動が各変異体構築物（construct）に導入され、各単一の突然変異が複数の変異体構築物に存在することを確保する（結果の議論については、下記実施例６を参照のこと）。

【0184】

ウシキモシンの変異体を、ウシ及びラクダキモシンの比較に基づいて設計した。ウシ残基を、ラクダ対応物に変更した（結果の議論については、下記実施例７を参照のこと）。

【0185】

実施例３：キモシン変異体酵素材料の調製
すべてのキモシン変異体を、合成遺伝子として合成し、そしてｐＧＡＭｐＲ－Ｃに実質的に対応する菌類発現ベクター中にクローン化した（国際公開第０２／３６７５２Ａ２号に記載される）。

【0186】

ベクターを用いて、Ｅ．コリ（E．coli）を形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを、当業者に知られている標準の分子生物学プロトコルを用いて精製した。変異体プラスミドを用いて、それぞれ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）株を形質転換し、そしてタンパク質を、国際公開第０２／３６７５２Ａ２号に記載されるようにして、実質的に生成し、そして標準のクロマトグラフィー技法を用いて精製した。

【0187】

当該技術分野において知られているように－当業者は、彼らの共通する一般的な知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体、例えば本明細書に記載されるウシ及びラクダキモシン変異体を生成し、そして精製し得る。

【0188】

実施例４：特定のキモシン活性の決定
４．１ 凝固活性の決定
凝乳活性を、国際酪農連盟により開発された標準方法（ＩＤＦ方法）であるＲＥＭＣＡＴ方法を用いて決定した。凝乳活性を、０．５ｇ／Ｌの塩化カルシウム溶液（ｐＨ約６．５）と共に、低発熱性、低脂肪粉乳から調製された標準乳基質の可視凝集のために必要とされる時間から決定した。レンネットサンプルの凝集時間を、サンプルとしてのＩＤＦ標準１１０Ｂにより、既知の凝乳活性を有し、そして同じ酵素組成物を有する参照標準のその凝集時間と比較する。サンプル及び参照標準を同一の化学的及び物理的条件下で測定した。変異体サンプルを、８４ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて、約３ＩＭＣＵ／ｍｌに調節した。この後、２００μｌの酵素を、一定の攪拌下で３２℃±１℃の一定温度を維持できる、水浴に配置されるガラス試験管中の１０ｍｌの予備加熱された乳（３２℃）に添加した。

【0189】

レンネットの総凝乳活性（強度）を、下記式に従って、サンプルと同じ酵素組成物を有する標準に対して、ｍｌ当たりの国際凝乳ユニット（ＩＭＣＵ）で計算した：
ＩＭＣＵ／ｍｌでの強度＝（Ｓ_standard×Ｔ_standard×Ｄ_sample）／（Ｄ_standard×Ｔ_sample）
Ｓ_standard：レネットについての国際参照標準の凝乳活性。
Ｔ_standard：標準希釈について得られる秒での凝集時間。
Ｄ_sample：サンプルについての希釈率。
Ｄ_standard：標準についての希釈率。
Ｔ_sample：酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネットサンプルについて得られた秒での凝集時間。

【0190】

実施例９におけるラクダ変異体評価の凝固活性決定について、μＩＭＣＵ方法を、ＲＥＭＣＡＴ方法の変わりに使用した。ＲＥＭＣＡＴに比較して、μＩＭＣＵアッセイでのキモシン変異体の凝集時間を、ＵＶ／ＶＩＳプレートリーダーにより、８００ｎｍで９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるＯＤ測定により決定した。既知凝固強度を有する参照標準の種々の希釈度の標準曲線を、各プレート上で記録した。サンプルを、８４ｍＭの酢酸緩衝液、０．１％Triton Ｘ１００（ｐＨ５．５）により酵素を希釈することにより調製した。３２℃での反応を、４％（ｗ／ｗ）低発熱性、低脂肪粉乳及び７．５％（ｗ／ｗ）塩化カルシウム（ｐＨ＝約６．５）を含む標準乳基質３５０μｌを、２５μｌの酵素サンプルに添加することにより開始した。ｍｌ当たり国際凝乳ユニット（ＩＭＣＵ）でのキモシン変異体の凝乳活性を、標準曲線に対するサンプル凝集時間に基づいて決定した。

【0191】

４．２ 総タンパク質含有量の決定
総タンパク質含有量を、Thermo ScientificからのPierce BCA Protein Assay Kitを用いて、そのキットの説明書に従って決定した。

【0192】

４．３ 特定の凝固活性の計算
特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を、総タンパク質含有量（ｍｌ当たりのｍｇの総タンパク質）により凝固活性（ＩＭＣＵ／ｌｍ）を割ることにより決定した。

【0193】

実施例５：タンパク質分解活性の決定
一般的なタンパク質分解活性を、基質として、蛍光標識されたBodipy－FLカゼイン（EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638）を用いて測定した。ｐH－非感受性緑色蛍光Bodipy－FLにより重度に標識されたカゼイン誘導体は、接合体の蛍光のほとんど完全な消光をもたらす。プロテアーゼ触媒された加水分解は、蛍光Bidipy－FLを放出する。CHYMAX Mは今日まで知られているすべての凝固剤の最低な一般的タンパク質分解活性を有するので、この実験のために必須であったこの方法は、非常に敏感である。

【0194】

このアッセイは、０．０４ｍｇ／ｍｌの最終基質濃度で、所望するｐHに調節された０．２Ｍのリン酸緩衝液において実施された。両者ともリン酸緩衝液において調製された、１部の基質と１部の酵素との混合の前、すべての酵素を、５０ＩＭＣＵ／ｍｌに標準化した（実施例４に従って）。基質及び酵素を、９６ウェルＮｕｎｃ Ｆｌｕｏｒｏマイクロタイタープレートにおいて混合し、密封し、そして３２℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、シールを除去し、そして蛍光を蛍光光度計で記録した。実施例９及び１０で評価された変異体について、１部の基質を、１部の標準化されていない酵素サンプルと共に、３８６ウェルのＮｕｎｃ Ｆｌｕｏｒｏマイクロタイタープレートにおいて混合し、そして蛍光を、３２℃で１０時間、蛍光光度計で連続して記録した。蛍光上昇の直線部分の傾きを用いて、一般的タンパク質分解活性を決定した。

【0195】

実施例６：ラクダキモシン変異体の評価
すべての変異体について、特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／全タンパク質のｍｇ）を、実施例４に従って、ｐＨ６．５で決定し、そしてタンパク質分解活性を、ｐＨ６．５で、実施例５に従って決定した。Ｃ／Ｐ比を、タンパク質分解活性により、特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ）を割ることにより、ｐＨ６．５で全変異体について決定した。参照として、ラクダ野生型遺伝子が含まれた。

【0196】

複数の置換を有する変異体
異なった置換が、それぞれの効果に対して影響を及ぼす場合、明確な組合せ効果が存在することが結論づけられ得る。

【0197】

【表2】

【0198】

変異体１、２、３、４、８、９、１０及び１１は、より高い特異的凝乳活性を有し、そして変異体２、８、１０及び１１は、最も強い改善性を有することが結論付けられ得る。

【0199】

変異体２及び９は、低められたタンパク質分解活性を有することが結論付けられ得る。変異体２、９及び１０は、高められたＣ／Ｐ比を有することが結論付けられ得る。これに基づけば、変異体２は最も好ましい変異体であり、そして変異体９及び１０もまた、好ましい特性を示す。

【0200】

個々の突然変異体
すべての変異体は多重突然変異を含んでいたので、ランクされた変異体のデータを、統計学的方法及び３Ｄ構造分析を用いて、より詳細に調べ、正又は負の効果を有する個々のアミノ酸変化を決定した。

【0201】

個々のアミノ酸変化の効果を次の通りに要約したが、しかし異なった変異体における他のアミノ酸変化に多く依存する。それらに基づけば、好ましい突然変異は、D117N、Q246E、G309D、Y326F及びL280Iである。

【0202】

【表3】

【0203】

用語「＋」は、陽性アミノ酸交換を言及し－すなわち、「＋＋」は、「＋」よりもより陽性である。用語「－」は、陰性アミノ酸交換を言及し－すなわち「－－」は、「－」よりもより陰性である。用語「陽性」とは、変異体のチーズ製造製質に対する陽性効果を言及し、すなわち改善された凝固活性「Ｃ」及び高められたＣ／Ｐ比は、陽性（「＋」又は「＋＋」）として見なされ、ところが高められた一般的タンパク質分解活性（Ｐ）は、陰性性質（「－」又は「－－」）であると見なされる。認定「＋／－」とは、比較的中性の効果を示唆する。

【0204】

前記表の右欄の記載は、個々の突然変異がラクダキモシンの３Ｄ構造に位置している場所を言及している。ラクダキモシンの３Ｄ構造は公的に入手できる。

【0205】

結論：
上記結果は、ラクダキモシンにおける次の個々の突然変異が好ましいことを実証する（すなわち、ラクダ野生型キモシンに比較して、改善されたＣ／Ｐ比を有する）：D117N、Q246E、G309D、Y326F、L280I。

【0206】

上記結果は、ラクダキモシンにおける次の多重置換／突然変異が好ましいことを実証する（すなわち、ラクダ野生型キモシンに比較して、改善されたＣ／Ｐ比を有する）：
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F。

【0207】

実施例７：ラクダ及びウシキモシン変異体の評価
すべての変異体について、特異的凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇの総タンパク質）を、実施例４に従ってｐＨ６．５で決定し、そして一般的な又は特異的タンパク質分解活性を、実施例５に記載のようにして決定した。Ｃ／Ｐ比を、タンパク質分解活性により特異的凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ）を割ることにより、ｐＨ６．５で、全変異体について決定した。参照として、ラクダ野生型遺伝子が含まれた。

【0208】

良好な比較のために、全変異体を、活性Ｎ－グリコシル化部位、いわゆるアグリー（Ｕｇｌｙ）変異体を有さなかったバックグラウンド下で製造した。それらは、２つの可能性あるＮ－グリコシル化部位におけるＮを、Ｑに変えることにより行われた。さらなる結果については、図３を参照のこと。

【0209】

変異体の説明
変異体Ｊ２においては、Ｋ２７９がウシ非グリコシル化キモシンにおけるＶにより置換された。変異体Ｊ３２においては、ウシ非グリコシル化キモシンからのフラップ領域が、ペプシンからのフラップ領域により置換された。

【0210】

変異体Ｊ７２においては、ウシキモシンからの陰性パッチが、ラクダキモシンにおけるその対応する領域を置換するために使用された。変異体Ｊ４４においては、Ｒ３００がＱ、すなわちウシキモシンにおけるその対応するアミノ酸により、ラクダキモシンにおいて置換された。この特全変異はまた、変体Ｊ７２にも見出される。

【0211】

【表4】

【0212】

結論：
ウシケモシンの位置２７９でのリシンの突然変異が、ウシケモシン（変異体Ｊ２）に比較して、同程度のタンパク質分解活性及び高められた特異的凝固活性を示した変異体をもたらした。従って、位置２７９でのバリンが好ましいアミノ酸であることが結論づけられ得る。

【0213】

チーズ製造性質に対するラクダケモシンのグリコシル化の効果は無視できる。野生型ラクダケモシンと、未グリコシル化ラクダ変異体との比較は、有意な変化のないことを示す。しかしながら、ラクダケモシンへのウシケモシンからの陰性パッチの導入（変異体Ｊ７２）は、特異的凝固活性に対して陽性効果を示したが、ところが一般的タンパク質分解活性は約２倍、低められ、Ｃ／Ｐ比の倍増をもたらした。このパッチから単一の突然変異Ｒ３００Ｑの導入は、変異体Ｊ７２について見られるように、凝固活性に対して類似する陽性効果を示す。Ｑは、位置３００での好ましいアミノ酸であることが結論付けられる。

【0214】

ウシケモシンにおける陰性パッチ領域は、正しい切断部位外の酵素の位置決定のための重要な効果を有することが予測され、従って、酵素特異性を改善する。前記効果はほとんどの関連する電荷であることが予測され、すなわち、この理由で、負の電荷を高める任意の変化が、高められ特異性をもたらすであろう。

【0215】

ウシ及びラクダキモシンの負に荷電された領域のアラインメントが下記に示される。荷電された残基のみが示されている。
RxxxxxxNxGxxRxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxK ラクダ
QxxxxxxDxDxxSxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxQ ウシ

【0216】

位置番号に関して、及び参照としてラクダを用いて、番号付けは、右側から出発する：
R300
N307
G309
R312
K336。

【0217】

実施例８：ラクダ変異体の評価
野生型ラクダキモシンに比較して、それぞれ多重置換を有する多くの異なった変異体を分析した。全変異体について、特異的凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇの全タンパク質）を、実施例４に従って、ｐＨ６．５で決定し、そして特異的タンパク質分解活性を、１００ＩＭＣＵ当たりのタンパク質分解活性を測定することにより、実施例５に記載のようにして決定した。参照として、ラクダ野生型遺伝子が含まれた。

【0218】

変異体の分析
表に示される変異体は、ラクダキモシン遺伝子（ラクダｗｔにより示される）と同一のアミノ酸配列を有するが、但し、各変異体について言及される変更を除く。

【0219】

凝固活性は、ｍｇ全タンパク質当たりのＩＭＣＵとして記載される。改善された凝固活性は、１又は２以上の「＋」記号により示される。タンパク質分解活性は、１００ＩＭＣＵ当たりの人工ユニットで表される。改善された変異体、すなわち低められたタンパク質分解活性を有する変異体は、１又は２以上の「＋」記号により示される。「全体」欄においては、「＋」記号は、一般的に改善された性質、すなわち高い凝固活性を有する低タンパク質分解活性を有する変異体を示す。

【0220】

【表5】

【0221】

高い特異的凝固活性は、良好な凝乳酵素のために必須である。ラクダキモシンに対して高められた特異的凝固活性を有する全２１の変異体が、下記表２に同定され、そして包含された。

【0222】

【表6】

【0223】

低められたタンパク質分解活性は、良好な凝乳酵素のための特典である。ラクダキモシンに対して、低められたタンパク質分解活性を有する合計１０種の変異体が同定された（下記表３を、参照のこと）。

【0224】

【表7】

【0225】

全体の分析に基づいて、凝乳及びタンパク質分解活性についての改善された性質を有した５種の変異体を同定した。それらの５種の変異体は、下記表４に示される。

【0226】

【表8】

【0227】

個々の突然変異の効果の統計学的分析
ＰＣＡに基づく、統計学的分析を使用し、タンパク質分解活性、凝乳活性の何れか又は両者に対して陽性効果を有する単一の突然変異を同定した。下記表においては、高められた凝固活性をもたらす突然変異、低められたタンパク質分解活性、又は両高められた凝固及び低められたタンパク質分解性が要約されている。ＰＣＡプロットが図４に示されている。

【0228】

【表9】

【0229】

位置効果
凝固活性又は一般的タンパク質分解活性（すなわち、特異性）に対する効果を有するほとんどの突然変異は、触媒クレフトに位置するか又は近接するであろうことが予測された。基質は、触媒クレフトに入り、そしてここで、切断が生じる。

【0230】

驚くべきことには、凝固活性及び／又は特異性に対して陽性効果を有することが示された置換の少数の置換のみが、この領域に位置した（例えば、Ｌ２８０Ｉ、Ｌ７０Ｍ及びＦ７５Ｙ）。陽性効果を有した多くの突然変異が、分子の他の部分上に見出された。

【0231】

改善された凝固活性をもたらす置換
改善された凝固活性をもたらす置換のほとんどは、酵素の本体に位置し、そして分子の立体構造変化を引起した可能性がある。置換Ｆ７５Ｙは、クレフトの入り口に位置し、そしてかなり微妙であり、高められた極性をもたらす。

【0232】

【表10】

【0233】

低められたタンパク質分解活性をもたらす置換
置換のほとんどは、分子本体に位置する。得られる構造変化は、基質に対する高められた接近性をもたらす。２つの突然変異が、触媒クレフトの入口をマーキングするローブで見出された。Ｌ１６３Ｅ置換は、負の電荷を高める。これは、それらの位置での電荷の重要性を示す、実施例７からの結果を強化する。

【0234】

【表11】

【0235】

改善された凝固及び低められたタンパク質分解活性をもたらす置換
凝乳能力の全体的な改善性をもたらす置換のいくつかは、基質認識に関与する可能性がある電荷変更をもたらす。それらは、より高い陽性をもたらすＨ１３４Ｑ、及びより陰性の電荷をもたらすＱ３４６Ｅ置換を包含する。凝固及び特異性の両者に対して陽性効果を有する他の置換は、キモシン分子のより一般的な構造変化をもたらす可能性が最も高い。

【0236】

【表12】

【0237】

実施例９：ラクダ変異体の評価
変異体の特性評価
凝乳（Ｃ）及び一般的タンパク質分解（Ｐ）活性に関する。実施例７において評価されたラクダキモシン変異体を、再び生成し、そしてそれらのカゼイン分解特異性Ｃ／Ｐに関して評価した（下記表１）。Ｃ／Ｐ比は、チーズ製造における凝固剤の効果、すなわち一定体積の乳から得られるチーズカードの収量についてのＲ度である。凝乳及び一般的タンパク質分解活性を、それぞれ、実施例４及び５に記載のようにして決定した。しかしながら、この実施例においては、タンパク質分解活性を、凝固活性について標準化しないで測定した。

【0238】

ラクダキモシンを、参照として分析した。すべての変異体のＣ／Ｐ値は、野生型ラクダキモシンに対する相対的値として示されている。Ｃ／Ｐに対する酵素サンプル中の全タンパク質濃度の影響を検出し、そしてＣ／Ｐ値を、それに応じて、この相関について補正した。

【0239】

【表13】

【0240】

４６の特性評価された変異体のうち合計３０の変異体が、野生型ラクダキモシンに比較して、改善されたＣ／Ｐを示す（下記表２）。３倍以上の改善性が、３種の上部変異体３３、６及び２０で観察された。

【0241】

【表14】

【0242】

Ｃ／Ｐに対する位置及び突然変異効果の統計学的分析
ＰＣＡに基づく統計学的分析を、ラクダキモシンの一般的カゼインタンパク質分解（Ｃ／Ｐ）に対する凝乳の特異性に対する陽性効果を有する単一の突然変異を同定するために使用した。次の突然変異は、高いＣ／Ｐ比のために有益であることが見出された：
H134Q, F281A, I103V, V256I, I154L, S222G, L224V, Q346E, S331Y, K77T, V367I, G309D, V261A, D325Q, L280I, D117N, L163E, S212A。

【0243】

実施例１０：ラクダ変異体の評価
変異体の特性評価
実施例７において決定された位置及び突然変異効果に基づいて、別の組のラクダケモシン変異体を、野生型ラクダケモシンに比較して、多重置換により生成し、そして実施例９に記載のようにして、それらのカゼイン基質特異性（Ｃ／Ｐ）に関して評価した（下記表１）。

【0244】

【表15】

【0245】

２９の変異体のうち合計２６の変異体が、野生型ラクダキモシンに比較して、改善されたＣ／Ｐ比を示す。２倍の改善性が、最良の変異体について観察された（下記表２）。

【0246】

【表16】

【0247】

ＰＣＡに基づく統計学的分析を、ラクダキモシンの一般的カゼインタンパク質分解（Ｃ／Ｐ）に対する凝乳の特異性に対する陽性効果を有する単一の突然変異を同定するために使用した。次の突然変異は、高いＣ／Ｐ比のために有益であることが見出された：
S331Y, Y79S, K77T, D117N, H 134Q, N108D, G309W, L224V, D156V, L280I, M223E, V367I, F114Y。

【0248】

実施例１１：ラクダ変異体の評価
ＰＣＡに基づく統計学的分析を、実施例９及び１０からの組合わされた組の変異体に対して実施し、そしてラクダキモシンの一般的カゼインタンパク質分解（Ｃ／Ｐ）に対する凝乳の特異性に対して陽性効果を有する単一の突然変異を同定した。次の突然変異が、高いＣ／Ｐ比について有益であることが見出された：
F281A, H 134Q, I103V, S331Y, S222G, I154L, L280I, G309D, D117N, L224V, N 108D, L163E, G309W, K77T, Y79S。

【0249】

それらの突然変異は、実施例９及び１０において決定された有益な突然変異と良く一致する

【0250】

Ｃ／Ｐに対する位置及び突然変異効果の構造的評価
実施例８に見られるように、有益な突然変異の大部分は、再び、基質結合クレフトから離れて位置している。Ｌ２８０Ｉ及びＦ２８１Ａのみがクレフト内に直接位置している（Gilliland et al. 1990）。Ｉ２８０はＣ末端ローブの疎水性コアに向かう。従って、この突然変異は、結合クレフトの微妙な構造変化を導き、そして従って、基質特異性に影響を及ぼす。位置２８１は、Ｓ２結合部位の位置であり、そしてカゼイン基質におけるＰ２位置と相互反応する。この位置での突然変異は、カゼイン結合、及び従って、タンパク質分解対する影響の可能性が非常に高い。突然変異Ｇ３０９Ｗ及びＳ３３１Ｙは、触媒性クレフトにおける基質結合を助けるためにκ－カゼインと相互作用することが記載されている領域におけるＣ末端ローブの表面上に位置する（Gilliland et al. 1990）。従って、それらの突然変異は、基質結合に対して陽性の影響を与える。Ｉ１５４Ｌ及びＤ１５６Ｖ、及びＬ１６３Ｅは、Ｎ末端ローブのコアへの変化を表し、たぶん、触媒活性に対して影響を与える酵素の微妙な構造的再配列を導く。突然変異Ｓ２２２Ｇ及びＬ２２４Ｖは、その活性化された形でタンパク質Ｎ末端と相互作用するβシートへの変化を導入する（Langholm Jensen et al.）。酵素の活性化状態に対する可能性ある効果は、シフトされたカゼイン基質特異性をもたらすことができた。残りのヒット突然変異Ｋ７７Ｔ、Ｙ７９Ｓ、Ｉ１０３Ｖ、Ｎ１０８Ｄ、Ｄ１１７Ｎ及びＨ１３４Ｑは、Ｎ末端ローブの表面上に位置し、そしてＩ１０３Ｖを除いて、極性アミノ酸の交換を表す。酵素の表面上のそれらの変化は、κ－カゼインの利益となるように、改善された特異性を導くカゼイン分子との相互作用に多分影響を及ぼす。

【0251】

参考文献：
1 : 国際公開第02/36752A2号 (Chr. Hansen)
2 : Suzuki et al : Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71
3 : Suzuki et al : Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569
4: van den Brink et al : Increased production of chymosin by glycosylation, Jour-nal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310.
5 : Pitts et al : Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83
6 : M.G. Williams et al : Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997
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8 : Supannee et al : Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139
9 : Zhang et al : Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
10 : 国際公開第2013/174840A1号 (Chr. Hansen).
11 : 国際公開第2013/164479A2号 (DSM).
12 : Langholm Jensen et al : Camel and bovine chymosin : the relationship between their structures and cheese-making properties, Acta Crystallographica Section D : Biological Crystallography, vol. 69, 2013, pages 901-913.
13 : Gilliland et al : The three-dimentional structure of bovine chymosin at 2.3A resolution, Proteins, vol. 8, 1990, pages 82-101。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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【外国語明細書】