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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022123073
(43)【公開日】2022-08-23
(54)【発明の名称】ＥＦＰの治療または低減方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/48 20060101AFI20220816BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220816BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220816BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220816BHJP
【ＦＩ】
A61K38/48
A61P17/00
A61P43/00 105
A61K9/08
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022098817
(22)【出願日】2022-06-20
(62)【分割の表示】P 2020103455の分割
【原出願日】2012-10-19
(31)【優先権主張番号】61/549,863
(32)【優先日】2011-10-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】515140543
【氏名又は名称】エンド グローバル ベンチャーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ハート，スーザン ジー．，エミー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】患者の結合組織の線維症（ＥＦＰ）を治療または低減する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、ＥＦＰ罹患領域に１回または複数回の低用量コラゲナーゼ注射を投与することを含む患者のＥＦＰを治療または低減する方法であって、１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５０～約２００ＡＢＣ単位、および／またはコラゲナーゼの濃度が、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットル（ｍｌ）である方法を含む。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、ＥＦＰ罹患領域に１回または複数回の低用量コラゲナーゼ注射を投与することを含む患者のＥＦＰを治療または低減する方法であって、１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５０～約２００ＡＢＣ単位、および／またはコラゲナーゼの濃度が、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットル（ｍｌ）である方法を含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域に投与することを含む患者の結合組織の線維症（ＥＦＰ）を治療または低減する方法であって、１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が約５～約２００ＡＢＣ単位である、方法。
【請求項2】
複数回の皮下注射が、複数箇所の注射部位に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記投与されるコラゲナーゼの濃度が、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
各コラゲナーゼ注射が、約０．５ｍｌ以下の容量で投与される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記投与されるコラゲナーゼの合計用量が、約５～約２０００ＡＢＣ単位である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５～約１００ＡＢＣ単位である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５～約５０ＡＢＣ単位である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記コラゲナーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクムから精製される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記コラゲナーゼが、組換え型コラゲナーゼである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記クロストリジウム・ヒストリチクムから精製されたコラゲナーゼが、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、１：１の質量比で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項12】
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なキャリアーから基本的に構成される医薬組成物中に存在する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なキャリアーから構成される医薬組成物中に存在する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記方法が、１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射を投与することから基本的に構成される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記方法が、１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射を投与することから構成される請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
少なくとも２回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の２箇所の注射部位に投与される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
少なくとも５回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の５箇所の注射部位に投与される、請求項１６記載の方法。
【請求項18】
少なくとも１０回のコラゲナーゼ注射が、前記患部の１０箇所の注射部位に投与される、請求項１７記載の方法。
【請求項19】
前記ＥＦＰ患部が、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２の面積を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
複数のコラゲナーゼ皮下注射が投与され、注射部位間の距離が少なくとも約１～約４ｃｍである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記注射部位間の距離が、約２～約３ｃｍである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記ＥＦＰ罹患領域が約１０ｃｍの長さと約８ｃｍの幅を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
注射部位間に約２．５ｃｍの距離が存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
各注射が、約０．５ｍｌの容量である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
各注射が、約０．１ｍｌの容量である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域内に投与することを含む患者のＥＦＰを治療または低減する方法であって、前記患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量が約５～約５０００ＡＢＣ単位であり、前記複数回の注射がそれぞれ約５～約２００ＡＢＣ単位であり、前記複数回の注射が複数箇所の注射部位に投与される、方法。
【請求項27】
複数回のコラゲナーゼ皮下注射が、複数箇所の注射部位に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記投与されるコラゲナーゼの濃度が、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルである、請求項２６および２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
各コラゲナーゼ注射が、約０．５ｍｌ以下の容量で投与される請求項２５～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５～約２００ＡＢＣ単位である、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量が、約５～約２０００ＡＢＣ単位である、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量が、約５～約１０００ＡＢＣ単位である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記コラゲナーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクムから精製される、請求項２６～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記コラゲナーゼが、組換え型コラゲナーゼである、請求項２６～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記クロストリジウム・ヒストリチクムから精製されたコラゲナーゼが、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、１：１の質量比で存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
少なくとも２回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の２箇所の注射部位に投与される、請求項２６～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
少なくとも５回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の５箇所の注射部位に投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
少なくとも１０回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の１０箇所の注射部位に投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域に投与することを含む患者のＥＦＰを治療または低減する方法であって、１回の注射当たり前記患部に投与されるコラゲナーゼの前記用量が、約５～約２００ＡＢＣ単位で、前記患部に投与されるコラゲナーゼの濃度が約５０～２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルであり、前記複数回の注射が複数箇所の注射部位に投与される、方法。
【請求項41】
前記複数回の注射が、複数箇所の注射部位に投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
投与コラゲナーゼ注射のそれぞれの前記容量が、約０．５ｍｌ以下である、請求項４０および４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
それぞれの注射が約０．２ｍｌ以下の容量である、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１１年１０月２１日出願の米国特許仮出願第６１／５４９，８６３号の利益を主張する。上記参照出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１１年１０月２１日出願の米国特許仮出願第６１／５４９，８６３号の利益を主張する。上記参照出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
結合組織の線維症（ＥＦＰ）は、一般には、セルライトと呼ばれているが、皮膚外観上の組織分布の変化として現れ、思春期後の女性の約９０％が発症する状態である（Ｒａｗｌｉｎｇｓ（２００６）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉ ２００６；２８：１７５－９０；Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）、Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２０１０；６２：３６１－７０）。ＥＦＰは、小さな窪みのある皮膚として現れ、よく言われるオレンジの皮のような外観の皮膚になる。コラゲナーゼで構成されている皮膚隔膜は、皮膚の陥凹形成の原因となる役割をしていると考えられている。
【0003】
コラーゲンを消化する特殊能力を有する酵素であるコラゲナーゼは、例えば、デュピュイトラン拘縮、ペイロニー病、脂肪腫および癒着性関節包炎、などの種々のコラーゲン媒介疾患に用いられてきた。また、米国特許第４，６４５，６６８号および米国特許公開第２００７０２２４１８４号も、コラゲナーゼの特定の使用について開示している。コラゲナーゼの主要供給源は、細菌、クロストリジウム・ヒストリチクムの発酵生成物である。ヒストリチクス菌コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む注射可能製剤は、デュピュイトラン拘縮の治療用として、ＸＩＡＦＬＥＸ（登録商標）の商標で販売されており、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から認可されている。
【0004】
本発明は、ＥＦＰの治療または低減方法に関し、この方法は、ＥＦＰ罹患領域に対する
１回または複数回のコラゲナーゼ注射を含む。
１回または複数回のコラゲナーゼ注射を含む。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、コラゲナーゼＥＦＰ罹患領域に対する１回または複数回の低用量注射によりこのＥＦＰを効果的に減らす、または治療できるという発見に基づいている。単回注射のコラゲナーゼの量は、５ＡＢＣ単位、または０．０００２９ｍｇ（０．２９μｇ）程度に少なくてよい。投与されるコラゲナーゼの合計用量は、治療領域の大きさに依存し、従って、約５～約５０００ＡＢＣ単位である。コラゲナーゼの濃度は、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットル（ｍｌ）である。１０，０００ＡＢＣ単位は、０．５８ｍｇコラゲナーゼに等しい。
【0006】
一実施形態では、本発明は、患者のＥＦＰを治療または低減する方法に関し、この方法は、前記患者のＥＦＰ罹患領域に１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射を投与することを含み、１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量は、約５～約２００ＡＢＣ単位であり、その複数回の皮下注射は、複数の注射部位に対し投与される。特定の態様では、複数回の皮下注射が複数の注射部位に投与される。さらなる実施形態では、投与されるコラゲナーゼの濃度は、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルである。追加の特定の実施形態では、それぞれのコラゲナーゼ注射は、約０．５ｍｌ以下の容量で投与される。さらなる態様では、投与されるコラゲナーゼの合計用量は、約５～約２０００ＡＢＣ単位である。
【0007】
別の実施形態では、本発明は、患者のＥＦＰを治療または低減する方法に関し、この方法は、前記患者のＥＦＰ罹患領域内に１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射を投与することを含み、患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量は、約５～約５０００ＡＢＣ単位であり、その複数回の注射は、複数の注射部位に投与される。特定の態様では、それぞれの注射は、約５～約２００ＡＢＣ単位である。一部の実施形態では、投与されるコラゲナーゼの濃度は、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルであり、および／またはそれぞれのコラゲナーゼの注射は、約０．５ｍｌ以下の容量で投与される。
【0008】
さらに別の実施形態では、本発明は、患者のＥＦＰを治療または低減する方法であり、この方法は、前記患者のＥＦＰ罹患領域に１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射を投与することを含み、１回の注射当たり患部に投与されるコラゲナーゼの用量は、約５～約２００ＡＢＣ単位で、患部に投与されるコラゲナーゼの濃度は、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルである。
【0009】
さらなる態様では、本発明は、患者のＥＦＰを治療または低減する方法に関し、この方法は、１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域に投与することを含み、患部に投与されるコラゲナーゼの濃度は、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルで、コラゲナーゼのそれぞれの注射の容量は、約０．５ｍｌ以下である。
【0010】
一部の実施形態では、１回の注射当たり投与されるコラゲナーゼの用量は、約５～約１００ＡＢＣ単位である。さらなる実施形態では、１回の注射当たり投与されるコラゲナーゼの用量は、約５～約５０ＡＢＣ単位である。
【0011】
コラゲナーゼは、細菌源由来であっても、またはコラゲナーゼの組換え型由来であってもよい。一部の実施形態では、コラゲナーゼは、クロストリジウム・ヒストリチクムから精製される。さらなる実施形態では、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む。さらなる実施形態では、コラゲナーゼは、クロストリジウム・ヒストリチクムから精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩであり、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む。
【0012】
前出および他の本発明の目的、特徴、および利点は、以下の本発明の好ましい実施形態のさらに具体的な付随する図で例示される説明から明らかになるであろう。これらの図では、異なる図を通して、類似の参照記号は同じ部分を指す。図は、必ずしも縮尺通りではなく、本発明の原理を示す際には、強調が行われている。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】注射テンプレートを示す図で、八角形内の各ドットは、注射部位を表す。円内のＸは、「中央のくぼみ」に対する注射部位を表す。４コーナーは、右上（ＵＲ）、右下（ＬＲ）、左上（ＵＬ）、および左下（ＬＬ）として標識する。
【図2】テンプレートコーナー標識をつけた殿部および上後大腿部を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の好ましい実施形態の説明を、以下に示す。
上で考察のように、本発明は、ＥＦＰ罹患領域に対するコラゲナーゼの低用量注射がコラーゲンの溶解に効果的であり、その結果、前記ＥＦＰを低減するか、または治療するという発見に基づいている。単回注射コラゲナーゼの量は、５ＡＢＣ単位、または０．０００２９ｍｇ程度の少なさであってよい。投与されるコラゲナーゼの合計用量は、治療領域の大きさに依存し、従って、約５～約５０００ＡＢＣ単位であり、および／または本発明の方法では、使われるコラゲナーゼの濃度は、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットル（ｍｌ）である。本発明の方法により用いられるコラゲナーゼの用量および濃度は、デュピュイトラン拘縮治療用に現在使われ、米国ＦＤＡから認可されているコラゲナーゼの用量および濃度より実質的に低い。
上で考察のように、本発明は、ＥＦＰ罹患領域に対するコラゲナーゼの低用量注射がコラーゲンの溶解に効果的であり、その結果、前記ＥＦＰを低減するか、または治療するという発見に基づいている。単回注射コラゲナーゼの量は、５ＡＢＣ単位、または０．０００２９ｍｇ程度の少なさであってよい。投与されるコラゲナーゼの合計用量は、治療領域の大きさに依存し、従って、約５～約５０００ＡＢＣ単位であり、および／または本発明の方法では、使われるコラゲナーゼの濃度は、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットル（ｍｌ）である。本発明の方法により用いられるコラゲナーゼの用量および濃度は、デュピュイトラン拘縮治療用に現在使われ、米国ＦＤＡから認可されているコラゲナーゼの用量および濃度より実質的に低い。
【0015】
単語の「ａ」または「ａｎ」は、特に別義が指定されない限り、１つまたは複数を包含することが意図されている。
【0016】
ＥＦＰの「治療（Ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書記載の組成物または薬剤を投与し、以前にＥＦＰに罹患した皮膚の外観の改善、および／または美的結果の改善を実現することを含む。例えば、ＥＦＰの治療は、目視によるＥＦＰの重症度の低下、または目視による皮膚のくぼみの重症度もしくは数の低減を含んでもよい。
【0017】
本発明は、患者のＥＦＰを治療または低減する方法を含み、方法は、１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域に投与することを含み、その複数回の注射は、ＥＦＰ罹患領域内の複数の注射部位に注射され、１回の注射当たり投与されるコラゲナーゼの用量は、約５～約２００ＡＢＣ単位である。さらなる実施形態では、１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量は、約５～約１００ＡＢＣ単位、または約５～約５０ＡＢＣ単位、または約１０～約１００ＡＢＣ単位、または約１０～約５０ＡＢＣ単位である。さらなる実施形態では、患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量は、約５～約５０００ＡＢＣ単位である。また、本発明は、患部に投与されるコラゲナーゼの濃度が、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ｍｌである場合のコラゲナーゼをＥＦＰ罹患領域に投与することを含む方法を包含する。さらに、本発明は、複数回のコラゲナーゼ注射をＥＦＰ罹患領域に投与し、１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が約５～約２００ＡＢＣ単位である場合の患者のＥＦＰを治療または低減する方法を包含する。
【0018】
ＥＦＰ罹患領域（本明細書では、「標的領域」または「治療領域」とも呼ぶ）は、典型的な例では、１つまたは複数のくぼみを特徴とする大腿部および／または殿部の皮膚の領域である。一部の実施形態では、１回または複数回のコラゲナーゼ注射で治療されるＥＦＰの領域は、大腿部の外側上面の領域、または殿部の領域で、殿溝を含まない。また、コラゲナーゼで治療される標的領域は、右もしくは左殿部または右もしくは左大腿部の重度のＥＦＰ重症度に対し中等度を表す１０以上の写真による数値化ＥＦＰ重症度スケール（ＣＳＳ）スコアを有する領域であってもよい（Ｈｅｘｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）．「検証された写真による数値化ＥＦＰ重症度スケール（Ａ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｐｈｏｔｏｎｕｍｅｒｉｃ ＥＦＰ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃａｌｅ）」、ＪＥＡＤＶ ２００９；２３：５２３－５２。この文献の内容は、参照によって明示的に本明細書に組み込まれる）。ＣＳＳは、ＥＦＰの５つの重要な形態学的特徴：（Ａ）くぼみの数、（Ｂ）くぼみの深さ、（Ｃ）皮膚表面の形態学的外観、（Ｄ）皮膚のゆるみ、弛緩またはたるみ、および（Ｅ）ＮｕｍｂｅｒｇｅｒとＭｕｌｌｅｒにより、Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ １９７８；４（３）：２２１－２９、に最初に記載された分類スケール、を調べる写真による数値化スケールである（Ｈｅｘｓｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００９）。これらの特徴のそれぞれは、低い値の０から高い値の３までの４点スケールで評価される。スケールは、０～１５の範囲である。
【0019】
ＥＦＰの１回または複数回の注射で治療された標的領域は、通常、患者が立位の場合に、目視で明白な１つまたは複数のくぼみを特徴とする皮膚の領域である。治療領域の幾何学領域は、ＥＦＰ罹患領域の大きさに依存する。従って、例えば、ＥＦＰ罹患領域が１つのくぼみを含む場合、標的領域の幾何学領域は、約１ｃｍ２～約５ｃｍ２であってもよい。さらなる態様では、ＥＦＰ罹患領域は、複数のくぼみを含み、１ｃｍ２を越える幾何学領域を有する。一実施形態では、標的領域は、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２の幾何学領域を有する。当然のことながら、標的領域は、通常、大腿部または殿部の領域であるから、その領域は、例えば、ほぼ矩形の形であり、約１～約１５ｃｍの長さ、約１～約１０ｃｍの幅であってよい。さらなる例では、標的領域は、約６～約１５ｃｍの長さ、約４～約１０ｃｍの幅である。また、当業者なら、標的領域は、所望の治療用領域に応じて、ほぼ円形でも、または他のいずれかの幾何学的形状であってもよいことを理解するであろう。任意選択で、標的領域は、治療されるＥＦＰの領域のほぼ中心にある少なくとも１つの皮膚のくぼみを特徴としてもよく、この場合、ＥＦＰの領域は、１回または複数回の注射により治療される。コラゲナーゼ注射部位は、ＥＦＰ罹患領域内で番号をつけ、間隔を置いて配置して、注射コラゲナーゼの分布と効力の均一化ができるようにしてもよい。コラゲナーゼ注射の数は、通常、治療される領域の大きさに依存する。一部の実施形態では、注射部位の数は、少なくとも１箇所以上である。他の態様では、注射部位の数は、少なくとも約３箇所以上である。別の態様では、注射部位の数は、少なくとも約５箇所以上である。また他の態様では、注射部位の数は、少なくとも約７箇所以上である。さらなる態様では、注射部位の数は、少なくとも１０箇所以上である。
【0020】
治療領域が、単一くぼみ領域であるか、またはそれ以外の約５ｃｍ２未満の幾何学領域である一実施形態では、単一注射部位のみがあり、約５～約２００ＡＢＣ単位のコラゲナーゼが注射される。任意選択で、単回注射をくぼみの中心に行ってもよい。治療領域がさらに大きい実施形態では、複数の注射部位になり、１回の注射当たり約５～約２００ＡＢＣ単位のコラゲナーゼが投与される。任意選択で、複数回の注射は、１つのくぼみの中心に投与される少なくとも１回の注射を含む。例えば、注射部位は、相互に約１～約４ｃｍの間隔であってもよい。さらに他の態様では、注射部位は、相互に約２～約３ｃｍの間隔であってもよい。例えば、特定の実施形態では、ＥＦＰ罹患領域は、約８ｃｍの幅と約１０ｃｍの長さの寸法で、投与されるコラゲナーゼ注射の数は、１０回、注射部位間の距離は、約２．５ｃｍである。特定の態様では、目的の注射部位を示す標識を含む注射テンプレート（例えば、薄い透明材料で作られた）が標的領域上に配置され、テンプレートにより示された部位に１回または複数回の注射が行われる。
【0021】
標的領域は、１回または複数回の同時コラゲナーゼ注射で治療される。本明細書で使われる同時注射は、同じ時間、または同じ期間内、すなわち、単一治療作業の間に順次投与される注射である。上で考察のように、ＥＦＰ罹患領域に投与されるコラゲナーゼの合計用量は、コラゲナーゼの約５～約５０００ＡＢＣ単位である。投与されるコラゲナーゼの合計用量は、治療領域の大きさに依存する。コラゲナーゼの合計用量は、１回または複数回のコラゲナーゼ注射により投与される用量の合計である。特定の態様では、それぞれのコラゲナーゼ注射は、等用量のコラゲナーゼを含む。例えば、治療領域に分布させる注射の数が１０で、それぞれの注射がコラゲナーゼ２００ＡＢＣ単位である場合、標的領域に投与されるコラゲナーゼの合計用量は、２０００ＡＢＣ単位となる。さらなる例では、治療領域に分布させる注射の数が１０で、それぞれの注射がコラゲナーゼ５ＡＢＣ単位の場合、標的領域に投与されるコラゲナーゼの合計用量は、５０ＡＢＣ単位になる。さらなる例では、治療領域に分布させる注射の数が５で、それぞれの注射がコラゲナーゼ５ＡＢＣ単位の場合、標的領域に投与されるコラゲナーゼの合計用量は、２５ＡＢＣ単位になる。単回注射のみが行われ、選択された用量が５ＡＢＣ単位の場合、投与されるコラゲナーゼの合計用量は、５ＡＢＣ単位になる。罹患領域に投与されるコラゲナーゼの濃度は、約５０ＡＢＣ単位／ｍｌ～約２０００ＡＢＣ単位／ｍｌである。コラゲナーゼは、１回の注射当たり約０．５ｍｌ以下の容量で投与できる。別の態様では、コラゲナーゼは、１回の注射当たり約０．１ｍｌ～約０．５ｍｌの用量で投与できる。例えば、投与されるコラゲナーゼの全容量は、約０．１ｍｌ（単一注射部位が使われる場合）～約７ｍｌ（複数の注射部位に対し）でよく、また、さらに大きな寸法の治療領域に対しては、より多くてよい。一実施形態では、治療領域が約８０ｃｍ２の場合、投与される全容量は、０．１ｍｌ～０．５ｍｌの１０回の注射の合計で、約１～約５ｍｌである。
【0022】
コラゲナーゼは、コラーゲンを消化する特殊能力を有する酵素である。コラゲナーゼの１つの商用供給源は、クロストリジウム・ヒストリチクムによる発酵によるものである。特定の態様では、コラゲナーゼは、精製されたクロストリジウム・ヒストリチクムコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの組み合わせを含む。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、約１：１の質量比で存在することが好ましい。コラゲナーゼＡＵＸ Ｉは、分子量１１５ｋＤａの約１０００アミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖を持つ。また、コラゲナーゼＡＵＸ ＩＩは、分子量１１０ｋＤａの約１０００アミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖を持つ。ヒストリチクス菌由来の粗製コラゲナーゼは、例えば、ヘパリン親和性クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および金属キレート化クロマトグラフィー、などの当業者に既知の種々の方法で精製できる。また、ヒストリチクス菌由来粗製コラゲナーゼの精製方法は、米国特許第７，８１１，５６０号に記載されている。この特許の内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。上で考察のように、ヒストリチクス菌コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む注射可能製剤は、ＸＩＡＦＬＥＸ（登録商標）の商標により米国で販売されており、デュピュイトラン拘縮治療薬として米国ＦＤＡにより認可されている。例えば、コラゲナーゼは、ほぼ１：１質量比の２種のコラゲナーゼ：コラゲナーゼＩ（ＡＵＸ－Ｉ、クロストリジウムＩ型コラゲナーゼ）およびコラゲナーゼＩＩ（ＡＵＸ－ＩＩ；クロストリジウムタイプＩＩコラゲナーゼ）からなる非経口の凍結乾燥生成物であってもよい。コラゲナーゼは、約１：１の質量比で、逆相高速液体クロマトグラフィーで測定した面積で少なくとも約９５％の純度（例えば、米国特許第７，８１１，５６０号に記載のように）を有するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含むのが好ましい。
【0023】
また、本発明のコラゲナーゼ組成物は、特定の数の活性単位または特定の質量の精製された酵素を混合して調製できる。コラゲナーゼ活性は、酵素の合成ペプチドまたはコラーゲン基質を加水分解する能力により測定できる。当業者なら、本明細書で開示されたもの以外の酵素アッセイを使っても、機能的に等価な酵素組成物を定義し、調製できることに気付くであろう。
【0024】
用語の「コラゲナーゼＩ」、「ＡＢＣＩ」、「ＡＵＸＩ」、「コラゲナーゼＡＵＸＩ」、および「コラゲナーゼＡＢＣＩ」は、同じものを意味し、区別なく使用できることは、理解されよう。同様に、用語の「コラゲナーゼＩＩ」、「ＡＢＣＩＩ」、「ＡＵＸＩＩ」、「コラゲナーゼＡＵＸＩＩ」、および「コラゲナーゼＡＢＣＩＩ」は、同じ酵素を意味し、区別なく使用できる。
【0025】
さらなる特定の実施形態では、本明細書記載の方法により投与されるコラゲナーゼは、組換え型コラゲナーゼである。
【0026】
コラゲナーゼは、コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含む医薬組成物として投与される。一部の実施形態では、組成物は、コラゲナーゼ以外のプロテアーゼ酵素（細菌発酵から精製されたコラゲナーゼに存在する可能性のある少量または痕跡量のタンパク分解性酵素以外の）を含まない。さらなる実施形態では、医薬組成物は、コラゲナーゼ以外の酵素（細菌発酵から精製されたコラゲナーゼに存在する可能性のある少量または痕跡量の酵素以外の）を含まない。当業者なら、細菌発酵由来のコラゲナーゼは、精製後でも、他のプロテアーゼ酵素などの他の酵素を含む少量または痕跡量の不純物を含む場合があることを理解するであろう。例えば、少量または痕跡量の不純物は、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満のコラゲナーゼ組成物であってもよい。一部の実施形態では、少量または痕跡量の不純物は、逆相高速液体クロマトグラフィーで測定して、約１％、２％、３％、４％または５％未満の面積であってもよい。別の態様では、医薬組成物は、基本的に、コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤から構成される。本明細書で使われる「コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤から基本的に構成される」薬学的に組成物は、医薬組成物から、他の上述の少量または痕跡量以外のプロテアーゼ酵素およびヒアルロニダーゼを除くことを意図している。さらなる特定の態様では、「コラゲナーゼから基本的に構成される」組成物は、組成物から、コラゲナーゼ以外の酵素を除外する。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なその塩から構成される。
【0027】
ＥＦＰを治療または低減する方法は、局部麻酔薬を使った標的領域の前処理をさらに含んでもよい。
【0028】
さらなる態様では、本発明は、患者のＥＦＰの治療または低減に関し、１回または複数回のコラゲナーゼ注射をＥＦＰ罹患領域に投与することから基本的に構成され、投与されるコラゲナーゼの用量は、約５～約２００ＡＢＣ単位であり、任意選択で、さらに、コラゲナーゼの濃度は、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ｍｌである。またさらなる態様では、本発明は、複数回のコラゲナーゼ注射を投与することから構成される患者のＥＦＰの治療または低減に関し、１回の注射当たり投与されるコラゲナーゼの用量は、約５～約２００ＡＢＣ単位であり、任意選択で、さらに、コラゲナーゼの濃度は、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ｍｌである。
【0029】
薬学的に許容可能なキャリアーは、１つまたは複数の液体キャリアーまたは注射に適する賦形剤であってよい。本明細書で使われる用語の「薬学的に許容可能なキャリアーまたは賦形剤」は、非毒性、不活性の、液体注入剤、希釈剤、封入材料または任意のタイプの処方補助剤を意味する。薬学的に許容可能なキャリアーの役割ができる材料の一部の例は、ラクトース、グルコースおよびショ糖などの糖；コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン；カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースとその誘導体；粉末化トラガント；麦芽；ゼラチン；滑石；プロピレングリコールなどのグリコール；エチルオレアートおよびエチルラウラートなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよびアルミニウム水酸化物などの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質不含水；等張性食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸塩緩衝液であり、さらに、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性の相溶性潤滑剤、ならびに着色料、解除剤、コーティング剤、芳香剤、防腐剤および抗酸化剤も、処方者の判断により、組成物中に存在させることができる。注射可能製剤、例えば、無菌の注射可能水性または油性懸濁液は、適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を使って、既知の技術により処方できる。また、無菌注射可能製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射可能溶液、懸濁液または乳剤であってもよく、例えば、１，３－ブタンジオール中溶液としてもよい。採用可能な許容できるビークルおよび溶剤には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が溶媒または懸濁剤として都合よく採用される。この目的では、合成モノまたはジグリセリドなどの任意の無刺激の不揮発性油を採用できる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射液の調製に使用できる。
【0030】
注射可能製剤は、例えば、除菌フィルターを通す濾過により、または使用前に無菌水または他の無菌注射可能溶媒に溶解または分散できる無菌固体組成物の形の滅菌剤の添加により、滅菌できる。また、無菌溶液は、後で使用するために、凍結乾燥してもよい。一実施形態では、コラゲナーゼを含む医薬組成物は、ラクトースで処方された注射可能凍結乾燥組成物である。一実施形態では、１ミリグラムの注射可能コラゲナーゼに対し、１．９ｍｇのラクトースで処方される。別の実施形態では、１ミリグラムの射コラゲナーゼは、合成基質のｐｚＧＰＧＧＰＡを使った効力検定で測定して、約２８００ＳＲＣユニットおよび５１０００ユニットであるのが好ましい。
【0031】
別の実施形態では、本発明の方法で使われるコラゲナーゼ組成物は、約８．０のｐＨレベルのショ糖、トリスで、処方された凍結乾燥注射可能組成物である。例えば、１．０ｍｇの本発明の医薬品有効成分は、約８．０のｐＨの６０ｍＭショ糖、１０ｍＭトリス（これは、製剤緩衝液中の２０．５ｍｇ／ｍＬのショ糖および１．２１ｍｇ／ｍＬのトリスに等しい）で処方される。通常、塩化カルシウム、などのカルシウム源が、製剤中に含まれる。
【0032】
本発明は、以下の実施例に関連してさらによく理解されよう。この実施例は、例示のみの目的であり、本発明の範囲を制限する意図はない。開示実施形態に対する種々の変更および修正は、当業者には明らかであると思われ、また、このような変更と修正は、本発明の趣旨、および添付請求項の範囲を逸脱することなく、行うことができる。
【0033】
実施例
実施例１：ゲッチンゲンミニブタの皮膚コラーゲン溶解におけるコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムの有効性
コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム（Ａｕｘｉｌｉｕｍ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）は、ほぼ１：１質量比の２種のコラゲナーゼ：コラゲナーゼＩ（ＡＵＸ－Ｉ、クロストリジウムＩ型コラゲナーゼ）およびコラゲナーゼＩＩ（ＡＵＸ－ＩＩ；クロストリジウムＩＩ型コラゲナーゼ）から構成される非経口凍結乾燥生成物である。これらのコラゲナーゼは、クロストリジウム・ヒストリチクムの発酵から単離、精製される。凍結乾燥生成物の再構成用ビークルは、０．０３％（２ｍＭ）塩化カルシウムを含む食塩水（０．９％塩化ナトリウム）とした。以下でさらに詳細に記載される製剤の希釈と調製用のビークルは、１０ｍＭ（０．１３％）ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、６０ｍＭ（２．０％）ショ糖（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および２ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ８．０）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）を含む食塩水（注射用０．９％塩化ナトリウム；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）とした。ＩＮ ＨＣ１（塩酸）を使って、希釈用ビークルのｐＨを８．０にした。処方、サンプリングおよび用量投与手続きを通して、希釈用ビークルを混合した。希釈用ビークルは、その後、０．２２μｍＰＶＤＦシリンジフィルターを使って除菌し、無菌のバイアルに入れ、セプタムで蓋をした。希釈用ビークルは、無菌ガラス製品および用具を使って層流フード内で無菌法により調製した。
実施例１：ゲッチンゲンミニブタの皮膚コラーゲン溶解におけるコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムの有効性
コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム（Ａｕｘｉｌｉｕｍ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）は、ほぼ１：１質量比の２種のコラゲナーゼ：コラゲナーゼＩ（ＡＵＸ－Ｉ、クロストリジウムＩ型コラゲナーゼ）およびコラゲナーゼＩＩ（ＡＵＸ－ＩＩ；クロストリジウムＩＩ型コラゲナーゼ）から構成される非経口凍結乾燥生成物である。これらのコラゲナーゼは、クロストリジウム・ヒストリチクムの発酵から単離、精製される。凍結乾燥生成物の再構成用ビークルは、０．０３％（２ｍＭ）塩化カルシウムを含む食塩水（０．９％塩化ナトリウム）とした。以下でさらに詳細に記載される製剤の希釈と調製用のビークルは、１０ｍＭ（０．１３％）ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、６０ｍＭ（２．０％）ショ糖（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および２ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ８．０）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）を含む食塩水（注射用０．９％塩化ナトリウム；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）とした。ＩＮ ＨＣ１（塩酸）を使って、希釈用ビークルのｐＨを８．０にした。処方、サンプリングおよび用量投与手続きを通して、希釈用ビークルを混合した。希釈用ビークルは、その後、０．２２μｍＰＶＤＦシリンジフィルターを使って除菌し、無菌のバイアルに入れ、セプタムで蓋をした。希釈用ビークルは、無菌ガラス製品および用具を使って層流フード内で無菌法により調製した。
【0034】
下表に示す試験品（コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム）の濃度で投薬製剤を調製した。
【表1】
【0035】
投薬製剤を投薬の日に調製した。再構成用ビークルを使って凍結乾燥生成物を再構成し、２．５ｍｇ／ｍＬストック試験品溶液を得た。希釈用ビークルを使って、ストック試験品溶液を希釈し、投薬に使用される製剤を調製した。投薬の前、および投薬の間、製剤をウエットアイス上で維持した。製剤を無菌ガラス製品および用具を使って層流フード内で無菌法により調製した。
【0036】
この調査の試験系としてゲッチンゲンミニブタを使った。この種および交配動物は、一般毒性調査に適すると認められており、各種訓練の生物医学的な研究モデルとして利用されてきた。ブタは、心臓血管の解剖学的形態と生理機能、消化生理機能、および外皮構造と機能において、人間と多くの類似性を示す。ブタと人間の間の皮膚の解剖学的形態および生理機能の類似性の故に、ブタは、プラスチック手術、創傷治癒、および皮膚毒性調査のための標準的モデルになっている（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ、（１９９８）、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８、２５（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １）：２７－３０）。歴史的には、ブタは、有望な治療薬の中毒学的評価に使用されてきた。
【0037】
ゲッチンゲンミニブタ（４匹の雄と３匹の雌）を、Ｍａｒｓｈａｌｌ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｏｓｅ、ＮＹから良好な健康状態で入手した。動物は、受け入れ時、約３～４月齢であった。各動物は、全部で１２治療の内の１用量の投与を受け、１動物当たり約０．４３ｍｇコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムの合計用量であった。動物は、投薬時、約４月齢であった。体重は、用量投与時、雄で７１８５ｇ～８６４６ｇの範囲で、雌では、９３３３ｇ～９６３３ｇであった。試験製剤を、試験0日目に、テラゾール／キシラジンの皮下注射（ボーラス）麻酔した動物に投与した。注射の前日、必要に応じ、注射の指定領域の毛を切った。適切な大きさのシリンジと針（１６～２３ゲージ）を使って、各動物の右と左の外側胴部に沿って６回の注射を投与した。動物の同じ部位に２回以上の投与はしなかった。各皮下注射は、異なる、無作為に割り付けた治療（製剤濃度と投与容量の組み合わせ）から構成された。注射部位を、間隔を開けて十分離して配置し、起こりうる隣接注射部位からの反応を防いだ。試験品沈着部位のすぐ周辺領域を永久マーカーでマークし、必要に応じ再度マークした。個別注射部位を標識した。この試験のための選択投与経路は、皮下注射とした。
【0038】
脂肪細胞、神経、付属器構造（毛包、汗腺および皮脂腺）または被覆表皮に、薬剤関連組織学的影響は検出されなかった。コラーゲンの推定溶解度で評価して、性別間、または投薬後２４もしくは４８時間で安楽死させた動物の間で、コラーゲン溶解性の一貫した差異は認められなかった。投薬後２４および４８時間での死体解剖による結果を性別にまとめて下表に示した。０．０１５ｍｇ／ｍＬより低い濃度で、コラーゲン溶解度は、ほぼ用量反応性であった。０．０１５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度では、コラーゲン溶解度は、投与容量にほぼ比例した。これは、合計用量または製剤濃度に対する変化とは対照的であった（例えば、試験品７および８では、試験品７が、より低い濃度およびより多い容量の投与により、試験品８と同じ合計用量を表す）。
【表2】
【0039】
０．００１５～０．１５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の単回皮下注射として投与したコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムは、この試験で、０．０１５ｍｇ／ｍＬ以上のコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム濃度で治療した部位で、局所的膨潤を生じ、また、全ての用量、投与容量、および製剤濃度で、コラーゲン溶解（コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムの期待される薬理的効果）を生じた。本試験での最小限の有効量は、０．０００３ｍｇタンパク質であり、最小限の有効濃度は、０．００１５ｍｇ／ｍＬであった。０．０１５ｍｇ／ｍＬより低い濃度では、全体として、コラーゲン溶解度に対する用量反応性が明確であった。０．０１５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度では、効果的なコラーゲン溶解度は、合計用量または製剤濃度よりも、投与容量に対する関係が大きかった。
【0040】
コラーゲン溶解は、常に、いくつかの二次的変化を伴った。これらの変化には、全有効量レベルで常に認められた出血および／または急性炎症；０．００３ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で肉様層の筋繊維の壊死（合計用量≧０．０００６ｍｇタンパク質）；血管周囲および壁内浮腫、血管新生／線維症、血管壊死、および／または０．００９ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で散発的に認められる血栓症（合計用量≧０．００１８ｍｇタンパク質）；および０．０３０ｍｇ／ｍＬ以上の製剤濃度で散発的に認められる動脈壁内出血（合計用量≧０．００３ｍｇタンパク質）が含まれていた。脂肪細胞、神経、付属器構造または被覆表皮に対するコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム媒介効果は認められなかった。
【0041】
この試験の結果は、全コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム用量濃度で皮膚隔壁のある程度の組織学的に検出可能なコラーゲン溶解を示した。しかし、０．０１５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で、より多くの皮膚隔壁の完全溶解領域が認められた。この試験では、脂肪細胞、神経、付属器皮膚構造または被覆表皮に対しコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム媒介効果は無かった。各濃度でのコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムの局所効果（出血および／または急性炎症）が、死体解剖時の肉眼および／または顕微鏡調査で観察された。コラーゲンの推定溶解度に関し、性別間、または投薬後２４または４８時間で安楽死させた動物間でコラーゲン溶解性に一貫した差異は認められなかった。
【0042】
皮膚隔壁の完全溶解に有効な濃度で、用量および容量依存性コラーゲン溶解が約２．５ｃｍの直径内で発生することがミニブタ試験により示された。
【0043】
実施例２：ＥＦＰ治療のための第１ｂ相非盲検用量漸増および薬物動態学的試験
この試験の目的は、８０ｃｍ２の領域における、０．００２９ｍｇ～０．１１６ｍｇ（５０～２０００ＡＢＣ単位）の範囲の漸増合計用量、および０．００２９ｍｇ／ｍＬ～０．１１６ｍｇ／ｍＬ（５０～２０００ＡＢＣ単位／ｍＬ）の範囲の漸増濃度でのコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムのＥＦＰによる成人女性の治療に対する安全性、有効性、薬物動態学、および免疫原性を評価することである。
この試験の目的は、８０ｃｍ２の領域における、０．００２９ｍｇ～０．１１６ｍｇ（５０～２０００ＡＢＣ単位）の範囲の漸増合計用量、および０．００２９ｍｇ／ｍＬ～０．１１６ｍｇ／ｍＬ（５０～２０００ＡＢＣ単位／ｍＬ）の範囲の漸増濃度でのコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムのＥＦＰによる成人女性の治療に対する安全性、有効性、薬物動態学、および免疫原性を評価することである。
【0044】
ミニブタ試験（実施例１）に関し上記で考察した知見に基づいて、注射間で約２．５ｃｍの距離を許容するように第１相臨床試験用の注射テンプレートが設計される。この距離により、治療領域内での大きなギャップまたはオーバーラップなしに、ＥＦＰの８ｃｍｘ１０ｃｍ領域内でコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムの適切な分布および作用を可能とすることが期待される。ＥＦＰ治療用の最適用量（例えば、最低限の局所有害作用で効果的な）を決定するために、臨床的開発および診療ならびにミニブタ試験由来のデータの両方に基づき、今日までコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムの好ましい安全性プロファイルの考察の後で、用量選択を行った。結果として、１０回の別々の０．０００２９ｍｇ用量により、８ｃｍｘ１０ｃｍ標的ＥＦＰ領域内に０．００２９ｍｇ／ｍＬの濃度で投与される０．００２９ｍｇの出発用量が相１試験に対し提案される。
【0045】
この試験は、第ｌｂ相、非盲検、用量漸増および薬物動態学的試験である。選別来院中、被験者が立位のままで、試験責任医師または有資格被指名人が、左および右殿部ならびに左および右大腿部を検査し、中等度の重度ＥＦＰ重症度を表す１０以上の写真による数値化ＥＦＰ重症度スケール（ＣＳＳ）スコアの（Ｈｅｘｓｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００９）四分円を選択する。試験責任医師または有資格被指名人が、少なくとも８ｃｍｘ１０ｃｍ（すなわち、標的ＥＦＰ領域）で、治療に適する選択四分円内のＥＦＰ領域（すなわち、大腿部の外側上面または殿部内にあり、殿溝を含まない領域）を特定する。標的ＥＦＰ領域は、被験者が立位にあるとき、皮膚を挟むまたは筋肉収縮をさせるなどの何らかの操作をすることなく、目視で判断できなければならない。各被験者は、１日目の試験薬剤の注射の前に、試験適格性の観点から、２１日以内に、選別される。
【0046】
この試験では、６３被験者が、標的ＥＦＰ領域内にそれぞれ１０回の同時等容量のコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム注射を受けることになる。試験適格性選別の完了後、被験者は、コホート１、２、３、および４（表３）に順次割り付けられる。最初の９人の被験者は、コホート１（１ｍＬ全容量／標的ＥＦＰ領域）に割り付けられる。残りのコホート２～４のそれぞれに対し、各コホートの最初の９人の被験者は、５ｍＬ全容量／標的ＥＦＰ領域に割り付けられ、続いて、次の９人の被験者は、１ｍＬ全容量／標的ＥＦＰ領域に割り付けられる。投薬は、コホート１から開始する。コホート２と３での投薬は、安全性モニタリング委員会（ＳＭＣ）によるコホート１の被験者の安全性の評価が完了するまで開始されない。コホート４の投薬は、ＳＭＣによるコホート２と３の被験者の安全性評価が完了するまで開始されない。
【0047】
８ｃｍｘ１０ｃｍのＥＦＰ領域の治療に提案された用量は、デュピュイトラン拘縮用認可製品で使われる濃度の０．１％（０．００２９ｍｇ／ｍＬ）～５％（０．１１６ｍｇ／ｍＬ）の濃度で、デュピュイトラン拘縮用単回注射で使われる用量の０．５％（０．００２９ｍｇ）～２０％（０．１１６ｍｇ）である。
【表3】
【0048】
コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムの成分は、混合コラゲナーゼＡＵＸ－ＩおよびＡＵＸ－ＩＩ、１０ｍＭトリス、６０ｍＭショ糖、である。再構成用コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム無菌希釈剤Ａの成分は、０．９％（１５４ｍＭ）塩化ナトリウム（ＮａＣL）溶液中０．０３％（２ｍＭ）塩化カルシウム（ＣａＣL）、ｐＨ６．０～７．０、で、最終無菌化液として３．０ｍＬ／バイアルで供給される。追加希釈用無菌コラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム緩衝無菌希釈剤Ｂの成分は、０．０３％（２ｍＭ）塩化カルシウムおよび０．９％（１５４ｍＭ）塩化ナトリウム中の０．１２％（１０ｍＭ）トロメタミン（トリス）、ｐＨ８．０塩化物で、最終無菌化液として３．０ｍＬ／バイアルで供給される。希釈剤Ａによる再構成、および希釈剤Ｂによる追加希釈後、Ａ４５００溶液は、投与前１時間まで室温（２０°～２５℃／６８°～７７°Ｆ）で保持、または投与前４時間まで２°～８℃（３６°～４６°Ｆ）で冷蔵できる。
【0049】
注射テンプレートが薄い透明材料で作られる。８ｃｍｘ１０ｃｍ注射テンプレートには、図１に示す線図および注射部位が予め印刷される。八角形内のそれぞれの黒色ドットは、注射部位を示す。丸で囲んだ「Ｘ」は、中央のくぼみ（すなわち、標的領域（図１）中の最も深い陥凹部の領域）の注射部位を表す。それぞれの黒色ドット（中央のくぼみおよび４つのコーナーの部位を含む）は、試験責任医師が必要に応じ、標的ＥＦＰ領域をマークできるように切り抜かれている。図１の八角形内のそれぞれのドットは、注射部位を表す。円内のＸは、「中央のくぼみ」に対する注射部位を表す。４つのコーナーは、右上（ＵＲ）、右下（ＬＲ）、左上（ＵＬ）、および左下（ＬＬ）と標識される。
【0050】
選別来院中、被験者が立位のままで、試験責任医師または有資格被指名人は、左と右殿部および左と右上後大腿部を検査し、重度ＥＦＰに対する中程度の（ＣＳＳスコアが１０以上）四分円を選択する。試験責任医師または有資格被指名人は、少なくとも８ｃｍｘ１０ｃｍの治療に適した（例えば、上後大腿部または殿部内で、殿溝を含まない）選択四分円内のＥＦＰ領域（この実施例では、標的ＥＦＰ領域と呼ぶ）を特定する。また、標的ＥＦＰ領域は、何らかの操作（皮膚を挟むまたは筋肉収縮をさせるなどの）をすることなく、被験者が立位のときに、目視で判断できなければならない。
【0051】
その後、試験責任医師は、注射テンプレートを標的ＥＦＰ領域の上に置き（被験者は立位のままで）、テンプレートの丸で囲んだ「Ｘ」を、標的領域内の最大深さの陥凹部（例えば、中央のくぼみ）の中心に重ねて置く。試験責任医師は、サージカルマーカーを使って、被験者の皮膚にテンプレートの２つのコーナー位置をマークする。試験責任医師は、テンプレートを取り除き、どの２つのテンプレートのコーナーがマークされたかを記録する（例えば、右上、右下、左上、左下）。試験責任医師は、巻尺を使って下記のように測定する：
１．膝窩の中心から始まる上大腿部および殿部の正中線を特定する（図２）。
２．正中線に垂直で、第１のテンプレートコーナーマークを通る線を特定する（図２の［線ＢＣ］で示されるような）。点ＢとＣの間の距離を測定する（距離を記録する）。
３．図２で示されるように点Ａ～点Ｂの距離を測定する（距離を記録する）。
４．ステップ２と３を繰り返し、第２のテンプレートコーナーマーク（図２の［点Ａ、Ｄ、およびＥ］）の測定を行う。
それぞれの記録測定値は、注射前、および各効力評価時点の前に、８ｃｍｘ１０ｃｍ標的ＥＦＰ領域を再配置するのに使用される。
１．膝窩の中心から始まる上大腿部および殿部の正中線を特定する（図２）。
２．正中線に垂直で、第１のテンプレートコーナーマークを通る線を特定する（図２の［線ＢＣ］で示されるような）。点ＢとＣの間の距離を測定する（距離を記録する）。
３．図２で示されるように点Ａ～点Ｂの距離を測定する（距離を記録する）。
４．ステップ２と３を繰り返し、第２のテンプレートコーナーマーク（図２の［点Ａ、Ｄ、およびＥ］）の測定を行う。
それぞれの記録測定値は、注射前、および各効力評価時点の前に、８ｃｍｘ１０ｃｍ標的ＥＦＰ領域を再配置するのに使用される。
【0052】
注射後１日目に、部位を特定、マーク（上述のように）、写真撮影、および注射前効力評価を完了し、被験者は、前にマークした注射部位を備えた８ｃｍｘ１０ｃｍ標的ＥＦＰ領域全体が目視でき、試験責任医師が評価できるように、診察台上で腹臥位に配置される。注射部位領域には、アルコールなどの適切な消毒薬を使って準備がなされる。
【0053】
前に調製した３０ゲージ１／４インチ針を備えた５ｍＬまたは１ｍＬシリンジ（コホートの割付けに応じて）を使って、試験責任医師は、０．５ｍＬまたは０．１ｍＬの用量のコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクムを、１０箇所の注射部位のそれぞれに投与する。１０箇所の部位のそれぞれで、試験薬剤を、被験者の皮膚に垂直に、１／４インチ（約７ｍｍ）の深さまで注入する。
【0054】
試験責任医師は、それぞれの１０箇所の部位が、単回０．５ｍＬまたは０．１ｍＬコラゲナーゼクロストリジウム・ヒストリチクム注射を確実に受けられる手順で試験薬剤を投与する。１０箇所目の注射後、最大許容容量の試験薬剤が投与されたことになる（５ｍＬまたは１ｍＬ）。注射後の注射部位表面のいずれの注入液（溢血を示唆する）にも注意して、関連注射部位を記録する。試験薬剤の注射後、局部マッサージまたは触診を行ってはいけない。
【0055】
９０日目に以下の主要エンドポイントが評価される。
・試験責任医師による標的ＥＦＰ領域の全体的美的改善スケール評価；
・被験者による標的ＥＦＰ領域の全体的美的改善スケール評価；および
・３－Ｄデジタル写真に基づく標的ＥＦＰ領域の表面のでこぼこの標準偏差のベースラインからの３０％以上の改善が得られた被験者の比率に基づくレスポンダー分析
・試験責任医師による標的ＥＦＰ領域の全体的美的改善スケール評価；
・被験者による標的ＥＦＰ領域の全体的美的改善スケール評価；および
・３－Ｄデジタル写真に基づく標的ＥＦＰ領域の表面のでこぼこの標準偏差のベースラインからの３０％以上の改善が得られた被験者の比率に基づくレスポンダー分析
【0056】
本発明は、その好ましい実施形態に言及しながら詳細に示され、説明されてきたが、当業者には、添付請求項に包含される本発明の範囲を逸脱することなく形態と詳細の種々の変更が可能であることが理解されよう。
【0057】
本願は以下の発明をも包含する。
（１）
少なくとも１回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域に投与することを含む患者の結合組織の線維症（ＥＦＰ）を治療または低減する方法であって、１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が約５～約２００ＡＢＣ単位である、方法。
（２）
複数回の皮下注射が、複数箇所の注射部位に投与される（１）に記載の方法。
（３）
前記投与されるコラゲナーゼの濃度が、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルである、（１）に記載の方法。
（４）
各コラゲナーゼ注射が、約０．５ｍｌ以下の容量で投与される、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
前記投与されるコラゲナーゼの合計用量が、約５～約２０００ＡＢＣ単位である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
前記１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５～約１００ＡＢＣ単位である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
前記１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５～約５０ＡＢＣ単位である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（８）
前記コラゲナーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクムから精製される、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）
前記コラゲナーゼが、組換え型コラゲナーゼである、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）
前記クロストリジウム・ヒストリチクムから精製されたコラゲナーゼが、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む、（８）に記載の方法。
（１１）
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、１：１の質量比で存在する、（５）に記載の方法。
（１２）
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なキャリアーから基本的に構成される医薬組成物中に存在する、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１３）
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なキャリアーから構成される医薬組成物中に存在する、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１４）
前記方法が、１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射を投与することから基本的に構成される、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１５）
前記方法が、１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射を投与することから構成される（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１６）
少なくとも２回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の２箇所の注射部位に投与される、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１７）
少なくとも５回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の５箇所の注射部位に投与される、（１６）記載の方法。
（１８）
少なくとも１０回のコラゲナーゼ注射が、前記患部の１０箇所の注射部位に投与される、（１７）記載の方法。
（１９）
前記ＥＦＰ患部が、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２の面積を有する、（１）～（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）
複数のコラゲナーゼ皮下注射が投与され、注射部位間の距離が少なくとも約１～約４ｃｍである、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（２１）
前記注射部位間の距離が、約２～約３ｃｍである、（２０）に記載の方法。
（２２）
前記ＥＦＰ罹患領域が約１０ｃｍの長さと約８ｃｍの幅を有する、（１９）に記載の方法。
（２３）
注射部位間に約２．５ｃｍの距離が存在する、（２２）に記載の方法。
（２４）
各注射が、約０．５ｍｌの容量である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（２５）
各注射が、約０．１ｍｌの容量である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（２６）
１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域内に投与することを含む患者のＥＦＰを治療または低減する方法であって、前記患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量が約５～約５０００ＡＢＣ単位であり、前記複数回の注射がそれぞれ約５～約２００ＡＢＣ単位であり、前記複数回の注射が複数箇所の注射部位に投与される、方法。
（２７）
複数回のコラゲナーゼ皮下注射が、複数箇所の注射部位に投与される、（２６）に記載の方法。
（２８）
前記投与されるコラゲナーゼの濃度が、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルである、（２６）および（２７）のいずれかに記載の方法。
（２９）
各コラゲナーゼ注射が、約０．５ｍｌ以下の容量で投与される（２５）～（２８）のいずれかに記載の方法。
（３０）
前記１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５～約２００ＡＢＣ単位である、（２５）～（２９）のいずれかに記載の方法。
（３１）
前記患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量が、約５～約２０００ＡＢＣ単位である、（２５）～（３０）のいずれかに記載の方法。
（３２）
前記患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量が、約５～約１０００ＡＢＣ単位である、（３１）に記載の方法。
（３３）
前記コラゲナーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクムから精製される、（２６）～（３２）のいずれかに記載の方法。
（３４）
前記コラゲナーゼが、組換え型コラゲナーゼである、（２６）～（３２）のいずれかに記載の方法。
（３５）
前記クロストリジウム・ヒストリチクムから精製されたコラゲナーゼが、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む、（３３）に記載の方法。
（３６）
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、１：１の質量比で存在する、（３５）に記載の方法。
（３７）
少なくとも２回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の２箇所の注射部位に投与される、（２６）～（３２）のいずれかに記載の方法。
（３８）
少なくとも５回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の５箇所の注射部位に投与される、（３７）に記載の方法。
（３９）
少なくとも１０回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の１０箇所の注射部位に投与される、（３８）に記載の方法。
（４０）
１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域に投与することを含む患者のＥＦＰを治療または低減する方法であって、１回の注射当たり前記患部に投与されるコラゲナーゼの前記用量が、約５～約２００ＡＢＣ単位で、前記患部に投与されるコラゲナーゼの濃度が約５０～２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルであり、前記複数回の注射が複数箇所の注射部位に投与される、方法。
（４１）
前記複数回の注射が、複数箇所の注射部位に投与される、（４０）に記載の方法。
（４２）
投与コラゲナーゼ注射のそれぞれの前記容量が、約０．５ｍｌ以下である、（４０）および（４１）のいずれかに記載の方法。
（４３）
それぞれの注射が約０．２ｍｌ以下の容量である、（４０）～（４２）のいずれかに記載の方法。
（１）
少なくとも１回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域に投与することを含む患者の結合組織の線維症（ＥＦＰ）を治療または低減する方法であって、１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が約５～約２００ＡＢＣ単位である、方法。
（２）
複数回の皮下注射が、複数箇所の注射部位に投与される（１）に記載の方法。
（３）
前記投与されるコラゲナーゼの濃度が、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルである、（１）に記載の方法。
（４）
各コラゲナーゼ注射が、約０．５ｍｌ以下の容量で投与される、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
前記投与されるコラゲナーゼの合計用量が、約５～約２０００ＡＢＣ単位である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
前記１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５～約１００ＡＢＣ単位である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
前記１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５～約５０ＡＢＣ単位である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（８）
前記コラゲナーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクムから精製される、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）
前記コラゲナーゼが、組換え型コラゲナーゼである、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）
前記クロストリジウム・ヒストリチクムから精製されたコラゲナーゼが、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む、（８）に記載の方法。
（１１）
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、１：１の質量比で存在する、（５）に記載の方法。
（１２）
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なキャリアーから基本的に構成される医薬組成物中に存在する、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１３）
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼおよび薬学的に許容可能なキャリアーから構成される医薬組成物中に存在する、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１４）
前記方法が、１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射を投与することから基本的に構成される、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１５）
前記方法が、１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射を投与することから構成される（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１６）
少なくとも２回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の２箇所の注射部位に投与される、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１７）
少なくとも５回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の５箇所の注射部位に投与される、（１６）記載の方法。
（１８）
少なくとも１０回のコラゲナーゼ注射が、前記患部の１０箇所の注射部位に投与される、（１７）記載の方法。
（１９）
前記ＥＦＰ患部が、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２の面積を有する、（１）～（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）
複数のコラゲナーゼ皮下注射が投与され、注射部位間の距離が少なくとも約１～約４ｃｍである、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（２１）
前記注射部位間の距離が、約２～約３ｃｍである、（２０）に記載の方法。
（２２）
前記ＥＦＰ罹患領域が約１０ｃｍの長さと約８ｃｍの幅を有する、（１９）に記載の方法。
（２３）
注射部位間に約２．５ｃｍの距離が存在する、（２２）に記載の方法。
（２４）
各注射が、約０．５ｍｌの容量である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（２５）
各注射が、約０．１ｍｌの容量である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（２６）
１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域内に投与することを含む患者のＥＦＰを治療または低減する方法であって、前記患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量が約５～約５０００ＡＢＣ単位であり、前記複数回の注射がそれぞれ約５～約２００ＡＢＣ単位であり、前記複数回の注射が複数箇所の注射部位に投与される、方法。
（２７）
複数回のコラゲナーゼ皮下注射が、複数箇所の注射部位に投与される、（２６）に記載の方法。
（２８）
前記投与されるコラゲナーゼの濃度が、約５０～約２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルである、（２６）および（２７）のいずれかに記載の方法。
（２９）
各コラゲナーゼ注射が、約０．５ｍｌ以下の容量で投与される（２５）～（２８）のいずれかに記載の方法。
（３０）
前記１回の注射当たりのコラゲナーゼの用量が、約５～約２００ＡＢＣ単位である、（２５）～（２９）のいずれかに記載の方法。
（３１）
前記患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量が、約５～約２０００ＡＢＣ単位である、（２５）～（３０）のいずれかに記載の方法。
（３２）
前記患部に投与されるコラゲナーゼの合計用量が、約５～約１０００ＡＢＣ単位である、（３１）に記載の方法。
（３３）
前記コラゲナーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクムから精製される、（２６）～（３２）のいずれかに記載の方法。
（３４）
前記コラゲナーゼが、組換え型コラゲナーゼである、（２６）～（３２）のいずれかに記載の方法。
（３５）
前記クロストリジウム・ヒストリチクムから精製されたコラゲナーゼが、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む、（３３）に記載の方法。
（３６）
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、１：１の質量比で存在する、（３５）に記載の方法。
（３７）
少なくとも２回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の２箇所の注射部位に投与される、（２６）～（３２）のいずれかに記載の方法。
（３８）
少なくとも５回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の５箇所の注射部位に投与される、（３７）に記載の方法。
（３９）
少なくとも１０回のコラゲナーゼ注射が、前記患部内の１０箇所の注射部位に投与される、（３８）に記載の方法。
（４０）
１回または複数回のコラゲナーゼ皮下注射をＥＦＰ罹患領域に投与することを含む患者のＥＦＰを治療または低減する方法であって、１回の注射当たり前記患部に投与されるコラゲナーゼの前記用量が、約５～約２００ＡＢＣ単位で、前記患部に投与されるコラゲナーゼの濃度が約５０～２０００ＡＢＣ単位／ミリリットルであり、前記複数回の注射が複数箇所の注射部位に投与される、方法。
（４１）
前記複数回の注射が、複数箇所の注射部位に投与される、（４０）に記載の方法。
（４２）
投与コラゲナーゼ注射のそれぞれの前記容量が、約０．５ｍｌ以下である、（４０）および（４１）のいずれかに記載の方法。
（４３）
それぞれの注射が約０．２ｍｌ以下の容量である、（４０）～（４２）のいずれかに記載の方法。
【図1】
【図2】
【手続補正書】
【提出日】2022-07-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者の結合組織の線維症（ＥＦＰ）を低減する方法に用いられる医薬組成物であって、前記医薬組成物は、唯一の活性成分としてコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを１：１の質量比で含み、前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは逆相高速液体クロマトグラフィーで測定した面積で少なくとも約９５％の純度を有し、前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが０．５８ミリグラム当たり１０，０００ＡＢＣ単位の特異的活性を有し、前記方法は、前記医薬組成物を準備し、約１０ｃｍの長さと約８ｃｍの幅を有する線維症（ＥＦＰ）罹患領域に前記医薬組成物を複数回の同時皮下注射により投与することを含み、１回の注射当たりのコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの用量が約０．０００２９～約０．０１１６ミリグラムであり、複数回の同時皮下注射により投与されるコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの合計用量が、約０．０００２９～約０．１１６ミリグラムであり、注射部位間の距離が少なくとも約１～約４ｃｍである、医薬組成物。
【請求項2】
複数回の皮下注射が、複数箇所の注射部位に投与される請求項１に記載の医薬組成物。。
【請求項3】
前記投与されるコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの濃度が、約０．００２９～約０．１１６ミリグラム／ミリリットルである、、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
各皮下注射が、約０．５ｍｌ以下の容量で投与される、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
１回の皮下注射当たりのコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの用量が、約０．０００２９～約０．００５８ミリグラムである、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
１回の皮下注射当たりのコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの用量が、約０．０００２９～約０．００２９ミリグラムである、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、クロストリジウム・ヒストリチクムから精製される、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、組換え型コラゲナーゼＩおよび組換え型コラゲナーゼＩＩである、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
少なくとも２回の前記医薬組成物の皮下注射が、患部内の２箇所の注射部位に投与される、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
少なくとも５回の前記医薬組成物の皮下が、患部内の５箇所の注射部位に投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
少なくとも１０回の前記医薬組成物の皮下注射が、患部内の１０箇所の注射部位に投与される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記注射部位間の距離が、約２ｃｍ～約３ｃｍである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
注射部位間に約２．５ｃｍの距離が存在する、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
各皮下注射が、約０．５ｍｌの容量である、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
各皮下注射が、約０．１ｍｌの容量である、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。