知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022123166
(43)【公開日】2022-08-24
(54)【発明の名称】フィラグリン増量剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/12 20060101AFI20220817BHJP
A61K 36/062 20060101ALI20220817BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20220817BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20220817BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220817BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220817BHJP
A61K 8/99 20170101ALI20220817BHJP
【ＦＩ】
A61K38/12
A61K36/062
A61K8/64
A61Q19/08
A61P43/00 105
A61P17/00
A61K8/99
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021020301
(22)【出願日】2021-02-11
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000165251
【氏名又は名称】月桂冠株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100118382
【弁理士】
【氏名又は名称】多田 央子
(74)【代理人】
【識別番号】100094477
【弁理士】
【氏名又は名称】神野 直美
(74)【代理人】
【識別番号】100078813
【弁理士】
【氏名又は名称】上代 哲司
(72)【発明者】
【氏名】戸所 健彦
(72)【発明者】
【氏名】石田 博樹
【テーマコード（参考）】
4C083
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C083AA031
4C083AD411
4C083BB51
4C083CC03
4C083EE12
4C083EE13
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA17
4C084BA24
4C084CA05
4C084CA59
4C084MA63
4C084NA14
4C084ZA89
4C084ZB21
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC11
4C087CA16
4C087MA63
4C087NA14
4C087ZA89
4C087ZB21
(57)【要約】
【課題】デフェリフェリクリシンの新たな用途を提供する。
【解決手段】デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンが表皮細胞の分化ないしは成熟化を促進するタンパク質の生産量を増大させることが示された。従って、デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンは、化粧料などの保湿剤の有効成分として好適に使用できる。保湿剤中のデフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンの含有量は、０．００１～１００重量％とすることができる。
【選択図】なし
【解決手段】デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンが表皮細胞の分化ないしは成熟化を促進するタンパク質の生産量を増大させることが示された。従って、デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンは、化粧料などの保湿剤の有効成分として好適に使用できる。保湿剤中のデフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンの含有量は、０．００１～１００重量％とすることができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンを含むフィラグリン増量剤。
【請求項2】
デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンが、麹菌の培養物、麹菌の培養物から精製したもの、化学合成品、又は酵素合成品の形態で含まれる、請求項１に記載のフィラグリン増量剤。
【請求項3】
デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンを含むフィラグリン増量用外用組成物。
【請求項4】
デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンが、麹菌の培養物、麹菌の培養物から精製したもの、化学合成品、又は酵素合成品の形態で含まれる、請求項３に記載のフィラグリン増量用外用組成物。
【請求項5】
デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンの含有量が、外用組成物の全量に対して、１×１０－８～１００重量％である、請求項３又は４に記載のフィラグリン増量用外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、清酒成分を含有する安全なフィラグリン増量剤、及びフィラグリン増量用外用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
デフェリフェリクリシン（以下、「Ｄｆｃｙ」と略称することがある）は、３価鉄イオン（Ｆｅ３＋）をキレートする化合物であるシデロフォアの１種であり、下記構造を有する。
Ｄｆｃｙは様々な生物が生産するが、麹菌であるアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）が生産するＤｆｃｙは、清酒の着色物質として見出され、それが米麹由来であることが知られている。また、ごく微量の鉄イオンが存在すると麹菌はＤｆｃｙを全く生産しなくなることも知られており、一般的な米麹、清酒、麹菌液体培養物などにはほとんど含まれない。従って、このＤｆｃｙについては、それほど多くの研究はなされてはいない。
【化1】
【0003】
例えば、特許文献１は、Ｄｆｃｙが、皮膚のメラノーマからのメラニン生産を抑制する活性を有することから、美白用の化粧料の成分として有用であることを開示している。
また、特許文献２は、Ｄｆｃｙを経口投与すると、筋肉中の鉄イオン量が増大し、筋肉の持久力が向上するため、Ｄｆｃｙは、筋肉疲労を改善させるための健康食品の成分として有用であることを開示している。
また、特許文献３は、Ｄｆｃｙを経口投与すると、小腸及び大腸の粘膜の炎症を改善することから、Ｄｆｃｙは、炎症性腸疾患の治療薬の有効成分として有用であることを開示している。
また、特許文献４は、Ｄｆｃｙを経口投与すると、血中尿酸濃度が低減することから、Ｄｆｃｙは、高尿酸血症や通風の治療薬の有効成分として有用であることを開示している。
また、特許文献２は、Ｄｆｃｙを経口投与すると、筋肉中の鉄イオン量が増大し、筋肉の持久力が向上するため、Ｄｆｃｙは、筋肉疲労を改善させるための健康食品の成分として有用であることを開示している。
また、特許文献３は、Ｄｆｃｙを経口投与すると、小腸及び大腸の粘膜の炎症を改善することから、Ｄｆｃｙは、炎症性腸疾患の治療薬の有効成分として有用であることを開示している。
また、特許文献４は、Ｄｆｃｙを経口投与すると、血中尿酸濃度が低減することから、Ｄｆｃｙは、高尿酸血症や通風の治療薬の有効成分として有用であることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１２－１２６６８４号
【特許文献2】特開２００７－９１７１１号
【特許文献3】特開２０１２－１６２５６６号
【特許文献4】特開２０１６－１５５７７３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、Ｄｆｃｙの新たな用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は上記課題を解決するために研究を重ね、Ｄｆｃｙをヒト正常表皮細胞に作用させると、この細胞におけるフィラグリンの生成量が増大することを見出した。
【0007】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記〔１〕～〔５〕を提供する。
〔１〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンを含むフィラグリン増量剤。
〔２〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンが、麹菌の培養物、麹菌の培養物から精製したもの、化学合成品、又は酵素合成品の形態で含まれる、〔１〕に記載のフィラグリン増量剤。
〔３〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンを含むフィラグリン増量用外用組成物。
〔４〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンが、麹菌の培養物、麹菌の培養物から精製したもの、化学合成品、又は酵素合成品の形態で含まれる、〔３〕に記載のフィラグリン増量用外用組成物。
〔５〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンの含有量が、外用組成物の全量に対して、１×１０－８～１００重量％である、〔３〕又は〔４〕に記載のフィラグリン増量用外用組成物。
〔１〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンを含むフィラグリン増量剤。
〔２〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンが、麹菌の培養物、麹菌の培養物から精製したもの、化学合成品、又は酵素合成品の形態で含まれる、〔１〕に記載のフィラグリン増量剤。
〔３〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンを含むフィラグリン増量用外用組成物。
〔４〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンが、麹菌の培養物、麹菌の培養物から精製したもの、化学合成品、又は酵素合成品の形態で含まれる、〔３〕に記載のフィラグリン増量用外用組成物。
〔５〕 デフェリフェリクリシン及び／又はフェリクリシンの含有量が、外用組成物の全量に対して、１×１０－８～１００重量％である、〔３〕又は〔４〕に記載のフィラグリン増量用外用組成物。
【発明の効果】
【0008】
表皮は、体外環境に対するバリア機能を有し、体外環境からの異物の侵入を防ぐと共に、体内からの水分の蒸散を防いでいる。
バリア機能は、細胞間に存在する脂質多重層構造とこれを支える表皮細胞が担っている。また、表皮細胞内で生成される天然保湿成分（ＮＭＦ）は、皮膚に水分を保持するのに必須の成分である。
バリア機能は、細胞間に存在する脂質多重層構造とこれを支える表皮細胞が担っている。また、表皮細胞内で生成される天然保湿成分（ＮＭＦ）は、皮膚に水分を保持するのに必須の成分である。
【0009】
ヒトの表皮は、表皮角化細胞の多数層が積層した細胞層により形成されている。この細胞層は、内側の真皮側から、さかんに増殖する小型細胞からなる基底細胞層、有棘細胞層、顆粒細胞層、角質化した扁平な細胞からなる角質細胞層（角層細胞層ともいう）からなる。基底細胞層で分裂した細胞は、体表側に向かって移動すると共に、分化（角化）していく。角質細胞層に達して表皮細胞として最終分化を完了した細胞は、体表面の被覆・保護という表皮の重要な役割を果たし、やがて体表面から剥離する。正常な表皮では、これらの増殖と分化の過程が厳密に制御され、滞りなく進行することによって恒常性が維持されている（組織培養研究 第7巻第2号 1989年, 49-58頁）。
【0010】
角質細胞は、主に、ケラチン繊維束とそれを埋めるフィラグリンからなっている。ケラチンは、等電点と分子量により分類された複数種が存在する。角質細胞には、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ５、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｋ１４が発現している（組織培養研究 第7巻第2号 1989年, 49-58頁）。
フィラグリンは、フィラグリンが１０～１２個つながった前駆物質であって顆粒細胞層に蓄えられたプロフィラグリンが、角化と共に分解して生成し、ケラチンと重合して、ケラチンパターンと呼ばれる角質細胞の内部骨格を形成している。
フィラグリンが表皮の最上層に近づくと、フィラグリン分子中のアルギニンが、ペプチジルアルギニンデイミナーゼにより脱イミノ化されることにより、ケラチンと遊離し、タンパク質分解酵素の作用を受け易くなる。最終的にこれがアミノ酸レベルまで分解されて天然保湿成分（ＮＭＦ）が生成する。フィラグリンは、カスパーゼ－１４、カルパインＩにより順次分解され、最終的に、ブレオマイシン水解酵素によりアミノ酸レベルに分解される（J.Soc.Cosmet.Chem.Jpn. 47(3）216-220 (2013)）。
また、角質細胞の細胞膜に相当するユーニファイド・セルエンベロープは、トランスグルタミナーゼの作用で、インボルクリン、ロリクリン、エラフィン、スモールプロリンリッチプロテインなどが結合した不溶化タンパク質膜と、その外側のセラミド層からなる（Drug Delivery system 22-4, 2007, 424-432）。また、ユーニファイド・セルエンベロープには、ＣＳＴＡ、ＳＰＲＲ１Ｂなどのタンパク質も存在する。
フィラグリンは、フィラグリンが１０～１２個つながった前駆物質であって顆粒細胞層に蓄えられたプロフィラグリンが、角化と共に分解して生成し、ケラチンと重合して、ケラチンパターンと呼ばれる角質細胞の内部骨格を形成している。
フィラグリンが表皮の最上層に近づくと、フィラグリン分子中のアルギニンが、ペプチジルアルギニンデイミナーゼにより脱イミノ化されることにより、ケラチンと遊離し、タンパク質分解酵素の作用を受け易くなる。最終的にこれがアミノ酸レベルまで分解されて天然保湿成分（ＮＭＦ）が生成する。フィラグリンは、カスパーゼ－１４、カルパインＩにより順次分解され、最終的に、ブレオマイシン水解酵素によりアミノ酸レベルに分解される（J.Soc.Cosmet.Chem.Jpn. 47(3）216-220 (2013)）。
また、角質細胞の細胞膜に相当するユーニファイド・セルエンベロープは、トランスグルタミナーゼの作用で、インボルクリン、ロリクリン、エラフィン、スモールプロリンリッチプロテインなどが結合した不溶化タンパク質膜と、その外側のセラミド層からなる（Drug Delivery system 22-4, 2007, 424-432）。また、ユーニファイド・セルエンベロープには、ＣＳＴＡ、ＳＰＲＲ１Ｂなどのタンパク質も存在する。
【0011】
また、前述した、角質細胞間に存在する脂質多重層構造として、セラミドからなるラメラ構造があり、この構造が角質層を保持し、保湿やバリア機能を担っていることが知られている。
顆粒細胞層においては、隣り合う角質細胞を結合させる役割をタイトジャンクションというタンパク質が担っており、このタンパク質が減少すると、角質のフィラグリンやセラミドが減り、結果的に保湿やバリア機能が低下することが知られている。
顆粒細胞層においては、隣り合う角質細胞を結合させる役割をタイトジャンクションというタンパク質が担っており、このタンパク質が減少すると、角質のフィラグリンやセラミドが減り、結果的に保湿やバリア機能が低下することが知られている。
【0012】
角質細胞の生成及び維持に関与するこれらのタンパク質の生成量が低下すると、角質細胞に異常が生じたり、角質細胞数が少なくなったりして、表皮のバリア機能が損なわれる。そこで、一般に、保湿性や表皮のバリア機能向上作用を有する化粧品には、上記タンパク質を網羅的に生産向上させるような有効成分が配合されている。
他方、Ｄｆｃｙは、ヒト表皮細胞に作用して、角質細胞の内部骨格を形成するフィラグリンの生成量を優先的に増大させる。従って、Ｄｆｃｙは、表皮のバリア機能改善に寄与し、また、他の有効成分と併用することで、より効果的に表皮のバリア機能を維持し、また損なわれたバリア機能を正常化することができる。
他方、Ｄｆｃｙは、ヒト表皮細胞に作用して、角質細胞の内部骨格を形成するフィラグリンの生成量を優先的に増大させる。従って、Ｄｆｃｙは、表皮のバリア機能改善に寄与し、また、他の有効成分と併用することで、より効果的に表皮のバリア機能を維持し、また損なわれたバリア機能を正常化することができる。
【0013】
また、Ｄｆｃｙは、清酒やもろみの成分として人類が古くから摂取してきたものであり、誤って口に入ったり、経皮吸収されたりしても問題はなく、高い安全性を有する。
【0014】
近年のウイルス感染症の増加に伴い、手指をアルコールなどの消毒剤で消毒したり、界面活性剤を含む洗浄剤で洗浄したりする機会が増えており、これが表皮細胞にダメージを与える。本発明のフィラグリン増量剤を使用すれば、このような消毒ないしは洗浄による表皮のダメージを防止し、改善することができる。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）フィラグリン増量剤
本発明のフィラグリン増量剤は、デフェリフェリクリシン（Ｄｆｃｙ）及び／又はフェリクリシン（Ｆｃｙ）を含み、特に、これらを有効成分として含むことができる。
Ｆｃｙは、Ｄｆｃｙが鉄イオンをキレートしたものである。水を含む環境中にはほとんどの場合鉄が存在する。Ｄｆｃｙは、製剤に配合する場合にその中に混在する鉄イオンや、皮膚上に存在する鉄イオンによってＦｃｙになるが、Ｆｃｙになってもその活性は阻害されない。
（１）フィラグリン増量剤
本発明のフィラグリン増量剤は、デフェリフェリクリシン（Ｄｆｃｙ）及び／又はフェリクリシン（Ｆｃｙ）を含み、特に、これらを有効成分として含むことができる。
Ｆｃｙは、Ｄｆｃｙが鉄イオンをキレートしたものである。水を含む環境中にはほとんどの場合鉄が存在する。Ｄｆｃｙは、製剤に配合する場合にその中に混在する鉄イオンや、皮膚上に存在する鉄イオンによってＦｃｙになるが、Ｆｃｙになってもその活性は阻害されない。
【0016】
Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙは、水溶液などの液体として、或いは乾燥した粉末のような固体としてフィラグリン増量剤中に含まれることができる。
また、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙは、それには限定されないが、麹菌の培養物自体、その培養物から精製したもの（完全又は不完全な精製物）、あるいは化学合成品や非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）などの酵素合成品などとしてフィラグリン増量剤中に含まれることができる。
麹菌の培養によりＤｆｃｙを得る場合、培地中の鉄イオン濃度を１０μＭ未満にすることで、Ｄｆｃｙを効率よく生成させることができる。麹菌を培養したものとして、米麹や清酒（酒税法で言う日本酒も含む）を挙げることができる。なお、麹菌培養物は多種多様な成分の混合物であり、存在が知られていない成分もある。ＤｆｃｙやＦｃｙはこれら無数の成分の一つである。
本発明のフィラグリン増量剤は、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙのみからなるフィラグリン増量剤とすることもできる。
また、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙは、それには限定されないが、麹菌の培養物自体、その培養物から精製したもの（完全又は不完全な精製物）、あるいは化学合成品や非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）などの酵素合成品などとしてフィラグリン増量剤中に含まれることができる。
麹菌の培養によりＤｆｃｙを得る場合、培地中の鉄イオン濃度を１０μＭ未満にすることで、Ｄｆｃｙを効率よく生成させることができる。麹菌を培養したものとして、米麹や清酒（酒税法で言う日本酒も含む）を挙げることができる。なお、麹菌培養物は多種多様な成分の混合物であり、存在が知られていない成分もある。ＤｆｃｙやＦｃｙはこれら無数の成分の一つである。
本発明のフィラグリン増量剤は、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙのみからなるフィラグリン増量剤とすることもできる。
【0017】
（２）フィラグリン増量用外用組成物
本発明のフィラグリン増量用外用組成物は、デフェリフェリクリシン（Ｄｆｃｙ）及び／又はフェリクリシン（Ｆｃｙ）を含み、特に、これらを有効成分として含むことができる。即ち、本発明のフィラグリン増量用外用組成物は、本発明のフィラグリン増量剤を含む。
本発明のフィラグリン増量用外用組成物は、デフェリフェリクリシン（Ｄｆｃｙ）及び／又はフェリクリシン（Ｆｃｙ）を含み、特に、これらを有効成分として含むことができる。即ち、本発明のフィラグリン増量用外用組成物は、本発明のフィラグリン増量剤を含む。
【0018】
外用組成物中のＤｆｃｙ及び／又はＦｃｙの含有量は、外用組成物の全量に対して、総量で、例えば０．０００００００１（１×１０－８）重量％（ｗ/ｗ％）以上、０．００００００１重量％以上、０．０００００１重量％以上、０．００００１重量％以上、０．０００１重量％以上、０．００１重量％以上、０．０１重量％以上、０．１重量％以上、又は１重量％以上とすることができ、また、例えば９９重量％以下、７０重量％以下、５０重量％以下、３０重量％以下、２５重量％以下、１０重量％以下、５重量％以下、３重量％以下、１重量％以下、０．１重量％以下、０．０１重量％以下、又は０．００１重量％以下とすることができる。Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙは、基剤や添加剤を配合しなくても単独で表皮に浸透してフィラグリン増量効果を発揮できるため、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙのみからなる外用組成物、即ち、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙの含有量が１００重量％の外用組成物とすることもできる。
【0019】
固形物の米麹（水分を含む湿重量とする）を外用組成物に配合する場合は、この米麹の配合量は、外用組成物の全量に対して、例えば０．０００００１重量％以上、 ０．００００１重量％以上、０．０００１重量％以上、０．００１重量％以上、０．０１重量％以上、０．１重量％以上、又は１重量％以上であればよい。
液体の清酒あるいは液体培養物を配合する場合は、清酒又は液体培養物の配合量は、外用組成物の全量に対して、例えば０．０００００１ｗ/ｖ％以上、 ０．００００１ｗ/ｖ％以上、０．０００１ｗ/ｖ％以上、０．００１ｗ/ｖ％以上、０．０１ｗ/ｖ％以上、０．１ｗ/ｖ％以上、１ｗ/ｖ％以上、１０重量％以上、３０重量％以上、又は５０重量％以上であればよい。
固体又は液体の麹菌培養物の濃縮物又は精製物を配合する場合は、この濃縮物又は精製物の配合量は、外用組成物の全量に対して、例えば０．０００００００１（１×１０－８）重量％以上、０．００００００１重量％以上、０．０００００１重量％以上、０．００００１重量％以上、０．０００１重量％以上、０．００１重量％以上、０．０１重量％以上、０．１重量％以上、１重量％以上であればよい。
また、固体又は液体の麹菌培養物の濃縮物又は精製物を他の液体に添加した希釈組成物を外用組成物に配合することもでき、その場合、希釈組成物の配合量は、希釈率によって異なるが、外用組成物の全量に対して、例えば０．００１ｗ/ｖ％以上、０．０１ｗ/ｖ％以上、０．１ｗ/ｖ％以上、１ｗ/ｖ％以上、３ｗ/ｖ％以上、１０ｗ/ｖ％以上であればよい。
何れの場合も、外用組成物の全量に対して、例えば１００重量％以下、９９重量％以下、７０％以下、３０％以下、１０％以下、３％以下、１％以下、０．１％以下、０．０１％以下、０．００１％以下とすることができる（「％」は、液体を配合する場合は「ｗ/ｖ％」を表し、固体を配合する場合は「重量％（ｗ／ｗ％）」を表す）。
液体の清酒あるいは液体培養物を配合する場合は、清酒又は液体培養物の配合量は、外用組成物の全量に対して、例えば０．０００００１ｗ/ｖ％以上、 ０．００００１ｗ/ｖ％以上、０．０００１ｗ/ｖ％以上、０．００１ｗ/ｖ％以上、０．０１ｗ/ｖ％以上、０．１ｗ/ｖ％以上、１ｗ/ｖ％以上、１０重量％以上、３０重量％以上、又は５０重量％以上であればよい。
固体又は液体の麹菌培養物の濃縮物又は精製物を配合する場合は、この濃縮物又は精製物の配合量は、外用組成物の全量に対して、例えば０．０００００００１（１×１０－８）重量％以上、０．００００００１重量％以上、０．０００００１重量％以上、０．００００１重量％以上、０．０００１重量％以上、０．００１重量％以上、０．０１重量％以上、０．１重量％以上、１重量％以上であればよい。
また、固体又は液体の麹菌培養物の濃縮物又は精製物を他の液体に添加した希釈組成物を外用組成物に配合することもでき、その場合、希釈組成物の配合量は、希釈率によって異なるが、外用組成物の全量に対して、例えば０．００１ｗ/ｖ％以上、０．０１ｗ/ｖ％以上、０．１ｗ/ｖ％以上、１ｗ/ｖ％以上、３ｗ/ｖ％以上、１０ｗ/ｖ％以上であればよい。
何れの場合も、外用組成物の全量に対して、例えば１００重量％以下、９９重量％以下、７０％以下、３０％以下、１０％以下、３％以下、１％以下、０．１％以下、０．０１％以下、０．００１％以下とすることができる（「％」は、液体を配合する場合は「ｗ/ｖ％」を表し、固体を配合する場合は「重量％（ｗ／ｗ％）」を表す）。
【0020】
本発明のフィラグリン増量用外用組成物は、特に皮膚外用組成物とすることができる。
また、各種の性状の外用組成物とすることができる。外用組成物の性状としては、水溶液などの溶液；乳液、クリームなどの乳剤（Ｏ／Ｗ型、Ｗ／Ｏ型、Ｗ／Ｏ／Ｗ型、Ｏ／Ｗ／Ｏ型）；ゲル；フォーム又はエアゾール；塊状、粉末状などの固形物などが挙げられる。Ｄｆｃｙ及びＦｃｙは水溶性物質であるため、乳剤中では水相に存在し得る。また、溶液、乳液などの液剤を不織布などの支持体に含浸させたり、クリーム、ゲル、固形物などを支持体上に塗布したものも挙げられる。
また、各種の性状の外用組成物とすることができる。外用組成物の性状としては、水溶液などの溶液；乳液、クリームなどの乳剤（Ｏ／Ｗ型、Ｗ／Ｏ型、Ｗ／Ｏ／Ｗ型、Ｏ／Ｗ／Ｏ型）；ゲル；フォーム又はエアゾール；塊状、粉末状などの固形物などが挙げられる。Ｄｆｃｙ及びＦｃｙは水溶性物質であるため、乳剤中では水相に存在し得る。また、溶液、乳液などの液剤を不織布などの支持体に含浸させたり、クリーム、ゲル、固形物などを支持体上に塗布したものも挙げられる。
【0021】
また、外用組成物の形態は、特に限定されず、化粧料であれば、例えば、化粧水、化粧用乳液、化粧用クリーム、化粧用ゲル、美容液、パック剤のようなスキンケア用品；ファンデーション、口紅、リップクリーム、リップグロス、アイシャドー、アイライナーのようなメイクアップ用品；洗顔剤、ボディソープ、ハンドクリーム、石鹸、クレンジング剤、シャンプー、リンスのような洗浄用品；整髪料などが挙げられる。これらは医薬部外品の薬用化粧料であってもよい。また、入浴剤や薬用入浴剤とすることもできる。
【0022】
外用組成物は、皮膚外用組成物に用いられる基剤にＤｆｃｙ及び／又はＦｃｙを配合し、さらに必要に応じて、添加剤や他の生理活性成分を配合することにより調製できる。基剤、添加剤、他の生理活性成分は、それぞれ１種又は２種以上を使用できる。
【0023】
基剤としては、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、カラギーナン、マンナン、アガロース、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、メトキシエチレン－無水マレイン酸共重合体、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルランのようなポリマー類；白色ワセリン、黄色ワセリン、パラフィン、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックスのような炭化水素類；ゲル化炭化水素（例えば、商品名プラスチベース、ブリストルマイヤーズスクイブ社製）；ステアリン酸のような高級脂肪酸；セタノール、オクチルドデカノール、ステアリルアルコールのような高級アルコール；ポリエチレングリコール；プロピレングリコール、グリセリン、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、濃グリセリンのような多価アルコール；モノオレイン酸エステル、ステアリン酸グリセリドのような脂肪酸エステル類などが挙げられる。
【0024】
添加物は、特に制限されず、界面活性剤、増粘剤、酸化防止剤、安定剤、防腐剤、溶解補助剤、無機充填剤、ｐＨ調節剤、Ｄｆｃｙ以外のキレート剤、清涼化剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、着色剤、香料などが挙げられる。
【0025】
Ｄｆｃｙ、Ｆｃｙ以外の生理活性成分としては、セラミド増量剤又はセラミドそのもの、細胞間接着向上剤（タイトジャンクション（タンパク質）増量剤）、Ｄｆｃｙ、Ｆｃｙ以外の保湿成分、抗菌剤、抗ウイルス剤、血流促進剤、収斂剤、抗炎症剤、細胞賦活剤、脂肪代謝促進剤、ムコ多糖類、ムコ多糖類の分解阻害又は合成促進剤、メイラード反応阻害剤、育毛剤、抗脂漏剤などが挙げられる。
【0026】
セラミド含量増加剤としては、例えば、ヒト型セラミド１、２、３の混合物を挙げることができ、これはセラミドそのものを直接増量させるだけでなく、間接的に皮膚においてセラミド産生を促進する（小林製薬社ニュースリリース、2016年8月19日付け）。また、皮膚においてセラミド産生を促進する成分として、センキュウ抽出物（特開2010-150237号）、ユーカリ、ホップ、ショウガ、ガンビールノキ、ノイバラ、セイヨウトチノキ、ユリ、ハトムギ、ガマ、ビワ、クチナシ、オタネニンジン、サボンソウ、シラカバ、アマチャ、チョウジ、ベニバナ、ワレモコウ、イリス、及びクララから選ばれる植物又はその抽出物（特許第3813515号）、黄色バラ花発酵エキス（特許第5621330号）、椿の種子と大豆に納豆菌を添加して発酵させた液に米糠油を添加して凍結したもの（特開2012-056902号）も挙げられる。また、セラミドは、スフィンゴミエリンの加水分解により生成するため、スフィンゴミエリン又はそれを構成成分とするリポソームも皮膚においてセラミドを増量させる成分として挙げられる（特開2012-025720号）。
【0027】
角層では、角層細胞同士がコルネオデスモゾームという構造体で接着され、効果的に乾燥を防ぐことが知られているが、この構造体形成には顆粒細胞層における正常なタイトジャンクションタンパク質形成が必要であることも知られている。タイトジャンクションタンパク質は、物質透過を制御するバリア機能を有しており、クローディン－１遺伝子（CLDN1）などの発現により増加することが知られている。このタイトジャンクション増量剤として、アスチルビン、それを含む植物である黄杞（学名：Engelhardtia chrysolepis Hance）、オトギリソウ（学名：Hypericum erectum，Hypericum perforatum）が挙げられる（特開2017-075117）。
【0028】
本発明の外用組成物が化粧料である場合、１回あたりのヒト成人の皮膚面積に対する塗布量は、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙの塗布量が例えば０．００００１～０．５ｍｇ／ｃｍ２、好ましくは０．０００１２～０．４５ｍｇ／ｃｍ２、より好ましくは０．００５～０．２５ｍｇ／ｃｍ２となる量にすればよい。また、１日の塗布回数は、例えば１～８回、好ましくは１～３回とすればよい。
【0029】
実施例の項目で示す通り、Ｄｆｃｙは、表皮細胞のフィラグリンを増量させる。また、ケラチンを増量させることも示唆されている。前述した通り、フィラグリンはケラチンと共に、表皮の最外層である角質細胞を構成しており、体外環境からの異物の侵入を防ぐと共に、体内からの水分の蒸散を防ぐ役割をしている。また、フィラグリンは天然保湿成分（ＮＭＦ）の原料となる。
従って、本発明のフィラグリン増量剤は、保湿剤（特に、皮膚の保湿剤）、表皮のバリア機能の維持、正常化、又は改善剤、水分蒸散抑制剤、角質層（角質細胞）の維持、正常化、又は改善剤、皮膚の保護剤（例えば消毒剤又は洗浄剤のような異物の侵入を防ぐ、皮膚の保護剤）などと捉えることもできる。即ち、本発明は、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙを含む保湿剤（特に、皮膚の保湿剤）、表皮のバリア機能の維持、正常化、又は改善剤、水分蒸散抑制剤、角質層（角質細胞）の維持、正常化、又は改善、皮膚の保護剤も提供する。
また、本発明のフィラグリン増量剤は、中でもフィラグリンの生産促進剤とすることができる。また、表皮のフィラグリン増量剤、中でも表皮のフィラグリンの生産促進剤とすることができる。
また、このフィラグリン増量剤は、他の皮膚タンパク質増量効果を有しても良く、例えばケラチン増量剤の機能を有しても良い。ケラチンをコードする遺伝子は幾つか存在を知られているが、ケラチン１４遺伝子（KRT14）、ケラチン１遺伝子（KRT1）の発現量を増加させるものが好ましい。
従って、本発明のフィラグリン増量剤は、保湿剤（特に、皮膚の保湿剤）、表皮のバリア機能の維持、正常化、又は改善剤、水分蒸散抑制剤、角質層（角質細胞）の維持、正常化、又は改善剤、皮膚の保護剤（例えば消毒剤又は洗浄剤のような異物の侵入を防ぐ、皮膚の保護剤）などと捉えることもできる。即ち、本発明は、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙを含む保湿剤（特に、皮膚の保湿剤）、表皮のバリア機能の維持、正常化、又は改善剤、水分蒸散抑制剤、角質層（角質細胞）の維持、正常化、又は改善、皮膚の保護剤も提供する。
また、本発明のフィラグリン増量剤は、中でもフィラグリンの生産促進剤とすることができる。また、表皮のフィラグリン増量剤、中でも表皮のフィラグリンの生産促進剤とすることができる。
また、このフィラグリン増量剤は、他の皮膚タンパク質増量効果を有しても良く、例えばケラチン増量剤の機能を有しても良い。ケラチンをコードする遺伝子は幾つか存在を知られているが、ケラチン１４遺伝子（KRT14）、ケラチン１遺伝子（KRT1）の発現量を増加させるものが好ましい。
【0030】
同様に、本発明は、Ｄｆｃｙ及び／又はＦｃｙを含む保湿用外用組成物（特に、皮膚の保湿用外用組成物）、表皮のバリア機能の維持、正常化、又は改善用外用組成物、水分蒸散抑制用外用組成物、表皮のターンオーバーの維持、正常化、又は改善用外用組成物も提供する。
また、本発明のフィラグリン増量用外用組成物は、中でもフィラグリンの生産促進用外用組成物とすることができる。また、表皮のフィラグリン増量用外用組成物、中でも表皮のフィラグリンの生産促進用外用組成物とすることができる。
また、このフィラグリン増量用外用組成物は、他の皮膚タンパク質増量効果を有しても良く、例えばケラチン増量用外用組成物の機能を有しても良い。中でも、ケラチン１４遺伝子（KRT14）、ケラチン１遺伝子（KRT1）の発現量を増加させるものが好ましい。
また、本発明のフィラグリン増量用外用組成物は、中でもフィラグリンの生産促進用外用組成物とすることができる。また、表皮のフィラグリン増量用外用組成物、中でも表皮のフィラグリンの生産促進用外用組成物とすることができる。
また、このフィラグリン増量用外用組成物は、他の皮膚タンパク質増量効果を有しても良く、例えばケラチン増量用外用組成物の機能を有しても良い。中でも、ケラチン１４遺伝子（KRT14）、ケラチン１遺伝子（KRT1）の発現量を増加させるものが好ましい。
【実施例0031】
以下、本発明を、実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１（Ｄｆｃｙの調製）
アスペルギルス オリゼを、Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地を用いて、３０℃で７日間振とう培養した。この培地の組成は、２重量％ グルコース、０．３重量％ ＮａＮＯ３、０．２重量％ ＫＣｌ、０．１重量％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５重量％ ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．０とした。培養終了後、ろ過により菌体と培養上清を分離した。培養上清から、限外ろ過膜を用いて分子量５０００以上のタンパク質等の高分子を除去した後、ろ液を疎水性カラムクロマトグラフィー（カラム：アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ、オルガノ社）に供した。そして、１００％エタノールで溶出された溶出液を、Ｄｆｃｙ含有画分として回収した。
実施例１（Ｄｆｃｙの調製）
アスペルギルス オリゼを、Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地を用いて、３０℃で７日間振とう培養した。この培地の組成は、２重量％ グルコース、０．３重量％ ＮａＮＯ３、０．２重量％ ＫＣｌ、０．１重量％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５重量％ ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．０とした。培養終了後、ろ過により菌体と培養上清を分離した。培養上清から、限外ろ過膜を用いて分子量５０００以上のタンパク質等の高分子を除去した後、ろ液を疎水性カラムクロマトグラフィー（カラム：アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ、オルガノ社）に供した。そして、１００％エタノールで溶出された溶出液を、Ｄｆｃｙ含有画分として回収した。
【0032】
この溶出液にＤｆｃｙが含まれていることは、以下の方法により確認した。Ｆｃｙは、波長４３０ｎｍに極大吸収を示す（Agr.Biol.Chem., Vol.31, No.12, 1482頁）。そこで、この溶出液と、この溶出液に塩化第二鉄溶液を添加したものとを、それぞれ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して分析した。この結果、塩化第二鉄溶液を添加した場合にのみ、波長４３０ｎｍに極大吸収を示したことから、前記操作により、Ｄｆｃｙを高含有する画分が得られたことが分かった。Ｄｆｃｙの純度は７７．３％であった。
この溶出液を凍結乾燥して、Ｄｆｃｙの粉末を得た。
この溶出液を凍結乾燥して、Ｄｆｃｙの粉末を得た。
【0033】
実施例２（フィラグリン生産に対するＤｆｃｙの作用）
実施例１で調製したＤｆｃｙを用いて、角質細胞の構造維持に関与する代表的なタンパク質であるフィラグリンの生産量に及ぼすＤｆｃｙの作用を、ウェスタンブロッティング法で評価した。
正常ヒト表皮細胞を、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地を入れた２４ウェルプレートに、６．０×１０４ｃｅｌｌｓ/ウェルの細胞密度で播種した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２日間培養後、ウシ脳下垂体抽出物末含有ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地の６００μｌと交換した。さらに同条件で２日間培養後、被験試料（Ｄｆｃｙ）をウシ脳下垂体抽出物末含有ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地に溶解させフィルター（孔径０．４５μｍ）滅菌した溶液５００μｌと交換した。同条件で７２時間培養した後、細胞をＰＢＳ(－)で洗浄し、０．５％Ｔｒｉｉｔｏｎ Ｘ－１００（２ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ含有）を３００μＬ加え、ＵＬＴＲＡ ＳＯＮＩＣ ＨＯＭＯＧＮＩＺＥＲ ＵＨ－５０を用いて細胞を破砕した。細胞溶解液について、ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いてタンパク質量を測定した。
ニトロセルロース膜に細胞溶解液をブロッティングし、乾燥後、ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(―)にてブロッキングした。１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ(－)にて洗浄し、一次抗体としてＦｉｌａｇｇｒｉｎ（ＡＥ２１）：ｓｃ－８０６０９ ａｎｔｉｂｏｄｙをニトロセルロース膜上に添加した。４℃で１晩反応させた後、１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ(－)にて洗浄し、その後、２次抗体としてＨＲＰ標識Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ(ヒストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ（Ｍ）)をニトロセルロース膜上に添加し、抗原抗体反応を室温で３時間行った。１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ(－)にて洗浄し、Ｌｉｍｉ－Ｌｉｇｈｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅによる発光をライトキャプチャーにて検出した。得られたドットの輝度は、ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０を数値化した。
フィラグリン量は、被験試料未処理コントロールの輝度平均を１００としたＩｎｄｅｘ（％）にて表した。各測定値は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を用いて有意差検定を行い、コントロールとの差異を評価した。
各試料の評価は、それぞれ独立した４ウェルで行った（ｎ＝４に相当）。
実施例１で調製したＤｆｃｙを用いて、角質細胞の構造維持に関与する代表的なタンパク質であるフィラグリンの生産量に及ぼすＤｆｃｙの作用を、ウェスタンブロッティング法で評価した。
正常ヒト表皮細胞を、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地を入れた２４ウェルプレートに、６．０×１０４ｃｅｌｌｓ/ウェルの細胞密度で播種した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２日間培養後、ウシ脳下垂体抽出物末含有ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地の６００μｌと交換した。さらに同条件で２日間培養後、被験試料（Ｄｆｃｙ）をウシ脳下垂体抽出物末含有ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地に溶解させフィルター（孔径０．４５μｍ）滅菌した溶液５００μｌと交換した。同条件で７２時間培養した後、細胞をＰＢＳ(－)で洗浄し、０．５％Ｔｒｉｉｔｏｎ Ｘ－１００（２ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ含有）を３００μＬ加え、ＵＬＴＲＡ ＳＯＮＩＣ ＨＯＭＯＧＮＩＺＥＲ ＵＨ－５０を用いて細胞を破砕した。細胞溶解液について、ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いてタンパク質量を測定した。
ニトロセルロース膜に細胞溶解液をブロッティングし、乾燥後、ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(―)にてブロッキングした。１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ(－)にて洗浄し、一次抗体としてＦｉｌａｇｇｒｉｎ（ＡＥ２１）：ｓｃ－８０６０９ ａｎｔｉｂｏｄｙをニトロセルロース膜上に添加した。４℃で１晩反応させた後、１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ(－)にて洗浄し、その後、２次抗体としてＨＲＰ標識Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ(ヒストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ（Ｍ）)をニトロセルロース膜上に添加し、抗原抗体反応を室温で３時間行った。１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ(－)にて洗浄し、Ｌｉｍｉ－Ｌｉｇｈｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅによる発光をライトキャプチャーにて検出した。得られたドットの輝度は、ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０を数値化した。
フィラグリン量は、被験試料未処理コントロールの輝度平均を１００としたＩｎｄｅｘ（％）にて表した。各測定値は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を用いて有意差検定を行い、コントロールとの差異を評価した。
各試料の評価は、それぞれ独立した４ウェルで行った（ｎ＝４に相当）。
【0034】
フィラグリン及び細胞由来の総タンパク質の生産量の結果を、表１に示す。
【表1】
【0035】
フィラグリン生産量は、Ｄｆｃｙの終濃度０．０００１重量％で増加傾向を示し、Ｄｆｃｙの終濃度０．０００４重量％で有意に増大した。また、総タンパク質量は、Ｄｆｃｙの終濃度０．０００１重量％及び０．０００４重量％で有意に増大した。Ｄｆｃｙの終濃度０．０００４重量％は、総タンパク質量が増えていることから、細胞傷害を示さない濃度である。
なお、各ウェルは底面積１．９ｃｍ２、液量６００μＬであり、フィラグリン生産量を有意に増大させたＤｆｃｙ濃度が０．０００４重量％であることから、Ｄｆｃｙの約０．０００１２ｍｇを皮膚の1ｃｍ２に塗布すればフィラグリン増量効果があると言える。
なお、各ウェルは底面積１．９ｃｍ２、液量６００μＬであり、フィラグリン生産量を有意に増大させたＤｆｃｙ濃度が０．０００４重量％であることから、Ｄｆｃｙの約０．０００１２ｍｇを皮膚の1ｃｍ２に塗布すればフィラグリン増量効果があると言える。
【0036】
実施例３（各種遺伝子発現に対する作用）
実施例１で調製したＤｆｃｙの各種遺伝子発現に対する作用を、正常ヒト表皮細胞を用いたＤＮＡマイクロアレイ法で評価した。
正常ヒト表皮細胞を、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地を入れた１２ウェルプレートに、２．５×１０５ ｃｅｌｌｓ/ウェルの細胞密度（８割コンフルエント）で播種した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養後、被験試料（終濃度０．１重量％又は０．０１重量％となるＤｆｃｙ）を含有するＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地の１ｍＬと交換した。同条件で２４時間培養後、細胞をＱＩＡｚｏｌ (商品名)ｒｅａｇｅｎｔに浸漬し、溶解した。溶解液からｍｉＲＮＡｅａｓｙ（商品名）Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、生成したＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡを三菱ケミカル社に送付し、ｍＲＮＡ発現解析チップ（ＤＮＡチップジェノパール（商品名）ＮＤＲカスタムチップ）を用いて、ＤＮＡマイクロアレイを実施した。
また、被験試料を含有するＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地に代えて、Ｄｆｃｙを含有しないＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地を添加したコントロールについても同様の操作を行った。
ＲＮＡ回収及びＤＮＡマイクロアレイ解析からなる一連の操作を、それぞれ２回行い（ｎ＝２）、平均値を算出した。
本解析では、フィラグリン遺伝子(FLG)、ケラチン遺伝子（KRT1、5、10、14）、セラミド合成酵素遺伝子(CERS6)、タイトジャンクション遺伝子(CLDN1)を含む、表皮細胞の機能や構造維持に関与する遺伝子の発現を測定した。
実施例１で調製したＤｆｃｙの各種遺伝子発現に対する作用を、正常ヒト表皮細胞を用いたＤＮＡマイクロアレイ法で評価した。
正常ヒト表皮細胞を、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地を入れた１２ウェルプレートに、２．５×１０５ ｃｅｌｌｓ/ウェルの細胞密度（８割コンフルエント）で播種した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養後、被験試料（終濃度０．１重量％又は０．０１重量％となるＤｆｃｙ）を含有するＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地の１ｍＬと交換した。同条件で２４時間培養後、細胞をＱＩＡｚｏｌ (商品名)ｒｅａｇｅｎｔに浸漬し、溶解した。溶解液からｍｉＲＮＡｅａｓｙ（商品名）Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、生成したＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡを三菱ケミカル社に送付し、ｍＲＮＡ発現解析チップ（ＤＮＡチップジェノパール（商品名）ＮＤＲカスタムチップ）を用いて、ＤＮＡマイクロアレイを実施した。
また、被験試料を含有するＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地に代えて、Ｄｆｃｙを含有しないＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地を添加したコントロールについても同様の操作を行った。
ＲＮＡ回収及びＤＮＡマイクロアレイ解析からなる一連の操作を、それぞれ２回行い（ｎ＝２）、平均値を算出した。
本解析では、フィラグリン遺伝子(FLG)、ケラチン遺伝子（KRT1、5、10、14）、セラミド合成酵素遺伝子(CERS6)、タイトジャンクション遺伝子(CLDN1)を含む、表皮細胞の機能や構造維持に関与する遺伝子の発現を測定した。
【0037】
コントロールより発現量が増えた遺伝子の発現量の結果を表２に示す。表２中の数値は、コントロールを１としたときの相対値である。
【表2】
【0038】
Ｄｆｃｙ終濃度０．１重量％において、フィラグリン遺伝子（FLG）の発現量は大きく増加した。皮膚細胞においてフィラグリンはケラチン繊維と共に存在することが知られているが、ケラチン１４遺伝子（KRT14）とケラチン１遺伝子（KRT1）が、フィラグリン遺伝子と同様に、顕著に増加した。Ｄｆｃｙ及びＤｆｃｙがこれらケラチン（タンパク質）を増量させる可能性が示された。また、皮膚バリアに関与する主要なセラミド合成系遺伝子であるセラミド合成酵素遺伝子(CERS6)と、細胞と細胞の間をシールするタイトジャンクション遺伝子(CLDN1)は増加しなかった。
この結果から、本発明であるフィラグリン増量剤は、セラミド合成やタイトジャンクション強化とは別経路で、皮膚の保湿やバリア機能を向上させる可能性が示された。なお、Ｄｆｃｙ終濃度０．０１重量％についても試験を行ったが、上記各遺伝子の発現量の増減はＤｆｃｙ終濃度０．１重量％ほど顕著には観察されなかった。Ｄｆｃｙが、用量依存的にフィラグリン遺伝子（FLG）、ケラチン１４遺伝子（KRT14）、及びケラチン１遺伝子（KRT1）の発現を増大させたことが分かる。
この結果から、本発明であるフィラグリン増量剤は、セラミド合成やタイトジャンクション強化とは別経路で、皮膚の保湿やバリア機能を向上させる可能性が示された。なお、Ｄｆｃｙ終濃度０．０１重量％についても試験を行ったが、上記各遺伝子の発現量の増減はＤｆｃｙ終濃度０．１重量％ほど顕著には観察されなかった。Ｄｆｃｙが、用量依存的にフィラグリン遺伝子（FLG）、ケラチン１４遺伝子（KRT14）、及びケラチン１遺伝子（KRT1）の発現を増大させたことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【0039】
Ｄｆｃｙ及び／Ｆｃｙは、ヒト表皮細胞に作用して皮膚の保湿に関与するフィラグリンの生産を増大させるため、化粧料などの外用組成物の有効成分として好適に使用できる。