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特開2022-123676アコヤ貝殻黒変病原因細菌の特異的検出法及びそのためのキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022123676
(43)【公開日】2022-08-24
(54)【発明の名称】アコヤ貝殻黒変病原因細菌の特異的検出法及びそのためのキット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220817BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20220817BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20220817BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12Q1/689 ZNA
C12Q1/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021021128
(22)【出願日】2021-02-12
(71)【出願人】
【識別番号】305060567
【氏名又は名称】国立大学法人富山大学
(71)【出願人】
【識別番号】304026696
【氏名又は名称】国立大学法人三重大学
(74)【代理人】
【識別番号】100123788
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 昭夫
(74)【代理人】
【識別番号】100127454
【弁理士】
【氏名又は名称】緒方 雅昭
(72)【発明者】
【氏名】酒徳 昭宏
(72)【発明者】
【氏名】一色 正
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】操作が簡便であり、迅速に検出・同定することが可能な、アコヤガイ殻黒変病の原因細菌の一つであるTenacibaculum sp. Pbs-1株の検出方法を提供すること。
【解決手段】ＰＣＲ法を用いたアコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出方法であって、前記殻黒変病原因細菌の検出用の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを合成するためのプライマーペアとして、前記殻黒変病原因細菌の１６ＳｒＲＮＡに含まれる塩基配列からなるフォワードプライマーと、１６Ｓと２３ＳのＩＳＲ領域（internal spacer region）に含まれる塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、を用いる。
【選択図】なし
【解決手段】ＰＣＲ法を用いたアコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出方法であって、前記殻黒変病原因細菌の検出用の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを合成するためのプライマーペアとして、前記殻黒変病原因細菌の１６ＳｒＲＮＡに含まれる塩基配列からなるフォワードプライマーと、１６Ｓと２３ＳのＩＳＲ領域（internal spacer region）に含まれる塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、を用いる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＣＲ法を用いたアコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出方法であって、
前記殻黒変病原因細菌の検出用の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを合成するためのプライマーペアとして、
前記殻黒変病原因細菌の１６ＳｒＲＮＡに含まれる塩基配列からなるフォワードプライマーと、
前記殻黒変病原因細菌の１６Ｓと２３ＳのＩＳＲ領域（internal spacer region）に含まれる塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
を用いる殻黒変病原因細菌の同定方法。
前記殻黒変病原因細菌の検出用の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを合成するためのプライマーペアとして、
前記殻黒変病原因細菌の１６ＳｒＲＮＡに含まれる塩基配列からなるフォワードプライマーと、
前記殻黒変病原因細菌の１６Ｓと２３ＳのＩＳＲ領域（internal spacer region）に含まれる塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
を用いる殻黒変病原因細菌の同定方法。
【請求項2】
前記プライマーペアが、
（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかである、
請求項１に記載の検出方法。
（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかである、
請求項１に記載の検出方法。
【請求項3】
前記殻黒変病原因細菌が、Tenacibaculumsp. Pbs-1株である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項4】
前記ＰＣＲ法が、２ステップＰＣＲ法である、請求項１～３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項5】
前記ＰＣＲ法が、以下の条件で行われる、請求項４に記載の検出方法：
初めに９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒間、６９．６℃で１分間の２ＳＴＥＰ反応を３５サイクル繰り返した後、４℃でクーリングする。
初めに９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒間、６９．６℃で１分間の２ＳＴＥＰ反応を３５サイクル繰り返した後、４℃でクーリングする。
【請求項6】
（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかである、プライマーペア。
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかである、プライマーペア。
【請求項7】
請求項６記載のプライマーペアを含む、アコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出用キット。
【請求項8】
配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー。
【請求項9】
配列番号１において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したフォワードプライマー。
【請求項10】
配列番号１の塩基配列に対応する相補的配列からなるフォワードプライマー。
【請求項11】
配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー。
【請求項12】
配列番号２において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したリバースプライマー。
【請求項13】
配列番号２の塩基配列に対応する相補的配列からなるリバースプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は, アコヤ貝の殻黒変病の原因細菌を迅速・特異的に検出するPCR法及びそのためのキットに関するものである。
【背景技術】
【0002】
日本の真珠養殖は三重県、長崎県および愛媛県の３県を合わせて生産量の約９割を占めている。これらの地域で生産されるアコヤ真珠は、世界的にも非常に評価が高い。その年間生産量と輸出額はそれぞれ２０トンと３００億円を超え、地域経済・産業の根幹を担っているとともに、輸出品としても重要な産業となっている。特に、三重県は真珠養殖発祥の地であり、大珠作成法の開発や、厘珠や小珠の主要生産地として、生産量だけでは計れない重要な地域であるが、近年、真珠形成母貝アコヤガイの殻黒変病が深刻化し、そのような伝統技術の継承も危ぶまれている。
【0003】
本症例は１９６７年に初報告され、２０２０年現在も解決には至っていない。重症な殻黒変病個体は斃死に至り、真珠を収穫できる個体が養殖開始時の半分に満たない年すらある。また、斃死に至らなくても本疾病個体は、抱いている真珠にも黒変様の「しみ」が形成され、低品質真珠（ドクズ珠）として格下げとなり、取引価格に雲泥の差が出る。そのため、真珠養殖業者は真珠を安定的に生産することが非常に困難であり、平成５年から平成１５年の１０年間で、三重県、愛媛県および長崎県にける真珠養殖の経営体数は、それぞれ３６％、２８％、２４％も減少した。特に三重県での減少が著しく、平成２５年時の経営体数は、２８３経営体（最盛期の１０％）にまで減少している。このように、殻黒変病は、真珠養殖業者の間で大きな問題としてとらえられており、殻黒変病に対する対策が急務とされているが、その原因すらわかっていなかった。そのような中、富山大学を中心とした研究コンソーシアムは、日本国内の主要養殖地（三重・愛媛・長崎）におけるアコヤガイの殻黒変病の発症状況を調査し、殻黒変病に特定の細菌が高密度に感染している可能性を見出し（非特許文献１参照）、更に研究を進めた結果、殻黒変病個体からTenacibaculum sp.Pbs-1株を単離し、本菌株を健常な母貝に感染させて殻黒変病を再現することに成功し、約５０年間不明だった殻黒変病の１因を特定した。（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】真珠形成母貝アコヤガイの寄生虫病に関する新展開 －その被害状況の把握と原因の究明－. 酒徳昭宏., 藤村卓也., 伊藤美智子., 高島成剛., 一色 正. 日本応用生物学会誌., 30, 1-6. 2017.
【非特許文献2】Newly isolated bacterium Tenacibaculum sp. strain Pbs-1 from diseased pearl oysters is associated with black-spot shell disease. Sakatoku A., Fujimura T., Ito M., Takashima S., Isshiki T. Aquaculture. 493, 61- 67. 2018.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、現在、アコヤ貝殻黒変病の原因細菌の一つであるTenacibaculumsp.Pbs-1株の感染の有無を確認する方法は、非特許文献２に記載した富山大学が開発したＰＣＲ－ＤＧＧＥによるものしかなく、操作の煩雑性や検出までに時間がかかることなど問題点も多い。
したがって、解決しようとする課題は、操作が簡便であり、迅速に検出・同定することが可能な、アコヤガイ殻黒変病の原因細菌の一つであるTenacibaculum sp. Pbs-1株の検出方法を提供することにある。
したがって、解決しようとする課題は、操作が簡便であり、迅速に検出・同定することが可能な、アコヤガイ殻黒変病の原因細菌の一つであるTenacibaculum sp. Pbs-1株の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、次の［１］ないし［１３］に関する。
［１］ ＰＣＲ法を用いたアコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出方法であって、
前記殻黒変病原因細菌の検出用の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを合成するためのプライマーペアとして、
前記殻黒変病原因細菌の１６ＳｒＲＮＡに含まれる塩基配列からなるフォワードプライマーと、
前記殻黒変病原因細菌の１６Ｓと２３ＳのＩＳＲ領域（internal spacer region）に含まれる塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
を用いる殻黒変病原因細菌の同定方法。
［２］ 前記プライマーペアが、
（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかである、
前記［１］に記載の検出方法
［３］ 前記殻黒変病原因細菌が、Tenacibaculumsp. Pbs-1株である、前記［１］又は［２］に記載の検出方法。
［４］ 前記ＰＣＲ法が、２ステップＰＣＲ法である、前記［１］～［３］のいずれか１つに記載の検出方法。
［５］ 前記ＰＣＲ法が、以下の条件で行われる、前記［４］に記載の検出方法：
初めに９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒間、６９．６℃で１分間の２ＳＴＥＰ反応を３５サイクル繰り返した後、４℃でクーリングする。
［６］ （Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかである、プライマーペア。
［７］ 前記［６］記載のプライマーペアを含む、アコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出用キット。
［８］ 配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー。
［９］ 配列番号１において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したフォワードプライマー。
［１０］ 配列番号１の塩基配列に対応する相補的配列からなるフォワードプライマー。
［１１］ 配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー。
［１２］ 配列番号２において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したリバースプライマー。
［１３］ 配列番号２の塩基配列に対応する相補的配列からなるリバースプライマー。
［１］ ＰＣＲ法を用いたアコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出方法であって、
前記殻黒変病原因細菌の検出用の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを合成するためのプライマーペアとして、
前記殻黒変病原因細菌の１６ＳｒＲＮＡに含まれる塩基配列からなるフォワードプライマーと、
前記殻黒変病原因細菌の１６Ｓと２３ＳのＩＳＲ領域（internal spacer region）に含まれる塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
を用いる殻黒変病原因細菌の同定方法。
［２］ 前記プライマーペアが、
（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかである、
前記［１］に記載の検出方法
［３］ 前記殻黒変病原因細菌が、Tenacibaculumsp. Pbs-1株である、前記［１］又は［２］に記載の検出方法。
［４］ 前記ＰＣＲ法が、２ステップＰＣＲ法である、前記［１］～［３］のいずれか１つに記載の検出方法。
［５］ 前記ＰＣＲ法が、以下の条件で行われる、前記［４］に記載の検出方法：
初めに９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒間、６９．６℃で１分間の２ＳＴＥＰ反応を３５サイクル繰り返した後、４℃でクーリングする。
［６］ （Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかである、プライマーペア。
［７］ 前記［６］記載のプライマーペアを含む、アコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出用キット。
［８］ 配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー。
［９］ 配列番号１において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したフォワードプライマー。
［１０］ 配列番号１の塩基配列に対応する相補的配列からなるフォワードプライマー。
［１１］ 配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー。
［１２］ 配列番号２において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したリバースプライマー。
［１３］ 配列番号２の塩基配列に対応する相補的配列からなるリバースプライマー。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、アコヤガイ殻黒変病の原因細菌の一つであるTenacibaculum sp. Pbs-1株を簡便な操作で、迅速に検出・同定することができる。このため作業者の負担の軽減およびシステムの自動化を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】実験例１－１におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図2】実験例１－２におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図3】実験例２－１におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図4】実験例２－２におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図5】実験例２－３におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図6】実験例２－４におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図7】実験例２－５におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図8】実験例３－１におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図9】実験例３－２におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図10】実験例４－１におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図11】実験例４－２におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図12】実験例４－３におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図13】実験例４－４におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図14】実験例５におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明は、アコヤガイ殻黒変病の原因細菌、具体的には、Tenacibaculum sp. Pbs-1株を簡便な操作で、迅速に検出・同定する新規なＰＣＲ法を見出したものである。
Tenacibaculum sp. Pbs-1株は、アコヤガイ殻黒変病の原因細菌の一つとして、富山大学を中心とした研究コンソーシアムにより発見されたものであり、この細菌は、非特許文献２に記載の方法で入手可能である。
Tenacibaculum sp. Pbs-1株は、アコヤガイ殻黒変病の原因細菌の一つとして、富山大学を中心とした研究コンソーシアムにより発見されたものであり、この細菌は、非特許文献２に記載の方法で入手可能である。
【0010】
Tenacibaculum sp. Pbs-1株の検出方法は、非特許文献２に記載されているとおり、富山大学が開発したＰＣＲ－ＤＧＧＥによるものしかなく, 操作の煩雑性や検出までに時間がかかることなど問題点も多い。
これに対し、本出願人は、アコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出用の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを合成するためのプライマーを設計する過程において、殻黒変病原因細菌の１６ＳｒＲＮＡ領域と１６Ｓと２３Ｓのinternal spacer region（ＩＳＲ領域）の２つの領域に着目し、１６ＳｒＲＮＡ領域に含まれる塩基配列をフォワードプライマーとし、ＩＳＲ領域に含まれる塩基配列からなるリバースプライマーとするプライマーペアを用いることが有効であることを見出したものである。
具体的には、フォワードプライマーとして配列番号１に示す塩基配列（５’－ATACGGAGGGTGCAAGCGTT－３’）を含むプライマーと、リバースプライマーとして、配列番号２に示す塩基配列（５’－TAGCTTGCGCTACAACGAGC－３’）を含むプライマーとからなるプライマーペアを用いたＰＣＲにより、Tenacibaculum sp. Pbs-1株を特異的に検出することができる。－ＴＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧ－３’）を含む－ＣＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＣＧＴＧＡＴＧ－３’）を含む
これに対し、本出願人は、アコヤ貝殻黒変病原因細菌の検出用の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを合成するためのプライマーを設計する過程において、殻黒変病原因細菌の１６ＳｒＲＮＡ領域と１６Ｓと２３Ｓのinternal spacer region（ＩＳＲ領域）の２つの領域に着目し、１６ＳｒＲＮＡ領域に含まれる塩基配列をフォワードプライマーとし、ＩＳＲ領域に含まれる塩基配列からなるリバースプライマーとするプライマーペアを用いることが有効であることを見出したものである。
具体的には、フォワードプライマーとして配列番号１に示す塩基配列（５’－ATACGGAGGGTGCAAGCGTT－３’）を含むプライマーと、リバースプライマーとして、配列番号２に示す塩基配列（５’－TAGCTTGCGCTACAACGAGC－３’）を含むプライマーとからなるプライマーペアを用いたＰＣＲにより、Tenacibaculum sp. Pbs-1株を特異的に検出することができる。－ＴＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧ－３’）を含む－ＣＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＣＧＴＧＡＴＧ－３’）を含む
【0011】
配列番号１の塩基配列を含むフォワードプライマーには、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーのほか、
配列番号１において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したフォワードプライマーや、
配列番号１の塩基配列に対応する相補的配列からなるフォワードプライマーを含んでもよい。
配列番号１において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したフォワードプライマーや、
配列番号１の塩基配列に対応する相補的配列からなるフォワードプライマーを含んでもよい。
【0012】
また配列番号２の塩基配列を含むリバースプライマーには、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーのほか、
配列番号２において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したリバースプライマーや、
配列番号２の塩基配列に対応する相補的配列からなるリバースプライマーを含んでもよい。
配列番号２において、塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したリバースプライマーや、
配列番号２の塩基配列に対応する相補的配列からなるリバースプライマーを含んでもよい。
【0013】
したがって、配列番号１の塩基配列を含むフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列を含むリバースプライマーとの組み合わせよりなるプラマーペアは、
（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかであってもよい。
（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかであってもよい。
【0014】
かかるプライマーペアの具体例としては、
（１ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーと組合せ、
（１ｂ－１）配列番号１の改変塩基配列からなる改変フォワードプライマーと、配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｂ－２）配列番号１からなるフォワードプライマーと、配列番号２の改変塩基配列からなる改変リバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｂ－３）配列番号１の改変塩基配列からなる改変フォワードプライマーと、配列番号２の改変塩基配列からなる改変リバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｃ－１）配列番号１の相補配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の相補配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｃ－２）配列番号１の改変塩基配列の相補配列からなる改変フォワードプライマーと、配列番号２の相補配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｃ－３）配列番号１の相補配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の改変塩基配列の相補配列からなる改変リバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｃ－４）配列番号１の改変塩基配列の相補配列からなる改変フォワードプライマーと、配列番号２の改変塩基配列の相補配列からなる改変リバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、が挙げられる。
（１ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーと組合せ、
（１ｂ－１）配列番号１の改変塩基配列からなる改変フォワードプライマーと、配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｂ－２）配列番号１からなるフォワードプライマーと、配列番号２の改変塩基配列からなる改変リバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｂ－３）配列番号１の改変塩基配列からなる改変フォワードプライマーと、配列番号２の改変塩基配列からなる改変リバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｃ－１）配列番号１の相補配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の相補配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｃ－２）配列番号１の改変塩基配列の相補配列からなる改変フォワードプライマーと、配列番号２の相補配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｃ－３）配列番号１の相補配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の改変塩基配列の相補配列からなる改変リバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
（１ｃ－４）配列番号１の改変塩基配列の相補配列からなる改変フォワードプライマーと、配列番号２の改変塩基配列の相補配列からなる改変リバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、が挙げられる。
【0015】
ＰＣＲ法としては、タッチダウンＰＣＲ法、ネステッドＰＣＲ法、２ステップ ＰＣＲ法などのいずれを用いてもよいが、迅速に高精度な結果が得られることから、２ステップ ＰＣＲ法が好ましい。２ステップ ＰＣＲ法は、アニーリングと伸長反応のステップを同時に行う方法であり、２つのステップを同時に行うことにより、検出時間の短縮が可能である。また、高温でアニーリングを行うため、反応の特異性が高くなり、高精度な結果が期待できる。
【0016】
本発明でＰＣＲ分析のために使用されるプライマーペア以外の試薬は、公知のものを公知の組合せにより使用することができる。測定に必要な試薬としては、ＰＣＲ用の酵素、ｐＨ緩衝液、ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋源、ろ過処理などにより精製された滅菌水が挙げられる。
【0017】
本発明において使用されるＰＣＲ用の酵素としては、耐熱性DNAポリメラーゼが挙げられる。耐熱性DNAポリメラーゼは、通常用いられるあらゆる耐熱性DNAポリメラーゼを用いることができる。このような酵素として、例えば，pol Ｉ 型DNAポリメラーゼ、α型DNAポリメラーゼ、混合型DNAポリメラーゼ、Hot start用DNAポリメラーゼ等が挙げられる。ポリメラーゼは，通常用いられるあらゆる耐熱性DNAポリメラーゼを用いることができる。このような酵素として，例えば，pol Ｉ 型DNAポリメラーゼ，α型DNAポリメラーゼ，混合型DNAポリメラーゼ，Hot start用DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【0018】
ＰＣＲにおける温度サイクルの条件を含む具体例としては、採用するＰＣＲ法により、適宜調製されるものであるが、
例えば、タッチダウンＰＣＲ法であれば、後述の実験例２－３に示すように、
Tenacibaculum sp. Pbs-1株を、初めに９４℃で１分間、その後９４℃で３０秒間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を３サイクル繰り返し、
最後に、７２℃で３分間反応させた後、４℃でクーリングする方法が一例として挙げられる。
なお、上記ＰＣＲ工程において、（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）とは、１サイクル当たり、０．２℃ずつ温度が低下することを意味する。つまり、上記の場合、反応１サイクル目は６８℃であるところ、２サイクル目で６７．８℃、３サイクル目で６７．６℃と、０．２℃ずつ温度が低下し、１５サイクル目では、６５℃になる。
例えば、タッチダウンＰＣＲ法であれば、後述の実験例２－３に示すように、
Tenacibaculum sp. Pbs-1株を、初めに９４℃で１分間、その後９４℃で３０秒間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を３サイクル繰り返し、
最後に、７２℃で３分間反応させた後、４℃でクーリングする方法が一例として挙げられる。
なお、上記ＰＣＲ工程において、（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）とは、１サイクル当たり、０．２℃ずつ温度が低下することを意味する。つまり、上記の場合、反応１サイクル目は６８℃であるところ、２サイクル目で６７．８℃、３サイクル目で６７．６℃と、０．２℃ずつ温度が低下し、１５サイクル目では、６５℃になる。
【0019】
また、ネステッドＰＣＲ法では、後述の実験例３－１に示すように、
Tenacibaculum sp. Pbs-1株を、最初に、配列番号１のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーを使用して増幅し増幅産物を得た後（以下、「ａ工程」ともいう）、
その増幅産物を鋳型ＤＮＡにして, 配列番号１のフォワードプライマーと配列番号２のリバースプライマーを使用してさらに増幅する（以下、「ｂ工程」ともいう）工程において、
前記のａ工程のＰＣＲプログラムは、以下のとおりとし：
初めに９４℃で３０秒間、その後９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応を７サイクル繰り返した後、
７２℃で３分間反応させ、４℃でクールダウンした。
また前記のｂ工程のＰＣＲプログラムは、以下のとおりとして行う方法が一例として挙げられる。
初めに９４℃で１分間、その後９４℃で３０秒間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を３サイクル繰り返した後、
最後に、７２℃で３分間反応させ、４℃でクールダウンした。
Tenacibaculum sp. Pbs-1株を、最初に、配列番号１のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーを使用して増幅し増幅産物を得た後（以下、「ａ工程」ともいう）、
その増幅産物を鋳型ＤＮＡにして, 配列番号１のフォワードプライマーと配列番号２のリバースプライマーを使用してさらに増幅する（以下、「ｂ工程」ともいう）工程において、
前記のａ工程のＰＣＲプログラムは、以下のとおりとし：
初めに９４℃で３０秒間、その後９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応を７サイクル繰り返した後、
７２℃で３分間反応させ、４℃でクールダウンした。
また前記のｂ工程のＰＣＲプログラムは、以下のとおりとして行う方法が一例として挙げられる。
初めに９４℃で１分間、その後９４℃で３０秒間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を３サイクル繰り返した後、
最後に、７２℃で３分間反応させ、４℃でクールダウンした。
【0020】
また２ＳＴＥＰ ＰＣＲ法では、後述の実験例４－２で示すように、
Tenacibaculum sp. Pbs-1株を、９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒、６９．６℃で１分間の２ｓｔｅｐの反応を３５サイクル繰り返した後、４℃でクーリングする方法が一例として挙げられる。
Tenacibaculum sp. Pbs-1株を、９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒、６９．６℃で１分間の２ｓｔｅｐの反応を３５サイクル繰り返した後、４℃でクーリングする方法が一例として挙げられる。
【0021】
本発明にかかるアコヤ貝殻黒変病原因細菌検出用のキットは、少なくとも
（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかを含み、
これらの構成成分に加えて、前述の「ＰＣＲ用の酵素、ｐＨ緩衝液、ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋源、ろ過処理などにより精製された滅菌水」を含んでも良い。
さらに本発明にかかるキットには、ＰＣＲ法等の手順が記載されている取扱説明書に添付してもよい。
（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せ、
（Ｂ）前記（Ａ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で１または２の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、及び
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の各プライマーペアの一方又は両方のプライマーの塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペアの何れかを含み、
これらの構成成分に加えて、前述の「ＰＣＲ用の酵素、ｐＨ緩衝液、ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋源、ろ過処理などにより精製された滅菌水」を含んでも良い。
さらに本発明にかかるキットには、ＰＣＲ法等の手順が記載されている取扱説明書に添付してもよい。
【実施例0022】
製造例１ Tenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のTenacibaculum属細菌のＤＮＡの準備
以下の実施例等で使用したTenacibaculum sp. Pbs-1株は、非特許文献２に記載の方法で採取したものを使用し、その他の近縁種のTenacibaculum属細菌は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構から購入したものを使用した。またTenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のDNAは、海水サイトファーガ液体培地で約1日培養後の菌体からWizard Genomic DNA Purification Kit(プロメガ)を用いてDNAを抽出した。そのようにして得られたＤＮＡ溶液をテンプレートとしてＰＣＲに用いた。
以下の実施例等で使用したTenacibaculum sp. Pbs-1株は、非特許文献２に記載の方法で採取したものを使用し、その他の近縁種のTenacibaculum属細菌は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構から購入したものを使用した。またTenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のDNAは、海水サイトファーガ液体培地で約1日培養後の菌体からWizard Genomic DNA Purification Kit(プロメガ)を用いてDNAを抽出した。そのようにして得られたＤＮＡ溶液をテンプレートとしてＰＣＲに用いた。
【0023】
ＰＣＲ法における最適な条件の検討
・一般的な３ｓｔｅｐ ＰＣＲ法について
実験例１－１
Tenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のTenacibaculum属細菌のDNAを、以下の手順にて一般的な３－ＳＴＥＰ ＰＣＲ法を用いて増幅した。
ＰＣＲ法に供する反応液は、下記表１に記載の組成の反応液を使用した。
上記表１中、Primer F、Primer R、はそれぞれフォワードプライマー、リバースプライマーを示す。また反応溶液中、Ex Taq buffer、dNTPmix及びEx Taq HSは、タカラバイオ社のものを使用した。
ＰＣＲプログラムは、初めに９４℃で３分間、その後９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３５サイクル繰り返した後、最後に７２℃で３分間反応させ、１５℃でクーリングした。なお、プライマーには16S rRNA遺伝子上に設計した配列番号１のフォワードプライマー（以下「16S フォワード」ともいう）と16S-23S internal spacer region上に設計した配列番号２のリバースプライマー（以下、「リバースｂ」ともいう）及び、配列番号３に示す塩基配列（5’- TCTCTAGGCATTGCCCAGTG-3’）のリバースプライマー（以下、「リバースａ」ともいう）を用いた。
上記の手順によるＰＣＲ法により増幅したTenacibaculum sp. Pbs-1株とその他のTenacibaculum属細菌のＤＮＡを、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動を行い、増幅産物（バンド）を確認した。結果を図１（ａ）及び（ｂ）に示す。なお、図１（ａ）はリバースａを使用したもの、図１（ｂ）はリバースｂを使用したものを示す。
図１（ａ）及び（ｂ）より、リバースｂの方がリバースａに比して、検出される菌数の数はわずかに少ないものの、いずれのリバースもほぼすべての菌種が検出され、Pbs-1株に対する特異性は認められなかった。
・一般的な３ｓｔｅｐ ＰＣＲ法について
実験例１－１
Tenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のTenacibaculum属細菌のDNAを、以下の手順にて一般的な３－ＳＴＥＰ ＰＣＲ法を用いて増幅した。
ＰＣＲ法に供する反応液は、下記表１に記載の組成の反応液を使用した。
【表1】
ＰＣＲプログラムは、初めに９４℃で３分間、その後９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３５サイクル繰り返した後、最後に７２℃で３分間反応させ、１５℃でクーリングした。なお、プライマーには16S rRNA遺伝子上に設計した配列番号１のフォワードプライマー（以下「16S フォワード」ともいう）と16S-23S internal spacer region上に設計した配列番号２のリバースプライマー（以下、「リバースｂ」ともいう）及び、配列番号３に示す塩基配列（5’- TCTCTAGGCATTGCCCAGTG-3’）のリバースプライマー（以下、「リバースａ」ともいう）を用いた。
上記の手順によるＰＣＲ法により増幅したTenacibaculum sp. Pbs-1株とその他のTenacibaculum属細菌のＤＮＡを、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動を行い、増幅産物（バンド）を確認した。結果を図１（ａ）及び（ｂ）に示す。なお、図１（ａ）はリバースａを使用したもの、図１（ｂ）はリバースｂを使用したものを示す。
図１（ａ）及び（ｂ）より、リバースｂの方がリバースａに比して、検出される菌数の数はわずかに少ないものの、いずれのリバースもほぼすべての菌種が検出され、Pbs-1株に対する特異性は認められなかった。
【0024】
なお、図１（ａ）および（ｂ）の記号および番号で示される各レーンは以下の産物及び化合物の電気泳動の結果を示す。
Ｍ： 100bp ラダーマーカー
１： Tenacibaculum sp. Pbs-1株
２： T.ascidiaceicola
３： T.sediminilitoris
４： T.aestuariivivum
５： T.maritimum
６： T.amylolyticum
７： T.mesophilum
８： N.C.(DNAテンプレートの代わりに, 滅菌水を同量加えたもの)
Ｍ： 100bp ラダーマーカー
１： Tenacibaculum sp. Pbs-1株
２： T.ascidiaceicola
３： T.sediminilitoris
４： T.aestuariivivum
５： T.maritimum
６： T.amylolyticum
７： T.mesophilum
８： N.C.(DNAテンプレートの代わりに, 滅菌水を同量加えたもの)
【0025】
実験例１－２
ＰＣＲプログラムを、下記に変更する以外は、実験例１－１と同様にしてＰＣＲを行った。
初めに９４℃で３分間、その後９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３０サイクル繰り返した後、最後に７２℃で３分間反応させ、１５℃でクーリングした。結果を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。なお、図２（ａ）はリバースａを使用したもの、図２はリバースｂを使用したものを示す。また、図２（ａ）および（ｂ）の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図２より、図１と比較して検出される菌種の数は減少したものの、Pbs-1株に対する特異性は認められなかった。
ＰＣＲプログラムを、下記に変更する以外は、実験例１－１と同様にしてＰＣＲを行った。
初めに９４℃で３分間、その後９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３０サイクル繰り返した後、最後に７２℃で３分間反応させ、１５℃でクーリングした。結果を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。なお、図２（ａ）はリバースａを使用したもの、図２はリバースｂを使用したものを示す。また、図２（ａ）および（ｂ）の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図２より、図１と比較して検出される菌種の数は減少したものの、Pbs-1株に対する特異性は認められなかった。
【0026】
・タッチダウン ＰＣＲ法に関する検討
実験例２－１
Tenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のTenacibaculum属細菌のＤＮＡを、以下の手順にてタッチダウン ＰＣＲ法を用いて増幅した。
ＰＣＲ法に供する反応液は、下記表２に記載の組成の反応液を使用した。
実験例２－１
Tenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のTenacibaculum属細菌のＤＮＡを、以下の手順にてタッチダウン ＰＣＲ法を用いて増幅した。
ＰＣＲ法に供する反応液は、下記表２に記載の組成の反応液を使用した。
【0027】
【表2】
【0028】
ＰＣＲプログラムは，初めに９４℃で３分間、その後９４℃で１分間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で１分間、７２℃で１分間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を５サイクル繰り返し、
最後に、７２℃で３分間反応させた後、４℃でクーリングした。なお、使用したプライマーは実験例１－１と同様である。結果を図３（ａ）及び（ｂ）に示す。なお、図３（ａ）はリバースａを使用したもの、図３（ｂ）はリバースｂを使用したものを示す。また図３（ａ）および（ｂ）の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図３より、実験例１－１及び１－２の一般的なＰＣＲ法に比して、Pbs-1株に対する特異性が向上したが、一部他の細菌も検出された。
また、図３（ａ）及び（ｂ）との対比から、リバースｂの方がリバースａに比して、バンドが濃く鮮明であることから、以後の実験では、リバースｂのみを使用して検討を行った。
９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を５サイクル繰り返し、
最後に、７２℃で３分間反応させた後、４℃でクーリングした。なお、使用したプライマーは実験例１－１と同様である。結果を図３（ａ）及び（ｂ）に示す。なお、図３（ａ）はリバースａを使用したもの、図３（ｂ）はリバースｂを使用したものを示す。また図３（ａ）および（ｂ）の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図３より、実験例１－１及び１－２の一般的なＰＣＲ法に比して、Pbs-1株に対する特異性が向上したが、一部他の細菌も検出された。
また、図３（ａ）及び（ｂ）との対比から、リバースｂの方がリバースａに比して、バンドが濃く鮮明であることから、以後の実験では、リバースｂのみを使用して検討を行った。
【0029】
実験例２－２
リバースｂのみを使用し、ＰＣＲプログラムを、下記に変更する以外は、実験例２－１と同様にしてＰＣＲを行った。
初めに９４℃で３分間、その後９４℃で１分間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で１分間、７２℃で１分間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３サイクル繰り返し、
最後に、７２℃で3分間反応させた後、４℃でクーリングした。結果を図４に示す。なお、図４の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図４より、Ｐｂｓ株のみにバンドが検出された。
リバースｂのみを使用し、ＰＣＲプログラムを、下記に変更する以外は、実験例２－１と同様にしてＰＣＲを行った。
初めに９４℃で３分間、その後９４℃で１分間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で１分間、７２℃で１分間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３サイクル繰り返し、
最後に、７２℃で3分間反応させた後、４℃でクーリングした。結果を図４に示す。なお、図４の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図４より、Ｐｂｓ株のみにバンドが検出された。
【0030】
実験例２－３
ＰＣＲプログラムを、下記示す通り、反応時間を短縮するプログラムに変更する以外は、実験例２－２と同様にしてＰＣＲを行った。
初めに９４℃で１分間、その後９４℃で３０秒間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を３サイクル繰り返し、
最後に、７２℃で３分間反応させた後、４℃でクーリングした。結果を図５に示す。なお、図５の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図５より、各反応時間を実験例２－２に比して短縮してもPbs-1株のみにバンドが検出された。
ＰＣＲプログラムを、下記示す通り、反応時間を短縮するプログラムに変更する以外は、実験例２－２と同様にしてＰＣＲを行った。
初めに９４℃で１分間、その後９４℃で３０秒間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を３サイクル繰り返し、
最後に、７２℃で３分間反応させた後、４℃でクーリングした。結果を図５に示す。なお、図５の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図５より、各反応時間を実験例２－２に比して短縮してもPbs-1株のみにバンドが検出された。
【0031】
実験例２－４
菌種をTenacibaculum sp. Pbs-1株のみとし、その濃度を０ｇ～１μｇの範囲になるよう調製してＰＣＲを行う以外は、実験例２－２と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図６に示す。なお、図６の横軸のうち、Ｍは100bp ラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの濃度における電気泳動の結果を示す。
図６より、タッチダウンＰＣＲでは、Pbs-1株の濃度が１０ｎｇの範囲まで検出できることがわかった。
菌種をTenacibaculum sp. Pbs-1株のみとし、その濃度を０ｇ～１μｇの範囲になるよう調製してＰＣＲを行う以外は、実験例２－２と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図６に示す。なお、図６の横軸のうち、Ｍは100bp ラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの濃度における電気泳動の結果を示す。
図６より、タッチダウンＰＣＲでは、Pbs-1株の濃度が１０ｎｇの範囲まで検出できることがわかった。
【0032】
実験例２－５
菌種をTenacibaculum sp. Pbs-1株のみとし、その菌体数を０～１０９cells/mlの範囲になるよう調製してＰＣＲを行う以外は、実験例２－２と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図７に示す。なお、図７の横軸のうち、Ｍは100bp ラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの菌体数における電気泳動の結果を示す。
図７より、タッチダウンＰＣＲでは、Pbs-1株の菌体数が１０９の範囲まで検出できることがわかった。
菌種をTenacibaculum sp. Pbs-1株のみとし、その菌体数を０～１０９cells/mlの範囲になるよう調製してＰＣＲを行う以外は、実験例２－２と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図７に示す。なお、図７の横軸のうち、Ｍは100bp ラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの菌体数における電気泳動の結果を示す。
図７より、タッチダウンＰＣＲでは、Pbs-1株の菌体数が１０９の範囲まで検出できることがわかった。
【0033】
・ネステッド ＰＣＲ法について
実験例３－１
Tenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のTenacibaculum属細菌のＤＮＡを、以下の手順にてネステッド ＰＣＲ法を用いて増幅した。
ＰＣＲ法に供する反応液は、下記表３に記載の組成の反応液を使用した。
上記表３中、Ex Taq buffer、dNTPmix及びEx Taq HSは、実験例１－１と同様のものを使用した。
実験例３－１
Tenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のTenacibaculum属細菌のＤＮＡを、以下の手順にてネステッド ＰＣＲ法を用いて増幅した。
ＰＣＲ法に供する反応液は、下記表３に記載の組成の反応液を使用した。
【表3】
【0034】
最初に、Tenacibaculum sp. Pbs-1株を、実験例１－１等と同様の16S フォワードと23Sに設計した配列番号４に示す塩基配列（5’-ACCAGCGGATTTGCCTACCA-3’）のリバースプライマー(以下、「23S リバース」ともいう)を使用して増幅し増幅産物を得た後（以下、「ａ工程」ともいう）、
その増幅産物を鋳型ＤＮＡにして, 前述の16Sフォワードと前述のリバースbを使用してさらに増幅した（以下、「ｂ工程」ともいう）。
その増幅産物を鋳型ＤＮＡにして, 前述の16Sフォワードと前述のリバースbを使用してさらに増幅した（以下、「ｂ工程」ともいう）。
【0035】
前記のａ工程のＰＣＲプログラムは、以下のとおりである。
初めに９４℃で３０秒間、その後９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応を７サイクル繰り返した後、
７２℃で３分間反応させ、４℃でクールダウンした。
また前記のｂ工程のＰＣＲプログラムは、以下のとおりである。
初めに９４℃で１分間、その後９４℃で３０秒間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を３サイクル繰り返した後、
最後に、７２℃で３分間反応させ、４℃でクールダウンした。
結果を図８に示す。なお、図８の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図８より、実験例３－２のタッチダウンＰＣＲ法（図４参照）に比してより濃いバンドが検出された。
初めに９４℃で３０秒間、その後９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応を７サイクル繰り返した後、
７２℃で３分間反応させ、４℃でクールダウンした。
また前記のｂ工程のＰＣＲプログラムは、以下のとおりである。
初めに９４℃で１分間、その後９４℃で３０秒間、６８℃（－０．２℃／ｃｙｃｌｅ）で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を１５サイクル繰り返した後、
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を３サイクル繰り返した後、
最後に、７２℃で３分間反応させ、４℃でクールダウンした。
結果を図８に示す。なお、図８の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図８より、実験例３－２のタッチダウンＰＣＲ法（図４参照）に比してより濃いバンドが検出された。
【0036】
実験例３－２
菌種をTenacibaculum sp. Pbs-1株のみとし、その濃度を０ｇ～１００ｎｇの範囲になるよう調製してＰＣＲを行う以外は、実験例３－１と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図９に示す。なお、図９の横軸のうち、Ｍは100bp ラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの濃度における電気泳動の結果を示す。
図９より、ネステッドＰＣＲでは、Pbs-1株の濃度が１０ｎｇの範囲まで検出できることがわかった。なお、検出感度は、タッチダウン法と同程度であった。
菌種をTenacibaculum sp. Pbs-1株のみとし、その濃度を０ｇ～１００ｎｇの範囲になるよう調製してＰＣＲを行う以外は、実験例３－１と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図９に示す。なお、図９の横軸のうち、Ｍは100bp ラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの濃度における電気泳動の結果を示す。
図９より、ネステッドＰＣＲでは、Pbs-1株の濃度が１０ｎｇの範囲まで検出できることがわかった。なお、検出感度は、タッチダウン法と同程度であった。
【0037】
・２ＳＴＥＰ ＰＣＲ法に関する検討
実験例４－１
Tenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のTenacibaculum属細菌のＤＮＡを、以下の手順にて２ＳＴＥＰ ＰＣＲ法を用いて増幅した。
ＰＣＲ法に供する反応液は、下記表４に記載の組成の反応液を使用した。
実験例４－１
Tenacibaculum sp. Pbs-1株とその他の近縁種のTenacibaculum属細菌のＤＮＡを、以下の手順にて２ＳＴＥＰ ＰＣＲ法を用いて増幅した。
ＰＣＲ法に供する反応液は、下記表４に記載の組成の反応液を使用した。
【0038】
【表4】
【0039】
ＰＣＲプログラムは，初めに９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒間、６９．６℃で１分間の２ＳＴＥＰ反応を３５サイクル繰り返した後、４℃でクーリングした。
なお、使用したプライマーは実験例２－２と同様である。結果を図１０に示す。なお、図１０の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図１０より、Pbs-1株に太いバンドが検出されたが、他の菌種にもバンドが検出された。
なお、使用したプライマーは実験例２－２と同様である。結果を図１０に示す。なお、図１０の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図１０より、Pbs-1株に太いバンドが検出されたが、他の菌種にもバンドが検出された。
【0040】
実験例４－２
プライマーの濃度を１／２（０．１２５μｇ）に変更する以外は、実験例４－１と同様にして、ＰＣＲ法を行った。結果を図１１に示す。なお、図１１の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図１１より、２ＳＴＥＰ ＰＣＲ法では、タッチダウンＰＣＲ法より濃いバンドが、Pbs-1株のみに検出された。
プライマーの濃度を１／２（０．１２５μｇ）に変更する以外は、実験例４－１と同様にして、ＰＣＲ法を行った。結果を図１１に示す。なお、図１１の記号および番号で示される各レーンは図１と同様である。
図１１より、２ＳＴＥＰ ＰＣＲ法では、タッチダウンＰＣＲ法より濃いバンドが、Pbs-1株のみに検出された。
【0041】
実験例４－３
Tenacibaculum sp. Pbs-1株の濃度を０ｇ～１００ｎｇの範囲になるように調製してＰＣＲを行う以外は、実験例４－２と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図１２に示す。なお、図１２の横軸のうち、Ｍは100bpラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの濃度における電気泳動の結果を示す。
図１２より、２ＳＴＥＰ ＰＣＲでは、Pbs-1株の濃度が１ｎｇの範囲まで検出できることがわかった。この検出感度は、タッチダウン法、ネステッド法に比して、最も優れたものであった。
Tenacibaculum sp. Pbs-1株の濃度を０ｇ～１００ｎｇの範囲になるように調製してＰＣＲを行う以外は、実験例４－２と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図１２に示す。なお、図１２の横軸のうち、Ｍは100bpラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの濃度における電気泳動の結果を示す。
図１２より、２ＳＴＥＰ ＰＣＲでは、Pbs-1株の濃度が１ｎｇの範囲まで検出できることがわかった。この検出感度は、タッチダウン法、ネステッド法に比して、最も優れたものであった。
【0042】
実験例４－４
Tenacibaculum sp. Pbs-1株の菌体数を菌体数が０～１０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲になるように調製してＰＣＲを行う以外は、実験例４－２と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図１３に示す。なお、図１３の横軸のうち、Ｍは100bp ラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの菌体数における電気泳動の結果を示す。
図１３より、２ＳＴＥＰ ＰＣＲでは、Pbs-1株の菌体数が１０９の範囲まで検出できることがわかった。
Tenacibaculum sp. Pbs-1株の菌体数を菌体数が０～１０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲になるように調製してＰＣＲを行う以外は、実験例４－２と同様にしてＰＣＲを行った。結果を図１３に示す。なお、図１３の横軸のうち、Ｍは100bp ラダーマーカーであり、その他は、図中に示されるそれぞれの菌体数における電気泳動の結果を示す。
図１３より、２ＳＴＥＰ ＰＣＲでは、Pbs-1株の菌体数が１０９の範囲まで検出できることがわかった。
【0043】
・実験結果のまとめ
以上の結果より、16S rRNA遺伝子上に設計した配列番号１のフォワードプライマーと16S-23S internal spacer region上に設計した配列番号２のリバースプライマーを用い、２ＳＴＥＰ ＰＣＲ法を用い、「初めに９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒間、６９．６℃で１分間の２ＳＴＥＰ反応を３５サイクル繰り返した後、４℃でクーリングする」というＰＣＲプログラムにより行うＰＣＲ法が、Tenacibaculum sp. Pbs-1株のみの検出に特異的であることが確認された。
以上の結果より、16S rRNA遺伝子上に設計した配列番号１のフォワードプライマーと16S-23S internal spacer region上に設計した配列番号２のリバースプライマーを用い、２ＳＴＥＰ ＰＣＲ法を用い、「初めに９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒間、６９．６℃で１分間の２ＳＴＥＰ反応を３５サイクル繰り返した後、４℃でクーリングする」というＰＣＲプログラムにより行うＰＣＲ法が、Tenacibaculum sp. Pbs-1株のみの検出に特異的であることが確認された。
【0044】
また非特許文献２に記載のPbs-1株の検出法、他の論文に記載のPCRの反応時間を表５にまとめた。表５より、非特許文献２に記載のPbs-1株の検出法と比較して, 1日半程度も短縮できることが確認された。
また表５より、他の論文と比べて, 約30分の時間短縮できることが確認された。
また表５より、他の論文と比べて, 約30分の時間短縮できることが確認された。
【0045】
【表5】
【0046】
【産業上の利用可能性】
【0047】
現在、殻黒変病の原因細菌の感染の有無を確認する方法は、富山大学が開発したＰＣＲ－ＤＧＧＥ（非特許文献２参照）によるものしかなく、操作の煩雑性や検出までに時間がかかることなど問題点も多い。本発明により原因細菌特異検出法をキット化することも可能になると考えられる。キット化された際には養殖地のある県の水産試験場でも簡便に使用することができ、原因細菌の発生状況の把握や感染個体の除去（間引き）など養殖過程での対応もできるようになることから、１級品真珠生産量の増加に大きく貢献することが期待できる。また、本発明で感染対策に関する研究を行う際に細菌の有無を簡便に調べることができ、その進捗を大きく加速させることができると予想できる。そして将来的に、感染対策法が確立された際には生産量が回復（約４０トン／年）し、生産額と輸出額が２倍の３００億円と６００億円になると予想される。加えて、予備的な調査から、日本で養殖されている日本産やベトナム産アコヤガイ（Pinctada fucata）だけでなく、インド洋産アコヤガイ（P. radiata）やクロチョウガイ（P.margaritifera）など、他国の別種母貝でも本疾病と同様の黒変が見られていることから、本発明は、日本だけでなく、世界中の真珠養殖業者が求めているものであり、波及した際には、さらに大きな経済的効果が得られると予想される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】