知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 東芝メディカルシステムズ株式会社の特許一覧 ▶ 一般社団法人日本・多国間臨床試験機構の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022124478
(43)【公開日】2022-08-25
(54)【発明の名称】成人スティル病の検査方法及び検査キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20220818BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20220818BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20220818BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220818BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20220818BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20220818BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 X
C12Q1/06 ZNA
C07K16/18
C12N15/13
G01N33/68
C12P21/08
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022020290
(22)【出願日】2022-02-14
(31)【優先権主張番号】P 2021021500
(32)【優先日】2021-02-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】594164542
【氏名又は名称】キヤノンメディカルシステムズ株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】519390667
【氏名又は名称】一般社団法人日本・多国間臨床試験機構
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】藤田 昌昭
(72)【発明者】
【氏名】黄 政龍
(72)【発明者】
【氏名】和田 洋巳
(72)【発明者】
【氏名】保田 裕貴
(72)【発明者】
【氏名】櫻井 康雄
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045DA36
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QS33
4B063QX02
4B064AG26
4B064AG27
4B064CA19
4B064CA20
4B064CC24
4B064CE06
4B064DA13
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA10
(57)【要約】
【課題】成人スティル病（ＡＳＤ）の判定に有用な方法を提供すること。
【解決手段】以下が提供される。
（Ｉ）下記（１）及び（２）を含む、成人スティル病の検査方法：
（１）被験体から採取された血液試料において変性ＣＲＰ濃度を測定する工程；並びに
（２）測定された変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値を基準値と比較する工程。
（ＩＩ）変性ＣＲＰ特異的な抗体；並びに
（ＩＩＩ）成人スティル病の検査キット。
【選択図】図１１
【解決手段】以下が提供される。
（Ｉ）下記（１）及び（２）を含む、成人スティル病の検査方法：
（１）被験体から採取された血液試料において変性ＣＲＰ濃度を測定する工程；並びに
（２）測定された変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値を基準値と比較する工程。
（ＩＩ）変性ＣＲＰ特異的な抗体；並びに
（ＩＩＩ）成人スティル病の検査キット。
【選択図】図１１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（１）及び（２）を含む、成人スティル病の検査方法：
（１）被験体から採取された血液試料において変性ＣＲＰ濃度を測定する工程；並びに
（２）測定された変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値を基準値と比較する工程。
（１）被験体から採取された血液試料において変性ＣＲＰ濃度を測定する工程；並びに
（２）測定された変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値を基準値と比較する工程。
【請求項2】
被験体が、炎症性疾患に罹患した被験体、又は炎症性疾患に罹患したと疑われる被験体である、請求項１記載の方法。
【請求項3】
被験体が、感染症以外の疾患に罹患した被験体、又は感染症以外の疾患に罹患したと疑われる被験体である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
前記方法が、成人スティル病を血管炎、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症または全身性エリテマトーデスから鑑別するための方法である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
【請求項5】
前記指標値が、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の関係式から算出される値である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
【請求項6】
変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の関係式から算出される値が、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の相対関係式から算出される値である、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
【請求項7】
被験体が、ＣＲＰ値が測定されている被験体である、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
【請求項8】
被験体が、基準値よりも高いＣＲＰ値を示す被験体である、請求項７記載の方法。
【請求項9】
被験体が、ＣＲＰ値が測定されていない被験体であり、
被験体から採取された血液試料において、ＣＲＰ値を測定する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
被験体から採取された血液試料において、ＣＲＰ値を測定する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
【請求項10】
測定されたＣＲＰ値が基準値よりも高い被験体を選別して、前記比較する工程に供することをさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項11】
変性ＣＲＰ濃度が、変性ＣＲＰ特異的な抗体を用いて測定される、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項12】
変性ＣＲＰ濃度が、下記（１）～（３）からなる群より選ばれる変性ＣＲＰ特異的な抗体又はその組合せを用いて測定される、請求項１１記載の方法：
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【請求項13】
下記（１）～（３）からなる群より選ばれる、変性ＣＲＰ特異的な抗体：
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【請求項14】
変性ＣＲＰ特異的な抗体を含む、成人スティル病の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、成人スティル病の検査方法及び検査キットなどに関する。
【背景技術】
【0002】
Ｃ－反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、炎症マーカーとして汎用されている。ＣＲＰとしては、コンホメーションが異なるタイプ、すなわち、ネイティブＣＲＰである五量体ＣＲＰ（ｐＣＲＰ）、及び五量体ＣＲＰの変性により構成因子が解離した変性ＣＲＰ、代表的には、単量体ＣＲＰ（ｍＣＲＰ）が存在し、それぞれ、異なる生理学的役割を果たすことが示唆されている。
【0003】
炎症の指標に利用されているＣＲＰの臨床検査試薬はネイティブＣＲＰの濃度の測定を意図されており、ｍＣＲＰのような変性ＣＲＰの濃度を特異的に測定できるものではないため、臨床の現場では、変性ＣＲＰの濃度測定は、一般的ではない。変性ＣＲＰの濃度としては、急性心筋梗塞患者由来の血漿中の変性ＣＲＰ濃度（２０．９６ｎｇ／ｍＬ）（非特許文献５）、並びに乾癬、湿疹及び蕁麻疹（皮膚関連自己免疫疾患）患者由来の血漿中の変性ＣＲＰ濃度（それぞれ、３５．４ｎｇ／ｍＬ、３０．０ｎｇ／ｍＬ及び５９．８ｎｇ／ｍＬ）（非特許文献６）が報告されている。
【0004】
成人スティル病（Ａｄｕｌｔ Ｓｔｉｌｌ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＳＤ）は、発熱、関節炎、皮疹の３症状を主徴とする疾患である。ＡＳＤには、成人で発症するタイプである成人発症スティル病（Ａｄｕｌｔ Ｏｎｓｅｔ Ｓｔｉｌｌ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＯＳＤ）、及び若年で発症する全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）から移行するＡＳＤがある。ＡＳＤは、類似症状を呈する類似疾患と混同され易い（非特許文献１～３）。そのため、ＡＳＤの診断は、Ｙａｍａｇｕｃｈｉらの分類基準（非特許文献４）にしたがい類似疾患の除外診断が基本とされている。このような類似疾患の一つとして、血管炎がある。しかし、血管炎では、発熱及びＣＲＰ高値のみを呈する症例が認められることがある。このような血管炎の症例では、ＡＳＤとの鑑別が困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】永井弥生，２００６，日本皮膚科学会雑誌，１１６（４）：４２９－４３６．
【非特許文献2】荻野昇，２００９，日本内科学会雑誌，９８（１０）：２４２１－２４３１．
【非特許文献3】長澤浩平，２０１０，日本内科学会雑誌，９９（１０）：２４６０－２４６６．
【非特許文献4】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１９：４２４－４３０．
【非特許文献5】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２０１５，ｖｏｌ．２３９，ｐ．３４３－３４９
【非特許文献6】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８，ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ ５１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本開示の目的は、ＡＳＤの判定に有用な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、鋭意検討した結果、変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値（例、ＣＲＰ変性度）がＡＳＤの検査に有用であることを見出した（実施例５）。興味深いことに、また予想外なことに、ＡＳＤ患者由来の血液試料中の変性ＣＲＰ濃度は、本発明者らが把握している既報の変性ＣＲＰ濃度よりも顕著に高く、また、ＡＳＤは、他の炎症性疾患に比し、最高のＣＲＰ変性度を示した（実施例５）。
【0008】
上記のような知見に基づき、本発明者らは、変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値に基づきＡＳＤを検査及び鑑別できることを見出した。
【0009】
すなわち、本開示は、以下などに関する。
【0010】
一実施形態では、下記（１）及び（２）を含む、成人スティル病の検査方法が開示される：
（１）被験体から採取された血液試料において変性ＣＲＰ濃度を測定する工程；並びに
（２）測定された変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値を基準値と比較する工程。
（１）被験体から採取された血液試料において変性ＣＲＰ濃度を測定する工程；並びに
（２）測定された変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値を基準値と比較する工程。
【0011】
別の実施形態では、変性ＣＲＰ特異的な抗体を含む、成人スティル病の検査キットが開示される。
【0012】
特定の実施形態では、上記方法およびキットにおける被験体は、炎症性疾患に罹患した被験体、又は炎症性疾患に罹患したと疑われる被験体であってもよい。
【0013】
特定の実施形態では、上記方法およびキットにおける被験体は、感染症以外の疾患に罹患した被験体、又は感染症以外の疾患に罹患したと疑われる被験体であってもよい。
【0014】
特定の実施形態では、上記方法およびキットは、成人スティル病を血管炎、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症または全身性エリテマトーデスから鑑別するための方法およびキットであってもよい。
【0015】
特定の実施形態では、上記方法およびキットで利用される指標値は、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の関係式から算出される値であってもよい。
【0016】
特定の実施形態では、上記方法およびキットで利用される、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の関係式から算出される値は、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の相対関係式から算出される値であってもよい。
【0017】
特定の実施形態では、上記方法およびキットにおける被験体は、ＣＲＰ値が測定されている被験体であってもよい。
【0018】
特定の実施形態では、上記方法およびキットにおける被験体は、基準値よりも高いＣＲＰ値を示す被験体であってもよい。
【0019】
特定の実施形態では、上記方法およびキットにおける被験体は、ＣＲＰ値が測定されていない被験体であってもよく、上記方法およびキットは、被験体から採取された血液試料において、ＣＲＰ値を測定する工程、またはＣＲＰに対する抗体をさらに含んでいてもよい。
【0020】
特定の実施形態では、上記方法およびキットは、測定されたＣＲＰ値が基準値よりも高い被験体を選別して、前記比較する工程に供することをさらに含む検査に対応するものであってもよい。
【0021】
特定の実施形態では、上記方法およびキットは、変性ＣＲＰ濃度を、変性ＣＲＰ特異的な抗体を用いて測定するためのものであってもよい。
【0022】
特定の実施形態では、上記方法およびキットは、変性ＣＲＰ濃度を、下記（１）～（３）からなる群より選ばれる変性ＣＲＰ特異的な抗体又はその組合せを用いて測定するためのものであってもよい：
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【0023】
別の実施形態では、下記（１）～（３）からなる群より選ばれる、変性ＣＲＰ特異的な抗体が開示される：
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【発明の効果】
【0024】
本開示によれば、ＡＳＤの検査、並びにＡＳＤを血管炎、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症または全身性エリテマトーデスから鑑別することが可能となり、臨床診断を補助することができる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】図１は、ヒトＣＲＰのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＬ４８２１８）、並びにヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体により認識されるヒトＣＲＰ中の中和エピトープ（配列番号２）（全長アミノ酸配列における９９～１０８位。シグナル除去配列における８１～９０位）を示す図である。
【図2】図２は、ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧを、阻害ＥＬＩＳＡ（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ）により解析した結果を示す図である。阻害（－）：ハイブリドーマの培養上清から精製されたＩｇＧを、ヒト単量体ＣＲＰ（ｍＣＲＰ）及びヒト五量体（ｐＣＲＰ）（単なる「ＣＲＰ」と同義）の双方を含まない溶液とプレインキュベートした溶液を使用した場合の実験結果（コントロール）；ｍＣＲＰ阻害：ハイブリドーマの培養上清から精製されたＩｇＧを、過剰量のヒトｍＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液を使用した場合の実験結果；ｐＣＲＰ阻害：ハイブリドーマの培養上清から精製されたＩｇＧを、過剰量のヒトｐＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液を使用した場合の実験結果（図３、４も同様）。
【図5】図５は、ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃを培養して得られた培養上清から精製された抗体（３Ｃ）における重鎖中のシグナル配列、並びにＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）及びＣＤＲ３（配列番号７）を示す図である。
【図6】図６は、ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃを培養して得られた培養上清から精製された抗体（３Ｃ）における軽鎖中のシグナル配列、並びにＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）及びＣＤＲ３（配列番号１２）を示す図である。
【図7】図７は、ハイブリドーマｍＣＲＰ－１２Ｃを培養して得られた培養上清から精製された抗体（１２Ｃ）における重鎖中のシグナル配列、並びにＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号１６）及びＣＤＲ３（配列番号１７）を示す図である。
【図8】図８は、ハイブリドーマｍＣＲＰ－１２Ｃを培養して得られた培養上清から精製された抗体（１２Ｃ）における軽鎖中のシグナル配列、並びにＣＤＲ１（配列番号２０）、ＣＤＲ２（配列番号２１）及びＣＤＲ３（配列番号２２）を示す図である。
【図9】図９は、ハイブリドーマｍＣＲＰ－１８Ａを培養して得られた培養上清から精製された抗体（１８Ａ）における重鎖中のシグナル配列、並びにＣＤＲ１（配列番号２５）、ＣＤＲ２（配列番号２６）及びＣＤＲ３（配列番号２７）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
（成人スティル病の検査方法）
本開示は、成人スティル病（ＡＳＤ）の検査方法に関する。
本開示は、成人スティル病（ＡＳＤ）の検査方法に関する。
【0027】
検査方法は、下記（１）及び（２）を含む：
（１）被験体から採取された血液試料において変性ＣＲＰ濃度を測定する工程；並びに
（２）測定された変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値を基準値と比較する工程。
（１）被験体から採取された血液試料において変性ＣＲＰ濃度を測定する工程；並びに
（２）測定された変性ＣＲＰ濃度及び／又はそれに基づく指標値を基準値と比較する工程。
【0028】
検査方法では、測定された変性ＣＲＰ濃度が基準値よりも高い場合に成人スティル病の指標とすることができる。また、変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値が変性ＣＲＰ濃度の高さを反映して高く算出される値である場合、測定された変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値が基準値よりも高いときに成人スティル病の指標とすることができる。さらに、変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値が変性ＣＲＰ濃度の高さを反映して低く算出される値である場合、測定された変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値が基準値よりも低いときに成人スティル病の指標とすることができる。
【0029】
被験体としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ハムスター等の齧歯類；イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウマ、ウシ、ブタ等のペット又は使役動物）が挙げられる。好ましくは、被験体は、ヒトである。
【0030】
一実施形態では、被験体は、炎症性疾患に罹患した被験体、又は炎症性疾患に罹患したと疑われる被験体であってもよい。このような被験体において、炎症性疾患としてＡＳＤに罹患している可能性があるか検査できる。ＡＳＤと鑑別されるべき炎症性疾患としては、例えば、血管炎、関節炎（例、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節炎、若年性関節炎）、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症、感染症（例、ウイルス、微生物、寄生虫）、心筋梗塞、皮膚関連炎症性疾患（例、乾癬、湿疹及び蕁麻疹）が挙げられる。上記方法によれば、基準値等の条件を適宜設定することにより、ＡＳＤを、このような炎症性疾患から鑑別することができる。
【0031】
別の実施形態では、被験体は、感染症以外の疾患に罹患した被験体、又は感染症以外の疾患に罹患したと疑われる被験体であってもよい。感染症は、その症状に応じて診断がしばしば容易な場合がある。また、感染症は病原体（例、ウイルス、微生物）の特定（例、遺伝子・ゲノムの検出）により確定診断できるため、ＡＳＤは、感染症と判別し易い場合も多い。よって、ＡＳＤの検査では、感染症以外の炎症性疾患に罹患した被験体、又は感染症以外の炎症性疾患に罹患したと疑われる被験体が検査されてもよい。
【0032】
さらに別の実施形態では、被験体は、ＡＳＤと血管炎、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症または全身性エリテマトーデスとの鑑別が所望される被験体であってもよい。
【0033】
特定の実施形態では、被験体は、ＣＲＰ値が測定されている被験体であってもよい。この場合、基準値よりも高いＣＲＰ値を示す被験体を検査方法に供することができる。ＣＲＰの臨床検査では、検査機関や各国で基準が異なり得るものの、正常範囲にあるＣＲＰ濃度の一つの目安として、３μｇ／ｍＬ（０．３ｍｇ／ｄＬ）未満の濃度が採用されることが多い。したがって、このような基準値は、３μｇ／Ｌ以上の濃度、好ましくは５μｇ／ｍＬ以上の濃度、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上の濃度、さらにより好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上の濃度、特に好ましくは３０μｇ／ｍＬ以上の濃度、４０μｇ／ｍＬ以上の濃度、又は５０μｇ／ｍＬ以上の濃度であってもよい。このような基準値はまた、１００μｇ／ｍＬ以下の濃度、好ましくは９０μｇ／ｍＬ以下の濃度、より好ましくは８０μｇ／ｍＬ以下の濃度、さらにより好ましくは７０μｇ／ｍＬ以下の濃度、特に好ましくは６０μｇ／ｍＬ以下の濃度であってもよい。より具体的には、このような基準値は、３～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは５～９０μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０～８０μｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは２０～７０μｇ／ｍＬ、特に好ましくは３０～６０μｇ／ｍＬ、４０～６０μｇ／ｍＬ、又は５０～６０μｇ／ｍＬであってもよい。
【0034】
また、被験体においてＣＲＰ値が既に測定されている場合、再度のＣＲＰ値の測定を省略できるため、変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値（例、後述するような、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の関係式から算出される値）を簡便に算出することができる。
【0035】
別の特定の実施形態では、被験体は、ＣＲＰ値が測定されていない被験体であってもよい。この場合、検査方法は、被験体から採取された血液試料において、ＣＲＰ値を測定する工程をさらに含んでいてもよい。このような工程により、ＣＲＰ値の測定後に、測定されたＣＲＰ値が基準値よりも高い被験体を選別すること、及び変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値（例、後述するような、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の関係式から算出される値）を算出することが可能である。
【0036】
血液試料としては、例えば、全血（末梢血）、血漿及び血清、並びにこれらを処理した試料が挙げられる。このような処理としては、例えば、遠心分離、分画、抽出、ろ過、沈殿、冷蔵、凍結、及び加熱が挙げられる。
【0037】
濃度は、単位溶液量あたりの目的物質の含有量（例、ｇ／Ｌ、モル濃度等の相対値で規定される値）である。したがって、濃度は、所定量の溶液中の目的物質の絶対値（例、グラム、モル数）として評価されてもよい。
【0038】
変性ＣＲＰ濃度の測定は、変性ＣＲＰの量を測定できる任意の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、イムノアッセイ、及びクロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー）が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、ブロッティング法（例、ウエスタンブロット法）、ラテックス凝集法が挙げられる。イムノアッセイでは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、改変抗体（例、単鎖抗体、Ｆｃフラグメント）等の任意の抗体を用いることができる。
【0039】
変性ＣＲＰ濃度の測定がイムノアッセイにより行われる場合、イムノアッセイは、変性ＣＲＰ特異的な抗体を用いて行うことができる。
【0040】
「変性ＣＲＰ特異的な抗体」とは、ネイティブＣＲＰに対する結合能よりも、変性ＣＲＰ（好ましくは、ヒト単量体ＣＲＰ）に対する結合能が高い抗体をいう。
【0041】
「ヒト単量体ＣＲＰ」（ｍＣＲＰ）とは、配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＬ４８２１８）を有する、ヒトＣＲＰの単量体タンパク質（シグナル配列は除去されていてもよい）又はその天然に生じる変異体（例、天然バリアント、又はＳＮＰ若しくはハプロタイプ）をいう。
【0042】
「ネイティブＣＲＰ」とは、上記ヒト単量体ＣＲＰから構成される五量体タンパク質をいう。
【0043】
「変性ＣＲＰ」とは、上記ネイティブＣＲＰの変性により構成因子が解離した変性ＣＲＰをいう。変性ＣＲＰとしては、例えば、単量体ＣＲＰ（ｍＣＲＰ）、二量体ＣＲＰ、三量体ＣＲＰ、及び四量体ＣＲＰ、並びにこれらの１種以上（例、２種、３種、４種）の組み合わせが挙げられる。
【0044】
イムノアッセイによる変性ＣＲＰ濃度の測定では、２種以上の抗体が用いられてもよい。変性ＣＲＰ濃度の測定において２種以上の抗体が用いられる場合（例、サンドイッチアッセイ）、変性ＣＲＰ特異的な２種の抗体（同種又は異種、好ましくは異種）を含む抗体のセットを用いることができる。あるいは、変性ＣＲＰ特異的な１種の抗体及びネイティブＣＲＰに対する１種の抗体の組み合わせを含む抗体のセットが用いられてもよい。少なくとも１種の抗体が変性ＣＲＰ特異的な抗体であれば、変性ＣＲＰを測定できるためである。好ましくは、変性ＣＲＰに対する特異性の向上の観点から、変性ＣＲＰ特異的な２種の抗体を含む抗体のセットが用いられてもよい。例えば、２種以上の抗体が用いられる場合、少なくとも１種の抗体は固相抗体として用いることができ、少なくとも１種の抗体は標識抗体として用いることができる。
【0045】
変性ＣＲＰ特異的な抗体は、１）抗原として変性ＣＲＰ（好ましくは、ヒト単量体ＣＲＰ）を用いることにより、変性ＣＲＰに対する抗体を産生するハイブリドーマを作製し、２）抗原として変性ＣＲＰ及び五量体ＣＲＰを用いて、五量体ＣＲＰに対する結合能よりも、単量体ＣＲＰに対する結合能が高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、３）選択されたハイブリドーマの培養上清から抗体を単離することにより、又はハイブリドーマにより産生される抗体の遺伝子を組み込んだ形質転換細胞の培養物から抗体を単離することにより、得ることができる。変性ＣＲＰ特異的な抗体の確認は、抗原として変性ＣＲＰ及び五量体ＣＲＰを用いて、試験抗体が、五量体ＣＲＰに対する結合能よりも、変性ＣＲＰに対する結合能が高いことを確認することにより行うことができる（例、実施例に記載される阻害ＥＬＩＳＡを参照）。あるいは、変性ＣＲＰ特異的な抗体としては公知の抗体（例、非特許文献３及び４）が存在するので、このような公知の抗体を変性ＣＲＰ特異的な抗体として利用することもできる。
【0046】
好ましくは、変性ＣＲＰ特異的な抗体は、後述する抗体であってもよい。
【0047】
一実施形態では、測定された変性ＣＲＰ濃度が、基準値と比較される。ＡＳＤでは、血液試料中の変性ＣＲＰ濃度が高いことが明らかにされている（実施例５）。したがって、測定された変性ＣＲＰ濃度と基準値との比較の結果、測定された変性ＣＲＰ濃度が基準値よりも高い場合、被験体がＡＳＤに罹患している可能性があると判定できる。
【0048】
別の実施形態では、測定された変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値が、基準値と比較される。このような指標値は、変性ＣＲＰ濃度の高さを反映できる指標である限り特に限定されない。また、ＡＳＤにおいて血液試料中のＣＲＰ値が高いこと、及びＡＳＤにおいてＣＲＰ値に対する変性ＣＲＰ濃度の相対比率（変性ＣＲＰ濃度／ＣＲＰ値）であるＣＲＰ変性度が高いという知見が明らかにされているので（実施例５）、指標値は、このような相対比に基づき設定することができる。
【0049】
ＣＲＰ値の測定は、ＣＲＰの量を測定できる任意の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、上述したようなイムノアッセイ、及びクロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー）が挙げられる。
【0050】
ＣＲＰ値の測定がイムノアッセイにより行われる場合、イムノアッセイは、ＣＲＰに対する抗体を用いて行うことができる。炎症の指標に利用されている、ＣＲＰに対する抗体を含むＣＲＰの臨床検査試薬は、ネイティブＣＲＰの濃度の測定を通常は意図されているものの、変性ＣＲＰへの結合性が確認又は開示されていない場合がある。これは、ネイティブＣＲＰは古典的な炎症マーカーとして従来から汎用されていたものの、変性ＣＲＰの存在及び意義は従来不明であり、変性ＣＲＰへの結合性を確認する動機付けに欠け、又は変性ＣＲＰへの結合性を開示する必要性が無い又は低いためであったと考えられる。したがって、ＣＲＰの臨床検査試薬は、その種類によっては、ネイティブＣＲＰ及び少なくとも一部の変性ＣＲＰに結合できる抗体を含み、ネイティブＣＲＰ及び少なくとも一部の変性ＣＲＰの合計濃度を測定している場合もあると考えられる。したがって、ＣＲＰ値は、ネイティブＣＲＰ濃度、又はネイティブＣＲＰ濃度及び少なくとも一部の変性ＣＲＰの濃度の合計濃度であってもよい。ＣＲＰの測定では、ネイティブＣＲＰの濃度のみを測定できるＣＲＰの臨床検査試薬、並びにネイティブＣＲＰ及び少なくとも一部の変性ＣＲＰの合計濃度を測定できるＣＲＰの臨床検査試薬のいずれも使用することができる。また、ネイティブＣＲＰ及び変性ＣＲＰに結合できる抗体は公知であるため（例、特開２００４－１８９６６５号公報）、このような公知の抗体が測定に用いられてもよい。
【0051】
好ましい実施形態では、変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値は、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の関係式から算出される値である。ＡＳＤでは、上述のとおり、変性ＣＲＰ濃度が高いこと、ＣＲＰ値が高いこと、及びＣＲＰ値に対する変性ＣＲＰ濃度の相対比率が高いという知見が明らかにされているためである。変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値は、鑑別されるべき被験体の種類（例、健常被験体、炎症性疾患患者、血管炎患者、関節リウマチ患者、リウマチ性多発筋痛症患者、全身性エリテマトーデス患者）、並びに所望される診断感度及び診断特異度等の因子に応じて異なり、検査目的に応じて適宜設定することができる。
【0052】
変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の関係式から算出される値としては、例えば、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の相対関係式から算出される値、及び変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の非相対関係式から算出される値が挙げられる。
【0053】
変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の相対関係式から算出される値としては、例えば、下記式から算出される値が挙げられる。
（Ａ）（変性ＣＲＰ濃度）ｎ１／（ＣＲＰ値）ｍ１
〔ここで、ｎ１は、任意の指数（簡潔には１の整数）であり、ｍ１は、任意の指数（簡潔には１の整数）である〕
（Ｂ）（ＣＲＰ値）ｎ２／（変性ＣＲＰ濃度）ｍ２
〔ここで、ｎ２は、任意の指数（簡潔には１の整数）であり、ｍ２は、任意の指数（簡潔には１の整数）である〕
（Ａ）の関係式から算出される値は、変性ＣＲＰ濃度の高さを反映して高く算出される値である。したがって、（Ａ）の関係式から算出される値が指標値として使用される場合、指標値が基準値よりも高いときに、被験体がＡＳＤに罹患している可能性があると判定できる。
一方、（Ｂ）の関係式から算出される値は、変性ＣＲＰ濃度の高さを反映して低く算出される値である。したがって、（Ｂ）の関係式から算出される値が指標値として使用される場合、指標値が基準値よりも低いときに、被験体がＡＳＤに罹患している可能性があると判定できる。
（Ａ）（変性ＣＲＰ濃度）ｎ１／（ＣＲＰ値）ｍ１
〔ここで、ｎ１は、任意の指数（簡潔には１の整数）であり、ｍ１は、任意の指数（簡潔には１の整数）である〕
（Ｂ）（ＣＲＰ値）ｎ２／（変性ＣＲＰ濃度）ｍ２
〔ここで、ｎ２は、任意の指数（簡潔には１の整数）であり、ｍ２は、任意の指数（簡潔には１の整数）である〕
（Ａ）の関係式から算出される値は、変性ＣＲＰ濃度の高さを反映して高く算出される値である。したがって、（Ａ）の関係式から算出される値が指標値として使用される場合、指標値が基準値よりも高いときに、被験体がＡＳＤに罹患している可能性があると判定できる。
一方、（Ｂ）の関係式から算出される値は、変性ＣＲＰ濃度の高さを反映して低く算出される値である。したがって、（Ｂ）の関係式から算出される値が指標値として使用される場合、指標値が基準値よりも低いときに、被験体がＡＳＤに罹患している可能性があると判定できる。
【0054】
簡潔には、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の上記相対関係式から算出される値は、下記式から算出される値であってもよい。
（Ａ’）ＣＲＰ値に対する変性ＣＲＰ濃度の比率（変性ＣＲＰ濃度／ＣＲＰ値）（すなわち、ＣＲＰ変性度）
（Ｂ’）変性ＣＲＰ濃度に対するＣＲＰ値の比率（ＣＲＰ値／変性ＣＲＰ濃度）
（Ａ’）ＣＲＰ値に対する変性ＣＲＰ濃度の比率（変性ＣＲＰ濃度／ＣＲＰ値）（すなわち、ＣＲＰ変性度）
（Ｂ’）変性ＣＲＰ濃度に対するＣＲＰ値の比率（ＣＲＰ値／変性ＣＲＰ濃度）
【0055】
変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の非相対関係式から算出される値としては、例えば、下記式から算出される値が挙げられる。
（Ｃ）（変性ＣＲＰ濃度）ｎ５×（ＣＲＰ値）ｍ５
〔ここで、ｎ５は、任意の指数（最も簡潔には１の整数）であり、ｍ５は、任意の指数（最も簡潔には１の整数）である〕
（Ｃ）の関係式から算出される値は、変性ＣＲＰ濃度の高さを反映して高く算出される値である。したがって、（Ｃ）の関係式から算出される値が指標値として使用される場合、指標値が基準値よりも高いときに、被験体がＡＳＤに罹患している可能性があると判定できる。
（Ｃ）（変性ＣＲＰ濃度）ｎ５×（ＣＲＰ値）ｍ５
〔ここで、ｎ５は、任意の指数（最も簡潔には１の整数）であり、ｍ５は、任意の指数（最も簡潔には１の整数）である〕
（Ｃ）の関係式から算出される値は、変性ＣＲＰ濃度の高さを反映して高く算出される値である。したがって、（Ｃ）の関係式から算出される値が指標値として使用される場合、指標値が基準値よりも高いときに、被験体がＡＳＤに罹患している可能性があると判定できる。
【0056】
簡潔には、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の上記非相対関係式から算出される値は、下記式から算出される値であってもよい。
（Ｃ’）変性ＣＲＰ濃度×ＣＲＰ値
（Ｃ’）変性ＣＲＰ濃度×ＣＲＰ値
【0057】
変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の関係式から算出される値としては、変性ＣＲＰ濃度とＣＲＰ値との間の相対関係式から算出される値が好ましく、上記式（Ａ）又は（Ｂ）から算出される値がより好ましく、上記式（Ａ）から算出される値（すなわち、ＣＲＰ変性度）が特に好ましい。
【0058】
変性ＣＲＰ濃度又はそれに基づく指標値の基準値は、鑑別されるべき被験体の種類（例、健常被験体、炎症性疾患患者、血管炎患者、関節リウマチ患者、リウマチ性多発筋痛症患者、全身性エリテマトーデス患者）、並びに所望される診断感度及び診断特異度等の因子に応じて異なり得る。例えば、このような基準値としては、比較被験体（例、健常被験体、炎症性疾患患者、血管炎患者、関節リウマチ患者、リウマチ性多発筋痛症患者、全身性エリテマトーデス患者）の血液試料における変性ＣＲＰ濃度又はそれに基づく指標値について通常の範囲内にある値を適宜用いることができる。また、このような基準値としては、例えば、カットオフ値、又は比較被験体由来の血液試料中の変性ＣＲＰ濃度又はそれに基づく指標値の平均値、もしくは当該平均値に一定の値を加算した値（例、平均値＋ＳＤ、平均値＋２ＳＤ）が使用されてもよい。カットオフ値は、当業者であれば適宜設定することができる。このような基準値はまた、変性ＣＲＰ濃度及びＣＲＰ値の測定方法の種類（例、イムノアッセイに用いた抗体の種類）、及びＣＲＰ値による被験体の選別のためのカットオフ値としてのＣＲＰ値の使用の有無等の因子に応じて変動することがある。
【0059】
より具体的には、変性ＣＲＰ濃度又はそれに基づく指標値の例を示すとすれば、変性ＣＲＰ濃度の基準値は、例えば、２００ｎｇ／ｍＬ以上の値、好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ以上の値、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ以上の値、さらにより好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ以上の値であってもよい（表５、７）。また、変性ＣＲＰ濃度の基準値として、上限値を便宜的に設けてもよい。例えば、このような上限値は、３０００ｎｇ／ｍＬ以下の値、２５００ｎｇ／ｍＬ以下の値、２０００ｎｇ／ｍＬ以下の値、又は１５００ｎｇ／ｍＬ以下の値であってもよい。
【0060】
あるいは、変性ＣＲＰ濃度に基づく指標値としてＣＲＰ変性度（変性ＣＲＰ濃度／ＣＲＰ値）を示すと、変性ＣＲＰ濃度（ｎｇ／ｍＬ）およびＣＲＰ値（μｇ／ｍＬ）という異なる濃度単位で比率を計算すると、ＣＲＰ変性度の基準値は、２．２以上の値、好ましくは２．３以上の値、より好ましくは２．４以上の値、さらにより好ましくは２．６以上の値であってもよい（表５、７）。また、ＣＲＰ変性度の基準値として、上限値を便宜的に設けてもよい。例えば、このような上限値は、１００以下の値、５０以下の値、２０以下の値、１０以下の値、８以下の値、又は６以下の値であってもよい。当然のことながら、同じ濃度単位（ｎｇ／ｍＬ）で比率を計算する場合、上記基準値は、１０－３の値となる。
【0061】
変性ＣＲＰ濃度又はそれに基づく指標値は、複数組み合わせて用いられてもよい。例えば、組合せとして、変性ＣＲＰ濃度とそれに基づく１以上の指標値の組み合わせ、及び変性ＣＲＰ濃度に基づく２以上の指標値の組み合わせを用いることができる。このような場合、各基準値の値を緩やかに設定することもできる。
【0062】
ＡＳＤ患者の変性ＣＲＰ濃度は、ＣＲＰ値が高い値を示す炎症性疾患の中でも突出して高い。したがって、上述の方法によれば、ＡＳＤ（例、ＡＯＳＤ）患者を、所定の被験体（例、健常被験体、炎症性疾患患者、血管炎患者、関節リウマチ患者、リウマチ性多発筋痛症患者、全身性エリテマトーデス患者）から鑑別することができる。したがって、上述の方法は、ＡＳＤ（例、ＡＯＳＤ）の検査に有用である。
【0063】
（抗体）
本開示は、変性ＣＲＰ特異的な抗体及びそれに関連する発明に関する。
本開示は、変性ＣＲＰ特異的な抗体及びそれに関連する発明に関する。
【0064】
抗体は、下記（１）～（３）からなる群より選ばれる抗体であってもよい。
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～１４１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【0065】
好ましくは、抗体は、下記（１）～（３）からなる群より選ばれる抗体であってもよい。
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～４６９位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～２３８位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～４６５位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～２４０位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～４７６位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～２４０位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖。
（１）下記（１ａ）及び（１ｂ）を含む抗体
（１ａ）配列番号４のアミノ酸配列における２０～４６９位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖、及び
（１ｂ）配列番号９のアミノ酸配列における２０～２３８位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖、
（２）下記（２ａ）及び（２ｂ）を含む抗体
（２ａ）配列番号１４のアミノ酸配列における２０～４６５位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖、及び
（２ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列における２１～２４０位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖、並びに
（３）下記（３ａ）及び（３ｂ）を含む抗体
（３ａ）配列番号２４のアミノ酸配列における２０～４７６位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖；及び
（３ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列における２１～２４０位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖。
【0066】
あるいは、抗体は、（ａ）配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、または配列番号７１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖、及び（ｂ）配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、または配列番号７９のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む抗体であってもよい。
【0067】
上記同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上であってもよい。同一性の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、同一性の算定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。
【0068】
また、目的のアミノ酸配列に対して所望の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対する所望の数のアミノ酸残基の変異によって特定することができる。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸残基の欠失、置換、付加及び挿入からなる群より選ばれる１、２、３又は４種の変異である。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。例えば、目的のアミノ酸配列が４００個以上のアミノ酸残基から構成される場合、目的のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して４０個以下のアミノ酸残基の変異が許容され、目的のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して２０個以下のアミノ酸残基の変異が許容される。また、目的のアミノ酸配列が３００個以上のアミノ酸残基から構成される場合、目的のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して３０個以下のアミノ酸残基の変異が許容され、目的のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して１５個以下のアミノ酸残基の変異が許容される。さらに、目的のアミノ酸配列が２００個以上のアミノ酸残基から構成される場合、目的のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して２０個以下のアミノ酸残基の変異が許容され、目的のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して１０個以下のアミノ酸残基の変異が許容される。また、目的のアミノ酸配列が１００個以上のアミノ酸残基から構成される場合、目的のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して１０個以下のアミノ酸残基の変異が許容され、目的のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基の変異が許容される。
【0069】
ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例、ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥが挙げられ、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧである。
【0070】
本開示はまた、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ及びＲＮＡを挙げることができ、ＤＮＡが好ましい。
【0071】
本開示はまた、上記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターに関する。プロモーターとしては、例えば、所望の宿主細胞で高発現している遺伝子のプロモーター、及びウイルス由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、構成的プロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。
【0072】
発現ベクターはまた、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、及び薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【0073】
発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。
【0074】
発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、又は人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、又はＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。
【0075】
本開示はまた、上記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換細胞に関する。
【0076】
「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする最小単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、及び薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。発現単位はまた、タンパク質として発現されるべき１つのポリヌクレオチド、及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、モノシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）、又はタンパク質として発現されるべき複数のポリヌクレオチド（例えば、重鎖をコードするポリヌクレオチド、及び軽鎖をコードするポリヌクレオチド）、並びにそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）であってもよい。発現単位は、１又は２以上（例、１、２、３、４、又は５）の異なる位置においてゲノム領域中に含まれていてもよい。非ゲノム領域に含まれる発現単位の具体的な形態としては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、及び人工染色体が挙げられる。プロモーターは、上述のものと同様である。
【0077】
形質転換細胞は、当該分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えば、形質転換細胞は、発現ベクターを用いる方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）、又はゲノム改変技術により作製することができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））によれば、発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことが可能である。形質転換細胞の宿主細胞としては、例えば、真核細胞〔例、動物細胞（例、哺乳動物細胞）、植物細胞、真核微生物〕、及び原核細胞（例、原核微生物）が挙げられる。
【0078】
（検査キット）
本開示はまた、変性ＣＲＰ特異的な抗体を含む検査キットに関する。
本開示はまた、変性ＣＲＰ特異的な抗体を含む検査キットに関する。
【0079】
変性ＣＲＰ特異的な抗体の詳細は、上述のとおりである。
【0080】
一実施形態では、キットは、ＡＳＤの検査キットである。
【0081】
別の実施形態では、キットは、ＣＲＰに対する抗体又はＣＲＰの臨床検査試薬をさらに含んでいてもよい。すなわち、キットは、変性ＣＲＰ特異的な抗体と、ＣＲＰに対する抗体又はＣＲＰの臨床検査試薬との組合せを含む疾患の検査キットであってもよい。本発明者らが把握する限り、変性ＣＲＰ特異的な抗体により測定できる変性ＣＲＰ濃度と、ＣＲＰに対する抗体又はＣＲＰの臨床検査試薬により測定できるＣＲＰ値との比率（例、ＣＲＰ変性度）が疾患の診断に有用であることは、今回初めて見出されたものである。すなわち、本発明者らの研究成果によれば、これらの組合せを用いる動機付けが初めて生じるものの、このような比率に着目していない先行技術では、これらを組み合わせる動機付けはない。したがって、疾患の診断におけるこのような組合せの使用は、先行技術から容易に想到できるものではない。
【0082】
特定の実施形態では、キットは、変性ＣＲＰ濃度の測定（例、サンドイッチイムノアッセイ）のため、２種以上の抗体を含んでいてもよい。このような２種以上の抗体としては、変性ＣＲＰ特異的な２種の抗体（同種又は異種、好ましくは異種）を含む抗体のセットを用いることができる。あるいは、変性ＣＲＰ特異的な１種の抗体及びネイティブＣＲＰに対する１種の抗体の組み合わせを含む抗体のセットが用いられてもよい。少なくとも１種の抗体が変性ＣＲＰ特異的な抗体であれば、変性ＣＲＰを測定できるためである。好ましくは、変性ＣＲＰに対する特異性の向上の観点から、変性ＣＲＰ特異的な２種の抗体を含む抗体のセットが用いられてもよい。例えば、２種以上の抗体が用いられる場合、少なくとも１種の抗体は固相抗体として用いることができ、少なくとも１種の抗体は標識抗体として用いることができる。
【0083】
別の特定の実施形態では、キットは、イムノアッセイ用キットである。キットは、好ましくはＥＬＩＳＡ用キットであり、より好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡ用キットである。したがって、キットは、以下を含んでいてもよい：
（１）変性ＣＲＰ特異的な第１抗体（固相抗体）；
（２）変性ＣＲＰ特異的な第２抗体（標識抗体）；及び
（３）固相。
（１）変性ＣＲＰ特異的な第１抗体（固相抗体）；
（２）変性ＣＲＰ特異的な第２抗体（標識抗体）；及び
（３）固相。
【0084】
さらに別の特定の実施形態では、キットは、変性ＣＲＰ濃度に加えてＣＲＰ値を測定できるイムノアッセイ用キットである。キットは、ＣＲＰに対する１種以上の抗体をさらに含む。キットは、好ましくはＥＬＩＳＡ用キットであり、より好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡ用キットである。したがって、キットは、以下を含んでいてもよい：
（１）変性ＣＲＰ特異的な第１抗体（固相抗体）；
（２）変性ＣＲＰ特異的な第２抗体（標識抗体）；
（３）（ａ）ＣＲＰに対する第１抗体とＣＲＰに対する第２抗体との組合せ、又は（ｂ）ＣＲＰの臨床検査薬；及び
（４）固相。
（１）変性ＣＲＰ特異的な第１抗体（固相抗体）；
（２）変性ＣＲＰ特異的な第２抗体（標識抗体）；
（３）（ａ）ＣＲＰに対する第１抗体とＣＲＰに対する第２抗体との組合せ、又は（ｂ）ＣＲＰの臨床検査薬；及び
（４）固相。
【0085】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、改変抗体（例、単鎖抗体、Ｆｃフラグメント）等の任意の抗体を用いることができる。抗体は、固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、プレート、支持体、膜、粒子（例、磁性粒子、ラテックス粒子）が挙げられる。例えば、キットがＥＬＩＳＡ用キットである場合、固相抗体が固定された固相、および標識抗体を含むように、キットは構成されていてもよい。また、キットが、ＥＬＩＳＡ用キット以外のキット、例えば、免疫クロマトグラフィー用キットである場合、目的物質に対する固相抗体および標識抗体が固定された支持体を含むように、キットは構成されていてもよい。
【0086】
キットはまた、補助的な手段を含んでいてもよい。このような補助的な手段としては、例えば、緩衝液、安定化剤、抗体の標識に用いられる酵素およびその酵素の基質、血液の予備処理用の容器（例、採血管）が挙げられる。
【0087】
キットは、例えば、上記方法において好適に利用することができる。
【実施例0088】
以下の実施例により本開示をより詳細に説明するが、本開示は以下の実施例に限定されるものではない。
【0089】
実施例１：ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体の作製
（１）抗原（ヒトｍＣＲＰ）の調製
ヒト５量体ＣＲＰ（Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｅｕｒａｌ Ｆｌｕｉｄ，Ｌｅｅ ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，カタログ番号：１４０－１１）（ヒトｐＣＲＰ）を、８Ｍ Ｕｒｅａ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中にて３７℃で２時間処理し、ヒト単量体ＣＲＰ（ヒトｍＣＲＰ）溶液を調製した。調製後、透析チューブを用いて、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）、１５ｍＭ ＮａＣｌ中にて透析した。透析した溶液を透析チューブに移した後、４℃、３，５００ｘｇにて遠心し、濃縮した。
（１）抗原（ヒトｍＣＲＰ）の調製
ヒト５量体ＣＲＰ（Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｅｕｒａｌ Ｆｌｕｉｄ，Ｌｅｅ ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，カタログ番号：１４０－１１）（ヒトｐＣＲＰ）を、８Ｍ Ｕｒｅａ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中にて３７℃で２時間処理し、ヒト単量体ＣＲＰ（ヒトｍＣＲＰ）溶液を調製した。調製後、透析チューブを用いて、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）、１５ｍＭ ＮａＣｌ中にて透析した。透析した溶液を透析チューブに移した後、４℃、３，５００ｘｇにて遠心し、濃縮した。
【0090】
（２）抗原（ヒトｍＣＲＰ）によるマウスの免疫
抗原（ヒトｍＣＲＰ）濃度を２００μｇ／０．５ｍＬに調製し、アジュバントを同量加えガラスシリンジにてエマルジョンを作製した。アジュバントは、初回免疫時のみフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ， ＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ）を使用し、２回目以降はフロイント不完全アジュバント（ＦＩＣＡ， ＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ）を使用した。４回免疫後、抗体価上昇を確認し、最終免疫（ｉ．ｐ．／５０μｇ／匹）を行った。
得られたエマルジョンをマウスの皮下及び皮内に２７Ｇ注射針を用いて注射した。以後７日毎に合計４回免疫し、４回免疫後の７日後に尾静脈より少量採血した。ヒトｍＣＲＰを固相化したイムノプレートに、希釈抗血清を添加し、抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ検出により、抗血清の力価を確認した。具体的には、抗血清の力価の確認は、以下の固相ＥＬＩＳＡにより行った。
抗原（ヒトｍＣＲＰ）濃度を２００μｇ／０．５ｍＬに調製し、アジュバントを同量加えガラスシリンジにてエマルジョンを作製した。アジュバントは、初回免疫時のみフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ， ＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ）を使用し、２回目以降はフロイント不完全アジュバント（ＦＩＣＡ， ＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ）を使用した。４回免疫後、抗体価上昇を確認し、最終免疫（ｉ．ｐ．／５０μｇ／匹）を行った。
得られたエマルジョンをマウスの皮下及び皮内に２７Ｇ注射針を用いて注射した。以後７日毎に合計４回免疫し、４回免疫後の７日後に尾静脈より少量採血した。ヒトｍＣＲＰを固相化したイムノプレートに、希釈抗血清を添加し、抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ検出により、抗血清の力価を確認した。具体的には、抗血清の力価の確認は、以下の固相ＥＬＩＳＡにより行った。
【0091】
（３）固相ＥＬＩＳＡ
固相ＥＬＩＳＡの材料としては、以下を用いた。
（ａ）プレート：Ｎｕｎｃ製 ＥＬＩＳＡ用イムノプレート（９６ウェル）
（ｂ）基質：Ｏ．Ｐ．Ｄ ｔａｂｌｅｔ（ＳＩＧＭＡ）
（ｃ）固相化用緩衝液：０．１Ｍ炭酸緩衝液，ｐＨ９．５（ＩＢＬ）
（ｄ）抗血清希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（関東化学） ｉｎ ＰＢＳ
（ｅ）標識抗体希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ＰＢＳ
（ｆ）洗浄用緩衝液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ０．１Ｍ リン酸バッファー
（ｇ）基質用緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）
（ｈ）反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ－Ｈ２ＳＯ４（和光純薬）
（ｉ）固相タンパク質：ヒトｍＣＲＰ，又はＢＳＡ（コントロール）
固相ＥＬＩＳＡの材料としては、以下を用いた。
（ａ）プレート：Ｎｕｎｃ製 ＥＬＩＳＡ用イムノプレート（９６ウェル）
（ｂ）基質：Ｏ．Ｐ．Ｄ ｔａｂｌｅｔ（ＳＩＧＭＡ）
（ｃ）固相化用緩衝液：０．１Ｍ炭酸緩衝液，ｐＨ９．５（ＩＢＬ）
（ｄ）抗血清希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（関東化学） ｉｎ ＰＢＳ
（ｅ）標識抗体希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ＰＢＳ
（ｆ）洗浄用緩衝液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ０．１Ｍ リン酸バッファー
（ｇ）基質用緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）
（ｈ）反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ－Ｈ２ＳＯ４（和光純薬）
（ｉ）固相タンパク質：ヒトｍＣＲＰ，又はＢＳＡ（コントロール）
【0092】
固相ＥＬＩＳＡは、以下の手順により行った。
（ａ）タンパク質を、５０ｎｇ／ウェル（５０μＬ／ウェル）で用いて、４℃で１６時間放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相タンパク質を、ダルベッコＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）サンプル（抗血清）を希釈用緩衝液にて希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｇ）標識抗体である抗マウスＩｇＧ（γ特異的）－ＨＲＰを各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｉ）基質液（４００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて１５分間反応させた。
（ｊ）１５分後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
（ａ）タンパク質を、５０ｎｇ／ウェル（５０μＬ／ウェル）で用いて、４℃で１６時間放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相タンパク質を、ダルベッコＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）サンプル（抗血清）を希釈用緩衝液にて希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｇ）標識抗体である抗マウスＩｇＧ（γ特異的）－ＨＲＰを各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｉ）基質液（４００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて１５分間反応させた。
（ｊ）１５分後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
【0093】
（４）ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体を産生するハイブリドーマの調製
上記固相ＥＬＩＳＡによりヒトｍＣＲＰに対する有意な力価の上昇が確認されたマウスから採取された脾臓細胞又はリンパ節細胞をミエローマ細胞（Ｘ－６３．Ａｇ８ ６５３（ＡＴＣＣ））と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて細胞融合した（９６ウェルプレート１９枚）。ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）選択培地を用いて、ハイブリドーマを選択的に培養した。その後、ハイブリドーマのコロニー形成を確認し、ハイブリドーマの培養物の上清希釈物をサンプルとして用いて、上述の固相ＥＬＩＳＡ（固相抗原：ヒトｍＣＲＰ）によるスクリーニングを行い、３６個の陽性クローンを選択した。
上記固相ＥＬＩＳＡによりヒトｍＣＲＰに対する有意な力価の上昇が確認されたマウスから採取された脾臓細胞又はリンパ節細胞をミエローマ細胞（Ｘ－６３．Ａｇ８ ６５３（ＡＴＣＣ））と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて細胞融合した（９６ウェルプレート１９枚）。ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）選択培地を用いて、ハイブリドーマを選択的に培養した。その後、ハイブリドーマのコロニー形成を確認し、ハイブリドーマの培養物の上清希釈物をサンプルとして用いて、上述の固相ＥＬＩＳＡ（固相抗原：ヒトｍＣＲＰ）によるスクリーニングを行い、３６個の陽性クローンを選択した。
【0094】
（５）阻害ＥＬＩＳＡ（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ）
次に、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体を産生するハイブリドーマを、阻害ＥＬＩＳＡにより選択した。
阻害ＥＬＩＳＡでは、サンプルとして、（ｉ）ハイブリドーマの培養上清を、過剰量のヒトｍＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液、（ｉｉ）ハイブリドーマの培養上清を、過剰量のヒトｐＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液、（ｉｉｉ）ハイブリドーマの培養上清を、ヒトｍＣＲＰ及びヒトｐＣＲＰの双方を含まない溶液とプレインキュベートした溶液（コントロール）を用いて、上述したような固相ＥＬＩＳＡ（固相抗原：ヒトｍＣＲＰ）を行った。このような阻害ＥＬＩＳＡでは、ヒトｍＣＲＰに特異的に結合する能力を有する抗ヒトｍＣＲＰ抗体を産生するハイブリドーマの培養上清は、（ｉ）では、溶液中のヒトｍＣＲＰと結合するため固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できないことから、シグナルが実質的に検出されない。一方、このような培養上清は、（ｉｉ）では、溶液中のヒトｐＣＲＰと結合しないため固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できることから、十分なシグナルが検出される。また、このような培養上清は、（ｉｉｉ）では、溶液中にヒトｍＣＲＰ及びヒトｐＣＲＰが存在しないので固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できるため、十分なシグナルが検出される。
次に、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体を産生するハイブリドーマを、阻害ＥＬＩＳＡにより選択した。
阻害ＥＬＩＳＡでは、サンプルとして、（ｉ）ハイブリドーマの培養上清を、過剰量のヒトｍＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液、（ｉｉ）ハイブリドーマの培養上清を、過剰量のヒトｐＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液、（ｉｉｉ）ハイブリドーマの培養上清を、ヒトｍＣＲＰ及びヒトｐＣＲＰの双方を含まない溶液とプレインキュベートした溶液（コントロール）を用いて、上述したような固相ＥＬＩＳＡ（固相抗原：ヒトｍＣＲＰ）を行った。このような阻害ＥＬＩＳＡでは、ヒトｍＣＲＰに特異的に結合する能力を有する抗ヒトｍＣＲＰ抗体を産生するハイブリドーマの培養上清は、（ｉ）では、溶液中のヒトｍＣＲＰと結合するため固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できないことから、シグナルが実質的に検出されない。一方、このような培養上清は、（ｉｉ）では、溶液中のヒトｐＣＲＰと結合しないため固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できることから、十分なシグナルが検出される。また、このような培養上清は、（ｉｉｉ）では、溶液中にヒトｍＣＲＰ及びヒトｐＣＲＰが存在しないので固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できるため、十分なシグナルが検出される。
【0095】
具体的には、阻害ＥＬＩＳＡは、以下のとおり行った。
（ａ）ヒトｍＣＲＰを、希釈用緩衝液で４０μｇ／ｍＬに調整した（溶液ａ１）。又はヒトｐＣＲＰを、希釈用緩衝液で４０μｇ／ｍＬに調整した（溶液ａ２）。
（ｂ）培養上清を、希釈用緩衝液にて２倍希釈した（溶液２）。
（ｃ）溶液ａ１を溶液２と各５０μＬずつ混和して、培養上清中の抗体とヒトｍＣＲＰを、４℃で１６時間以上反応させた。また、溶液ａ２を溶液２と各５０μＬずつ混和して、培養上清中の抗体とヒトｐＣＲＰを、４℃で１６時間以上反応させた。
（ｄ）以降の手順は、固相ＥＬＩＳＡの上述した（ａ）～（ｊ）の手順と同様であった。阻害ＥＬＩＳＡの（ｃ）で得られた溶液を、固相ＥＬＩＳＡの（ｅ）で用いられたサンプルとして用いた。結果を表１に示す。
（ａ）ヒトｍＣＲＰを、希釈用緩衝液で４０μｇ／ｍＬに調整した（溶液ａ１）。又はヒトｐＣＲＰを、希釈用緩衝液で４０μｇ／ｍＬに調整した（溶液ａ２）。
（ｂ）培養上清を、希釈用緩衝液にて２倍希釈した（溶液２）。
（ｃ）溶液ａ１を溶液２と各５０μＬずつ混和して、培養上清中の抗体とヒトｍＣＲＰを、４℃で１６時間以上反応させた。また、溶液ａ２を溶液２と各５０μＬずつ混和して、培養上清中の抗体とヒトｐＣＲＰを、４℃で１６時間以上反応させた。
（ｄ）以降の手順は、固相ＥＬＩＳＡの上述した（ａ）～（ｊ）の手順と同様であった。阻害ＥＬＩＳＡの（ｃ）で得られた溶液を、固相ＥＬＩＳＡの（ｅ）で用いられたサンプルとして用いた。結果を表１に示す。
【0096】
【表1】
【0097】
その結果、３６個の陽性クローンのうちの多くのクローンにおいて、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に比し（ｉ）ではシグナルが小さい値を示した。このことは、多くのクローンが、ヒトｍＣＲＰに特異的に結合する能力を有する抗ヒトｍＣＲＰ抗体を産生することを示す。これらのクローンのなかから、（ｉ）ではシグナルが実質的に検出されない一方で、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）では十分なシグナルが検出された７種のクローン（３，１２，１８，１９，２１，３５，３６）を選択した。このような７種のクローンは、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有する優れたヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体を産生できると考えられる。
【0098】
（６）ハイブリドーマの一次クローニングとサブクラスの同定
選抜した７種のクローンを限界希釈法により、１次クローニングした。２週間後、ＥＩＡ法にてスクリーニングを行い陽性ウェルを選抜した。陽性ウェルを３ウェル（Ａ，Ｂ，Ｃ）ずつ選抜し上清を採取し、固相ＥＬＩＳＡ、及び阻害ＥＬＩＳＡを行った。その結果、１種のクローンでは、良好な抗体反応性が確認されなかったが、６種のクローン（クローン番号３，１２，１８，１９，２１，３５）にそれぞれ対応する３種のサブクローン（Ａ，Ｂ，Ｃ）において、良好な抗体反応性が確認された。以降の実験は、これらのサブクローン（３Ｃ、１２Ｃ、１８Ａ、１９Ｃ、２１Ａ、３５Ａ）を用いた。
選抜した７種のクローンを限界希釈法により、１次クローニングした。２週間後、ＥＩＡ法にてスクリーニングを行い陽性ウェルを選抜した。陽性ウェルを３ウェル（Ａ，Ｂ，Ｃ）ずつ選抜し上清を採取し、固相ＥＬＩＳＡ、及び阻害ＥＬＩＳＡを行った。その結果、１種のクローンでは、良好な抗体反応性が確認されなかったが、６種のクローン（クローン番号３，１２，１８，１９，２１，３５）にそれぞれ対応する３種のサブクローン（Ａ，Ｂ，Ｃ）において、良好な抗体反応性が確認された。以降の実験は、これらのサブクローン（３Ｃ、１２Ｃ、１８Ａ、１９Ｃ、２１Ａ、３５Ａ）を用いた。
【0099】
次に、各クローン１個の培養上清を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによるサブクラスチェックを実施したところ、結果は以下であった。
（ａ）ｍＣＲＰ－３Ｃ：マウスＩｇＧ２ｂ，κ
（ｂ）ｍＣＲＰ－１２Ｃ：マウスＩｇＧ１，κ
（ｃ）ｍＣＲＰ－１８Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ｄ）ｍＣＲＰ－１９Ｃ：マウスＩｇＧ１，κ
（ｅ）ｍＣＲＰ－２１Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ｆ）ｍＣＲＰ－３５Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ａ）ｍＣＲＰ－３Ｃ：マウスＩｇＧ２ｂ，κ
（ｂ）ｍＣＲＰ－１２Ｃ：マウスＩｇＧ１，κ
（ｃ）ｍＣＲＰ－１８Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ｄ）ｍＣＲＰ－１９Ｃ：マウスＩｇＧ１，κ
（ｅ）ｍＣＲＰ－２１Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ｆ）ｍＣＲＰ－３５Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
【0100】
（７）ＩｇＧ精製
６種のハイブリドーマ（３Ｃ，１２Ｃ，１８Ａ，１９Ｃ，２１Ａ，３５Ａ）を常法により培養して得られた培養上清からＩｇＧを精製し、ｍＣＲＰに対する結合能を分析した。
６種のハイブリドーマ（３Ｃ，１２Ｃ，１８Ａ，１９Ｃ，２１Ａ，３５Ａ）を常法により培養して得られた培養上清からＩｇＧを精製し、ｍＣＲＰに対する結合能を分析した。
【0101】
ＩｇＧの精製及び分析に用いた材料及び機器は、以下である。
（ａ）プロテインＡカラム
（ｂ）結合緩衝液（グリシン－ＮａＣｌ，ｐＨ８．９）
（ｃ）溶出緩衝液（クエン酸，ｐＨ４．０）
（ｄ）再生緩衝液（クエン酸，ｐＨ２．０）
（ｅ）Ｄ－ＰＢＳ
（ｆ）吸光度モニタ－２８０ｎｍ（ＡＴＴＯ）
（ｇ）ＡＫＴＡシステム（ＧＥヘルスケア）
（ｈ）ＡＫＴＡ用分析カラム（ＧＥヘルスケア）
（ａ）プロテインＡカラム
（ｂ）結合緩衝液（グリシン－ＮａＣｌ，ｐＨ８．９）
（ｃ）溶出緩衝液（クエン酸，ｐＨ４．０）
（ｄ）再生緩衝液（クエン酸，ｐＨ２．０）
（ｅ）Ｄ－ＰＢＳ
（ｆ）吸光度モニタ－２８０ｎｍ（ＡＴＴＯ）
（ｇ）ＡＫＴＡシステム（ＧＥヘルスケア）
（ｈ）ＡＫＴＡ用分析カラム（ＧＥヘルスケア）
【0102】
ＩｇＧの精製及び分析は、以下のとおり行った。
（ＩｇＧの精製）
（ａ）培養上清を０．４５μｍで濾過し、硫安塩析後、結合緩衝液で希釈した。
（ｂ）結合緩衝液に平衡化されたＰｒｏｔｅｉｎＡカラムへ添加した。
（ｃ）結合緩衝液で夾雑蛋白の除去のためカラムを十分に洗浄した。
（ｄ）溶出緩衝液でＩｇＧ溶出する。回収容器に、あらかじめ回収液の１／１０量程度の中和緩衝液を入れておき、溶出物のｐＨを中和した。
（ｅ）溶出物をＰＢＳに冷蔵下で、透析した。
（ｆ）ＩｇＧを回収し、０．２２μｍで濾過した。
（ｇ）ＯＤ２８０ｎｍを測定しＩｇＧ濃度を算出した。
（ｈ）限外濾過法により、５ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮し、０．２２μｍにてフィルトレーション後、分注凍結保存した。
（ＩｇＧの精製）
（ａ）培養上清を０．４５μｍで濾過し、硫安塩析後、結合緩衝液で希釈した。
（ｂ）結合緩衝液に平衡化されたＰｒｏｔｅｉｎＡカラムへ添加した。
（ｃ）結合緩衝液で夾雑蛋白の除去のためカラムを十分に洗浄した。
（ｄ）溶出緩衝液でＩｇＧ溶出する。回収容器に、あらかじめ回収液の１／１０量程度の中和緩衝液を入れておき、溶出物のｐＨを中和した。
（ｅ）溶出物をＰＢＳに冷蔵下で、透析した。
（ｆ）ＩｇＧを回収し、０．２２μｍで濾過した。
（ｇ）ＯＤ２８０ｎｍを測定しＩｇＧ濃度を算出した。
（ｈ）限外濾過法により、５ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮し、０．２２μｍにてフィルトレーション後、分注凍結保存した。
【0103】
（ＩｇＧの分析）
（ａ）２８０ｎｍの吸光度を測定し、Ａ２８０＝１．３８２を１ｍｇ／ｍＬとしてタンパク濃度を算出した。
（ｂ）ＡＫＴＡ ＦＰＬＣによるゲル濾過分析により、純度を確認した。
（ｃ）上述の固相ＥＬＩＳＡにて力価を確認した。
その結果、６種のハイブリドーマを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧはいずれも、ヒトｍＣＲＰに対する結合能を有することが確認された。
（ａ）２８０ｎｍの吸光度を測定し、Ａ２８０＝１．３８２を１ｍｇ／ｍＬとしてタンパク濃度を算出した。
（ｂ）ＡＫＴＡ ＦＰＬＣによるゲル濾過分析により、純度を確認した。
（ｃ）上述の固相ＥＬＩＳＡにて力価を確認した。
その結果、６種のハイブリドーマを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧはいずれも、ヒトｍＣＲＰに対する結合能を有することが確認された。
【0104】
実施例２：ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマの２次スクリーニング
実施例１で得られたハイブリドーマのサブクローン（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）を、限界希釈法により２次クローニングした。細胞培養、並びにＩｇＧの精製及び分析は、それぞれ、実施例１と同様にして行った。
その結果、上述の固相ＥＬＩＳＡにて力価を確認したところ、２次クローニングに供された３種のハイブリドーマ（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）を培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧはいずれも、ヒトｍＣＲＰに対する結合能を有することが確認された。
また、これらのハイブリドーマを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧを、実施例１（５）に記載した阻害ＥＬＩＳＡにより解析したところ、これらのＩｇＧは、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体であることが確認された（図２～４）。
実施例１で得られたハイブリドーマのサブクローン（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）を、限界希釈法により２次クローニングした。細胞培養、並びにＩｇＧの精製及び分析は、それぞれ、実施例１と同様にして行った。
その結果、上述の固相ＥＬＩＳＡにて力価を確認したところ、２次クローニングに供された３種のハイブリドーマ（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）を培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧはいずれも、ヒトｍＣＲＰに対する結合能を有することが確認された。
また、これらのハイブリドーマを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧを、実施例１（５）に記載した阻害ＥＬＩＳＡにより解析したところ、これらのＩｇＧは、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体であることが確認された（図２～４）。
【0105】
実施例３：ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体の構造解析
実施例２で２次スクリーニングされた３種のハイブリドーマ（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）よりｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製した。マウス重鎖及び軽鎖特異的なプライマーを用いて、５’－ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法を行い、重鎖及び軽鎖のＮ末の塩基配列を決定した。Ｎ末塩基配列の翻訳開始メチオニン周辺配列をＮ末側プライマーとして、重鎖及び軽鎖の全長ｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングした。ＣＤＲ及び可変領域は、ＮＣＢＩにおけるＩｇＢＬＡＳＴを利用してＫａｂａｔらの定義にしたがい決定した。
その結果、各ハイブリドーマにより産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体は、下記表２に示される構造的特徴を有していた（図５～１０も参照のこと）。
実施例２で２次スクリーニングされた３種のハイブリドーマ（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）よりｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製した。マウス重鎖及び軽鎖特異的なプライマーを用いて、５’－ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法を行い、重鎖及び軽鎖のＮ末の塩基配列を決定した。Ｎ末塩基配列の翻訳開始メチオニン周辺配列をＮ末側プライマーとして、重鎖及び軽鎖の全長ｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングした。ＣＤＲ及び可変領域は、ＮＣＢＩにおけるＩｇＢＬＡＳＴを利用してＫａｂａｔらの定義にしたがい決定した。
その結果、各ハイブリドーマにより産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体は、下記表２に示される構造的特徴を有していた（図５～１０も参照のこと）。
【0106】
【表2】
【0107】
以上より、上記のようなＣＤＲを含む抗体がヒトｍＣＲＰを特異的に認識できることが示された。
【0108】
以降では、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体について、下記略称を使用することがある。
１）ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：３Ｃ抗体
２）ハイブリドーマｍＣＲＰ－１２Ｃから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：１２Ｃ抗体
３）ハイブリドーマｍＣＲＰ－１８Ａから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：１８Ａ抗体
１）ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：３Ｃ抗体
２）ハイブリドーマｍＣＲＰ－１２Ｃから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：１２Ｃ抗体
３）ハイブリドーマｍＣＲＰ－１８Ａから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：１８Ａ抗体
【0109】
実施例４：ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体のエピトープ解析
（１）ペプチド合成（その１）
３Ｃ抗体のエピトープを解析した。先ず、エピトープ解析に使用する下記ペプチドを合成した。下記ペプチドは、固相への固定を可能にするため、ヒトｍＣＲＰのエピトープのＣ末端にシステイン残基（Ｃ）が付加されている。
（１）ペプチド合成（その１）
３Ｃ抗体のエピトープを解析した。先ず、エピトープ解析に使用する下記ペプチドを合成した。下記ペプチドは、固相への固定を可能にするため、ヒトｍＣＲＰのエピトープのＣ末端にシステイン残基（Ｃ）が付加されている。
【0110】
１）ｍＣＲＰ（１９）：ＱＴＤＭＳＲＫＡＦＶＣ（配列番号３３）
２）ｍＣＲＰ（２９）：ＦＰＫＥＳＤＴＳＹＶＣ（配列番号３４）
３）ｍＣＲＰ（３９）：ＳＬＫＡＰＬＴＫＰＬＣ（配列番号３５）
４）ｍＣＲＰ（４９）：ＫＡＦＴＶＣＬＨＦＹＣ（配列番号３６）
５）ｍＣＲＰ（５９）：ＴＥＬＳＳＴＲＧＹＳＣ（配列番号３７）
６）ｍＣＲＰ（６９）：ＩＦＳＹＡＴＫＲＱＤＣ（配列番号３８）
７）ｍＣＲＰ（７９）：ＮＥＩＬＩＦＷＳＫＤＣ（配列番号３９）
８）ｍＣＲＰ（８９）：ＩＧＹＳＦＴＶＧＧＳＣ（配列番号４０）
９）ｍＣＲＰ（９９）：ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴＣ（配列番号４１）
１０）ｍＣＲＰ（１０９）：ＶＡＰＶＨＩＣＴＳＷＣ（配列番号４２）
１１）ｍＣＲＰ（１１９）：ＥＳＡＳＧＩＶＥＦＷＣ（配列番号４３）
１２）ｍＣＲＰ（１２９）：ＶＤＧＫＰＲＶＲＫＳＣ（配列番号４４）
１３）ｍＣＲＰ（１３９）：ＬＫＫＧＹＴＶＧＡＥＣ（配列番号４５）
１４）ｍＣＲＰ（１４９）：ＡＳＩＩＬＧＱＥＱＤＣ（配列番号４６）
１５）ｍＣＲＰ（１５９）：ＳＦＧＧＮＦＥＧＳＱＣ（配列番号４７）
１６）ｍＣＲＰ（１６９）：ＳＬＶＧＤＩＧＮＶＮＣ（配列番号４８）
１７）ｍＣＲＰ（１７９）：ＭＷＤＦＶＬＳＰＤＥＣ（配列番号４９）
１８）ｍＣＲＰ（１８９）：ＩＮＴＩＹＬＧＧＰＦＣ（配列番号５０）
１９）ｍＣＲＰ（１９９）：ＳＰＮＶＬＮＷＲＡＬＣ（配列番号５１）
２０）ｍＣＲＰ（２０９）：ＫＹＥＶＱＧＥＶＦＴＫＰＱＬＷＰＣ（配列番号５２）
２）ｍＣＲＰ（２９）：ＦＰＫＥＳＤＴＳＹＶＣ（配列番号３４）
３）ｍＣＲＰ（３９）：ＳＬＫＡＰＬＴＫＰＬＣ（配列番号３５）
４）ｍＣＲＰ（４９）：ＫＡＦＴＶＣＬＨＦＹＣ（配列番号３６）
５）ｍＣＲＰ（５９）：ＴＥＬＳＳＴＲＧＹＳＣ（配列番号３７）
６）ｍＣＲＰ（６９）：ＩＦＳＹＡＴＫＲＱＤＣ（配列番号３８）
７）ｍＣＲＰ（７９）：ＮＥＩＬＩＦＷＳＫＤＣ（配列番号３９）
８）ｍＣＲＰ（８９）：ＩＧＹＳＦＴＶＧＧＳＣ（配列番号４０）
９）ｍＣＲＰ（９９）：ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴＣ（配列番号４１）
１０）ｍＣＲＰ（１０９）：ＶＡＰＶＨＩＣＴＳＷＣ（配列番号４２）
１１）ｍＣＲＰ（１１９）：ＥＳＡＳＧＩＶＥＦＷＣ（配列番号４３）
１２）ｍＣＲＰ（１２９）：ＶＤＧＫＰＲＶＲＫＳＣ（配列番号４４）
１３）ｍＣＲＰ（１３９）：ＬＫＫＧＹＴＶＧＡＥＣ（配列番号４５）
１４）ｍＣＲＰ（１４９）：ＡＳＩＩＬＧＱＥＱＤＣ（配列番号４６）
１５）ｍＣＲＰ（１５９）：ＳＦＧＧＮＦＥＧＳＱＣ（配列番号４７）
１６）ｍＣＲＰ（１６９）：ＳＬＶＧＤＩＧＮＶＮＣ（配列番号４８）
１７）ｍＣＲＰ（１７９）：ＭＷＤＦＶＬＳＰＤＥＣ（配列番号４９）
１８）ｍＣＲＰ（１８９）：ＩＮＴＩＹＬＧＧＰＦＣ（配列番号５０）
１９）ｍＣＲＰ（１９９）：ＳＰＮＶＬＮＷＲＡＬＣ（配列番号５１）
２０）ｍＣＲＰ（２０９）：ＫＹＥＶＱＧＥＶＦＴＫＰＱＬＷＰＣ（配列番号５２）
【0111】
（２）エピトープ解析（その１）
エピトープ解析の材料としては、以下を用いた。
（ａ）プレート：Ｎｕｎｃ製 ＥＬＩＳＡ用イムノプレート（９６ウェル）
（ｂ）基質：Ｏ．Ｐ．Ｄ ｔａｂｌｅｔ（ＳＩＧＭＡ）
（ｃ）固相化用緩衝液：０．１Ｍ炭酸緩衝液 ｐＨ９．５（ＩＢＬ）
（ｄ）抗血清希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（関東化学） ｉｎ ＰＢＳ
（ｅ）標識抗体希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ＰＢＳ
（ｆ）洗浄用緩衝液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ０．１ＭＰＢ
（ｇ）基質用緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）（ＩＢＬ）
（ｈ）反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ－Ｈ２ＳＯ４（和光純薬）
（ｉ）固相ペプチド
エピトープ解析の材料としては、以下を用いた。
（ａ）プレート：Ｎｕｎｃ製 ＥＬＩＳＡ用イムノプレート（９６ウェル）
（ｂ）基質：Ｏ．Ｐ．Ｄ ｔａｂｌｅｔ（ＳＩＧＭＡ）
（ｃ）固相化用緩衝液：０．１Ｍ炭酸緩衝液 ｐＨ９．５（ＩＢＬ）
（ｄ）抗血清希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（関東化学） ｉｎ ＰＢＳ
（ｅ）標識抗体希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ＰＢＳ
（ｆ）洗浄用緩衝液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ０．１ＭＰＢ
（ｇ）基質用緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）（ＩＢＬ）
（ｈ）反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ－Ｈ２ＳＯ４（和光純薬）
（ｉ）固相ペプチド
【0112】
エピトープ解析は、以下の手順により行った。
（ａ）ペプチドを、５０ｎｇ／ウェル（５０μＬ／ウェル）で用いて、４℃で１６時間放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相ペプチドを、ダルベッコＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）抗体を希釈用緩衝液にて１μｇ／ｍＬに希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｇ）標識抗体である抗マウスＩｇＧ（γ特異的）－ＨＲＰを各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｉ）基質液（４００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて１５分間反応させた。
（ｊ）１５分後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
（ａ）ペプチドを、５０ｎｇ／ウェル（５０μＬ／ウェル）で用いて、４℃で１６時間放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相ペプチドを、ダルベッコＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）抗体を希釈用緩衝液にて１μｇ／ｍＬに希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｇ）標識抗体である抗マウスＩｇＧ（γ特異的）－ＨＲＰを各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｉ）基質液（４００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて１５分間反応させた。
（ｊ）１５分後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
【0113】
その結果、３Ｃ抗体は、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）を含むペプチドに対して、ｍＣＲＰと同様の反応性を示した（表３）。また、上記（ｅ）において、各ウェルに添加する抗体濃度を５μｇ／ｍＬに変更した場合にも、同様の結果が確認された。なお、ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体である１２Ｃ抗体、１８Ａ抗体（図３、４）について、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）を含むペプチドに対して結合するか確認したところ、このペプチドに対して結合しなかった。このことは、これらの抗体が３Ｃ抗体と異なるエピトープを認識していることを示す。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体のエピトープは１種のみではなく、複数種存在すると考えられる。
【0114】
【表3】
【0115】
以上より、ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体のエピトープとして、３Ｃ抗体のエピトープであるＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）（図１）を含む複数のエピトープが存在すると考えられた。
【0116】
（３）ペプチド合成（その２）
３Ｃ抗体のエピトープを追試のため解析した。エピトープとしては、上記１）～２０）のペプチドに代えて、より長い下記ペプチドを合成して使用した。
２１）ｍＣＲＰ（１－３０）：ＱＴＤＭＳＲＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤＴＳＹＶＳＬＫＡＰＬＴＫＰＬＣ（配列番号５３）
２２）ｍＣＲＰ（３１－６０）：ＫＡＦＴＶＣＬＨＦＹＴＥＬＳＳＴＲＧＹＳＩＦＳＹＡＴＫＲＱＤＣ（配列番号５４）
２３）ｍＣＲＰ（６１－９０）：ＮＥＩＬＩＦＷＳＫＤＩＧＹＳＦＴＶＧＧＳＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴＣ（配列番号５５）
２４）ｍＣＲＰ（９１－１２０）：ＶＡＰＶＨＩＣＴＳＷＥＳＡＳＧＩＶＥＦＷＶＤＧＫＰＲＶＲＫＳＣ（配列番号５６）
２５）ｍＣＲＰ（１２１－１５０）：ＬＫＫＧＹＴＶＧＡＥＡＳＩＩＬＧＱＥＱＤＳＦＧＧＮＦＥＧＳＱＣ（配列番号５７）
２６）ｍＣＲＰ（１５１－１８０）：ＳＬＶＧＤＩＧＮＶＮＭＷＤＦＶＬＳＰＤＥＩＮＴＩＹＬＧＧＰＦＣ（配列番号５８）
２７）ｍＣＲＰ（１８１－２０６）：ＳＰＮＶＬＮＷＲＡＬＫＹＥＶＱＧＥＶＦＴＫＰＱＬＷＰＣ（配列番号５９）
３Ｃ抗体のエピトープを追試のため解析した。エピトープとしては、上記１）～２０）のペプチドに代えて、より長い下記ペプチドを合成して使用した。
２１）ｍＣＲＰ（１－３０）：ＱＴＤＭＳＲＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤＴＳＹＶＳＬＫＡＰＬＴＫＰＬＣ（配列番号５３）
２２）ｍＣＲＰ（３１－６０）：ＫＡＦＴＶＣＬＨＦＹＴＥＬＳＳＴＲＧＹＳＩＦＳＹＡＴＫＲＱＤＣ（配列番号５４）
２３）ｍＣＲＰ（６１－９０）：ＮＥＩＬＩＦＷＳＫＤＩＧＹＳＦＴＶＧＧＳＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴＣ（配列番号５５）
２４）ｍＣＲＰ（９１－１２０）：ＶＡＰＶＨＩＣＴＳＷＥＳＡＳＧＩＶＥＦＷＶＤＧＫＰＲＶＲＫＳＣ（配列番号５６）
２５）ｍＣＲＰ（１２１－１５０）：ＬＫＫＧＹＴＶＧＡＥＡＳＩＩＬＧＱＥＱＤＳＦＧＧＮＦＥＧＳＱＣ（配列番号５７）
２６）ｍＣＲＰ（１５１－１８０）：ＳＬＶＧＤＩＧＮＶＮＭＷＤＦＶＬＳＰＤＥＩＮＴＩＹＬＧＧＰＦＣ（配列番号５８）
２７）ｍＣＲＰ（１８１－２０６）：ＳＰＮＶＬＮＷＲＡＬＫＹＥＶＱＧＥＶＦＴＫＰＱＬＷＰＣ（配列番号５９）
【0117】
（４）エピトープ解析（その２）
エピトープ解析の材料は、実施例４（２）と同じであった。エピトープ解析の手順は、実施例４（２）と同様にして行った。
その結果、３Ｃ抗体は、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）を含むペプチドに対して反応した（表４）。また、ペプチドを固相に直接固定するのではなく、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を介して固相に固定した場合にも、同様の結果が確認された。
エピトープ解析の材料は、実施例４（２）と同じであった。エピトープ解析の手順は、実施例４（２）と同様にして行った。
その結果、３Ｃ抗体は、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）を含むペプチドに対して反応した（表４）。また、ペプチドを固相に直接固定するのではなく、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を介して固相に固定した場合にも、同様の結果が確認された。
【0118】
【表4】
【0119】
以上より、３Ｃ抗体のエピトープはＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）であることが確認された（図１）。
【0120】
実施例５：変性ＣＲＰ濃度に基づく疾患の検査
（１）ＣＲＰ値及び変性ＣＲＰ濃度の測定
本試験は、公益財団法人 田附興風会 医学研究所 北野病院 倫理委員会、および関西電力病院 倫理委員会で承認されている。また、患者に書面を提示し、同意が得られた患者からのみ検体採取を実施した。
（１）ＣＲＰ値及び変性ＣＲＰ濃度の測定
本試験は、公益財団法人 田附興風会 医学研究所 北野病院 倫理委員会、および関西電力病院 倫理委員会で承認されている。また、患者に書面を提示し、同意が得られた患者からのみ検体採取を実施した。
【0121】
患者としては、二重で疾患名で診断されている患者を除き、単一の炎症性疾患と診断された患者を対象とした。対象とした炎症性疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、成人発症スティル病（ＡＯＳＤ）、血管炎、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、感染症である。
【0122】
ＣＲＰ値及び変性ＣＲＰ濃度の測定に用いた試料として、患者由来の血漿を用いた。
【0123】
ＣＲＰ値の測定は、ＣＲＰに対する抗体を含むＣＲＰの臨床検査試薬であるＮ－アッセイ ＬＡ ＣＲＰ－Ｔ ニットーボー、あるいはＮ－アッセイ ＬＡ ＣＲＰ－Ｓ ニットーボー Ｄ－ｔｙｐｅ（ニットーボーメディカル株式会社）を用いて行った。
【0124】
変性ＣＲＰ濃度の測定は、上記実施例で得られた１２Ｃ抗体（固相抗体）及び１８Ａ抗体（標識抗体）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。具体的には、変性ＣＲＰ濃度の測定は、以下のとおり行った。
（ａ）精製した１２Ｃ抗体を、固相化用緩衝液にて２０μｇ／ｍＬ に調製し、２μｇ／ウェル（１００μＬ／ウェル）で用いて、４℃で一晩放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相抗体を、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）検体を希釈用緩衝液にて希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（１００μＬ／ウェル）、３７℃で６０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回洗浄した。
（ｇ）標識抗体であるＦａｂ’化１８Ａ抗体－ＨＲＰを、希釈用緩衝液にて０．４μｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに添加して（１００μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で５回洗浄した。
（ｉ）基質液を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて３０分間反応させた。
（ｊ）３０分後、反応停止液の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４５０ｎｍおよび６５０ｎｍ）を測定した。
（ｋ）測定値をもとに作成した検量線から、検体中の変性ＣＲＰ濃度を算出した。検量線作成用タンパク質（標準品）として、ヒトｍＣＲＰを使用した。
結果は、以下のとおりである。
（ａ）精製した１２Ｃ抗体を、固相化用緩衝液にて２０μｇ／ｍＬ に調製し、２μｇ／ウェル（１００μＬ／ウェル）で用いて、４℃で一晩放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相抗体を、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）検体を希釈用緩衝液にて希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（１００μＬ／ウェル）、３７℃で６０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回洗浄した。
（ｇ）標識抗体であるＦａｂ’化１８Ａ抗体－ＨＲＰを、希釈用緩衝液にて０．４μｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに添加して（１００μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で５回洗浄した。
（ｉ）基質液を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて３０分間反応させた。
（ｊ）３０分後、反応停止液の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４５０ｎｍおよび６５０ｎｍ）を測定した。
（ｋ）測定値をもとに作成した検量線から、検体中の変性ＣＲＰ濃度を算出した。検量線作成用タンパク質（標準品）として、ヒトｍＣＲＰを使用した。
結果は、以下のとおりである。
【0125】
【表5】
【0126】
次に、ＣＲＰ値が基準値を超える変性ＣＲＰ陽性の患者を抽出した。ＣＲＰ値の基準値として≧５０μｇ／ｍＬを採用した。また、変性ＣＲＰ陽性の基準値として≧１５０ｎｇ／ｍＬを採用した。
【0127】
【表6】
【0128】
次に、ＣＲＰ値が上記基準値を超える患者について、変性ＣＲＰ濃度及びＣＲＰ値、並びにそれらの比率を抽出し、成人発症スティル病（ＡＯＳＤ）と他の疾患との間で、Ｄｕｎｎ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定によりｐ値を算出し、統計学的有意差を検討した。
【0129】
但し、ＳＬＥについては、変性ＣＲＰ濃度が圧倒的に低く、ＣＲＰ値が５０μｇ／ｍＬを超える患者も１例しか見出せなかったため、以降の解析を省略した。しかしながら、ＡＯＳＤとＳＬＥは、変性ＣＲＰ濃度及びＣＲＰ値の双方が根本的に異なるので、以降の解析の有無にかかわらず、変性ＣＲＰ濃度及び／又はＣＲＰ値の測定により、ＡＯＳＤをＳＬＥから容易に鑑別できることが理解される。
【0130】
【表7】
【0131】
【表8】
【0132】
実施例６：変性ＣＲＰ濃度のみに基づく疾患の検査
症例数を増やして、実施例５記載の方法と同様にして、変性ＣＲＰ濃度及びＣＲＰ値（ＣＲＰ値によるカットオフなし）を測定した。
結果は、以下のとおりである。
症例数を増やして、実施例５記載の方法と同様にして、変性ＣＲＰ濃度及びＣＲＰ値（ＣＲＰ値によるカットオフなし）を測定した。
結果は、以下のとおりである。
【0133】
【表9】
【0134】
最後に、変性ＣＲＰ濃度及びＣＲＰ値、並びにそれらの比率を抽出し、成人発症スティル病（ＡＯＳＤ）と他の疾患との間で、Ｄｕｎｎ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定によりｐ値を算出し、統計学的有意差を検討した。
【0135】
但し、ＳＬＥについては、変性ＣＲＰ濃度が圧倒的に低いため、以降の解析を省略した。しかしながら、ＡＯＳＤとＳＬＥは、変性ＣＲＰ濃度及びＣＲＰ値の双方が根本的に異なるので、以降の解析の有無にかかわらず、変性ＣＲＰ濃度及び／又はＣＲＰ値の測定により、ＡＯＳＤをＳＬＥから容易に鑑別できることが理解される。
【0136】
【表10】
【0137】
（ＡＳＤ）
今回、ＡＳＤとして、ＡＯＳＤを評価に用いた。ＡＯＳＤ及び感染症は、他の炎症性疾患に比し、血漿中の変性ＣＲＰ濃度が高かった（表５～１０）。興味深いことに、ＡＯＳＤ患者由来の血漿中の変性ＣＲＰ濃度は、心筋梗塞患者患者由来の血漿中の既報の変性ＣＲＰ濃度（２０．９６ｎｇ／ｍＬ）よりも顕著に高く（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２０１５，ｖｏｌ．２３９，ｐ．３４３－３４９）、また、乾癬、湿疹及び蕁麻疹（皮膚関連自己免疫疾患）患者由来の血漿中の既報の変性ＣＲＰ濃度（それぞれ、３５．４ｎｇ／ｍＬ、３０．０ｎｇ／ｍＬ及び５９．８ｎｇ／ｍＬ）よりも顕著に高かった（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８，ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ ５１１）。すなわち、興味深いことに、また予想外なことに、ＡＯＳＤ患者由来の体液中の変性ＣＲＰ濃度は、本発明者らが把握している既報の変性ＣＲＰ濃度よりも高かった。感染症は、その症状に応じて診断がしばしば容易な場合がある。また、感染症は病原体（例、ウイルス、微生物）の特定（例、遺伝子・ゲノムの検出）により確定診断できるため、ＡＯＳＤは、感染症と判別し易い場合も多い。上記のとおりＡＯＳＤ及び感染症が互いに判別し易いことを考慮すると、高い変性ＣＲＰ濃度は、ＡＯＳＤの検査に有用である。
今回、ＡＳＤとして、ＡＯＳＤを評価に用いた。ＡＯＳＤ及び感染症は、他の炎症性疾患に比し、血漿中の変性ＣＲＰ濃度が高かった（表５～１０）。興味深いことに、ＡＯＳＤ患者由来の血漿中の変性ＣＲＰ濃度は、心筋梗塞患者患者由来の血漿中の既報の変性ＣＲＰ濃度（２０．９６ｎｇ／ｍＬ）よりも顕著に高く（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２０１５，ｖｏｌ．２３９，ｐ．３４３－３４９）、また、乾癬、湿疹及び蕁麻疹（皮膚関連自己免疫疾患）患者由来の血漿中の既報の変性ＣＲＰ濃度（それぞれ、３５．４ｎｇ／ｍＬ、３０．０ｎｇ／ｍＬ及び５９．８ｎｇ／ｍＬ）よりも顕著に高かった（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８，ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ ５１１）。すなわち、興味深いことに、また予想外なことに、ＡＯＳＤ患者由来の体液中の変性ＣＲＰ濃度は、本発明者らが把握している既報の変性ＣＲＰ濃度よりも高かった。感染症は、その症状に応じて診断がしばしば容易な場合がある。また、感染症は病原体（例、ウイルス、微生物）の特定（例、遺伝子・ゲノムの検出）により確定診断できるため、ＡＯＳＤは、感染症と判別し易い場合も多い。上記のとおりＡＯＳＤ及び感染症が互いに判別し易いことを考慮すると、高い変性ＣＲＰ濃度は、ＡＯＳＤの検査に有用である。
【0138】
したがって、変性ＣＲＰ濃度の高さ、及びそれに関連するＣＲＰ変性度の高さ〔例、高比率（変性ＣＲＰ濃度／ＣＲＰ値）〕は、ＡＯＳＤ等のＡＳＤの指標として有用であることが確認された。
【0139】
（血管炎）
血管炎及びＳＬＥは、他の炎症性疾患に比し、血漿中の変性ＣＲＰ濃度が低かった（表５、９）。ＳＬＥは、血漿中のＣＲＰ値が低いため（表５、９）、低いＣＲＰ値に応じて変性ＣＲＰ濃度も低くなり易いことが理解できる。ＳＬＥは二本鎖ＤＮＡ、尿中タンパク質及び自己抗体等のマーカーの測定により検査することができるため、血管炎は、ＳＬＥから容易に鑑別することができる。また、ＳＬＥは、血管炎とは異なり低いＣＲＰ値を示すため（表５、９）、血管炎は、ＳＬＥから容易に鑑別することができる。上記のとおり血管炎及びＳＬＥが互いに鑑別し易いことを考慮すると、低い変性ＣＲＰ濃度は、血管炎の指標として有用である。
血管炎及びＳＬＥは、他の炎症性疾患に比し、血漿中の変性ＣＲＰ濃度が低かった（表５、９）。ＳＬＥは、血漿中のＣＲＰ値が低いため（表５、９）、低いＣＲＰ値に応じて変性ＣＲＰ濃度も低くなり易いことが理解できる。ＳＬＥは二本鎖ＤＮＡ、尿中タンパク質及び自己抗体等のマーカーの測定により検査することができるため、血管炎は、ＳＬＥから容易に鑑別することができる。また、ＳＬＥは、血管炎とは異なり低いＣＲＰ値を示すため（表５、９）、血管炎は、ＳＬＥから容易に鑑別することができる。上記のとおり血管炎及びＳＬＥが互いに鑑別し易いことを考慮すると、低い変性ＣＲＰ濃度は、血管炎の指標として有用である。
【0140】
また、血管炎は、炎症性疾患において、高いＣＲＰ値及び著しく低い変性ＣＲＰ濃度に起因して、最低の比率（変性ＣＲＰ平均濃度／ＣＲＰ平均値）を示した（表５～１０）。
【0141】
したがって、変性ＣＲＰ濃度の低さ、及びそれに関連するＣＲＰ変性度の低さ〔例、低比率（変性ＣＲＰ濃度／ＣＲＰ値）〕は、血管炎の指標として有用であることが確認された。
【0142】
（ＡＳＤと血管炎との鑑別）
ＡＯＳＤ及び血管炎は、変性ＣＲＰ濃度及びＣＲＰ変性度の双方において、高度な統計学的有意差を示した（表８、１０、図１１）。このことは、ＣＲＰ変性度がＡＯＳＤのようなＡＳＤと血管炎との鑑別のための指標として極めて優れることを示す。したがって、ＣＲＰ変性度は、ＡＳＤと血管炎との鑑別に有用であることが確認された。
ＡＯＳＤ及び血管炎は、変性ＣＲＰ濃度及びＣＲＰ変性度の双方において、高度な統計学的有意差を示した（表８、１０、図１１）。このことは、ＣＲＰ変性度がＡＯＳＤのようなＡＳＤと血管炎との鑑別のための指標として極めて優れることを示す。したがって、ＣＲＰ変性度は、ＡＳＤと血管炎との鑑別に有用であることが確認された。
【0143】
（ＡＳＤとＲＡおよびＰＭＲとの鑑別）
ＡＳＤ、ＲＡ、ＰＭＲは共に発熱、関節痛、筋痛が共通の症状である。ＣＲＰも中等度から高度上昇を認めることが多いため、鑑別診断に難渋することが少なくない。ＡＯＳＤに特徴的な皮疹が出現すれば鑑別の一助となるが、皮疹が出現しないＡＯＳＤが２０－３０％存在するため、その際は鑑別を一層困難にする。また、ＲＡではいわゆるｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅＲＡ（ＲＦ陰性及びＣＣＰ陰性）が３０％程度存在し、ＰＭＲでは特異的なマーカーは現時点では確認されていない。血管炎でも一部のもの（ＡＮＣＡ関連血管炎）を除くと特異的なマーカーは存在しない。このため、ＡＯＳＤのようなＡＳＤと血清学的陰性の血管炎、血清学的陰性のＲＡ、ＰＭＲとの鑑別が臨床上極めて重要となる。この観点で、変性ＣＲＰ濃度、あるいは、変性ＣＲＰ濃度／ＣＲＰによる鑑別手法は、臨床的に非常に有用な手段として期待される。
ＡＳＤ、ＲＡ、ＰＭＲは共に発熱、関節痛、筋痛が共通の症状である。ＣＲＰも中等度から高度上昇を認めることが多いため、鑑別診断に難渋することが少なくない。ＡＯＳＤに特徴的な皮疹が出現すれば鑑別の一助となるが、皮疹が出現しないＡＯＳＤが２０－３０％存在するため、その際は鑑別を一層困難にする。また、ＲＡではいわゆるｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅＲＡ（ＲＦ陰性及びＣＣＰ陰性）が３０％程度存在し、ＰＭＲでは特異的なマーカーは現時点では確認されていない。血管炎でも一部のもの（ＡＮＣＡ関連血管炎）を除くと特異的なマーカーは存在しない。このため、ＡＯＳＤのようなＡＳＤと血清学的陰性の血管炎、血清学的陰性のＲＡ、ＰＭＲとの鑑別が臨床上極めて重要となる。この観点で、変性ＣＲＰ濃度、あるいは、変性ＣＲＰ濃度／ＣＲＰによる鑑別手法は、臨床的に非常に有用な手段として期待される。
【0144】
実施例７：ヒト化抗体及びキメラ抗体の作製および解析
（１）ヒト化抗体及びキメラ抗体の作製
先の実施例で得られたヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体（３Ｃ抗体）の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）における相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を共有するヒト化抗体及びキメラ抗体を作製し、それらの結合能を解析した。
（１）ヒト化抗体及びキメラ抗体の作製
先の実施例で得られたヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体（３Ｃ抗体）の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）における相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を共有するヒト化抗体及びキメラ抗体を作製し、それらの結合能を解析した。
【0145】
先ず、３Ｃ抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列から、Ｋａｂａｔ および ＩＭＧＴ ナンバリングスキームに基づき、ＣＤＲ１～３を同定した。同定されたＣＤＲ１～３を、ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子（ＩＧＨＶ）及びヒト免疫グロブリンカッパ可変遺伝子（ＩＧＫＶ）に基づく可変領域に移植した。
【0146】
次に、移植後の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を、それぞれＩｇＧ１（Ｇ１ｍ１７，１）とＩｇＫ１（Ｋｍ３）の定常領域のアミノ酸配列を有する発現ベクターにクローニングして、３Ｃ抗体（マウス抗体）の重鎖中のＣＤＲ１～３をヒト抗体に移植した重鎖（ＨＣ１～５）、及び３Ｃ抗体の軽鎖中のＣＤＲ１～３をヒト抗体に移植した軽鎖（ＬＣ１～３）を含むヒト化抗体を作製した。
【0147】
なお、３Ｃ抗体（マウス抗体）の重鎖可変領域をヒト抗体の重鎖定常領域に連結した重鎖（ＨＣ０）、及び３Ｃ抗体の軽鎖可変領域をヒト抗体の軽鎖定常領域に連結した軽鎖（ＬＣ０）を含むキメラ抗体も併せて作製した。
作製した各抗体の重鎖（ＨＣ０～５）及び軽鎖（ＬＣ０～３）の情報を表１１に示す。
作製した各抗体の重鎖（ＨＣ０～５）及び軽鎖（ＬＣ０～３）の情報を表１１に示す。
【0148】
【表11】
【0149】
（２）ヒト化抗体及びキメラ抗体の解析
作製した各抗体の結合能を解析した。発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入し、培養した後、発現した抗体を培養上清からＡＫＴＡＴＭ ｄｅｓｉｇｎ クロマトグラフィーシステムを用いて精製した。得られた１０種類の精製抗体の結合能を、２種類の方法で解析した。
作製した各抗体の結合能を解析した。発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入し、培養した後、発現した抗体を培養上清からＡＫＴＡＴＭ ｄｅｓｉｇｎ クロマトグラフィーシステムを用いて精製した。得られた１０種類の精製抗体の結合能を、２種類の方法で解析した。
【0150】
先ず、バイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ）を利用するＯｃｔｅｔ Ｓｙｓｔｅｍｓを用いて、精製抗体の結合能を解析した。キメラ抗体（ＨＣ０／ＬＣ０）の結合能を１００％として、ヒト化抗体（ＨＣｘ／ＬＣｘ）の結合能を百分率で評価した。
【0151】
次に、ＢｉａｃｏｒｅＴＭにより、精製抗体の結合能を解析した。
【0152】
その結果、１０種類の精製抗体はいずれも高い結合能を示すことが確認された（表１２）。
【表12】
【0153】
以上述べた少なくとも一つの実施形態によれば、臨床診断を補助することができる。
【0154】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】