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特開2022-124480ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体、並びにそれを含む医薬及び抗炎症剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022124480
(43)【公開日】2022-08-25
(54)【発明の名称】ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体、並びにそれを含む医薬及び抗炎症剤
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20220818BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220818BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20220818BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220818BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220818BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220818BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220818BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
C12N15/13 ZNA
C07K16/18
C12N15/63 Z
A61K39/395 Y
A61P29/00
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P37/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022020435
(22)【出願日】2022-02-14
(31)【優先権主張番号】P 2021021509
(32)【優先日】2021-02-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】594164542
【氏名又は名称】キヤノンメディカルシステムズ株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】519390667
【氏名又は名称】一般社団法人日本・多国間臨床試験機構
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】藤田 昌昭
(72)【発明者】
【氏名】黄 政龍
(72)【発明者】
【氏名】和田 洋巳
(72)【発明者】
【氏名】保田 裕貴
(72)【発明者】
【氏名】櫻井 康雄
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085CC08
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA22
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】抗炎症剤等の医薬に利用可能なヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を提供すること。
【解決手段】以下の発明：
１）ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を含む抗炎症剤；
２）ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体；
３）ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
４）上記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター；
５）上記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換細胞；並びに
６）ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を含む医薬。
【選択図】図１
【解決手段】以下の発明：
１）ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を含む抗炎症剤；
２）ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体；
３）ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
４）上記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター；
５）上記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換細胞；並びに
６）ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を含む医薬。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を含む抗炎症剤。
【請求項2】
前記中和抗体が、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有する、請求項１記載の抗炎症剤。
【請求項3】
前記中和抗体が下記１）及び２）を含む、請求項１又は２記載の抗炎症剤：
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【請求項4】
前記中和抗体がＩｇＧである、請求項１～３のいずれか一項記載の抗炎症剤。
【請求項5】
抗炎症剤が自己免疫疾患に起因する炎症である、請求項１～４のいずれか一項記載の抗炎症剤。
【請求項6】
自己免疫疾患が関節リウマチ又は全身性エリテマトーデスである、請求項５記載の抗炎症剤。
【請求項7】
ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体。
【請求項8】
前記中和抗体が下記１）及び２）を含む、請求項７記載の中和抗体：
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【請求項9】
請求項７又は８記載の中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項９記載のポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター。
【請求項11】
請求項９記載のポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換細胞。
【請求項12】
ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を含む医薬。
【請求項13】
前記中和抗体が下記１）及び２）を含む、請求項１２記載の医薬：
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体、並びにそれを含む医薬及び抗炎症剤などに関する。
【背景技術】
【0002】
Ｃ－反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、炎症マーカーとして汎用されている。ＣＲＰとしては、コンホメーションが異なるタイプ、すなわち、ネイティブな五量体ＣＲＰ（ｐＣＲＰ）、及び五量体ＣＲＰの変性により構成因子が解離した変性ＣＲＰ、代表的には、単量体ＣＲＰ（ｍＣＲＰ）が存在し、それぞれ、異なる生理学的役割を果たすことが示唆されている〔非特許文献１及び２、並びに特許文献１（特に段落［００１６］）〕。
【0003】
抗ＣＲＰ抗体については、幾つかの報告がなされている。例えば、特許文献２には、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体が記載されている。特許文献２に記載される抗体は、ヒトＣＲＰのペプチド１（２３～３０位）、ペプチド２（１０９～１２３位）、ペプチド３（１３７～１５２位）に結合せず、ペプチド４（１９９～２０６位）に結合するか又は結合せず、かつフラグメントＡ（１～１４６位）・フラグメントＢ（１４７～２０６位）の一方と結合し他方と結合しないという性質を有する（上記位置は、末端が２０６位に設定されていることを考慮すると、シグナル除去配列を基準にしていると解される）。
【0004】
特許文献３には、通常のＣＲＰ（すなわち、ネイティブなｐＣＲＰ）及びＣａ欠損型ＣＲＰ（変性ＣＲＰ）の双方に結合できる抗体（エピトープ不明）が記載されている。
【0005】
特許文献４には、通常のＣＲＰ（すなわち、ネイティブなｐＣＲＰ）に結合できる抗体が記載されている。特許文献４に記載される抗体は、特許文献４における配列番号１のアミノ酸配列に基づくと、ヒトＣＲＰの１４７～１７２位、又は１７３～２０６位をエピトープとする（特許文献４における配列番号１のアミノ酸配列は、全長２０６個のアミノ酸残基から構成される）。
【0006】
特許文献５には、通常のＣＲＰ（すなわち、ネイティブなｐＣＲＰ）に結合できる抗体が記載されている。特許文献５に記載される抗体は、ヒトＣＲＰの部分ペプチド１（２５～２８位）、部分ペプチド２（５７～６０位）、部分ペプチド３（１１４～１２１位）、部分ペプチド４（１７７～１８０位）、及び部分ペプチド５（２０４～２０６位）からなる群から選択されるペプチド抗原を用いて作製されている（上記位置は、シグナル除去配列に基づく）。
【0007】
しかしながら、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は未だ開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特表２００７－５２３８３７号公報
【特許文献2】特表平０４－５０５８５７公報
【特許文献3】特開２００４－１８９６６５号公報
【特許文献4】国際公開第２００９／１０７１７０号
【特許文献5】特開２００６－１１５７１６号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｌｉ，Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６；２９１（１６）：８７９５－８８０４
【非特許文献2】Ｗｕ，Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５；３９６（１１）：１１８１－１１９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本開示の目的は、抗炎症剤等の医薬に利用可能なヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ヒトｍＣＲＰの中和作用を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を作製することに成功し、これを抗炎症剤等の医薬として利用できることを見出した。特に、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）（ヒトＣＲＰの全長アミノ酸配列における９９～１０８位、及びシグナル除去配列における８１～９０位に対応する）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、ヒトｍＣＲＰの中和作用に優れることから、抗炎症剤等の医薬として有望である。
【0012】
すなわち、本開示は、以下などに関する。
【0013】
一実施形態では、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を含む抗炎症剤が提供される。
【0014】
特定の実施形態では、前記中和抗体は、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有していてもよい。
【0015】
好ましい実施形態では、前記中和抗体は、下記１）及び２）を含んでいてもよい：
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【0016】
特定の実施形態では、前記中和抗体は、ＩｇＧであってもよい。
【0017】
特定の実施形態では、抗炎症剤は、自己免疫疾患に起因する炎症であってもよい。
【0018】
好ましい実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ又は全身性エリテマトーデスであってもよい。
【0019】
別の実施形態では、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体が提供される。
【0020】
特定の実施形態では、前記中和抗体は、下記１）及び２）を含んでいてもよい：
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【0021】
さらに別の実施形態では、前記中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
【0022】
さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターが提供される。
【0023】
さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換細胞が提供される。
【0024】
さらに別の実施形態では、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を含む医薬が提供される。
【0025】
特定の実施形態では、前記中和抗体は、下記１）及び２）を含んでいてもよい：
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
【発明の効果】
【0026】
ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、抗炎症剤として有用である。また、中和抗体は、変性ＣＲＰの中和作用に優れる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】図１は、ヒトＣＲＰのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＬ４８２１８）、並びにヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体により認識されるヒトＣＲＰ中の中和エピトープ（配列番号２）（全長アミノ酸配列における９９～１０８位。シグナル除去配列における８１～９０位）を示す図である。
【図2】図２は、ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧを、阻害ＥＬＩＳＡ（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ）により解析した結果を示す図である。阻害（－）：ハイブリドーマの培養上清から精製されたＩｇＧを、ヒト単量体ＣＲＰ（ｍＣＲＰ）及びヒト五量体（ｐＣＲＰ）（単なる「ＣＲＰ」と同義）の双方を含まない溶液とプレインキュベートした溶液を使用した場合の実験結果（コントロール）；ｍＣＲＰ阻害：ハイブリドーマの培養上清から精製されたＩｇＧを、過剰量のヒトｍＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液を使用した場合の実験結果；ｐＣＲＰ阻害：ハイブリドーマの培養上清から精製されたＩｇＧを、過剰量のヒトｐＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液を使用した場合の実験結果（図３、４も同様）。
【図5】図５は、ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃを培養して得られた培養上清から精製された抗体（３Ｃ）における重鎖中のシグナル配列、並びにＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）及びＣＤＲ３（配列番号７）を示す図である。
【図6】図６は、ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃを培養して得られた培養上清から精製された抗体（３Ｃ）における軽鎖中のシグナル配列、並びにＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）及びＣＤＲ３（配列番号１２）を示す図である。
【図8A】図８Ａは、ｍＣＲＰ依存的インテグリン活性化（β３活性化／リンパ球）を示す図である。リンパ球をｍＣＲＰで処理し、細胞表面へのＦＩＴＣ標識したフィブリノーゲンの結合をフローサイトメトリーによって解析した。縦軸は、メジアン蛍光強度（Ｍｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）を示す（以下同様）。
【図8C】図８Ｃは、ｍＣＲＰ依存的インテグリン活性化（β３活性化／単球）を示す図である。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をｍＣＲＰで処理し、細胞表面へのＦＩＴＣ標識したフィブリノーゲンの結合をフローサイトメトリーによって解析した。
【図9】図９は、チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）誘導性腹膜炎に対するｍＣＲＰの炎症増悪能及び抗ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体の炎症抑制効果を示す図である。チオグリコレートをマウス腹腔内に投与することで腹膜炎を誘発させ、腹水に遊走された好中球及び単球の数をフローサイトメトリーにて測定した。この際、ｍＣＲＰ及び抗ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体（３Ｃ及び３５Ａ）の投与が、腹水に遊走する好中球及び単球の数に与える影響を検証した（Ｎ＝４又は５）。
【図10A】図１０Ａは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎に対する抗ｍＣＲＰ抗体の予防効果を示す図である。ＩＩ型コラーゲンに対する４種類のモノクローナル抗体をマウス静脈内に投与して３日後、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）を腹腔内投与することで関節炎を惹起させ、四肢に対する関節炎の度合いを関節炎スコア（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）として計測した。この際、３日目における抗ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体（３Ｃ）の投与が関節炎に与える影響を検証した。
【図10B】図１０Ｂは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎に対する抗ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体の予防効果を示す写真（１４日目）である。３Ｃ投与群では軽度の炎症細胞浸潤を認めるのに対し、ＩｇＧ投与群では著明な炎症細胞の浸潤、パンヌス形成及び関節軟骨の破壊を認めた。
【図11A】図１１Ａは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎に対する抗ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体の治療効果を示す図である。ＩＩ型コラーゲンに対する４種のモノクローナル抗体をマウス静脈内に投与して３日後、ＬＰＳを腹腔内投与することで関節炎を惹起させ、四肢に対する関節炎の度合いを関節炎スコアとして計測した。この際、９日目における抗ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体（３Ｃ）の投与が関節炎に与える影響を検証した。
【図11B】図１１Ｂは、抗コラーゲン抗体誘導性関節炎に対する抗ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体の治療効果を示す写真である。３Ｃ投与群ではほぼ正常に近い骨組織を認めるのに対し、ＩｇＧ投与群では炎症細胞の浸潤、パンヌス形成及び関節軟骨の破壊を認めた。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本開示は、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を含む抗炎症剤に関する。
【0029】
「ヒト単量体ＣＲＰ」（ｍＣＲＰ）とは、配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＬ４８２１８）を有する、ヒトＣＲＰの単量体タンパク質（シグナル配列は除去されていてもよい）又はその天然に生じる変異体（例、天然バリアント、又はＳＮＰ若しくはハプロタイプ）をいう。
【0030】
「ネイティブＣＲＰ」とは、上記ヒト単量体ＣＲＰから構成される五量体タンパク質をいう。炎症の指標として広く採用されているＣＲＰの臨床検査は、ネイティブＣＲＰを検出するように開発されているため、ＣＲＰの臨床検査で用いられる抗ヒトＣＲＰ抗体は、ネイティブＣＲＰに対する抗体であるということができる。
【0031】
「変性ＣＲＰ」とは、上記ネイティブＣＲＰの変性により構成因子が解離した変性ＣＲＰをいう。変性ＣＲＰとしては、例えば、単量体ＣＲＰ（ｍＣＲＰ）、二量体ＣＲＰ、三量体ＣＲＰ、及び四量体ＣＲＰ、並びにこれらの１種以上（例、２種、３種、４種）の組み合わせが挙げられる。
【0032】
「ヒト変性ＣＲＰ特異的」とは、ネイティブなヒト五量体ＣＲＰに対する結合能よりも、ヒト変性ＣＲＰに対する結合能が高いことをいう。ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体は、１）抗原としてヒト変性ＣＲＰ（好ましくは、ｍＣＲＰ）を用いることにより、ヒト単量体ＣＲＰに対する抗体を産生するハイブリドーマを作製し、２）抗原としてヒト変性ＣＲＰ及びヒト五量体ＣＲＰを用いて、ヒト五量体ＣＲＰに対する結合能よりも、ヒト単量体ＣＲＰに対する結合能が高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、３）選択されたハイブリドーマの培養上清から抗体を単離することにより、又はハイブリドーマにより産生される抗体の遺伝子を組み込んだ形質転換細胞の培養物から抗体を単離することにより、得ることができる。ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体の確認は、抗原としてヒト変性ＣＲＰ及びヒト五量体ＣＲＰを用いて、試験抗体が、ヒト五量体ＣＲＰに対する結合能よりも、ヒト変性ＣＲＰに対する結合能が高いことを確認することにより行うことができる（例、実施例に記載される阻害ＥＬＩＳＡを参照）。
【0033】
「ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体」とは、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体であって、かつヒト変性ＣＲＰ（例、単量体ＣＲＰ）の活性の中和作用を有する抗体をいう。変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）非存在下では末梢血単核球はフィブリノーゲンに結合できないが、変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）存在下ではインテグリンが活性化されるためフィブリノーゲンは細胞表面に結合できるようになることが知られている。したがって、ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）の活性の中和作用は、例えば、ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）により媒介されるフィブリノーゲンへの末梢血単核球の結合促進の抑制であってもよい。ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）の中和作用は、例えば、変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）及び試験抗体の存在下におけるフィブリノーゲンへの末梢血単核球の結合が、ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）の存在下及び試験抗体の非存在下におけるフィブリノーゲンへの血球（例、末梢血単核球、リンパ球）の結合に比し低下するかどうかにより評価することができる（例、実施例５を参照）。
【0034】
別の観点では、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）の中和エピトープを認識できる抗体であるということができる。中和エピトープとは、ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）特異的な中和抗体の結合するヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）の部分ペプチド又は部分立体構造を意味する。中和エピトープは、当該分野において周知の方法により決定することができる。
先ず、抗原の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴヌクレオチド合成技術を用いることができる。例えば、ＣＤ１４７のＣ末端又はＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、更に短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。また、抗体が、部分ペプチドではなく、部分立体構造をエピトープとしている場合は、特定のアミノ酸配列を改変することにより立体構造を改変することによってどこの部分立体構造と結合するかを決定することができる。部分立体構造であるエピトープは、Ｘ線構造解析によって決定することもできる。
次に、上記のように決定されたエピトープを認識できる抗体が、ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）の活性の中和作用を有するか否かを評価することにより、エピトープが中和エピトープであるか決定することができる。
実施例に記載される３Ｃ抗体及び３５Ａ抗体は、ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）特異的な中和抗体であることが確認されている。したがって、これらの抗体が認識する中和エピトープを上記のとおり決定することにより、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を効率良く作製することができる。例えば、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、中和エピトープ（配列番号２）からなるペプチド、又はそれに富むポリペプチドを抗原として投与した動物（例、マウス、ラット）から採取された細胞からハイブリドーマを用いることにより得ることができる。また、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、上記のとおり作製されたハイブリドーマにより産生される抗体の遺伝子を組み込んだ形質転換細胞を用いることにより得ることができる。あるいは、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、中和エピトープ（配列番号２）からなるペプチド、又はそれに富むポリペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリー（例、ヒト抗体ライブラリー、ヒト化抗体ライブラリー、ヒトキメラ抗体ライブラリー）から、当該抗原に対する結合能を有する抗体を選択することにより得ることができる。
先ず、抗原の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴヌクレオチド合成技術を用いることができる。例えば、ＣＤ１４７のＣ末端又はＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、更に短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。また、抗体が、部分ペプチドではなく、部分立体構造をエピトープとしている場合は、特定のアミノ酸配列を改変することにより立体構造を改変することによってどこの部分立体構造と結合するかを決定することができる。部分立体構造であるエピトープは、Ｘ線構造解析によって決定することもできる。
次に、上記のように決定されたエピトープを認識できる抗体が、ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）の活性の中和作用を有するか否かを評価することにより、エピトープが中和エピトープであるか決定することができる。
実施例に記載される３Ｃ抗体及び３５Ａ抗体は、ヒト変性ＣＲＰ（例、ｍＣＲＰ）特異的な中和抗体であることが確認されている。したがって、これらの抗体が認識する中和エピトープを上記のとおり決定することにより、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を効率良く作製することができる。例えば、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、中和エピトープ（配列番号２）からなるペプチド、又はそれに富むポリペプチドを抗原として投与した動物（例、マウス、ラット）から採取された細胞からハイブリドーマを用いることにより得ることができる。また、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、上記のとおり作製されたハイブリドーマにより産生される抗体の遺伝子を組み込んだ形質転換細胞を用いることにより得ることができる。あるいは、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、中和エピトープ（配列番号２）からなるペプチド、又はそれに富むポリペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリー（例、ヒト抗体ライブラリー、ヒト化抗体ライブラリー、ヒトキメラ抗体ライブラリー）から、当該抗原に対する結合能を有する抗体を選択することにより得ることができる。
【0035】
抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、ＣＤＲにより特定することができる。
【0036】
特定の実施形態では、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、下記１）及び２）を含む抗体であってもよい：
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
このようなヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体では、ＣＤＲ以外の重鎖及び軽鎖の可変領域（例、フレームワーク領域）として、並びに重鎖及び軽鎖の定常領域として、ヒト抗体のものが使用されてもよい。
１）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
このようなヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体では、ＣＤＲ以外の重鎖及び軽鎖の可変領域（例、フレームワーク領域）として、並びに重鎖及び軽鎖の定常領域として、ヒト抗体のものが使用されてもよい。
【0037】
好ましい実施形態では、上記特定配列番号のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１～３を含む可変領域を含む抗体重鎖は、（ａ）配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１（好ましくは配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１）のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖であってもよい。
【0038】
別の好ましい実施形態では、上記特定配列番号のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１～３を含む可変領域を含む抗体軽鎖は、（ｂ）配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、または配列番号５９（好ましくは配列番号５５、配列番号５７、または配列番号５９）のアミノ酸配列における２１～１３２位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖であってもよい。
【0039】
より好ましい実施形態では、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、（ａ）配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１（好ましくは配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１）のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖、および（ｂ）配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、または配列番号５９（好ましくは配列番号５５、配列番号５７、または配列番号５９）のアミノ酸配列における２１～１３２位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む抗体であってもよい。
【0040】
好ましい実施形態では、上記特定配列番号のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１～３を含む可変領域を含む抗体重鎖は、（ａ）配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１（好ましくは配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１）のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖であってもよい。
【0041】
別の好ましい実施形態では、上記特定配列番号のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１～３を含む可変領域を含む抗体軽鎖は、（ｂ）配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、または配列番号５９（好ましくは配列番号５５、配列番号５７、または配列番号５９）のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖であってもよい。
【0042】
より好ましい実施形態では、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、（ａ）配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１（好ましくは配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１）のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖、および（ｂ）配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、または配列番号５９（好ましくは配列番号５５、配列番号５７、または配列番号５９）のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む抗体であってもよい。
【0043】
別の特定の実施形態では、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、下記１）及び２）を含む抗体であってもよい：
１）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
このようなヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体では、重鎖及び軽鎖の定常領域として、ヒト抗体のものが使用されてもよい。
１）配列番号４のアミノ酸配列における２０～１３３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号９のアミノ酸配列における２０～１３１位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む抗体軽鎖。
このようなヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体では、重鎖及び軽鎖の定常領域として、ヒト抗体のものが使用されてもよい。
【0044】
さらに別の特定の実施形態では、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、下記１）及び２）を含む抗体であってもよい：
１）配列番号４のアミノ酸配列における２０～４６９位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号９のアミノ酸配列における２０～２３８位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖。
１）配列番号４のアミノ酸配列における２０～４６９位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体重鎖；並びに
２）配列番号９のアミノ酸配列における２０～２３８位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む抗体軽鎖。
【0045】
上記同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上であってもよい。同一性の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、同一性の算定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。
【0046】
また、目的のアミノ酸配列に対して所望の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対する所望の数のアミノ酸残基の変異によって特定することができる。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸残基の欠失、置換、付加及び挿入からなる群より選ばれる１、２、３又は４種の変異である。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。例えば、目的のアミノ酸配列が４００個以上のアミノ酸残基から構成される場合、目的のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して４０個以下のアミノ酸残基の変異が許容され、目的のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して２０個以下のアミノ酸残基の変異が許容される。また、目的のアミノ酸配列が３００個以上のアミノ酸残基から構成される場合、目的のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して３０個以下のアミノ酸残基の変異が許容され、目的のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して１５個以下のアミノ酸残基の変異が許容される。さらに、目的のアミノ酸配列が２００個以上のアミノ酸残基から構成される場合、目的のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して２０個以下のアミノ酸残基の変異が許容され、目的のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して１０個以下のアミノ酸残基の変異が許容される。また、目的のアミノ酸配列が１００個以上のアミノ酸残基から構成される場合、目的のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して１０個以下のアミノ酸残基の変異が許容され、目的のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基の変異が許容される。
【0047】
ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体には、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体なども含まれる。キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる。ヒト化抗体としては、ＣＤＲのみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体、及びＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体を挙げることができる。ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体であり、例えば、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法、及びヒト抗体ライブラリーを用いる方法（例、ファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法、ヒト抗体産生細胞からヒト抗体を取得する方法）により得られるヒト抗体を挙げることができる。
【0048】
また、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、一本鎖イムノグロブリンであってもよい。抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリンを取得する方法が知られている。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であってもよい。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はナノボディと呼ばれており、抗原結合能が保持されていることが報告されている。
【0049】
また、抗体に結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞障害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、多くの報告がなされている。
【0050】
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する場合、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されてもよく、別々の発現ベクターに挿入されてもよいが、好ましくは、同一の発現ベクターに挿入することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、哺乳動物細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、及びチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞を培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
【0051】
ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例、ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥが挙げられ、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧである。
【0052】
ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体は、抗炎症剤として用いることができる。例えば、抗炎症剤が適用され得る炎症性疾患は、炎症の対象となる臓器又は組織に基づき分類することができる。このような炎症性疾患としては、例えば、腹膜炎、虫垂炎、眼瞼炎、細気管支炎若しくは気管支炎（例、喘息）、滑液包炎、子宮頚炎、胆管炎、胆嚢炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、肝炎、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、耳管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、へんとう炎、ブドウ膜炎、膣炎、血管炎、外陰炎が挙げられる。炎症性疾患はまた、感染症（例、ウイルス、微生物、寄生虫）に伴う炎症であってもよい。
【0053】
特定の実施形態では、炎症性疾患は、自己免疫疾患であってもよい。このような自己免疫疾患としては、例えば、関節炎（例、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節炎、若年性関節炎）、全身性エリテマトーデス、成人発症スティル病、炎症性腸疾患、橋本甲状腺炎、バセドー病、シェーグレン症候群、多発性硬化症、ギランバレー症候群、急性播種性脳脊髄炎、アディソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、グッドパスチャー症候群、視神経炎、原発性胆汁性肝硬変、ライター病、高安動脈炎、側頭動脈炎、ヴェグナー肉芽腫、乾癬、全身性脱毛症、ベーチェット病、慢性疲労症候群、間質性膀胱炎が挙げられる。
【0054】
別の特定の実施形態では、炎症性疾患は、非自己免疫疾患であってもよい。このような非自己免疫疾患としては、例えば、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、拒絶反応（例、臓器移植等の移植による拒絶反応）、神経変性疾患（例、アルツハイマー病）、加齢黄斑変性症が挙げられる。
【0055】
本開示はまた、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体、及びそれを含む医薬に関する。ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体の詳細は、上述のとおりである。このような医薬は、上述の炎症性疾患等の疾患の予防又は治療に有用である。
【0056】
本開示はまた、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）に結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ及びＲＮＡを挙げることができ、ＤＮＡが好ましい。
【0057】
本開示はまた、上記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターに関する。プロモーターとしては、例えば、所望の宿主細胞で高発現している遺伝子のプロモーター、及びウイルス由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、構成的プロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。
【0058】
発現ベクターはまた、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、及び薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【0059】
発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。
【0060】
発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、又は人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、又はＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。
【0061】
本開示はまた、上記ポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換細胞に関する。
【0062】
「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする最小単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、及び薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。発現単位はまた、タンパク質として発現されるべき１つのポリヌクレオチド、及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、モノシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）、又はタンパク質として発現されるべき複数のポリヌクレオチド（例えば、重鎖をコードするポリヌクレオチド、及び軽鎖をコードするポリヌクレオチド）、並びにそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）であってもよい。発現単位は、１又は２以上（例、１、２、３、４、又は５）の異なる位置においてゲノム領域中に含まれていてもよい。非ゲノム領域に含まれる発現単位の具体的な形態としては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、及び人工染色体が挙げられる。プロモーターは、上述のものと同様である。
【0063】
形質転換細胞は、当該分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えば、形質転換細胞は、発現ベクターを用いる方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）、又はゲノム改変技術により作製することができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））によれば、発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことが可能である。形質転換細胞の宿主細胞としては、例えば、真核細胞〔例、動物細胞（例、哺乳動物細胞）、植物細胞、真核微生物〕、及び原核細胞（例、原核微生物）が挙げられる。
【実施例0064】
以下の実施例により本開示をより詳細に説明するが、本開示は以下の実施例に限定されるものではない。
【0065】
実施例１：ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体の作製
（１）抗原（ヒトｍＣＲＰ）の調製
ヒト５量体ＣＲＰ（Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｅｕｒａｌ Ｆｌｕｉｄ，Ｌｅｅ ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，カタログ番号：１４０－１１）（ヒトｐＣＲＰ）を、８Ｍ Ｕｒｅａ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中にて３７℃で２時間処理し、ヒト単量体ＣＲＰ（ヒトｍＣＲＰ）溶液を調製した。調製後、透析チューブを用いて、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）、１５ｍＭ ＮａＣｌ中にて透析した。透析した溶液を透析チューブに移した後、４℃、３，５００ｘｇにて遠心し、濃縮した。
（１）抗原（ヒトｍＣＲＰ）の調製
ヒト５量体ＣＲＰ（Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｅｕｒａｌ Ｆｌｕｉｄ，Ｌｅｅ ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，カタログ番号：１４０－１１）（ヒトｐＣＲＰ）を、８Ｍ Ｕｒｅａ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中にて３７℃で２時間処理し、ヒト単量体ＣＲＰ（ヒトｍＣＲＰ）溶液を調製した。調製後、透析チューブを用いて、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）、１５ｍＭ ＮａＣｌ中にて透析した。透析した溶液を透析チューブに移した後、４℃、３，５００ｘｇにて遠心し、濃縮した。
【0066】
（２）抗原（ヒトｍＣＲＰ）によるマウスの免疫
抗原（ヒトｍＣＲＰ）濃度を２００μｇ／０．５ｍＬに調製し、アジュバントを同量加えガラスシリンジにてエマルジョンを作製した。アジュバントは、初回免疫時のみフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ， ＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ）を使用し、２回目以降はフロイント不完全アジュバント（ＦＩＣＡ， ＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ）を使用した。４回免疫後、抗体価上昇を確認し、最終免疫（ｉ．ｐ．／５０μｇ／匹）を行った。
得られたエマルジョンをマウスの皮下及び皮内に２７Ｇ注射針を用いて注射した。以後７日毎に合計４回免疫し、４回免疫後の７日後に尾静脈より少量採血した。ヒトｍＣＲＰを固相化したイムノプレートに、希釈抗血清を添加し、抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ検出により、抗血清の力価を確認した。具体的には、抗血清の力価の確認は、以下の固相ＥＬＩＳＡにより行った。
抗原（ヒトｍＣＲＰ）濃度を２００μｇ／０．５ｍＬに調製し、アジュバントを同量加えガラスシリンジにてエマルジョンを作製した。アジュバントは、初回免疫時のみフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ， ＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ）を使用し、２回目以降はフロイント不完全アジュバント（ＦＩＣＡ， ＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ）を使用した。４回免疫後、抗体価上昇を確認し、最終免疫（ｉ．ｐ．／５０μｇ／匹）を行った。
得られたエマルジョンをマウスの皮下及び皮内に２７Ｇ注射針を用いて注射した。以後７日毎に合計４回免疫し、４回免疫後の７日後に尾静脈より少量採血した。ヒトｍＣＲＰを固相化したイムノプレートに、希釈抗血清を添加し、抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ検出により、抗血清の力価を確認した。具体的には、抗血清の力価の確認は、以下の固相ＥＬＩＳＡにより行った。
【0067】
（３）固相ＥＬＩＳＡ
固相ＥＬＩＳＡの材料としては、以下を用いた。
（ａ）プレート：Ｎｕｎｃ製 ＥＬＩＳＡ用イムノプレート（９６ウェル）
（ｂ）基質：Ｏ．Ｐ．Ｄ ｔａｂｌｅｔ（ＳＩＧＭＡ）
（ｃ）固相化用緩衝液：０．１Ｍ炭酸緩衝液，ｐＨ９．５（ＩＢＬ）
（ｄ）抗血清希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（関東化学） ｉｎ ＰＢＳ
（ｅ）標識抗体希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ＰＢＳ
（ｆ）洗浄用緩衝液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ０．１Ｍ リン酸バッファー
（ｇ）基質用緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）
（ｈ）反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ－Ｈ２ＳＯ４（和光純薬）
（ｉ）固相タンパク質：ヒトｍＣＲＰ，又はＢＳＡ（コントロール）
固相ＥＬＩＳＡの材料としては、以下を用いた。
（ａ）プレート：Ｎｕｎｃ製 ＥＬＩＳＡ用イムノプレート（９６ウェル）
（ｂ）基質：Ｏ．Ｐ．Ｄ ｔａｂｌｅｔ（ＳＩＧＭＡ）
（ｃ）固相化用緩衝液：０．１Ｍ炭酸緩衝液，ｐＨ９．５（ＩＢＬ）
（ｄ）抗血清希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（関東化学） ｉｎ ＰＢＳ
（ｅ）標識抗体希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ＰＢＳ
（ｆ）洗浄用緩衝液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ０．１Ｍ リン酸バッファー
（ｇ）基質用緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）
（ｈ）反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ－Ｈ２ＳＯ４（和光純薬）
（ｉ）固相タンパク質：ヒトｍＣＲＰ，又はＢＳＡ（コントロール）
【0068】
固相ＥＬＩＳＡは、以下の手順により行った。
（ａ）タンパク質を、５０ｎｇ／ウェル（５０μＬ／ウェル）で用いて、４℃で１６時間放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相タンパク質を、ダルベッコＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）サンプル（抗血清）を希釈用緩衝液にて希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｇ）標識抗体である抗マウスＩｇＧ（γ特異的）－ＨＲＰを各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｉ）基質液（４００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて１５分間反応させた。
（ｊ）１５分後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
（ａ）タンパク質を、５０ｎｇ／ウェル（５０μＬ／ウェル）で用いて、４℃で１６時間放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相タンパク質を、ダルベッコＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）サンプル（抗血清）を希釈用緩衝液にて希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｇ）標識抗体である抗マウスＩｇＧ（γ特異的）－ＨＲＰを各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｉ）基質液（４００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて１５分間反応させた。
（ｊ）１５分後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
【0069】
（４）ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体を産生するハイブリドーマの調製
上記固相ＥＬＩＳＡによりヒトｍＣＲＰに対する有意な力価の上昇が確認されたマウスから採取された脾臓細胞又はリンパ節細胞をミエローマ細胞（Ｘ－６３．Ａｇ８ ６５３（ＡＴＣＣ））と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて細胞融合した（９６ウェルプレート１９枚）。ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）選択培地を用いて、ハイブリドーマを選択的に培養した。その後、ハイブリドーマのコロニー形成を確認し、ハイブリドーマの培養物の上清希釈物をサンプルとして用いて、上述の固相ＥＬＩＳＡ（固相抗原：ヒトｍＣＲＰ）によるスクリーニングを行い、３６個の陽性クローンを選択した。
上記固相ＥＬＩＳＡによりヒトｍＣＲＰに対する有意な力価の上昇が確認されたマウスから採取された脾臓細胞又はリンパ節細胞をミエローマ細胞（Ｘ－６３．Ａｇ８ ６５３（ＡＴＣＣ））と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて細胞融合した（９６ウェルプレート１９枚）。ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）選択培地を用いて、ハイブリドーマを選択的に培養した。その後、ハイブリドーマのコロニー形成を確認し、ハイブリドーマの培養物の上清希釈物をサンプルとして用いて、上述の固相ＥＬＩＳＡ（固相抗原：ヒトｍＣＲＰ）によるスクリーニングを行い、３６個の陽性クローンを選択した。
【0070】
（５）阻害ＥＬＩＳＡ（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ）
次に、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体を産生するハイブリドーマを、阻害ＥＬＩＳＡにより選択した。
阻害ＥＬＩＳＡでは、サンプルとして、（ｉ）ハイブリドーマの培養上清を、過剰量のヒトｍＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液、（ｉｉ）ハイブリドーマの培養上清を、過剰量のヒトｐＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液、（ｉｉｉ）ハイブリドーマの培養上清を、ヒトｍＣＲＰ及びヒトｐＣＲＰの双方を含まない溶液とプレインキュベートした溶液（コントロール）を用いて、上述したような固相ＥＬＩＳＡ（固相抗原：ヒトｍＣＲＰ）を行った。このような阻害ＥＬＩＳＡでは、ヒトｍＣＲＰに特異的に結合する能力を有する抗ヒトｍＣＲＰ抗体を産生するハイブリドーマの培養上清は、（ｉ）では、溶液中のヒトｍＣＲＰと結合するため固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できないことから、シグナルが実質的に検出されない。一方、このような培養上清は、（ｉｉ）では、溶液中のヒトｐＣＲＰと結合しないため固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できることから、十分なシグナルが検出される。また、このような培養上清は、（ｉｉｉ）では、溶液中にヒトｍＣＲＰ及びヒトｐＣＲＰが存在しないので固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できるため、十分なシグナルが検出される。
次に、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体を産生するハイブリドーマを、阻害ＥＬＩＳＡにより選択した。
阻害ＥＬＩＳＡでは、サンプルとして、（ｉ）ハイブリドーマの培養上清を、過剰量のヒトｍＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液、（ｉｉ）ハイブリドーマの培養上清を、過剰量のヒトｐＣＲＰを含む溶液とプレインキュベートした溶液、（ｉｉｉ）ハイブリドーマの培養上清を、ヒトｍＣＲＰ及びヒトｐＣＲＰの双方を含まない溶液とプレインキュベートした溶液（コントロール）を用いて、上述したような固相ＥＬＩＳＡ（固相抗原：ヒトｍＣＲＰ）を行った。このような阻害ＥＬＩＳＡでは、ヒトｍＣＲＰに特異的に結合する能力を有する抗ヒトｍＣＲＰ抗体を産生するハイブリドーマの培養上清は、（ｉ）では、溶液中のヒトｍＣＲＰと結合するため固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できないことから、シグナルが実質的に検出されない。一方、このような培養上清は、（ｉｉ）では、溶液中のヒトｐＣＲＰと結合しないため固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できることから、十分なシグナルが検出される。また、このような培養上清は、（ｉｉｉ）では、溶液中にヒトｍＣＲＰ及びヒトｐＣＲＰが存在しないので固相抗原（ヒトｍＣＲＰ）と結合できるため、十分なシグナルが検出される。
【0071】
具体的には、阻害ＥＬＩＳＡは、以下のとおり行った。
（ａ）ヒトｍＣＲＰを、希釈用緩衝液で４０μｇ／ｍＬに調整した（溶液ａ１）。又はヒトｐＣＲＰを、希釈用緩衝液で４０μｇ／ｍＬに調整した（溶液ａ２）。
（ｂ）培養上清を、希釈用緩衝液にて２倍希釈した（溶液２）。
（ｃ）溶液ａ１を溶液２と各５０μＬずつ混和して、培養上清中の抗体とヒトｍＣＲＰを、４℃で１６時間以上反応させた。また、溶液ａ２を溶液２と各５０μＬずつ混和して、培養上清中の抗体とヒトｐＣＲＰを、４℃で１６時間以上反応させた。
（ｄ）以降の手順は、固相ＥＬＩＳＡの上述した（ａ）～（ｊ）の手順と同様であった。阻害ＥＬＩＳＡの（ｃ）で得られた溶液を、固相ＥＬＩＳＡの（ｅ）で用いられたサンプルとして用いた。結果を表１に示す。
（ａ）ヒトｍＣＲＰを、希釈用緩衝液で４０μｇ／ｍＬに調整した（溶液ａ１）。又はヒトｐＣＲＰを、希釈用緩衝液で４０μｇ／ｍＬに調整した（溶液ａ２）。
（ｂ）培養上清を、希釈用緩衝液にて２倍希釈した（溶液２）。
（ｃ）溶液ａ１を溶液２と各５０μＬずつ混和して、培養上清中の抗体とヒトｍＣＲＰを、４℃で１６時間以上反応させた。また、溶液ａ２を溶液２と各５０μＬずつ混和して、培養上清中の抗体とヒトｐＣＲＰを、４℃で１６時間以上反応させた。
（ｄ）以降の手順は、固相ＥＬＩＳＡの上述した（ａ）～（ｊ）の手順と同様であった。阻害ＥＬＩＳＡの（ｃ）で得られた溶液を、固相ＥＬＩＳＡの（ｅ）で用いられたサンプルとして用いた。結果を表１に示す。
【0072】
【表1】
【0073】
その結果、３６個の陽性クローンのうちの多くのクローンにおいて、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に比し（ｉ）ではシグナルが小さい値を示した。このことは、多くのクローンが、ヒトｍＣＲＰに特異的に結合する能力を有する抗ヒトｍＣＲＰ抗体を産生することを示す。これらのクローンのなかから、（ｉ）ではシグナルが実質的に検出されない一方で、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）では十分なシグナルが検出された７種のクローン（３，１２，１８，１９，２１，３５，３６）を選択した。このような７種のクローンは、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有する優れたヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体を産生できると考えられる。
【0074】
（６）ハイブリドーマの一次クローニングとサブクラスの同定
選抜した７種のクローンを限界希釈法により、１次クローニングした。２週間後、ＥＩＡ法にてスクリーニングを行い陽性ウェルを選抜した。陽性ウェルを３ウェル（Ａ，Ｂ，Ｃ）ずつ選抜し上清を採取し、固相ＥＬＩＳＡ、及び阻害ＥＬＩＳＡを行った。その結果、１種のクローンでは、良好な抗体反応性が確認されなかったが、６種のクローン（クローン番号３，１２，１８，１９，２１，３５）にそれぞれ対応する３種のサブクローン（Ａ，Ｂ，Ｃ）において、良好な抗体反応性が確認された。以降の実験は、これらのサブクローン（３Ｃ、１２Ｃ、１８Ａ、１９Ｃ、２１Ａ、３５Ａ）を用いた。
選抜した７種のクローンを限界希釈法により、１次クローニングした。２週間後、ＥＩＡ法にてスクリーニングを行い陽性ウェルを選抜した。陽性ウェルを３ウェル（Ａ，Ｂ，Ｃ）ずつ選抜し上清を採取し、固相ＥＬＩＳＡ、及び阻害ＥＬＩＳＡを行った。その結果、１種のクローンでは、良好な抗体反応性が確認されなかったが、６種のクローン（クローン番号３，１２，１８，１９，２１，３５）にそれぞれ対応する３種のサブクローン（Ａ，Ｂ，Ｃ）において、良好な抗体反応性が確認された。以降の実験は、これらのサブクローン（３Ｃ、１２Ｃ、１８Ａ、１９Ｃ、２１Ａ、３５Ａ）を用いた。
【0075】
次に、各クローン１個の培養上清を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによるサブクラスチェックを実施したところ、結果は以下であった。
（ａ）ｍＣＲＰ－３Ｃ：マウスＩｇＧ２ｂ，κ
（ｂ）ｍＣＲＰ－１２Ｃ：マウスＩｇＧ１，κ
（ｃ）ｍＣＲＰ－１８Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ｄ）ｍＣＲＰ－１９Ｃ：マウスＩｇＧ１，κ
（ｅ）ｍＣＲＰ－２１Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ｆ）ｍＣＲＰ－３５Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ａ）ｍＣＲＰ－３Ｃ：マウスＩｇＧ２ｂ，κ
（ｂ）ｍＣＲＰ－１２Ｃ：マウスＩｇＧ１，κ
（ｃ）ｍＣＲＰ－１８Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ｄ）ｍＣＲＰ－１９Ｃ：マウスＩｇＧ１，κ
（ｅ）ｍＣＲＰ－２１Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
（ｆ）ｍＣＲＰ－３５Ａ：マウスＩｇＧ２ａ，κ
【0076】
（７）ＩｇＧ精製
６種のハイブリドーマ（３Ｃ，１２Ｃ，１８Ａ，１９Ｃ，２１Ａ，３５Ａ）を常法により培養して得られた培養上清からＩｇＧを精製し、ｍＣＲＰに対する結合能を分析した。
６種のハイブリドーマ（３Ｃ，１２Ｃ，１８Ａ，１９Ｃ，２１Ａ，３５Ａ）を常法により培養して得られた培養上清からＩｇＧを精製し、ｍＣＲＰに対する結合能を分析した。
【0077】
ＩｇＧの精製及び分析に用いた材料及び機器は、以下である。
（ａ）プロテインＡカラム
（ｂ）結合緩衝液（グリシン－ＮａＣｌ，ｐＨ８．９）
（ｃ）溶出緩衝液（クエン酸，ｐＨ４．０）
（ｄ）再生緩衝液（クエン酸，ｐＨ２．０）
（ｅ）Ｄ－ＰＢＳ
（ｆ）吸光度モニタ－２８０ｎｍ（ＡＴＴＯ）
（ｇ）ＡＫＴＡシステム（ＧＥヘルスケア）
（ｈ）ＡＫＴＡ用分析カラム（ＧＥヘルスケア）
（ａ）プロテインＡカラム
（ｂ）結合緩衝液（グリシン－ＮａＣｌ，ｐＨ８．９）
（ｃ）溶出緩衝液（クエン酸，ｐＨ４．０）
（ｄ）再生緩衝液（クエン酸，ｐＨ２．０）
（ｅ）Ｄ－ＰＢＳ
（ｆ）吸光度モニタ－２８０ｎｍ（ＡＴＴＯ）
（ｇ）ＡＫＴＡシステム（ＧＥヘルスケア）
（ｈ）ＡＫＴＡ用分析カラム（ＧＥヘルスケア）
【0078】
ＩｇＧの精製及び分析は、以下のとおり行った。
（ＩｇＧの精製）
（ａ）培養上清を０．４５μｍで濾過し、硫安塩析後、結合緩衝液で希釈した。
（ｂ）結合緩衝液に平衡化されたＰｒｏｔｅｉｎＡカラムへ添加した。
（ｃ）結合緩衝液で夾雑蛋白の除去のためカラムを十分に洗浄した。
（ｄ）溶出緩衝液でＩｇＧ溶出する。回収容器に、あらかじめ回収液の１／１０量程度の中和緩衝液を入れておき、溶出物のｐＨを中和した。
（ｅ）溶出物をＰＢＳに冷蔵下で、透析した。
（ｆ）ＩｇＧを回収し、０．２２μｍで濾過した。
（ｇ）ＯＤ２８０ｎｍを測定しＩｇＧ濃度を算出した。
（ｈ）限外濾過法により、５ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮し、０．２２μｍにてフィルトレーション後、分注凍結保存した。
（ＩｇＧの精製）
（ａ）培養上清を０．４５μｍで濾過し、硫安塩析後、結合緩衝液で希釈した。
（ｂ）結合緩衝液に平衡化されたＰｒｏｔｅｉｎＡカラムへ添加した。
（ｃ）結合緩衝液で夾雑蛋白の除去のためカラムを十分に洗浄した。
（ｄ）溶出緩衝液でＩｇＧ溶出する。回収容器に、あらかじめ回収液の１／１０量程度の中和緩衝液を入れておき、溶出物のｐＨを中和した。
（ｅ）溶出物をＰＢＳに冷蔵下で、透析した。
（ｆ）ＩｇＧを回収し、０．２２μｍで濾過した。
（ｇ）ＯＤ２８０ｎｍを測定しＩｇＧ濃度を算出した。
（ｈ）限外濾過法により、５ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮し、０．２２μｍにてフィルトレーション後、分注凍結保存した。
【0079】
（ＩｇＧの分析）
（ａ）２８０ｎｍの吸光度を測定し、Ａ２８０＝１．３８２を１ｍｇ／ｍＬとしてタンパク濃度を算出した。
（ｂ）ＡＫＴＡ ＦＰＬＣによるゲル濾過分析により、純度を確認した。
（ｃ）上述の固相ＥＬＩＳＡにて力価を確認した。
その結果、６種のハイブリドーマを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧはいずれも、ヒトｍＣＲＰに対する結合能を有することが確認された。
（ａ）２８０ｎｍの吸光度を測定し、Ａ２８０＝１．３８２を１ｍｇ／ｍＬとしてタンパク濃度を算出した。
（ｂ）ＡＫＴＡ ＦＰＬＣによるゲル濾過分析により、純度を確認した。
（ｃ）上述の固相ＥＬＩＳＡにて力価を確認した。
その結果、６種のハイブリドーマを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧはいずれも、ヒトｍＣＲＰに対する結合能を有することが確認された。
【0080】
実施例２：ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマの２次スクリーニング
実施例１で得られたハイブリドーマのサブクローン（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）を、限界希釈法により２次クローニングした。細胞培養、並びにＩｇＧの精製及び分析は、それぞれ、実施例１と同様にして行った。
その結果、上述の固相ＥＬＩＳＡにて力価を確認したところ、２次クローニングに供された３種のハイブリドーマ（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）を培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧはいずれも、ヒトｍＣＲＰに対する結合能を有することが確認された。
また、これらのハイブリドーマを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧを、実施例１（５）に記載した阻害ＥＬＩＳＡにより解析したところ、これらのＩｇＧは、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体であることが確認された（図２～４）。
実施例１で得られたハイブリドーマのサブクローン（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）を、限界希釈法により２次クローニングした。細胞培養、並びにＩｇＧの精製及び分析は、それぞれ、実施例１と同様にして行った。
その結果、上述の固相ＥＬＩＳＡにて力価を確認したところ、２次クローニングに供された３種のハイブリドーマ（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）を培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧはいずれも、ヒトｍＣＲＰに対する結合能を有することが確認された。
また、これらのハイブリドーマを培養して得られた培養上清から精製されたＩｇＧを、実施例１（５）に記載した阻害ＥＬＩＳＡにより解析したところ、これらのＩｇＧは、ヒトｍＣＲＰに結合する能力を有するヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体であることが確認された（図２～４）。
【0081】
実施例３：ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体の構造解析
実施例２で２次スクリーニングされた３種のハイブリドーマ（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）よりｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製した。マウス重鎖及び軽鎖特異的なプライマーを用いて、５’－ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法を行い、重鎖及び軽鎖のＮ末の塩基配列を決定した。Ｎ末塩基配列の翻訳開始メチオニン周辺配列をＮ末側プライマーとして、重鎖及び軽鎖の全長ｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングした。ＣＤＲおよび可変領域は、ＮＣＢＩにおけるＩｇＢＬＡＳＴを利用してＫａｂａｔらの定義にしたがい決定した。
その結果、各ハイブリドーマにより産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体は、下記表２に示される構造的特徴を有していた（図５、６も参照のこと）。
実施例２で２次スクリーニングされた３種のハイブリドーマ（ｍＣＲＰ－３Ｃ、ｍＣＲＰ－１２Ｃ、ｍＣＲＰ－１８Ａ）よりｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製した。マウス重鎖及び軽鎖特異的なプライマーを用いて、５’－ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法を行い、重鎖及び軽鎖のＮ末の塩基配列を決定した。Ｎ末塩基配列の翻訳開始メチオニン周辺配列をＮ末側プライマーとして、重鎖及び軽鎖の全長ｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングした。ＣＤＲおよび可変領域は、ＮＣＢＩにおけるＩｇＢＬＡＳＴを利用してＫａｂａｔらの定義にしたがい決定した。
その結果、各ハイブリドーマにより産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体は、下記表２に示される構造的特徴を有していた（図５、６も参照のこと）。
【0082】
【表2】
【0083】
以上より、上記のようなＣＤＲを含む抗体がヒトｍＣＲＰを認識できることが示された。
【0084】
以降では、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体について、下記略称を使用することがある。
１）ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：３Ｃ抗体
２）ハイブリドーマｍＣＲＰ－１２Ｃから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：１２Ｃ抗体
３）ハイブリドーマｍＣＲＰ－１８Ａから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：１８Ａ抗体
１）ハイブリドーマｍＣＲＰ－３Ｃから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：３Ｃ抗体
２）ハイブリドーマｍＣＲＰ－１２Ｃから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：１２Ｃ抗体
３）ハイブリドーマｍＣＲＰ－１８Ａから産生されるヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体：１８Ａ抗体
【0085】
実施例４：ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体のエピトープ解析
（１）ペプチド合成（その１）
３Ｃ抗体のエピトープを解析した。先ず、エピトープ解析に使用する下記ペプチドを合成した。下記ペプチドは、固相への固定を可能にするため、ヒトｍＣＲＰのエピトープのＣ末端にシステイン残基（Ｃ）が付加されている。
（１）ペプチド合成（その１）
３Ｃ抗体のエピトープを解析した。先ず、エピトープ解析に使用する下記ペプチドを合成した。下記ペプチドは、固相への固定を可能にするため、ヒトｍＣＲＰのエピトープのＣ末端にシステイン残基（Ｃ）が付加されている。
【0086】
１）ｍＣＲＰ（１９）：ＱＴＤＭＳＲＫＡＦＶＣ（配列番号１３）
２）ｍＣＲＰ（２９）：ＦＰＫＥＳＤＴＳＹＶＣ（配列番号１４）
３）ｍＣＲＰ（３９）：ＳＬＫＡＰＬＴＫＰＬＣ（配列番号１５）
４）ｍＣＲＰ（４９）：ＫＡＦＴＶＣＬＨＦＹＣ（配列番号１６）
５）ｍＣＲＰ（５９）：ＴＥＬＳＳＴＲＧＹＳＣ（配列番号１７）
６）ｍＣＲＰ（６９）：ＩＦＳＹＡＴＫＲＱＤＣ（配列番号１８）
７）ｍＣＲＰ（７９）：ＮＥＩＬＩＦＷＳＫＤＣ（配列番号１９）
８）ｍＣＲＰ（８９）：ＩＧＹＳＦＴＶＧＧＳＣ（配列番号２０）
９）ｍＣＲＰ（９９）：ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴＣ（配列番号２１）
１０）ｍＣＲＰ（１０９）：ＶＡＰＶＨＩＣＴＳＷＣ（配列番号２２）
１１）ｍＣＲＰ（１１９）：ＥＳＡＳＧＩＶＥＦＷＣ（配列番号２３）
１２）ｍＣＲＰ（１２９）：ＶＤＧＫＰＲＶＲＫＳＣ（配列番号２４）
１３）ｍＣＲＰ（１３９）：ＬＫＫＧＹＴＶＧＡＥＣ（配列番号２５）
１４）ｍＣＲＰ（１４９）：ＡＳＩＩＬＧＱＥＱＤＣ（配列番号２６）
１５）ｍＣＲＰ（１５９）：ＳＦＧＧＮＦＥＧＳＱＣ（配列番号２７）
１６）ｍＣＲＰ（１６９）：ＳＬＶＧＤＩＧＮＶＮＣ（配列番号２８）
１７）ｍＣＲＰ（１７９）：ＭＷＤＦＶＬＳＰＤＥＣ（配列番号２９）
１８）ｍＣＲＰ（１８９）：ＩＮＴＩＹＬＧＧＰＦＣ（配列番号３０）
１９）ｍＣＲＰ（１９９）：ＳＰＮＶＬＮＷＲＡＬＣ（配列番号３１）
２０）ｍＣＲＰ（２０９）：ＫＹＥＶＱＧＥＶＦＴＫＰＱＬＷＰＣ（配列番号３２）
２）ｍＣＲＰ（２９）：ＦＰＫＥＳＤＴＳＹＶＣ（配列番号１４）
３）ｍＣＲＰ（３９）：ＳＬＫＡＰＬＴＫＰＬＣ（配列番号１５）
４）ｍＣＲＰ（４９）：ＫＡＦＴＶＣＬＨＦＹＣ（配列番号１６）
５）ｍＣＲＰ（５９）：ＴＥＬＳＳＴＲＧＹＳＣ（配列番号１７）
６）ｍＣＲＰ（６９）：ＩＦＳＹＡＴＫＲＱＤＣ（配列番号１８）
７）ｍＣＲＰ（７９）：ＮＥＩＬＩＦＷＳＫＤＣ（配列番号１９）
８）ｍＣＲＰ（８９）：ＩＧＹＳＦＴＶＧＧＳＣ（配列番号２０）
９）ｍＣＲＰ（９９）：ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴＣ（配列番号２１）
１０）ｍＣＲＰ（１０９）：ＶＡＰＶＨＩＣＴＳＷＣ（配列番号２２）
１１）ｍＣＲＰ（１１９）：ＥＳＡＳＧＩＶＥＦＷＣ（配列番号２３）
１２）ｍＣＲＰ（１２９）：ＶＤＧＫＰＲＶＲＫＳＣ（配列番号２４）
１３）ｍＣＲＰ（１３９）：ＬＫＫＧＹＴＶＧＡＥＣ（配列番号２５）
１４）ｍＣＲＰ（１４９）：ＡＳＩＩＬＧＱＥＱＤＣ（配列番号２６）
１５）ｍＣＲＰ（１５９）：ＳＦＧＧＮＦＥＧＳＱＣ（配列番号２７）
１６）ｍＣＲＰ（１６９）：ＳＬＶＧＤＩＧＮＶＮＣ（配列番号２８）
１７）ｍＣＲＰ（１７９）：ＭＷＤＦＶＬＳＰＤＥＣ（配列番号２９）
１８）ｍＣＲＰ（１８９）：ＩＮＴＩＹＬＧＧＰＦＣ（配列番号３０）
１９）ｍＣＲＰ（１９９）：ＳＰＮＶＬＮＷＲＡＬＣ（配列番号３１）
２０）ｍＣＲＰ（２０９）：ＫＹＥＶＱＧＥＶＦＴＫＰＱＬＷＰＣ（配列番号３２）
【0087】
（２）エピトープ解析（その１）
エピトープ解析の材料としては、以下を用いた。
（ａ）プレート：Ｎｕｎｃ製 ＥＬＩＳＡ用イムノプレート（９６ウェル）
（ｂ）基質：Ｏ．Ｐ．Ｄ ｔａｂｌｅｔ（ＳＩＧＭＡ）
（ｃ）固相化用緩衝液：０．１Ｍ炭酸緩衝液 ｐＨ９．５（ＩＢＬ）
（ｄ）抗血清希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（関東化学） ｉｎ ＰＢＳ
（ｅ）標識抗体希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ＰＢＳ
（ｆ）洗浄用緩衝液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ０．１ＭＰＢ
（ｇ）基質用緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）（ＩＢＬ）
（ｈ）反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ－Ｈ２ＳＯ４（和光純薬）
（ｉ）固相ペプチド
エピトープ解析の材料としては、以下を用いた。
（ａ）プレート：Ｎｕｎｃ製 ＥＬＩＳＡ用イムノプレート（９６ウェル）
（ｂ）基質：Ｏ．Ｐ．Ｄ ｔａｂｌｅｔ（ＳＩＧＭＡ）
（ｃ）固相化用緩衝液：０．１Ｍ炭酸緩衝液 ｐＨ９．５（ＩＢＬ）
（ｄ）抗血清希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（関東化学） ｉｎ ＰＢＳ
（ｅ）標識抗体希釈用緩衝液：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ＰＢＳ
（ｆ）洗浄用緩衝液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ｉｎ ０．１ＭＰＢ
（ｇ）基質用緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４－クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）（ＩＢＬ）
（ｈ）反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ－Ｈ２ＳＯ４（和光純薬）
（ｉ）固相ペプチド
【0088】
エピトープ解析は、以下の手順により行った。
（ａ）ペプチドを、５０ｎｇ／ウェル（５０μＬ／ウェル）で用いて、４℃で１６時間放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相ペプチドを、ダルベッコＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）抗体を希釈用緩衝液にて１μｇ／ｍＬに希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｇ）標識抗体である抗マウスＩｇＧ（γ特異的）－ＨＲＰを各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｉ）基質液（４００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて１５分間反応させた。
（ｊ）１５分後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
（ａ）ペプチドを、５０ｎｇ／ウェル（５０μＬ／ウェル）で用いて、４℃で１６時間放置することによりプレートに固相化した。
（ｂ）固相ペプチドを、ダルベッコＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した。
（ｃ）０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＤ－ＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して４℃で一晩放置することにより、ブロッキングを行った。
（ｄ）各ウェルを、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
（ｅ）抗体を希釈用緩衝液にて１μｇ／ｍＬに希釈し、希釈液を各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｆ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｇ）標識抗体である抗マウスＩｇＧ（γ特異的）－ＨＲＰを各ウェルに添加して（５０μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間放置した。
（ｈ）各ウェルを洗浄用緩衝液で４回以上洗浄した。
（ｉ）基質液（４００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加（１００μＬ／ウェル）することにより発色反応を開始させ、遮光下で室温にて１５分間反応させた。
（ｊ）１５分後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸の添加（１００μＬ／ウェル）により反応を停止させ、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
【0089】
その結果、３Ｃ抗体は、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）を含むペプチドに対して、ｍＣＲＰと同様の反応性を示した（表３）。また、上記（ｅ）において、各ウェルに添加する抗体濃度を５μｇ／ｍＬに変更した場合にも、同様の結果が確認された。なお、ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体である１２Ｃ抗体、１８Ａ抗体（図３、４）について、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）を含むペプチドに対して結合するか確認したところ、このペプチドに対して結合しなかった。このことは、これらの抗体が３Ｃ抗体と異なるエピトープを認識していることを示す。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体のエピトープは１種のみではなく、複数種存在すると考えられる。
【0090】
【表3】
【0091】
以上より、ヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体のエピトープとして、３Ｃ抗体のエピトープであるＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）（図１）を含む複数のエピトープが存在すると考えられた。
【0092】
（３）ペプチド合成（その２）
３Ｃ抗体のエピトープを追試のため解析した。エピトープとしては、上記１）～２０）のペプチドに代えて、より長い下記ペプチドを合成して使用した。
２１）ｍＣＲＰ（１－３０）：ＱＴＤＭＳＲＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤＴＳＹＶＳＬＫＡＰＬＴＫＰＬＣ（配列番号３３）
２２）ｍＣＲＰ（３１－６０）：ＫＡＦＴＶＣＬＨＦＹＴＥＬＳＳＴＲＧＹＳＩＦＳＹＡＴＫＲＱＤＣ（配列番号３４）
２３）ｍＣＲＰ（６１－９０）：ＮＥＩＬＩＦＷＳＫＤＩＧＹＳＦＴＶＧＧＳＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴＣ（配列番号３５）
２４）ｍＣＲＰ（９１－１２０）：ＶＡＰＶＨＩＣＴＳＷＥＳＡＳＧＩＶＥＦＷＶＤＧＫＰＲＶＲＫＳＣ（配列番号３６）
２５）ｍＣＲＰ（１２１－１５０）：ＬＫＫＧＹＴＶＧＡＥＡＳＩＩＬＧＱＥＱＤＳＦＧＧＮＦＥＧＳＱＣ（配列番号３７）
２６）ｍＣＲＰ（１５１－１８０）：ＳＬＶＧＤＩＧＮＶＮＭＷＤＦＶＬＳＰＤＥＩＮＴＩＹＬＧＧＰＦＣ（配列番号３８）
２７）ｍＣＲＰ（１８１－２０６）：ＳＰＮＶＬＮＷＲＡＬＫＹＥＶＱＧＥＶＦＴＫＰＱＬＷＰＣ（配列番号３９）
３Ｃ抗体のエピトープを追試のため解析した。エピトープとしては、上記１）～２０）のペプチドに代えて、より長い下記ペプチドを合成して使用した。
２１）ｍＣＲＰ（１－３０）：ＱＴＤＭＳＲＫＡＦＶＦＰＫＥＳＤＴＳＹＶＳＬＫＡＰＬＴＫＰＬＣ（配列番号３３）
２２）ｍＣＲＰ（３１－６０）：ＫＡＦＴＶＣＬＨＦＹＴＥＬＳＳＴＲＧＹＳＩＦＳＹＡＴＫＲＱＤＣ（配列番号３４）
２３）ｍＣＲＰ（６１－９０）：ＮＥＩＬＩＦＷＳＫＤＩＧＹＳＦＴＶＧＧＳＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴＣ（配列番号３５）
２４）ｍＣＲＰ（９１－１２０）：ＶＡＰＶＨＩＣＴＳＷＥＳＡＳＧＩＶＥＦＷＶＤＧＫＰＲＶＲＫＳＣ（配列番号３６）
２５）ｍＣＲＰ（１２１－１５０）：ＬＫＫＧＹＴＶＧＡＥＡＳＩＩＬＧＱＥＱＤＳＦＧＧＮＦＥＧＳＱＣ（配列番号３７）
２６）ｍＣＲＰ（１５１－１８０）：ＳＬＶＧＤＩＧＮＶＮＭＷＤＦＶＬＳＰＤＥＩＮＴＩＹＬＧＧＰＦＣ（配列番号３８）
２７）ｍＣＲＰ（１８１－２０６）：ＳＰＮＶＬＮＷＲＡＬＫＹＥＶＱＧＥＶＦＴＫＰＱＬＷＰＣ（配列番号３９）
【0093】
（４）エピトープ解析（その２）
エピトープ解析の材料は、実施例４（２）と同じであった。エピトープ解析の手順は、実施例４（２）と同様にして行った。
その結果、３Ｃ抗体は、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）を含むペプチドに対して反応した（表４）。また、ペプチドを固相に直接固定するのではなく、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を介して固相に固定した場合にも、同様の結果が確認された。
エピトープ解析の材料は、実施例４（２）と同じであった。エピトープ解析の手順は、実施例４（２）と同様にして行った。
その結果、３Ｃ抗体は、ＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）を含むペプチドに対して反応した（表４）。また、ペプチドを固相に直接固定するのではなく、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を介して固相に固定した場合にも、同様の結果が確認された。
【0094】
【表4】
【0095】
以上より、３Ｃ抗体のエピトープはＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）であることが確認された（図１）。
【0096】
実施例５：ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体によるｍＣＲＰ結合能阻害効果の検討
ｍＣＲＰは、Ｆｃレセプターやインテグリンを介して細胞表面に結合する。そこで、作製した抗体がｍＣＲＰの細胞表面への結合を阻害するかどうか検討した。血球としては、健常人由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用い、ＦＡＭ標識したｍＣＲＰの細胞表面への結合をフローサイトメーターにて解析した。健常人由来の末梢血単核球は、健常人血球よりｆｉｃｏｌｌにて分離した（ＧＥ：Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ）。ｍＣＲＰとＰＢＭＣとの結合は、ＦＡＭ－ｍＣＲＰとＰＢＭＣを５分インキュベートすることにより確認した。結合阻害の検討では、１００μｇ／ｍｌ ｍＣＲＰと１００μｇ／ｍｌの抗ｍＣＲＰ抗体（３Ｃ，１２Ｃ，１８Ａ，１９Ｃ，２１Ａ，３５Ａ）を室温で１５分プレインキュベートした（Ｎ＝３）。
その結果、抗ｍＣＲＰ抗体の一部（３Ｃ，３５Ａ）は、ｍＣＲＰのＰＢＭＣへの結合を強く抑制した（図７）。よって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体（３Ｃ，３５Ａ）は、ｍＣＲＰの結合能を強く阻害できることがインビトロで確認された。
ｍＣＲＰは、Ｆｃレセプターやインテグリンを介して細胞表面に結合する。そこで、作製した抗体がｍＣＲＰの細胞表面への結合を阻害するかどうか検討した。血球としては、健常人由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用い、ＦＡＭ標識したｍＣＲＰの細胞表面への結合をフローサイトメーターにて解析した。健常人由来の末梢血単核球は、健常人血球よりｆｉｃｏｌｌにて分離した（ＧＥ：Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ）。ｍＣＲＰとＰＢＭＣとの結合は、ＦＡＭ－ｍＣＲＰとＰＢＭＣを５分インキュベートすることにより確認した。結合阻害の検討では、１００μｇ／ｍｌ ｍＣＲＰと１００μｇ／ｍｌの抗ｍＣＲＰ抗体（３Ｃ，１２Ｃ，１８Ａ，１９Ｃ，２１Ａ，３５Ａ）を室温で１５分プレインキュベートした（Ｎ＝３）。
その結果、抗ｍＣＲＰ抗体の一部（３Ｃ，３５Ａ）は、ｍＣＲＰのＰＢＭＣへの結合を強く抑制した（図７）。よって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体（３Ｃ，３５Ａ）は、ｍＣＲＰの結合能を強く阻害できることがインビトロで確認された。
【0097】
実施例６：抗ヒト変性ＣＲＰ抗体の中和作用の検討
ｍＣＲＰ非存在下では末梢血単核球はフィブリノーゲンに結合できないが、ｍＣＲＰ存在下ではインテグリンが活性化されるためフィブリノーゲンは細胞表面に結合できるようになる。抗ｍＣＲＰ抗体がこのｍＣＲＰの効果を抑制する中和作用を有するか検討した。
血球としては、健常人由来の末梢血単核球を用い、ＦＡＭ標識したフィブリノーゲン（γＣｔｒｕｎｃ３９９）の細胞表面への結合をフローサイトメーターにて解析した。健常人由来の末梢血単核球は患者血球よりｆｉｃｏｌｌにて分離した（ＧＥ：Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ）。インテグリンの活性化は１００μｇ／ｍｌのｍＣＲＰで単核球を刺激することにより誘導した。中和作用の検討では、１００μｇ／ｍｌ ｍＣＲＰと１００μｇ／ｍｌの抗ｍＣＲＰ抗体（３Ｃ，１２Ｃ，１８Ａ，１９Ｃ，２１Ａ，３５Ａ）を室温で１５分プレインキュベートした（Ｎ＝３）。
その結果、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体の一部（３Ｃ，３５Ａ）は、ｍＣＲＰによるインテグリン活性化を強く抑制する中和作用を示した（図８Ａ～Ｄ）。よって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体（３Ｃ及び３５Ａ）は、ｍＣＲＰの強い中和作用を有する中和抗体であることがインビトロで確認された。また、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体（３Ｃ）により認識されるエピトープであるＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）が、優れた中和エピトープであることが確認された。
ｍＣＲＰ非存在下では末梢血単核球はフィブリノーゲンに結合できないが、ｍＣＲＰ存在下ではインテグリンが活性化されるためフィブリノーゲンは細胞表面に結合できるようになる。抗ｍＣＲＰ抗体がこのｍＣＲＰの効果を抑制する中和作用を有するか検討した。
血球としては、健常人由来の末梢血単核球を用い、ＦＡＭ標識したフィブリノーゲン（γＣｔｒｕｎｃ３９９）の細胞表面への結合をフローサイトメーターにて解析した。健常人由来の末梢血単核球は患者血球よりｆｉｃｏｌｌにて分離した（ＧＥ：Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ）。インテグリンの活性化は１００μｇ／ｍｌのｍＣＲＰで単核球を刺激することにより誘導した。中和作用の検討では、１００μｇ／ｍｌ ｍＣＲＰと１００μｇ／ｍｌの抗ｍＣＲＰ抗体（３Ｃ，１２Ｃ，１８Ａ，１９Ｃ，２１Ａ，３５Ａ）を室温で１５分プレインキュベートした（Ｎ＝３）。
その結果、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体の一部（３Ｃ，３５Ａ）は、ｍＣＲＰによるインテグリン活性化を強く抑制する中和作用を示した（図８Ａ～Ｄ）。よって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体（３Ｃ及び３５Ａ）は、ｍＣＲＰの強い中和作用を有する中和抗体であることがインビトロで確認された。また、ヒト変性ＣＲＰ特異的な抗体（３Ｃ）により認識されるエピトープであるＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴ（配列番号２）が、優れた中和エピトープであることが確認された。
【0098】
実施例７：腹膜炎モデルマウスを用いたヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体の有用性の検討
チオグリコレートの腹腔内投与により、腹腔内への炎症細胞の遊走が刺激される。通常、２４時間後には好中球、４８時間後には単球の遊走がピークになる。この腹膜炎モデルによれば、チオグリコレート投与後に腹腔内の炎症細胞数をカウントすることにより、炎症反応の程度（腹膜炎）を簡便に把握することができる。本モデルを用いて、ヒヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体がチオグリコレート誘導性腹膜炎を抑制するかどうかを検討した。
７週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス（清水実験材料）に４％チオグリコレート溶液を１ｍｌ腹腔内投与し腹膜炎を誘導した。また、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体（３Ｃ及び３５Ａ）あるいはコントロールＩｇＧ抗体を８０μｇ／ｂｏｄｙ、ヒト変性ＣＲＰを５０μｇ／ｂｏｄｙで投与した。４８時間後にマウスを安楽死させ（中枢破壊）、腹腔内にＰＢＳ１０ｍｌを注入し、腹水を回収した。回収した腹水１ｍｌを分注し、抗マウスＧｒ－１－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＲＢ６－８Ｃ５）、ラット抗マウスＦ４／Ｆ８０－ＦＩＴＣ（ａｂｃａｍ ＢＭ８）と反応させ、それぞれ、ＧＲ－１陽性細胞（好中球）、Ｆ４／Ｆ８０陽性細胞（単球・マクロファージ）をフローサイトメーターにてカウントした。
その結果、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体はチオグリコレート誘導性腹膜炎を抑制した（図９）。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を炎症性疾患の治療剤として使用できることが確認された。
チオグリコレートの腹腔内投与により、腹腔内への炎症細胞の遊走が刺激される。通常、２４時間後には好中球、４８時間後には単球の遊走がピークになる。この腹膜炎モデルによれば、チオグリコレート投与後に腹腔内の炎症細胞数をカウントすることにより、炎症反応の程度（腹膜炎）を簡便に把握することができる。本モデルを用いて、ヒヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体がチオグリコレート誘導性腹膜炎を抑制するかどうかを検討した。
７週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス（清水実験材料）に４％チオグリコレート溶液を１ｍｌ腹腔内投与し腹膜炎を誘導した。また、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体（３Ｃ及び３５Ａ）あるいはコントロールＩｇＧ抗体を８０μｇ／ｂｏｄｙ、ヒト変性ＣＲＰを５０μｇ／ｂｏｄｙで投与した。４８時間後にマウスを安楽死させ（中枢破壊）、腹腔内にＰＢＳ１０ｍｌを注入し、腹水を回収した。回収した腹水１ｍｌを分注し、抗マウスＧｒ－１－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＲＢ６－８Ｃ５）、ラット抗マウスＦ４／Ｆ８０－ＦＩＴＣ（ａｂｃａｍ ＢＭ８）と反応させ、それぞれ、ＧＲ－１陽性細胞（好中球）、Ｆ４／Ｆ８０陽性細胞（単球・マクロファージ）をフローサイトメーターにてカウントした。
その結果、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体はチオグリコレート誘導性腹膜炎を抑制した（図９）。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を炎症性疾患の治療剤として使用できることが確認された。
【0099】
実施例８：関節炎モデルマウスを用いたヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体の有用性の検討（予防効果）
コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）はＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体により惹起されるため、抗ＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体及びリポポリサッカリド（ＬＰＳ）の投与によりマウスに関節炎を発症させることができる。
７週齢のＤＢＡ／１Ｊマウス（清水実験材料）をもちいて、ＩＩ型コラーゲンに対する５種類のモノクローナル抗体カクテル（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ－ＣＩＡ： Ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，ＵＳＡ）１．２５ｍｇを０日目に腹腔内投与した（Ｎ＝１０）。３日目にＬＰＳ（２５μｇ）（Ｎ＝１０）及びヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体３Ｃ（１００μｇ）（Ｎ＝５）あるいはコントロールＩｇＧ（１００μｇ）（Ｎ＝５）を腹腔内投与した。関節スコアは１肢４点の最高１６点のスコアリングで評価した。スコアは指、甲、手首の３関節を評価した（０：変化なし；１：いずれかの関節１つの腫脹；２：いずれかの関節２つの腫脹；３：すべての関節の腫脹；４：すべての関節の腫脹があり肢全体が赤く腫脹）。ＤＡＹ０からＤＡＹ１４まで、２～３日毎に測定した。
関節炎は４日目より惹起され、１０～１５日目に最高値に達した。３Ｃ抗体を投与した群ではＩｇＧ抗体を投与した群と比較し、関節スコアの低下が認められた（図１０Ａ）。また、３Ｃ投与群では軽度の炎症細胞浸潤が認められたのに対し、ＩｇＧ投与群では著明な炎症細胞の浸潤、パンヌス形成及び関節軟骨の破壊が認められた（図１０Ｂ）。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を関節リウマチの予防剤として使用できることが確認された。
コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）はＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体により惹起されるため、抗ＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体及びリポポリサッカリド（ＬＰＳ）の投与によりマウスに関節炎を発症させることができる。
７週齢のＤＢＡ／１Ｊマウス（清水実験材料）をもちいて、ＩＩ型コラーゲンに対する５種類のモノクローナル抗体カクテル（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ－ＣＩＡ： Ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，ＵＳＡ）１．２５ｍｇを０日目に腹腔内投与した（Ｎ＝１０）。３日目にＬＰＳ（２５μｇ）（Ｎ＝１０）及びヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体３Ｃ（１００μｇ）（Ｎ＝５）あるいはコントロールＩｇＧ（１００μｇ）（Ｎ＝５）を腹腔内投与した。関節スコアは１肢４点の最高１６点のスコアリングで評価した。スコアは指、甲、手首の３関節を評価した（０：変化なし；１：いずれかの関節１つの腫脹；２：いずれかの関節２つの腫脹；３：すべての関節の腫脹；４：すべての関節の腫脹があり肢全体が赤く腫脹）。ＤＡＹ０からＤＡＹ１４まで、２～３日毎に測定した。
関節炎は４日目より惹起され、１０～１５日目に最高値に達した。３Ｃ抗体を投与した群ではＩｇＧ抗体を投与した群と比較し、関節スコアの低下が認められた（図１０Ａ）。また、３Ｃ投与群では軽度の炎症細胞浸潤が認められたのに対し、ＩｇＧ投与群では著明な炎症細胞の浸潤、パンヌス形成及び関節軟骨の破壊が認められた（図１０Ｂ）。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を関節リウマチの予防剤として使用できることが確認された。
【0100】
実施例９：関節炎モデルマウスを用いたヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体の有用性の検討（治療効果）
７週齢のＤＢＡ／１Ｊマウス（清水実験材料）をもちいて、ＩＩ型コラーゲンに対する５種類のモノクローナル抗体カクテル（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ－ＣＩＡ： Ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，ＵＳＡ）１．２５ｍｇを０日目に腹腔内投与した（Ｎ＝１０）。３日目にＬＰＳ（２５μｇ）を腹腔内投与した（Ｎ＝１０）。７日目にヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体３Ｃ（１００μｇ）（Ｎ＝５）あるいはコントロールＩｇＧ（１００μｇ）（Ｎ＝５）を腹腔内投与した。関節炎は４日目より惹起され、１０～１５日目に最高値に達した。関節スコアは１肢４点の最高１６点のスコアリングで評価した。スコアは指、甲、手首の３関節を評価した（０：変化なし；１：いずれかの関節１つの腫脹；２：いずれかの関節２つの腫脹；３：すべての関節の腫脹；４：すべての関節の腫脹があり肢全体が赤く腫脹）。ＤＡＹ０からＤＡＹ１７まで、２～３日毎に測定した。
その結果、３Ｃ抗体を投与した群ではＩｇＧ抗体を投与した群と比較し、関節スコアの低下が認められた（図１１Ａ）。また、３Ｃ投与群ではほぼ正常に近い骨組織が認められたのに対し、ＩｇＧ投与群では炎症細胞の浸潤、パンヌス形成及び関節軟骨の破壊が認められた（図１１Ｂ）。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を関節リウマチの治療剤として使用できることが確認された。
７週齢のＤＢＡ／１Ｊマウス（清水実験材料）をもちいて、ＩＩ型コラーゲンに対する５種類のモノクローナル抗体カクテル（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ－ＣＩＡ： Ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，ＵＳＡ）１．２５ｍｇを０日目に腹腔内投与した（Ｎ＝１０）。３日目にＬＰＳ（２５μｇ）を腹腔内投与した（Ｎ＝１０）。７日目にヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体３Ｃ（１００μｇ）（Ｎ＝５）あるいはコントロールＩｇＧ（１００μｇ）（Ｎ＝５）を腹腔内投与した。関節炎は４日目より惹起され、１０～１５日目に最高値に達した。関節スコアは１肢４点の最高１６点のスコアリングで評価した。スコアは指、甲、手首の３関節を評価した（０：変化なし；１：いずれかの関節１つの腫脹；２：いずれかの関節２つの腫脹；３：すべての関節の腫脹；４：すべての関節の腫脹があり肢全体が赤く腫脹）。ＤＡＹ０からＤＡＹ１７まで、２～３日毎に測定した。
その結果、３Ｃ抗体を投与した群ではＩｇＧ抗体を投与した群と比較し、関節スコアの低下が認められた（図１１Ａ）。また、３Ｃ投与群ではほぼ正常に近い骨組織が認められたのに対し、ＩｇＧ投与群では炎症細胞の浸潤、パンヌス形成及び関節軟骨の破壊が認められた（図１１Ｂ）。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体を関節リウマチの治療剤として使用できることが確認された。
【0101】
実施例１０：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）モデルマウスを用いたヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体の有用性の検討
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、１２週目よりＳＬＥの表現型を示す（リンパ節腫脹、腎炎、関節炎、唾液腺炎）。
９週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウス（清水実験材料）に、１１週目より、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体（３Ｃ）及びコントロールＩｇＧ抗体を腹腔内投与し（週１回；１００μｇ／ｂｏｄｙ）（コントロール群：Ｎ＝６、及び３Ｃ群：Ｎ＝７）、１８週目まで投与を行った。この間、週１回で尿タンパク質を測定した。尿タンパク質測定にはテルモ社のマイウリエースＴを用いた。尿タンパク質評価は、テステープ色調変化にて定量した（０：－；±：１５ｍｇ／ｄｌ；＋：３０ｍｇ／ｄｌ；＋＋：１００ｍｇ／ｄｌ；＋＋＋：２５０ｍｇ／ｄｌ）。１９週目にマウスを安楽死させ（中枢破壊）、抗二本鎖（ｄｓ）－ＤＮＡ抗体価測定（心臓穿刺）を行った（ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体投与群：Ｎ＝７、及びＩｇＧ投与群：Ｎ＝６）。抗ｄｓ－ＤＮＡ抗体価測定は、ＦＵＪＩＦＩＬＭ社のＥＬＩＳＡキット（レビス 抗ｄｓ－ＤＮＡ－マウスＥＬＩＳＡキット）を用いて測定した。
その結果、３Ｃ抗体を投与した群ではＩｇＧ抗体を投与した群と比較し、抗ｄｓ－ＤＮＡ抗体価の低下、及び尿タンパク質の減少が認められた（図１２Ａ及び１２Ｂ）。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体をＳＬＥの治療剤として使用できることが確認された。
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、１２週目よりＳＬＥの表現型を示す（リンパ節腫脹、腎炎、関節炎、唾液腺炎）。
９週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウス（清水実験材料）に、１１週目より、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体（３Ｃ）及びコントロールＩｇＧ抗体を腹腔内投与し（週１回；１００μｇ／ｂｏｄｙ）（コントロール群：Ｎ＝６、及び３Ｃ群：Ｎ＝７）、１８週目まで投与を行った。この間、週１回で尿タンパク質を測定した。尿タンパク質測定にはテルモ社のマイウリエースＴを用いた。尿タンパク質評価は、テステープ色調変化にて定量した（０：－；±：１５ｍｇ／ｄｌ；＋：３０ｍｇ／ｄｌ；＋＋：１００ｍｇ／ｄｌ；＋＋＋：２５０ｍｇ／ｄｌ）。１９週目にマウスを安楽死させ（中枢破壊）、抗二本鎖（ｄｓ）－ＤＮＡ抗体価測定（心臓穿刺）を行った（ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体投与群：Ｎ＝７、及びＩｇＧ投与群：Ｎ＝６）。抗ｄｓ－ＤＮＡ抗体価測定は、ＦＵＪＩＦＩＬＭ社のＥＬＩＳＡキット（レビス 抗ｄｓ－ＤＮＡ－マウスＥＬＩＳＡキット）を用いて測定した。
その結果、３Ｃ抗体を投与した群ではＩｇＧ抗体を投与した群と比較し、抗ｄｓ－ＤＮＡ抗体価の低下、及び尿タンパク質の減少が認められた（図１２Ａ及び１２Ｂ）。したがって、ヒト変性ＣＲＰ特異的な中和抗体をＳＬＥの治療剤として使用できることが確認された。
【0102】
実施例１１：ヒト化抗体及びキメラ抗体の作製および解析
（１）ヒト化抗体及びキメラ抗体の作製
先の実施例で得られたヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体（３Ｃ抗体）の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）における相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を共有するヒト化抗体及びキメラ抗体を作製し、それらの結合能を解析した。
（１）ヒト化抗体及びキメラ抗体の作製
先の実施例で得られたヒト変性ＣＲＰ特異的なモノクローナル抗体（３Ｃ抗体）の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）における相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を共有するヒト化抗体及びキメラ抗体を作製し、それらの結合能を解析した。
【0103】
先ず、３Ｃ抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列から、Ｋａｂａｔ および ＩＭＧＴ ナンバリングスキームに基づき、ＣＤＲ１～３を同定した。同定されたＣＤＲ１～３を、ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子（ＩＧＨＶ）及びヒト免疫グロブリンカッパ可変遺伝子（ＩＧＫＶ）に基づく可変領域に移植した。
【0104】
次に、移植後の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を、それぞれＩｇＧ１（Ｇ１ｍ１７，１）とＩｇＫ１（Ｋｍ３）の定常領域のアミノ酸配列を有する発現ベクターにクローニングして、３Ｃ抗体（マウス抗体）の重鎖中のＣＤＲ１～３をヒト抗体に移植した重鎖（ＨＣ１～５）、及び３Ｃ抗体の軽鎖中のＣＤＲ１～３をヒト抗体に移植した軽鎖（ＬＣ１～３）を含むヒト化抗体を作製した。
【0105】
なお、３Ｃ抗体（マウス抗体）の重鎖可変領域をヒト抗体の重鎖定常領域に連結した重鎖（ＨＣ０）、及び３Ｃ抗体の軽鎖可変領域をヒト抗体の軽鎖定常領域に連結した軽鎖（ＬＣ０）を含むキメラ抗体も併せて作製した。
作製した各抗体の重鎖（ＨＣ０～５）及び軽鎖（ＬＣ０～３）の情報を表５に示す。
作製した各抗体の重鎖（ＨＣ０～５）及び軽鎖（ＬＣ０～３）の情報を表５に示す。
【0106】
【表5】
【0107】
（２）ヒト化抗体及びキメラ抗体の解析
作製した各抗体の結合能を解析した。発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入し、培養した後、発現した抗体を培養上清からＡＫＴＡＴＭ ｄｅｓｉｇｎ クロマトグラフィーシステムを用いて精製した。得られた１０種類の精製抗体の結合能を、２種類の方法で解析した。
作製した各抗体の結合能を解析した。発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入し、培養した後、発現した抗体を培養上清からＡＫＴＡＴＭ ｄｅｓｉｇｎ クロマトグラフィーシステムを用いて精製した。得られた１０種類の精製抗体の結合能を、２種類の方法で解析した。
【0108】
先ず、バイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ）を利用するＯｃｔｅｔ Ｓｙｓｔｅｍｓを用いて、精製抗体の結合能を解析した。キメラ抗体（ＨＣ０／ＬＣ０）の結合能を１００％として、ヒト化抗体（ＨＣｘ／ＬＣｘ）の結合能を百分率で評価した。
【0109】
次に、ＢｉａｃｏｒｅＴＭにより、精製抗体の結合能を解析した。
【0110】
その結果、１０種類の精製抗体はいずれも高い結合能を示すことが確認された（表６）。
【表6】
【0111】
以上述べた少なくとも一つの実施形態によれば、中和抗体を抗炎症剤のような医薬として使用することができる。
【0112】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【配列表】