特開 2022-125317 補助的免疫抑制処置を行わないＭＡＰＣ療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022125317

(43)【公開日】2022-08-26

(54)【発明の名称】補助的免疫抑制処置を行わないＭＡＰＣ療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/12 20150101AFI20220819BHJP

   A61K 35/50 20150101ALI20220819BHJP

   A61K 35/51 20150101ALI20220819BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220819BHJP

   A61K 35/14 20150101ALI20220819BHJP

   A61K 35/26 20150101ALI20220819BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20220819BHJP

   A61K 35/35 20150101ALI20220819BHJP

   A61K 35/407 20150101ALI20220819BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20220819BHJP

【ＦＩ】

A61K35/12

A61K35/50

A61K35/51

A61K35/28

A61K35/14 Z

A61K35/26

A61K35/30

A61K35/35

A61K35/407

A61K45/00

A61K38/19

A61P19/10

A61P19/08

A61P35/00

A61P19/02

A61P3/10

A61P17/02

A61P21/04

A61P21/00

A61P1/00

A61P9/00

A61P9/10

A61P9/10 101

A61P13/12

A61P9/04

A61P25/14

A61P25/16

A61P25/28

A61P31/00

A61P7/04

A61P27/02

A61P17/00

A61P17/14

A61P1/16

A61P1/18

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022110378

(22)【出願日】2022-07-08

(62)【分割の表示】P 2020093132の分割

【原出願日】2007-01-23

(31)【優先権主張番号】60/760,951

(32)【優先日】2006-01-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】508137464

【氏名又は名称】エービーティー ホールディング カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100107489

【弁理士】

【氏名又は名称】大塩 竹志

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ダブリュ． メイズ

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ジェイ． ディーンズ

(57)【要約】

【課題】補助的免疫抑制処置を行わないＭＡＰＣ療法の提供。
【解決手段】本発明は、補助的な免疫抑制処置の必要がないＭＡＰＣｓによる種々の損傷、障害、機能不全及び疾患などの治療に関する。本発明は、（ｉ）胚幹細胞、胚生殖細胞、及び生殖細胞ではなく；（ｉｉ）内胚葉性、外胚葉性及び中胚葉性の胚系統の少なくとも２種それぞれの少なくとも１種の細胞型に分化することができ；そして（ｉｉｉ）補助的な免疫抑制処置を必要とせずに、これによる処置に感受性の損傷、機能不全、障害又は疾患の治療に有効である細胞、を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

図面に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の参照
本出願は、以下に列挙する出願番号を有する出願のそれぞれ及び全ての優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：
本出願は、米国特許仮出願第６０／７６０，９５１号（２００６年１月２３日出願）の一部継続出願、ＰＣＴ／ＵＳ／４３８０４（２００６年１１月９日出願）の一部継続出願であり、この出願は、米国特許出願第１１／２６９，７３６号（２００５年１１月９日出願）の一部継続出願であり、この出願は、米国出願第１１／１５１，６８９号（２００５年６月１３日出願）の一部継続出願であり、この出願は、米国出願第１０／９６３，４４４号（２００４年１０月１１日出願）（放棄）の一部継続出願であり、この出願は、米国出願第１０／０４８，７５７号（２００２年２月１日出願）の一部継続出願であり、この出願は、ＰＣＴ／ＵＳ００／２１３８７（２０００年８月４日出願）の米国国内段階の出願であり、この出願は、２００１年２月１５日にＷＯ０１／１１０１１として英語で公開され、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）により米国仮出願第６０／１４７，３２４号（１９９９年８月５日出願）と第６０／１６４，６５０号（１９９９年１１月１０日出願）の優先権を主張し、かつ米国出願第１０／４６７，９６３号（２００３年８月１１日出願）の一部継続出願であり、この出願はＰＣＴ／ＵＳ０２／０４６５２（２００２年２月１４日出願）の米国国内段階の出願であり、この出願は、２００２年８月２２日にＷＯ０２／０６４７４８として英語で公開され、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）により米国仮出願第６０／２６８，７８６号（２００１年２月１４日出願）、第６０／２６９，０６２号（２００１年２月１５日出願）、第６０／３１０，６２５号（２００１年８月７日出願）、及び第６０／３４３，８３６号（２００１年１０月２５日出願）の優先権を主張する（これらすべての出願と刊行物は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本出願においてその優先権の完全な利益を主張する）。

【0002】

発明の分野
本発明の分野は、補助的な免疫抑制処置の必要がない多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣｓ）による損傷、障害、機能不全及び疾患の治療である。

【背景技術】

【0003】

細胞療法は、多くの極めて重大な健康問題を含む様々な病気の治療に有望である。例えば、脳疾患などの脳損傷は、米国及び世界中において主要な健康問題である。脳損傷の多くは、低酸素、例えば脳への血液供給の狭窄又は閉塞によって生じることが多い局所性低酸素、及び被験体の空気供給の結紮によって一般的に生じるびまん性低酸素などによって生じる。局所性低酸素は、例えば、皮質梗塞及び卒中に至ることがある。びまん性低酸素は、低酸素虚血性脳損傷（「ＨＩ損傷」）に至ることがある。皮質梗塞及び卒中、並びにＨＩ損傷は、重大な健康問題である。

【0004】

ＨＩ損傷及びそれに関連する転帰は、毎年生児出生のかなりの数に影響を及ぼす。小児における虚血性及び低酸素性脳損傷の発生及び影響を測定することは複雑であるが、どの評価でも罹患患者数は多い。ＨＩ損傷は、生児出生４０００当たり１と高い割合で発生している（Nelsonら、LancetNeurol.3:150-158 (2004)参照）。これらの乳児の大部分は、相当の認知及び運動障害をもって生きている（Barker, Ann Med. 31:Suppl 1:3-6 (1999)参照）。全ての原因による新生児脳症は、出生数１０００当たり１～６で起こっている
（例えば、米国産科婦人科学会のウェブサイト：www.acog.org.参照）。分娩時新生児仮
死のリスクは全出生数の２．５％と推定されている（Heinonenら、BJOG 109: 261-264 (2002)参照）。この多数の乳児のうち、より少数の乳児が運動及び認知障害を伴う脳損傷を生じるほど重大なＨＩ脳症を経験する。米国において１０００人に１～２人が脳性麻痺又は慢性の非進行性運動障害を患っている。これらの患者の約６％はＨＩ損傷に関連する出生時損傷によってその障害を受けている（例えば、ＮＩＮＤＳウェブサイトwww.ninds.nih.gov参照）。

【0005】

ＨＩ損傷を有する満期産児の現在の全体的な臨床転帰は芳しいものではない。ＨＩ損傷を患う全満期新生児のうち１０％は死亡し、３０％は永久に神経学的障害を有する（Volpe,NEUROLOGY OFTHE NEWBORN, 4^th Ed., W.B. Saunders, Philadelphia (2001)参照）。
最近公表されたフェーズＩ低体温法試験、満期産児における低酸素性－虚血性脳症のための低体温法の無作為化比較試験の対照群から得られた統計では、さらに高い死亡率であることがわかり、３７％の新生児が死亡し、２５％が神経学的障害を有した（Shankaranら
、N Engl JMed. 353: 1574-1584 (2005)参照）。

【0006】

支持療法以外に、ＨＩ損傷の治療は制限されている。全身低体温法が新生児ＨＩの治療におけるフェーズＩ多施設臨床試験において安全かつ有益であることが報告された。しかしながら、治療の有効性は、生後わずかの期間に限定されるようである（Shankaran(2005)前掲参照）。

【0007】

現在、治療の不在、罹患者数と、生活のためのケア及びリハビリを促進するために必要なコストも相まって、ＨＩ損傷は重大で満たされていない医療ニーズとなっている。同様に、脳組織、特に脳皮質組織に対するダメージ、例えば低酸素、梗塞から生じるものなど、並びに他の損傷及び／又は傷害、例えば、ＨＩ脳損傷、脳卒中及び／又は卒中を生じる及び／又はそれに関連する虚血及び／又は壊死などの虚血及び／又は壊死をもたらす損傷などを特徴とする種々の他の症状にも同じことがいえる。従って、これらの、関連する及び類似の損傷、病理及び疾患の治療のための改善された方法のニーズがある。

【0008】

この目的で幹細胞を使用することが最近注目されている。この分野でいくつかの有望な観察結果がある。最近、種々の幹細胞が単離され特性決定されている。これらは、非常に限定された分化能や培養で増殖する限定された能力を有するものから、明らかに無制限の分化能や培養で増殖する無制限の能力を有するものにわたる。前者は一般に入手が容易で、種々の成体組織から得られる。後者は生殖細胞や胚から得る必要があり、胚幹（ＥＳ）細胞、胚生殖（ＥＧ）細胞、及び生殖細胞と呼ばれる。胚幹（ＥＳ）細胞は無制限の自己再生能を有し、すべての種類の組織に分化することができる。ＥＳ細胞は胚盤胞の内細胞塊から得られる。胚生殖（ＥＧ）細胞は、卵着床後の胚の始原生殖細胞から得られる。成体組織から得られる幹細胞は免疫原性で、分化能力が限定されており、かつ培養で増幅する能力が限定されているため、価値が限定されている。ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及び生殖細胞はこれらの欠点が無いが、同種異系宿主で奇形腫を生成する顕著な傾向があり、医療での使用には当然懸念される。このため、その有利な広い分化能にもかかわらず、臨床用途での有用性には悲観的である。胚由来の幹細胞も疾患治療への使用を妨げ得る倫理的議論がある。

【0009】

ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及び生殖細胞の代わりを見出す試みは、成体組織由来の細胞に焦点を当てている。哺乳動物のほとんどの組織で成体幹細胞が同定されているが、その分化能は限定されており、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及び生殖細胞の分化能よりかなり狭い。実際、多くのそのような細胞は、１又は数種の分化細胞型を生じることができるが、他の多くは単一の胚系統に限定される。例えば、造血幹細胞は分化して造血系細胞のみを生成することができ、神経幹細胞は神経外胚葉起源の細胞のみに分化し、間葉幹細胞（ＭＳＣ）は間葉起源の細胞（中胚葉細胞型）に限定される。したがって、これらの幹細胞型は、本質的にその治療への利用可能性に制限がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Nelsonら、Lancet Neurol. 3:150-158 (2004)

【非特許文献2】Barker, Ann Med. 31: Suppl 1:3-6 (1999)

【非特許文献3】Heinonenら、BJOG 109: 261-264 (2002)

【非特許文献4】Volpe, NEUROLOGY OF THE NEWBORN, 4th Ed., W.B. Saunders,Philadelphia(2001)

【非特許文献5】Shankaranら、N Engl J Med. 353: 1574-1584 (2005)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

従って、損傷、機能不全、障害及び／又は疾患などの治療に使用することができる幹細胞であって、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及び生殖細胞の自己再生能と分化能とを有するが免疫原性ではなく；宿主に同種移植又は異種移植したとき奇形腫を生成せず；ＥＳ細胞、ＥＧ細胞及び生殖細胞に関連する他の安全性の問題を生じず；ＥＳ細胞、ＥＧ細胞及び生殖細胞の他の利点を保持し；容易に入手できる供給源（例えば、胎盤、臍帯、臍帯血、血液、及び骨髄）から単離し易く；長期間にわたり安全に保存でき；容易に得られ、かつ志願者、ドナー又は患者、及び承諾した他の者にリスクが無く；そして、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞及び生殖細胞を得る際及びこれらを扱う際に関連する技術的かつロジスティックな困難性を伴わない、幹細胞についてのニーズがある。

【0012】

本明細書中で多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣｓ）と称するある種の細胞が単離され、特徴付けられている（例えば、米国特許第７，０１５，０３７号参照、これは参照によりその全体を本明細書に組み込まれる）。（「ＭＡＰＣｓ」はまた「ＭＡＳＣｓ」とも呼ばれていた）。これらの細胞は、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及び生殖細胞の利点の多くを提供し、かつこれらの欠点の多くが無い。例えばＭＡＰＣｓは分化能を消失することなく無限に培養することができる。ＭＡＰＣｓは、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスで効率的な長期の生着、及び複数の発生系統に沿った分化を、奇形腫を生成する証拠（ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及び生殖細胞でしばしば見られる）なく示す（Reyes,M. and C.M. Verfaillie Ann NY Acad Sci. 938: 231-5 (2001)）。

【0013】

治療のための他の細胞の使用は、補助的な免疫抑制処置による治療が必要となる有害な免疫応答を引き起こし、この補助的な免疫抑制処置は、しばしば部分的にしか有効でなかったり、全く機能しないことがあった。従って、補助的免疫抑制処置の必要のない、損傷、機能不全、障害及び／又は疾患などを治療するための細胞及び細胞を用いた治療方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0014】

従って、いくつかの実施形態において、本発明は、（ｉ）胚幹細胞、胚生殖細胞、及び生殖細胞ではなく；（ｉｉ）内胚葉性、外胚葉性及び中胚葉性の胚系統の少なくとも２種それぞれの少なくとも１種の細胞型に分化することができ；そして（ｉｉｉ）補助的な免疫抑制処置を必要とせずに、これによる処置に感受性の損傷、機能不全、障害又は疾患の治療に有効である細胞、を提供する。

【0015】

この関連で、本発明のいくつかの実施形態において、前記細胞は、一次治療様式として単独で又は他の治療薬や治療様式とともに使用される。本発明のいくつかの実施形態において、前記細胞は単独の治療薬として使用される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、１又はそれ以上の他の治療薬と共に使用される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、１又はそれ以上の一次治療様式において、単独で又は１若しくはそれ以上の他の治療薬と共に使用される。本発明のいくつかの実施形態において、前記細胞は、１又はそれ以上の補助的治療様式において、単独で又は１若しくはそれ以上の他の治療薬と共に使用される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、１又はそれ以上の一次治療様式及び１又はそれ以上の補助的治療様式において、単独で又は１若しくはそれ以上の他の治療薬と共に使用される。

【0016】

いくつかの態様及び実施形態における本発明について、さらに以下の番号を付した段落で具体的に説明する。以下の段落は、本発明の例示であって限定するものではなく、本発明の完全な理解は、提供される本明細書の全文、全図面、要約書を含む本開示の全体を読み、本発明に関連する技術分野の当業者の視点からかつ当業者の知識及び経験に基づいて、例示的に本明細書に記載されたものから本発明を解釈することによってのみ達成されうる。

【0017】

番号を付した段落で記載される「上記又は下記のいずれかに記載の」という表現は、個々に他の番号を付した段落の任意の１以上の発明とそれぞれ組み合わせることが可能な段落の発明を意味する。これに関して、以下の段落は、そこに記載される発明のそのような全ての組合せに関して特許請求の範囲を明らかに支持するものである。特定の場合には、番号を付した段落の発明は、異なる番号を付した段落の発明との組合せから排除されているときに、この排除は、「番号（この番号は排除される段落を示す）以外の上記又は下記のいずれかに記載の」という表現で表される。

【0018】

１．被験体における損傷、機能不全、障害及び／又は疾患の治療方法であって、損傷、機能不全、障害及び／又は疾患に罹患する可能性があるか、罹患しているか又は罹患した被験体に、該損傷、機能不全、障害及び／又は疾患を治療するのに有効な経路と有効な量で、細胞（ＭＡＰＣｓ）を投与することを含み、該細胞は、胚幹細胞、胚生殖細胞又は生殖細胞ではなく；内胚葉性、外胚葉性及び中胚葉性の胚系統の少なくとも２種それぞれの少なくとも１種の細胞型に分化することができ；上記機能不全の治療に有効であり、該細胞（ＭＡＰＣｓ）と補助的に免疫抑制処置が施行されることのないものである、前記方法。

【0019】

２．細胞が被験体において免疫原性ではない、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0020】

３．細胞が、内胚葉性、外胚葉性、及び中胚葉性の胚系統それぞれの少なくとも１種の細胞型に分化することができる、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0021】

４．細胞がテロメラーゼを発現する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0022】

５．細胞がｏｃｔ－３／４について陽性である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0023】

６．細胞が、被験体への投与の前に培養で少なくとも１０～４０回の細胞倍加を受けている、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0024】

７．細胞が哺乳動物細胞である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0025】

８．細胞が、ヒト、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラット、又はマウス細胞である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0026】

９．細胞が、ヒト、ラット、又はマウス細胞である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0027】

１０．細胞がヒト細胞である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0028】

１１．細胞が、胎盤組織、臍帯組織、臍帯血、骨髄、血液、脾臓組織、胸腺組織、脊髄組織、脂肪組織、及び肝臓組織のいずれかから単離された細胞に由来する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0029】

１２．細胞が、胎盤組織、臍帯組織、臍帯血、骨髄、血液、及び脾臓組織のいずれかから単離された細胞に由来する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0030】

１３．細胞が、胎盤組織、臍帯組織、臍帯血、骨髄、又は血液のいずれかから単離された細胞に由来する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0031】

１４．細胞が、骨髄又は血液のいずれか１つ以上から単離された細胞に由来する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0032】

１５．細胞が被験体に対して同種異系である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0033】

１６．細胞が被験体に対して異種である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0034】

１７．細胞が被験体に対して自己由来である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0035】

１８．被験体が哺乳動物である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0036】

１９．被験体が、哺乳動物のペット動物、哺乳動物の家畜動物、哺乳動物の研究動物、又は非ヒト霊長類である、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0037】

２０．被験体がヒトである、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0038】

２１．細胞が、被験体の質量１ｋｇあたり１０^４～１０^８個の細胞を含む単回又は複数回用量で被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0039】

２２．細胞が、被験体の質量１ｋｇあたり１０^５～１０^７個の細胞を含む単回又は複数回用量で被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0040】

２３．細胞が、被験体の質量１ｋｇあたり５×１０^６～５×１０^７個の細胞を含む単回又は複数回用量で被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0041】

２４．細胞が、被験体の質量１ｋｇあたり２×１０^７～４×１０^７個の細胞を含む単回又は複数回用量で被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0042】

２５．細胞に加えて、１又はそれ以上の因子を被験体に投与するる、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0043】

２６．細胞に加えて、１又はそれ以上の増殖因子、分化因子、シグナル伝達因子、及び／又はホーミングを増加させる因子を被験体に投与する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0044】

２７．細胞に加えて、１又はそれ以上のサイトカインを被験体に投与する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0045】

２８．細胞が、該細胞の投与前、同時、又は後に施行される別の処置に対して補助的に被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0046】

２９．さらに１又はそれ以上の抗生剤を被験体に投与する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0047】

３０．さらに１又はそれ以上の抗菌剤を被験体に投与する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0048】

３１．さらに１又はそれ以上の抗ウイルス剤を被験体に投与する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0049】

３２．抗生剤及び／又は抗菌剤及び／又は抗ウイルス剤の２又はそれ以上の任意の組合せをさらに被験体に投与する、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0050】

３３．細胞が、１又はそれ以上の他の医薬活性物質を含む製剤で投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0051】

３４．細胞が、１つ又はそれ以上の抗生物質を含む製剤で投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0052】

３５．細胞が、１つ又はそれ以上の抗菌剤を含む製剤で投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0053】

３６．細胞が、１つ又はそれ以上の抗ウイルス剤を含む製剤で投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0054】

３７．細胞が、非経口経路で被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0055】

３８．細胞が、次の非経口経路、すなわち静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内、くも膜下内、骨内、関節内、滑液包内、皮内（intracutaneous）、皮内（intradermal）、皮下、
及び筋肉内注射のいずれか１以上により被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0056】

３９．細胞が、次の非経口経路、すなわち静脈内、動脈内、皮内（intracutaneous）、皮内（intradermal）、皮下、及び筋肉内注射のいずれか１以上により投与される、上記
又は下記のいずれかに記載の方法。

【0057】

４０．細胞が、次の非経口経路、すなわち静脈内、動脈内、皮内（intracutaneous）、皮下、及び筋肉内注射のいずれか１以上により投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0058】

４１．細胞が、注射器により皮下注射針を介して被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0059】

４２．細胞が、カテーテルを介して被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0060】

４３．細胞が、外科的移植により投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0061】

４４．細胞が、関節鏡視下の処置を用いた移植法により被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0062】

４５．細胞が、定位注入により被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0063】

４６．細胞が、支持体内又は支持体上で存在させて被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0064】

４７．細胞が、封入形態で被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0065】

４８．細胞が、次の経路、すなわち経口、直腸、経皮、眼内、鼻内、及び肺内のいずれか１以上による投与に適するように製剤化される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0066】

４９．細胞が、単回用量で被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0067】

５０．細胞が、２回またはそれ以上の用量系列で連続して被験体に投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0068】

５１．細胞が、単回用量で、２回用量で、または３回以上の用量で投与され、その用量は同じか又は異なり、等しい間隔又は等しくない間隔で投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0069】

５２．細胞が、１日未満～１週間、１週間～１ヶ月、１ヶ月～１年、１年～２年、又は２年より長い期間にわたって投与される、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【0070】

５３．損傷、機能不全、障害及び／又は疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨折、骨髄炎、骨壊死、軟骨形成不全、骨形成不全症、遺伝性多発性外骨症、多発性骨端異形成症、マルファン症候群、ムコ多糖症、神経線維腫症、側弯症、二分脊椎、半椎、癒合椎骨、四肢異常、腫瘍損傷組織の再建、加齢に伴う疾患若しくは損傷、スポーツに伴う損傷、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、強直性脊椎炎、変形性関節症、再建手術、整形手術、２型糖尿病、創傷、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー症、骨格筋ミオパシー、骨格筋損傷、食道などの胃腸系の発育異常、閉鎖、腸閉塞、腸重積症、血管損傷、アテローム性動脈硬化、動脈瘤、糖尿病性ニューロパシー、遠位曲細尿管若しくは傍糸球体組織の緻密斑、心筋梗塞、うっ血性心不全、弁膜症及び置換弁との併用、先天性心疾患、心筋症、心内膜炎、脊髄損傷、神経変性障害（ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症及びアルツハイマー病など）、中枢神経系における感染性疾患、卒中、筋萎縮性側索硬化症、脳腫瘍、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、先天性神経変性障害、貯蔵障害（例えば、大脳白質萎縮症（球様細胞白質萎縮症、カナバン病）、フコシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ニーマンピック病、サンフィリッポ症候群、ウォルマン病、及びテイ・サックス病など）、ＣＮＳ出血、ＣＮＳ外傷、末梢神経系障害（例えば脊髄損傷又は脊髄空洞症など）、網膜障害（例えば網膜剥離、黄斑変性症、糖尿病網膜症、他の変性網膜障害など）、皮膚障害、脱毛症、皮膚異常、火傷、白皮症、臓器疾患、先天性肝臓疾患（例えば高ビリルビン障害、例としてクリーグラー・ナジャー症候群、アンモニア障害、例えば尿素サイクルの先天異常、オルニチンデカルボキシラーゼ欠乏症、シトルリン血症、アルギノコハク酸尿症、アミノ酸及び有機酸の先天異常、例えばフェニルケトン尿症、遺伝性チロシン血症、α１－アンチトリプシン欠乏症、凝固障害、例えば第ＩＸ因子欠乏症など）、胆道障害（例えば胆汁性肝硬変及び胆道閉鎖症など）、膵臓障害（例えば膵臓閉鎖症、膵臓炎症など）、糖尿病消化管閉塞、炎症性腸疾患、腸梗塞、並びに腸切除の任意の１つ又は組合せである、上記又は下記のいずれかに記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0071】

【図1】実施例１に記載のように、本明細書で記載した実施例のいくつかにおいて使用した一般的な実験プロトコールを示すフローチャートである。

【図2】実施例２に記載のように、同系及び同種異系ＭＡＰＣ移植物が新生ＨＩラットにおける行動の回復を促進することを示す一連のグラフである。同系及び同種異系ＭＡＰＣ移植物を投与した動物において、運動及び神経機能についての行動試験を７日目及び１４日目に実施した。動物は、対照と比較して、まず移植後７日目に行動の欠陥が少ない傾向を示し、続いて移植後１４日目までに運動異常の有意な低減を示した。星印は、陰性対照（ビヒクル注入）に対するｐ＜０．０５での統計学的有意性を示す。

【図3】実施例３に記載のように、ＭＡＰＣ移植片がＨＩ損傷動物におけるＣＡ３ニューロン細胞欠損を低減することを示すグラフである。このグラフは、海馬切片の組織学的分析により観察された生存細胞を示す。動物をＭＡＰＣｓの移植後１４日目に犠牲にした。脳切片を調製し、ニッスル染色して、ＭＡＰＣ及びビヒクル処置した動物の海馬におけるニューロン生存能について調べた。各切片の損傷及び非損傷の対側海馬領域の両方における視野当たりの生存細胞を計数し、これらの数を比較した。非損傷海馬細胞の数を１００％とした。データは、ＭＡＰＣ移植によるＣＡ３領域におけるニューロンの統計学的に有意な保護を実証している（ＡＮＯＶＡ Ｆ値は３５．３３、ｄｆ＝２，１９及びｐ＜０．０００１；Ｆｉｓｈｅｒ事後検定はｐ＜０．０００１）。

【図4】実施例７に記載のように、異種ＭＡＰＣ移植物は、外科的に誘導された虚血性卒中後の成体ラットにおける行動の回復を促進することを示す一連のグラフである。卒中誘導後１４日目及び２１日目（頭蓋内移植後７日目及び１４日目）に運動及び神経機能のための行動試験を実施した。動物には、１００，０００個、２００，０００個及び４００，０００個の異種ＭＡＰＣ細胞、又はビヒクルのみの対照としてＰＢＳを投与した。星印は、対照群とＭＡＰＣ実験群との有意差を示す（ＡＮＯＶＡの反復測定、ｐ＜０．０００１；ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ事後ｔ－検定、ｐ’ｓ＜０．０００１）。

【図5】異種及び同種異系ＭＡＰＣ移植物が、虚血性卒中後のラットにおいて持続的かつ統計学的に有意な運動の回復を促進することを示すグラフである。実施例１０に記載のように、１４日目及びその後５６日目まで１４日毎に運動機能についての行動試験を実施した。星印は、陰性対照（非生存照射ＭＡＰＣｓ）に対するｐ＜０．０００１での統計学的有意性を示す。

【図6】異種及び同種異系ＭＡＰＣ移植物が、虚血性卒中後のラットにおいて持続的かつ統計学的に有意な神経の回復を促進することを示すグラフである。実施例１０に記載のように、１４日目及びその後５６日目まで１４日毎に神経機能についての行動試験を実施した。星印は、陰性対照（非生存照射ＭＡＰＣｓ）に対するｐ＜０．０００１での統計学的有意性を示す。

【図7】実施例１２に記載のように、虚血性卒中を有するラットへの異種ＭＡＰＣｓの投与による、運動機能における用量依存的改善を示すグラフである。１４日目及びその後５６日目まで１４日毎に運動機能についての行動試験を実施した。星印は、陰性対照（非生存照射ＭＡＰＣｓ）に対するｐ＜０．０１での統計学的有意性を示す。

【図8】実施例１２に記載のように、異種ＭＡＰＣｓで処置した虚血性卒中ラットの神経機能における用量依存的改善を示すグラフである。１４日目及びその後５６日目まで１４日毎に神経機能についてのＢｅｄｅｒｓｏｎ試験を実施した。星印は、陰性対照（非生存照射ＭＡＰＣｓ）に対するｐ＜０．０１での統計学的有意性を示す。

【図9】実施例１４に記載のように、異種ＭＡＰＣｓで処置した虚血性卒中ラットの運動機能における用量依存的改善を示すグラフである。運動機能を判定するためのＥＢＳＴを、静注後１週間において、続いて長期効力を実証するために８週目まで毎週１回実施した。遅延１日は、虚血性損傷の誘導後１日目に細胞を投与した群を示し、遅延２日は、損傷後２日目に細胞を投与した群であり、遅延７日は、虚血性損傷後７日目に細胞を投与した群である。星印は、陰性対照（非生存照射ＭＡＰＣｓを卒中後７日目に送達した）に対するｐ＜０．００１での統計学的有意性を示す。

【図10】実施例１４に記載のように、異種ＭＡＰＣｓで処置した虚血性卒中ラットの神経機能における用量依存的改善を示すグラフである。神経機能を判定するためのＢｅｄｅｒｓｏｎ試験を、静注後１週間において、続いて長期効力を実証するために８週目まで毎週１回実施した。遅延１日は、虚血性損傷の誘導後１日目に細胞を投与した群を示し、遅延２日は、虚血性損傷後２日目に細胞を投与した群を示し、遅延７日は、虚血性損傷後７日目に細胞を投与した群を示す。星印は、陰性対照（非生存照射ＭＡＰＣｓを卒中後７日目に送達した）に対するｐ＜０．００１での統計学的有意性を示す。

【図11】実施例１６に記載のように、虚血性卒中ラットにおける内因性ニューロン細胞損失がＭＡＰＣｓの静注により経時的に低減することを示すグラフ及び写真である。ＭＡＰＣ注入の開始後５６日目に動物を犠牲にした。脳切片を調製し、ニューロンの生存についてニッスル染色した。生存は移植した動物の全てにおいて判定し、ニューロン生存を損傷後種々の時点でＭＡＰＣｓを投与した動物において比較した。損傷の各部位、及び同じ切片の対側域における非損傷部位について、視野当たりの生存細胞を計数し、この結果を比較した。非損傷対側部位の数を１００％とした。図１１に示すグラフに示されるように、このデータは、ＭＡＰＣ移植後の半影領域におけるニューロンの統計学的に有意な保護を示している。星印は、他の群に対するｐ＜０．０５での統計学的有意性を示している。グラフの上に挿入した写真は、損傷部位の代表的な断面を示している。

【発明を実施するための形態】

【0072】

用語の説明
通常、本明細書で使用する用語及び表現は、当該分野で確立されている意味に従うものとする。しかし、不明確となる可能性を避けるため、本明細書で使用するいくつかの用語及び表現の意味を以下に記載する。

【0073】

「Ａ」又は「ａ」は、１又はそれ以上で、すなわち、少なくとも１を指す。

【0074】

「補助的」は、共同で、一緒に、加えて、組合せてなどを意味する。

【0075】

「脳梗塞（cerebralinfarct, cerebral infarction）」は、大脳への又はそれを介した血流の閉塞によって引き起こされる大脳の虚血状態を意味する。脳梗塞は典型的に、閉塞に起因する血流の損失によって酸素が枯渇した組織の壊死に至る。脳梗塞は永久的な局所性神経学的欠損を生じることも多い。

【0076】

「脳血管障害」は、卒中と同じ意味である。

【0077】

「脳虚血」とは、大脳への血流が正常な神経機能の維持に必要な最小値未満に低下した場合に起こる状態を意味する。脳虚血は、頸動脈狭窄、脳底動脈狭窄、椎骨動脈狭窄及び脳閉塞症によって生じることが多い。また、モヤモヤ病及び高安動脈炎により生じることもある。

【0078】

「共投与する」は、２またはそれ以上の作用物質の同時又は連続的投与を含むことができる。

【0079】

「皮質」とは、器官の外側部分又は器官の一部などを指す。例えば、大脳の外側部分は大脳皮質と呼ばれる。ヒトの大脳皮質は２～４ｍｍ（０．０８～０．１６インチ）の厚さであり、多くの複雑な脳機能において中心的な役割を果たしている。ヒト大脳皮質の表面はひだ状であり、皮質表面の３分の２を超える部分が、「溝（sulci)」と呼ばれるこのひだの溝に存在する。大脳皮質の系統学的に古い部分は海馬と呼ばれる。より近年になって進化した部分は新皮質と呼ばれる。
「皮質梗塞」とは、脳の皮質への血液供給の損失に伴う梗塞、典型的には大脳への血液供給の損失に伴う梗塞を指す。皮質梗塞は脳梗塞とほぼ同じ意味を有する。

【0080】

「サイトカイン」は、ＭＡＰＣｓ、又は他の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化した細胞の、ホーミングなどの細胞挙動を誘導又は増強する細胞因子を指す。サイトカインはまた、そのような細胞が分裂するように刺激し得る。

【0081】

「有害な」とは害があることを意味する。例えば、本明細書において「有害な免疫応答」とは、害がある免疫応答、例えば欠如しているか若しくは弱過ぎる免疫応答、強すぎる免疫応答、及び／又は標的を誤った免疫応答を意味する。また有害な免疫応答には、医療処置を妨害する免疫応答（正常な免疫応答を含む）がある。例としては、移植物及び移植片の拒絶、移植片対宿主病を引き起こす移植物及び移植片における免疫担当細胞の応答などがある。

【0082】

「分化因子」とは、系統の決定を誘導する細胞因子（例えば増殖因子）を指す。

【0083】

「機能不全」は、本明細書において、障害、疾患、又は正常なプロセスによる有害作用を意味する。例えば、皮質梗塞及び酸素不足（低酸素症）は、虚血性損傷などの又はそれを導く機能不全を引き起こす可能性がある。他の機能不全には、例えば、通常は免疫抑制処置によって治療する必要のある、移植や移植片の拒絶に関与する免疫応答、及び移植片対宿主病を引き起こす移植や移植片における免疫担当細胞の応答などがある。

【0084】

「ＥＣ細胞」は胚癌細胞を指す。

【0085】

「有効量」、「有効用量」などは一般に、所望の局所的又は全身的効果を与える量を意味する。例えば有効量は、有益な又は所望の臨床結果を実現するのに十分な量である。有効量は、全てを単回の投与で一度に提供することもできるし、又は数回の投与で有効量を提供する分割量で提供することもできる。例えば、ＭＡＰＣｓの有効量は単回又は複数回で投与することができ、あらかじめ選択された任意の量の細胞を含むことができる。有効量とみなされる量の正確な決定は、各被験体に対する個々の要因（その大きさ、年齢、損傷を含む）、及び／又は治療対象の疾患又は損傷、並びに損傷が発生してから又は疾患が始まってからの時間を基礎とすることができる。当業者は所与の被験体についての有効量を、当該分野で慣用的であるこれらの検討事項に基づいて決定できるであろう。すなわち、例えば当業者（例えば医師）は、本明細書に開示の及び当該分野におけるＭＡＰＣｓの既知の性質に基づいて、前記要因を考慮しながら、所与の被験体のＭＡＰＣｓの有効量を決定できるであろう。本明細書で使用する「有効用量」は、「有効量」と同じことを意味する。

【0086】

一般的には、本明細書における用語「有効な」とは、ある点では改善された予後及び／又は良好な患者の状態でありうる、所望の結果を達成するために十分であることを意味する。これは、損傷、機能不全、障害又は疾患の改善又は治癒を意味することもある。脳の損傷、機能不全、障害又は疾患の場合には、例えば、有効用量は、所望の神経学的結果、例えばその「有効」量による治療がない場合に生じうる細胞損傷を低減すること、さらなる細胞損傷を途絶えさせること、及び／又は細胞損傷を逆転させることなど、を達成するものである。本明細書において「有効」とはまた、臨床結果、例えば神経機能のさらなる低下がないこと及び／又は神経機能の改善などによって定義することができる。これに関して神経機能の改善は、担当者によりこの目的のために使用される種々の試験及び尺度の任意のものによって判定することができる。

【0087】

他の損傷、機能不全、障害及び疾患に関する有効用量及び量についてもほぼ同じことがいえる。

【0088】

「ＥＧ細胞」は胚生殖細胞を指す。

【0089】

「生着」は、目的の既存の組織にｉｎ ｖｉｖｏで細胞を接触及び組み込むプロセスを指す。

【0090】

「富化集団」は、開始集団中の他の細胞又は成分と比較したＭＡＰＣｓの数の相対的増加、例えば培養物（例えば初代培養物など）又はｉｎ ｖｉｖｏにおける１以上の非ＭＡＰＣ細胞型と比較したＭＡＰＣｓの数の増加を意味する。

【0091】

「ＥＳ細胞」は胚幹細胞を指す。

【0092】

「増大（増幅）」は、分化を伴わない細胞（１又は複数）の増殖を指す。

【0093】

「ＧＶＨＤ」は移植片対宿主病を指し、これは、移植片の免疫担当細胞により非自己として認識されるとき、主に免疫不全宿主で起こるプロセスを意味する。

【0094】

「ＨＶＧ」は、宿主対移植片反応を指し、これは、宿主が移植片を拒絶するときに起こるプロセスを意味する。典型的には、ＨＶＧは、移植片が宿主の免疫担当細胞により外来（非自己）として認識されるときに誘発される。

【0095】

「低酸素」とは酸素不足を意味する。神経学的には、これは、血液の十分な供給にもかかわらず生じる可能性のある脳への酸素の低減を意味する。低酸素は、息詰まり、絞殺、窒息、頭部外傷、一酸化炭素中毒、心停止から、一般的な麻酔の合併症として、そして血流閉鎖又は閉塞から生じうる。脳低酸素は、細胞損傷及び細胞死を生じる事象のカスケードに導く。脳低酸素／虚血は、心血管ポンプ機能系又は呼吸系に影響を及ぼす広範囲の疾患により生じることがある。脳低酸素／虚血は、４つのタイプ、すなわち局所性脳虚血、全脳虚血、びまん性脳低酸素、及び脳梗塞に分類される。

【0096】

局所性脳虚血（ＦＣＩ）は、罹患領域の血流を低減する脳内の血餅により生じる。ＦＣＩの重症度は多様であり、感受性ニューロンに不可逆性の損傷を生じることがある。全脳虚血（ＧＣＩ）は、脳への血流を遮断する心室細動又は心停止により生じる。５～１０分を超えて持続するＧＣＩからの回復は問題がある。より長時間のＧＣＩは一般的に致命的である。びまん性脳低酸素（ＤＣＨ）は、血液酸素化の欠損により生じ、典型的には軽度から中程度の低酸素血症に至る。純粋なＤＣＨは脳機能不全を引き起こすが、不可逆性の脳損傷には至らない。これは、肺疾患、高山病又は重症な貧血によって生じうる。脳梗塞（ＣＩ）は、壊死を引き起こす脳領域における局所性血管閉塞から生じる。

【0097】

「免疫抑制」とは、被験体における免疫応答、例えば外来抗原（同種異系又は異種の細胞又は組織）に対する免疫応答などを防止、抑制及び／又は逆転することを指す。いくつかの事例では、例えば、細胞又は器官の移植体を用いた被験体の治療の所望の臨床結果に対して有害となりうる被験体の免疫応答を抑制するために免疫抑制処置が必要である。

【0098】

「梗塞（infarct）」、「梗塞（infarction）」とは、通常血栓又は塞栓により引き起こされる虚血（血流の閉塞）から生じる組織における壊死の領域を指す。これはまた、通常血栓又は塞栓により引き起こされる、虚血を生じる血流の閉塞を指す。

【0099】

「虚血」とは、典型的にはその閉塞血管が酸素を供給する組織に対する機能不全又は損傷を生じる血管閉塞による、血液の供給の制限を指す。虚血はまた、血管の収縮又は閉塞により生じる、身体の一部への不十分な血流を指す。脳組織における虚血は、タンパク質分解酵素、活性酸素種、及び脳組織に損傷を与えて最終的に死滅させうる他の物質を放出するカスケード（虚血性カスケードとも称する）を開始する。

【0100】

「単離された」とは、１又はそれ以上の細胞と会合していないか、あるいはｉｎ ｖｉｖｏ又は一次培養で細胞（１又は複数）と会合している１又はそれ以上の細胞成分と会合していない細胞（１又は複数）を指す。

【0101】

「ＭＡＰＣ」は、「多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell）」の
頭文字を取ったものである。これは、２つ以上の胚葉、例えば３種すべての胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の細胞系統を生じることができる非ＥＳ細胞、非ＥＧ細胞、非生殖細胞を指す。ＭＡＰＣｓはまたテロメラーゼ活性を有する。これらはｏｃｔ－３／４（例えばヒトｏｃｔ－３／４）について陽性であり得る。ＭＡＰＣｓはまた、ｒｅｘ－１、ｒｏｘ－１、ｓｏｘ－２、ＳＳＥＡ－４、及び／又はｎａｎｏｇの１以上を発現し得る。ＭＡＰＣ中の用語「成体」は限定的ではない。これは、単に、これらの細胞がＥＳ細胞、ＥＧ細胞、又は生殖細胞ではないことを意味するものである。本明細書で使用するように、典型的には、ＭＡＰＣは単数であり、ＭＡＰＣｓは複数である。ＭＡＰＣｓはまた、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣｓ）とも呼ばれる。例えば米国特許第７，０１５，０３７号（これは、ＭＡＰＣｓ／ＭＡＳＣｓの単離及び増殖について開示された方法として、参照により本明細書に組み込まれる。この方法は、本発明において有用な方法の例及び例示にすぎず、限定するものではない）を参照されたい。

【0102】

「ＭＡＳＣ」、ＭＡＰＣを参照されたい。

【0103】

「ＭＮＣ」は単核細胞を指す。

【0104】

「様式（modality）」は、種類、手法、手段、又は方法、例えば治療様式は、治療法の種類を意味する。

【0105】

「ＭＳＣ」は、間葉性幹細胞の頭文字を取ったものである。

【0106】

ＭＡＰＣｓについて「多能性」は、分化により２種以上の胚葉、例えば３種すべての胚葉（すなわち内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の細胞系統を生じる能力を指す。

【0107】

「存続・持続（persistence）」は、細胞が拒絶に抵抗し、ｉｎ ｖｉｖｏで長期的（
例えば、数日、数週間、数ヶ月、若しくは数年）に数を維持する及び／又は増加する能力を指す。

【0108】

「一次培養物」とは、継代培養前の、生物由来の材料の組織片から直接得られる細胞集団を指す。典型的に、一次培養物は、（ａ）生物からの組織の単離、（ｂ）組織の解剖及び／又は解離、並びに（Ｃ）組織由来の細胞を、培地に懸濁するか又はより典型的には培養容器の表面に付着させて増殖を開始させること、によって確立する。一次培養物は、組織片の細胞の継代培養、例えば細胞を分裂させて希釈し、それを新鮮な培地及び／又は新鮮な培養容器に再度植えることなどを含むものではなく、それに先立つものである。典型的には、付着した細胞の一次培養物は、細胞を組織の断片から適当な基板に移して付着させるか、又は組織を機械的若しくは酵素的に解離させて細胞懸濁液を得て、続いてその一部が基板に付着するようにすることによって得られる。

【0109】

多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣｓ）で使用される「前駆」は、これらの細胞が他の細胞（例えばさらに分化した細胞）を生じることができることを指す。この用語は限定的ではなく、これらの細胞を特定の系統に限定するものではない。

【0110】

「自己再生」とは、元々の細胞と同一の分化能を有する娘幹細胞を産生（複製）する能力を指す。この関連で使用される同様の用語は「増殖」である。

【0111】

「卒中」は、急性の神経損傷である。これは、脳の血液かん流を阻害（梗塞）し、典型的には中断する、脳への血液供給の途絶によって、８０％の症例（虚血性卒中と称する）で生じる。この中断は、動脈血流における途絶によって生じるうるが、静脈血流における途絶によって生じることもある。かん流が阻害された脳の部分は、十分な酸素を受容することができず、細胞損傷及び死を生じる。この結果が卒中である。卒中はまた、一過性の神経学的障害、持続的な障害又は死に至ることがある。障害は、局所性又は全身性である。虚血性卒中は一般的に、血栓性脳卒中、塞栓性脳卒中、全身血流低下（分水嶺卒中若しくは境界域卒中）、又は静脈血栓症に分類される。血栓性卒中は、通常はアテローム斑を含む、血栓による動脈の狭窄によって生じる。塞栓性卒中は、塞栓、最も高頻度には血餅による動脈閉塞から生じる。

【0112】

「被験体」は、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒトである。哺乳動物は、特に限定されないが、ヒト、家畜、競技動物、及びペットなどを含む。本発明の方法により治療が必要な被験体は、障害、機能不全、又は疾患（例えば、皮質梗塞、及び／又は低酸素虚血性脳損傷）、或いはこれらの又はその治療の副作用を患っており、一次治療又は補助的治療としてのＭＡＰＣｓの投与から利益を受けることができる被験体を含む。

【0113】

本明細書で使用する「移植」は、被験体に細胞、組織、又は臓器を導入することを意味する。移植物は、被験体から、培養物から、又は非被験体供給源から得ることができる。

【0114】

「治療する」、「治療している」、「治療」などは、患者の、特に障害又は疾患の対処に関して、管理及びケアすることに関し、例えば限定されるものではないが、不全、機能不全、障害若しくは疾患、又は有害作用を有する他のプロセスを、予防、改善、阻害、及び／又は治癒する（例えば損傷、機能不全、障害又は疾患に対処する、これを予防する、改善する、阻害する及び／又は治癒するなど）ことを含む。

【0115】

「療法」は、治療と同義である。

【0116】

本発明の種々の実施形態は、補助的な免疫抑制処置を行うことなく、損傷、機能不全、障害又は疾患を防止する、予防する、治療する、改善する、緩和する、低減する、最小限にする、排除する及び／又は治癒するためにＭＡＰＣｓを用いる方法及び関連する発明を提供する。

【0117】

本発明の種々の実施形態は、補助的な免疫抑制処置を行うことなく、損傷、機能不全、障害及び／又は疾患を処置する、例えば防止する、予防する、対処する、改善する、緩和する、低減する、最小限にする、排除する及び／又は治癒するなどのために処置するためにＭＡＰＣｓを用いる方法を提供する。これは、本明細書においては脳の損傷、機能不全、障害及び／又は疾患を参照して説明されるが、本発明はこれらの例示的な説明に限定されるものではない。むしろ、本明細書に開示する、補助的な免疫抑制処置の必要のない、ＭＡＰＣｓによる損傷、機能不全、障害及び／又は疾患を治療するための方法は、ＭＡＰＣｓによる細胞療法が有効であると考えられる前述の任意のものを含む非常に多様な損傷、機能不全、障害及び／又は疾患を治療するために有効である。

【0118】

したがって、いくつかの本発明の実施形態において、本発明は、（ｉ）胚幹細胞、胚生殖細胞、及び生殖細胞ではなく；（ｉｉ）内胚葉性、外胚葉性及び中胚葉性の胚系統の少なくとも２種それぞれの少なくとも１種の細胞型に分化することができ；そして（ｉｉｉ）補助的な免疫抑制処置を必要とせずに、損傷、機能不全、障害及び／又は疾患の治療に有効である細胞、を提供する。

【0119】

この関連で、本発明のいくつかの実施形態において、前記細胞は、一次治療様式として単独で又は他の治療薬や治療様式とともに使用される。本発明のいくつかの実施形態において、前記細胞は単独の治療薬として又は他の治療薬と一緒に使用される。本発明のいくつかの実施形態において、前記細胞は、１又はそれ以上の一次治療様式及び１又はそれ以上の補助的治療様式の両方において、単独で、又は他の治療薬若しくは治療様式と共に使用される。

【0120】

実施形態において、本明細書において記載されるように補助的免疫抑制処置を行わずにＭＡＰＣｓの投与により治療することができる損傷、機能不全、障害及び疾患としては、限定されるものではないが、骨粗鬆症、パジェット病、骨折、骨髄炎、骨壊死、軟骨形成不全、骨形成不全症、遺伝性多発性外骨症、多発性骨端異形成症、マルファン症候群、ムコ多糖症、神経線維腫症、側弯症、二分脊椎、半椎、癒合椎骨、四肢異常、腫瘍損傷組織の再建、加齢に伴う疾患若しくは損傷、スポーツに伴う損傷、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、強直性脊椎炎、変形性関節症、再建手術、整形手術、２型糖尿病、創傷、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー症、骨格筋ミオパシー、骨格筋損傷、食道などの胃腸系の発育異常、閉鎖、腸閉塞、腸重積症、血管損傷、アテローム性動脈硬化、動脈瘤、糖尿病性ニューロパシー、遠位曲細尿管若しくは傍糸球体組織の緻密斑、心筋梗塞、うっ血性心不全、弁膜症及び置換弁との併用、先天性心疾患、心筋症、心内膜炎、脊髄損傷、神経変性障害（ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症及びアルツハイマー病など）、中枢神経系における感染性疾患、卒中、筋萎縮性側索硬化症、脳腫瘍、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、先天性神経変性障害、貯蔵障害（例えば、大脳白質萎縮症（球様細胞白質萎縮症、カナバン病）、フコシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ニーマンピック病、サンフィリッポ症候群、ウォルマン病、及びテイ・サックス病など）、ＣＮＳ出血、ＣＮＳ外傷、末梢神経系障害（例えば脊髄損傷又は脊髄空洞症など）、網膜障害（例えば網膜剥離、黄斑変性症、糖尿病網膜症、他の変性網膜障害など）、皮膚障害、脱毛症、皮膚異常、火傷、白皮症、臓器疾患、先天性肝臓疾患（例えば高ビリルビン障害、例としてクリーグラー・ナジャー症候群、アンモニア障害、例えば尿素サイクルの先天異常、オルニチンデカルボキシラーゼ欠乏症、シトルリン血症、アルギノコハク酸尿症、アミノ酸及び有機酸の先天異常、例えばフェニルケトン尿症、遺伝性チロシン血症、α１－アンチトリプシン欠乏症、凝固障害、例えば第ＩＸ因子欠乏症など）、胆道障害（例えば胆汁性肝硬変及び胆道閉鎖症など）、膵臓障害（例えば膵臓閉鎖症、膵臓炎症など）、糖尿病消化管閉塞、炎症性腸疾患、腸梗塞、並びに腸切除が挙げられる。

【0121】

ＭＡＰＣｓ
本発明において細胞は本明細書においてさらに詳細に説明され、本明細書において一般に「多能性成体前駆細胞」、及び頭文字を取って「ＭＡＰＣ」（しばしば複数で「ＭＡＰＣｓ」が用いられる）と称される。これらの細胞はＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及び生殖細胞ではなく、かつ３種の原始胚葉系統（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の少なくとも２種の細胞型、例えば３種すべての原始系統の細胞に、分化する能力を有すると理解される。

【0122】

ＭＡＰＣｓは、例えば特に以下の細胞を生成することができる：内臓板中胚葉細胞、筋肉細胞、骨細胞、軟骨細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、内皮細胞、毛髪形成細胞、歯形成細胞、臓側中胚葉細胞、造血細胞、間質細胞、骨髄間質細胞、神経細胞、神経外胚葉細胞、上皮細胞、眼細胞、膵細胞、及び肝細胞様細胞、並びに同じ系統の細胞など。例えば、ＭＡＰＣｓにより形成される細胞には、骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞（skeletal musclecell）、骨格筋細胞（skeletal myocyte）、胆管上皮細胞、膵腺房細胞
、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、心筋細胞（cardiac muscle cell）、心筋細胞（cardiomyocyte）、骨細胞、血管形成細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン（セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、ドパミン作動性ニューロンを含む）、グリア細胞、小グリア細胞、膵上皮細胞、消化管上皮細胞、肝上皮細胞、皮膚上皮細胞、腎（kidney）上皮細胞、腎（renal）上皮細胞、膵島細胞、繊維芽細胞、肝細胞、及び上記と同じ系統の他の細胞などが
ある。

【0123】

ＭＡＰＣｓは、自己再生に及び複製老化を回避するために必要なテロメラーゼ活性を有する。一般にこれらはまたｏｃｔ－３／４を発現する。ｏｃｔ－３／４（ヒトのｏｃｔ－３Ａ）は、本来ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及び生殖細胞に特異的である。これは、広い分化能力を有する未分化細胞のマーカーであると考えられている。ｏｃｔ－３／４はまた一般に、未分化状態で細胞を維持するのに役割を有すると考えられている。ｏｃｔ－４（ヒトのｏｃｔ－３）は、原腸形成前の胚、初期卵割段階の胚、胚盤胞の内部細胞塊の細胞、及び胚性癌腫（「ＥＣ」）細胞で発現される転写因子であり（Nichols,J. et al. (1998) Cell 95: 379-91）、細胞が誘導されて分化するときにダウンレギュレートされる。ｏｃｔ
－４遺伝子（ヒトのｏｃｔ－３）はヒトで少なくとも２つのスプライス変異体（ｏｃｔ－３Ａとｏｃｔ－３Ｂ）に転写される。ｏｃｔ－３Ｂスプライス変異体は多くの分化細胞でみられるが、ｏｃｔ－３Ａスプライス変異体（以前はｏｃｔ－３／４と呼ばれた）は未分化胚幹細胞に特異的であると報告された。Shimozakiet al. (2003) Development 130: 2505-12を参照されたい。ｏｃｔ－３／４の発現は、胚形成と分化の初期段階を決定する上で重要な役割を果たす。ｏｃｔ－３／４はｒｏｘ－１と一緒に、Ｚｎ－フィンガータンパク質ｒｅｘ－１（これもＥＳ細胞を未分化状態に維持するのに必要である）の転写活性化を引き起こす（Rosfjord,E.and Rizzino, A. (1997) Biochem．Biophys．Res．Com．203: 1795-802;Ben-Shushan, E. etal. (1998) Mol. Cell Biol. 18: 1866-78）。

【0124】

ＭＡＰＣｓはまた、他のマーカーを発現することがある。これらには、ｒｅｘ－１、ｒｏｘ－１、及びｓｏｘ－２がある。ｒｅｘ－１はｏｃｔ－３／４により制御され、これはｒｅｘ－１の下流の発現を活性化する。ｒｏｘ－１とｓｏｘ－２は非ＥＳ細胞で発現される。

【0125】

本発明のいくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは、一次治療様式として１又はそれ以上の他の物質及び／又は治療様式とともに使用される。本発明のいくつかの実施形態において、前記細胞は補助的治療様式として、すなわち他の一次治療様式の補助として使用される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、補助的治療様式の単独の活性物質として使用される。別の実施形態では、前記細胞は、１又はそれ以上の他の物質又は治療様式とともに、補助的治療様式として使用される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、一次及び補助的治療薬及び／又は様式の両方として使用される。両者に関して、前記細胞は、一次及び／又は補助的様式において単独で使用することができる。前記細胞はまた、一次若しくは補助的様式又はその両方において、他の治療薬又は治療様式とともに使用することができる。

【0126】

上記したように、一次治療（例えば、治療薬、治療法、及び／又は治療様式）は、治療対象の主要な機能不全（例えば疾患）を標的とする（すなわち、それに対して作用させることが意図される）。補助的治療（例えば、治療法及び／又は治療様式）は、一次治療（例えば治療薬、治療法、及び／又は治療様式）と併用して施すことにより、主要な機能不全（例えば疾患）に作用し、一次治療の効果を補足し、その結果、治療レジメンの全体的な有効性を増大させることができる。補助的治療（例えば、治療薬、治療法及び／又は治療様式）をさらに施すことにより、主要な機能不全（例えば疾患）の合併症及び／又は副作用、並びに／あるいは治療（例えば、治療薬、治療法及び／又は治療様式）により引き起こされるものに作用させることができる。これらの使用のいずれかについて、１、２、３、またはそれ以上の一次治療は、１、２、３、またはそれ以上の補助的治療とともに使用することができる。

【0127】

いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは、機能不全（例えば疾患、及び／又は副作用）の開始前に被験体に投与される。実施形態において、この細胞は、機能不全が進行している間に投与される。いくつかの実施形態において、この細胞は、機能不全が確立された後に投与される。ＭＡＰＣｓは、機能不全の進行、存続、及び／又は増幅の任意の段階で、あるいは機能不全が後退した後に投与することができる。

【0128】

上記したように、本発明の実施形態は、一次治療法又は補助的治療法のための細胞と方法とを提供する。本発明の特定の実施形態において、この細胞は同種異系の被験体に投与される。いくつかの実施形態において、この細胞は被験体に対して自己由来である。いくつかの実施形態において、この細胞は被験体に対して同系である。いくつかの実施形態において、この細胞は被験体に対して異種である。同種異系であっても、自己由来であっても、同系であっても、又は異種であっても、本発明の種々の実施形態において、ＭＡＰＣｓは被験体においてほんの弱い免疫原性であるか又は非免疫原性である。実施形態において、ＭＡＰＣｓは十分に低い免疫原性を有するか又は非免疫原性であり、一般に有害な免疫応答は十分にはなく、同種異系の被験体に投与される場合に、これらは組織型判定や適合をすることなく「普遍的」ドナー細胞として使用することができる。本発明の種々の実施形態に従って、ＭＡＰＣｓは細胞バンクで保存し維持することができ、その結果、必要な時に利用できるように維持することができる。

【0129】

さらにこの点に関して、種々の実施形態においてＭＡＰＣｓは、補助的な免疫抑制処置を行わずに投与することができる。

【0130】

これらの及び他のすべての関連で、本発明の実施形態は、哺乳動物（ある実施形態においてヒトを含む）由来のＭＡＰＣ、及び他の実施形態で非ヒト霊長類、ラット及びマウス、並びにイヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、及びウシ由来のＭＡＰＣｓを提供する。上記した哺乳動物から調製したＭＡＰＣｓは、本明細書に記載した本発明の方法及び態様の全てで使用することができる。

【0131】

本発明の種々の実施形態においてＭＡＰＣｓは、見出されているそのような哺乳動物の種々の区画や組織（特に限定されないが、骨髄、末梢血、臍帯血、血液、脾臓、肝臓、筋肉、脳、脂肪組織、胎盤及び他の後述のもの）から単離することができる。いくつかの実施形態においてＭＡＰＣｓは使用前に培養される。

【0132】

いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは、免疫調節性を改善するために遺伝子操作される。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＭＡＰＣｓはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養で作製される。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＭＡＰＣｓはトランスジェニック生物から作製される。

【0133】

ＭＡＰＣｓの作用機構
ＭＡＰＣｓの性質、活性、及び作用についていずれか１以上の説明的機構に限定されることなく、ＭＡＰＣｓが種々の様式を介してＭＡＰＣｓによる治療などの有益な影響を発揮することができることは注目に値する。例えば、ＭＡＰＣｓは直接的に有益な作用を有することができる。かかる直接的な作用は主に、ＭＡＰＣｓと宿主の細胞とが直接的に接触することである。接触は、細胞の構造メンバー又はこれらのすぐ近くの環境中の成分との接触でもよい。かかる直接的な機構は、直接的な接触、拡散、取り込み、又は当業者に周知の他のプロセスなどを含み得る。ＭＡＰＣｓの直接的な活性及び作用は、局所的沈着の領域又は注射により接触される身体区画などに、空間的に限定されることがある。

【0134】

ＭＡＰＣｓはまた、「ホーミング」シグナル（例えば損傷又は疾患の部位で放出されるシグナル）に応答して「帰巣する（home）」ことができる。ホーミングは、修復が必要な部位に細胞を動員する天然の機能を有するシグナルにより仲介されることが多いため、ホーミング挙動はＭＡＰＣｓを治療標的に濃縮するための強力手段となる。この作用は、特異的な因子（後述）により刺激することができる。

【0135】

ＭＡＰＣｓはまた因子へのその応答によりＭＡＰＣｓによる治療などの有益な影響を調節し得る。これは、直接的な調節に加えて又はその代わりに生じ得る。かかる因子には、ホーミング因子、分裂促進因子、及び他の刺激因子などが含まれ得る。これらにはまた、分化因子、及び特定の細胞プロセスを誘発する因子も含まれ得る。後者には、細胞に他の特異的因子（例えば、損傷又は疾患の部位に細胞、例えば幹細胞（ＭＡＰＣｓを含む）を動員する際に関与する因子）を分泌させる因子がある。

【0136】

上記に加えて又はその代わりに、ＭＡＰＣｓは、内因性細胞（例えば幹細胞又は前駆細胞）に作用する因子を分泌し得る。この因子は他の細胞に作用して、それらの活性を引き起こすか、増強するか、低下させるか、又は抑制し得る。ＭＡＰＣｓは、幹細胞、前駆細胞、分化細胞に作用してこれらの細胞を分裂及び／又は分化させる因子を分泌し得る。修復が必要な部位に帰巣するＭＡＰＣｓは、その部位に他の細胞を誘引する栄養因子を分泌し得る。こうして、ＭＡＰＣｓは幹細胞、前駆細胞又は分化細胞を必要な部位に誘引し得る。ＭＡＰＣｓはまた、そのような細胞を分裂又は分化させる因子を分泌し得る。

【0137】

かかる因子（栄養因子を含む）の分泌は、ＭＡＰＣｓの効力（例えば、炎症性損傷を限定する、血管透過性を制限する、細胞生存を改善する、並びに損傷部位への修復細胞のホーミングを引き起こすか及び／又は増強する）に寄与することができる。かかる因子はまた、直接Ｔ細胞増殖に影響を与えるかもしれない。かかる因子はまた、その食作用活性及び抗原提示活性（これもＴ細胞活性に影響し得る）を低下させることにより、樹状細胞に影響し得る。

【0138】

これら及び他の機構により、ＭＡＰＣｓは、種々の損傷、機能不全、障害及び疾患の治療に有益な影響を与えることができる。

【0139】

ＭＡＰＣ投与
ＭＡＰＣ調製物
ＭＡＰＣｓは種々の組織、例えば骨髄細胞（本明細書で詳述される）から調製することができる。

【0140】

多くの実施形態において、被験体に投与するためのＭＡＰＣｓの純度は約１００％である。別の実施形態において、これは９５％～１００％である。いくつかの実施形態において、これは８５％～９５％である。特に他の細胞との混合物の場合、ＭＡＰＣｓの割合（％）は、２％～５％、３％～７％、５％～１０％、７％～１５％、１０％～１５％、１０％～２０％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～９５％であることができる。

【0141】

所与の容量中のＭＡＰＣｓの数は、周知かつ慣用の手順及び装置により、本明細書中で記載するものなどの特定のマーカー（テロメラーゼなど）の存在及び／又は不在を利用して、また望ましい場合には本明細書に記載のように３種の原始系統のうち２種以上の細胞へ分化する能力を利用して、測定することができる。所与の容量の細胞混合物におけるＭＡＰＣｓの割合（％）は、細胞（例えばサンプルのアリコート中の細胞）を計数し、ＭＡＰＣｓを同定するための上述した手法を用いてＭＡＰＣｓである細胞の数を判定することによって測定することができる。細胞は、手動で又は自動化細胞カウンターを使用して容易に計測することができる。ＭＡＰＣｓは、所与の容量中のＭＡＰＣｓなどは、例えば特異的結合試薬（蛍光標識と結合した抗体であることが多い）を用いた特異的染色と、その後の視覚的検査及び計数、又は自動化同定及び計数装置（例えばＦＡＣＳ：蛍光活性化セルソーター）装置により、測定することができる。

【0142】

ＭＡＰＣｓによる障害又は疾患などの治療は、未分化ＭＡＰＣｓを用いてもよい。治療はまた、ある分化経路に決定されるように処理されたＭＡＰＣｓを用いてもよい。治療はまた、分化能が限定されたあまり分化能のない幹細胞に分化するように処理されたＭＡＰＣｓを含んでもよい。これはまた、最終分化細胞型に分化するように処理されたＭＡＰＣｓを含んでもよい。これに関し、ＭＡＰＣｓの最適な種類又は混合物は、その特定の使用状況により決定され、当業者がＭＡＰＣｓの効果的な種類又は組合せを決定することは慣用の設計事項であろう。

【0143】

製剤化
所与の用途のためのＭＡＰＣｓ投与用の製剤の選択は、種々の要因に依存する。これらの中で顕著なものは、被験体の種、治療する障害、機能不全、又は疾患の性質とその状態、及び被験体における分布、施される他の治療や物質の性質、ＭＡＰＣｓ投与のための最適経路、その経路を介するＭＡＰＣｓの生存性、投与レジメン、並びに当業者に自明の他の因子であろう。特に、例えば適切な担体及び他の添加物の選択は、正確な投与経路及び特定の剤形の性質に依存するであろう。

【0144】

細胞の生存は、ＭＡＰＣｓを用いた治療法の効力の重要な決定要因となり得る。これは、一次治療法及び補助的治療法の両方で確かである。標的部位が細胞接種及び細胞増殖に適さない場合、別の懸念が生じる。これは、治療用ＭＡＰＣｓのその部位への接近及び／又はそこでの生着を妨害し得る。実施形態において、本発明は、細胞生存を高めるための、並びに／又は、接種及び／若しくは増殖に対するバリアにより生じる問題を克服するための方法の使用を含む。

【0145】

ＭＡＰＣｓを含む組成物の例には、筋肉内又は静脈内投与（例えば注射投与）のための溶液、懸濁液及び調製物などの液体調製物、例えば無菌懸濁液又はエマルジョンが含まれる。かかる組成物は、ＭＡＰＣｓと適当な担体、希釈剤、又は賦形剤（例えば、無菌水、生理食塩水、グルコース、ブドウ糖など）との混合物を含み得る。この組成物は凍結乾燥することもできる。この組成物は、所望の投与経路及び調製物に応じて、補助物質（例えば湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、ゲル化剤、又は粘度増強添加物、保存剤、香味剤、着色剤など）を含むことができる。過度の実験を行うことなく適切な調製物を調製するために、標準的テキスト、例えば「REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCE」 第17版、1985（
参照により本明細書に組み込まれる）を参照してもよい。

【0146】

本発明の組成物はしばしば、液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、又は粘性組成物として提供することが都合よく、これは選択されたｐＨに緩衝化してもよい。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物より調製するのが容易である。さらに、液体組成物は、特に注射による投与にいくらかより好都合である。一方、粘性組成物は、特定の組織との長い接触期間を与えるように、適切な粘度範囲で製剤化することができる。

【0147】

組成物の安定性、無菌性、及び等張性を増強するために、しばしば種々の添加物、例えば抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、及び緩衝剤が含まれる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤や抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより保証することができる。多くの場合に、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含むことが好ましいであろう。注射可能な医薬形態の吸収の延長は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより達成することができる。しかし、本発明に従って、使用されるビヒクル、希釈剤、又は添加物はいずれも前記細胞と適合性である必要があろう。

【0148】

ＭＡＰＣ溶液、懸濁液、及びゲルは、前記細胞に加えて多量の水（好ましくは精製された無菌水）を含有することがある。少量の他の成分、例えばｐＨ調整剤（例えばＮａＯＨなどの塩基）、乳化剤又は分散剤、緩衝化剤、保存剤、湿潤剤、ゲル化剤（例えばメチルセルロース）も存在してもよい。

【0149】

しばしば、前記組成物は等張であり、すなわちこれらは、投与用に適切に調製されたとき、血液や涙液と同じ浸透圧を有する。

【0150】

本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム又は他の薬剤学的に許容される物質、例えばブドウ糖、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、又は他の無機若しくは有機溶質を使用して達成される。塩化ナトリウムは、特にナトリウムイオンを含有するバッファーに好適である。

【0151】

所望であれば、組成物の粘度は、薬剤学的に許容される増粘剤を使用して、選択したレベルで維持することができる。メチルセルロースは容易にかつ経済的に入手でき、取り扱いが容易であるため好ましい。他の適切な増粘剤には、例えばキサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどがある。増粘剤の好適な濃度は、選択される物質に依存する。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。粘性の組成物は通常、かかる増粘剤を添加して溶液から調製される。

【0152】

ＭＡＰＣ組成物の寿命を延ばすために、薬剤学的に許容される保存剤又は細胞安定化剤を使用することができる。かかる保存剤が含まれる場合、ＭＡＰＣｓの生存率又は効力に影響を与えない組成物を選択することは、十分に当業者の技術範囲内である。

【0153】

組成物の成分が化学的に不活性であるべきことを当業者は認識するであろう。当業者には化学的及び薬剤学的原理に問題が無いことが明らかであろう。標準的テキストを参照して、又は本明細書の開示、引用文献に提供される情報、及び当該分野で一般に入手できる情報を使用した簡単な実験（過度の実験を含まない）により問題は容易に回避することができる。

【0154】

無菌の注射可能な溶液は、必要量の適切な溶媒中に、必要に応じて種々の量の他の成分とともに、本発明を実施するのに使用される前記細胞を組み込むことにより調製することができる。

【0155】

また、注射、例えば定位注入及び注入（静注など）のための溶液が好ましい。

【0156】

いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは注射可能な単位投与剤形（溶液、懸濁液、又はエマルジョンなど）で製剤化される。ＭＡＰＣｓの注射に適した医薬製剤は、典型的には無菌の水溶液及び分散液である。注射可能な製剤の担体は、例えば水、食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体であることができる。

【0157】

本発明の方法で投与されるべき組成物中の前記細胞、並びに任意の添加物、ビヒクル、及び／又は担体の量を、当業者は容易に決定できる。典型的には、任意の添加物（細胞に加えて）は、リン酸緩衝化生理食塩水などの溶液中に０．００１～５０重量％の量で存在する。活性成分はマイクログラム～ミリグラムのオーダー、例えば約０．０００１～約５重量％、好ましくは約０．０００１～約１重量％、最も好ましくは約０．０００１～約０．０５重量％、又は約０．００１～約２０重量％、好ましくは約０．０１～約１０重量％、そして最も好ましくは約０．０５～約５重量％で存在する。

【0158】

動物又はヒトに投与されるべき任意の組成物について、及び特定の任意の投与方法について、例えば適当な動物モデル（例えば、マウス又はラットのようなげっ歯動物）で致死用量（ＬＤ）やＬＤ５０を測定することにより、毒性を決定し、そして組成物の投与量、その中の成分の濃度、及び適切な応答を誘発する組成物投与のタイミングを決定することが好ましい。かかる決定は、当業者の知識、本開示、及び本明細書で引用された文献から、過度の実験を必要とするものではない。そして、連続投与の時間は過度の実験を行うことなく確認できるであろう。

【0159】

いくつかの実施形態において、特にカプセル化が治療法の有効性を増強するか又は取り扱い及び／若しくは貯蔵寿命に利点を提供する場合、ＭＡＰＣｓは投与用にカプセル化される。ＭＡＰＣ介在免疫抑制の効力が増大するいくつかの実施形態では、カプセル化の結果、免疫抑制剤療法の必要性も低下する可能性がある。

【0160】

またいくつかの実施形態においてカプセル化は、被験体の免疫系に対するバリアを与え、これはＭＡＰＣｓに対する被験体の免疫応答をさらに低下させることができ（これは、一般的に、同種異系移植において免疫原性ではないか、又は弱い免疫原性のみである）、その結果、細胞の投与により生じ得る任意の移植片拒絶又は炎症を低下させる。

【0161】

別の種類の細胞との混合物でＭＡＰＣｓが投与される（これは同種異系又は異種移植ではより典型的に免疫原性である）種々の実施形態において、カプセル化は、混合された細胞が免疫担当細胞でありかつ宿主を非自己として認識する場合、免疫障害をもつ宿主で生じ得る非ＭＡＰＣ細胞に対する宿主の有害な免疫応答及び／又はＧＶＨＤを低下又は排除することができる。

【0162】

ＭＡＰＣｓは移植前に、膜ならびにカプセルでカプセル化してもよい。細胞カプセル化に利用できる多くの方法のいずれかを使用できることが意図される。いくつかの実施形態において、細胞は個々にカプセル化される。いくつかの実施形態において、多くの細胞が同じ膜内にカプセル化される。細胞が移植後に除去される予定の実施形態において、多くの細胞をカプセル化する比較的大きなサイズの構造（例えば単一の膜内）が、便利な回収手段を提供し得る。

【0163】

ＭＡＰＣｓのマイクロカプセル化のために、種々の実施形態において、広範な材料を使用することができる。かかる材料には、例えばポリマーカプセル、アルギナート－ポリ－Ｌ－リジン－アルギナートマイクロカプセル、バリウムポリ－Ｌ－リジンアルギナートカプセル、アルギン酸バリウムカプセル、ポリアクリロニトリル／ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ／ＰＶＣ）中空繊維、及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空繊維などがある。

【0164】

ＭＡＰＣｓの投与のために使用し得る細胞のマイクロカプセル化技術は当業者に公知であり、例えばChang,P., et al., 1999; Matthew,H.W., et al., 1991; Yanagi, K., et al.,1989; Cai Z.H., et al., 1988; Chang,T.M., 1992、及び米国特許第５，６３９，
２７５号（これは、例えば、生物活性分子を安定に発現する細胞の長期維持のための生体適合性カプセルを記載する）に記載されている。更なるカプセル化方法は、ヨーロッパ特許公報第３０１，７７７号、及び米国特許第４，３５３，８８８号；４，７４４，９３３号；４，７４９，６２０号；４，８１４，２７４号；５，０８４，３５０号；５，０８９，２７２号；５，５７８，４４２号；５，６３９，２７５号；及び５，６７６，９４３号に記載されている。前記のすべては、ＭＡＰＣｓのカプセル化に関する部分で、参照により本明細書に組み込まれる。

【0165】

特定の実施形態はＭＡＰＣｓをポリマー（例えばバイオポリマー又は合成ポリマー）に組み込む。バイオポリマーの例には、特に限定されないが、フィブロネクチン、フィビン、フィブリノゲン、トロンビン、コラーゲン、及びプロテオグリカンなどがある。他の因子（例えば、上記サイトカイン）もまたポリマーに組み込むことができる。本発明の他の実施形態において、ＭＡＰＣｓは３次元ゲルのすき間に組み込まれてもよい。大きなポリマー又はゲルは典型的には外科的に移植される。充分に小さい粒子又は繊維中で製剤化され得るポリマー又はゲルは、他の一般的なより便利で外科的ではない経路で投与することができる。

【0166】

本発明の医薬組成物は、錠剤、硬又は軟ゼラチンカプセル、水溶液、懸濁液、及びリポソーム並びに他の持続放出製剤（例えば成形ポリマーゲル）を含む多くの形態で調製し得る。経口液体医薬組成物は、例えば水性若しくは油性懸濁液、液剤、エマルジョン、シロップ剤、エリキシル剤の形態であってもよいし、使用前に水若しくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提供してもよい。かかる液体医薬組成物は、一般的な添加物、例えば懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（これは食用油を含み得る）、又は保存剤を含有してもよい。胃を通過した後に細胞が腸内に放出されるように、経口投与剤形を調製してもよい。かかる製剤は米国特許第６，３０６，４３４号及びそこに含まれる文献に記載されている。

【0167】

直腸投与に適した医薬組成物を単位投与坐剤として調製することができる。適切な担体には食塩水や当該分野で一般的に使用される他の物質がある。

【0168】

吸入による投与のために、細胞は吸入器、ネブライザー、若しくは加圧パック、又はエアゾルスプレーを送達するための他の便利な手段から送達されることが好都合である。加圧パックは、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロエタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスを含むことができる。加圧エアゾル剤の場合、投与単位は計量された量を送達するための弁を備えることにより決定することができる。

【0169】

あるいは、吸入又はガス注入による投与のために、乾燥粉末組成物、例えば変調物質と適切な粉末基剤（例えば乳糖又はデンプン）の粉末ミックスの形態の手段を採ることもできる。粉末組成物は、例えばカプセル、又はカートリッジ中で、或いは例えばゼラチン若しくはブリスターパック（ここから、粉末は吸入器又はガス注入器を用いて投与される）中で、単位投与剤形で提供してもよい。鼻内投与のために、細胞は液体スプレーを介して、例えばプラスチックボトルの噴霧器を介して投与してもよい。

【0170】

他の活性成分
ＭＡＰＣｓは他の薬剤学的に活性な物質とともに投与することができる。いくつかの実施形態において、１つ又はそれ以上のかかる物質は、投与のためにＭＡＰＣｓとともに製剤化される。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓ及び１つ又はそれ以上の物質は別の製剤中に存在する。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓ及び／又は１つ又はそれ以上の物質を含む組成物は、互いの補助的使用のために調製される。

【0171】

本発明の実施形態で使用し得る他の薬理活性物質や組成物を少し列挙すると、かかる物質はまた、抗生剤、抗菌剤、及び抗ウイルス剤などがある。

【0172】

典型的な抗生物質又は抗真菌化合物は、特に限定されないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ニスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、プロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、タイロシン、ゼオシン、及びセファロスポリン、アミノグリコシド、及びエキノカンジンなどがある。

【0173】

この種のさらなる添加物は、ＭＡＰＣｓが他の幹細胞のように、被験体への投与後に、その増殖と機能に適した環境に「帰巣（ホーミング）」し得るという事実に関する。かかる「ホーミング」はしばしば細胞をこれらが必要な部位（例えば免疫疾患、機能不全、又は疾患の部位）で濃縮する。ホーミングを刺激する多くの物質が知られている。これらには、増殖因子や栄養シグナル伝達物質、例えばサイトカインなどがある。これらは、治療標的部位へのＭＡＰＣｓのホーミングを促進するために使用することができる。これらは、ＭＡＰＣｓで治療する前、ＭＡＰＣｓと一緒に、又はＭＡＰＣｓの投与後に被験体に投与することができる。

【0174】

特定のサイトカインは、例えば、治療の必要な部位（例えば免疫障害のある部位）へのＭＡＰＣｓ又は分化したその対応物の移動を改変するか又はこれに影響を与える。この点で使用し得るサイトカインには、特に限定されないが、ストロマ細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、アンジオポエチン－１、胎盤由来増殖因子（ＰＩＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子）、ＩＣＡＭやＶＣＡＭなどの内皮細胞接着分子の発現を刺激するサイトカイン、及びホーミングを引き起こすか又は促進するサイトカインなどがある。

【0175】

これらは被験体に、前処置としてＭＡＰＣｓとともに、又はＭＡＰＣｓが投与された後に投与されて、改善されたホーミングにより又は他の機構により、所望の部位へのホーミングを促進し、治療効果を改善し得る。かかる因子は、一緒に投与されるべきこれらに適した製剤中でＭＡＰＣｓと組合せることができる。あるいは、かかる因子は別々に製剤化し投与してもよい。

【0176】

因子（例えば上記サイトカイン）やＭＡＰＣｓの投与順序、製剤化、用量、投与頻度、及び投与経路は一般に、治療対象の障害又は疾患、その重症度、被験体、行われている他の治療法、障害又は疾患のステージ、及び予後因子により変動する。他の治療法について確立された一般的なレジメンは、ＭＡＰＣ介在の直接治療法又は補助的治療法において適切な投与を決定するためのフレームワークを提供する。これらは本明細書に記載の追加の情報とともに、当業者が、過度の実験を行うことなく本発明の実施形態の適切な投与処置を決定することを可能にする。

【0177】

実施形態において、細胞は、以下で説明する実施例で例示するように脳損傷を治療するために好適に製剤化される。実施例の特定の例示的な実施形態のような実施形態において、製剤は、非経口投与に有効である。実施形態において、製剤は静注に有効である。実施形態において、製剤は定位注入に有効である。

【0178】

経路
ＭＡＰＣｓは、細胞を被験体に投与するために使用し得る当業者に公知の種々の経路のいずれかにより被験体に投与することができる。

【0179】

種々の実施形態において、ＭＡＰＣｓは、細胞療法の有効な送達のための任意の経路により被験体に投与される。いくつかの実施形態において、この細胞は注射（局所的及び／又は全身注射を含む）により投与される。特定の実施形態において、この細胞は、治療が意図される機能不全の部位内及び／又はその近傍で投与される。いくつかの実施形態において、この細胞は、機能不全の部位の近傍ではなくその部位で注射により投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、全身注射（例えば静脈内注射）により投与される。

【0180】

本発明の実施形態においてこの点で使用し得る方法には、非経口経路によりＭＡＰＣｓを投与する方法がある。本発明の種々の実施形態で有用な非経口投与経路には、特に静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内、くも膜下内、骨内、関節内、滑液包内、皮内（intracutaneous）、皮内（intradermal）、皮下、及び／又は筋肉内注射による投与などがある。い
くつかの実施形態において、静脈内、動脈内、皮内（intracutaneous）、皮内（intradermal）、皮下及び／又は筋肉内注射が使用される。いくつかの実施形態において、静脈内
、動脈内、皮内（intracutaneous）、皮下及び／又は筋肉内注射が使用される。

【0181】

本発明の種々の実施形態において、ＭＡＰＣｓは全身性注射により投与される。全身性注射（例えば静脈内注射）は、ＭＡＰＣｓを投与するための最も単純で侵襲性の小さい経路の１つである。一部の場合に、これらの経路は、最適な有効性及び／又は標的部位へのＭＡＰＣｓのホーミングのために高用量のＭＡＰＣを必要とすることがある。種々の実施形態において、ＭＡＰＣｓは、標的部位での最適な作用を確実にするために、標的化及び／又は局所注射により投与してもよい。

【0182】

ＭＡＰＣｓは、本発明のいくつかの実施形態において、注射器による皮下注射針を介して被験体に投与することができる。種々の実施形態において、ＭＡＰＣｓはカテーテルを介して被験体に投与される。種々の実施形態において、ＭＡＰＣｓは外科的移植により投与される。さらにこの点で、本発明の種々の実施形態において、ＭＡＰＣｓは関節鏡視下の処置を用いた移植によって被験体に投与される。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは定位注入により被験者に投与される。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは例えばポリマー又はゲルなどの固体支持体中又は固体支持体上に存在させて被験体に投与される。種々の実施形態において、ＭＡＰＣｓはカプセル形態で被験体に投与される。

【0183】

本発明の更なる実施形態において、ＭＡＰＣｓは、経口、直腸、経皮、眼内、鼻内、及び肺内送達のために適切に製剤化され、適宜投与される。

【0184】

実施形態において、細胞は、以下で説明する実施例で例示するように、脳損傷を治療するために非経口投与が用いられる。実施例において例示するような実施形態において、静注が用いられる。実施例において例示するような実施形態において、定位注入が用いられる。

【0185】

投与
組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、及び症状、並びに投与される製剤（例えば固体対液体）などの要因を考慮して、医学分野及び獣医学分野の当業者に周知の投与量及び方法で投与することができる。ヒト又は他の哺乳動物についての用量は、過度の実験を行うことなく当業者により、本開示、本明細書で引用される文献、及び当該分野の知識から決定することができる。

【0186】

本発明の種々の実施形態で使用するのに適したＭＡＰＣｓの用量は、多くの要因に依存するであろう。これは、異なる状況について大きく変動する可能性がある。一次治療法及び補助的治療法のために投与されるべきＭＡＰＣｓの最適な用量を決定するパラメータは一般に以下の一部又は全てを含む：治療対象の疾患とそのステージ；被験体の種、その健康、性別、年齢、体重、代謝速度；被験体の免疫適格性；施される他の治療薬；及び被験体の病歴又は遺伝子型から予測される可能性のある合併症。このパラメータはさらに以下を含み得る：ＭＡＰＣｓが同系、自己由来、同種異系、又は異種であるか；その力価（比活性）；ＭＡＰＣｓが有効であるように標的化されるべき部位及び／又は配置；並びにＭＡＰＣｓへの接近性及び／又はＭＡＰＣｓの生着などの部位の特徴。追加のパラメータには、他の因子（例えば増殖因子及びサイトカイン）のＭＡＰＣｓとの共投与などがある。所与の状況で最適な投与量は、細胞の製剤化手段、これらを投与する手段、及び細胞が投与後に標的部位で局在化する程度も考慮するであろう。最後に、必要な最適投与量の決定は、最大有効作用の閾値以下でも、ＭＡＰＣｓの投与に関連する有害作用が投与量の増加の利点より大きくなる閾値異常でもない有効投与量を提供する。

【0187】

いくつかの実施形態に最適なＭＡＰＣｓの用量は、自己由来単核骨髄移植で使用される用量範囲内であろう。これは、サイズ（体重）及び代謝因子の違いを考慮して動物実験から、並びに他の細胞療法（移植療法など）について確立されている投与量要件からの推定によって評価することができる。

【0188】

実施形態において、最適用量は、１回の投与でレシピエントの質量１ｋｇあたり１０^４～１０^９個のＭＡＰＣ細胞の範囲である。実施形態において、１回の投与あたりの最適用量は１０^５～１０^８個のＭＡＰＣ細胞／ｋｇである。実施形態において、１回の投与あたりの最適用量は５×１０^５～５×１０^７個のＭＡＰＣ細胞／ｋｇである。実施形態において、１回の投与あたりの最適用量は、１、２、３、４、５、６、７、８又は９×１０^６のいずれかから１、２、３、４、５、６、７、８又は９×１０^７のいずれかまでのＭＡＰＣ細胞／ｋｇである。

【0189】

参考のため、前記の中～高用量の一部は、自己由来単核骨髄移植で使用される有核細胞の用量に似ている。中～低用量の一部は、自己由来単核骨髄移植で使用されるＣＤ３４^＋細胞／ｋｇの数に類似している。

【0190】

単回用量を全て一度に、分割して、又はある期間にわたって連続的に送達してもよいことは理解されるべきである。全用量を１つの位置に送達してもよいし、又はいくつかの位置に分散させてもよい。

【0191】

種々の実施形態において、ＭＡＰＣｓを初回量で投与し、次にさらにＭＡＰＣｓを投与して維持してもよい。ＭＡＰＣｓを、最初は１つの方法で投与し、次に同じ方法で又は１若しくはそれ以上の異なる方法で投与してもよい。被験体のＭＡＰＣレベルは、前記細胞の継続投与により維持することができる。種々の実施形態は、最初に又は被験体でそのレベルを維持するために、或いはその両者のために、ＭＡＰＣｓを静脈内注射により投与する。種々の実施形態において、患者の症状や本明細書で記載した他の要因に依存して、他の投与形態が使用される。

【0192】

ヒト被験体は一般に実験動物より長期間治療されることに留意されたい。しかし、治療は一般に、疾患プロセスの長さと治療の有効性に比例する長さである。当業者は、ヒトでの適切な用量を決定するために、ヒト及び／又は動物（例えばラット、マウス、非ヒト霊長類など）で行われた他の処置の結果を使用する上でこれを考慮するであろう。これらの考慮に基づき、かつ本開示や先行技術により与えられた指針を考慮することにより、過度の実験を行うことなく、当業者によるそのような決定を可能にする。

【0193】

初回投与及び追加投与に、又は連続的投与に適切なレジメンは、全て同じでもあっても変動してもよい。適切なレジメンは、本開示、本明細書で引用された文書、及び当該分野の知識から、当業者が確認できるであろう。

【0194】

治療の用量、頻度、及び期間は、多くの要因（疾患の性質、被験体、及び施し得る他の治療法を含む）に依存する。従って、ＭＡＰＣｓを投与するために広範なレジメンを使用し得る。

【0195】

いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは単回用量で被験体に投与される。他の実施形態では、ＭＡＰＣｓは２回用量またはそれ以上の用量系列で連続して被験体に投与される。単回用量、２回用量、及び／又は３回以上の用量でＭＡＰＣｓが投与される他のいくつかの実施形態において、その用量は同じかまたは異なってもよく、これらは等しい又は等しくない間隔で投与される。

【0196】

ＭＡＰＣｓは広範な時間にわたって、例えば所望の治療効果が達成されるまで、何度も投与することができる。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは、１日以内の期間にわたって投与される。他の実施形態において、これらは、２日、３日、４日、５日、又は６日間にわたって投与される。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは週に１回又はそれ以上で数週間の期間にわたって投与される。他の実施形態において、これらは数週間から１～数ヶ月の期間にわたって投与される。種々の実施形態において、これらは数ヶ月の期間にわたって投与され得る。他の実施形態において、これらは、１年又はそれ以上の期間にわたって投与され得る。一般に治療の長さは、疾患プロセスの長さと適用されている治療法の有効性、及び治療対象の被験体の症状と応答に比例する。

【0197】

いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは、所望の治療効果が達成されるまで又は投与がこれ以上被験体に利益を与えると思われなくなるまで、１回、２回、３回、又はそれ以上投与される。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＣｓは、ある期間にわたって連続的に、例えば点滴静注により投与される。ＭＡＰＣｓの投与は、短期間、数日、数週間、数ヶ月、数年、又はそれ以上の期間でもよい。

【0198】

実施例で例示する実施形態を以下で説明する。実施形態において、脳損傷を治療するために単回のボーラスが投与される。以下の実施例で例示するような実施形態において、単回のボーラスを、１以上の日数の時間間隔をおいて２回以上投与する。実施形態において、各用量は、数分から数時間の任意の時間間隔で、静注により投与する。実施形態において、単回用量の細胞を定位注入により投与する。実施形態において、２回以上の用量を、定位注入により脳の同じ又は異なる領域に投与する。これに関して脳損傷を治療するためのボーラス注射、静注（ＩＶ注射）及び定位注入を行う実施形態において、１回の投与当たりの細胞の用量は、１回の投与でレシピエントの質量１ｋｇあたり１０^４～１０^９個のＭＡＰＣ細胞の範囲である。実施形態において、用量は１０^５～１０^８個のＭＡＰＣ細胞／ｋｇである。実施形態において、用量は５×１０^５～５×１０^７個のＭＡＰＣ細胞／ｋｇである。実施形態において、用量は、１、２、３、４、５、６、７、８又は９×１０^６から１、２、３、４、５、６、７、８又は９×１０^７のいずれかまでである。

【0199】

米国特許第７，０１５，０３７号に記載されるＭＡＰＣｓ
ヒトＭＡＰＣｓが当該分野で記載されている。ヒト及びマウスについてＭＡＰＣを単離する方法は当該分野で公知である。すなわち、現在は当業者が、骨髄穿刺液、脳若しくは肝生検、及び他の臓器を得て、これらの細胞で発現される（又は発現されない）遺伝子に依存する当業者に利用可能な陽性若しくは陰性選択を用いて（例えば、上で参照する出願に開示されるような機能的又は形態的アッセイにより（これは参照により本明細書に組み込まれる））細胞を単離することが可能である。例示的な方法は、例えば米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている（この内容は、ＭＡＰＣｓの説明とその調製方法に関して、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0200】

米国特許第７，０１５，０３７号に記載されるＭＡＰＣｓの単離と増殖
例えばヒト、ラット、マウス、イヌ及びブタからのＭＡＰＣ単離方法は、当該分野で公知である。例示的な方法は、例えば、米国特許第７，０１５，０３７号、及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０４６５２（ＷＯ０２／０６４７４８として公開）に記載されており、これらの方法はそこに開示されたＭＡＰＣｓの特徴付けとともに、例示を目的として、非限定的な例としてのみ、参照により本明細書に組み込まれる。

【0201】

ＭＡＰＣｓはまず骨髄から単離され、次に他の組織（脳及び筋肉を含む）から確立された（Jiang,Y. et al., 2002）。ＭＡＰＣｓは多くの供給源（限定されるものではないが
、骨髄、胎盤、臍帯及び臍帯血、筋肉、脳、肝臓、脊髄、血液、脂肪細胞及び皮膚など）から単離することができる。例えば、ＭＡＰＣｓは、骨髄穿刺液から得ることができ、当業者が利用できる標準的手段により得ることができる（例えば、Muschler,G.F., et al., 1997; Batinic,H., et al., 1990参照）。

【0202】

米国特許第７，０１５，０３７号に記載された条件下でのヒトＭＡＰＣ表現型
２２～２５回の細胞倍加後に得られたヒトＭＡＰＣｓのＦＡＣＳによる免疫表現型分析は、この細胞が、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ及び－Ｐ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｍｕｃ１８、ＳＴＲＯ－１、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋを発現せず；低レベルのＣＤ４４、ＨＬＡ－クラスＩ、及びβ２－ミクログロブリンを発現し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１（Ｎ＞１０）を発現することを示した。

【0203】

４０回超の倍加で培養した細胞を約２×１０^３／ｃｍ^２で再接種すると、表現型はより均一になり、ＨＬＡ－クラスＩ又はＣＤ４４を発現した細胞は無かった（Ｎ＝６）。より高いコンフルエンスで細胞を増殖させると、これらは高レベルのＭｕｃ１８、ＣＤ４４、ＨＬＡクラスＩ、及びβ２－ミクログロブリンを発現し、これはＭＳＣについて記載された表現型に似ている（Ｎ＝８）（Pittenger,1999）。

【0204】

免疫組織化学は、約２ｘ１０^３／ｃｍ^２の接種密度で増殖させたヒトＭＡＰＣｓが、ＥＧＦ－Ｒ、ＴＧＦ－Ｒ１と－２、ＢＭＰ－Ｒ１Ａ、血小板由来増殖因子－Ｒ１ａと－Ｂを発現すること、及びＭＡＰＣｓの小集団（１～１０％）が抗ＳＳＥＡ４抗体で染色されたこと（Kannagi,R.,1983）を示した。

【0205】

Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃＤＮＡアレイを使用して、約２×１０^３細胞／ｃｍ^２の接種密度で２２回及び２６回の細胞倍加のために培養したヒトＭＡＰＣｓの発現遺伝子プロフィールを調べた：
Ａ．ＭＡＰＣｓは、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４４－Ｈ、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ；ＩＬ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ１１、Ｇ ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｅｐｏ、Ｆｌｔ３－Ｌ、又はＣＮＴＦの受容体；及び低レベルのＨＬＡ－クラスＩ、ＣＤ４４－Ｅ、及びＭｕｃ－１８ ｍＲＮＡを発現しなかった。
Ｂ．ＭＡＰＣｓは、サイトカインＢＭＰ１、ＢＭＰ５、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＭＣＰ１のｍＲＮＡ；サイトカイン受容体Ｆｌｋ１、ＥＧＦ－Ｒ、血小板由来増殖因子－Ｒ１α、ｇｐ１３０、ＬＩＦ－Ｒ、アクチビンＲ１と－Ｒ２、ＴＧＦＲ－２、ＢＭＰ－Ｒ１Ａ；接着受容体ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９；及びＣＤ１０を発現した。
Ｃ．ＭＡＰＣｓは、ｈＴＲＴとＴＲＦ１のｍＲＮＡ；ＰＯＵドメイン転写因子ｏｃｔ－４、ｓｏｘ－２（ＥＳ／ＥＣの未分化状態を維持するためにｏｃｔ－４とともに必要とされる、UwanoghoH.,1995）、ｓｏｘ１１（神経発生）、ｓｏｘ９（軟骨形成）（Lefebvre V., 1998）；ホメオドメイン転写因子：Ｈｏｘ－ａ４と－ａ５（頸部と胸部骨格指定；呼
吸器の器官形成）（PackerAI, 2000）、Ｈｏｘ－ａ９（骨髄造血）（Lawrence H, 1997）、Ｄｌｘ４（前脳と頭部の周囲構造の指定）（AkimenkoMA, 1994）、ＭＳＸ１（胚中胚
葉、成体の心臓と筋肉、軟骨形成と骨形成）（Foerst-Potts L. 1997）、ＰＤＸ１（膵臓）（OffieldMF, 1996）を発現した。
Ｄ．ｏｃｔ－４、ＬＩＦ－Ｒ、及びｈＴＲＴ ｍＲＮＡの存在はＲＴ－ＰＣＲにより確認された。
Ｅ．さらに、ＲＴ－ＰＣＲは、ｒｅｘ－１ ｍＲＮＡとｒｏｘ－１ ｍＲＮＡがＭＡＰＣｓ中で発現されることを示した。

【0206】

ｏｃｔ－４、ｒｅｘ－１、及びｒｏｘ－１は、ヒト及びミューリンの骨髄並びにミューリンの肝臓及び脳から得られたＭＡＰＣｓで発現された。ヒトＭＡＰＣｓはＬＩＦ－Ｒを発現し、ＳＳＥＡ－４で陽性染色された。最後に、ｏｃｔ－４、ＬＩＦ－Ｒ、ｒｅｘ－１、及びｒｏｘ－１ ｍＲＮＡレベルは、３０回超の細胞倍加で培養したヒトＭＡＰＣｓで増加することがわかり、これにより表現型的により均一な細胞を生じた。これに対して、高密度で培養したＭＡＰＣｓはこれらのマーカーの発現が消失した。これは、４０回の細胞倍加前の老化と、軟骨芽細胞、骨芽細胞、及び脂肪細胞以外の細胞への分化の消失に関連していた。すなわちｏｃｔ－４の存在は、ｒｅｘ－１、ｒｏｘ－１、及びｓｏｘ－２との組合せで、ＭＡＰＣｓ培養物中の最も原始的な細胞の存在と相関した。

【0207】

ＭＡＰＣｓを培養する方法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第７，０１５，０３７号を参照、これはＭＡＰＣｓを培養する方法について参照により本明細書に組み込まれる）。ＭＡＰＣｓを培養するための密度は約１００細胞／ｃｍ^２又は約１５０細胞／ｃｍ^２～約１０，０００細胞／ｃｍ^２で変動することができ、約２００細胞／ｃｍ^２～約１５００細胞／ｃｍ^２～約２０００細胞／ｃｍ^２を含む。密度は種間で異なり得る。さらに、最適密度は、培養条件と細胞の供給源により異なり得る。培養条件と細胞の所与のセットについて最適密度を決定することは当業者の技術範囲内である。

【0208】

また、培養物におけるＭＡＰＣｓの単離、増殖、及び分化中の任意の時期に、約１０％未満（約３～５％を含む）の有効な大気酸素濃度を使用することができる。

【0209】

本発明はさらに、以下の例示的な非限定的実施例により説明される。

【実施例0210】

ラットにおける低酸素虚血性損傷と、ＭＡＰＣｓ、ＭＡＰＣｓ及び免疫抑制による処置
７日齢SpragueDawley（ＳＤ）子ラット（試験群当たりｎ＝７）に対して、Riceら、Ann
Neurol. 9:131-141 (1981)（特にこの方法に関して参照によりその全体を本明細書に組
み入れる）に記載されているように、片側頚動脈結紮の後の８％低酸素の方法によってＨＩ損傷を行った。損傷後７日目に、ＳＤラット（同系、ＧＦＰ標識、動物当たり２００，０００個の細胞）又はＦｉｓｈｅｒラット（同種異系、β－ｇａｌ標識、動物当たり２００，０００個の細胞）に由来する凍結乾燥ＭＡＰＣｓ（移植の直前に解凍したもの）を動物の海馬領域に定位移植した。全ての動物にその生存期間にわたって毎日免疫抑制処置（ＣＳＡ、１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））を行った。移植後７日目及び１４日目に、上体旋回試験（ElevatedBodySwing Test；ＥＢＳＴ）及びロタロッド試験を行って、一
般的及び協調的運動及び神経機能をBorlonganら、J Neurosci., 15: 5372-5378 (1995)（特に行動遂行を評価するこれらの方法に関して参照によりその全体を本明細書に組み入れる）に記載のように明らかにした。生着したＭＡＰＣｓの免疫組織化学分析のために、１４日目に試験後の動物を安楽死させた。実験のフローチャートを図１に示す。試験過程でＭＡＰＣを移植した動物では死亡が観察されなかった。

【実施例0211】

実施例２Ａ：ＨＩ損傷ラットにおけるＭＡＰＣ注射後７日目及び１４日目における運動能力の評価
実施例１に記載のように動物に処置を行った。移植後７日目に、ＭＡＰＣを移植したＨＩ損傷動物は、ビヒクルを注入した損傷動物と比較して、ＥＢＳＴで判定した場合に運動非対称性が低くなり（６４％～６５％対７５％）、ロタロッドでは長い時間費やす（１４．１～１６．５秒対１８秒）傾向があることが示された。移植後１４日目に、ＭＡＰＣを移植した動物は、ビヒクル注入を行った対照動物よりも有意に低い運動非対称性を示し（６６％～７０％対８７％）、ロタロッドで長い時間を費やした（２７．３～２８．３秒対２１秒）。損傷動物に移植した同系及び同種異系ＭＡＰＣｓは、両方の試験期間においてその行動の改善に統計学的差がなかった。結果をグラフとして図２に示す。この結果は、運動及び神経の両方の測定でラットＨＩ損傷モデルに注射したＭＡＰＣｓの治療効果を示している。

【0212】

実施例２Ｂ：ＨＩラットの脳におけるＭＡＰＣ注射後１４日目におけるＭＡＰＣ生着の組織学的分析
実施例１に記載のように動物に処置を行った。移植後１４日目に犠牲にした後、ＨＩ損傷動物の脳における生着ＭＡＰＣｓを組織学的検査により検出した。ＧＦＰ陽性同系移植片は主に、ＤＡＰＩで同時に標識された、元の海馬ＣＡ３移植部位及び隣接するＣＡ２領域において検出された。同種異系移植片は、抗β－ｇａｌ染色と、ＤＡＰＩによる同時標識によって検出され、これはＨＩ損傷脳で生存した移植片と同様のパターンを示した。移植片の生存は、１４日目に０．９６％だった（ＡＮＯＶＡ Ｆ値２４．２７、ｄｆ＝２，１９及びｐ＜０．０００１；Ｆｉｓｈｅｒ事後検定はｐ＜０．０００１）。この結果は、同系及び同種異系ＭＡＰＣｓはいずれも、ラットＨＩ損傷モデルにおいて注射部位に生着し、直接脳内注射後少なくとも２週間持続していることを示す。