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特開2022-126237シェーグレン症候群検査装置、情報取得方法、プログラム及びシェーグレン症候群検査キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022126237
(43)【公開日】2022-08-30
(54)【発明の名称】シェーグレン症候群検査装置、情報取得方法、プログラム及びシェーグレン症候群検査キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20220823BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220823BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220823BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20220823BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z
C12Q1/02 ZNA
C12Q1/686 Z
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021024181
(22)【出願日】2021-02-18
(71)【出願人】
【識別番号】504258527
【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100168114
【弁理士】
【氏名又は名称】山中 生太
(74)【代理人】
【識別番号】100162259
【弁理士】
【氏名又は名称】末富 孝典
(74)【代理人】
【識別番号】100146916
【弁理士】
【氏名又は名称】廣石 雅紀
(72)【発明者】
【氏名】山城 康太
(72)【発明者】
【氏名】杉浦 剛
(72)【発明者】
【氏名】▲濱▼田 倫史
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB11
4B029CC01
4B029FA12
4B029FA15
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ52
4B063QQ57
4B063QQ58
4B063QR06
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】非侵襲的かつ簡便にシェーグレン症候群を検査できるシェーグレン症候群検査装置、情報取得方法、プログラム及びシェーグレン症候群検査キットを提供する。
【解決手段】シェーグレン症候群検査装置は、被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する判定部を備える。
【選択図】図５
【解決手段】シェーグレン症候群検査装置は、被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する判定部を備える。
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する判定部を備える、
シェーグレン症候群検査装置。
シェーグレン症候群検査装置。
【請求項2】
前記マイクロＲＮＡは、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８からなる群から選択される少なくとも１つである、
請求項１に記載のシェーグレン症候群検査装置。
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８からなる群から選択される少なくとも１つである、
請求項１に記載のシェーグレン症候群検査装置。
【請求項3】
前記マイクロＲＮＡは、
エクソソームから抽出される、
請求項１又は２に記載のシェーグレン症候群検査装置。
エクソソームから抽出される、
請求項１又は２に記載のシェーグレン症候群検査装置。
【請求項4】
前記判定部は、
前記マイクロＲＮＡの発現量を基準値と比較することによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する、
請求項１から３のいずれか一項に記載のシェーグレン症候群検査装置。
前記マイクロＲＮＡの発現量を基準値と比較することによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する、
請求項１から３のいずれか一項に記載のシェーグレン症候群検査装置。
【請求項5】
前記マイクロＲＮＡは、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０であって、
前記判定部は、
前記マイクロＲＮＡの発現量及び前記発現量に対応するシェーグレン症候群の罹患の有無を示す情報を、それぞれ説明変数に対応する情報及び目的変数に対応する情報とする教師あり学習で構築されたモデルによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する、
請求項１から４のいずれか一項に記載のシェーグレン症候群検査装置。
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０であって、
前記判定部は、
前記マイクロＲＮＡの発現量及び前記発現量に対応するシェーグレン症候群の罹患の有無を示す情報を、それぞれ説明変数に対応する情報及び目的変数に対応する情報とする教師あり学習で構築されたモデルによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する、
請求項１から４のいずれか一項に記載のシェーグレン症候群検査装置。
【請求項6】
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定するための情報を取得する取得ステップを含む、
情報取得方法。
情報取得方法。
【請求項7】
コンピュータを、
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する判定部として機能させる、
プログラム。
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する判定部として機能させる、
プログラム。
【請求項8】
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量を定量する試薬を備える、
シェーグレン症候群検査キット。
シェーグレン症候群検査キット。
【請求項9】
前記マイクロＲＮＡは、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８からなる群から選択される少なくとも１つである、
請求項８に記載のシェーグレン症候群検査キット。
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８からなる群から選択される少なくとも１つである、
請求項８に記載のシェーグレン症候群検査キット。
【請求項10】
前記マイクロＲＮＡの発現量を基準値と比較することによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かが判定される、
請求項８又は９に記載のシェーグレン症候群検査キット。
請求項８又は９に記載のシェーグレン症候群検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シェーグレン症候群検査装置、情報取得方法、プログラム及びシェーグレン症候群検査キットに関する。
【背景技術】
【0002】
シェーグレン症候群（以下“ＳＳ”ともいう）は、腺組織の破壊により涙液又は唾液の産生低下を来たし、眼又は口腔の乾燥症状を呈する自己免疫疾患である。ＳＳは難治性の疾患で、国の指定難病に含まれている。ＳＳの主な治療法は、眼又は口腔の乾燥症状に応じた処置及び投薬等の対症療法である。
【0003】
現在、国内で主に使われているＳＳの診断基準の中には、生検病理組織検査及び採血等の侵襲的な検査、並びに唾液腺造影及びシンチグラフィー等の煩雑な検査が含まれる。さらに、ＳＳは、複数の検査を施行しなければ診断できないため、患者の負担が大きい。日本のみならず、米国及び欧州の診断基準にも、生検病理組織検査及び採血等の侵襲的な検査が含まれている。
【0004】
特許文献１には、健常者と比較してＳＳ患者の小唾液腺において有意に増加又は減少しているマイクロＲＮＡの発現レベルを用いて、ＳＳを診断する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特表２０１２－５２２５０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１では、下唇から切除された小唾液腺の組織におけるマイクロＲＮＡの発現量の増減が検討されている。下唇から小唾液腺を切除するため、特許文献１に開示された方法が侵襲的な検査であることに変わりはない。特許文献１では、唾液中のエクソソームに含まれるマイクロＲＮＡが検討されているが、クエン酸で舌を刺激したうえで、耳下腺採取器等を用いる煩雑な方法で唾液が採取されている。また、エクソソームに含まれるマイクロＲＮＡに関しては、健常者と比較してＳＳ患者の小唾液腺において有意に増加又は減少しているマイクロＲＮＡは同定されていない。
【0007】
ＳＳにおける非侵襲的な検査法は、未だに実用化されていない。疾患の進行及び病勢を簡便に評価するためにも、非侵襲的かつ簡便なＳＳの検査法の確立が求められている。
【0008】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、非侵襲的かつ簡便にシェーグレン症候群を検査できるシェーグレン症候群検査装置、情報取得方法、プログラム及びシェーグレン症候群検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の第１の観点に係るシェーグレン症候群検査装置は、
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する判定部を備える。
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する判定部を備える。
【0010】
前記マイクロＲＮＡは、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８からなる群から選択される少なくとも１つである、
こととしてもよい。
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８からなる群から選択される少なくとも１つである、
こととしてもよい。
【0011】
前記マイクロＲＮＡは、
エクソソームから抽出される、
こととしてもよい。
エクソソームから抽出される、
こととしてもよい。
【0012】
前記判定部は、
前記マイクロＲＮＡの発現量を基準値と比較することによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する、
こととしてもよい。
前記マイクロＲＮＡの発現量を基準値と比較することによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する、
こととしてもよい。
【0013】
前記マイクロＲＮＡは、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０であって、
前記判定部は、
前記マイクロＲＮＡの発現量及び前記発現量に対応するシェーグレン症候群の罹患の有無を示す情報を、それぞれ説明変数に対応する情報及び目的変数に対応する情報とする教師あり学習で構築されたモデルによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する、
こととしてもよい。
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０であって、
前記判定部は、
前記マイクロＲＮＡの発現量及び前記発現量に対応するシェーグレン症候群の罹患の有無を示す情報を、それぞれ説明変数に対応する情報及び目的変数に対応する情報とする教師あり学習で構築されたモデルによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する、
こととしてもよい。
【0014】
本発明の第２の観点に係る情報取得方法は、
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定するための情報を取得する取得ステップを含む。
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定するための情報を取得する取得ステップを含む。
【0015】
本発明の第３の観点に係るプログラムは、
コンピュータを、
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する判定部として機能させる。
コンピュータを、
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かを判定する判定部として機能させる。
【0016】
本発明の第４の観点に係るシェーグレン症候群検査キットは、
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量を定量する試薬を備える。
被験者の含嗽液中のｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量を定量する試薬を備える。
【0017】
前記マイクロＲＮＡは、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８からなる群から選択される少なくとも１つである、
こととしてもよい。
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８からなる群から選択される少なくとも１つである、
こととしてもよい。
【0018】
前記マイクロＲＮＡの発現量を基準値と比較することによって、前記被験者がシェーグレン症候群に罹患しているか否かが判定される、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、非侵襲的かつ簡便にシェーグレン症候群を検査できる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】（Ａ）は本発明の実施の形態に係るＳＳ検査装置のハードウエア構成を示すブロック図である。（Ｂ）はＳＳ検査装置の機能を示すブロック図である。
【図3】ＳＳ群及び健常者（ＨＣ）群の各マイクロＲＮＡの相対的な発現量を示す図である。（Ａ）はｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐの発現量を示す図である。（Ｂ）はｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０の発現量を示す図である。（Ｃ）はｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐの発現量を示す図である。（Ｄ）はｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８の発現量を示す図である。
【図4】マイクロＲＮＡの発現量に基づくＳＳの判定精度を示す図である。（Ａ）はｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐの発現量に基づく判定の受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。（Ｂ）はｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０の発現量に基づく判定のＲＯＣ曲線を示す図である。（Ｃ）はｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐの発現量に基づく判定のＲＯＣ曲線を示す図である。（Ｄ）はｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８の発現量に基づく判定のＲＯＣ曲線を示す図である。
【図5】マイクロＲＮＡの発現量に係る指標に基づくＳＳの判定精度を示す図である。（Ａ）はＳＳ群及びＨＣ群の指標を示す図である。（Ｂ）は指標に基づく判定のＲＯＣ曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。
【0022】
本実施の形態に係るＳＳ検査装置１００について図１を参照して説明する。ＳＳ検査装置１００は、被験者の生体試料から取得されるデータを解析して被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定するための装置である。図１（Ａ）に示すように、ＳＳ検査装置１００は、記憶部１０、ＲＡＭ（Random Access Memory）２０、入力装置３０、表示装置４０及びＣＰＵ（Central Processing Unit）５０が、バス６０で通信可能に接続された構成を有する。
【0023】
記憶部１０は、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）及びフラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部１０は、各種データ及びソフトウェアプログラムの他、ＳＳ判定プログラム１１を記憶している。
【0024】
ＲＡＭ２０はＣＰＵ５０のメインメモリとして機能し、ＣＰＵ５０によるＳＳ判定プログラム１１の実行に際し、ＳＳ判定プログラム１１がＲＡＭ２０に展開される。ＲＡＭ２０には、入力装置３０から入力されたデータが一時的に記憶される。
【0025】
入力装置３０は、使用者がＳＳ検査装置１００にデータを入力するためのハードウエアである。入力装置３０は、被験者から採取される試料としての含嗽液におけるマイクロＲＮＡの発現量を示すデータをＣＰＵ５０に入力する。ＣＰＵ５０は、入力されたマイクロＲＮＡの発現量を示すデータを記憶部１０に記憶させる。
【0026】
含嗽液は、うがい液ともいい、被験者が一定量の液体で口腔内をすすいだ後に口外に出される液体をいう。うがいは、喉を洗浄するうがいであってもよいが、好ましくは、うがいは主に口を洗浄するうがいである。含嗽液には、被験者において分泌された唾液及び剥離した口腔内の細胞を含む。含嗽液であれば、非侵襲的に採取可能である。また、含嗽液を用いることで、口腔の乾燥症状（ドライマウス）で唾液が少ないＳＳ患者又はＳＳの疑いがある被験者でも簡便に検体の採取が可能となる。
【0027】
マイクロＲＮＡの発現量を示すデータは、含嗽液におけるマイクロＲＮＡの発現量の値である。マイクロＲＮＡの発現量の値は発現量の定量方法に応じて選択できるが、例えば、マイクロＲＮＡの濃度の値でもよいし、内因性コントロールのマイクロＲＮＡの発現量に対する相対的な発現量を示す数値であってもよい。以下では、被験者の含嗽液におけるマイクロＲＮＡの発現量を示すデータを“発現量データ”ともいう。
【0028】
マイクロＲＮＡは、ｐｒｉ－マイクロＲＮＡ、ｐｒｅ－マイクロＲＮＡ及び成熟マイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは、エクソソームから抽出されてもよい。エクソソーム内部には、タンパク質やマイクロＲＮＡを含む核酸等の情報伝達物質が含まれている。細胞から分泌されたエクソソームは、血流等を介して別の細胞に取り込まれ、情報伝達物質を当該別の細胞に送り込む。情報伝達物質を取り込んだ細胞は情報伝達物質に反応して細胞の形質を変化させる。このため、エクソソームに含まれるマイクロＲＮＡは、ＳＳの発症及び進展等に関与すると考えられる。
【0029】
エクソソームは、超遠心法、ポリマー沈殿法、親和性を利用した分離法、及びサイズ排除クロマトグラフィーによる精製等の公知の方法で単離される。単離したエクソソームからＲＮＡを抽出し、マイクロＲＮＡの発現量を測定すればよい。
【0030】
マイクロＲＮＡの発現量は公知の方法で測定される。マイクロＲＮＡの発現量の測定方法としては、例えば、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、リアルタイムＰＣＲ法及びマイクロアレイ法が挙げられる。マイクロＲＮＡの発現量の測定では、含嗽液から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲでマイクロＲＮＡを定量してもよい。全ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成及びリアルタイムＰＣＲによるマイクロＲＮＡの定量は、市販のキットでも行うことができる。
【0031】
表示装置４０は、ＣＰＵ５０によるＳＳの罹患に関する判定の結果を出力するためのディスプレイである。ＣＰＵ５０は、記憶部１０に記憶されたＳＳ判定プログラム１１をＲＡＭ２０に読み出して、ＳＳ判定プログラム１１を実行することにより、以下に説明する機能を実現する。
【0032】
図１（Ｂ）は、ＣＰＵ５０が実現する機能を示すブロック図である。ＳＳ判定プログラム１１は、ＣＰＵ５０に判定部１及び出力部２として機能させる。
【0033】
判定部１は、被験者の含嗽液中のマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定する。具体的に“ＳＳに罹患している”とは、ＳＳ診断基準、例えば日本の厚生省改訂診断基準、アメリカヨーロッパ改訂診断基準、シェーグレン国際登録ネットワーク診断基準又はアメリカリウマチ学会シェーグレン症候群分類基準等の基準を満たしＳＳと診断される状態をいう。
【0034】
下記実施例に示すように、所定のｍｉＲＮＡの含嗽液中での発現量は、健常者と比較してＳＳの患者で増加又は減少している。このようなマイクロＲＮＡは、例えば、表１に示される。なお、マイクロＲＮＡを示すＩＤはマイクロＲＮＡのデータベースであるｍｉＲＢａｓｅにおける識別情報を示す。
【0035】
【表1】
【0036】
ＳＳ患者と健常者とで比較した場合、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１２４－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３２００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１００は、健常者よりもＳＳ患者での発現量が低い。ＳＳ患者において健常者よりも発現量が低いこれらのマイクロＲＮＡを低下マイクロＲＮＡ群とする。
【0037】
一方、ＳＳ患者と健常者とで比較した場合、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐは健常者よりもＳＳ患者での発現量が高い。ＳＳ患者において健常者よりも発現量が高いこれらのマイクロＲＮＡを亢進マイクロＲＮＡ群とする。
【0038】
判定部１は、亢進マイクロＲＮＡ群に含まれる少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量を基準値と比較する。判定部１は、亢進マイクロＲＮＡ群に含まれる少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量が基準値より高い場合に被験者がＳＳに罹患していると判定し、亢進マイクロＲＮＡ群に含まれる少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量が基準値より低い場合に被験者がＳＳに罹患していないと判定する。また、判定部１は、低下マイクロＲＮＡ群に含まれる少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量を基準値と比較する。判定部１は、低下マイクロＲＮＡ群に含まれる少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量が基準値より高い場合に被験者がＳＳに罹患していないと判定し、低下マイクロＲＮＡ群に含まれる少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現量が基準値より低い場合に被験者がＳＳに罹患していると判定する。ここでの基準値は、例えば、健常者における当該マイクロＲＮＡの発現量の平均値又は中央値である。
【0039】
好ましくは、判定部１は、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８の少なくとも１つの発現量を基準値と比較する。判定部１は、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８の少なくとも１つの発現量が基準値より高い場合に被験者がＳＳに罹患していると判定し、発現量が基準値より低い場合に被験者がＳＳに罹患していないと判定する。
【0040】
判定部１は、複数のマイクロＲＮＡの発現量を組み合わせて、被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定してもよい。例えば、判定部１は、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐの発現量が第１の基準値より高く、かつｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０の発現量が第２の基準値より高い場合に被験者がＳＳに罹患していると判定してもよい。
【0041】
判定部１は、マイクロＲＮＡの発現量と基準値との比較だけではなく、１つ以上のマイクロＲＮＡの発現量から算出される指標に基づいて被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定してもよい。例えば、判定部１は、公知のデータマイニングの手法を用いて構築されたモデルから得られる指標に基づいて、マイクロＲＮＡの発現量から被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定してもよい。好ましくは、当該モデルは教師あり学習で構築されたモデルである。
【0042】
教師あり学習とは、説明変数とそれに付随する目的変数との組み合わせの集合を学習用データとして、学習用データに対するフィッティングを行うことにより学習を行う機械学習の一手法である。フィッティングは、学習用データに含まれる説明変数の特徴量を抽出して目的変数ごとの特徴量を選んだり、その目的変数に属するデータの特徴を抽出したり、目的変数を識別する判断基準を生成したりすることで行う。フィッティングによって、入力された説明変数からその説明変数に対応するべき目的変数を出力するモデルが構築される。モデルによって、学習用データに含まれない説明変数に対応する目的変数を出力することができる。
【0043】
ＳＳの罹患を判定する場合、学習用データにおける説明変数は１つ以上のマイクロＲＮＡの発現量データであって、目的変数は当該発現量データが示すマイクロＲＮＡの発現量に対応するＳＳに罹患しているか否かを示す情報である。例えば、健常者の含漱液中における２つのマイクロＲＮＡの各発現量がＥ１及びＥ２とすると、説明変数“Ｅ１，Ｅ２”に、ＳＳに罹患していないことを示す情報である目的変数“０”が対応付けられる。一方、ＳＳ患者の含漱液中における同じ２つのマイクロＲＮＡの各発現量がＥ３及びＥ４とすると、説明変数“Ｅ３及びＥ４”に、ＳＳに罹患していることを示す情報である目的変数“１”が対応付けられる。好ましくは、学習用データは、複数のマイクロＲＮＡの発現量データと当該発現量に対応するＳＳに罹患しているか否かを示す情報との組み合わせの集合である。
【0044】
教師あり学習の方法には、公知の任意の方法を採用すればよい。教師あり学習の方法としては、例えば、判別分析、正準判別分析、線形分類、重回帰分析、ロジスティック回帰分析、サポートベクターマシーン、決定木、ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、パーセプトロン及びｋ近傍法等が挙げられる。
【0045】
ロジスティック回帰分析では、目的変数を確率ｐ、説明変数をｘとするとモデルとして次の式が用いられる。なお、式１において、このａｉはｘｉに対する偏回帰係数である。偏回帰係数は、学習用データを用いて公知の方法、例えば、最小二乗法又は最尤法で求めることができる。
ｐ＝１／｛１＋ｅｘｐ（－（ａ１ｘ１＋ａ２ｘ２＋・・・＋ａｎｘｎ＋ｂ））｝ （式１）
ｐ＝１／｛１＋ｅｘｐ（－（ａ１ｘ１＋ａ２ｘ２＋・・・＋ａｎｘｎ＋ｂ））｝ （式１）
【0046】
構築されたモデルは、記憶部１０に記憶されている。判定部１は、被験者のマイクロＲＮＡの発現量を、記憶部１０に記憶されたモデルに入力することで、被験者がＳＳに罹患しているか否かを示す情報を出力として得る。例えば、被験者がＳＳに罹患しているか否かを示す情報は、被験者がＳＳに罹患していることを示す情報又は被験者がＳＳに罹患していないことを示す情報である。
【0047】
判定部１は、被験者がＳＳに罹患しているか否かを示す情報を出力部２に入力する。出力部２は、判定部１によって入力されたＳＳに罹患しているか否かを示す情報を表示装置４０に表示する。
【0048】
続いて、ＳＳ検査装置１００による判定処理を図２に示すフローチャートを参照して説明する。なお、当該フローチャートでは、判定部１は、ロジスティック回帰分析で構築されたモデルを用いて、ＳＳ検査装置１００に入力された複数のマイクロＲＮＡの発現量データから被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定する。モデルは、目的変数“１”及び“０”を、それぞれＳＳに罹患していることを示す情報及びＳＳに罹患していないことを示す情報として構築されたものとする。また、当該モデルは、あらかじめ記憶部１０に記憶されているものとする。
【0049】
判定部１は、使用者によって被験者のマイクロＲＮＡの発現量データが入力装置３０を介して入力されるのを待つ（ステップＳ１；Ｎｏ）。被験者のマイクロＲＮＡの発現量データが入力されると（ステップＳ１；Ｙｅｓ）、判定部１は、記憶部１０を参照し、モデルのｘｉに各発現量を代入してｐを算出する（ステップＳ２）。続いて、判定部１は、基準値０．５とｐとを比較し、被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定する（ステップＳ３）。ｐが基準値以上の場合（ステップＳ３；Ｙｅｓ）、出力部２は、被験者がＳＳに罹患していることを示す情報を、表示装置４０を介して表示する（ステップＳ４）。一方、ｐが基準値未満の場合（ステップＳ３；Ｎｏ）、出力部２は、被験者がＳＳに罹患していないことを示す情報を、表示装置４０を介して表示する（ステップＳ５）。そして、判定部１は判定処理を終了する。
【0050】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るＳＳ検査装置１００は、被験者の含嗽液中の、ＳＳの罹患に関連するマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定する。含嗽液を用いることで、非侵襲的かつ簡便にＳＳを検査できる。含嗽液は、安価に、何度も繰り返し採取できる。さらに、含嗽液は専門家でなくても容易に採取できることも利点である。本実施の形態に係るマイクロＲＮＡの発現量を用いた判定によれば、下記実施例に示すように、被験者のＳＳへの罹患を高い精度で判定することができる。
【0051】
また、ＳＳ検査装置１００は、エクソソームから抽出されるマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定してもよいこととした。含嗽液中のエクソソームに含まれるマイクロＲＮＡには、ＳＳの発症又は罹患に関連するマイクロＲＮＡが多く含まれると考えられるため、ＳＳの発症又は罹患にほとんど影響しないマイクロＲＮＡの検出による判定精度の低下を抑えることができる。
【0052】
また、含嗽液は簡便に取得できるため、迅速にＳＳを判定することができる。含嗽液の採取は非侵襲であるため、被験者の含嗽液中のマイクロＲＮＡを任意のタイミングで定量することができる。これにより、ＳＳの進行及び病勢を随時評価することができる。また、ＳＳ検査装置１００は、ＳＳの進行及び病勢を簡便に監視できる検査ツールとなりうる。
【0053】
なお、判定部１は、マイクロＲＮＡの発現量の値に対して任意の値を加減乗除した値で判定してもよく、発現量を公知の変換方法、例えば、指数変換、対数変換、角変換、平方根変換、プロビット変換、逆数変換、Ｂｏｘ－Ｃｏｘ変換又はべき乗変換等で変換した値で判定してもよい。判定部１は、マイクロＲＮＡの発現量の値を被験者の性別又は年齢別に重み付けをして変換して得られる値で判定してもよい。また、判定部１は、第１のマイクロＲＮＡの発現量と第１のマイクロＲＮＡとは異なる第２のマイクロＲＮＡの発現量との比を基準値等と比較して判定してもよい。
【0054】
なお、ＣＰＵ５０は、上記モデルを構築するモデル構築部として機能してもよい。モデル構築部は、記憶部１０に記憶された学習用データを用いた教師あり学習によってモデルを構築する。より詳細には、モデル構築部は、１つ以上のマイクロＲＮＡの発現量及び当該発現量に対応するＳＳに罹患しているか否かを示す情報をそれぞれ説明変数及び目的変数とした学習用データを用いて教師あり学習を実行する。モデル構築部は、構築したモデルを記憶部１０に記憶させる。これにより、判定部１は、被験者のマイクロＲＮＡの発現量を、記憶部１０に記憶されたモデルに入力することで、被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定する。
【0055】
なお、年齢、性別、喫煙習慣及び飲酒習慣等の因子によるマイクロＲＮＡの発現量の差を考慮して、判定部１は、被験者に関するこれら因子の影響を補正したマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、ＳＳに罹患しているか否かを判定してもよい。
【0056】
なお、ＳＳ検査装置１００は、通信インターフェイスを備え、ネットワークに接続されてもよい。判定部１は、当該ネットワークに接続する外部の装置等から通信手段を介して送信された発現量データを受信し、被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定してもよい。さらに出力部２は、通信インターフェイスを介して被験者がＳＳに罹患しているか否かを示す情報等を外部の装置に送信してもよい。
【0057】
また、別の実施の形態では、被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定するためのデータを得るために、当該被験者の含漱液中の上記マイクロＲＮＡを検出する検出ステップを含む方法が提供される。
【0058】
また、他の実施の形態ではＳＳの検査に有用な情報取得方法が提供される。情報取得方法は、被験者の含嗽液中の上記マイクロＲＮＡの発現量に基づいて、被験者がＳＳに罹患しているか否かを判定するための情報を取得する取得ステップを含む。他の実施の形態では、取得ステップと、取得ステップで取得した情報に基づいて、ＳＳ治療薬を被験者に投与する投与ステップと、を含むＳＳ治療方法が提供される。さらに別の実施の形態では、被験者の含嗽液中の上記マイクロＲＮＡの発現量に基づいて、被験者がＳＳに罹患しているか否かを診断する診断ステップを含む、ＳＳ診断方法が提供される。
【0059】
また、他の実施の形態ではＳＳ検査方法が提供される。ＳＳ検査方法は、被験者の含嗽液中の上記マイクロＲＮＡの発現量に基づいて、被験者がＳＳに罹患しているか否かの判定を補助する補助ステップを含む。
【0060】
なお、別の実施の形態では、ＳＳ検査キットが提供される。ＳＳ検査キットは、被験者の含嗽液中の上記マイクロＲＮＡの発現量を定量する試薬を備える。好適には、当該試薬は、マイクロＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで定量するためのプライマー及びプローブである。プライマーは、上記マイクロＲＮＡをＰＣＲ産物の塩基配列中に含むように設計されたものであれば特に限定されない。
【0061】
プライマー及びプローブの塩基配列としては、上記マイクロＲＮＡをコードするｃＤＮＡの全体の塩基配列若しくは部分配列、又は当該全体の塩基配列若しくは部分配列に相補的な塩基配列が挙げられる。
【0062】
プローブは、ＰＣＲ産物とハイブリダイゼーションするものである。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、プローブが、塩基配列が相補的な核酸とはハイブリダイズするが、相補的ではない塩基配列の核酸にはハイブリダイズしないストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版（２００１年）等に基づき適宜決定でき、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で保温、である。プライマー及びプローブは、例えば、市販の自動核酸合成機を用いて化学的に合成することができる。
【0063】
プローブは、蛍光物質等で標識されていてもよい。標識として、シアン、フルオレサミン、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）及びＴＲＩＴＣ等の蛍光標識を用いることができる。ＳＳ検査キットは、内在性コントロールとするマイクロＲＮＡに対するプライマー及びプローブを備えてもよく、さらには緩衝液、マイクロＲＮＡの定量に使用するその他の試薬を備えてもよい。
【0064】
ＳＳ検査装置１００で用いられるＳＳ判定プログラム１１及び各種ソフトウェアプログラムは、ＣＤ－ＲＯＭ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｃ Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｄｉｓｃ）、光磁気ディスク（Ｍａｇｎｅｔｏ－Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃ）、ＵＳＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｒｉａｌ Ｂｕｓ）メモリ、メモリカード及びＨＤＤ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納して配布することが可能である。そして、ＳＳ判定プログラム１１及び各種ソフトウェアプログラムを特定の又は汎用のコンピュータにインストールすることによって、当該コンピュータをＳＳ検査装置１００として機能させることが可能である。また、ＳＳ判定プログラム１１及び各種ソフトウェアプログラムをインターネット上の他のサーバが有する記憶装置に格納しておき、当該サーバからＳＳ判定プログラム１１及び各種ソフトウェアプログラムがダウンロードされるようにしてもよい。
【0065】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例0066】
（対象）
被験者は２０１９年から２０２０年に鹿児島大学病院口腔顎顔面センター口腔外科を受診したＳＳ患者とＨＣとした。ＳＳ群は、厚生省改訂診断基準（１９９９）、アメリカヨーロッパ改訂診断基準（２００２）、シェーグレン国際登録ネットワーク診断基準（２０１２）、及びアメリカリウマチ学会シェーグレン症候群分類基準（２０１６）の基準の少なくとも２つ以上を満たし一次性ＳＳと診断できる２４名を対象とした。コントロール群としてのＨＣ群は、鹿児島大学病院口腔顎顔面センター口腔外科を受診中の健常者２４名を対象とした。健常者は、口腔乾燥症状がなく、悪性疾患、炎症性疾患及び自己免疫疾患を有していなかった。
被験者は２０１９年から２０２０年に鹿児島大学病院口腔顎顔面センター口腔外科を受診したＳＳ患者とＨＣとした。ＳＳ群は、厚生省改訂診断基準（１９９９）、アメリカヨーロッパ改訂診断基準（２００２）、シェーグレン国際登録ネットワーク診断基準（２０１２）、及びアメリカリウマチ学会シェーグレン症候群分類基準（２０１６）の基準の少なくとも２つ以上を満たし一次性ＳＳと診断できる２４名を対象とした。コントロール群としてのＨＣ群は、鹿児島大学病院口腔顎顔面センター口腔外科を受診中の健常者２４名を対象とした。健常者は、口腔乾燥症状がなく、悪性疾患、炎症性疾患及び自己免疫疾患を有していなかった。
【0067】
（検体採取）
検体採取は午前９～１２時の間に行った。採取当日の被験者に発熱及び感冒症状はなく、被験者は全身的に健康な状態であった。被験者は、採取の３０分前から食事、飲水、喫煙及び歯磨きを行っていない。被験者が椅子に座った状態で滅菌精製水１０ｍＬを口に含み、１分間含嗽し、全量を専用の容器に吐き出して含嗽液を採取した。採取した含嗽液を速やかに冷凍庫に入れ、解析まで－８０℃で保管した。
検体採取は午前９～１２時の間に行った。採取当日の被験者に発熱及び感冒症状はなく、被験者は全身的に健康な状態であった。被験者は、採取の３０分前から食事、飲水、喫煙及び歯磨きを行っていない。被験者が椅子に座った状態で滅菌精製水１０ｍＬを口に含み、１分間含嗽し、全量を専用の容器に吐き出して含嗽液を採取した。採取した含嗽液を速やかに冷凍庫に入れ、解析まで－８０℃で保管した。
【0068】
（エクソソームの単離）
１．５ｍＬの含嗽液より、超遠心法のプロトコールに従って１５０μＬのエクソソームペレットを作製した。まず１．５ｍＬの検体を３００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上澄みを採取し、１．５ｍＬチューブに移した。次に２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上澄みを採取し１．５ｍＬチューブに移した。その後、１００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄みを２．２ｍＬの超遠心用チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）に移した。チューブをバケットにセットし、チューブ内のサンプルが規定量に達するようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、調整を行った。バケットをスイングローターにセットし、１０００００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離を行い、上澄みを２ｍｍ残してそれ以外を除去した。チューブにＰＢＳを加え沈殿しているエクソソームを洗浄し、再度バケットをスイングローターにセットし、１０００００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離を行った。上澄みを除去し、少量のＰＢＳを加えて１５０μＬのエクソソームペレットを作製した。単離したエクソソームを、ナノトラッキング法及びウェスタンブロッティングにて確認した。
１．５ｍＬの含嗽液より、超遠心法のプロトコールに従って１５０μＬのエクソソームペレットを作製した。まず１．５ｍＬの検体を３００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上澄みを採取し、１．５ｍＬチューブに移した。次に２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上澄みを採取し１．５ｍＬチューブに移した。その後、１００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄みを２．２ｍＬの超遠心用チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）に移した。チューブをバケットにセットし、チューブ内のサンプルが規定量に達するようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、調整を行った。バケットをスイングローターにセットし、１０００００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離を行い、上澄みを２ｍｍ残してそれ以外を除去した。チューブにＰＢＳを加え沈殿しているエクソソームを洗浄し、再度バケットをスイングローターにセットし、１０００００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離を行った。上澄みを除去し、少量のＰＢＳを加えて１５０μＬのエクソソームペレットを作製した。単離したエクソソームを、ナノトラッキング法及びウェスタンブロッティングにて確認した。
【0069】
（ＲＮＡ抽出）
製品説明書のプロトコールに従い、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、１５０μＬのエクソソームペレットからｔｏｔａｌＲＮＡ（ｓｍａｌｌＲＮＡを含む）を単離した。単離したＲＮＡを、マイクロＲＮＡマイクロアレイ及びリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）に直接使用した。
製品説明書のプロトコールに従い、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、１５０μＬのエクソソームペレットからｔｏｔａｌＲＮＡ（ｓｍａｌｌＲＮＡを含む）を単離した。単離したＲＮＡを、マイクロＲＮＡマイクロアレイ及びリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）に直接使用した。
【0070】
（マイクロアレイ）
マイクロＲＮＡマイクロアレイを実行して、ランダムに選択されたＳＳ群の１０人とＨＣ群の１０人から、プールされた含嗽液中の発現量が異なるマイクロＲＮＡを特定した。「ＲＮＡ単離」のセクションに記載されているプロトコール通りに単離したＲＮＡを、３Ｄ－Ｇｅｎｅ マイクロＲＮＡラベリングキット（Ｔｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）によって標識した。標識されたＲＮＡを、３Ｄ－Ｇｅｎｅ マイクロＲＮＡアレイプラットフォーム（２５６５ マイクロＲＮＡ、ｖｅｒ．２１、東レ社製）にハイブリダイズさせた。プローブのアノテーション及びオリゴヌクレオチド配列は、ｍｉＲＢａｓｅマイクロＲＮＡデータベース（http://www.mirbase.org/）に準拠した。
マイクロＲＮＡマイクロアレイを実行して、ランダムに選択されたＳＳ群の１０人とＨＣ群の１０人から、プールされた含嗽液中の発現量が異なるマイクロＲＮＡを特定した。「ＲＮＡ単離」のセクションに記載されているプロトコール通りに単離したＲＮＡを、３Ｄ－Ｇｅｎｅ マイクロＲＮＡラベリングキット（Ｔｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）によって標識した。標識されたＲＮＡを、３Ｄ－Ｇｅｎｅ マイクロＲＮＡアレイプラットフォーム（２５６５ マイクロＲＮＡ、ｖｅｒ．２１、東レ社製）にハイブリダイズさせた。プローブのアノテーション及びオリゴヌクレオチド配列は、ｍｉＲＢａｓｅマイクロＲＮＡデータベース（http://www.mirbase.org/）に準拠した。
【0071】
厳密に洗浄した後、蛍光シグナルを３Ｄ－Ｇｅｎｅ Ｓｃａｎｎｅｒ（東レ社製）でスキャンし、３Ｄ－Ｇｅｎｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（東レ社製）を使用して分析した。各スポットの生データは、すべてのブランクスポットの信号強度によって決定されたバックグラウンド信号の平均強度を９５％の信頼区間で置き換えることによって正規化した。バックグラウンド信号強度の２標準偏差を超える信号強度のスポットの測定を有効とみなした。マイクロアレイ実験を通して有効なスポットの信号強度を比較することにより、マイクロＲＮＡの相対的な発現レベルを計算した。データは、シグナル強度の中央値が２５に調整されるように、アレイごとにグローバルに正規化した。相対的なハイブリダイゼーション強度とバックグラウンドハイブリダイゼーション値を算出した。ＳＳ群の結果をＨＣ群の結果と比較し、有意な差を＞２．０倍又は＜０．５倍と定義した。
【0072】
（リアルタイムＰＣＲ）
マイクロＲＮＡマイクロアレイの結果、ＳＳ群とＨＣ群との間で有意に発現量に差があったマイクロＲＮＡは３０２種類であった。３０２種類から過去の報告及びプライマーの入手可否を参考に表１に示す１２種類を候補マイクロＲＮＡとして選択した。１２種の候補マイクロＲＮＡの発現量を、メーカーのプロトコールに従い次のように測定した。
マイクロＲＮＡマイクロアレイの結果、ＳＳ群とＨＣ群との間で有意に発現量に差があったマイクロＲＮＡは３０２種類であった。３０２種類から過去の報告及びプライマーの入手可否を参考に表１に示す１２種類を候補マイクロＲＮＡとして選択した。１２種の候補マイクロＲＮＡの発現量を、メーカーのプロトコールに従い次のように測定した。
【0073】
ＴａｑＭａｎ（商標） マイクロＲＮＡＡｓｓａｙｓとＴａｑＭａｎ（商標） ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し（表２参照）、リアルタイムＰＣＲにてＳＳ群２４人とＨＣ群２４人それぞれの含嗽液におけるエクソソーム由来の候補マイクロＲＮＡの発現を比較した。
【0074】
まず、各マイクロＲＮＡに対する特異的ＲＴプライマーを含む逆転写酵素をチューブ内で混合した。次にＲＴの条件を設定し（プレートを１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、及び８５℃で５分間インキュベートし、その後は４℃で保持）、それぞれ反応させた。ＲＴ反応の生成物は、使用するまで－２０℃で保存した。ＰＣＲサイクリング条件は、９５℃で１０分間を１サイクル、続いて９５℃で１５秒間と６０℃で６０秒間とを４５サイクルとした。Ｃｔ値は、ＭｘＰｒｏ Ｍｘ３０００Ｐｖｅｒ．４．０ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって計算されたバックグラウンドをベースとした閾値で決定した。マイクロＲＮＡの統一された内因性コントロールがないため、本研究ではｈｓａ－ｍｉ２４とｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐを選択した。ｈｓａ－ｍｉＲ－２４は内因性コントロールとしての報告があり、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐはマイクロＲＮＡマイクロアレイにてＳＳ群とＨＣ群の間で発現量の変化を示さなかったものである。
【0075】
【表2】
【0076】
また、リアルタイムＰＣＲによって内因性コントロールマイクロＲＮＡの発現レベルを分析し、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４とｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐの平均値を内因性コントロールとして選択した。各検体における標的マイクロＲＮＡの発現量（コントロールと比較した相対的発現量）を、以下の式を使用した２－ｄｄＣｔ法（ＣＴ＝サイクル閾値）にて評価した。
ｄｄＣＴ ＳＳ ｐａｔｉｅｎｔ＝ＣＴ ｐａｔｉｅｎｔ－ＣＴ Ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ（ｈｓａ－ｍｉＲ－２４ ａｎｄ ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ）－ｄＣＴ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｄＣＴ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ＝Ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ［ＣＴ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＴ Ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ（ｈｓａ－ｍｉＲ－２４ ａｎｄ ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ）］
ｄｄＣＴ ＳＳ ｐａｔｉｅｎｔ＝ＣＴ ｐａｔｉｅｎｔ－ＣＴ Ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ（ｈｓａ－ｍｉＲ－２４ ａｎｄ ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ）－ｄＣＴ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｄＣＴ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ＝Ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ［ＣＴ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＴ Ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ（ｈｓａ－ｍｉＲ－２４ ａｎｄ ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ）］
【0077】
（統計分析）
ＳＳ群とＨＣ群との間で、候補マイクロＲＮＡのリアルタイムＰＣＲで定量した相対的発現量をｔ検定で比較した。発現量がＨＣ群と比較して有意に増加していた各マイクロＲＮＡについて、発現量の適切なカットオフ値を取得するために、ＲＯＣ曲線分析によって評価した。
ＳＳ群とＨＣ群との間で、候補マイクロＲＮＡのリアルタイムＰＣＲで定量した相対的発現量をｔ検定で比較した。発現量がＨＣ群と比較して有意に増加していた各マイクロＲＮＡについて、発現量の適切なカットオフ値を取得するために、ＲＯＣ曲線分析によって評価した。
【0078】
ＲＯＣ曲線分析によって得られたカットオフ値を用いてＳＳ群とＨＣ群それぞれの標本を２分割し、フィッシャー検定を用いて、候補マイクロＲＮＡの発現量に加え、年齢及び性別を変数として、変数と疾患との関連を評価した。より正確にＳＳを検出するために、ロジスティック回帰分析を使用して組み合わせ分析を実行した。
【0079】
すべての検定は事前にＳｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ検定で２群のデータが正規分布に従うかどうかを確認し、正規分布する場合はＬｅｖｅｎ検定で等分散性を確認した後に、適切な検定を適用した。上記の統計分析は、ＳＰＳＳソフトウェアバージョン２６を用いて実施した。すべての検定の有意水準はｐ＝０．０５とした。
【0080】
（結果）
リアルタイムＰＣＲの結果、図３に示すように、ＳＳ群におけるｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ（Ａ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（Ｂ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（Ｃ）及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８（Ｄ）の発現量がＨＣ群と比較して有意に増加していた。
リアルタイムＰＣＲの結果、図３に示すように、ＳＳ群におけるｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ（Ａ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０（Ｂ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（Ｃ）及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８（Ｄ）の発現量がＨＣ群と比較して有意に増加していた。
【0081】
ＲＯＣ曲線分析の結果を図４に示す。ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０及びｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐの３種類のマイクロＲＮＡにおいてＡＵＣが０．７を超えた。
【0082】
統計分析により、表３に示すｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０及びｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐの組み合わせが特定された。得られた回帰式を用いて、個々の検体のＳＳインデックスを算出した。
【0083】
【表3】
【0084】
Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｔｎｅｙ Ｕ検定で、ＳＳ群とＨＣ群のＳＳインデックスの差を評価したところ、図５（Ａ）に示すように統計的に有意であった。ＳＳインデックスの判定性能をＲＯＣ曲線で評価したところ、図５（Ｂ）に示すようにＡＵＣが０．８５６で、統計的に有意であった。
【0085】
図５（Ｂ）に示すＲＯＣ曲線にて求めたカットオフ値を判定指標にしたところ、表４に示すように、感度：９１．７％、特異度：８３．３％、陽性的中率：８４．６％、陰性的中率：９０．９％となり、高い判定精度を示した。
【0086】
【表4】
【0087】
ＳＳの診断では、抗ＳＳ－Ａ抗体、抗ＳＳ－Ｂ抗体、リウマトイド因子及び抗核抗体といった様々な自己抗体が使用されている。これら自己抗体に関して報告されたＳＳ罹患の判定における感度、特異度、陽性的中率及び陰性的中率（Ｍａｎｕｅｌ Ｒａｍｏｓ－Ｃａｓａｌｓ ｅｔ ａｌ．，２００２年；８１：２８１）と本実施例に係るＳＳインデックスとの比較を次の表５に示す。ＳＳインデックスによる判定は、自己抗体と同等以上の精度であった。
【0088】
【表5】
【0089】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【0090】
本発明は、シェーグレン症候群の検査、診断及び治療に好適である。
【符号の説明】
【0091】
１ 判定部、２ 出力部、１０ 記憶部、１１ ＳＳ判定プログラム、２０ ＲＡＭ、３０ 入力装置、４０ 表示装置、５０ ＣＰＵ、６０ バス、１００ ＳＳ検査装置
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】