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特開2022-127591パルボウイルスの構造タンパク質およびウイルス様粒子ワクチン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022127591
(43)【公開日】2022-08-31
(54)【発明の名称】パルボウイルスの構造タンパク質およびウイルス様粒子ワクチン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220824BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20220824BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220824BHJP
C07K 14/015 20060101ALI20220824BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220824BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220824BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220824BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220824BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220824BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220824BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220824BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220824BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220824BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220824BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220824BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/35
C07K19/00
C07K14/015
C12N7/01
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K35/76
A61P37/04
A61P43/00 111
A61K48/00
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022016204
(22)【出願日】2022-02-04
(31)【優先権主張番号】P 2021025307
(32)【優先日】2021-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000173692
【氏名又は名称】一般財団法人阪大微生物病研究会
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 明男
(72)【発明者】
【氏名】吉田 明日香
(72)【発明者】
【氏名】野口 貴史
(72)【発明者】
【氏名】蝦名 博貴
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA31
4B065CA44
4B065CA45
4B065CA46
4C084AA13
4C084MA02
4C084MA22
4C084MA23
4C084MA31
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA41
4C084MA43
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA58
4C084MA59
4C084MA60
4C084MA63
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZC022
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZC02
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZC02
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA01
4H045DA86
4H045DA89
4H045EA29
4H045FA74
4H045GA15
4H045GA23
(57)【要約】
【課題】パルボウイルスの免疫原性が良好である新たな構造タンパク質およびウイルス様粒子を提供する。
【解決手段】受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性領域とを有するパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１のＮ末端に、１個以上５個以下のＲＢＤがさらに付加された構造タンパク質およびこれを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。
【選択図】図１
【解決手段】受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性領域とを有するパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１のＮ末端に、１個以上５個以下のＲＢＤがさらに付加された構造タンパク質およびこれを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
受容体結合ドメインとホスホリパーゼＡ２活性領域とを有するパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１のＮ末端に、１個以上５個以下の前記受容体結合ドメインがさらに付加された構造タンパク質。
【請求項2】
１個以上３個以下の前記受容体結合ドメインが付加された、請求項１に記載の構造タンパク質。
【請求項3】
前記ホスホリパーゼＡ２活性領域において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された、請求項１または２に記載の構造タンパク質。
【請求項4】
前記パルボウイルスは、ヒトパルボウイルスＢ１９である、請求項１～３のいずれか１項に記載の構造タンパク質。
【請求項5】
ウイルス様粒子形成能を有し、（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むパルボウイルスの構造タンパク質；
（ａ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
（ａ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の構造タンパク質とパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ２とを含む、ウイルス様粒子。
【請求項7】
野生型ウイルス様粒子よりもホスホリパーゼＡ２活性が減弱した、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載の構造タンパク質をコードする核酸。
【請求項9】
請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項10】
請求項８に記載の核酸または請求項９に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項11】
請求項６もしくは７に記載のウイルス様粒子、請求項８に記載の核酸、または請求項９に記載のベクターを含む免疫原性組成物。
【請求項12】
請求項１０に記載の細胞を培養する工程および前記細胞から産生されたウイルス様粒子を回収する工程を含む、ウイルス様粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、パルボウイルスの構造タンパク質およびウイルス様粒子ワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトパルボウイルスＢ１９は、小児伝染性紅斑（リンゴ病）の原因ウイルスとして知られており、患者の９０％は９歳までの小児である。ヒトパルボウイルスＢ１９は、成人にも感染し、発熱、皮疹、関節炎など様々な症状を引き起こす。ヒトパルボウイルスＢ１９感染症の予後は一般的には良好である。しかしながら、妊娠初期の女性がヒトパルボウイルスＢ１９に感染すると、母子感染により高い確率で流産や胎児水腫を引き起こす。
【0003】
ヒトパルボウイルスＢ１９は、パルボウイルス科エリスロウイルス属に属し、約５５００塩基からなる一本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムを有する。ゲノムには、構造タンパク質（ＶＰ１およびＶＰ２）、非構造タンパク質（ＮＳ１）およびいくつかの小タンパク質がコードされている。ヒトパルボウイルスＢ１９は、ウイルスゲノムおよび２つの構造タンパク質から、直径約２３ｎｍの正二十面体構造を有するウイルス粒子を形成する。パルボウイルスのウイルス粒子はエンベロープをもたないため、エタノール、有機溶媒および石鹸に抵抗性を有し、熱処理（例えば６０℃３０分）にも安定である。
【0004】
これまで、ヒトパルボウイルスＢ１９のワクチンおよび二次感染予防策は実用化されていない。ヒトパルボウイルスＢ１９は、培養細胞での増殖が難しく、ウイルスの培養系や動物感染モデルも存在しないため、弱毒生ウイルスワクチンまたは不活化ウイルスワクチンを生産することが困難である。このため、ワクチン候補として、ウイルス粒子に類似した構造を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）が挙げられる。ＶＬＰは体内で増殖しないため、安全性の観点からワクチンに適する。一方でＶＬＰは、組み換えタンパク質を抗原とするワクチンまたは核酸ワクチンと比較すると高い免疫原性が期待できるものの、弱毒生ウイルスワクチンまたは不活化ウイルスワクチンと比べると、免疫原性は十分とは言い難い。特許文献１～３および非特許文献１には、ヒトパルボウイルスＢ１９のＶＬＰを作製する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１１／１２７３１６号
【特許文献2】国際公開第９０／０５５３８号
【特許文献3】国際公開第２０１４／１２５０５３号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１１，Ｏｃｔｏｂｅｒ ６；２９（４３）：７３５７－７３６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
パルボウイルスに対するワクチンの開発のためには、免疫原性が良好な抗原が必要である。本発明は、パルボウイルスの免疫原性が良好である新たな構造タンパク質およびＶＬＰを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性領域とを有するパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１のＮ末端に、１個以上５個以下の前記受容体結合ドメインがさらに付加された構造タンパク質に関する。また、本発明の一例に係る構造タンパク質は、ＰＬＡ２活性領域に変異を含むことにより、好ましくは野生型のＶＬＰよりもＰＬＡ２活性が減弱、より好ましくはＰＬＡ２活性が欠失したＶＬＰを形成することができる。
【0009】
本発明は、以下に例示される項目に関する。
［１］ 受容体結合ドメインとホスホリパーゼＡ２活性領域とを有するパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１のＮ末端に、１個以上５個以下の前記受容体結合ドメインがさらに付加された構造タンパク質。
［２］ １個以上３個以下の前記受容体結合ドメインが付加された、［１］に記載の構造タンパク質。
［３］ 前記ホスホリパーゼＡ２活性領域において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された、［１］または［２］に記載の構造タンパク質。
［４］ 前記パルボウイルスは、ヒトパルボウイルスＢ１９である、［１］～［３］のいずれかに記載の構造タンパク質。
［５］ ウイルス様粒子形成能を有し、（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むパルボウイルスの構造タンパク質；
（ａ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
［６］ ［１］～［５］のいずれかに記載の構造タンパク質とパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ２とを含む、ウイルス様粒子。
［７］ 野生型ウイルス様粒子よりもホスホリパーゼＡ２活性が減弱した、［６］に記載のウイルス様粒子。
［８］ ［１］～［５］のいずれかに記載の構造タンパク質をコードする核酸。
［９］ ［８］に記載の核酸を含むベクター。
［１０］ ［８］に記載の核酸または［９］に記載のベクターが導入された細胞。
［１１］ ［６］もしくは［７］に記載のウイルス様粒子、［８］に記載の核酸、または［９］に記載のベクターを含む免疫原性組成物。
［１２］ ［１０］に記載の細胞を培養する工程および前記細胞から産生されたウイルス様粒子を回収する工程を含む、ウイルス様粒子の製造方法。
［１］ 受容体結合ドメインとホスホリパーゼＡ２活性領域とを有するパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１のＮ末端に、１個以上５個以下の前記受容体結合ドメインがさらに付加された構造タンパク質。
［２］ １個以上３個以下の前記受容体結合ドメインが付加された、［１］に記載の構造タンパク質。
［３］ 前記ホスホリパーゼＡ２活性領域において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された、［１］または［２］に記載の構造タンパク質。
［４］ 前記パルボウイルスは、ヒトパルボウイルスＢ１９である、［１］～［３］のいずれかに記載の構造タンパク質。
［５］ ウイルス様粒子形成能を有し、（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むパルボウイルスの構造タンパク質；
（ａ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
［６］ ［１］～［５］のいずれかに記載の構造タンパク質とパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ２とを含む、ウイルス様粒子。
［７］ 野生型ウイルス様粒子よりもホスホリパーゼＡ２活性が減弱した、［６］に記載のウイルス様粒子。
［８］ ［１］～［５］のいずれかに記載の構造タンパク質をコードする核酸。
［９］ ［８］に記載の核酸を含むベクター。
［１０］ ［８］に記載の核酸または［９］に記載のベクターが導入された細胞。
［１１］ ［６］もしくは［７］に記載のウイルス様粒子、［８］に記載の核酸、または［９］に記載のベクターを含む免疫原性組成物。
［１２］ ［１０］に記載の細胞を培養する工程および前記細胞から産生されたウイルス様粒子を回収する工程を含む、ウイルス様粒子の製造方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、パルボウイルスの免疫原性が良好である新たな構造タンパク質およびＶＬＰを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】パルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１およびＶＰ２、ならびにＲＢＤが付加されたＶＰ１およびＶＰ２の構造を示す様式図である。
【図2】実験１において作製された、ヒトパルボウイルスＢ１９のＶＰ１ ｗｔおよびＶＰ２ ｗｔ、ならびにＲＢＤが付加されたＶＰ１およびＶＰ２（「ＲＢＤ付加タンパク質」ともいう。）の発現プラスミドの構造を示す様式図である。
【図3】実験２において、ＶＰ１ ｗｔまたはＲＢＤ付加タンパク質を含むＶＬＰについてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後のＣＢＢ染色図である。
【図4】実験２において、ＶＬＰ中に含まれるＶＰ１ ｗｔまたはＲＢＤ付加タンパク質の割合を示すグラフである。
【図5】実験３において、ＶＰ１ ｗｔまたは２ＲＢＤ－ＶＰ１を含むＶＬＰを投与したマウスから採取した血清中の抗体価を示すグラフである。
【図6】実験４において、ＶＰ１ ｗｔまたはＲＢＤ付加タンパク質を含むＶＬＰを投与したマウスから採取した血清のパルボウイルス中和活性を感染率の低下によって評価するグラフである。
【図7】実験５において、ＶＰ１のＰＬＡ２活性領域の欠失部位を示す様式図である。
【図8】実験５において、ＶＰ１ ｗｔ、２ＲＢＤ－ＶＰ１または２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２を含むＶＬＰについてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後のＣＢＢ染色図である。
【図9】実験５において、ＶＬＰ中に含まれるＶＰ１ ｗｔ、２ＲＢＤ－ＶＰ１または２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２の割合を示すグラフである。
【図10】実験６において、２ＲＢＤ－ＶＰ１または２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２を含むＶＬＰを投与したマウス血清中の抗体価を示すグラフである。
【図11】実験７において、ＶＰ１ ｗｔ、２ＲＢＤ－ＶＰ１または２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２を含むＶＬＰのＰＬＡ２活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
＜構造タンパク質＞
パルボウイルスの構造タンパク質には、ＶＰ１およびＶＰ２が存在する。ＶＰ１は、図１のＶＰ１ ｗｔに示すように受容体結合ドメインとホスホリパーゼＡ２活性領域とを有する。本発明に係る構造タンパク質は、パルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１のＮ末端に、１個以上５個以下のＲＢＤがさらに付加された構造タンパク質である。本発明者らは、ＲＢＤ付加箇所としてＶＰ１のＮ末端を選択し、当該箇所に１個以上５個以下のＲＢＤを付加することで、優れた免疫原性を示すことを見出した。すなわち、本発明に係る構造タンパク質は、図１の１ＲＢＤ－ＶＰ１に例示されるように、Ｎ末端に２個以上のＲＢＤを有する。本明細書においてＲＢＤが付加されたＶＰ１を「ＲＢＤ付加ＶＰ１」ということがある。
パルボウイルスの構造タンパク質には、ＶＰ１およびＶＰ２が存在する。ＶＰ１は、図１のＶＰ１ ｗｔに示すように受容体結合ドメインとホスホリパーゼＡ２活性領域とを有する。本発明に係る構造タンパク質は、パルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１のＮ末端に、１個以上５個以下のＲＢＤがさらに付加された構造タンパク質である。本発明者らは、ＲＢＤ付加箇所としてＶＰ１のＮ末端を選択し、当該箇所に１個以上５個以下のＲＢＤを付加することで、優れた免疫原性を示すことを見出した。すなわち、本発明に係る構造タンパク質は、図１の１ＲＢＤ－ＶＰ１に例示されるように、Ｎ末端に２個以上のＲＢＤを有する。本明細書においてＲＢＤが付加されたＶＰ１を「ＲＢＤ付加ＶＰ１」ということがある。
【0013】
本発明に係る構造タンパク質は、良好な免疫原性を有するＶＬＰを形成することができる。本発明に係る構造タンパク質は、単独でも有意な免疫応答を起こし得る。ＶＬＰの免疫原性は当業者に周知な方法で評価できるが、例えばマウスにＶＬＰを投与し、回収した血清が目的の抗体を有するか否かで評価できる。目的の抗体を有するか否かを評価するために、免疫抗原全長もしくはその一部の領域をコーティングしたプレートを用いたＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いることができる。目的の抗体としては、例えば中和抗体が挙げられ、中和エピトープ領域に対するＩｇＧ ＥＬＩＳＡを行うことで、当該抗体の有無を評価することができる。パルボウイルスがヒトパルボウイルスＢ１９であるとき、ＶＰ１の中和エピトープ領域は当業者に公知のいずれの箇所であってよく、例えば配列番号１の１－９０アミノ酸領域であってよい。
【0014】
付加されるＲＢＤ（本明細書において「付加領域」ということがある。）は、好ましくは１個以上５個以下であり、４個以下または３個以下であってもよく、２個であってもよい。パルボウイルスのＶＰ１にＲＢＤが多く付加された構造タンパク質を含むＶＬＰは、ＲＢＤが付加されていない野生型のパルボウイルスＶＰ１を含むＶＬＰ（本明細書において、「野生型のＶＬＰ」ということがある。）より免疫原性が高くなる傾向がある。しかしながら、付加されるＲＢＤの個数が多すぎると、ＶＬＰを構成しにくくなるおそれがある。本発明に係る構造タンパク質は、パルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１のＮ末端に１個以上５個以下のＲＢＤ、好ましくは１個以上３個以下のＲＢＤを付加することで、ＲＢＤを付加しても良好なウイルス様粒子形成能を有する。ウイルス様粒子形成能とは、ウイルス様粒子を形成し得る能力をいう。例えば、パルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ２と組み合わせることでＶＬＰを形成し得るＲＢＤ付加ＶＰ１は、ウイルス様粒子形成能を有する。ＶＬＰの形成の有無は、後述の＜ＶＬＰ＞の段落に記載の方法で確認できる。
【0015】
付加されたＲＢＤとＶＰ１との間、および複数のＲＢＤが付加されている場合は付加されたＲＢＤ同士は、適切な長さのリンカーペプチドによって接続されていてもよい。リンカー配列は、例えば１アミノ酸残基以上２０アミノ酸残基以下であってよく、１０アミノ酸残基以下であってもよい。リンカー配列はグリシンリッチな配列でもよく、例えばＧＧＧＧＧＧ配列を含んでもよい。本明細書において、アミノ酸残基を一文字表記で表すことがある。
【0016】
ヒトパルボウイルスＢ１９のゲノムは、ウイルス粒子を構成する構造タンパク質であるＶＰ１およびＶＰ２をコードする。ＶＰ１とＶＰ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は重なっており、ＶＰ１はＶＰ２をコードする配列の上流にＲＢＤおよびＰＬＡ２活性領域がコードされている。ＶＰ１は、図１に示すようにＮ末端側から順にＲＢＤおよびＰＬＡ２活性領域を含むＶＰ１ユニーク領域、ならびにＶＰ２との共通領域から構成される。パルボウイルスＢ１９－Ｊ３５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ３８６３３０）のＶＰ１およびＶＰ２のアミノ酸配列を配列番号１および配列番号２にそれぞれ示す。上記パルボウイルスＢ１９のＲＢＤは、ＶＰ１の５番目～８０番目の７６アミノ酸残基（配列番号３）からなる。上記パルボウイルスＢ１９のＰＬＡ２活性領域は、ＶＰ１の１３０番目～１９５番目の６６個のアミノ酸残基（配列番号４）からなる。本明細書において、単に「ＶＬＰ」、「ＶＰ１」、「ＶＰ２」、「ＲＢＤ」および「ＰＬＡ２活性領域」というときは、それぞれパルボウイルスのＶＬＰ、ＶＰ１、ＶＰ２、ＲＢＤおよびＰＬＡ２活性領域をさす。
【0017】
ヒトパルボウイルスＢ１９の受容体は、赤血球膜表面にあるＰ抗原であり、ヒトパルボウイルスＢ１９は、Ｐ抗原保有細胞、特に赤芽球前駆細胞に感染し、増殖する。パルボウイルスを抗原として誘導される抗体のうち、ＶＰ１ユニーク領域に含まれるＲＢＤに対する抗体が感染防御に重要であるが、ＲＢＤ単独では免疫原性を有さない。
【0018】
本発明に係る構造タンパク質は、ＰＬＡ２活性領域において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されることにより、ＰＬＡ２活性領域に変異を含むことが好ましい。パルボウイルスの粒子はＰＬＡ２活性領域を粒子の内側に有するためＰＬＡ２活性を示さない。一方、ウイルス粒子とは一部異なる構造を有するＶＬＰは、ＰＬＡ２活性領域を粒子の外側に有するためＰＬＡ２活性を示す（Ｒｏｓ ｅｔ ａｌ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｄｅｃ．２００６，ｐ．１２０１７－１２０２４）。ＰＬＡ２活性領域に変異を含む構造タンパク質は、好ましくはＰＬＡ２活性が減弱、より好ましくは欠失したＶＬＰを形成することができ、炎症反応が低減されやすくなるため、ワクチンとしての安全性を向上させることができる。
【0019】
ヒトパルボウイルスＢ１９のＰＬＡ２活性領域は、一般的な分泌型ＰＬＡ２に存在するＨＤＸＸＹモチーフを有する。ヒトパルボウイルスＢ１９のＰＬＡ２活性中心は、ＶＰ１の１５３番目から１６４番目のアミノ酸（ＨＤＦＲＹＳＱＬＡＫＬＧ）であると報告されている（Ｂｏｎｓｃｈ ｅｔ ａｌ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｄｅｃ．２００８，ｐ．１１７８４－１１７９１）。ＰＬＡ２活性領域において、ＶＰ１の１３０（Ｙ）、１３２（Ｇ）、１５３（Ｈ）、１５４（Ｄ）、１５７（Ｙ）、１６２（Ｋ）、１６８（Ｙ）、１７５（Ｄ）、１９５（Ｄ）番目のアミノ酸が特にＰＬＡ２活性に関与すると報告されている（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ ８，Ｉｓｓｕｅ ４，ｅ６１４４０）。本発明に係る構造タンパク質は、これらのアミノ酸のうち少なくとも１つが欠失もしくは置換またはＰＬＡ２活性領域に任意のアミノ酸が挿入もしくは付加されていることが好ましい。ＰＬＡ２活性領域におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加は、ＶＬＰ形成能に影響を与えないことが好ましい。また、ＰＬＡ２活性領域におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加は、ＶＬＰの免疫原性を低下させないことが好ましい。本発明では、ＰＬＡ２活性領域の一部に変異を挿入することで、ＶＬＰ形成能及び免疫原性を保った状態で、ＰＬＡ２活性を減弱または欠失し得ることを見出した。変異を挿入する箇所としては、ＶＬＰ形成能及び免疫原性を保った状態で、ＰＬＡ２活性を減弱または欠失し得る箇所であれば問わないが、ＰＬＡ２活性領域の一部を含む１４１番目から１５９番目のアミノ酸が好ましい。ＶＰ１の１４１番目から１５９番目において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていることが好ましく、ＶＰ１の１４１番目から１５９番目のアミノ酸の少なくとも１個が欠失していることがより好ましく、１４１番目から１５９番目のアミノ酸が全て欠失していてもよい。ＰＬＡ２活性領域の一部を欠失させた領域は、適切な長さのリンカーペプチドによって接続されていてもよい。リンカー配列は、例えば１アミノ酸残基以上２０アミノ酸残基以下であってよく、１０アミノ酸残基以下であってもよい。リンカー配列は、グリシンリッチな配列でもよく、例えばＧＧＧＧＧＧ配列を含んでもよい。
【0020】
本明細書において、パルボウイルスは、哺乳動物種（例えば、ヒト、イヌ、ニワトリ、ネコ、マウス、ブタ、アライグマ、ミンク、キルハムラット、ウサギ）に関連する全てのパルボウイルスを含んでよい。パルボウイルスは、広範には、パルボウイルス科ファミリーの全ての属、例えばパルボウイルス属、ディペンドウイルス属、エリスロウイルス属、ボカウイルス属を含んでよい。パルボウイルス属は、例えばイヌパルボウイルス、ネコパルボウイルスを含む。ディペンドウイルス属は、アデノ随伴ウイルスを含む。エリスロウイルスは、ヒトパルボウイルスＢ１９を含む。ボカウイルス属はウシパルボウイルス、イヌ微小ウイルスを含む。パルボウイルスは、好ましくはヒトに感染するディペンドウイルス属、エリスロウイルス属またはボカウイルス属であり、より好ましくはヒトパルボウイルスＢ１９である。いくつかの実施形態において、パルボウイルスは、パルボウイルス属由来である。パルボウイルスは、出願時には特徴づけられていない分離株も包含し得る。
【0021】
ヒトパルボウイルスＢ１９は、３つの別個の遺伝子型に細分され得ることが知られている。これらの遺伝子型間のヌクレオチドの相違は、およそ１０％であり、プロモーター領域においては２０％超である。以前よりヒトパルボウイルスＢ１９として公知であったウイルスは全て遺伝子型１として分類された。遺伝子型２は、比較的まれに見いだされる。遺伝子型２が見いだされる場合、およそ４０歳よりも高齢の個体においてはるかに高い頻度で同定される。遺伝子型３のウイルスは、原型（ｐｒｏｔｙｐｅ）株Ｖ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ００３４２１）および原型株Ｄ９１．１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０８３２３４）によって代表される２つのサブタイプに分類される。遺伝子型３のウイルスは、西アフリカのガーナに特有であることが示されており、ブラジルの特定の地域に存在する可能性もある。
【0022】
本明細書において、パルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１は、ヒトパルボウイルスＢ１９のＶＰ１に相当する構造タンパク質であってよく、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。パルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ１は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してもよい。本明細書において数個とは、例えば２～２０個、２～１０個、２～５個、または２～３個であってよい。
【0023】
本明細書において、パルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ２は、ヒトパルボウイルスＢ１９のＶＰ２に相当する構造タンパク質であってよく、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。パルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ２は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してもよい。
【0024】
本明細書において、パルボウイルスのＲＢＤは、ヒトパルボウイルスＢ１９のＶＰ１のＲＢＤに相当する領域であってよく、配列番号３に記載のアミノ酸配列と８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。パルボウイルスのＲＢＤは、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してもよい。
【0025】
本明細書において、パルボウイルスのＰＬＡ２活性領域は、ヒトパルボウイルスＢ１９のＶＰ１のＰＬＡ２活性領域に相当する領域であってよく、配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。パルボウイルスのＰＬＡ２活性領域は、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してもよい。
【0026】
本発明に係る構造タンパク質は、ウイルス様粒子形成能を有し、（ａ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含むパルボウイルスの構造タンパク質であってよい。配列番号５～７に記載されたアミノ酸配列は、それぞれヒトパルボウイルスＢ１９のＶＰ１のＮ末端に１個、２個または３個のＲＢＤが付加されたアミノ酸配列である。配列番号８～１０に記載されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５～７のアミノ酸配列からＰＬＡ２活性領域の一部が欠失したアミノ酸配列である。本発明に係る構造タンパク質は、配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列からなってもよい。
【0027】
本発明に係る構造タンパク質は、ウイルス様粒子形成能を有し、（ｂ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むパルボウイルスの構造タンパク質であってよい。本発明に係る構造タンパク質は、配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列と好ましくは９２％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。
【0028】
本発明に係る構造タンパク質は、ウイルス様粒子形成能を有し、（ｃ）配列番号５～１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むパルボウイルスの構造タンパク質であってよい。
【0029】
＜核酸＞
本発明に係る核酸は、本発明に係る構造タンパク質をコードする。本発明に係る核酸からは、上述の構造タンパク質を製造できる。核酸は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡであり、一本鎖または二本鎖であってよい。本発明に係る核酸は、本発明に係る構造タンパク質に対応する塩基配列の５’末端側に他のペプチドをコードする塩基配列を含んでいてもよく、塩基配列の３’末端に終止コドンを含んでいてもよく、イントロン配列を含んでもよい。
本発明に係る核酸は、本発明に係る構造タンパク質をコードする。本発明に係る核酸からは、上述の構造タンパク質を製造できる。核酸は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡであり、一本鎖または二本鎖であってよい。本発明に係る核酸は、本発明に係る構造タンパク質に対応する塩基配列の５’末端側に他のペプチドをコードする塩基配列を含んでいてもよく、塩基配列の３’末端に終止コドンを含んでいてもよく、イントロン配列を含んでもよい。
【0030】
本発明に係る核酸は、野生型のパルボウイルスが有する核酸配列に限定されず、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他のコドンに置換した塩基配列を含む核酸が含まれる。タンパク質の発現を向上させる観点から、本発明に係る核酸は、核酸が導入される細胞種、好ましくはヒト細胞に適するようにコドン出現頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更した塩基配列を含む核酸であってもよい。
【0031】
本実施形態に係る核酸は、化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによって得ることができる。
【0032】
本発明に係る核酸の例は、ヒトパルボウイルスＢ１９のＶＰ１をコードする核酸にＲＢＤの核酸配列が１～３個付加された核酸配列（配列番号１１～１３）および配列番号１２の核酸配列からＰＬＡ２活性領域の一部が欠失した核酸配列（配列番号１４）が挙げられる。配列番号１１～１４に示した核酸配列は、ヒトのコドンに最適化させた配列である。
【0033】
＜ベクター＞
本発明に係るベクターは、上述の核酸を含む。ベクターは、ＤＮＡを増幅、維持できる核酸分子であり、例えば発現ベクターおよびクローニングベクターが挙げられる。一例において、上述の核酸は、発現ベクターに挿入された形で宿主細胞などに導入され、本発明に係る構造タンパク質を発現できる。本発明に係るベクターは，通常の遺伝子工学的手法に準じて上述の核酸を適当な基本ベクター中に挿入して得ることができる。
本発明に係るベクターは、上述の核酸を含む。ベクターは、ＤＮＡを増幅、維持できる核酸分子であり、例えば発現ベクターおよびクローニングベクターが挙げられる。一例において、上述の核酸は、発現ベクターに挿入された形で宿主細胞などに導入され、本発明に係る構造タンパク質を発現できる。本発明に係るベクターは，通常の遺伝子工学的手法に準じて上述の核酸を適当な基本ベクター中に挿入して得ることができる。
【0034】
本発明に係るベクターは、ＶＰ２をコードする核酸をさらに含んでいてもよい。ＲＢＤ付加ＶＰ１遺伝子とＶＰ２遺伝子とは、異なるベクターに含まれていてもよいし、同一ベクター上に含まれていてもよい。同一ベクター上に、ＲＢＤ付加ＶＰ１遺伝子とＶＰ２遺伝子とを含むとき、１つのベクターの導入によりＲＢＤ付加ＶＰ１とＶＰ２との両方を宿主細胞内で発現することができる。
【0035】
ベクターは、例えば細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクター、人工染色体ベクターなどであってよい。ベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＥＴ系プラスミドベクターなどが挙げられる。具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合にはｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ２８ａ（＋）、ｐＥＴ３２などを挙げることができる。哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えばｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ＥＢウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを挙げることができる。
【0036】
発現ベクターは、組み込まれた遺伝子を発現するためのプロモーター配列を有してもよい。ベクターに組み込まれる核酸は、プロモーターが機能可能な状態でプロモーターの下流に挿入される。プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。宿主が大腸菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合、Ｇａｌ１／１０プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。宿主が植物細胞である場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーターなどが好ましい。
【0037】
発現ベクターとしては、上記の他に、目的によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子などの選択マーカー、複製起点などを含有しているものを用いることができる。
【0038】
例えば自律複製起点（ｏｒｉ）を有するベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。ＳＶ４０のｏｒｉが組み込まれたベクターは、例えばｏｒｉを欠失したＳＶ４０ゲノムで形質転換されたＣＯＳ細胞などに導入されると、細胞内でベクターのコピー数を非常に増大させることができる。
【0039】
＜細胞＞
本実施形態に係る細胞は、上述の核酸が導入された細胞である。核酸は、ベクターに含まれた形態で細胞に導入されてもよい。核酸が導入された細胞は、本発明に係る構造タンパク質を発現できる。核酸は細胞内で染色体外に保持されていてもよいし、宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよい。本発明に係る核酸または本発明に係るベクターは、好ましくは宿主細胞内で機能するプロモーターの制御下で遺伝子が発現可能な状態で保持されている。
本実施形態に係る細胞は、上述の核酸が導入された細胞である。核酸は、ベクターに含まれた形態で細胞に導入されてもよい。核酸が導入された細胞は、本発明に係る構造タンパク質を発現できる。核酸は細胞内で染色体外に保持されていてもよいし、宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよい。本発明に係る核酸または本発明に係るベクターは、好ましくは宿主細胞内で機能するプロモーターの制御下で遺伝子が発現可能な状態で保持されている。
【0040】
細胞に核酸を導入する方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオニックリポソーム法などの化学的手法；アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＨＶＪリポソームなどの生物学的手法；エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃などの物理的手法などが例示される。導入する細胞に応じて、適切な導入方法を選択することができる。
【0041】
核酸が導入される細胞としては、真核生物または原核生物の細胞を用いることができ、細菌、真菌、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞が挙げられる。細胞は、酵母、大腸菌、哺乳動物、鳥類または魚類の細胞であってよく、哺乳動物としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌなどが含まれる。核酸が導入される細胞としては当業者に周知な細胞を利用できるが、例えば、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞などが用いられる。
【0042】
＜ＶＬＰ＞
本発明に係るＶＬＰは、本発明に係る構造タンパク質およびパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ２を含む。本発明に係るパルボウイルスのＶＬＰは、ウイルスゲノムを含まない、非複製的かつ非感染性のウイルスの殻である。一般に、ウイルスの構造タンパク質であるＶＰ１にタンパク質またはペプチドが付加されるとＶＬＰが形成されにくくなるおそれがあるが、本発明に係るＶＬＰは、上述のＲＢＤ付加ＶＰ１およびパルボウイルスのＶＰ２を適切な細胞で発現させると自動的に形成され得る。本発明に係るＶＬＰは、任意のパルボウイルスのＲＢＤ付加ＶＰ１および任意のパルボウイルスのＶＰ２の組み合わせから形成されてよい。ＶＬＰの存在は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により粒子を直接観察する方法、密度勾配遠心分離により特徴的な密度のバンドの存在を確認する方法などの当業者に既知の方法で確認できる。ＶＬＰの粒子サイズおよび形状はばらつきが大きいため、ある対象について複数の手段でＶＬＰか否かを確認することもできる。本発明に係るＶＬＰは、免疫原性を有する。
本発明に係るＶＬＰは、本発明に係る構造タンパク質およびパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ２を含む。本発明に係るパルボウイルスのＶＬＰは、ウイルスゲノムを含まない、非複製的かつ非感染性のウイルスの殻である。一般に、ウイルスの構造タンパク質であるＶＰ１にタンパク質またはペプチドが付加されるとＶＬＰが形成されにくくなるおそれがあるが、本発明に係るＶＬＰは、上述のＲＢＤ付加ＶＰ１およびパルボウイルスのＶＰ２を適切な細胞で発現させると自動的に形成され得る。本発明に係るＶＬＰは、任意のパルボウイルスのＲＢＤ付加ＶＰ１および任意のパルボウイルスのＶＰ２の組み合わせから形成されてよい。ＶＬＰの存在は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により粒子を直接観察する方法、密度勾配遠心分離により特徴的な密度のバンドの存在を確認する方法などの当業者に既知の方法で確認できる。ＶＬＰの粒子サイズおよび形状はばらつきが大きいため、ある対象について複数の手段でＶＬＰか否かを確認することもできる。本発明に係るＶＬＰは、免疫原性を有する。
【0043】
本発明に係るＶＬＰは、好ましくは野生型のＶＬＰよりもＰＬＡ２活性が減弱しており、より好ましくはＰＬＡ２活性を有していない。ＰＬＡ２活性が減弱したＶＬＰは、対象に投与したときの安全性を向上させることができる。ＰＬＡ２活性の減弱とは、例えば天然（野生型）のＶＰ１を含むＶＬＰが有するＰＬＡ２活性の半分以下であり、好ましくは１／３以下、１／５以下または１／１０以下であってよい。ＰＬＡ２活性は、例えば後述の実施例において使用されるキットによって測定できる。ＰＬＡ２活性が減弱または欠失したＶＬＰは、上述の構造タンパク質において、ＶＰ１のＰＬＡ２活性領域の少なくとも一部に変異を有し、好ましくはＶＰ１の１４１番目から１５９番目において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加され、より好ましくはＶＰ１の１４１番目から１５９番目のアミノ酸の少なくとも１個が欠失し、例えば１４１番目から１５９番目のアミノ酸が全て欠失している構造タンパク質をＶＬＰの構成要素として使用することで得ることができる。ＰＬＡ２活性領域の一部を欠失させた領域は、適切な長さのリンカーペプチドによって接続されていてもよい。リンカー配列は、例えば１アミノ酸残基以上２０アミノ酸残基以下であってよく、１０アミノ酸残基以下であってもよい。リンカー配列は、グリシンリッチな配列でもよく、例えばＧＧＧＧＧＧ配列を含んでもよい。
【0044】
ＶＬＰには、ＲＢＤ付加ＶＰ１がＶＰ２と等量程度含まれていてもよいが、ＶＰ２よりも少ない量が含まれていてもよい。ＶＬＰ中のＲＢＤ付加ＶＰ１とＶＰ２との量比は、例えば５：９５～４０：６０であり、３０：７０、２０：８０または１０：９０であってもよい。ＶＬＰ中のＲＢＤ付加ＶＰ１とＶＰ２との量比は、例えば細胞に導入されるＲＢＤ付加ＶＰ１発現ベクターとＶＰ２発現ベクターの量、これらのベクター導入のタイミング、ベクターに含まれるプロモーターの種類、その他の転写調製因子などによって調製することができる。タンパク質の量比は、吸光度、蛍光度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などによって測定できる。
【0045】
＜ＶＬＰの製造方法＞
ＶＬＰを製造するための方法は当技術分野で公知である。一態様では、本発明に係る構造タンパク質をコードする核酸または当該核酸を含むベクターが導入された細胞を培養する工程および細胞から産生されたＶＬＰを回収する工程を含む。
ＶＬＰを製造するための方法は当技術分野で公知である。一態様では、本発明に係る構造タンパク質をコードする核酸または当該核酸を含むベクターが導入された細胞を培養する工程および細胞から産生されたＶＬＰを回収する工程を含む。
【0046】
細胞は、本発明に係る構造タンパク質を発現できる細胞である。細胞には、パルボウイルスのＶＰ２をコードする核酸または核酸を含むベクターが導入されている。同一細胞内でＲＢＤ付加ＶＰ１遺伝子とＶＰ２遺伝子とを含む細胞を培養することで、同一細胞内でＲＢＤ付加ＶＰ１とＶＰ２とが発現し、ＶＬＰが形成される。ＲＢＤ付加ＶＰ１遺伝子とＶＰ２遺伝子とは、同一ベクター内に含まれていてもよいし、異なるベクターに含まれていてもよい。ＲＢＤ付加ＶＰ１遺伝子とＶＰ２遺伝子とは、異なるプロモーターまたは異なる転写調節を受けることが好ましい。ＲＢＤ付加ＶＰ１遺伝子とＶＰ２遺伝子とは、同じタイミングまたは異なるタイミングで細胞に導入されてよい。
【0047】
細胞の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。例えば大腸菌またはバチルス属菌を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など；窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質；無機物としては、例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５～約８である。大腸菌の培養は、通常約１５～約４３℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。バチルス属菌の培養は、通常約３０～約４０℃で行なわれる。必要により、通気または撹拌を行ってもよい。
酵母を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地、０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５～約８である。培養は、通常約２０℃～約３５℃で行なわれる。必要に応じて、通気または撹拌を行ってもよい。
昆虫細胞を培養する場合の培地としては、例えばＧｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍに非働化した１０％ウシ胎児血清などの添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２～約６．４である。培養は、通常約２７℃で行なわれる。必要に応じて通気または撹拌を行ってもよい。
動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約５～約２０％のウシ胎児血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０培地、１９９培地などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６～約８である。培養は、通常約３０℃～約４０℃で行なわれる。必要に応じて通気または撹拌を行ってもよい。
植物細胞を培養する培地としては、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地などが用いられる。培地のｐＨは好ましくは約５～約８である。培養は、通常約２０℃～約３０℃で行なわれる。必要に応じて通気または撹拌を行ってもよい。
酵母を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地、０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５～約８である。培養は、通常約２０℃～約３５℃で行なわれる。必要に応じて、通気または撹拌を行ってもよい。
昆虫細胞を培養する場合の培地としては、例えばＧｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍに非働化した１０％ウシ胎児血清などの添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２～約６．４である。培養は、通常約２７℃で行なわれる。必要に応じて通気または撹拌を行ってもよい。
動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約５～約２０％のウシ胎児血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０培地、１９９培地などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６～約８である。培養は、通常約３０℃～約４０℃で行なわれる。必要に応じて通気または撹拌を行ってもよい。
植物細胞を培養する培地としては、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地などが用いられる。培地のｐＨは好ましくは約５～約８である。培養は、通常約２０℃～約３０℃で行なわれる。必要に応じて通気または撹拌を行ってもよい。
【0048】
ＶＬＰを回収する工程においては、宿主細胞の培養上清、宿主細胞の溶解物、宿主細胞のホモジネート、またはそれらの組み合わせからＶＬＰを回収すればよい。回収されたＶＬＰは、密度勾配遠心分離（例えばスクロースクッション、スクロース勾配、ＰＥＧ沈殿、ペレット形成など）、クロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィなど）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される精製方法を用いて精製することができる。
【0049】
＜免疫原性組成物＞
本発明は、上述のＶＬＰを含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、単一の型のＶＬＰ、または２種以上の異なるＶＬＰ、および目的に応じて１または複数の追加的なポリペプチド、タンパク質、他のウイルスのＶＬＰ等を含んでよい。本発明に係る構造タンパク質またはそれを含むＶＬＰは、抗原として、例えば、予防的なまたは治療的な免疫原性組成物中で、個別にまたは組み合わせて投与することができる。免疫原性組成物は、目的の効果を実現するために、２回以上追加投与してもよい（例えば、「初回刺激（ｐｒｉｍｅ）」投与、その後の１または複数の「追加刺激（ｂｏｏｓｔ）」）。同じ組成物を、１または複数の初回刺激ステップおよび１または複数の追加刺激ステップで投与してよい。初回刺激および追加刺激のために異なる組成物を用いてよい。
本発明は、上述のＶＬＰを含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、単一の型のＶＬＰ、または２種以上の異なるＶＬＰ、および目的に応じて１または複数の追加的なポリペプチド、タンパク質、他のウイルスのＶＬＰ等を含んでよい。本発明に係る構造タンパク質またはそれを含むＶＬＰは、抗原として、例えば、予防的なまたは治療的な免疫原性組成物中で、個別にまたは組み合わせて投与することができる。免疫原性組成物は、目的の効果を実現するために、２回以上追加投与してもよい（例えば、「初回刺激（ｐｒｉｍｅ）」投与、その後の１または複数の「追加刺激（ｂｏｏｓｔ）」）。同じ組成物を、１または複数の初回刺激ステップおよび１または複数の追加刺激ステップで投与してよい。初回刺激および追加刺激のために異なる組成物を用いてよい。
【0050】
本発明は、本発明に係る構造タンパク質をコードする核酸およびパルボウイルスＶＰ２をコードする核酸を含有する免疫原性組成物も提供し得る。ＲＢＤ付加ＶＰ１およびＶＰ２をコードする核酸を含有する免疫原性組成物において、核酸は、本明細書に記載の任意の核酸、例えば直鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、自己複製するＲＮＡなどであってよい。目的に応じて、核酸は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性および／または抵抗性を改善するために１または複数の修飾塩基を含有してよい。目的に応じて、核酸は、細胞による核酸の取り込みを容易にするため、および／またはヌクレアーゼ分解を低下させるために、１または複数の成分、例えばカチオン性の微小粒子またはナノ粒子、カチオン性脂質なども含んでよい。
【0051】
免疫原性組成物は、一般に、１または複数の薬学的に許容される賦形剤またはビヒクル、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどを、単独で、または組み合わせて含んでよい。免疫原性組成物は、典型的に、上記の成分に加えて、１または複数の薬学的に許容されるキャリアを含んでよい。このようなキャリアとしては、それ自体は、組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、典型的に、大型のゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸共重合体、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソームなど）などである。そのようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、補助的な物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを含んでよい。薬学的に許容される成分の考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において入手可能である。
【0052】
薬学的に許容される塩も、本発明の免疫原性組成物において用いることができる。塩としては、例えば無機塩類または有機酸の塩が挙げられ、無機塩類としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などが、有機酸の塩としては酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが挙げられる。
【0053】
目的に応じて、抗原は、リポソームおよび粒子キャリア、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチドｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）の微小粒子またはナノ粒子などに吸着させる、その中に閉じ込める、またはその他の方法でそれと結びつけることができる。抗原は、免疫原性を増強するために、キャリアタンパク質に結合体化することができる。Ｒａｍｓａｙら（２００１年）Ｌａｎｃｅｔ ３５７巻（９２５１号）：１９５～１９６頁；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９年）Ｖａｃｃｉｎｅ １７ Ｓｕｐｐｌ ２巻：Ｓ２８～３６頁；Ｂｕｔｔｅｒｙ＆Ｍｏｘｏｎ（２０００年）Ｊ Ｒ Ｃｏｌｌ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｌｏｎｄ ３４巻：１６３～１６８頁；Ａｈｍａｄ＆Ｃｈａｐｎｉｃｋ（１９９９年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １３巻：１１３～１３３頁、ｖｉｉ；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７巻：５６３～５６７頁；欧州特許第０４７７５０８号；米国特許第５，３０６，４９２；ＷＯ９８／４２７２１；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｃｒｕｓｅら編）ＩＳＢＮ ３８０５５４９３２６、特に１０巻：４８～１１４頁；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８または０１２３４２３３５Ｘを参照されたい。
【0054】
本発明の免疫原性組成物は、他の免疫調節剤と併せて投与することができる。例えば本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含んでよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩またはその組み合わせ、フロイントアジュバント、レチノイン酸、水中油エマルジョン、無機塩、サポニン、他のＶＬＰ、微生物誘導体（例えば、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性の誘導体、リピドＡ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ－リボシル化毒素およびその解毒された誘導体）、サイトカイン（インターロイキンを含む）、生体接着剤および粘膜接着剤（エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフェア、ポリ（アクリル酸）を含む）、微小粒子（例えば、ポリ（α－ヒドロキシ酸）から形成された直径約１００ｎｍ～約１５０μｍの粒子）、リポソーム、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物、ポリホスファゼン、ムラミルペプチド、イミダゾキノロン化合物等の公知のアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。これらのアジュバントは単独または組み合わせて含んでよい。本発明の免疫原性組成物は、投与する前にアジュバントと予め混合することもできる。本発明の一態様は、免疫原性組成物の製造における上記構造タンパク質またはそれを含むＶＬＰの使用である。
【0055】
＜免疫原性組成物の投与＞
本発明の免疫原性組成物の投与方法としては、特に限定されず、直腸内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口投与や経口投与等のいずれであってもよい。本発明の免疫原性組成物の剤型としては特に限定されず、注射剤、乳剤、座剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。なお、投与回数および投与間隔については、適宜決定することができる。
本発明の免疫原性組成物の投与方法としては、特に限定されず、直腸内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口投与や経口投与等のいずれであってもよい。本発明の免疫原性組成物の剤型としては特に限定されず、注射剤、乳剤、座剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。なお、投与回数および投与間隔については、適宜決定することができる。
【0056】
本発明の免疫原性組成物は、哺乳動物、例えば、マウス、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトなどに投与する。また、本発明の組成物は、使用される特定の組成物と適合する様式で、かつ免疫応答を誘導するために有効な量で投与できる。
【0057】
免疫原性組成物中のタンパク質の詳細な投与量は、特に限定されないが、免疫原性組成物を投与する哺乳動物の種、年齢、および全身状態、ならびに組成物の投与形式を含めた多くの因子に左右され得る。本発明の免疫原性組成物の有効量は、常套的な実験のみを用いて容易に決定することができる。適切な用量を同定するためにｉｎ ｖｉｔｒｏモデルおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルを用いることができる。一般に、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇまたは５０ｍｇのパルボウイルスポリペプチドまたはＶＬＰを、大型の哺乳動物、例えば、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトなどに投与できる。目的に応じて、共起刺激分子またはアジュバントも、組成物の投与前、投与後、または同時に投与することができる。
【0058】
本発明の組成物を投与することによって生じる、パルボウイルスに特異的な免疫応答は、投与量、投与経路、または投与回数などを変動させることによって増強することができる。
【0059】
＜免疫応答の効力を決定するための試験＞
免疫応答の効力を評価する１つの方式は、組成物を投与した後に、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答をモニターすることを伴う。
免疫応答の効力を評価する１つの方式は、組成物を投与した後に、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答をモニターすることを伴う。
【0060】
免疫応答の効力を調査する１つの方式は、組成物を投与した後に、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答をモニターすること（例えば、ＩｇＧ１生成レベルおよびＩｇＧ２ａ生成レベルをモニターすることなど）および／または粘膜免疫応答をモニターすること（例えば、ＩｇＡ生成レベルをモニターすることなど）を伴う。
【0061】
現在、パルボウイルス（例えば、ヒトパルボウイルスＢ１９）免疫原性組成物によって誘導される防御免疫を評価するための、承認された動物モデルはない。しかし、免疫原性組成物の免疫応答を誘導する能力は、適切な動物において評価することができる。
【0062】
＜医薬品としての免疫原性組成物の使用＞
本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物も提供する。医薬品は、哺乳動物における免疫応答を生じさせることができること（すなわち、免疫原性組成物である）が好ましく、ワクチンであることがより好ましい。本発明は、上述のＶＬＰを含むワクチンを哺乳動物に投与し、パルボウイルスの免疫応答を誘導する方法も提供する。本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための医薬品の製造における本発明の組成物の使用も提供する。医薬品は、ワクチンであることが好ましい。ワクチンを使用して、小児における伝染性紅斑、妊娠中の女性における胎児水腫または流産を予防および／または処置することが好ましい。
本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物も提供する。医薬品は、哺乳動物における免疫応答を生じさせることができること（すなわち、免疫原性組成物である）が好ましく、ワクチンであることがより好ましい。本発明は、上述のＶＬＰを含むワクチンを哺乳動物に投与し、パルボウイルスの免疫応答を誘導する方法も提供する。本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための医薬品の製造における本発明の組成物の使用も提供する。医薬品は、ワクチンであることが好ましい。ワクチンを使用して、小児における伝染性紅斑、妊娠中の女性における胎児水腫または流産を予防および／または処置することが好ましい。
【0063】
本発明は、本明細書に記載の組成物を用いて免疫応答を誘導、または増大させるための方法を提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、液性免疫および／または細胞性免疫を含んでよい（全身免疫および粘膜免疫を含む）。免疫応答は、追加刺激応答を含む。
【0064】
本発明は、有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための方法も提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、液性免疫および／または細胞性免疫を伴うことが好ましい。免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の一方または両方を含むことが好ましい。
【0065】
哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。ヒトは、小児、青年または成人であってよく、好ましくは就学前の小児または青年であり、より好ましくは乳幼児または妊娠前の女性である。
【0066】
＜キット＞
本発明に係るキットは、本発明に係るパルボウイルスＶＬＰを含む。キットは、本発明に係るＶＬＰ、核酸またはベクターを含む免疫原性組成物を含んでもよい。免疫原性組成物は、液体の形態であってもよく、凍結乾燥されていてもよい。キットは、１または複数の容器を含んでよい。組成物用の適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスティックを含めた種々の材料から形成されていてよい。容器は、滅菌アクセスポートを有してよい。容器は、例えば静脈内溶液バッグまたは注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアルであってよい。
本発明に係るキットは、本発明に係るパルボウイルスＶＬＰを含む。キットは、本発明に係るＶＬＰ、核酸またはベクターを含む免疫原性組成物を含んでもよい。免疫原性組成物は、液体の形態であってもよく、凍結乾燥されていてもよい。キットは、１または複数の容器を含んでよい。組成物用の適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスティックを含めた種々の材料から形成されていてよい。容器は、滅菌アクセスポートを有してよい。容器は、例えば静脈内溶液バッグまたは注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアルであってよい。
【0067】
キットは、薬剤的に許容できる緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、またはブドウ糖溶液などを含む第２の容器をさらに含んでよい。これは、他の薬学的に許容される処方用溶液、例えば、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジまたは他の送達デバイスなどを含めた、最終使用者にとって有用な他の材料も含有してよい。キットは、アジュバントを含む第３の成分をさらに含んでよい。
【0068】
キットは、免疫誘導する方法のため、または感染を処置するための使用説明書を含有する添付文書も含んでよい。キットは、本発明の免疫原性組成物を予め満たした送達デバイス、例えば、注射針を有する、または有さないシリンジを含んでもよい。
【0069】
本発明は、上記の方法によって生成される構造タンパク質またはＶＬＰを、パルボウイルスについて血清陽性を決定するための抗原として用いる診断用キットも提供し得る。診断用キットは、本明細書に記載の構造タンパク質またはＶＬＰの他に、個体がパルボウイルスに結合する抗体について血清陽性であるかどうかを決定するための１または複数の補助的な試薬を含有してよい。適切な補助的な試薬としては、例えば、緩衝液、二次抗体または検出抗体（例えば、標識された抗ヒト抗体、標識された抗イヌ抗体）、検出剤などが挙げられる。キットは、診断アッセイを実施するための説明書をさらに含んでよい。
【実施例0070】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0071】
実験１：ＲＢＤ付加ＶＰ１発現プラスミドのクローニング
パルボウイルスＢ１９－Ｊ３５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ３８６３３０）のＶＰ１およびＶＰ２について、ヒトのコドンに最適化された核酸（ｈＶＰ１：配列番号１５）および（ｈＶＰ２：配列番号１６）を、ｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ真核細胞発現ベクターに挿入し、図２のｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－ｈＶＰ１およびｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－ｈＶＰ２を得た。制限酵素サイトとして、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１を用いた。ｈＶＰ１遺伝子のＮ末端にＲＢＤ（配列番号１７）を１つ、２つまたは３つ付加し、図２のｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－１ＲＢＤ－ｈＶＰ１、ｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－２ＲＢＤ－ｈＶＰ１およびｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－３ＲＢＤ－ｈＶＰ１を作製した。１ＲＢＤ－ｈＶＰ１、２ＲＢＤ－ｈＶＰ１および３ＲＢＤ－ｈＶＰ１の核酸配列を配列番号１１～１３に示す。以上により、パルボウイルスのＶＰ１のＮ末端に１～３個のＲＢＤがさらに付加された構造タンパク質、具体的には図１に示す１ＲＢＤ－ＶＰ１：配列番号５、２ＲＢＤ－ＶＰ１：配列番号６、３ＲＢＤ－ＶＰ１：配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現プラスミドを得た。
パルボウイルスＢ１９－Ｊ３５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ３８６３３０）のＶＰ１およびＶＰ２について、ヒトのコドンに最適化された核酸（ｈＶＰ１：配列番号１５）および（ｈＶＰ２：配列番号１６）を、ｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ真核細胞発現ベクターに挿入し、図２のｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－ｈＶＰ１およびｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－ｈＶＰ２を得た。制限酵素サイトとして、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１を用いた。ｈＶＰ１遺伝子のＮ末端にＲＢＤ（配列番号１７）を１つ、２つまたは３つ付加し、図２のｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－１ＲＢＤ－ｈＶＰ１、ｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－２ＲＢＤ－ｈＶＰ１およびｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－３ＲＢＤ－ｈＶＰ１を作製した。１ＲＢＤ－ｈＶＰ１、２ＲＢＤ－ｈＶＰ１および３ＲＢＤ－ｈＶＰ１の核酸配列を配列番号１１～１３に示す。以上により、パルボウイルスのＶＰ１のＮ末端に１～３個のＲＢＤがさらに付加された構造タンパク質、具体的には図１に示す１ＲＢＤ－ＶＰ１：配列番号５、２ＲＢＤ－ＶＰ１：配列番号６、３ＲＢＤ－ＶＰ１：配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現プラスミドを得た。
【0072】
比較例として、ｈＶＰ２遺伝子のＮ末端にＲＢＤを１つまたは２つ付加し、図２のｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－１ＲＢＤ－ｈＶＰ２およびｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－２ＲＢＤ－ｈＶＰ２を作製した。１ＲＢＤ－ｈＶＰ２および２ＲＢＤ－ｈＶＰ２の核酸配列を配列番号１８および配列番号１９にそれぞれ示す。また、比較例として、ｈＶＰ１遺伝子のＣ末端にＲＢＤを１つ付加し、図２のｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ－ｈＶＰ１－１ＲＢＤを作製した。ｈＶＰ１－１ＲＢＤの核酸配列を配列番号２０に示す。ＲＢＤ同士、ＲＢＤとｈＶＰ１、またはＲＢＤとｈＶＰ２とは、配列番号２１に記載のリンカー配列（アミノ酸配列：ＧＧＧＧＧＧ、配列番号２２）を含む核酸配列によって接続した。すべてのプラスミドはサンガーシークエンス法にて遺伝子配列を決定した。以上により、図１に示す１ＲＢＤ－ＶＰ２：配列番号２３、２ＲＢＤ－ＶＰ２：配列番号２４およびＶＰ１－１ＲＢＤ：配列番号２５に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現プラスミドを得た。
【0073】
実験２：パルボウイルスＶＬＰの作製
ＶＰ１（ＶＰ１ ｗｔ）、１ＲＢＤ－ＶＰ１、２ＲＢＤ－ＶＰ１、３ＲＢＤ－ＶＰ１、ＶＰ１－１ＲＢＤ、１ＲＢＤ－ＶＰ２または２ＲＢＤ－ＶＰ２と、ＶＰ２（ＶＰ２ ｗｔ）を、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に等質量ずつ同時に導入し、発現させた。遺伝子の導入にはＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｕｅｂｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃２４７６５－２、１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．０）を、プラスミド１μｇに対して９μｌ用いた。遺伝子導入後、細胞は５％ＣＯ２下、３７℃で４８時間培養した。
ＶＰ１（ＶＰ１ ｗｔ）、１ＲＢＤ－ＶＰ１、２ＲＢＤ－ＶＰ１、３ＲＢＤ－ＶＰ１、ＶＰ１－１ＲＢＤ、１ＲＢＤ－ＶＰ２または２ＲＢＤ－ＶＰ２と、ＶＰ２（ＶＰ２ ｗｔ）を、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に等質量ずつ同時に導入し、発現させた。遺伝子の導入にはＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｕｅｂｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃２４７６５－２、１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．０）を、プラスミド１μｇに対して９μｌ用いた。遺伝子導入後、細胞は５％ＣＯ２下、３７℃で４８時間培養した。
【0074】
培養後のＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞を、ピペッティング操作により培地と共に回収し、遠心（１，７５０ｇ、４℃、３分）により細胞と上清を分離した。上清を除き、細胞ペレットを得た。細胞にペニシリン・ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ＃Ｄ６４２９－５００ＭＬ）もしくはＰＢＳを加え、よく懸濁し、遠心（１，７５０ｇ、４℃、３分）により細胞と上清を分離した後、上清を除き、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットに、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｃａｔ＃Ａ１６０４６）を含むペニシリン・ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ（もしくはＰＢＳ）を、１０ｃｍｄｉｓｈ １枚当たり５００μｌ加え、ボルテックスを使用して十分に混合した後、室温で１０分間、震盪させながら混和した。遠心（３２，３００ｇ、４℃、６０分）により細胞残屑と上清を分離し、パルボウイルスのＶＬＰが含まれる上清（タンパク質抽出液）を得た。
【0075】
以下の手順で、パルボウイルスＶＬＰの精製を行った。３５．６ｍｌのポリプロピレンチューブ（ｈｉｍａｃ）中に１０％スクロースから５０％スクロースの連続勾配溶液を調製した。スクロースの連続勾配溶液の最上部にタンパク質抽出液を穏やかに加えた。４時間の超遠心（ｈｉｔａｃｈｉ Ｐ３２ＳＴローター、１００，０００ｇ、４℃）に供して、タンパク質抽出液をスクロースの連続密度勾配溶液に入れた。下部からスクロースの連続勾配溶液を分画し、１．５ｍｌごとの画分にした。
【0076】
ＶＬＰが含まれる画分を確認するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを行った。電気泳動後にゲル中のタンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）を用いて染色した。また、電気泳動後のゲル中のタンパク質をフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ＶＰ１およびＶＰ２を認識するａｎｔｉ－ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＶＰ２抗体（アブカム社、ａｂ６４２９５）を用いてＶＬＰの検出を行った。
【0077】
ＶＬＰを含む画分をＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｇ２ ２００００ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）内に入れ、およそ７０倍の体積のＰＢＳ溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＰＯ４
３－、ｐＨ７．４）に浸し、４℃下でＶＬＰを含む画分溶液のＰＢＳ置換を行った。透析後のＶＬＰ溶液を回収し、ポアサイズ０．４５μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社、Ｃａｔ＃ＳＬＨＶＲ３３ＲＳ）を用いて限外ろ過を行った。
【0078】
ＶＬＰ含有溶液を、予め洗浄し、かつ平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズが１ｍｌ充填されたカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃２９－０５１３－２５）に流量１ｍｌ／ｍｉｎで結合させた。ＮａＣｌ勾配を用いて、結合したタンパク質を溶出した。クロマトグラフィーは、以下の様に実行した。
緩衝液Ａ：ＰＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＰＯ４ ３－、ｐＨ７．４）
緩衝液Ｂ：１Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＰＯ４ ３－、ｐＨ７．４）
（１）カラム容量の３倍量の緩衝液Ａを用いて、流速１ｍｌ／ｍｉｎにてカラム内を洗浄した。
（２）カラム容量の２０倍量の緩衝液を、流速１ｍｌ／ｍｉｎかつ０－１００％の緩衝液Ｂの勾配にてカラム内を通し、タンパク質の溶出を行った。
（３）カラム容量の５倍量の緩衝液Ｂを用いて、流速１ｍｉｎ／ｍｌにてカラム内を洗浄した。
（４）溶出の間、１ｍｌで分画を行い、画分を保存した。
緩衝液Ａ：ＰＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＰＯ４ ３－、ｐＨ７．４）
緩衝液Ｂ：１Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＰＯ４ ３－、ｐＨ７．４）
（１）カラム容量の３倍量の緩衝液Ａを用いて、流速１ｍｌ／ｍｉｎにてカラム内を洗浄した。
（２）カラム容量の２０倍量の緩衝液を、流速１ｍｌ／ｍｉｎかつ０－１００％の緩衝液Ｂの勾配にてカラム内を通し、タンパク質の溶出を行った。
（３）カラム容量の５倍量の緩衝液Ｂを用いて、流速１ｍｉｎ／ｍｌにてカラム内を洗浄した。
（４）溶出の間、１ｍｌで分画を行い、画分を保存した。
【0079】
ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のバンドと同等、もしくはそれを超えるバンド強度を示すタンパク質が検出されないことを確認するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色を行った（図３）。また、各ＶＬＰ中（ＲＢＤ付加タンパク質とＶＰ２の合計）のＲＢＤ付加タンパク質の割合をバンド強度より算出した結果を図４に示す。以上の結果より、目的とするＶＬＰが作製できていることを確認した。また、ＶＬＰの形成は電子顕微鏡でも確認した。
【0080】
実験３：ＶＬＰの免疫原性の評価
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、ＶＰ１ ｗｔ ＶＬＰ（ｎ＝５）および２ＲＢＤ－ＶＰ１ ＶＬＰ（ｎ＝６）の免疫原性を評価した。免疫はアルミニウムアジュバント１０μｇとＶＬＰ５μｇの筋肉内注射により行った。７週齢で初回免疫を行い、その１４日後に９週齢で第２回の免疫を行った。第２回の免疫から１４日後に１１週齢で第３回の免疫を行った。第３回の免疫から１４日後に１３週齢でマウスから採血を行い、血清試料を取得した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、ＶＰ１ ｗｔ ＶＬＰ（ｎ＝５）および２ＲＢＤ－ＶＰ１ ＶＬＰ（ｎ＝６）の免疫原性を評価した。免疫はアルミニウムアジュバント１０μｇとＶＬＰ５μｇの筋肉内注射により行った。７週齢で初回免疫を行い、その１４日後に９週齢で第２回の免疫を行った。第２回の免疫から１４日後に１１週齢で第３回の免疫を行った。第３回の免疫から１４日後に１３週齢でマウスから採血を行い、血清試料を取得した。
【0081】
各投与群について、中和エピトープ領域であるＶＰ１（配列番号１）の１－９０アミノ酸領域でコーティングしたプレートを用いて、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを実施した。一次抗体としてマウス免疫血清、二次抗体としてＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｇｏａｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号：Ａ４４１６－１ＭＬ）を使用し、ＢｉｏＦＸ（登録商標） ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ社、カタログ番号：ＴＭＢＷ－１０００－０１）によって検出した。結果を図５に示す。ＶＰ１のＮ末端にＲＢＤが付加されたＶＰ１を含むＶＬＰ（２ＲＢＤ－ＶＰ１ ＶＬＰ）を投与したマウスでは、ＶＰ１ ｗｔを含むＶＬＰ（ＶＰ１ ｗｔ ＶＬＰ）を投与したマウスより高い抗体価が検出された。また、ＶＰ１のＮ末端にＲＢＤが付加されたＶＰ１を含むＶＬＰでは、マウスの個体ごとのバラツキが小さかった。ＶＰ１のＮ末端にＲＢＤを付加することで、ＶＬＰの免疫原性が上昇することがわかった。
【0082】
実験４：ＶＬＰにより誘導された抗体の中和活性の評価
実験２で得た各種ＶＬＰをＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３～６）に投与し、免疫を行った。免疫は実験３と同じ手順で行い、血清試料を得た。マウス血清中に含まれる中和抗体の中和活性を評価するため、以下の中和試験を実施した。
実験２で得た各種ＶＬＰをＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３～６）に投与し、免疫を行った。免疫は実験３と同じ手順で行い、血清試料を得た。マウス血清中に含まれる中和抗体の中和活性を評価するため、以下の中和試験を実施した。
【0083】
血清を力価８×１０７ ＩＵのウイルスと等しい容量で混合し、室温で１時間反応させた。ＣＤ３６発現陽性である臍帯血由来赤血球前駆細胞８×１０４個と反応液とを混合し、４℃で２時間静置した。その後、５％ＣＯ２、３７℃で細胞を培養し、培養開始から７０時間後（感染から７２時間後）に細胞を培養液ごと回収し、遠心（３００ｇ、５分）により細胞ペレットを得た。４％パラホルムアルデヒドに細胞を懸濁し、室温で１５分反応させた後、ＰＢＳにて洗浄後、遠心（３００ｇ、５分）により細胞ペレットを得た。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、Ｈｕｍａｎ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｃａｔ＃５６４２２０）を含むＰＢＳに細胞を懸濁し、室温で３０分反応させた後、ＰＢＳを加えてよく細胞を混合し、遠心（３００ｇ、５分）により、細胞ペレットを得た。ＶＰ２に対するウサギポリクローナル抗体（自家製）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含む、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に細胞を懸濁し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳを加えてよく細胞を混合し、遠心（３００ｇ、５分）により細胞ペレットを得た。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ａ－１１００８）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含む１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に細胞ペレットを懸濁し、遮光下、室温で１時間反応させた。ＰＢＳを加えてよく細胞を懸濁し、遠心（３００ｇ、５分）により細胞ペレットを得た。細胞をＰＢＳ溶液に懸濁しＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）にてＶＰ２陽性細胞数を測定した。計測した全細胞数に対するＶＰ２陽性細胞の割合を算出し、その値を感染率として中和活性を評価した。
【0084】
結果を図６に示す。ＶＰ１のＮ末端側にＲＢＤが付加された１ＲＢＤ－ＶＰ２、２ＲＢＤ－ＶＰ１および３ＲＢＤ－ＶＰ１を含むＶＬＰにより誘導された抗体は、ウイルス感染率を大きく低下させた。ＶＰ２のＮ末端にＲＢＤが付加された１ＲＢＤ－ＶＰ１または２ＲＢＤ－ＶＰ２を含むＶＬＰにより誘導された抗体はウイルス感染率をほとんど下げることができなかった。ＶＰ１のＣ末端にＲＢＤが付加されたＶＰ１－ＲＢＤを含むＶＬＰにより誘導された抗体は、ウイルス感染率を少し低下させた。ＶＰ１のＮ末端側にＲＢＤを付加することで、このタンパク質を含むＶＬＰが高い中和活性を有する抗体を誘導できることがわかった。
【0085】
実験５：ＰＬＡ２活性領域欠失ＶＰ１を含むＶＬＰの作製
２ＲＢＤ－ＶＰ１からＰＬＡ２活性領域の一部（ＶＰ１：配列番号１の１４１番目～１５９番目、図７において下線部）が欠失した構造タンパク質（２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２）の発現プラスミドを実験１で作製した２ＲＢＤ－ＶＰ１を元に作製した。欠失箇所には、グリシンリンカー（ＧＧＧＧＧＧ）を導入した。２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列番号９に、核酸配列を配列番号１４に示す。
２ＲＢＤ－ＶＰ１からＰＬＡ２活性領域の一部（ＶＰ１：配列番号１の１４１番目～１５９番目、図７において下線部）が欠失した構造タンパク質（２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２）の発現プラスミドを実験１で作製した２ＲＢＤ－ＶＰ１を元に作製した。欠失箇所には、グリシンリンカー（ＧＧＧＧＧＧ）を導入した。２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列番号９に、核酸配列を配列番号１４に示す。
【0086】
実験２と同じ方法で、２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２とＶＰ２とを細胞内で共発現させ、得られたＶＬＰを精製した。実験２と同じ方法で精製後のＶＬＰをＣＢＢ染色した結果を図８に示す。また、実験２と同じ方法でＶＬＰ（ＶＰ１とＶＰ２との合計）中のＶＰ１の割合を図９に示す。これより、目的のＶＬＰの作製が確認できた。
【0087】
実験６：ＰＬＡ２活性領域欠失ＶＬＰの免疫原性の評価
実験５で得た２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２を含むＶＬＰの免疫原性を評価した。実験３と同じ手順で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に免疫を行い、得られた血清試料について、中和エピトープ領域であるＶＰ１タンパク質の１－９０アミノ酸領域でコーティングしたプレートを用いて、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを実施した。結果を図１０に示す。炎症惹起作用に関与するとされるＰＬＡ２活性領域の一部欠失は、免疫原性に影響を与えないことがわかった。
実験５で得た２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２を含むＶＬＰの免疫原性を評価した。実験３と同じ手順で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に免疫を行い、得られた血清試料について、中和エピトープ領域であるＶＰ１タンパク質の１－９０アミノ酸領域でコーティングしたプレートを用いて、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを実施した。結果を図１０に示す。炎症惹起作用に関与するとされるＰＬＡ２活性領域の一部欠失は、免疫原性に影響を与えないことがわかった。
【0088】
実験７：ＰＬＡ２活性領域欠失ＶＬＰのＰＬＡ２活性の評価
実験５で得た２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２を含むＶＬＰに対して、ＰＬＡ２活性の評価を行った。ＰＬＡ２活性の評価にはｓＰＬＡ２ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、＃７６５００１）を使用し、次の手順で試験を行った。ｓＰＬＡ２ ＤＴＮＢ （＃７６５０１０）１０μｌと、サンプル１０μｌと、ｓＰＬＡ２ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（＃７６５０１０）５μｌとを混合し、２００μｌのｓＰＬＡ２ Ｄｉｈｅｐｔａｎｏｙｌ Ｔｈｉｏ－ＰＣ（＃７６５０１５）を添加した。プレートを攪拌後、プレートリーダーを用いて吸光度（４１４ｎｍ）を測定し、吸光度の値をもとにＰＬＡ２活性を算出した。結果を図１１に示す。ＰＬＡ２領域の一部欠失により、ＶＬＰのＰＬＡ２活性は有意に減弱することが確認された。
実験５で得た２ＲＢＤ－ＶＰ１ ｄｅｌＰＬＡ２を含むＶＬＰに対して、ＰＬＡ２活性の評価を行った。ＰＬＡ２活性の評価にはｓＰＬＡ２ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、＃７６５００１）を使用し、次の手順で試験を行った。ｓＰＬＡ２ ＤＴＮＢ （＃７６５０１０）１０μｌと、サンプル１０μｌと、ｓＰＬＡ２ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（＃７６５０１０）５μｌとを混合し、２００μｌのｓＰＬＡ２ Ｄｉｈｅｐｔａｎｏｙｌ Ｔｈｉｏ－ＰＣ（＃７６５０１５）を添加した。プレートを攪拌後、プレートリーダーを用いて吸光度（４１４ｎｍ）を測定し、吸光度の値をもとにＰＬＡ２活性を算出した。結果を図１１に示す。ＰＬＡ２領域の一部欠失により、ＶＬＰのＰＬＡ２活性は有意に減弱することが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】