特開 2022-128129 機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子及びこれを利用したソバ属植物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022128129

(43)【公開日】2022-09-01

(54)【発明の名称】機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子及びこれを利用したソバ属植物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20220825BHJP

   C12N 15/29 20060101ALI20220825BHJP

   A01H 1/06 20060101ALI20220825BHJP

   A01H 6/00 20180101ALI20220825BHJP

   C12N 15/01 20060101ALI20220825BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54

C12N15/29 ZNA

A01H1/06

A01H6/00

C12N15/01 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021026491

(22)【出願日】2021-02-22

(71)【出願人】

【識別番号】504132272

【氏名又は名称】国立大学法人京都大学

(71)【出願人】

【識別番号】301040039

【氏名又は名称】株式会社ニッセーデリカ

(74)【代理人】

【識別番号】100069431

【弁理士】

【氏名又は名称】和田 成則

(74)【代理人】

【識別番号】100102761

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 元也

(72)【発明者】

【氏名】安井 康夫

(72)【発明者】

【氏名】上野 まりこ

(72)【発明者】

【氏名】川手 康正

【テーマコード（参考）】

2B030

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AB03

2B030AD08

2B030CA08

2B030CB02

(57)【要約】

【課題】機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子及びこれを利用したソバ属植物を提供する。
【解決手段】ソバ属植物のゲノム配列の解読結果から同定した顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の中からソバ属植物の胚乳で高発現している顆粒性澱粉合成酵素遺伝子を同定し、この同定した顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の機能を突然変異誘導により欠損させて生成した機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子及びこの機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子をホモに持つ２重劣勢ホモ個体であるソバ属植物を生成した。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ソバ属植物のゲノム配列の解読結果から同定した５つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の中からソバ属植物の胚乳で高発現している２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子を同定し、
この同定した２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の機能を突然変異誘導により欠損させて生成した
ことを特徴とする機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子。

【請求項2】

前記５つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は、
ソバ属植物のゲノム配列を対象にして予め求めた顆粒性澱粉合成酵素遺伝子のクリエ配列に基づき同定される
ことを特徴とする請求項１に記載の機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子。

【請求項3】

前記５つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は、
FesPL4_sc0224.1.g147573.t3
FesPL4_sc0077.1.g193457.t1
FesPL4_sc0224.1.g149056.t1
FesPL4_sc0065.1.g82828.t1
FesPL4_sc0217.1.g44280.t1
である
ことを特徴とする請求項２に記載の機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子。

【請求項4】

前記２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は、
前記５つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子に対するトランスクリトーム解析に基づくリード数からき同定される
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子。

【請求項5】

前記２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は、
FesPL4_sc0224.1.g147573.t3およびFesPL4_sc0217.1.g44280.t1である
ことを特徴とする請求項４に記載の機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子。

【請求項6】

前記突然変異誘導は、
前記２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の機能をエチルメタンスルホン酸処理により欠損させることにより行われ、機能欠損型のFeGBSS1-wx1遺伝子及びFeGBSS2-wx1遺伝子を生成する
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子。

【請求項7】

前記FeGBSS1-wx1遺伝子は、
cDNA配列の522番目の塩基をGからAに改変させ、該FeGBSS1-wx1遺伝子がコードする174番目のアミノ酸はTrp (コドンはTGG)からストップコドン(TGA)に変異させたものであり、
前記FeGBSS2-wx1遺伝子は、
cDNA配列の513番目の塩基をGからAに改変させ、該FeGBSS2-wx1遺伝子がコードする171番目のアミノ酸はTrp (コドンはTGG) からストップコドン(TGA)に変異させたものである
ことを特徴とする請求項６に記載の機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子。

【請求項8】

ソバ属植物のゲノム配列の解読結果から同定した顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の中からソバ属植物の胚乳で高発現している顆粒性澱粉合成酵素遺伝子を同定し、この同定した顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の機能を突然変異誘導により欠損させて生成した機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子をホモに持つ２重劣勢ホモ個体であることを特徴とするソバ属植物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子及びこれを利用したソバ属植物に関し、特に、モチ性形質を持つソバ属植物（モチソバ）の生成を可能にした機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子及びこれを利用したソバ属植物に関する。

【背景技術】

【0002】

アミロースおよびアミロペクチンは、穀類の澱粉特性に大きな影響を与える重要な物質である。顆粒性澱粉合成酵素 (Granule Bound Starch Synthase:GBSS)はADPグルコースを基質として、アミロースを合成する。イネ科作物などでは、GBSSの機能が欠損するとアミロースが合成されないため、胚乳にはアミロペクチンのみからなるモチ澱粉が蓄積される。

【0003】

アミロースが含まれる澱粉はヨウ素溶液によって青紫色に染色され、アミロースが含まれない場合は「赤紫色」に染色される。このため一般的には、ヨウ素溶液を用いることによってモチ澱粉を胚乳に蓄積する個体のスクリーニングが簡便に行われる。

【0004】

モチ性形質を持つソバ属植物を生成するために、機能欠損型遺伝子を利用することが注目されている。ソバ属植物以外の他の植物においては、機能欠損型遺伝子を使用してその特性を改善する試みは、特許文献１、特許文献２などにおいて知られている。

【0005】

しかしながら、ソバ属植物においてはこれまでに機能欠損型遺伝子を使用したモチ性個体は確認されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０１６-８６７６１号公報

【特許文献2】特開２０１８-１８６８３５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子及びこれを利用したソバ属植物を提供することを目的とする。

【0008】

発明者等はソバのゲノム解読結果から、５個のGBSS遺伝子を発見した。さらにRNAseqによるトランスクリプトーム解析により、FeGBSS1タンパク質および FeGBSS2タンパク質が胚乳で高発現していることがわかった。

【0009】

そこで、EMSを用いて機能欠損型のFeGBSS1タンパク質および FeGBSS2タンパク質をコードするFeGBSS1-wx1およびFeGBSS2-wx1をそれぞれ開発した。さらに、交配によりFeGBSS1-wx1およびFeGBSS2-wx1を同時にホモに持つ個体（二重劣性ホモ個体）を作成した。二重劣性ホモ個体の胚乳をヨウ素溶液によって染色したところ、赤紫色を呈したことから、この二重劣性ホモ個体はモチ性形質を持つソバ属植物（モチソバ）であることが明らかとなった。

【課題を解決するための手段】

【0010】

請求項１の発明の機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は、ソバ属植物のゲノム配列の解読結果から同定した５つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の中からソバ属植物の胚乳で高発現している２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子を同定し、この同定した２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の機能を突然変異誘導により欠損させて生成したことを特徴とする。

【0011】

請求項２の発明は、請求項１に記載の発明において、前記５つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は、ソバ属植物のゲノム配列を対象にして予め求めた顆粒性澱粉合成酵素遺伝子のクリエ配列に基づき同定されることを特徴とする。

【0012】

請求項３の発明は、請求項２に記載の発明において、前記５つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は、
FesPL4_sc0224.1.g147573.t3
FesPL4_sc0077.1.g193457.t1
FesPL4_sc0224.1.g149056.t1
FesPL4_sc0065.1.g82828.t1
FesPL4_sc0217.1.g44280.t1
であることを特徴とする。

【0013】

請求項４の発明は、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の発明において、前記２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は、前記５つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子に対するトランスクリトーム解析に基づくリード数から同定されることを特徴とする。

【0014】

請求項５の発明は、請求項４に記載の発明において、前記２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は、FesPL4_sc0224.1.g147573.t3およびFesPL4_sc0217.1.g44280.t1であることを特徴とする。

【0015】

請求項６の発明は、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の発明において、前記突然変異誘導は、前記２つの顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の機能をエチルメタンスルホン酸処理により欠損させることにより行われ、機能欠損型のFeGBSS1-wx1遺伝子及びFeGBSS2-wx1遺伝子を生成することを特徴とする。

【0016】

請求項７の発明は、請求項６に記載の発明において、前記FeGBSS1-wx1遺伝子は、cDNA配列の522番目の塩基をGからAに改変させ、該FeGBSS1-wx1遺伝子がコードする174番目のアミノ酸はTrp (コドンはTGG)からストップコドン(TGA)に変異させたものであり、前記FeGBSS2-wx1遺伝子は、cDNA配列の513番目の塩基をGからAに改変させ、該FeGBSS2-wx1遺伝子がコードする171番目のアミノ酸はTrp (コドンはTGG) からストップコドン(TGA)に変異させたものであることを特徴とする。

【0017】

請求項８の発明のソバ属植物は、ソバ属植物のゲノム配列の解読結果から同定した顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の中からソバ属植物の胚乳で高発現している顆粒性澱粉合成酵素遺伝子を同定し、この同定した顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の機能を突然変異誘導により欠損させて生成した機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子をホモに持つ２重劣勢ホモ個体であることを特徴とする。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、ソバ属植物のゲノム配列の解読結果から同定した顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の中からソバ属植物の胚乳で高発現している顆粒性澱粉合成酵素遺伝子を同定し、この同定した顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の機能を突然変異誘導により欠損させて生成した機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子をホモに持つ２重劣勢ホモ個体であるソバ属植物を得ることができるので、他の配合物を加えることなく、モチ性形質を持ち、麺の劣化の少ないソバ属植物を提供できるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、顆粒性澱粉合成酵素遺伝子であるFeGBSS1_cDNA（正常型）の塩基配列を示す図である。

【図2】図２は、本発明に係る達明に機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子であるFeGBSS1-wx1_cDNA（変異型）の塩基配列を示す図である。

【図3】図３は、顆粒性澱粉合成酵素遺伝子であるFeGBSS2_cDNA（正常型）の塩基配列を示す図である。

【図4】図４は、図２は、本発明に係る機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子であるFeGBSS2-wx1_cDNA（変異型）の塩基配列を示す図である。

【図5】図５は、本発明に係るソバ属植物に関するヨウ素溶液を用いたモチ澱粉を胚乳に蓄積する個体のスクリーニングを示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明を実施するための実施例について、添付した図面を参照しながら詳細に説明する。

【0021】

本発明の実施例においては、そば中間母本農1号の核DNAをYasui et al (2016a)(Draft genome sequence of an inbred line of Chenopodium quinoa, an allotetraploid crop with great environmental adaptability and outstanding nutritional properties, DNA Research, 23, 535-546.) の手法に従って抽出し、DenovoMAGIC法によりDNA配列をアセンブルし、ソバのゲノム配列とした。DenovoMAGIC法によるアセンブルはNRGene社に委託した。業務委託先であるかずさDNA研究所において、ソバのゲノム配列上の全ての遺伝子を予測した。

【0022】

・GBSS遺伝子の同定
Yasui et al (2016b)で検出されたGBSS遺伝子（sc0002521）をクエリ配列に用いて、ソバのゲノム配列を対象としてTBLASTX解析を実施した。 その結果、以下の５つのGBSS遺伝子が存在することがわかった。

【0023】

FesPL4_sc0224.1.g147573.t3
FesPL4_sc0077.1.g193457.t1
FesPL4_sc0224.1.g149056.t1
FesPL4_sc0065.1.g82828.t1
FesPL4_sc0217.1.g44280.t1
以下にTBLASTX解析の結果（E value）を記す。

【0024】

遺伝子名 E value
FesPL4_sc0224.1.g147573.t3 0.0
FesPL4_sc0077.1.g193457.t1 0.0
FesPL4_sc0224.1.g149056.t1 5e-180
FesPL4_sc0065.1.g82828.t1 1e-161
FesPL4_sc0217.1.g44280.t1 1e-157
・トランスクリプトーム解析
交配12-14日後のソバの未熟種子からyasui.et.al (2012)(A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.)に従ってRNAを抽出し、イルミナ社のTruSeq RNA Sample prep Kit v2を用いてNGS解析用のライブラリーを作成した。イルミナ社のHiseqXで塩基配列リードを取得後に、trimmomatic 0.3.2(Bolger, A.M et al. 2014)でリードのクリーニングを行なった。参照配列に上記の５遺伝子を用いて、BWAによるマッピングを実施した。最終的に参照配列の遺伝子にマップされたリード数を発現強度とした。

【0025】

結果は以下の通りで、FesPL4_sc0224.1.g147573.t3およびFesPL4_sc0217.1.g44280.t1の２つのGBSS遺伝子が胚乳で高発現していることがわかった。発現量の高かったFesPL4_sc0224.1.g147573.t3をFeGBSS1、FesPL4_sc0217.1.g44280.t1をFeGBSS2と命名した。

【0026】

予測遺伝子 リード数
FesPL4_sc0224.1.g147573.t3 7,295,100
FesPL4_sc0077.1.g193457.t1 1,342
FesPL4_sc0224.1.g149056.t1 754
FesPL4_sc0065.1.g82828.t1 11,395
FesPL4_sc0217.1.g44280.t1 6,210,988
・変異誘導集団育成
FeGBSS1およびFeGBSS2の機能を欠損させるため、EMSによる突然変異誘導を実施した。約4,600粒の種子を0.33%のEMS溶液で15時間処理し、京都大学附属農場で栽培した。1個体から3-6粒ずつを採取し、7,490粒の種子を得た。さらにこの種子を0.6%のEMSで15時間処理し、最終的に2,710個体から採種した。採種においては、１個体当たり１から２粒ずつを採種した。この種子を京都大学附属農場で播種・栽培し、3,336個体から個体ごとに採種した。また栽培時には１２個体の葉を等量ずつまとめてDNAを抽出し、278のDNAバルクとした（12個体 x 278バルク = 3,336）。

【0027】

・変異検出を利用したFeGBSS1-wx1およびFeGBSS2-wx1の開発
FeGBSS1およびFeGBSS2のPCRプライマーを設計し、278のDNAバルクをテンプレートとして、以下の条件でPCR増幅を行なった。

【0028】

98度2分、（98度10秒、58度5秒、72度90秒) x 30回、72度5秒
PCRプライマーは以下の通り
FeGBSS1増幅用プライマー
GBSS_sc0005258_Fw1; GACGTCACTCACAATCACAAGTAGC
FeGBSS2増幅用プライマー
GBSS_sc0002521_Fw3; AATACCGCTGTGTGTATGGCAAG
GBSS_sc0002521_Rv1205; GGTCCTGAGAAAAATTTGTTGTTG
PCR後にNextera XT DNA Library Prep kit（イルミナ社）を用いてバルクごとにPCR産物をライブラリー化し、Hiseq X(イルミナ社)を用いて塩基配列リードを取得した。その後に、trimmomatic 0.3.2でリードのクリーニング、参照配列（FeGBSS1およびFeGBSS2遺伝子配列）へのBWA (Li and Durbin, 2009)(Draft genome sequence of an inbred line of Chenopodium quinoa, an allotetraploid crop with great environmental adaptability and outstanding nutritional properties, DNA Research, 23, 535-546.)によるマッピングを行った。

【0029】

そして、samtools(Li et al., 2009)（The Sequence Alignment/Map format and SAMtools, Bioinformatics, 25, 2078-2079.）による処理（BAM変換、ソート、mpileup）、VarScan (Koboldt et al., 2009)（VarScan: variant detection in massively parallel sequencing of individual and pooled samples. Bioinformatics (Oxford, England), 25, 2283-2285 PMID: 19542151）によるVcf作成、SnpEff(Cingolani et al., 2012)（A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.）による突然変異検出を行なった。

【0030】

その結果、図１に示すように、FeGBSS1のcDNA配列の522番目の塩基をGからAに改変させたFeGBSS1-wx1遺伝子を開発した。また、図２に示すように、FeGBSS1-wx1遺伝子がコードする174番目のアミノ酸はTrp (コドンはTGG)からストップコドン(TGA)に変異しており、FeGBSS1タンパク質の機能は欠損すると考えられる。

【0031】

また、図３に示すように、FeGBSS2のcDNA配列の513番目の塩基をGからAに改変させたFeGBSS2-wx1遺伝子を開発した。また、図４に示すように、FeGBSS2-wx1遺伝子がコードする171番目のアミノ酸はTrp (コドンはTGG) からストップコドン(TGA)に変異しており、FeGBSS2タンパク質の機能は欠損すると考えられる。

【0032】

・交配によるモチソバの開発
FeGBSS1およびFeGBSS2の２つの遺伝子は発現量が高く、ソバにモチ性形質を付与するにはFeGBSS1-wx1とFeGBSS2-wx1を同時にホモで保持する個体（二重劣性ホモ個体）を育成する必要がある。そこで、まず二重ヘテロ個体（遺伝子型; FeGBSS1/FeGBSS1-wx1, FeGBSS2/FeGBSS2-wx1）を育成し、二重ヘテロ個体同士の交配から、モチ性ソバ個体（遺伝子型; FeGBSS1-wx1/FeGBSS1-wx1, FeGBSS2-wx1/FeGBSS2-wx1）を育成した。この際、遺伝子型の判別にはFeGBSS1およびFeGBSS2遺伝子をPCR増幅し、サンガー法による塩基配列決定を行った。PCR条件は上述の通りであり、サンガー法による塩基配列決定には以下のPCRプライマーを用いた。

【0033】

GBSS1-wx1検出用シーケンシングプライマー, AGCTGAGGTAAAAGTGGGAGATAAG
GBSS2-wx1検出用シーケンシングプライマー, GGGGTTGATCGTGTCTTCGT
・ヨウ素液による染色
ソバの種子を切断し、切断面にヨウ素液（0.37 gの精製ヨウ素と0.74 gのKIを400 mlの蒸留水に溶解した）を滴下し、ソバのデンプンを染色した。その結果、モチ性ソバのデンプンは、図５（Ａ）に示すように、赤褐色に染まり、コントロールとして使った通常のソバのデンプンは、図５（Ｂ）に示すように、濃紺色に染まった。

【0034】

なお、本発明に係る上記ソバ属植物は、胚乳のアミロース含量が全デンプンの２０％以下になると考えられる。

【0035】

本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内であれば、当業者の通常の創作能力によって多くの変形が可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】