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特開2022-130286菌叢を改善するための組成物、およびそれを用いた菌叢を改善するための方法、並びにその応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022130286
(43)【公開日】2022-09-06
(54)【発明の名称】菌叢を改善するための組成物、およびそれを用いた菌叢を改善するための方法、並びにその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20220830BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220830BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20220830BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20220830BHJP
A61K 31/715 20060101ALI20220830BHJP
A61K 31/733 20060101ALI20220830BHJP
A61P 1/14 20060101ALI20220830BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A ZNA
C12Q1/02
A23L33/135
A61K35/747
A61K31/715
A61K31/733
A61P1/14
【審査請求】未請求
【請求項の数】27
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021197847
(22)【出願日】2021-12-06
(31)【優先権主張番号】P 2021029165
(32)【優先日】2021-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(71)【出願人】
【識別番号】517245981
【氏名又は名称】株式会社バイオパレット
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100118371
【弁理士】
【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】佐々木 建吾
(72)【発明者】
【氏名】佐々木 大介
(72)【発明者】
【氏名】近藤 昭彦
【テーマコード（参考）】
4B018
4B063
4B065
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB03
4B018LB05
4B018LB06
4B018LB08
4B018LB10
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
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4B018LE06
4B018MA01
4B018MD27
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4B018ME01
4B018ME07
4B018ME08
4B018ME09
4B018ME11
4B018MF08
4B063QA20
4B063QQ06
4B063QR43
4B063QR75
4B063QS17
4B063QX10
4B065AA30X
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4B065BC11
4B065BC15
4B065BD36
4B065BD38
4B065CA41
4B065CA44
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA20
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZA66
4C086ZA73
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC56
4C087CA09
4C087MA02
4C087MA52
4C087NA14
4C087ZA66
4C087ZA73
4C087ZC75
(57)【要約】
【課題】 菌叢を改善するための組成物、及びその方法を提供すること。
【解決手段】 本開示は、少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む、菌叢を改善するための組成物を提供する。また本開示は、改善された菌叢を生産するための方法であって、少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む培養液を提供する工程と、該培養液において菌叢を培養させる工程とを含む、方法を提供する。
【選択図】 なし
【解決手段】 本開示は、少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む、菌叢を改善するための組成物を提供する。また本開示は、改善された菌叢を生産するための方法であって、少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む培養液を提供する工程と、該培養液において菌叢を培養させる工程とを含む、方法を提供する。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む、菌叢を改善するための組成物。
【請求項2】
Lactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか２つ、またはすべてを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
（１）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物およびフコース含有化合物、（２）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物およびフルクタン含有化合物、（３）フコース含有化合物およびフルクタン含有化合物、または（４）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記Lactobacillus属細菌がLactobacillus paracasei（Lacticaseibacillus paracasei）、およびLactobacillus fermentum（Limosilactobacillus fermentum）からなる群より選択される少なくとも１種に属する細菌を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記フコース含有化合物がフコイダンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記フルクタン含有化合物が麦葉抽出物を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記菌叢における短鎖脂肪酸組成を改善するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記菌叢における酪酸生産量を増加させるための、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記菌叢におけるプロピオン酸生産量を増加させるための、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記菌叢における酢酸生産量を低下させるための、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
菌叢指標菌の比率を改善するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
前記菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させるための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
飲食品、食品添加物、サプリメント、医薬部外品、または医薬品である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物と、菌叢とを含む、剤。
【請求項15】
飲食品、食品添加物、サプリメント、医薬部外品、または医薬品である、請求項１４に記載の剤。
【請求項16】
前記菌叢は糞便を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１４または１５に記載の剤。
【請求項17】
凍結乾燥されたものである、請求項１～１３または１６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１４～１６のいずれか一項に記載の剤。
【請求項18】
請求項１～１３、１６または１７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１４～１７のいずれか一項に記載の剤を経口摂取させる工程を有する、菌叢を改善するための方法。
【請求項19】
菌叢における短鎖脂肪酸組成を改善するため、菌叢における酪酸生産量を増加させるため、菌叢におけるプロピオン酸生産量を増加させるため、菌叢における酢酸生産量を低下させるため、菌叢指標菌の比率を改善するため、及び／または菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させるための、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
改善された菌叢を生産するための方法であって、
少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む培養液を提供する工程と、
該培養液において菌叢を培養させる工程と
を含む、方法。
少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む培養液を提供する工程と、
該培養液において菌叢を培養させる工程と
を含む、方法。
【請求項21】
前記方法はインビトロで実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記方法は生体内で実施される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項23】
Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、
（１）プロピオン酸生成量を増加させる、
（２）酪酸生成量を増加させる、および
（３）酢酸生成量を減少させる
のうちの少なくとも１つの特徴を有する、菌株。
（１）プロピオン酸生成量を増加させる、
（２）酪酸生成量を増加させる、および
（３）酢酸生成量を減少させる
のうちの少なくとも１つの特徴を有する、菌株。
【請求項24】
前記菌株は、培養条件Ａで培養した場合に
（１）プロピオン酸生成量を少なくとも約１．１倍に増加させる、
（２）酪酸生成量を少なくとも約１．１倍に増加させる、および
（３）酢酸生成量を多くとも約９５％以下に減少させる
の少なくとも１つの特徴を有する、請求項２３に記載の菌株。
（１）プロピオン酸生成量を少なくとも約１．１倍に増加させる、
（２）酪酸生成量を少なくとも約１．１倍に増加させる、および
（３）酢酸生成量を多くとも約９５％以下に減少させる
の少なくとも１つの特徴を有する、請求項２３に記載の菌株。
【請求項25】
Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる、菌株。
【請求項26】
Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を少なくとも約１．１倍に増殖させる、菌株。
【請求項27】
前記菌株はLactobacillus paracasei（Lacticaseibacillus paracasei）、およびLactobacillus fermentum（Limosilactobacillus fermentum）からなる群より選択される少なくとも１種に属する、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、菌叢を改善するための組成物、それを用いた菌叢を改善するための方法、改善された菌叢を生産するための方法、並びに飲食品、医薬部外品、又は医薬品に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトや哺乳動物の腸内には、多種多様の細菌や真菌等の菌が常在しており、これらの菌が集まって腸内菌叢（腸内フローラ）を形成している。近年では、腸内菌叢は、ヒトにおいては１０００種ともされる多種類の菌群がバランスを保った状態で多様な機能を果たしている複合的な生態系であることがわかっている。すなわち、菌叢が健全な多様性を有していることによって、宿主であるヒトや哺乳動物に対して健全な影響を及ぼしていると考えられている。そのため、菌叢を改善し、多様性を維持、向上させるための組成物が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本発明者らはこれまでに、ヒト糞便を植菌源として培養系中にヒト腸内細菌種を保持する装置を開発してきた。この開発の過程において、特定の細菌および／または化合物が菌叢の改善に寄与していることを見出した。本開示は、その特定の細菌および／または化合物を利用し、菌叢を改善するための組成物、及びその方法を提供する。
【0004】
したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１） 少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む、菌叢を改善するための組成物。
（項目２） Lactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか２つ、またはすべてを含む、上記項目に記載の組成物。
（項目３） （１）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物およびフコース含有化合物、（２）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物およびフルクタン含有化合物、（３）フコース含有化合物およびフルクタン含有化合物、または（４）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目４） 前記Lactobacillus属細菌がLactobacillus paracasei（Lacticaseibacillus paracasei）、およびLactobacillus fermentum（Limosilactobacillus fermentum）からなる群より選択される少なくとも１種に属する細菌を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目５） 前記フコース含有化合物がフコイダンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６） 前記フルクタン含有化合物が麦葉抽出物を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７） 前記菌叢における短鎖脂肪酸組成を改善するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８） 前記菌叢における酪酸生産量を増加させるための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９） 前記菌叢におけるプロピオン酸生産量を増加させるための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０） 前記菌叢における酢酸生産量を低下させるための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１） 菌叢指標菌の比率を改善するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２） 前記菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させるための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３） 飲食品、食品添加物、サプリメント、医薬部外品、または医薬品である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４） 上記項目のいずれか一項に記載の組成物と、菌叢とを含む、剤。
（項目１５） 飲食品、食品添加物、サプリメント、医薬部外品、または医薬品である、上記項目に記載の剤。
（項目１６） 前記菌叢は糞便を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物、または上記項目のいずれか一項に記載の剤。
（項目１７） 凍結乾燥されたものである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物、または上記項目のいずれか一項に記載の剤。
（項目Ａ１） 上記項目のいずれか一項に記載の組成物を経口摂取させる工程を有する、菌叢を改善するための方法。
（項目Ａ２） 菌叢における短鎖脂肪酸組成を改善するため、菌叢における酪酸生産量を増加させるため、菌叢におけるプロピオン酸生産量を増加させるため、菌叢における酢酸生産量を低下させるため、菌叢指標菌の比率を改善するため、及び／または菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させるための、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１） 改善された菌叢を生産するための方法であって、
少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む培養液を提供する工程と、
該培養液において菌叢を培養させる工程と
を含む、方法。
（項目Ｂ２） 前記方法はインビトロで実施される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ３） 前記方法は生体内で実施される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。（項目Ｃ１） Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、
（１）プロピオン酸生成量を増加させる、
（２）酪酸生成量を増加させる、および
（３）酢酸生成量を減少させる
のうちの少なくとも１つの特徴を有する、菌株。
（項目Ｃ１ａ） 培養条件Ａが、（１）ＫＨ２ＰＯ４ ２．６７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌを加えたＧＡＭ培地で約１６時間行う前培養と、（２）約１１５℃にて約１５分間オートクレーブしたＧＡＭ培地（ｐＨを約６．５に調整）に、添加培地濃度を約４０ｇ／Ｌとし、培養前に約３７℃にて約１時間、約０．２μｍ ＰＴＦＥ膜を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に曝気（約１５ｍＬ／分）した培地に、ヒト健常被験体の糞便試料（綿棒で取得したものであり、綿棒の先端に付着した量、おおよそ０．１ｇ）を約１％のＬ－アスコルビン酸を添加した約０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および約０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の６１．６５：２８．３５混合物からなる）約２ｍＬ中に懸濁して調製した懸濁物を約１００μＬ接種して、嫌気培養を行う本培養とを含む、上記項目に記載の菌株。
（項目Ｃ２） 前記菌株は、培養条件Ａで培養した場合に
（１）プロピオン酸生成量を少なくとも約１．１倍に増加させる、
（２）酪酸生成量を少なくとも約１．１倍に増加させる、および
（３）酢酸生成量を多くとも約９５％以下に減少させる
の少なくとも１つの特徴を有する、上記項目に記載の菌株。
（項目Ｃ２ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ３） Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる、菌株。
（項目Ｃ３ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ４） Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を少なくとも約１．１倍に増殖させる、菌株。
（項目Ｃ４ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ５） 前記菌株はLactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus agilis、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillusanimalis、Lactobacilus antrumi、Lactobacillus avarius、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus confusus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus fructosus、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus graminis、Lactobacillus halotolerans、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus iners、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kandleri、Lactobacillus kefir、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus lactis、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus minor、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus oris、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus pontis、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus viridescens、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aviarius、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii、 Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis、Lactobacillus dextrinicus、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus equi、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus perolens、Lactobacillus protectus、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rennini、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rogosae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus zeae、またはLactobacillus zymaeからなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ５ａ） 前記菌株は、Lacticaseibacillus baoqingensis、Lacticaseibacillus brantae、Lacticaseibacillus camelliae、Lacticaseibacillus casei、Lacticaseibacillus zeae、Lacticaseibacillus chiayiensis、Lacticaseibacillus hulanensis、Lacticaseibacillus manihotivorans、Lacticaseibacillus nasuensis、Lacticaseibacillus pantheris、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans、Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans、Lacticaseibacillus porcinae、Lacticaseibacillus rhamnosus、Lacticaseibacillus rhamnosus、Lacticaseibacillus saniviri、Lacticaseibacillus sharpeae、Lacticaseibacillus songhuajiangensis、Lacticaseibacillus thailandensis、Lacticaseibacillus daqingensis、Lacticaseibacillus hegangensis、Lacticaseibacillus suibinensis、Lacticaseibacillus yichunensis、Lacticaseibacillus jixianensis、またはLacticaseibacillus zhaodongensisからなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ５ｂ） 前記菌株は、Limosilactobacillus alvi、Limosilactobacillus antri、Limosilactobacillus caviae、Limosilactobacillus coleohominis、Limosilactobacillus equigenerosi、Limosilactobacillus fermentum、Limosilactobacillus frumenti、Limosilactobacillus gastricus、Limosilactobacillus gorillae、Limosilactobacillus ingluviei、Limosilactobacillus mucosae、Limosilactobacillus oris、Limosilactobacillus panis、Limosilactobacillus pontis、Limosilactobacillus reuteri、Limosilactobacillus secaliphilus、またはLimosilactobacillus vaginalisからなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ５ｃ） 前記菌株は、Lactiplantibacillus daoliensis、Lactiplantibacillus daowaiensis、Lactiplantibacillus dongliensis、Lactiplantibacillus fabifermentans、Lactiplantibacillus herbarum、Lactiplantibacillus modestisalitolerans、Lactiplantibacillus mudanjiangensis、Lactiplantibacillus nangangensis、Lactiplantibacillus paraplantarum、Lactiplantibacillus pentosus、Lactiplantibacillus pingfangensis、Lactiplantibacillus plajomi、Lactiplantibacillus argentoratensis、Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum、Lactiplantibacillus songbeiensis、またはLactiplantibacillus xiangfangensisからなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ６） 前記菌株はLactobacillus paracasei（Lacticaseibacillus paracasei）、およびLactobacillus fermentum（Limosilactobacillus fermentum）からなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｄ１）
Lactobacillus属細菌に属する菌株をスクリーニングする方法であって、該方法は
（Ａ）Lactobacillus属細菌を含むかまたは含むと推定される試料を培養条件Ｘで培養する工程と、
（Ｂ）（Ａ）で得られた培養物または該培養物から必要に応じて単離した菌株を培養条件Ａで培養した場合に、（１）プロピオン酸生成量を増加させる、（２）酪酸生成量を増加させる、および（３）酢酸生成量を減少させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有する、菌株を同定する工程と、
（Ｃ）必要に応じて同定された菌株を単離する工程
を包含する、方法。
（項目Ｄ１ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｄ１ｂ） 培養条件Ｘが、試料１００μＬを、大麦若葉エキスを２０ｇ／ＬおよびＬ－システイン塩酸塩一水和物０．５ｇ／Ｌを含む培地（２５ｍＬ）中で３７℃で７日間培養し、これを繰り返して、培養液を培地にて１０７倍希釈し、希釈液１ｍＬを２５ｍＬの寒天培地に混釈して、Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０ガス下の３７℃でコロニーを形成させ、単一のコロニーをチップで吸い上げ、Reinforced Clostridial培地で培養して菌株を単離する条件をを含む、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｄ２）
Lactobacillus属細菌に属する菌株をスクリーニングする方法であって、該方法は
（Ａ）Lactobacillus属細菌を含むかまたは含むと推定される試料を培養条件Ｘで培養する工程と、
（Ｂ）（Ａ）で得られた培養物または該培養物から必要に応じて単離した菌株を培養条件Ａで培養した場合に菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる、菌株を同定する工程と、
（Ｃ）必要に応じて同定された菌株を単離する工程
を包含する、方法。
（項目Ｄ２ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｄ２ｂ） 培養条件Ｘが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目１） 少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む、菌叢を改善するための組成物。
（項目２） Lactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか２つ、またはすべてを含む、上記項目に記載の組成物。
（項目３） （１）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物およびフコース含有化合物、（２）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物およびフルクタン含有化合物、（３）フコース含有化合物およびフルクタン含有化合物、または（４）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目４） 前記Lactobacillus属細菌がLactobacillus paracasei（Lacticaseibacillus paracasei）、およびLactobacillus fermentum（Limosilactobacillus fermentum）からなる群より選択される少なくとも１種に属する細菌を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目５） 前記フコース含有化合物がフコイダンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６） 前記フルクタン含有化合物が麦葉抽出物を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７） 前記菌叢における短鎖脂肪酸組成を改善するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８） 前記菌叢における酪酸生産量を増加させるための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９） 前記菌叢におけるプロピオン酸生産量を増加させるための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０） 前記菌叢における酢酸生産量を低下させるための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１） 菌叢指標菌の比率を改善するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２） 前記菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させるための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３） 飲食品、食品添加物、サプリメント、医薬部外品、または医薬品である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４） 上記項目のいずれか一項に記載の組成物と、菌叢とを含む、剤。
（項目１５） 飲食品、食品添加物、サプリメント、医薬部外品、または医薬品である、上記項目に記載の剤。
（項目１６） 前記菌叢は糞便を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物、または上記項目のいずれか一項に記載の剤。
（項目１７） 凍結乾燥されたものである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物、または上記項目のいずれか一項に記載の剤。
（項目Ａ１） 上記項目のいずれか一項に記載の組成物を経口摂取させる工程を有する、菌叢を改善するための方法。
（項目Ａ２） 菌叢における短鎖脂肪酸組成を改善するため、菌叢における酪酸生産量を増加させるため、菌叢におけるプロピオン酸生産量を増加させるため、菌叢における酢酸生産量を低下させるため、菌叢指標菌の比率を改善するため、及び／または菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させるための、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１） 改善された菌叢を生産するための方法であって、
少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む培養液を提供する工程と、
該培養液において菌叢を培養させる工程と
を含む、方法。
（項目Ｂ２） 前記方法はインビトロで実施される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ３） 前記方法は生体内で実施される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。（項目Ｃ１） Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、
（１）プロピオン酸生成量を増加させる、
（２）酪酸生成量を増加させる、および
（３）酢酸生成量を減少させる
のうちの少なくとも１つの特徴を有する、菌株。
（項目Ｃ１ａ） 培養条件Ａが、（１）ＫＨ２ＰＯ４ ２．６７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌを加えたＧＡＭ培地で約１６時間行う前培養と、（２）約１１５℃にて約１５分間オートクレーブしたＧＡＭ培地（ｐＨを約６．５に調整）に、添加培地濃度を約４０ｇ／Ｌとし、培養前に約３７℃にて約１時間、約０．２μｍ ＰＴＦＥ膜を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に曝気（約１５ｍＬ／分）した培地に、ヒト健常被験体の糞便試料（綿棒で取得したものであり、綿棒の先端に付着した量、おおよそ０．１ｇ）を約１％のＬ－アスコルビン酸を添加した約０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および約０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の６１．６５：２８．３５混合物からなる）約２ｍＬ中に懸濁して調製した懸濁物を約１００μＬ接種して、嫌気培養を行う本培養とを含む、上記項目に記載の菌株。
（項目Ｃ２） 前記菌株は、培養条件Ａで培養した場合に
（１）プロピオン酸生成量を少なくとも約１．１倍に増加させる、
（２）酪酸生成量を少なくとも約１．１倍に増加させる、および
（３）酢酸生成量を多くとも約９５％以下に減少させる
の少なくとも１つの特徴を有する、上記項目に記載の菌株。
（項目Ｃ２ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ３） Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる、菌株。
（項目Ｃ３ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ４） Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を少なくとも約１．１倍に増殖させる、菌株。
（項目Ｃ４ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ５） 前記菌株はLactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus agilis、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillusanimalis、Lactobacilus antrumi、Lactobacillus avarius、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus confusus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus fructosus、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus graminis、Lactobacillus halotolerans、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus iners、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kandleri、Lactobacillus kefir、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus lactis、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus minor、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus oris、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus pontis、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus viridescens、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aviarius、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii、 Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis、Lactobacillus dextrinicus、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus equi、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus perolens、Lactobacillus protectus、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rennini、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rogosae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus zeae、またはLactobacillus zymaeからなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ５ａ） 前記菌株は、Lacticaseibacillus baoqingensis、Lacticaseibacillus brantae、Lacticaseibacillus camelliae、Lacticaseibacillus casei、Lacticaseibacillus zeae、Lacticaseibacillus chiayiensis、Lacticaseibacillus hulanensis、Lacticaseibacillus manihotivorans、Lacticaseibacillus nasuensis、Lacticaseibacillus pantheris、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans、Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans、Lacticaseibacillus porcinae、Lacticaseibacillus rhamnosus、Lacticaseibacillus rhamnosus、Lacticaseibacillus saniviri、Lacticaseibacillus sharpeae、Lacticaseibacillus songhuajiangensis、Lacticaseibacillus thailandensis、Lacticaseibacillus daqingensis、Lacticaseibacillus hegangensis、Lacticaseibacillus suibinensis、Lacticaseibacillus yichunensis、Lacticaseibacillus jixianensis、またはLacticaseibacillus zhaodongensisからなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ５ｂ） 前記菌株は、Limosilactobacillus alvi、Limosilactobacillus antri、Limosilactobacillus caviae、Limosilactobacillus coleohominis、Limosilactobacillus equigenerosi、Limosilactobacillus fermentum、Limosilactobacillus frumenti、Limosilactobacillus gastricus、Limosilactobacillus gorillae、Limosilactobacillus ingluviei、Limosilactobacillus mucosae、Limosilactobacillus oris、Limosilactobacillus panis、Limosilactobacillus pontis、Limosilactobacillus reuteri、Limosilactobacillus secaliphilus、またはLimosilactobacillus vaginalisからなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ５ｃ） 前記菌株は、Lactiplantibacillus daoliensis、Lactiplantibacillus daowaiensis、Lactiplantibacillus dongliensis、Lactiplantibacillus fabifermentans、Lactiplantibacillus herbarum、Lactiplantibacillus modestisalitolerans、Lactiplantibacillus mudanjiangensis、Lactiplantibacillus nangangensis、Lactiplantibacillus paraplantarum、Lactiplantibacillus pentosus、Lactiplantibacillus pingfangensis、Lactiplantibacillus plajomi、Lactiplantibacillus argentoratensis、Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum、Lactiplantibacillus songbeiensis、またはLactiplantibacillus xiangfangensisからなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｃ６） 前記菌株はLactobacillus paracasei（Lacticaseibacillus paracasei）、およびLactobacillus fermentum（Limosilactobacillus fermentum）からなる群より選択される少なくとも１種に属する、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｄ１）
Lactobacillus属細菌に属する菌株をスクリーニングする方法であって、該方法は
（Ａ）Lactobacillus属細菌を含むかまたは含むと推定される試料を培養条件Ｘで培養する工程と、
（Ｂ）（Ａ）で得られた培養物または該培養物から必要に応じて単離した菌株を培養条件Ａで培養した場合に、（１）プロピオン酸生成量を増加させる、（２）酪酸生成量を増加させる、および（３）酢酸生成量を減少させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有する、菌株を同定する工程と、
（Ｃ）必要に応じて同定された菌株を単離する工程
を包含する、方法。
（項目Ｄ１ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｄ１ｂ） 培養条件Ｘが、試料１００μＬを、大麦若葉エキスを２０ｇ／ＬおよびＬ－システイン塩酸塩一水和物０．５ｇ／Ｌを含む培地（２５ｍＬ）中で３７℃で７日間培養し、これを繰り返して、培養液を培地にて１０７倍希釈し、希釈液１ｍＬを２５ｍＬの寒天培地に混釈して、Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０ガス下の３７℃でコロニーを形成させ、単一のコロニーをチップで吸い上げ、Reinforced Clostridial培地で培養して菌株を単離する条件をを含む、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｄ２）
Lactobacillus属細菌に属する菌株をスクリーニングする方法であって、該方法は
（Ａ）Lactobacillus属細菌を含むかまたは含むと推定される試料を培養条件Ｘで培養する工程と、
（Ｂ）（Ａ）で得られた培養物または該培養物から必要に応じて単離した菌株を培養条件Ａで培養した場合に菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる、菌株を同定する工程と、
（Ｃ）必要に応じて同定された菌株を単離する工程
を包含する、方法。
（項目Ｄ２ａ） 培養条件Ａが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
（項目Ｄ２ｂ） 培養条件Ｘが上記項目と同一である、上記項目のいずれか一項に記載の菌株。
【0005】
本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【0006】
なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【発明の効果】
【0007】
本開示の方法により、菌叢を改善し、その多様性を維持または向上する効果に優れた組成物を提供することができる。また本開示の菌叢を改善するための組成物を用いることで、改善された菌叢を生産することも可能となり、下痢や便秘、肥満、感染症、免疫疾患、がんなどの種々の健康障害に対する医薬の開発が可能であるため、医療分野への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0010】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【0011】
本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
【0012】
本明細書において、「菌叢」とは、細菌の集合を意味し、腸内細菌叢に限らず、例えば、皮膚上や口腔内などの細菌叢、人工的に生産した複数の細菌を混合した製剤等も含む。したがって、菌叢とは、ヒトや動物の腸内、皮膚、口腔内などで共存する多種多様な細菌や真菌等の菌の集まりやこれを人工的に生産したものを意味する。本明細書において、「菌叢の改善」とは、菌叢を構成する細菌や真菌等の菌の種類が多く、それらのバランスが良好になることを含む。好ましい実施形態の一つでは、菌叢は腸内細菌叢を指すことがあるが、本開示はこれに限定されない。
【0013】
本明細書において、「菌叢指標菌」とは、その菌の存在自体またはその存在量が、菌叢における細菌や真菌等の菌の多様性やバランスを指し示す指標となり得る菌をいう。例えば、酪酸やプロピオン酸を生産するRuminococcus属細菌やCoprococcus属細菌は、その存在量が増加することにより、短鎖脂肪酸である酪酸やプロピオン酸の生産量も増加し、菌叢の多様性やバランスが改善するため、菌叢指標菌となり得る。本明細書において、「菌叢指標菌の比率の改善」とは、菌叢における当該指標菌の存在比率が、菌叢を改善できるような比率に変化することをいう。例えば、菌叢におけるRuminococcus属細菌および／またはCoprococcus属細菌を増殖させるような変化は、菌叢における短鎖脂肪酸のバランスが改善するため、菌叢指標菌の比率の改善といえる。
【0014】
（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
【0015】
本開示の一局面において、少なくともLactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか１つを含む、菌叢を改善するための組成物が提供される。本開示の一実施形態において、本開示の組成物は、Lactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちのいずれか２つ、またはすべてを含むことができる。したがって、本開示の一実施形態において、本開示の組成物は、（１）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物およびフコース含有化合物、（２）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物およびフルクタン含有化合物、（３）フコース含有化合物およびフルクタン含有化合物、または（４）Lactobacillus属細菌もしくはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物を含むことができ。また他の実施形態において、本開示の組成物は、Lactobacillus属細菌に属する細菌のうち、いずれか２つ、もしくは３つ、またはそれらの抽出物を含むこともできる。したがって、本開示の一実施形態において、本開示の組成物は、Limosilactobacillus fermentum KS-001株（NITE BP-03546）、Limosilactobacillus fermentum KS-002株（NITE BP-03547）およびLacticaseibacillus paracasei KS-003株（NITE BP-03548）のうち、いずれか２つ、もしくは３つ、またはそれらの抽出物を含むこともできる。本開示の組成物は、菌叢を改善し、その多様性を維持または向上させるものとして有用である。
【0016】
一実施形態において、本開示の組成物は、菌叢を改善するために用いることができ、Lactobacillus属細菌またはその抽出物、フコース含有化合物、およびフルクタン含有化合物のうちの少なくとも１つを含むことができる。この３つの成分はいずれか１つだけを用いた場合でも菌叢を改善することができ、また３つ組み合わせた場合にはさらにその効果を向上させることができる。
【0017】
本開示の組成物を用いることによって改善する菌叢を構成する細菌の種類としては、例えば、短鎖脂肪酸組成を改善する細菌を含むことができる。短鎖脂肪酸は腸管上皮細胞の増殖や粘液分泌機能、水やミネラルの吸収のためのエネルギーとして利用される。また短鎖脂肪酸は、炎症性サイトカインの抑制作用などによる抗炎症作用、抗潰瘍作用を有することが知られている。一実施形態において、本開示の組成物は短鎖脂肪酸組成を改善するためのものとすることができ、例えば、菌叢における酪酸やプロピオン酸の生産量を増加させ、および／または酢酸の生産量を低下させることができる。酪酸やプロピオン酸は上皮細胞のエネルギーとして利用され、制御性Ｔ細胞の誘導、ＮＦ－κＢの抑制から抗炎症作用を発揮することが知られている。一実施形態において、菌叢中にすでにプロピオン酸が飽和して存在している場合には、本開示の組成物はプロピオン酸生産量を増加させることはないが、菌叢中におけるプロピオン酸が飽和していない、または存在量が少ない場合には、本開示の組成物はプロピオン酸の生産量を増加させることができる。
【0018】
本開示の一実施形態において、本開示の組成物は、菌叢指標菌の比率を改善することで、短鎖脂肪酸組成を改善することもできる。このような菌叢指標菌としては、Ruminococcus属細菌、Coprococcus属細菌などが挙げられ、本明細書では、通常特に他の定義で用いない限り、菌叢指標菌は、Ruminococcus属細菌およびCoprococcus属細菌からなる群より選択される少なくとも１つ、または２つからなる。Ruminococcus属細菌は酪酸やプロピオン酸を生産するため、このRuminococcus属細菌が菌叢において増殖することで、酪酸やプロピオン酸の生産量が増加し、短鎖脂肪酸組成を改善することができる。したがって、一実施形態において、本開示の組成物は、菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させるためのものとすることができる。
【0019】
＜Lactobacillus属細菌組成物＞
別の局面において、本開示は、Lactobacillus属細菌またはその抽出物を含む、菌叢を改善するための組成物が提供される。本開示の組成物は、菌叢を改善し、その多様性を維持または向上させるものとして有用である。
別の局面において、本開示は、Lactobacillus属細菌またはその抽出物を含む、菌叢を改善するための組成物が提供される。本開示の組成物は、菌叢を改善し、その多様性を維持または向上させるものとして有用である。
【0020】
一実施形態において、本開示の組成物に含まれるLactobacillus属細菌またはその抽出物に使用されるLactobacillus属細菌は、例えば、ＫＨ２ＰＯ４ ２．６７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌを加えたＧＡＭ培地で前培養して、糞便試料とともに培養した場合に、菌叢におけるプロピオン酸および／または酪酸を生産する細菌を増殖させるものである。他の実施形態において、Lactobacillus属細菌としては、これに限られるものではないが、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus agilis、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillusanimalis、Lactobacilus antrumi、Lactobacillus avarius、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus confusus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus fructosus、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus graminis、Lactobacillus halotolerans、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus iners、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kandleri、Lactobacillus kefir、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus lactis、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus minor、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus oris、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus pontis、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus viridescens、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus algidus、L.amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aviarius、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii、 Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis、Lactobacillus dextrinicus、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus equi、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus perolens、Lactobacillus protectus、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rennini、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rogosae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus zeae、またはLactobacillus zymaeなどを含むことができる。本明細書において、「Lactobacillus属細菌」という場合は、Lactobacillus属の再分類に伴う学名変更による新分類および／または旧分類においてLactobacillus属に分類されていた、あるいは分類されている細菌を包含する。したがって、分類基準が改訂され、Lactobacillus属に分類されていた細菌が、他の属に分類されることとなっても、本明細書における「Lactobacillus属細菌」には、そのような細菌も包含され得る。Lactobacillus属は２６０を超える種が存在する非常に大きな属であったものの、近縁な関係にある他の属種と併せて、ゲノム解析に基づく分類学的な検証がなされた結果、２３の新しい属が提案され、Lactobacillus属は既存の属名であるLactobacillus属およびParalactobacillus属を含む２５属に再編成されている（ZhengJ et al., Int J Syst Evol Microbiol (2020) 70, 2782-2858、Liu DD & Gu CT,Int J Syst Evol Microbiol (2020) 70, 6414-6417.）。したがって、Lactobacillus paracaseiはLacticaseibacillus paracaseiを、Lactobacillus fermentumはLimosilactobacillus fermentumをそれぞれ指し、本明細書においては相互互換に使用することができる。
【0021】
またLactobacillus属の再分類に伴う学名変更によってLactobacillus属であったものが変更された新しい属名としては、Acetilactobacillus属、Agrilactobacillus属、Amylolactobacillus属、Apilactobacillus属、Bombilactobacillus属、Companilactobacillus属、Dellaglioa属、Fructilactobacillus属、Furfurilactobacillus属、Holzapfelia属、Lacticaseibacillus属、Lactiplantibacillus属、Lapidilactobacillus属、Latilactobacillus属、Lentilactobacillus属、Levilactobacillus属、Ligilactobacillus属、Limosilactobacillus属、Liquorilactobacillus属、Loigolactobacillus属、Paralactobacillus属、Paucilactobacillus属、Schleiferilactobacillus属、Secundilactobacillus属などが挙げられる。そのため、これらの属に分類される細菌であっても、再分類前にLactobacillus属に分類されていた細菌については、本明細書における「Lactobacillus属細菌」に包含され得る。
【0022】
したがって、本開示の一実施形態において、Lactobacillus属細菌としては、好ましくは、上記のZheng J et al.およびLiu DD & Gu CTによる新分類でLacticaseibacillus属、Limosilactobacillus属、またはLactiplantibacillus属に属する細菌とすることができ、Lacticaseibacillus属としては、これらに限られるものではないが、Lacticaseibacillus baoqingensis、Lacticaseibacillus brantae、Lacticaseibacillus camelliae、Lacticaseibacillus casei、Lacticaseibacillus zeae、Lacticaseibacillus chiayiensis、Lacticaseibacillus hulanensis、Lacticaseibacillus manihotivorans、Lacticaseibacillus nasuensis、Lacticaseibacillus pantheris、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans、Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans、Lacticaseibacillus porcinae、Lacticaseibacillus rhamnosus、Lacticaseibacillus rhamnosus、Lacticaseibacillus saniviri、Lacticaseibacillus sharpeae、Lacticaseibacillus songhuajiangensis、Lacticaseibacillus thailandensis、Lacticaseibacillus daqingensis、Lacticaseibacillus hegangensis、Lacticaseibacillus suibinensis、Lacticaseibacillus yichunensis、Lacticaseibacillus jixianensis、Lacticaseibacillus zhaodongensisなどを挙げることができ、Limosilactobacillus属としては、これらに限られるものではないが、Limosilactobacillus alvi、Limosilactobacillus antri、Limosilactobacillus caviae、Limosilactobacillus coleohominis、Limosilactobacillus equigenerosi、Limosilactobacillus fermentum、Limosilactobacillus frumenti、Limosilactobacillus gastricus、Limosilactobacillus gorillae、Limosilactobacillus ingluviei、Limosilactobacillus mucosae、Limosilactobacillus oris、Limosilactobacillus panis、Limosilactobacillus pontis、Limosilactobacillus reuteri、Limosilactobacillus secaliphilus、Limosilactobacillus vaginalisなどを挙げることができ、またLactiplantibacillus属としては、これらに限られるものではないが、Lactiplantibacillus daoliensis、Lactiplantibacillus daowaiensis、Lactiplantibacillus dongliensis、Lactiplantibacillus fabifermentans、Lactiplantibacillus herbarum、Lactiplantibacillus modestisalitolerans、Lactiplantibacillus mudanjiangensis、Lactiplantibacillus nangangensis、Lactiplantibacillus paraplantarum、Lactiplantibacillus pentosus、Lactiplantibacillus pingfangensis、Lactiplantibacillus plajomi、Lactiplantibacillus argentoratensis、Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum、Lactiplantibacillus songbeiensis、Lactiplantibacillus xiangfangensisなどを挙げることができる。
【0023】
本開示の一実施形態において、Lactobacillus属細菌としては、さらに好ましくは、Lactobacillus paracasei（Lacticaseibacillus paracasei）、およびLactobacillus fermentum（Limosilactobacillus fermentum）を挙げることができ、Lacticaseibacillus属、およびLimosilactobacillus属に属する細菌は、ＤＮＡ配列の相同性から、Lactobacillus paracasei（Lacticaseibacillus paracasei）および／またはLactobacillus fermentum（Limosilactobacillus fermentum）と同様の性質を有すると考えられ、またLactiplantibacillus属に属する細菌は、部分配列が近縁のものとなるため、Lactobacillus paracasei（Lacticaseibacillus paracasei）および／またはLactobacillus fermentum（Limosilactobacillus fermentum）と同様の性質を有すると考えられる。
【0024】
また本開示の一実施形態において、本開示の組成物に含まれるLactobacillus属細菌またはその抽出物に使用されるLactobacillus属細菌は、培養条件Ａで培養した場合に、（１）プロピオン酸生成量を増加させる、（２）酪酸生成量を増加させる、および（３）酢酸生成量を減少させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有するものを挙げることができ、この場合、プロピオン酸生成量は少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、または約１．６倍に、また酪酸生成量は少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、または約１．８倍に増加させるものが好ましい。また酢酸生成量については多くとも約９５％以下、約９０％以下、または約８０％以下に減少させるものが好ましい。一実施形態において、培養条件Ａとしては、例えば、（１）ＫＨ２ＰＯ４ ２．６７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌを加えたＧＡＭ培地で約１６時間行う前培養と、（２）約１１５℃にて約１５分間オートクレーブしたＧＡＭ培地（ｐＨを約６．５に調整）に、添加培地濃度を約４０ｇ／Ｌとし、培養前に約３７℃にて約１時間、約０．２μｍ ＰＴＦＥ膜を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に曝気（約１５ｍＬ／分）した培地に、ヒト健常被験体の糞便試料（綿棒で取得したものであり、綿棒の先端に付着した量、おおよそ０．１ｇ）を約１％のＬ－アスコルビン酸を添加した約０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および約０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の６１．６５：２８．３５混合物からなる）約２ｍＬ中に懸濁して調製した懸濁物を約１００μＬ接種して、嫌気培養を行う本培養とを含むことができる。一実施形態において、培養の間、培地を濾過滅菌した混合ガスに曝気することにより、嫌気性条件を維持することもできる。また他の実施形態において、培養は培養系腸管モデル（ＫＵＨＩＭＭ）を用いることもできる。
【0025】
また本開示の一実施形態において、本開示の組成物に含まれるLactobacillus属細菌またはその抽出物に使用されるLactobacillus属細菌は、培養条件Ａで培養した場合に、（１）菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる、および（２）該菌叢におけるCoprococcus属細菌を増殖させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有するものを挙げることができる。培養条件Ａとしては、例えば、（１）ＫＨ２ＰＯ４ ２．６７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌを加えたＧＡＭ培地で約１６時間行う前培養と、（２）約１１５℃にて約１５分間オートクレーブしたＧＡＭ培地（ｐＨを約６．５に調整）に、添加培地濃度を約４０ｇ／Ｌとし、培養前に約３７℃にて約１時間、約０．２μｍ ＰＴＦＥ膜を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に曝気（約１５ｍＬ／分）した培地に、ヒト健常被験体の糞便試料（綿棒で取得したものであり、綿棒の先端に付着した量、おおよそ０．１ｇ）を約１％のＬ－アスコルビン酸を添加した約０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および約０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の６１．６５：２８．３５混合物からなる）約２ｍＬ中に懸濁して調製した懸濁物を約１００μＬ接種して、嫌気培養を行う本培養とを含むことができる。一実施形態において、培養の間、培地を濾過滅菌した混合ガスに曝気することにより、嫌気性条件を維持することもできる。また他の実施形態において、培養は培養系腸管モデル（ＫＵＨＩＭＭ）を用いることもできる。
【0026】
さらに他の実施形態において、本開示の組成物に含まれるLactobacillus属細菌またはその抽出物に使用されるLactobacillus属細菌は、培養条件Ａで培養した場合に、（１）菌叢におけるRuminococcus属細菌を少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、または約２０倍に増殖させる、および（２）該菌叢におけるCoprococcus属細菌を少なくとも約１．０５倍、約１．１倍、または約２．０倍に増殖させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有するものを挙げることができる。一実施形態において、培養条件Ａとしては、例えば、（１）ＫＨ２ＰＯ４ ２．６７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌを加えたＧＡＭ培地で約１６時間行う前培養と、（２）約１１５℃にて約１５分間オートクレーブしたＧＡＭ培地（ｐＨを約６．５に調整）に、添加培地濃度を約４０ｇ／Ｌとし、培養前に約３７℃にて約１時間、約０．２μｍ ＰＴＦＥ膜を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に曝気（約１５ｍＬ／分）した培地に、ヒト健常被験体の糞便試料（綿棒で取得したものであり、綿棒の先端に付着した量、おおよそ０．１ｇ）を約１％のＬ－アスコルビン酸を添加した約０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および約０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の６１．６５：２８．３５混合物からなる）約２ｍＬ中に懸濁して調製した懸濁物を約１００μＬ接種して、嫌気培養を行う本培養とを含むことができる。一実施形態において、培養の間、培地を濾過滅菌した混合ガスに曝気することにより、嫌気性条件を維持することもできる。また他の実施形態において、培養は培養系腸管モデル（ＫＵＨＩＭＭ）を用いることもできる。
【0027】
＜フコース含有化合物＞
別の局面において、本開示は、フコース含有化合物を含む、菌叢を改善するための組成物が提供される。本開示の組成物は、菌叢を改善し、その多様性を維持または向上させるものとして有用である。
別の局面において、本開示は、フコース含有化合物を含む、菌叢を改善するための組成物が提供される。本開示の組成物は、菌叢を改善し、その多様性を維持または向上させるものとして有用である。
【0028】
一実施形態において、本開示の組成物に含まれるフコース含有化合物としては、これに限られるものではないが、例えばフコイダン、ペクチン、またはキシログルカンなどを挙げることができる。フコイダンは、モズクなどの褐藻類に存在し、フコースを中心にガラクトース、マンノース、キシロース、ウロン酸、硫酸基等で構成されるヘテロ硫酸化多糖であり、免疫成分として注目されている。
【0029】
一実施形態において、フコイダンは、主にＬ－フコースが多数結合し、Ｌ－フコース残基の少なくとも一部に硫酸が結合し硫酸エステルを形成した硫酸化多糖である。Ｌ－フコース残基以外に、グルクロン酸残基やガラクトース残基が結合していてもよい。フコイダンは、コンブ、ワカメ、モズク、アカモク等の海藻から単離されたものであってもよい。
【0030】
＜フルクタン含有化合物＞
別の局面において、本開示は、フルクタン含有化合物を含む、菌叢を改善するための組成物が提供される。本開示の組成物は、菌叢を改善し、その多様性を維持または向上させるものとして有用である。
別の局面において、本開示は、フルクタン含有化合物を含む、菌叢を改善するための組成物が提供される。本開示の組成物は、菌叢を改善し、その多様性を維持または向上させるものとして有用である。
【0031】
一実施形態において、本開示の組成物に含まれるフルクタン含有化合物としては、これに限られるものではないが、麦葉やその抽出物、ニンニクやその抽出物、ラッキョウやその抽出物、タマネギやその抽出物を挙げることができる。
【0032】
麦葉は、麦類植物の緑葉により構成される。麦葉は、例えばビタミン、ミネラル、スクロース、デンプン、及びフルクタンを含有する。これらのうち、ビタミン及びミネラルは、高脂血症患者の血漿コレステロールを低下させるという効果を期待できる。また、スクロース、デンプン、及びフルクタンは、麦類植物が窒素飢餓の間、一時的な貯蔵炭水化物として麦葉に蓄積される。またフルクタンは、フルクトース由来のオリゴ糖及び多糖であり、それらの構造に基づいて、フルクタンは、イヌリン型(β２→１結合）、レバン型（β２→６結合）、グラミナン型（β２→１結合及びβ２→６結合）に分類される。
【0033】
麦類植物として、例えば、大麦、小麦、えん麦、及びライ麦が挙げられる。中でも麦類植物が大麦であることが好ましい。大麦は、世界に広く分布している穀物であるため、入手しやすい利点がある。麦類植物が大麦である場合、麦類植物の緑葉は大麦若葉であることが好ましい。大麦若葉は、一般的には若い大麦における葉の部分として知られているが、茎部分も含んでよい。
【0034】
麦葉の抽出物は、麦葉またはその乾燥粉末を水と混合し、攪拌したのちに、遠心分離処理を行い、その上清を必要に応じて凍結乾燥して利用することができる。麦葉またはその乾燥粉末は市販のものを用いてもよく、または大麦若葉などの麦葉や葉茎から得ることもできる。
【0035】
＜剤・添加成分＞
本開示の一実施形態において、本開示の組成物または本開示の組成物と菌叢とを含む剤は、その剤型に応じて、上記の成分とは別の調剤用添加剤、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、及び調味料等の添加剤をさらに含むことができる。このような添加剤や賦形剤としては、例えば、アスコルビン酸、ビオチン、パントテン酸カルシウム、カロテン、ナイアシン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、パントテン酸ナトリウム、チアミン塩酸塩、トコフェロール、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ等のビタミン類；メタリン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム等のリン酸ナトリウム類；ソルビン酸カルシウム、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム等の保存料；アラビアガム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、マンニット、ソルビトール、ラクトース、可溶性澱粉、アミノ酸類、グルコース、フラクトース、スクロース、ハチミツ、脂肪酸エステル、二酸化ケイ素を挙げることができる。
本開示の一実施形態において、本開示の組成物または本開示の組成物と菌叢とを含む剤は、その剤型に応じて、上記の成分とは別の調剤用添加剤、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、及び調味料等の添加剤をさらに含むことができる。このような添加剤や賦形剤としては、例えば、アスコルビン酸、ビオチン、パントテン酸カルシウム、カロテン、ナイアシン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、パントテン酸ナトリウム、チアミン塩酸塩、トコフェロール、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ等のビタミン類；メタリン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム等のリン酸ナトリウム類；ソルビン酸カルシウム、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム等の保存料；アラビアガム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、マンニット、ソルビトール、ラクトース、可溶性澱粉、アミノ酸類、グルコース、フラクトース、スクロース、ハチミツ、脂肪酸エステル、二酸化ケイ素を挙げることができる。
【0036】
本開示の一実施形態において、本開示の組成物または本開示の組成物と菌叢とを含む剤の剤型は、例えば、粉末、顆粒、ペレット、錠剤、カプセル剤、油状、及び液状とすることができる。
【0037】
本開示の一実施形態において、本開示の組成物または本開示の組成物と菌叢とを含む剤は、飲食品、医薬部外品、医薬品に含まれてもよい。このうち、飲食品としては、例えば野菜加工食品、海藻加工食品、肉類加工品等の各種加工食品；スープ、スナック菓子、パン類、麺類、氷菓子類、お茶、ジュース、コーヒー、健康食品を挙げることができる。
【0038】
本開示の一実施形態において、本開示の組成物または本開示の組成物と菌叢とを含む剤は、凍結乾燥させることで菌叢の改善効果をさらに向上させることができ、医薬組成物として利用することもできる。
【0039】
本開示の一実施形態において、本開示の組成物または本開示の組成物と菌叢とを含む剤を経口摂取させる場合には、例えば、凍結乾燥処理または再培養した本開示の組成物または菌叢を、一週間あたり１回または２回程度経口摂取させることができる。投与後例えば２１日後に糞便の菌叢を評価することで、その効果を確認することができる。一実施形態において、評価項目としては、特に限られるものではないが、例えば免疫サイトカイン量、免疫系細胞の挙動などを挙げることができる。
【0040】
一実施形態において、菌叢培養液の消化管における各種免疫細胞への作用については、例えば、Ｔｈ１７細胞の増殖又は集積を誘導する効果あるいは制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を確認することによって評価することができる。一実施形態において、これらの作用は、例えば、菌叢あるいは培養上清若しくは上清成分、又は菌叢に由来する生理活性物質を無菌マウス等の実験動物に経口投与し、その後、消化管におけるＣＤ４陽性細胞を単離し、該ＣＤ４陽性細胞に含有されるＴｈ１７細胞の比率あるいは該細胞に含まれる制御性Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーにより測定することによって確認することができる。
【0041】
本開示の新規Lactobacillus属細菌は、本開示の組成物に含まれるLactobacillus属細菌またはその抽出物として使用することができる。
【0042】
＜培養＞
本開示の一局面について、本開示の組成物を含む培養液において菌叢を培養することで、改善された菌叢を生産することができる。菌叢の培養方法は、本開示の組成物を含有する培養液に糞便を接種し、培養に適した環境下で増殖させることを含み、生体内または生体外で培養することもできる。
本開示の一局面について、本開示の組成物を含む培養液において菌叢を培養することで、改善された菌叢を生産することができる。菌叢の培養方法は、本開示の組成物を含有する培養液に糞便を接種し、培養に適した環境下で増殖させることを含み、生体内または生体外で培養することもできる。
【0043】
菌叢または菌の培養期間中、培養液の温度は所定温度に維持されていることが好ましい。この所定温度は、特に限定されないが、例えば約３７℃である。所定温度が約３７℃であると、ヒトの体温（具体的には腸内温度）に模した温度で菌叢または菌は増殖できる。また、菌叢または菌の培養期間は、培養液の量や濁度等に応じて任意に設定されるため、特に限定されない。菌叢または菌の培養期間は、例えば、約４８時間であり、約７２時間とすることもできる。
【0044】
菌叢または菌を培養するにあたって、例えば、ＫＵＨＩＭＭ（神戸大学ヒト腸管細菌叢モデル（Kobe University Human IntestinalMicrobiota Model）Sasaki D et al 2018 SciRep 8 435(2018)）を採用することができる。ＫＵＨＩＭＭは、外因性機能化合物、すなわちヒト腸内細菌叢におけるプレバイオティクスの効果を評価したり、シミュレートしたりするための有用なモデルである。そして、ＫＵＨＩＭＭでは、大腸における短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生を再現することができる。例えば、潰瘍性大腸炎患者でみられる酪酸産生の低下をＫＵＨＩＭＭで再現できる。ＫＵＨＩＭＭは、複数の培養槽を備える多チャンネル発酵装置に適用することもでき、または任意のジャーファーメンターに適用することもできる。一実施形態において、菌叢または菌を培養するにあたって、培養条件としては、例えば、（１）ＫＨ２ＰＯ４ ２．６７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌを加えたＧＡＭ培地で約１６時間行う前培養と、（２）約１１５℃にて約１５分間オートクレーブしたＧＡＭ培地（ｐＨを約６．５に調整）に、添加培地濃度を約４０ｇ／Ｌとし、培養前に約３７℃にて約１時間、約０．２μｍ ＰＴＦＥ膜を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に曝気（約１５ｍＬ／分）した培地に、ヒト健常被験体の糞便試料（綿棒で取得したものであり、綿棒の先端に付着した量、おおよそ０．１ｇ）を約１％のＬ－アスコルビン酸を添加した約０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および約０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の６１．６５：２８．３５混合物からなる）約２ｍＬ中に懸濁して調製した懸濁物を約１００μＬ接種して、嫌気培養を行う本培養とを含むことができる。
【0045】
培養液に糞便を接種する際、糞便を培養液に直接接種してもよく、糞便を一旦水などに懸濁させてなる懸濁液を培養液に接種してもよい。懸濁液を培養液に接種する場合、懸濁液の量は、特に限定されないが、例えば、培養液の体積に対して約１／１０００である。
【0046】
本開示の一実施形態において、培養液に接種される糞便は、特に限られるものではないが、糞便採取前の２ヶ月以上、抗生物質による治療をうけていない健常人から提供を受けたものであることが好ましい。また、この健常人には、糖尿病、肝疾患、腎臓病、及び食物アレルギー等を含む各種疾患の既往歴または疑いがないことが好ましい。
【0047】
菌叢または菌の培養では、糞便接種前の培養液に本開示の組成物が配合される。本開示の組成物の配合量は、特に限られるものではないが、例えば、培養液の全質量に対して、約１．５質量％以上であることが好ましい。すなわち、培養液は、約１．５質量％以上の本開示の組成物を含有することが好ましい。ここで、「約１．５質量％」は、ヒトが約６質量部（具体的には、約６ｇ）の本開示の組成物を摂取した場合に腸内（特に糞便）に存在する本開示の組成物の濃度を想定した値である。
【0048】
本開示の一局面において、本開示の組成物を、または本開示の組成物と菌叢とを含む剤を経口摂取させることで菌叢を改善することができる。本開示の組成物は上記のとおり短鎖脂肪酸組成を改善し、菌叢における酪酸生産量を増加させ、菌叢におけるプロピオン酸生産量を増加させ、菌叢における酢酸生産量を低下させ、及び／または菌叢指標菌の比率を改善し、菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させることができるため、本開示の一実施形態において、本開示の組成物または本開示の組成物と菌叢とを含む剤を摂取することによって、生体内において、本開示の組成物を用いて菌叢または菌を培養した場合と同等の効果が期待できる。
【0049】
本開示の組成物を用いて菌叢または菌を培養すると、培養液中でRuminococcus属細菌を増殖させることができる。Ruminococcus属細菌が増殖すると、菌叢におけるプロピオン酸生成量及び／または酪酸生成量が増加し、一実施形態において、本開示の組成物を用いていない場合と比べて、プロピオン酸生成量は少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、または約１．６倍に、また酪酸生成量は少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、または約１．８倍に増加させることができる。
【0050】
＜Lactobacillus属細菌およびそのスクリーニング＞
本開示の一局面において、本開示は、Lactobacillus属細菌に属する菌株をスクリーニングする方法であって、該方法は（Ａ）Lactobacillus属細菌を含むかまたは含むと推定される試料を培養条件Ｘで培養する工程と、（Ｂ）（Ａ）で得られた培養物または該培養物から必要に応じて単離した菌株を培養条件Ａで培養した場合に、（１）プロピオン酸生成量を増加させる、（２）酪酸生成量を増加させる、および（３）酢酸生成量を減少させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有する、菌株を同定する工程と、（Ｃ）必要に応じて同定された菌株を単離する工程を包含する、方法を提供することができる。
本開示の一局面において、本開示は、Lactobacillus属細菌に属する菌株をスクリーニングする方法であって、該方法は（Ａ）Lactobacillus属細菌を含むかまたは含むと推定される試料を培養条件Ｘで培養する工程と、（Ｂ）（Ａ）で得られた培養物または該培養物から必要に応じて単離した菌株を培養条件Ａで培養した場合に、（１）プロピオン酸生成量を増加させる、（２）酪酸生成量を増加させる、および（３）酢酸生成量を減少させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有する、菌株を同定する工程と、（Ｃ）必要に応じて同定された菌株を単離する工程を包含する、方法を提供することができる。
【0051】
本明細書において「培養条件Ｘ」とは、試料１００μＬを、大麦若葉エキスを２０ｇ／ＬおよびＬ－システイン塩酸塩一水和物０．５ｇ／Ｌを含む培地（２５ｍＬ）中で３７℃で７日間培養し、これを繰り返して、培養液を培地にて１０７倍希釈し、希釈液１ｍＬを２５ｍＬの寒天培地に混釈して、Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０ガス下の３７℃でコロニーを形成させ（ここで使用される、寒天培地は、大麦若葉エキスを含む培地に寒天末（例えば、Code:01059-85、ナカライテスクのものを使用し得るが他社の市販品も使用し得る）を終濃度１％で加えることで作製する）、単一のコロニーをチップで吸い上げ、Reinforced Clostridial培地（例えば、Code:CM0149、OxoidCulture Media productのものを使用し得る）で培養して菌株を単離する条件をいう。
【0052】
本明細書において、「培養条件Ａ」とは、（１）ＫＨ２ＰＯ４ ２．６７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌを加えたＧＡＭ培地で約１６時間行う前培養と、（２）約１１５℃にて約１５分間オートクレーブしたＧＡＭ培地（ｐＨを約６．５に調整）に、添加培地濃度を約４０ｇ／Ｌとし、培養前に約３７℃にて約１時間、約０．２μｍ ＰＴＦＥ膜を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に曝気（約１５ｍＬ／分）した培地に、ヒト健常被験体の糞便試料（綿棒で取得したものであり、綿棒の先端に付着した量、おおよそ０．１ｇ）を約１％のＬ－アスコルビン酸を添加した約０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および約０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の６１．６５：２８．３５混合物からなる）約２ｍＬ中に懸濁して調製した懸濁物を約１００μＬ接種して、嫌気培養を行う本培養とを含む条件をいう。培養条件Ａで使用されるＧＡＭ培地は、５９．０ｇ（１Ｌ分）中、ペプトン１０．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン１０．０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇを含み、ｐＨ７．１としたものをいい、代表的には、日水製薬株式会社からカタログ番号Ｃｏｄｅ ０５４２２で販売されるものが使用されるが他社の市販品を用いてもよく、自己で調製してもよい。本明細書において、嫌気性条件は、培養の間、培地を濾過滅菌した混合ガスに曝気することができる。本明細書において、培養は培養系腸管モデル（ＫＵＨＩＭＭ）（生田ら、Ｎｅｗ ｆｏｏｄ ｉｎｄｕｓｔｒｙ＝ニューフードインダストリー：食品加工および資材の新知識 ６０（５），３７－４３，２０１８を参照）を用いることができる。
【0053】
また本開示の他の局面において、本開示は、Lactobacillus属細菌に属する菌株をスクリーニングする方法であって、該方法は（Ａ）Lactobacillus属細菌を含むかまたは含むと推定される試料を培養条件Ｘで培養する工程と、（Ｂ）（Ａ）で得られた培養物または該培養物から必要に応じて単離した菌株を培養条件Ａで培養した場合に菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる、菌株を同定する工程と、（Ｃ）必要に応じて同定された菌株を単離する工程を包含する、方法を提供することができる。
【0054】
本開示の一局面において、Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、（１）プロピオン酸生成量を増加させる、（２）酪酸生成量を増加させる、および（３）酢酸生成量を減少させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有する、菌株を提供する。
【0055】
本開示の一局面において、Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる菌株を提供する。
【0056】
本開示の一実施形態において、このようなLactobacillus属細菌は、本開示の組成物としても利用することができるため、当該菌株は、培養条件Ａにおいて（１）プロピオン酸生成量を少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、または約１．６倍に増加させる、（２）酪酸生成量を少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、または約１．８倍に増加させる、および（３）酢酸生成量を多くとも約９５％以下、約９０％以下、または約８０％以下に減少させる、の少なくとも１つの特徴を有することができる。
【0057】
また本開示の他の局面において、Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる、菌株が提供される。
【0058】
また他の局面において、Lactobacillus属細菌に属する菌株であって、該菌株は培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、または約２０倍に増殖させる、菌株を提供することができる。
【0059】
この新規Lactobacillus属細菌としては、これに限られるものではないが、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus agilis、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillusanimalis、Lactobacilus antrumi、Lactobacillus avarius、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus confusus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus fructosus、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus graminis、Lactobacillus halotolerans、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus iners、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kandleri、Lactobacillus kefir、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus lactis、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus minor、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus oris、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus pontis、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus viridescens、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aviarius、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii、 Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis、Lactobacillus dextrinicus、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus equi、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus perolens、Lactobacillus protectus、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rennini、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rogosae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus zeae、またはLactobacillus zymaeなどを含むことができる。
【0060】
他の実施形態において、Lactobacillus属細菌としては、これに限られるものではないが、上記のZheng J et al.およびLiu DD &Gu CTによる新分類でLacticaseibacillus属、Limosilactobacillus属、またはLactiplantibacillus属に属する細菌とすることができ、Lacticaseibacillus属としては、これらに限られるものではないが、Lacticaseibacillus baoqingensis、Lacticaseibacillus brantae、Lacticaseibacillus camelliae、Lacticaseibacillus casei、Lacticaseibacillus zeae、Lacticaseibacillus chiayiensis、Lacticaseibacillus hulanensis、Lacticaseibacillus manihotivorans、Lacticaseibacillus nasuensis、Lacticaseibacillus pantheris、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei、Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans、Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans、Lacticaseibacillus porcinae、Lacticaseibacillus rhamnosus、Lacticaseibacillus rhamnosus、Lacticaseibacillus saniviri、Lacticaseibacillus sharpeae、Lacticaseibacillus songhuajiangensis、Lacticaseibacillus thailandensis、Lacticaseibacillus daqingensis、Lacticaseibacillus hegangensis、Lacticaseibacillus suibinensis、Lacticaseibacillus yichunensis、Lacticaseibacillus jixianensis、Lacticaseibacillus zhaodongensisなどを挙げることができ、Limosilactobacillus属としては、これらに限られるものではないが、Limosilactobacillus alvi、Limosilactobacillus antri、Limosilactobacillus caviae、Limosilactobacillus coleohominis、Limosilactobacillus equigenerosi、Limosilactobacillus fermentum、Limosilactobacillus frumenti、Limosilactobacillus gastricus、Limosilactobacillus gorillae、Limosilactobacillus ingluviei、Limosilactobacillus mucosae、Limosilactobacillus oris、Limosilactobacillus panis、Limosilactobacillus pontis、Limosilactobacillus reuteri、Limosilactobacillus secaliphilus、Limosilactobacillus vaginalisなどを挙げることができ、またLactiplantibacillus属としては、これらに限られるものではないが、Lactiplantibacillus daoliensis、Lactiplantibacillus daowaiensis、Lactiplantibacillus dongliensis、Lactiplantibacillus fabifermentans、Lactiplantibacillus herbarum、Lactiplantibacillus modestisalitolerans、Lactiplantibacillus mudanjiangensis、Lactiplantibacillus nangangensis、Lactiplantibacillus paraplantarum、Lactiplantibacillus pentosus、Lactiplantibacillus pingfangensis、Lactiplantibacillus plajomi、Lactiplantibacillus argentoratensis、Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum、Lactiplantibacillus songbeiensis、Lactiplantibacillus xiangfangensisなどを挙げることができる。
【0061】
別の局面において、本開示は、新規Lactobacillus属細菌を提供し、この新規Lactobacillus属細菌は、培養条件Ａで培養した場合に、（１）プロピオン酸生成量を増加させる、（２）酪酸生成量を増加させる、および（３）酢酸生成量を減少させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有するものを挙げることができ、この場合、プロピオン酸生成量は少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、または約１．６倍に、また酪酸生成量は少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、または約１．８倍に増加させるものが好ましい。また酢酸生成量については多くとも約９５％以下、約９０％以下、または約８０％以下に減少させるものが好ましい。
【0062】
別の局面において、本開示は、新規Lactobacillus属細菌を提供し、このLactobacillus属細菌は、培養条件Ａで培養した場合に、（１）菌叢におけるRuminococcus属細菌を増殖させる、および（２）該菌叢におけるCoprococcus属細菌を増殖させる、のうちの少なくとも１つの特徴を有するものを挙げることができる。このようなLactobacillus属細菌の少なくとも１つ（例えば、本明細書の実施例において取得されるもの）は、これまでに報告のないものを含む新規菌株であるということができる。
【0063】
別の局面において、本開示は、新規Lactobacillus属細菌を提供し、このLactobacillus属細菌は、培養条件Ａで培養した場合に、菌叢におけるRuminococcus属細菌を少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、または約２０倍に増殖させるものを挙げることができる。
【0064】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８９）． Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ； Ｓｎｉｎｓｋｙ， Ｊ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９９）． ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８９）． Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ； Ｓｎｉｎｓｋｙ， Ｊ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９９）． ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【0065】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．（１９８５）． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．（１９９０）． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｆ．（１９９１）． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ａｄａｍｓ， Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）． Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ； Ｓｈａｂａｒｏｖａ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ； Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｇ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９６）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【0066】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【0067】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例0068】
（実施例１：糞便試料の採取および培養）
糞便試料の採取
健常者から糞便試料を採取した。なお実験参加者は、半年以上にわたりいかなる抗生物質も受けていない者であった。実験参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。本実験は、神戸大学医学部附属病院のガイドラインに従って行い、神戸大学の治験倫理審査委員会によって認可された。本実験で使用した全ての方法は、神戸大学の医療倫理による認可ガイドラインに従った。糞便試料は採取後、嫌気性培養スワブ（２１２５５０ ＢＤ ＢＢＬ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｗａｂ；ベクトン・ティッキンソンアンドカンパニー製）内に保管し、実験室に送付した。
糞便試料の採取
健常者から糞便試料を採取した。なお実験参加者は、半年以上にわたりいかなる抗生物質も受けていない者であった。実験参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。本実験は、神戸大学医学部附属病院のガイドラインに従って行い、神戸大学の治験倫理審査委員会によって認可された。本実験で使用した全ての方法は、神戸大学の医療倫理による認可ガイドラインに従った。糞便試料は採取後、嫌気性培養スワブ（２１２５５０ ＢＤ ＢＢＬ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｗａｂ；ベクトン・ティッキンソンアンドカンパニー製）内に保管し、実験室に送付した。
【0069】
大麦若葉エキスの調整方法
大麦若葉青汁粉末（健康食品の原料屋）１００ｇを超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）９００ｍＬと混ぜて、４℃で６時間撹拌する。続いて５００ｇで１分間の遠心分離により上清を回収する。上清は凍結後に、真空凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を大麦若葉エキスとして使用した。
大麦若葉青汁粉末（健康食品の原料屋）１００ｇを超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）９００ｍＬと混ぜて、４℃で６時間撹拌する。続いて５００ｇで１分間の遠心分離により上清を回収する。上清は凍結後に、真空凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を大麦若葉エキスとして使用した。
【0070】
Lactobacillus属の単離方法
便試料１００μＬを大麦若葉エキス ２０ｇ／ＬおよびＬ－システイン塩酸塩一水和物（Ｃｏｄｅ： １０３１３－４２、ナカライテスク） ０．５ｇ／Ｌを含む培地中で３７℃、気相Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０にて７日間培養し、これを再度繰り返して、培養液をこの培地にて１０７倍希釈した。希釈液１ｍＬを２５ｍＬの寒天培地に混釈して、気相Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：２０：２０ガス下の３７℃でコロニーを形成させた。寒天培地は、同濃度の大麦若葉エキスおよびＬ－システイン塩酸塩一水和物を含む培地に寒天末（Ｃｏｄｅ： ０１０５９－８５、ナカライテスク）を終濃度１％で加えて作成した。単一のコロニーをチップで吸い上げ、Reinforced Clostridial培地（Ｃｏｄｅ： ＣＭ０１４９、Ｏｘｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ｐｒｏｄｕｃｔ）で培養し、Lactobacillus paracasei(Lacticaseibacillus paracasei)、およびLactobacillus fermentum(Limosilactobacillus fermentum)を単離した。菌の同定はゲノムＤＮＡを以下に記載の方法で抽出した。プライマーＳ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０３４１－ｂ－Ｓ－１７ (5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)（配列番号１）およびＳ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０７８５－ａ－Ａ－２１(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)（配列番号２）を使用してＰＣＲを行い、ジェネティックアナライザ３５００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて遺伝子配列を読み実施した。
便試料１００μＬを大麦若葉エキス ２０ｇ／ＬおよびＬ－システイン塩酸塩一水和物（Ｃｏｄｅ： １０３１３－４２、ナカライテスク） ０．５ｇ／Ｌを含む培地中で３７℃、気相Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０にて７日間培養し、これを再度繰り返して、培養液をこの培地にて１０７倍希釈した。希釈液１ｍＬを２５ｍＬの寒天培地に混釈して、気相Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：２０：２０ガス下の３７℃でコロニーを形成させた。寒天培地は、同濃度の大麦若葉エキスおよびＬ－システイン塩酸塩一水和物を含む培地に寒天末（Ｃｏｄｅ： ０１０５９－８５、ナカライテスク）を終濃度１％で加えて作成した。単一のコロニーをチップで吸い上げ、Reinforced Clostridial培地（Ｃｏｄｅ： ＣＭ０１４９、Ｏｘｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ｐｒｏｄｕｃｔ）で培養し、Lactobacillus paracasei(Lacticaseibacillus paracasei)、およびLactobacillus fermentum(Limosilactobacillus fermentum)を単離した。菌の同定はゲノムＤＮＡを以下に記載の方法で抽出した。プライマーＳ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０３４１－ｂ－Ｓ－１７ (5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)（配列番号１）およびＳ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０７８５－ａ－Ａ－２１(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)（配列番号２）を使用してＰＣＲを行い、ジェネティックアナライザ３５００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて遺伝子配列を読み実施した。
【0071】
糞便試料の採取および培養
マルチチャンネル培養器（Ｂｉｏ Ｊｒ．８；エイブル株式会社製）を用いるヒト大腸を模した１回バッチ式培養装置を作製した。本インビトロモデル装置は、８つの並列した独立の容器からなり、各容器に、１００ｍＬのオートクレーブ（１１５℃にて１５分間）した岐阜大学処方嫌気性培地（ＧＡＭ培地［Ｃｏｄｅ ０５４２２］；日水製薬株式会社製）を入れ、培養開始時ｐＨを６．５に調整し、添加培地濃度を４０ｇ／Ｌとした。
マルチチャンネル培養器（Ｂｉｏ Ｊｒ．８；エイブル株式会社製）を用いるヒト大腸を模した１回バッチ式培養装置を作製した。本インビトロモデル装置は、８つの並列した独立の容器からなり、各容器に、１００ｍＬのオートクレーブ（１１５℃にて１５分間）した岐阜大学処方嫌気性培地（ＧＡＭ培地［Ｃｏｄｅ ０５４２２］；日水製薬株式会社製）を入れ、培養開始時ｐＨを６．５に調整し、添加培地濃度を４０ｇ／Ｌとした。
【0072】
培養前に３７℃にて１時間、０．２μｍ ＰＴＦＥ膜（ポール・コーポレーション製）を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に曝気（１５ｍＬ／分）することにより、培養容器の嫌気性条件を構築した。接種物の調製のため、各糞便試料（綿棒で取得したものであり、綿棒の先端に付着した量、おおよそ０．１ｇ）を、１％のＬ－アスコルビン酸（和光純薬工業株式会社製）を添加した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５，０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４の６１．６５：２８．３５混合物からなる）２ｍＬ中に懸濁した。１００μＬの上記糞便懸濁液を各培地含有容器内に接種して、試験対象となる成分（次段落に記載）を加えるまたは加えないで、嫌気培養（本実施例で、「本培養」ともいう）を開始した。培養の間、培地を濾過滅菌した混合ガスに曝気することにより、嫌気性条件を維持した。
【0073】
Lactobacillus属（Limosilactobacillus fermentum KS-001株（NITE BP-03546）、Limosilactobacillus fermentum KS-002株（NITE BP-03547）、Lacticaseibacillus paracasei KS-003株（NITE BP-03548））はＫＨ２ＰＯ４ ２．６７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・５Ｈ２Ｏ ０．１０ｇ／Ｌを加えてＧＡＭ培地で約１６時間前培養を行った。上記で説明した本培養の培養開始時に、容器の側面の突出部分よりLactobacillus属（１×１０８－細胞数／ｍＬ）、大麦若葉エキス（１０ｇ／Ｌ）、フコイダン（５ｇ／Ｌ）をそれぞれ単独、２剤併用、または３剤併用にて添加した。本培養の培養開始時、４８時間後に、容器の側面の突出部分より培養液の一部を回収した。培養期間中５分毎にｐＨデータを採取した。培養開始時の試料（糞便試料）および培養４８時間後に回収した試料（培養液）については、菌叢評価にも使用した。培養４８時間後に回収した試料（培養液）については、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）定量にも使用した。なお糞便試料および培養液は、測定に供するまで－２０℃下に保管した。
【0074】
短鎖脂肪酸の濃度測定方法
短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）濃度は、液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（株式会社島津製作所）を使用して測定した。ＨＰＬＣは、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）および示差屈折率検出器－１０Ａ（株式会社島津製作所）を備えている。
短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）濃度は、液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（株式会社島津製作所）を使用して測定した。ＨＰＬＣは、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）および示差屈折率検出器－１０Ａ（株式会社島津製作所）を備えている。
【0075】
ヒト健常被験体を用いた場合のそれぞれの菌叢培養液の短鎖脂肪酸解析結果を図１および４に示した。多くの場合で酢酸量の減少が認められ、またすべての場合で酪酸量の増加が認められた。
【0076】
（実施例２：糞便培養液の菌叢評価）
微生物ＤＮＡの抽出
培養開始時の試料（糞便試料）および培養４８時間後に回収した試料（培養液）について、大腸内細菌叢の菌のＤＮＡ抽出を下記のようにして行った。ＤＮＡ抽出における抽出液には、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）飽和フェノール５００μＬ、溶菌緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，０．５Ｍ ＥＤＴＡ）２５０μＬ、１０％ＳＤＳ ５０μＬ、ガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）０．３ｇを用いた。試料に抽出液を２００μＬ添加したものをＦａｓｔＰｒｅｐ２４ （ＭＰ）を用い、パワーレベル５．０で３０秒間縦方向に激しく振とうし、菌体を破砕した。そして、遠心分離により上清を回収しフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを用いてタンパク質変性後イソプロパノール沈殿によりＤＮＡを析出させた。ＤＮＡを析出させて、１００μＬのＴＥに溶解したものを鋳型ＤＮＡとして使用した。精製したＤＮＡを、使用するまで－２０℃下に保管した。
微生物ＤＮＡの抽出
培養開始時の試料（糞便試料）および培養４８時間後に回収した試料（培養液）について、大腸内細菌叢の菌のＤＮＡ抽出を下記のようにして行った。ＤＮＡ抽出における抽出液には、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）飽和フェノール５００μＬ、溶菌緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，０．５Ｍ ＥＤＴＡ）２５０μＬ、１０％ＳＤＳ ５０μＬ、ガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）０．３ｇを用いた。試料に抽出液を２００μＬ添加したものをＦａｓｔＰｒｅｐ２４ （ＭＰ）を用い、パワーレベル５．０で３０秒間縦方向に激しく振とうし、菌体を破砕した。そして、遠心分離により上清を回収しフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを用いてタンパク質変性後イソプロパノール沈殿によりＤＮＡを析出させた。ＤＮＡを析出させて、１００μＬのＴＥに溶解したものを鋳型ＤＮＡとして使用した。精製したＤＮＡを、使用するまで－２０℃下に保管した。
【0077】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定
ゲノムＤＮＡを、Ｓ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０３４１－ｂ－Ｓ－１７（(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’) （配列番号１））およびＳ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０７８５－ａ－Ａ－２１(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’) （配列番号２）のプライマー対を用いた細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域の増幅に供した。イルミナアダプターオーバーハングヌクレオチド配列（イルミナ株式会社製）を遺伝子特異的配列に付加した。製造者作成の説明書に従ってＰＣＲサイクリング反応を行った。確認したアンプリコンをＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡ精製ビーズ（ベックマン・コールター株式会社製）を用いて精製し、２５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中に溶出させた。精製後のアンプリコンをＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００ ＤＮＡ １０００チップ（アジレント・テクノロジー株式会社製）において定量し、等モル濃度（５ｎＭ）に調製した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子産物を内部コントロール（ＰｈｉＸコントロールＶ３；イルミナ株式会社製）と共に、６００サイクルＭｉＳｅｑ試薬キット（イルミナ株式会社製）によりＭｉＳｅｑシーケンサー（イルミナ株式会社製）を用いて、ペアエンドシーケンスに供した。ＰｈｉＸ配列を除去し、２０以上のＱスコアのペアエンドリードを、ソフトウェアパッケージＱＩＩＭＥ ２バージョン２０２０．８を用いて結合した。キメラ配列を同定し、ライブラリーから排除した。Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ） Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いてＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓ系統学的データベースによって、ペアエンドリードを系統学的に分類した。９７％類似性に達したＯＴＵ（Operational Taxonomic Unit）を、シャノン・ウィーナー指数の多様性比較のために用いた。
ゲノムＤＮＡを、Ｓ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０３４１－ｂ－Ｓ－１７（(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’) （配列番号１））およびＳ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０７８５－ａ－Ａ－２１(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’) （配列番号２）のプライマー対を用いた細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域の増幅に供した。イルミナアダプターオーバーハングヌクレオチド配列（イルミナ株式会社製）を遺伝子特異的配列に付加した。製造者作成の説明書に従ってＰＣＲサイクリング反応を行った。確認したアンプリコンをＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡ精製ビーズ（ベックマン・コールター株式会社製）を用いて精製し、２５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中に溶出させた。精製後のアンプリコンをＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００ ＤＮＡ １０００チップ（アジレント・テクノロジー株式会社製）において定量し、等モル濃度（５ｎＭ）に調製した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子産物を内部コントロール（ＰｈｉＸコントロールＶ３；イルミナ株式会社製）と共に、６００サイクルＭｉＳｅｑ試薬キット（イルミナ株式会社製）によりＭｉＳｅｑシーケンサー（イルミナ株式会社製）を用いて、ペアエンドシーケンスに供した。ＰｈｉＸ配列を除去し、２０以上のＱスコアのペアエンドリードを、ソフトウェアパッケージＱＩＩＭＥ ２バージョン２０２０．８を用いて結合した。キメラ配列を同定し、ライブラリーから排除した。Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ） Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いてＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓ系統学的データベースによって、ペアエンドリードを系統学的に分類した。９７％類似性に達したＯＴＵ（Operational Taxonomic Unit）を、シャノン・ウィーナー指数の多様性比較のために用いた。
【0078】
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲをＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）９６システム（ロシュ・ダイアグノシティックス株式会社製）を用いて行った。Takagi, R. et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One 11,e0160533 (2016).に記載のように、全腸内細菌をターゲットにするプライマーセット（ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT（配列番号３）およびGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC）（配列番号４）を用いた増幅を行った。
リアルタイムＰＣＲをＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）９６システム（ロシュ・ダイアグノシティックス株式会社製）を用いて行った。Takagi, R. et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One 11,e0160533 (2016).に記載のように、全腸内細菌をターゲットにするプライマーセット（ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT（配列番号３）およびGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC）（配列番号４）を用いた増幅を行った。
【0079】
バイオインフォマティクス
シャノン・ウィーナー多様性指数を、ＱＩＩＭＥ ２ソフトウェアパッケージを用いて算出した。
シャノン・ウィーナー多様性指数を、ＱＩＩＭＥ ２ソフトウェアパッケージを用いて算出した。
【0080】
Limosilactobacillus fermentum KS-001株（NITE BP-03546）を用いた場合のそれぞれの菌叢培養液のＯＴＵ（Operational Taxonomic Unit）およびシャノン・ウィーナー指数の多様性比較結果を図２に示した。いずれの場合も比較例とほぼ同等であった。またLimosilactobacillus fermentum KS-002株（NITE BP-03547）およびLacticaseibacillus paracasei KS-003株（NITE BP-03548）を用いた場合にもＯＴＵおよびシャノン・ウィーナー指数の多様性比較結果は同様のものとなった。また各種細菌の相対存在量を図３および５に示した。いずれの場合もRuminococcus属細菌の含有率が顕著に増加していた。
【0081】
（実施例３：凍結乾燥処理および菌叢の再培養）
培養液１ｍＬを遠心して菌体を沈降させて、上清８００μＬを除去する。菌体を含む液２００μＬに８％スキムミルク（Ｃｏｄｅ：３１１４９－７５、ナカライテスク）、０．８％グルタミン酸ナトリウム（Ｃｏｄｅ：１６９１４－０５，ナカライテスク）を添加して混合して、真空凍結乾燥する。乾燥後にガス相をＮ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０に置換して低温（４℃前後）で保存する。
培養液１ｍＬを遠心して菌体を沈降させて、上清８００μＬを除去する。菌体を含む液２００μＬに８％スキムミルク（Ｃｏｄｅ：３１１４９－７５、ナカライテスク）、０．８％グルタミン酸ナトリウム（Ｃｏｄｅ：１６９１４－０５，ナカライテスク）を添加して混合して、真空凍結乾燥する。乾燥後にガス相をＮ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０に置換して低温（４℃前後）で保存する。
【0082】
再培養時に、ＧＡＭ培地１ｍＬに懸濁してマルチチャンネル培養器で実施例１と同様に培養する。
【0083】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年２月２５日に出願された特願２０２１－２９１６５に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年２月２５日に出願された特願２０２１－２９１６５に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【0084】
本開示の方法によって、菌叢を改善し、その多様性を維持または向上する効果に優れた組成物を提供することができるため、菌叢が関連する種々の健康障害に対する医薬の開発が可能となり、医療分野への応用が期待できる。
【受託番号】
【0085】
Limosilactobacillus fermentum KS-001株（NITE BP-03546）
【0086】
Limosilactobacillus fermentum KS-002株（NITE BP-03547）
【0087】
Lacticaseibacillus paracasei KS-003株（NITE BP-03548）
【配列表フリーテキスト】
【0088】
配列番号１～２：実施例１及び２で用いたプライマー
配列番号３～４：全腸内細菌ターゲットプライマー
配列番号３～４：全腸内細菌ターゲットプライマー
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】