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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022130332
(43)【公開日】2022-09-06
(54)【発明の名称】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220830BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20220830BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220830BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220830BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220830BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20220830BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/10
A61K39/395 N
A61P31/14
A61P43/00 105
A61P43/00 111
G01N33/569 L
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022024995
(22)【出願日】2022-02-21
(31)【優先権主張番号】P 2021029050
(32)【優先日】2021-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】516255448
【氏名又は名称】株式会社Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】稲浦 峻亮
(72)【発明者】
【氏名】松村 佑太
(72)【発明者】
【氏名】東條 卓人
(72)【発明者】
【氏名】長見 篤
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085AA16
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA53
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体及びその利用法を提供する。
【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【選択図】なし
【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【請求項2】
Ｎ－タンパク質に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項3】
ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項4】
ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項5】
ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項6】
請求項１又は２記載の抗体をコードする核酸。
【請求項7】
以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項記載の抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項記載の抗体を含有する医薬。
【請求項10】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための請求項９記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２，；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）やＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同様ベータコロナウイルス属に属し、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行（パンデミック）を引き起こしている。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度で、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。また、ウイルス粒子（ビリオン）は、５０～２００ｎｍほどの大きさである。一般的なコロナウイルスと同様に、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質として知られる４つのタンパク質と、ＲＮＡより構成されている。このうちヌクレオカプシドタンパク質がＲＮＡと結合してヌクレオカプシドを形成し、脂質と結合したスパイクタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する（非特許文献２、３）。
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質（以下、Ｎタンパク質）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムに結合するタンパク質である。ウイルスゲノムのフォールディング・ウイルスタンパク質のアセンブリ・ウイルスの出芽といったウイルス粒子形成に関与するほか、宿主細胞の応答を抑制する機能があることが報告されている（非特許文献４）。
【0005】
ＣＯＶＩＤ－１９のウイルス学的診断には主に遺伝子増幅法（ＰＣＲ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子検出が行われている。ＰＣＲ検査は、現時点で使えるウイルス検査の中では最も高感度に検出することができるとされている。また、その他の検出法として、ウイルス表面のタンパク質（例えば、スパイクタンパク質など）の断片を検出する抗原検査も存在する。抗原検査としては、イムノクロマト法やＥＬＩＳＡ法を原理とした検出キットが既に市販されており、一般的にＰＣＲ検査よりも検出感度は劣るものの、所要時間の短さや簡便性の点において優れている。
【0006】
ウイルス検査においては、偽陽性及び偽陰性の無い検査法が求められる。偽陽性に関しては標的分子に対しての高い特異性をもつ測定原理であることが重要であり、また、偽陰性に関しては検査法の検出感度が重要となる。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者由来の体液（唾液や咽頭粘液など）や下水中にも、低濃度ながらウイルス構造体の一部が存在しており、これらのウイルスを検出するためには、既存のＰＣＲ検査及び抗原検査の方法では充分ではない場合もある。そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＣＲ検査及び抗原検査が既に汎用技術となっている一方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をより特異的かつ高感度に検出するための技術開発が強く求められている。
【0007】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、そのウイルスを構成するタンパク質の中で最も数の多いタンパク質の一つであることが報告されている（非特許文献４）。Ｎタンパク質の数は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面に露出しているスパイクタンパク質よりも遥かに多いため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原検査では、特に検出感度の点において、標的分子として好ましいタンパク質である。さらに、Ｎタンパク質はヌクレオカプシドとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムと結合した状態で存在する。そのため、例えばＮタンパク質を標的とし、選択的かつ強力に結合することができる抗体を開発し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質－ＲＮＡゲノム複合体を濃縮すること出来れば、ＰＣＲ検査においても、より高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能になる。また、同様にＮタンパク質を濃縮する工程を抗原検査と組み合わせることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原検査の高感度化も可能となる。
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、感染細胞内で主に発現するタンパク質の一つであり、強い免疫原性を示す。２００２年１１月より流行したＳＡＲＳ－ＣｏＶのＮタンパク質に対するＥＬＩＳＡ法では、高い特異性で感染初期と見られる患者も診断できたことが報告されている（非特許文献５）。
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、感染細胞内で主に発現するタンパク質の一つであり、強い免疫原性を示す。２００２年１１月より流行したＳＡＲＳ－ＣｏＶのＮタンパク質に対するＥＬＩＳＡ法では、高い特異性で感染初期と見られる患者も診断できたことが報告されている（非特許文献５）。
【0008】
通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）は重鎖と軽鎖の２つの可変領域で抗原と結合するが、ラクダ科動物の血清中から見いだされた重鎖抗体は１つの可変領域のみで結合活性と抗原特異性を示す。この抗体の可変領域はＶＨＨ(Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ) と呼ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量（通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）の１０分の１程度）とされる（非特許文献６）。ＶＨＨ抗体の機能面における特徴として、１）通常の抗体同等以上の結合活性を有すること、２）通常の抗体ではアクセスできない部分に入り込めること、３）生理的構造の形成と再生の容易性が高いこと、４）一本鎖のペプチドであるため、非常にシンプルな構造をもつことが挙げられる。特に３）の理由からＶＨＨ抗体は熱や圧に対する安定性が非常に高く、また従来は困難であった機能的な抗体の原核生物（大腸菌、枯草菌、コリネ菌、酵母など）での大量生産が可能である。また４）の理由より、タンパク質工学や化学修飾による機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製しやすいという特徴を有する。
【0009】
このように、ＶＨＨ抗体は通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）と比較して性状面、生産面において多くの利点を有している。そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を標的とするＶＨＨ抗体を用いた検出技術は、従来のＩｇＧ抗体を用いた技術よりも性能面、価格面において有利に提供できると期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020 Mar;579(7798):270-273.
【非特許文献2】A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020 Mar;579(7798):265-269.
【非特許文献3】The Coronavirus Nucleocapsid Is a Multifunctional Protein. Viruses. Volume 6、Issue 8、August 2014、Pages 2991-3018.
【非特許文献4】The SARS-CoV nucleocapsid protein: A protein with multifarious activities. Infection, Genetics and Evolution. Volume 8、July 2008、Pages 397-405.
【非特許文献5】Diagnosis of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) by Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Antibodies in an Antigen-Capturing Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Clinical Microbiology. Volume 41、No. 12、December 2003、Pages 5781-5782.
【非特許文献6】The Therapeutic Potential of Nanobodies. BioDrugs. Volume 34、November 2019、Pages 11-26.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体及びその利用法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合するＶＨＨ抗体を得るべく検討した結果、特定のアミノ酸数を有するＣＤＲ１～３をコンストラクトに含むＶＨＨ抗体ライブラリーから、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対して反応性の高いクローンを得ることに成功した。
【0013】
すなわち、本発明は以下の１）～５）に係るものである。
１）以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
２）１）の抗体をコードする核酸。
３）以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
４）１）の抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
５）１）の抗体を含有する医薬。
１）以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
２）１）の抗体をコードする核酸。
３）以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
４）１）の抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
５）１）の抗体を含有する医薬。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、反応性の高い抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗体を提供することができる。当該抗体を用いることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出、すなわちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の迅速な検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】セレクションにより選抜されたＣｏＶＨＨ―Ｎ１とＣｏＶＨＨ―Ｎ１変異体のアミノ酸配列のアライメント図。＊は保存されたアミノ酸を示す。ＣｏＶＨＨ―Ｎ１のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸が置換されている場所を四角で囲うことで示した。
【図2】合成されたＶＨＨのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果。矢印は目的タンパク質のバンドを示す。
【図3】表面プラズモン共鳴法によるＣｏＶＨＨ―Ｎ１のＮタンパク質に対する結合活性測定。黒線は計測された生データに基づく結合乖離曲線、灰色線はフィッティング後の結合乖離曲線を示す。
【図4】表面プラズモン共鳴法によるＣｏＶＨＨ―Ｎ２のＮタンパク質に対する結合活性測定。黒線は計測された生データに基づく結合乖離曲線、灰色線はフィッティング後の結合乖離曲線を示す。
【図5】ＥＬＩＳＡ法によるＣｏＶＨＨ―Ｎ１及びＣｏＶＨＨ―Ｎ２のコロナウイルスのＮタンパク質に対する結合特異性評価。
【図6】ＥＬＩＳＡ法によるＣｏＶＨＨ－Ｎ２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株コロナウイルスのＮタンパク質に対する結合特異性評価。
【図7】ＥＬＩＳＡ法によるＣｏＶＨＨ－Ｎ２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株コロナウイルスのＮタンパク質に対する結合特異性評価。
【図8】ＥＬＩＳＡ法によるＣｏＶＨＨ－Ｎ１及びＣｏＶＨＨ－Ｎ２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株コロナウイルスのＮタンパク質に対する結合特異性評価。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する）は、下記（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【0017】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となる、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスであり、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体であるが、詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体である。
【0018】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有する。ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；相補性決定領域）とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域とも云われる。本発明の抗体の構造ドメインにおいて、３つのＣＤＲは、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順で存在する。
【0019】
本発明の抗体の一態様は、構造ドメインにおいて、
ＣＤＲ１は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列はＧＦＰＦＴＫＦＷＭＹであり、配列番号２で示されるアミノ酸配列はＦＩＤＴＴＧＴＩＴＮであり、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３のアミノ酸配列はＧＰＰＧＳＴＷＶＶＤＦＨＳである。
ＣＤＲ１は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列はＧＦＰＦＴＫＦＷＭＹであり、配列番号２で示されるアミノ酸配列はＦＩＤＴＴＧＴＩＴＮであり、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３のアミノ酸配列はＧＰＰＧＳＴＷＶＶＤＦＨＳである。
【0020】
本発明の抗体の別の一態様は、構造ドメインにおいて、
ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３、配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列はＧＦＴＦＤＤＨＡＶＧであり、配列番号５で示されるアミノ酸配列ＡＩＳＧＤＧＹＴＴＶであり、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３のアミノ酸配列はＦＲＴＤＩＶＲＥＹである。
ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３、配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列はＧＦＴＦＤＤＨＡＶＧであり、配列番号５で示されるアミノ酸配列ＡＩＳＧＤＧＹＴＴＶであり、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３のアミノ酸配列はＦＲＴＤＩＶＲＥＹである。
【0021】
上記配列番号１～６で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲは、配列番号１～６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲに変異が導入されたＣＤＲを意味する。また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に変異が導入されていても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能を有している限り、本発明の抗体のＣＤＲに包含される。
ここで、置換されるアミノ酸の位置は限定されないが、好ましい位置として、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１においては１、２、４、６、７、８又は９番目が挙げられ、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２においては１又は１０番目が挙げられ、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３においては１、６、９又は１２番目が挙げられる。
ここで、置換されるアミノ酸の位置は限定されないが、好ましい位置として、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１においては１、２、４、６、７、８又は９番目が挙げられ、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２においては１又は１０番目が挙げられ、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３においては１、６、９又は１２番目が挙げられる。
【0022】
また、置換後のアミノ酸の種類は限定されないが、例えば、極性や大きさが類似のアミノ酸への置換が挙げられる。また、グリシン残基のアルギニン残基への置換、フェニルアラニン残基のロイシン残基又はシステイン残基への置換、リジン残基のアスパラギン残基への置換、トリプトファン残基のシステイン残基への置換、メチオニン残基のバリン残基又はアルギニン残基への置換、アスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換、グリシン残基のシステイン残基への置換、トレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、バリン残基のイソロイシン残基への置換、ヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換等が挙げられる。
【0023】
置換されるアミノ酸の位置及び置換後のアミノ酸の種類の好ましい組み合わせとしては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１においては、１番目のグリシン残基のアルギニン残基への置換、２番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、４番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、６番目のリジン残基のアスパラギン残基への置換、７番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基又はシステイン残基への置換、８番目のトリプトファン残基のシステイン残基への置換、９番目のメチオニン残基のバリン残基又はアルギニン残基への置換、
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２においては、１番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、１０番目のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換、
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３においては、１番目のグリシン残基のシステイン残基への置換、６番目のトレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、９番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、１２番目のヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換、が好ましい。
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２においては、１番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、１０番目のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換、
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３においては、１番目のグリシン残基のシステイン残基への置換、６番目のトレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、９番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、１２番目のヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換、が好ましい。
【0024】
なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能は、当業者に公知の方法により評価できる。具体的には、後述する実施例に示すように、表面プラズモン共鳴法により、平衡乖離定数ＫＤを求めることにより評価できる。また、例えば抗原を固定したＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、バイオレイヤー干渉法等を用いた方法によっても評価できる
【0025】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の両端にフレームワーク領域を有するものであってもよい。フレームワーク領域とは、抗体分子の可変領域において相補性決定領域を除く領域であり、保存性の高い領域を指す。
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下のものが挙げられる。
ＦＲ１：配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号１３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下のものが挙げられる。
ＦＲ１：配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号１３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【0026】
配列番号７～１３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域としては、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域が挙げられる。
【0027】
ここで、アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。配列の同一性は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを用いて解析を行なうことにより算出できる。
【0028】
本発明の抗体のうち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１３で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号１４）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１３で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号１５）を有する抗体は、それぞれ、後述する実施例において、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローン（前者：ＣｏＶＨＨ―Ｎ１、後者：ＣｏＶＨＨ―Ｎ２）であり、好適な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
【0029】
本発明の抗体は、上記の構造ドメインを少なくとも１つ有するものであればその形態は限定されず、ＶＨＨ抗体のようなシングルドメイン抗体（ナノボディーとも呼ばれる）の他、一本鎖抗体、重鎖抗体、可変領域断片をペプチドリンカーなどで結合させた多量体、例えば二量体、更には、可変領域断片と抗原特異性の異なる可変領域断片の１または複数を連結した多量体であってもよい。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
【0030】
本発明の抗体の作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、本発明の抗体をコードする核酸を適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換え抗体として産生させる方法が好ましい。
【0031】
組換え抗体として産生において使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、カビ、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞等が挙げられる。 抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の大腸菌と枯草菌で共用することができるシャトルベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
【0032】
発現させた本発明の抗体を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的の抗体を取得することができる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【0033】
本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合することから、これを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有するか、または含有する可能性のある被験試料と接触させることによって、当該試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
【0034】
被験試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液，咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、ウイルスが付着している可能性のある固体表面、例えばドアノブ、便器等から採取された試料が挙げられる。被験試料は、Ｎタンパク質への結合の点から、被験試料中のウイルスを界面活性剤等を含む溶液で溶解し、当該溶液中で抗体と結合させるのが好ましい。抗体は固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
【0035】
また、本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用キットの構成成分となり得る。当該キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の診断薬として、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬の開発用のツールとして使用可能である。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識するＮタンパク質抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識するＮタンパク質抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
【0036】
また、本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合し、細胞内でのウイルスの複製を阻害することが考えられる。したがって、本発明の抗体は、哺乳動物に投与し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療するための医薬として利用することも可能である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等が挙げられるが、ヒトが好ましい。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
【0037】
斯かる医薬において、その組成物中における本発明の抗体の含有量は適宜調整できる。 また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
【0038】
本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
＜１＞以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜２＞Ｎ－タンパク質に結合する、＜１＞の抗体。
＜３＞ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、＜１＞又は＜２＞の抗体。
＜４＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である＜３＞の抗体。
＜５＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを２つ連結した二量体である＜３＞の抗体。
＜６＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である＜３＞の抗体。
＜１＞以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜２＞Ｎ－タンパク質に結合する、＜１＞の抗体。
＜３＞ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、＜１＞又は＜２＞の抗体。
＜４＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である＜３＞の抗体。
＜５＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを２つ連結した二量体である＜３＞の抗体。
＜６＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である＜３＞の抗体。
【0039】
＜７＞配列番号１で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、１番目のグリシン残基のアルギニン残基への置換、２番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、４番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、６番目のリジン残基のアスパラギン残基への置換、７番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基又はシステイン残基への置換、８番目のトリプトファン残基のシステイン残基への置換、又は９番目のメチオニン残基のバリン残基又はアルギニン残基への置換である、＜１＞～＜６＞のいずれかの抗体。
＜８＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、１番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、又は１０番目のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換である、＜１＞～＜６＞のいずれかの抗体。
＜９＞配列番号３で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、１番目のグリシン残基のシステイン残基への置換、６番目のトレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、９番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、又は１２番目のヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換である、＜１＞～＜６＞のいずれかの抗体。
＜１０＞構造ドメインが、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものである、＜１＞～＜９＞のいずれかの抗体。
＜１１＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜１０＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号１３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１３で示されるアミノ酸配列である構造ドメインを有する、＜１０＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１３で示されるアミノ酸配列である構造ドメインを有する、＜１０＞の抗体。
＜１４＞＜１＞の抗体をコードする核酸。
＜１５＞以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜１６＞＜１＞～＜１３＞のいずれかの抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
＜１７＞＜１＞～＜１３＞のいずれかの抗体を含有する医薬。
＜１８＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための＜１７＞の医薬。
＜８＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、１番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、又は１０番目のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換である、＜１＞～＜６＞のいずれかの抗体。
＜９＞配列番号３で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、１番目のグリシン残基のシステイン残基への置換、６番目のトレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、９番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、又は１２番目のヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換である、＜１＞～＜６＞のいずれかの抗体。
＜１０＞構造ドメインが、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものである、＜１＞～＜９＞のいずれかの抗体。
＜１１＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜１０＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号１３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１３で示されるアミノ酸配列である構造ドメインを有する、＜１０＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１３で示されるアミノ酸配列である構造ドメインを有する、＜１０＞の抗体。
＜１４＞＜１＞の抗体をコードする核酸。
＜１５＞以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜１６＞＜１＞～＜１３＞のいずれかの抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
＜１７＞＜１＞～＜１３＞のいずれかの抗体を含有する医薬。
＜１８＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための＜１７＞の医薬。
【実施例0040】
実施例１ 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗体のスクリーニング
＜材料と方法＞
１．スクリーニングの標的分子
標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ－Ｔａｇ (Ｅ.ｃｏｌｉ)（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いた。
＜材料と方法＞
１．スクリーニングの標的分子
標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ－Ｔａｇ (Ｅ.ｃｏｌｉ)（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いた。
【0041】
２．ｃＤＮＡディスプレイの合成
（１）初期ＤＮＡの合成
ＶＨＨをコードしたｃＤＮＡディスプレイを合成するためのＤＮＡである４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ及び４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）をＰＣＲで増幅した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号１６））、１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ－３’（配列番号１７））、３００ｎｇのＤＮＡを混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで５０μＬになるように調製した。ＰＣＲは９５℃で５分間の後、９８℃で２０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を５サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。１．４ｍＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で３分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、１００μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で２分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＤＮＡを定量し、ＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ由来及び４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ由来のＰＣＲ産物を等量になるように混合した（これを初期ＤＮＡと呼ぶ）。
（１）初期ＤＮＡの合成
ＶＨＨをコードしたｃＤＮＡディスプレイを合成するためのＤＮＡである４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ及び４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）をＰＣＲで増幅した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号１６））、１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ－３’（配列番号１７））、３００ｎｇのＤＮＡを混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで５０μＬになるように調製した。ＰＣＲは９５℃で５分間の後、９８℃で２０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を５サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。１．４ｍＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で３分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、１００μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で２分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＤＮＡを定量し、ＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ由来及び４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ由来のＰＣＲ産物を等量になるように混合した（これを初期ＤＮＡと呼ぶ）。
【0042】
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。２５μＬのＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ２Ｘ Ｂｕｆｆｅｒ，２０ｐｍｏｌ ＰＣＲ産物（初期ＤＮＡまたは各セレクション後のＰＣＲ産物）、５μＬのＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを混合し，３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、５μＬのＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。転写産物の精製はＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬの転写産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で１０分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＲＮＡを定量した。
Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。２５μＬのＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ２Ｘ Ｂｕｆｆｅｒ，２０ｐｍｏｌ ＰＣＲ産物（初期ＤＮＡまたは各セレクション後のＰＣＲ産物）、５μＬのＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを混合し，３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、５μＬのＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。転写産物の精製はＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬの転写産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で１０分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＲＮＡを定量した。
【0043】
（３）ｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーの連結
４μＬの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｐｍｏｌのｍＲＮＡ、２０ｐｍｏｌのｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ ｌｉｎｋｅｒを混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで２０μＬになるように反応液を調製した。アニーリングはＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９０℃で２分間、７０℃で１分間、２５℃で３０秒、４℃でインキュベートの条件で行った。Ｒａｍｐ ｒａｔｅは０．１℃／秒に設定した。続いて、Ｈａｎｄｈｅｌｄ ＵＶ Ｌａｍｐ，６Ｗ、ＵＶＧＬ－５８、２５４／３６５ｎｍ、１００Ｖ（Ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ、Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて波長３６５ｎｍの紫外線を５分間照射した。ｍＲＮＡ－リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
４μＬの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｐｍｏｌのｍＲＮＡ、２０ｐｍｏｌのｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ ｌｉｎｋｅｒを混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで２０μＬになるように反応液を調製した。アニーリングはＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９０℃で２分間、７０℃で１分間、２５℃で３０秒、４℃でインキュベートの条件で行った。Ｒａｍｐ ｒａｔｅは０．１℃／秒に設定した。続いて、Ｈａｎｄｈｅｌｄ ＵＶ Ｌａｍｐ，６Ｗ、ＵＶＧＬ－５８、２５４／３６５ｎｍ、１００Ｖ（Ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ、Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて波長３６５ｎｍの紫外線を５分間照射した。ｍＲＮＡ－リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
【0044】
（４）無細胞翻訳
ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体の合成にはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。１０．５μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲ、１．５μＬの２０ｘ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ，５２．５μＬのＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ、１．５μＬのＲＮａｓｉｎ（商標） Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、９μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、３６μＬのＩＶＶ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ ＫＣｌ，１Ｍ ＭｇＣｌ２）混合液を加え、さらに３７℃で２０分間反応させることで、ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体の合成にはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。１０．５μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲ、１．５μＬの２０ｘ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ，５２．５μＬのＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ、１．５μＬのＲＮａｓｉｎ（商標） Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、９μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、３６μＬのＩＶＶ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ ＫＣｌ，１Ｍ ＭｇＣｌ２）混合液を加え、さらに３７℃で２０分間反応させることで、ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
【0045】
（５）ストレプトアビジン磁性体ビーズへの固定化
６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０μＬの２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は２回行った。７５μＬのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体、７５μＬの２ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁性プレート上で１分間静置した後、上清を除去した。２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は２回行った。
６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０μＬの２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は２回行った。７５μＬのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体、７５μＬの２ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁性プレート上で１分間静置した後、上清を除去した。２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は２回行った。
【0046】
（６）逆転写反応
５５．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ、１５μＬの５ｘ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１．５μＬのＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（１００Ｕ／μＬ）（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を混合した。上記の反応液にｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体が固定化されたストレプトアビジン磁性体ビーズを添加し、４２℃、３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
５５．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ、１５μＬの５ｘ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１．５μＬのＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（１００Ｕ／μＬ）（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を混合した。上記の反応液にｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体が固定化されたストレプトアビジン磁性体ビーズを添加し、４２℃、３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
【0047】
（７）ビーズからの切り出し
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体に対して，Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。続いて、３０μＬの１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた後、３７℃で１５分間静置することでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出させた。
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体に対して，Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。続いて、３０μＬの１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた後、３７℃で１５分間静置することでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出させた。
【0048】
（８）精製
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた後、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作は２回行った。ｃＤＮＡ－ペプチド連結体の溶出液とＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ懸濁液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。２００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作は２回行った。１０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることで、精製したｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体（ｃＤＮＡディスプレイと呼ぶ）を溶出した。
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた後、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作は２回行った。ｃＤＮＡ－ペプチド連結体の溶出液とＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ懸濁液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。２００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作は２回行った。１０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることで、精製したｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体（ｃＤＮＡディスプレイと呼ぶ）を溶出した。
【0049】
３．セレクション
（１）標的分子の固相化とブロッキング
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの５０μｇ／ｍＬ（１ラウンド目）、１０μｇ／ｍＬ（２ラウンド目）、５μｇ／ｍＬ（３ラウンド目）、１μｇ／ｍＬ（４ラウンド目及び５ラウンド目）になるようにＰＢＳにて調整したＨｉｓタグ付きＮタンパク質を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったHisタグ付きNタンパク質／ＰＢＳを取り除いた後、２００μＬの５％（ｗ／ｖ）スキムミルク/ＰＢＳＴ（０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で1時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に５％（ｗ／ｖ）スキムミルク/ＰＢＳＴ（０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
（１）標的分子の固相化とブロッキング
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの５０μｇ／ｍＬ（１ラウンド目）、１０μｇ／ｍＬ（２ラウンド目）、５μｇ／ｍＬ（３ラウンド目）、１μｇ／ｍＬ（４ラウンド目及び５ラウンド目）になるようにＰＢＳにて調整したＨｉｓタグ付きＮタンパク質を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったHisタグ付きNタンパク質／ＰＢＳを取り除いた後、２００μＬの５％（ｗ／ｖ）スキムミルク/ＰＢＳＴ（０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で1時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に５％（ｗ／ｖ）スキムミルク/ＰＢＳＴ（０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
【0050】
（２）プレインキュベーション（セレクションの２ラウンド目以降に実施）
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに２００μＬの５％（ｗ／ｖ）スキムミルク/ＰＢＳＴ（０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったスキムミルクを取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
１ラウンド目のセレクションでは２００ｐｍｏｌ、２ラウンド目のセレクションでは１２ｐｍｏｌ、３ラウンド目以降のセレクションでは６ｐｍｏｌに調製されたｃＤＮＡディスプレイを用いた。各ｃＤＮＡディスプレイはＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、１００μＬに調製した。このうち、２ラウンド目以降の各ｃＤＮＡディスプレイはスキムミルクによりブロッキングしたウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、上清を全て回収した。これにより、ブロッキング剤に対して結合性を示すｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を除去した。
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに２００μＬの５％（ｗ／ｖ）スキムミルク/ＰＢＳＴ（０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったスキムミルクを取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
１ラウンド目のセレクションでは２００ｐｍｏｌ、２ラウンド目のセレクションでは１２ｐｍｏｌ、３ラウンド目以降のセレクションでは６ｐｍｏｌに調製されたｃＤＮＡディスプレイを用いた。各ｃＤＮＡディスプレイはＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、１００μＬに調製した。このうち、２ラウンド目以降の各ｃＤＮＡディスプレイはスキムミルクによりブロッキングしたウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、上清を全て回収した。これにより、ブロッキング剤に対して結合性を示すｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を除去した。
【0051】
（３）セレクション
Ｎタンパク質が固相化されたウェルに、ｃＤＮＡディスプレイ（２ラウンド目以降は、プレインキュベーション後のｃＤＮＡディスプレイ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にｃＤＮＡディスプレイ溶液を取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は１０回行った。１００μＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を添加し、丁寧にピペッティングした後、室温で５分間静置した。静置後、上清を新しいチューブに回収した。
Ｎタンパク質が固相化されたウェルに、ｃＤＮＡディスプレイ（２ラウンド目以降は、プレインキュベーション後のｃＤＮＡディスプレイ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にｃＤＮＡディスプレイ溶液を取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は１０回行った。１００μＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を添加し、丁寧にピペッティングした後、室温で５分間静置した。静置後、上清を新しいチューブに回収した。
【0052】
４．ＰＣＲ増幅
溶出液をＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ、１２．５μＬのセレクション後のｃＤＮＡディスプレイ、９．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。プライマーは５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡ－３’（配列番号１８）と５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ－３’（配列番号１７）を用いた。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２２サイクル（１ラウンド目）または２４サイクル（２ラウンド目以降）、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、４５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。ここで得られたＰＣＲ産物を鋳型にして、次のセレクションラウンドで使用するためのｃＤＮＡディスプレイを合成した。
溶出液をＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ、１２．５μＬのセレクション後のｃＤＮＡディスプレイ、９．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。プライマーは５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡ－３’（配列番号１８）と５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ－３’（配列番号１７）を用いた。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２２サイクル（１ラウンド目）または２４サイクル（２ラウンド目以降）、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、４５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。ここで得られたＰＣＲ産物を鋳型にして、次のセレクションラウンドで使用するためのｃＤＮＡディスプレイを合成した。
【0053】
５．ＶＨＨ抗体候補配列の抽出
（１）ＰＣＲ産物の定量と濃度調製
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ(商標)ｄｓＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行った。定量値に従い、各サンプルの濃度を５０ｎｇ／ｍＬに調製した。
（１）ＰＣＲ産物の定量と濃度調製
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ(商標)ｄｓＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行った。定量値に従い、各サンプルの濃度を５０ｎｇ／ｍＬに調製した。
【0054】
（２）シーケンスの調製
１ｓｔ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、０．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、２．５μＬの前段落記載のＰＣＲ産物、９μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。プライマーは５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧ－３’（配列番号１９）と５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧ－３’（配列番号２０）を用いた。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、６２℃で１５秒間、７２℃で２０秒を１６サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。
ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。
続いて、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、１μＬの１０ μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、２．５μＬのテンプレートＤＮＡ、８μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を８サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズを確認後、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行い、以下の式（１）に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲで希釈することで４ｎＭに調製した（これをサンプルと呼ぶ。）。
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０６＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］・・・（１）
１ｓｔ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、０．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、２．５μＬの前段落記載のＰＣＲ産物、９μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。プライマーは５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧ－３’（配列番号１９）と５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧ－３’（配列番号２０）を用いた。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、６２℃で１５秒間、７２℃で２０秒を１６サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。
ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。
続いて、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、１μＬの１０ μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、２．５μＬのテンプレートＤＮＡ、８μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を８サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズを確認後、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行い、以下の式（１）に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲで希釈することで４ｎＭに調製した（これをサンプルと呼ぶ。）。
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０６＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］・・・（１）
【0055】
（３）シーケンス
４ｎＭを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルの最終濃度は７ｐＭになるように調製した。また、サンプル中のＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌは５％になるように調製した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２ ５００ ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行った。
４ｎＭを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルの最終濃度は７ｐＭになるように調製した。また、サンプル中のＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌは５％になるように調製した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２ ５００ ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行った。
【0056】
（４）シーケンスデータからＶＨＨ抗体のアミノ酸配列の抽出と重複数の計測
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。
【0057】
（５）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＨＨ抗体候補配列の選抜
４ラウンド目と５ラウンド目のセレクション後に共通して出現するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列毎のクローン数に基づき、各ＶＨＨ抗体の中における出現頻度を算出した。その結果、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１（配列番号１４）、ＣｏＶＨＨ―Ｎ２（配列番号１５）の出現頻度が高く、Ｎタンパク質との親和性が高い抗体として選抜された（表１）。
４ラウンド目と５ラウンド目のセレクション後に共通して出現するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列毎のクローン数に基づき、各ＶＨＨ抗体の中における出現頻度を算出した。その結果、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１（配列番号１４）、ＣｏＶＨＨ―Ｎ２（配列番号１５）の出現頻度が高く、Ｎタンパク質との親和性が高い抗体として選抜された（表１）。
【0058】
【表1】
【0059】
ＣｏＶＨＨ―Ｎ１のアミノ酸配列において、１～２６番がＦＲ１（配列番号７）、２７～３６番がＣＤＲ１（配列番号１）、３７～５０番がＦＲ２（配列番号９）、５１～６０番がＣＤＲ２（配列番号２）、６１～９９番がＦＲ３（配列番号１１）、１００～１１２番がＣＤＲ３（配列番号３）、１１３～１２３番がＦＲ４（配列番号１３）である。
ＣｏＶＨＨ―Ｎ２のアミノ酸配列において、１～２６番がＦＲ１（配列番号８）、２７～３６番がＣＤＲ１（配列番号４）、３７～５０番がＦＲ２（配列番号１０）、５１～６０番がＣＤＲ２（配列番号５）、６１～９９番がＦＲ３（配列番号１２）、１００～１０８番がＣＤＲ３（配列番号６）、１０９～１１９番がＦＲ４（配列番号１３）である。
ＣｏＶＨＨ―Ｎ２のアミノ酸配列において、１～２６番がＦＲ１（配列番号８）、２７～３６番がＣＤＲ１（配列番号４）、３７～５０番がＦＲ２（配列番号１０）、５１～６０番がＣＤＲ２（配列番号５）、６１～９９番がＦＲ３（配列番号１２）、１００～１０８番がＣＤＲ３（配列番号６）、１０９～１１９番がＦＲ４（配列番号１３）である。
【0060】
（６）ＶＨＨ抗体のＣＤＲ領域アミノ酸配列の抽出
４ラウンド及び５ラウンド後のセレクション後に共通して出現するＶＨＨの中から、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１のアミノ酸配列との比較を行い、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１の各ＣＤＲ領域に含まれる１つのアミノ酸が他のアミノ酸へ置換されたＣｏＶＨＨ―Ｎ１の変異体（ＣＤＲ１変異体、またはＣＤＲ２変異体、またはＣＤＲ３変異体と呼ぶ）を選抜した（図１）。ＣＤＲ１に１アミノ酸の置換をもつＣｏＶＨＨ―Ｎ１のＣＤＲ１変異体は、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１(配列番号２１)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―２(配列番号２２)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―３ (配列番号２３)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―４(配列番号２４)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―５(配列番号２５)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―６(配列番号２６)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―７(配列番号２７)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―８(配列番号２８)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―９(配列番号２９)であり、ＣＤＲ２に１アミノ酸の置換をもつＣｏＶＨＨ―Ｎ１のＣＤＲ１変異体は、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―1０(配列番号３０)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１１(配列番号３１)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１２(配列番号３２)、ＣＤＲ３に１アミノ酸の置換をもつＣｏＶＨＨ―Ｎ１のＣＤＲ１変異体は、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１３(配列番号３３)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１４(配列番号３４)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１５(配列番号３５)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１６(配列番号３６)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１７(配列番号３７)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１８(配列番号３８)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１９(配列番号３９)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―２０(配列番号４０)である。
４ラウンド及び５ラウンド後のセレクション後に共通して出現するＶＨＨの中から、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１のアミノ酸配列との比較を行い、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１の各ＣＤＲ領域に含まれる１つのアミノ酸が他のアミノ酸へ置換されたＣｏＶＨＨ―Ｎ１の変異体（ＣＤＲ１変異体、またはＣＤＲ２変異体、またはＣＤＲ３変異体と呼ぶ）を選抜した（図１）。ＣＤＲ１に１アミノ酸の置換をもつＣｏＶＨＨ―Ｎ１のＣＤＲ１変異体は、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１(配列番号２１)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―２(配列番号２２)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―３ (配列番号２３)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―４(配列番号２４)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―５(配列番号２５)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―６(配列番号２６)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―７(配列番号２７)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―８(配列番号２８)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―９(配列番号２９)であり、ＣＤＲ２に１アミノ酸の置換をもつＣｏＶＨＨ―Ｎ１のＣＤＲ１変異体は、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―1０(配列番号３０)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１１(配列番号３１)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１２(配列番号３２)、ＣＤＲ３に１アミノ酸の置換をもつＣｏＶＨＨ―Ｎ１のＣＤＲ１変異体は、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１３(配列番号３３)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１４(配列番号３４)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１５(配列番号３５)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１６(配列番号３６)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１７(配列番号３７)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１８(配列番号３８)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―１９(配列番号３９)、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１―２０(配列番号４０)である。
【0061】
実施例２ プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
（１）遺伝子の人工合成
合成されるＶＨＨのアミノ酸配列には、ＣｏＶＨＨ－Ｎ１（配列番号１４）またはＣｏＶＨＨ－Ｎ２（配列番号１５）のＣ末端側にリンカー配列を介したＨｉｓタグ配列（配列番号４１、ＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ）を付与した。これにより合成されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１（配列番号４２）及びＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２（配列番号４３）と呼ぶ。Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１及びＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２を合成するための人工合成遺伝子として、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１用人工合成遺伝子（配列番号４４）及びＣｏＶＨＨ－Ｎ２用人工合成遺伝子（配列番号４５）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。
（１）遺伝子の人工合成
合成されるＶＨＨのアミノ酸配列には、ＣｏＶＨＨ－Ｎ１（配列番号１４）またはＣｏＶＨＨ－Ｎ２（配列番号１５）のＣ末端側にリンカー配列を介したＨｉｓタグ配列（配列番号４１、ＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ）を付与した。これにより合成されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１（配列番号４２）及びＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２（配列番号４３）と呼ぶ。Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１及びＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２を合成するための人工合成遺伝子として、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１用人工合成遺伝子（配列番号４４）及びＣｏＶＨＨ－Ｎ２用人工合成遺伝子（配列番号４５）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。
【0062】
（２）ＶＨＨ発現用プラスミドの構築
組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号４６）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号４７）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号４８）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号４９）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号５０）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号５１）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に、（１）の人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込み、人工合成ＶＨＨ遺伝子の各々を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号４６）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号４７）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号４８）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号４９）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号５０）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号５１）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に、（１）の人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込み、人工合成ＶＨＨ遺伝子の各々を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
【0063】
（３）組換え枯草菌の作製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（以下、１６８株という）から、特開２００６－１７４７０７号公報に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ）の欠損株を作製した。また、特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、上記８種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Ｄｐｒ８から、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をＤｐｒ８ΔｓｉｇＦと記載する。
Ｄｐｒ８ΔｓｉｇＦ株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（以下、１６８株という）から、特開２００６－１７４７０７号公報に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ）の欠損株を作製した。また、特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、上記８種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Ｄｐｒ８から、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をＤｐｒ８ΔｓｉｇＦと記載する。
Ｄｐｒ８ΔｓｉｇＦ株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
【0064】
（４）ＶＨＨ産生
（３）で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。Ｄｐｒ８ΔｓｉｇＦは、前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。各ＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。精製後のタンパク質はＰＢＳ（３０ｍＭ イミダゾール）に溶解した。
（３）で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。Ｄｐｒ８ΔｓｉｇＦは、前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。各ＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。精製後のタンパク質はＰＢＳ（３０ｍＭ イミダゾール）に溶解した。
【0065】
（５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる確認
６．５μＬのＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１又はＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２の水溶液（共に２００μｇ／ｍＬ）、２．５μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ （１０Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を混合し、１００℃で加熱した。その後、１０μＬのサンプル溶液をゲルのウェルにアプライした。分子量マーカーとして、５μＬのＮｏｖｅｘ（商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）もゲルのウェルにアプライした。ゲルはＮｕＰＡＧＥ（商標）１０％，Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ，１．０ｍｍ，Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ，１２－ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。泳動用緩衝液にはＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （２０Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を水で２０倍希釈して調製した緩衝液を用いた。ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニセル電気泳動システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を泳動槽として用い、ＰｏｗｅｒＥａｓｅ（商標）９０Ｗ Ｐｏｗｅｒ Ｓｕｐｐｌｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続して２００Ｖの電圧で４０分間電気泳動を行った。その後、ゲルをＧｅｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色し、目的タンパク質のバンドを確認した（図２）。その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１とＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２が産生されていることが確認された。
６．５μＬのＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１又はＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２の水溶液（共に２００μｇ／ｍＬ）、２．５μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ （１０Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を混合し、１００℃で加熱した。その後、１０μＬのサンプル溶液をゲルのウェルにアプライした。分子量マーカーとして、５μＬのＮｏｖｅｘ（商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）もゲルのウェルにアプライした。ゲルはＮｕＰＡＧＥ（商標）１０％，Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ，１．０ｍｍ，Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ，１２－ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。泳動用緩衝液にはＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （２０Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を水で２０倍希釈して調製した緩衝液を用いた。ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニセル電気泳動システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を泳動槽として用い、ＰｏｗｅｒＥａｓｅ（商標）９０Ｗ Ｐｏｗｅｒ Ｓｕｐｐｌｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続して２００Ｖの電圧で４０分間電気泳動を行った。その後、ゲルをＧｅｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色し、目的タンパク質のバンドを確認した（図２）。その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１とＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２が産生されていることが確認された。
【0066】
実施例３ 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法共鳴法による結合活性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＮＴＡ（Ｃｙｔｉｖａ）に固相化したＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１又はＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２のＮタンパク質に対する結合活性を測定した。Ｗｉｚａｒｄ、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ／Ａｆｆｉｎｉｔｙのモードで測定した。温度は２５℃に設定した。ランニング緩衝液には１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０μＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ ７．４）を用いた。ラン毎の測定順は以下の通りである；１）ＶＨＨの固相化：流速を１０μＬ／ｍＬに設定し、０．５ｍＭ ＮｉＣｌ２水溶液を６０秒間添加し、その後、ランニング緩衝液で希釈したＨｉｓタグ付きＶＨＨ溶液を６０秒間添加することで１０００ＲＵ固定化した。２）結合活性の測定：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、ランニング緩衝液で希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆｃタグ付きＮタンパク質、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ１２０秒間、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ４００秒間に設定して相互作用させた。３）センサーチップ表面の再生：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、３５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ ８．０）を６０秒間添加することで固相化されたＨｉｓタグ付きＶＨＨを溶離した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ソフトウェアバージョン２．０）（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌによる解析を行い、結合活性を算出した（図３、図４）。その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１のＮタンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）は５．６４ｘ１０－１０Ｍ（ｋａ＝３．０２ｘ１０６（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝１．７０ｘ１０－３（１／ｓ））であった。Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２のＮタンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）は２．０９ｘ１０－９Ｍ（ｋａ＝４．３０ｘ１０５（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝９．００ｘ１０－４（１／ｓ））であった。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＮＴＡ（Ｃｙｔｉｖａ）に固相化したＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１又はＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２のＮタンパク質に対する結合活性を測定した。Ｗｉｚａｒｄ、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ／Ａｆｆｉｎｉｔｙのモードで測定した。温度は２５℃に設定した。ランニング緩衝液には１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０μＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ ７．４）を用いた。ラン毎の測定順は以下の通りである；１）ＶＨＨの固相化：流速を１０μＬ／ｍＬに設定し、０．５ｍＭ ＮｉＣｌ２水溶液を６０秒間添加し、その後、ランニング緩衝液で希釈したＨｉｓタグ付きＶＨＨ溶液を６０秒間添加することで１０００ＲＵ固定化した。２）結合活性の測定：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、ランニング緩衝液で希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆｃタグ付きＮタンパク質、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ１２０秒間、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ４００秒間に設定して相互作用させた。３）センサーチップ表面の再生：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、３５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ ８．０）を６０秒間添加することで固相化されたＨｉｓタグ付きＶＨＨを溶離した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ソフトウェアバージョン２．０）（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌによる解析を行い、結合活性を算出した（図３、図４）。その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１のＮタンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）は５．６４ｘ１０－１０Ｍ（ｋａ＝３．０２ｘ１０６（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝１．７０ｘ１０－３（１／ｓ））であった。Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２のＮタンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）は２．０９ｘ１０－９Ｍ（ｋａ＝４．３０ｘ１０５（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝９．００ｘ１０－４（１／ｓ））であった。
【0067】
実施例４ ＥＬＩＳＡ法による結合特異性の評価
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ ｔａｇｇｅｄ, Ｎｔｅｒ）（Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きＮタンパク質）（Ａｒｉｇｏ Ｂｉｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１又はＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図５）。その結果、ＣｏＶＨＨ－Ｎ１及びＣｏＶＨＨ－Ｎ２ともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に特異的に結合することが確認された。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ ｔａｇｇｅｄ, Ｎｔｅｒ）（Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きＮタンパク質）（Ａｒｉｇｏ Ｂｉｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１又はＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図５）。その結果、ＣｏＶＨＨ－Ｎ１及びＣｏＶＨＨ－Ｎ２ともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に特異的に結合することが確認された。
【0068】
実施例５ ＥＬＩＳＡ法による変異株Ｎタンパク質に対する結合活性の評価
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μｌの１０μｇ／ｍｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ （２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｐ１３Ｌ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｓ１９４Ｌ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｉ２９２Ｔ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３Ｌ，Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ，Ｓ２３５Ｆ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３Ｌ，Ｓ２３５Ｆ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｔ２０５Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｐ８０Ｒ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３７７Ｙ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ａ１２Ｇ，Ｔ２０５Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｒ２０３Ｍ，Ｄ３７７Ｙ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ａ１１９Ｓ，Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ，Ｍ２３４Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μｌのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μｌの１μｇ／ｍＬ ＣｏＶＨＨ－Ｎ２（Ｈｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／１０，０００に希釈した。各ウェルに５０μｌの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μｌの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図６、図７）。
その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株のＮタンパク質に対して、普遍的に結合することが確認された。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μｌの１０μｇ／ｍｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ （２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｐ１３Ｌ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｓ１９４Ｌ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｉ２９２Ｔ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３Ｌ，Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ，Ｓ２３５Ｆ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３Ｌ，Ｓ２３５Ｆ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｔ２０５Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｐ８０Ｒ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３７７Ｙ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ａ１２Ｇ，Ｔ２０５Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｒ２０３Ｍ，Ｄ３７７Ｙ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ａ１１９Ｓ，Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ，Ｍ２３４Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μｌのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μｌの１μｇ／ｍＬ ＣｏＶＨＨ－Ｎ２（Ｈｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／１０，０００に希釈した。各ウェルに５０μｌの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μｌの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図６、図７）。
その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株のＮタンパク質に対して、普遍的に結合することが確認された。
【0069】
実施例６ ＥＬＩＳＡ法によるオミクロン株Ｎタンパク質に対する結合活性の評価
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．５２９（Ｏｍｉｃｒｏｎ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＣｏＶＨＨ－Ｎ１（Ｈｉｓタグ付き）又はＣｏＶＨＨ－Ｎ２（Ｈｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／１０，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図８）。
その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１とＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２はともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株のＮタンパク質に対しても結合することが確認された。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．５２９（Ｏｍｉｃｒｏｎ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＣｏＶＨＨ－Ｎ１（Ｈｉｓタグ付き）又はＣｏＶＨＨ－Ｎ２（Ｈｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／１０，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図８）。
その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ１とＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２はともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株のＮタンパク質に対しても結合することが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】